WO2003077537A1 - Optisches bildaufnahme- und bildauswertesystem - Google Patents

Optisches bildaufnahme- und bildauswertesystem Download PDF

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WO2003077537A1
WO2003077537A1 PCT/EP2003/001702 EP0301702W WO03077537A1 WO 2003077537 A1 WO2003077537 A1 WO 2003077537A1 EP 0301702 W EP0301702 W EP 0301702W WO 03077537 A1 WO03077537 A1 WO 03077537A1
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WO
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digital cameras
image recording
image
evaluation system
optical
Prior art date
Application number
PCT/EP2003/001702
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dan Davidovici
Original Assignee
Carl Zeiss Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Carl Zeiss Ag filed Critical Carl Zeiss Ag
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Priority to DE50310155T priority patent/DE50310155D1/de
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Priority to US10/938,654 priority patent/US7929824B2/en

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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/18—Arrangements with more than one light path, e.g. for comparing two specimens

Definitions

  • the present invention relates to an optical image recording and evaluation system with an imaging beam path and at least two digital cameras and a beam splitter, which splits the light of the imaging beam path and leads to the two digital cameras.
  • Such a system is offered by the company Coordin under the designation 220-8.
  • the system contains a total of eight digital cameras.
  • the settings of the individual digital cameras e.g. the exposure times of each of the cameras can be set independently of one another.
  • the system is used to record series of images at high speed. Accordingly, the image recording of the different cameras is started one after the other, so that the desired series of images is created by the totality of the individual images recorded one after the other with the different cameras. It is not intended to be used in fluorescence analysis.
  • Laser scan microscopes have the disadvantage, however, that they are technically very complex and, on the other hand, they have relatively long recording times for recording large image fields, which can be up to a few seconds. In the case of very fast diffusion processes, these acquisition times can be too long to interpret detected differences correctly. Examples of a laser scan microscope and fluorescence analyzes that can be carried out with them are described, for example, in the prospectus “Axiovert 200” from the applicant with the reference 40-085d / 01.01.
  • the optical image recording and image evaluation system has an imaging beam path, at least two digital cameras and a beam splitter which splits the light from the imaging beam path and in each case leads a part thereof to the digital cameras.
  • the starting times for the image recording of the digital cameras are synchronized with one another, so that the starting times for the exposures of the digital cameras are identical within the scope of the synchronization accuracy.
  • the beam splitter is designed as a dichroic beam splitter, so that the digital cameras detect light from different spectral ranges.
  • the digital cameras should simultaneously record two-dimensional fields and, accordingly, each have a two-dimensional arrangement of light-sensitive pixels or another two-dimensional sensor chip.
  • the synchronization of the starting times of the exposure of the cameras should take place with a synchronization accuracy that is less than or equal to 1/1000 of the shortest exposure time of the digital cameras. It is thereby achieved that the beginning of the image recording of all cameras is simultaneous relative to the exposure times of all cameras, so that the recorded images correspond to images recorded simultaneously.
  • a trigger device should be provided for the synchronization of the individual cameras. Furthermore, the line lengths between the trigger device and the digital cameras - in the case of more than two digital cameras which are to record simultaneous images, the line lengths between the trigger device and all these digital cameras - should be identical to less than 10% of the longest of the line lengths. The latter ensures that no different, unknown delays occur on the signal paths between the trigger device and the cameras. Since the beam splitter is designed as a dichroic beam splitter, the different cameras only detect light in different spectral bands, and consequently the images recorded with different cameras reproduce the spatial distribution of different fluorescent compounds or fluorescent dyes. In addition, it is possible to use monochrome cameras with high pixel density and thus high digital resolution despite the requirement to record image information at different wavelengths.
  • one or more color cameras can also be used in order to achieve a color division within the spectral ranges already separated by the dichroic color splitter. With the additional color information obtained, the color shift due to biological or chemical processes can then be detected and also represented as an emission ratio.
  • a suitable lighting device should be provided for the excitation of fluorescence.
  • a further dichroic beam splitter should also be provided for the separation of the measurement light from the excitation light.
  • the optical image recording and image evaluation system according to the invention can be designed as a macroscopic or microscopic, magnifying system.
