WO2003076925A1

WO2003076925A1 - Procede de purification de nucleocide guanine blesse par oxydation, procede de mesure d'un tel nucleocide et dispositif d'analyse destine a ce mode de realisation

Info

Publication number: WO2003076925A1
Application number: PCT/JP2003/003007
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Kasai
Original assignee: Hiroshi Kasai
Priority date: 2002-03-14
Filing date: 2003-03-13
Publication date: 2003-09-18
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Description

明細書酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法、その測定方法、

及びこれらを実施するための分析装置技術分野本発明は、酸化的損傷グァニンヌクレオシド、特に 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（以下、 8