  • the design as a microscopic system with an enlarging optical system is preferred.
  • training as an additional module for microscopes e.g. in the form of a module that can be attached to the photo beam path of a microscope.
  • a digital camera In order to adjust the individual digital cameras relative to one another so that both or all cameras cover identical image areas, a digital camera should be adjustable — with more than two digital cameras all but one digital camera — to the optical axis of the partial beam path leading to it.
  • the optical image recording and image evaluation system should have an image evaluation unit for combining the images taken with different digital cameras.
  • This image evaluation unit can be designed as a personal computer with suitable evaluation software.
  • the image evaluation unit should enable the formation of quotient images, that is to say images whose brightness and / or color value at one location correspond to the quotient of the brightness values at the same location of partial images that were recorded with different cameras. The formation of quotients at different locations is also useful, for example to analyze diffusion processes in the recorded object.
  • a control device for recording and storing image series of simultaneously recorded images should be provided.
  • series of images recorded simultaneously at different wavelengths can be observed online.
  • quotient images of large image fields can then also be observed online. If the series of images are saved, the final evaluation can be carried out subsequently using pairs of images recorded simultaneously.
  • the recording parameters can preferably be set independently of one another, so that the recording conditions can be adapted to different extinctions in different spectral ranges.
  • the frame rate is determined by the exposure time of the digital camera with the longest exposure time, so that the simultaneity of the individual exposures is maintained.
  • the control device is designed so that all digital cameras work with an identical refresh rate, that is to say the refresh rate is coupled to the longest exposure time.
  • the invention is shown schematically in connection with a microscope.
  • the microscope usually has a stand (1) on which the stage (2) can be adjusted in height is included. Furthermore, a nosepiece (3) for holding a plurality of lenses (5, 6) is accommodated on the stand (1) above the object table (2).
  • An illumination device (7) is accommodated on the back of the microscope stand, which is used for illuminating a specimen to be recorded on the object table (2) in incident light.
  • the light from the incident light illumination (7) is deflected via an incident light illumination beam path (4) by a mirror (8) above the nosepiece (3) in the direction of the objective (5) switched on in the beam path.
  • the mirror (8) is designed as a dichroic beam splitter in order to separate the light coming from the incident light illumination (7) and the fluorescent light emitted by a sample.
  • the observation beam path (18) initially runs in the vertical direction.
  • a beam splitter prism (9) reflects part of the observation beam path in the direction of an eyepiece tube (10).
  • the part of the observation beam path that is not reflected by the beam splitter prism (9) continues in the vertical direction into a camera tube (19) with two outputs.
  • a further dichroic beam splitter (11) is accommodated in the camera tube (19), which splits the light from the observation beam path into the two outputs of the camera tube depending on the wavelength.
  • a digital camera (12, 13) is connected to each of the two outputs of the camera tube (19).
  • Each of the two digital cameras (12, 13) has a two-dimensional sensor chip and thereby simultaneously records a two-dimensional image field. Both cameras are synchronized with each other via a synchronization unit.
  • the synchronization unit is designed as a personal computer (14).
  • the line connections (16, 17) between the personal computer (14) and the two cameras are down to less than 10% the longer of the two line connections (16, 17) are identical. This ensures that the remaining time difference between the start of image recording with both cameras in the Range is from 50 ns to 100 ns. With exposure times of the digital cameras over Ojl ms it is then guaranteed that the synchronization accuracy is less than 1/1000 of the exposure time.
  • the personal computer is also used to evaluate the images recorded with both cameras (12, 13) and to display the image thus synthetically generated from two or more simultaneously recorded images on a monitor (15).
  • one of the cameras (12) is perpendicular to the optical axis (21) of the one leading to it via an adjustment unit (20) Part of the observation beam path can be adjusted with sub-pixel accuracy. This ensures that the two cameras (12, 13). covered image fields match with sub-pixel accuracy.
  • a corresponding tube is known, for example, from the applicant's double video adapter, which is described in the prospectus mentioned at the beginning.
  • Sliders (22, 23) are also provided between the dichroic beam splitter (11) and the two cameras (12, 13) for pivoting in the required color filters. As a result, the spectral ranges that have already been divided can be narrowed even further before detection.
  • the system described above can be used, for example, for Ca measurement by means of an emission ratio such as Indo 1 and Indo 2.
  • the fluorescence excitation then takes place at a wavelength of 340 nm and the detection at 360 and 380 nm.
  • the dichroic beam splitter ( ⁇ ) for separating the illumination and observation beam path then has a separating edge at a wavelength of approximately 350 nm and the beam splitter (21) for the division between the two cameras (12, 13) a separating edge at a wavelength of 370 nm.
  • the quotients of the brightness images of both cameras (11, 12) are formed at each location of the recorded images and from this an image of the Ca concentration generated as a function of location.
  • Another application is colocalization.
  • two proteins e.g. are labeled differently with FITC and Cy3, are localized in the same place or not. Due to the simultaneity of image acquisition at different wavelengths, diffusion processes can be recognized. Since the extinctions of the fluorescence at the different emission wavelengths are usually very different in this application, the settings of both cameras should also be selectable independently of one another for this application.
  • Another advantageous application arises if one of the two cameras has a color camera, e.g. the color camera Axiocam Color from the applicant, and the other camera a monochrome camera, e.g. the camera Axiocam Mono, which is the applicant.
  • a microscope which has both incident light illumination for fluorescence excitation and transmitted light illumination for imaging in differential interference contrast, like most conventional microscopes, z. B Visualize fluorescence and infrared DIC.
  • the image evaluation device can also be designed to record so-called mosaic images, in that several individual images are subsequently computationally combined to form a large overall image in order to generate overview images. Accordingly, the object table is to be designed as a motorized scanning table. The simultaneous image recording of the individual images in separate spectral ranges can then also be used as sum, difference and quotient images as mosaic overview images.
  • the system according to the invention has the advantage that a large image field is recorded simultaneously with each image acquisition, which e.g. 1000 * 1000 pixels or 3900 * 3090 pixels when using high-resolution digital cameras.
  • the system is much more flexible because you are not tied to special laser lines for fluorescence excitation, but can filter out the spectral range that is favorable for the respective application from a broadband light source.
  • the invention was illustrated using the example of an upright microscope. However, it can also be used in conjunction with an inverted microscope.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem mit einem Abbildungsstrahlengang und mindestens zwei Digitalkameras und einem Strahlteiler, der das Licht des Abbildungsstrahlenganges aufteilt und zu den beiden Digitalkameras führt. Der Startzeitpunkt der Bildaufnahme der Digitalkameras ist zueinander synchronisiert ist und der Strahlteiler ist ein dichroitischer Strahlteiler. Die Synchronisation der Startzeitpunkte hat vorzugsweise eine Genauigkeit, die kleiner gleich 1/1000 der kürzesten Belichtungszeit der Digitalkameras ist, so dass gleichzeitige Bilder in unterschiedlichen Spektralbereichen aufgenommen werden.

Description

Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem
Die vorliegende Erfindung betriff ein Optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem mit einem Abbildungsstrahlengang und mindestens zwei Digitalkameras und einem Strahlteiler, der das Licht des Abbildungsstrahlenganges aufteilt und zu den beiden Digitalkameras führt.
Ein derartiges System wird von der Firma Cordin unter der Bezeichnung 220-8 angeboten. Das System enthält insgesamt acht Digitalkameras. Die Einstellungen der einzelnen Digitalkameras, z.B. die Belichtungszeiten jeder der Kameras sind unabhängig von einander einstellbar. Das System dient zur Aufnahme von Bildserien mit hoher Geschwindigkeit. Demzufolge wird die Bildaufnahme der verschiedenen Kameras zeitlich nacheinander gestartet, so dass durch die Gesamtheit der nacheinander mit den verschiedenen Kameras aufgezeichneten Einzelbilder die gewünschte Bildserie entsteht. Ein Einsatz in der Fluoreszenzanalyse ist nicht vorgesehen.
ha der Fluoreszenzanalyse und in der Fluoreszenzmikroskopie sind Anwendungen bekannt, die bisher nur mit Laser-Scan Mikroskopen durchführbar sind. Beispiele hierfür sind Emission-Ration Messungen und Colokalisation von Teilchen. Laser-Scan Mikroskope haben jedoch den Nachteil, dass sie technisch sehr aufwendig sind und sie andererseits für die Aufnahme großer Bildfelder relativ große Aufiiahmezeiten haben, die bis zu wenigen Sekunden betragen können. Bei sehr schnellen Diffusionsvorgängen können diese Aufiiahmezeiten zu lang sein, um detektierte Unterschiede zutreffend zu interpretieren. Beispiele für ein Laser Scan Mikroskop und damit durchführbare Fluoreszenzanalysen sind beispielsweise in dem Prospekt „Axiovert 200" der Anmelderin mit dem Drackvermerk 40-085d/01.01 beschrieben.
Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem zu schaffen, mit dem bisher nur der Laser-Scan Mikroskopie vorbehaltene Fluoreszenzanwendungen auch mit konventionellen, ganze Bildfelder simultan übertragenden mikroskopischen oder makroskopischen Systemen durchgeführt werden können. Dieses Ziel wird erfindungsgemäß durch ein optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem mit den Merkmalen des Anspruches 1 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der abhängigen Ansprüche.
Das erfmdungemäße optische Bildaufnahme- und Bildauswertesystem weist einen Abbildungsstrahlengang, mindestens zwei Digitalkameras und einen Strahlteiler, der das Licht des Abbildungsstrahlenganges aufteilt und jeweils einen Teil davon zu den Digitalkameras führt, auf. Die Startzeitpunkte der Bildaufiiahme der Digitalkameras sind zueinander synchronisiert, so dass die Startzeitpunkte der Belichtungen der Digitalkameras im Rahmen der Synchronisationsgenauigkeit identisch sind. Der Strahlteiler ist als dichroitischer Strahlteiler ausgebildet, so dass die Digitalkameras Licht unterschiedlicher Spektralbereiche detektieren.
Die Digitalkameras sollten zweidimensionales Felder simultan aufzeichnen und dem entsprechend jeweils eine zweidimensionale Anordnung von lichtempfindlichen Pixeln oder einen anderweitig gestalteten zweidimensionalen Sensorchip aufweisen.
Die Synchronisation der Starzeitpunkte der Belichtung der Kameras sollte mit einer Synchronisationsgenauigkeit erfolgen, die kleiner gleich 1/1000 der kürzesten Belichtungszeit der Digitalkameras ist. Dadurch wird erreicht, dass der Beginn der Bildaufiiahme aller Kameras relativ zu den Belichtungszeiten aller Kameras gleichzeitig ist, so dass die aufgezeichneten Bilder gleichzeitig aufgenommenen Bildern entsprechen.
Für die Synchronisation der einzelnen Kameras sollte eine Triggereinrichtung vorgesehen sein. Weiterhin sollten die Leitungslängen zwischen der Triggereinrichtung und den Digitalkameras - bei mehr als zwei Digitalkameras, die gleichzeitige Bilder aufzeichnen sollen, die Leitungslängen zwischen der Triggereinrichtung und allen diesen Digitalkameras - bis auf weniger als 10 % der längsten der Leitungslängen identisch sein. Durch letzteres wird erreicht, dass auf den Signalwegen zwischen der Triggereinrichtung und den Kameras keine unterschiedlichen, unbekannten Verzögerungen entstehen. Da der Strahlteiler als dichroitischer Strahlteiler ausgebildet ist, detektieren die verschiedenen Kameras ausschließlich Licht in unterschiedlichen spektralen Bändern und demzufolge geben die mit unterschiedlichen Kameras aufgezeichneten Bilder die räumliche Verteilung unterschiedlicher fluoreszierender Verbindungen oder Fluoreszenzfarbstoffe wieder. Außerdem ist es möglich, trotz der Anforderung der Aufzeichnung von Bildinformation bei unterschiedlichen Wellenlängen monochrome Kameras mit hoher Pixeldichte und damit hoher digitaler Auflösung einzusetzen. Alternativ können jedoch auch eine oder mehrere Farbkameras eingesetzt werden, um eine Farbaufteilimg innerhalb der durch den dichroitischen Farbteiler bereits getrennten Spektralbereiche zu erreichen. Durch die zusätzlich gewonnene Farbinformation kann dann die Farbverschiebung aufgrund biologischer oder chemischer Vorgänge nachgewiesen und ebenfalls als Emission-Ratio dargestellt werden.
Soweit mehr als zwei zu einander synchronisierte Kameras vorgesehen sind, sind auch mehrere dichroitische Strahlteiler mit unterschiedlichen Trennungskanten vor zu sehen.
Für die Anregung von Fluoreszenzen sollte eine geeignete Beleuchtungseinrichtung vorgesehen sein. Bei einer Auflichtbeleuchtung sollte für die Trennung des Messlichts vom Anregungslicht ebenfalls ein weiterer dichroitischer Strahlteiler vorgesehen sein.
Das erfindungsgemäße optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem kann als makroskopisches oder mikroskopisches, vergrößerndes System ausgebildet sein. Dabei ist die Ausbildung als mikroskopisches System mit einem vergrößernd abbildenden optischen System bevorzugt. Weiterhin ist insbesondere auch die Ausbildung als Zusatzmodul für Mikroskope, z.B. in Form eines an den Photo strahlengang eines Mikroskops ansetzbaren Moduls bevorzugt.
Zur Justierung der einzelnen Digitalkameras relativ zueinander, so dass beide oder sämtliche Kameras identische Bildbereiche abdecken, sollte eine Digitalkamera - bei mehr als zwei Digitalkameras alle bis auf eine Digitalkameras - zur optischen Achse des zu ihr führenden Teilstrahlengangs justierbar sein. Das optische Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem sollte eine Bildauswerteeinheit zur Kombination der mit verschiedenen Digitalkameras aufgenommenen Bilder aufweisen. Diese Bildauswerteeinheit kann als Personal Computer mit einer geeigneten Auswertesoftware ausgebildet sein. Die Bildauswerteeinheit sollte die Bildung von Quotientenbildern ermöglichen, d.h. von Bildern, deren Helligkeits- und/oder Farbwert an einem Ort dem Quotienten der Helligkeitswerte am gleichen Ort von Teilbildern entsprechen, die mit unterschiedlichen Kameras aufgenommen wurden. Auch die Bildung von Quotienten an unterschiedlichen Orten ist sinnvoll, z.B. um Diffusionsprozesse im aufgenommenen Objekt zu analysieren.
Weiterhin sollte eine Steuereinrichtung zur Aufnahme und Abspeicherung von Bildserien gleichzeitig aufgenommener Bilder vorgesehen sein. Dadurch können Serien bei unterschiedlichen Wellenlängen gleichzeitig aufgenommener Bilder online beobachtet werden. Bei hinreichend schneller Bildverarbeitung können dann auch Quotientenbilder großer Bildfelder online beobachtet werden. Werden die Bildserien abgespeichert, kann die endgültige Auswertung nachträglich anhand von jeweils gleichzeitig aufgenommenen Bildpaaren erfolgen.
Die Aufhahmeparameter, insbesondere z.B. die Belichtungszeiten und ggf. die Empfindlichkeiten der Digitalkameras sind vorzugsweise unabhängig voneinander einstellbar, so daß die Aufnahmebedingungen an unterschiedliche Extinktionen in verschiedenen Spektralbereichen anpassbar sind. Wenn die Kameras unterschiedliche Belichtungszeiten aufweisen, dann ist die Bildwiederholrate durch die Belichtungszeit der Digitalkamera mit der längsten Belichtungszeit bestimmt, so dass die Gleichzeitigkeit der einzelnen Belichtungen beibehalten wird. Entsprechend ist die Steuereinrichtung ausgelegt, dass alle Digitalkameras mit identischer Bildwiederholrate arbeiten, also die Bildwiederholrate an die längste Belichtungszeit gekoppelt ist.
Weitere Einzelheiten der Erfindung werden nachfolgend anhand des in der Figur dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert.
h der Figur ist die Erfindung schematisch in Verbindung mit einem Mikroskop dargestellt. Das Mikroskop weist in üblicher Weise ein Stativ(l) auf, an dem der Objekttisch (2) höhenverstellbar aufgenommen ist. Weiterhin ist oberhalb des Objekttisches (2) am Stativ (1) ein Objektivrevolver (3) zur Aufnahme mehrerer Objektive (5, 6) aufgenommen.
An der Rückseite des Mikroskopstativs ist eine Beleuchtungseinrichtung (7) aufgenommen, die für eine Beleuchtung eines auf dem Objekttisch (2) aufzunehmenden Präparates im Auflicht dient. Das Licht der Auflichtbeleuchtung (7) wird über einen Auflichtbeleuchtungsstrahlengang (4) durch einen Spiegel (8) oberhalb des Objektivrevolvers (3) in Richtung auf das in den Strahlengang eingeschaltete Objektiv (5) umgelenkt. Der Spiegel (8) ist dabei als dichroitischer Strahlteiler ausgebildet, um das von der Auflichtbeleuchtung (7) kommende Licht und das von einer Probe emittierte Fluoreszenzlicht von einander zu trennen.
Oberhalb des Spiegels (8) verläuft der Beobachtungsstrahlengang (18) zunächst in vertikaler Richtung. Durch ein Strahlteilerprisma (9) wird ein Teil des Beobachtungsstrahlenganges in Richtung auf einen Okulartubus (10) ausgespiegelt.
Der vom Strahlteilerprisma (9) nicht ausgespiegelte Teil des Beobachtungsstrahlenganges verläuft weiter in vertikaler Richtung in einen Kameratubus (19) mit zwei Ausgängen. Im Kameratubus (19) ist ein weiterer dichroitischer Strahlteiler (11) aufgenommen, der das Licht des Beobachtungsstrahlenganges wellenlängenabhängig auf die beiden Ausgänge des Kameratubus aufteilt.
An jeden der beiden Ausgänge des Kameratubus (19) ist jeweils eine Digitalkamera (12, 13) angeschlossen. Jede der beiden Digitalkameras (12, 13) hat einen zweidimensionalen Sensorchip und zeichnet dadurch simultan ein zweidimensionales Bildfeld auf. Beide Kameras sind miteinander über eine Synchronisationseinheit synchronisiert. Die Synchronisationseinheit ist dabei als Personal Computer (14) ausgebildet. Um die hinreichend genaue Synchronisation - gemeint ist dabei die Gleichzeitigkeit des Beginns der Belichtung und Bildaufiiahme mit beiden Kameras - sicher zu stellen, sind die Leitungsverbindungen (16, 17) zwischen dem Personal Computer (14) und den beiden Kameras bis auf weniger als 10 % der längeren der beiden Leitungsverbindungen (16, 17) identisch. Dadurch wird sicher gestellt, dass der verbleibende zeitliche Unterschied zwischen dem Beginn der Bildaufzeichnung mit beiden Kameras im Bereich von 50 ns bis 100 ns liegt. Bei Belichtungszeiten der Digitalkameras über Ojl ms ist dann gewährleistet, dass die Synchronisationsgenauigkeit unter 1/1000 der Belichtungszeit liegt.
Der Personal-Computer dient gleichzeitig auch zur Auswertung der mit beiden Kameras (12, 13) aufgenommenen Bilder und zur Darstellung des so synthetisch aus zwei oder mehr gleichzeitig aufgenommenen Bildern erzeugten Bildes auf einem Monitor (15).
Um zu gewährleisten, dass die mit den beiden Kameras (12, 13) aufgenommenen Bilder nicht nur zeitlich sondern auch räumlich überein stimmen, ist eine der Kameras (12) über eine Justiereinheit (20) senkrecht zur optischen Achse (21) des zu ihr führenden Teils des Beobachtungsstrahlenganges mit Sub-Pixelgenauigkeit justierbar. Dadurch wird erreicht, dass die von beiden Kameras (12, 13). abdeckten Bildfelder mit Sub-Pixelgenauigkeit überein stimmen. Ein entsprechender Tubus ist beispielsweise von dem Doppel- Video- Adapter der Anmelderin, der in dem eingangs genannten Prospekt beschrieben ist, bekannt.
Zwischen dem dichroitischen Strahlteiler (11) und den beiden Kameras (12, 13) sind jeweils noch Schieber (22, 23) zum Einschwenken von benötigten Farbfiltern vorgesehen. Dadurch können die bereits aufgeteilten Spektralbereiche vor der Detektion noch weiter eingeengt werden.
Dass zuvor beschriebene System kann beispielsweise zur Ca-Messung durch ein Emission-Ratio wie z.B Indo 1 und Indo 2 dienen. Die Fluoreszenzanregung erfolgt dann bei einer Wellenlänge von 340 nm und die Detektion bei 360 und 380 nm. Der dichroitische Strahlteiler(δ) zur Trennung des Beleuchtungs- und Beobachtungsstrahlenganges hat dann eine Trennimgskante bei einer Wellenlänge von ca. 350 nm und der Strahlteiler (21) zur Aufteilung zwischen beiden Kameras (12, 13) eine Trennungskante bei einer Wellenlänge von 370 nm. Nachfolgend bei der Bildauswertung werden an jedem Ort der aufgenommenen Bilder die Quotienten der Helligkeitsbilder beider Kameras (11, 12) gebildet und daraus ein Bild der Ca- Konzentration als Funktion des Ortes erzeugt. Da beide Bilder gleichzeitig aufgenommen werden, ist gewährleistet, dass der Quotient der Fluoreszenzintensitäten tatsächlich der Konzentration entspricht und nicht durch anderweitige Prozesse bestimmt ist. Eine weitere Anwendung ist FRET, ein weiteres Emissions-Ratio, das jedoch auf einem einzigen Farbstoff, z.B. Chamäleon, basiert. Allerdings erfolgt hier die Anregung bei einer Wellenlänge von 480 nm und die Fluoreszenzdetektion bei 520 und 580 nm. Entsprechend sind die Trennungskanten der dichroitischen Strahlteiler (8, 21) zu wählen, so dass eine Kamera nur die Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 520 nm und die andere Kamera nur die Fluoreszenz bei 580 nm delektiert. Da die Extinktionen der Fluoreszenzen bei den verschiedenen Emissionswellenlängen sehr unterschiedlich sind, sollten für diese Anwendung die Einstellungen beider Kameras, insbesondere die Belichtungszeiten, unabhängig von einander wählbar sein.
Eine weitere Anwendung ist die Colocalisation. Bei dieser Anwendung ist es wichtig, ob zwei Proteine, die z.B. mit FITC und Cy3 unterschiedlich markiert sind, an der selben Stelle lokalisiert sind oder nicht. Durch die Gleichzeitigkeit der Bildaufnahme bei verschiedenen Wellenlängen können Diffusionsprozesse erkannt werden. Da auch bei dieser Anwendung in der Regel die Extinktionen der Fluoreszenzen bei den verschiedenen Emissionswellenlängen sehr unterschiedlich sind, sollten auch für diese Anwendung die Einstellungen beider Kameras unabhängig von einander wählbar sein.
Eine weitere vorteilhafte Anwendung ergibt sich, wenn eine der beiden Kameras eine Farbkamera, z.B. die Farbkamera Axiocam Color von der Anmelderin, und die andere Kamera eine monochrome Kamera, z.B. die Kamera Axiocam Mono, der Anmelderin ist. Mit einem Mikroskop, das sowohl eine Auflichtbeleuchtung für die Fluoreszenzanregung und eine Durchlichtbeleuchtung für eine Abbildung im Differential-Interferenz-Kontrast aufweist, wie die meisten konventionellen Mikroskope, lassen sich dann gleichzeitig z. B Fluoreszenz und Infrarot DIC visualisieren.
Weiterhin ist es möglich, zur Auswahl einer geeigneten Anregungswellenlänge eine breitbandige Lichtquelle mit einem nachgeschalteten Monochromator vor zu sehen. Dadurch wird die mit dem erfindungsgemäßen System mögliche hohe Flexibilität ausgenutzt. Entsprechende Monochromatoren könne z.B. einschwenk- oder einschiebbare auswechselbare Fluoreszenz- Anregungsfilter sein. Die Bildauswerte-Einrichtung kann auch zur Aufnahme sogenannter Mosaikbilder ausgebildet sein, indem mehrere Einzelbilder nachträglich rechnerisch zu einem großen Gesamtbild zusammengesetzt werden, um Übersichtbilder zu erzeugen. Entsprechend ist dann der Objekttisch als motorischere Scanningtisch auszubilden. Durch die gleichzeitige Bildaufiiahme der einzelnen Bilder in getrennten Spektralbereichen, lassen sich dann auch als Summen-, Differenz und Quotientenbilder als Mosaik-Übersichtsbilder darstellen.
Gegenüber Laser-Scan-Mikroskopen hat das erfindungsgemäße System den Vorteil, dass mit jeder Bildaufnahme simultan ein großes Bildfeld aufgenommen wird, das z.B. 1000 * 1000 Pixel oder bei Einsatz hochauflösender Digitalkameras 3900* 3090 Pixel umfassen kann. Außerdem ist das System wesentlich flexibler, da man nicht an spezielle Laserlinien zur Fluoreszenzanregung gebunden ist, sonder aus einer breitbandigen Lichtquelle den für die jeweilige Anwendung günstigen Spektralbereich heraus filtern kann.
Anhand des in den Figuren dargestellten Ausführungsbeispiels wurde die Erfindung am Beispiel eines aufrechten Mikroskopes dargestellt. Sie ist jedoch ebenso gut auch im Verbindung mit einem inversen Mikroskop einsetzbar.

Claims

Patentansprüche :
1. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem mit einem Abbildungsstrahlengang und mindestens zwei Digitalkameras und einem Strahlteiler, der das Licht des Abbildungsstrahlenganges aufteilt und zu den beiden Digitalkameras führt, wobei der Startzeitpunkt der Bildaufiiahme beider Digitalkameras zueinander synchronisiert ist und der Strahlteiler ein dichroitischer Strahlteiler ist.
2. Optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem nach Anspruch 1, wobei für die Synchronisation eine Triggereinrichtung vorgesehen ist.
3. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Synchronisationsgenauigkeit kleiner gleich 1/1000 der kürzesten Belichtungszeit der Digitalkameras ist.
4. Optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem nach Anspruch 3, wobei die Leitungslängen zwischen der Triggereinrichtung und beiden Digitalkameras bis weniger als 10 % der längeren der beiden Leitungslängen identisch sind.
5. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem nach einem der Ansprüche 1 - 4, wobei mindestens eine der Digitalkameras eine hochauflösende monochrome Kamera ist.
6. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem nach einem der Ansprüche 1 - 5, wobei eine Beleuchtungseinrichtung zur Anregung von Fluoreszenz in einem Objekt vorgesehen ist.
7. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem nach Anspruch 6, wobei ein vergrößernd abbildendes optisches System vorgesehen ist.
8. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem nach einem der Ansprüche 1 - 7, wobei eine der Digitalkameras senkrecht zur optischen Achse des zu ihr führenden Teilstrahlengang justierbar ist.
9. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem nach einem der Ansprüche 1 - 8, wobei eine Bildauswerteeinheit zur Kombination der mit den Digitalkameras aufgenommenen Bilder vorgesehen ist.
10. Optisches Bildaufnahme- und Bildauswertesystem nach Anspruch 9, wobei die Bildauswerteeinheit die Bildung von Quotientenbildern ermöglicht.
11. Optisches Bildaufiiahme- und Bildauswertesystem nach Anspruch 10, wobei eine Steuereinrichtung zur Aufnahme und Abspeicherung von Bildserien vorgesehen ist.
PCT/EP2003/001702 2002-03-12 2003-02-20 Optisches bildaufnahme- und bildauswertesystem WO2003077537A1 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
EP03743811A EP1483904B1 (de) 2002-03-12 2003-02-20 Optisches bildaufnahme- und bildauswertesystem
DE50310155T DE50310155D1 (de) 2002-03-12 2003-02-20 Optisches bildaufnahme- und bildauswertesystem
US10/938,654 US7929824B2 (en) 2002-03-12 2004-09-13 Optical image recording and image evaluation system

Applications Claiming Priority (2)

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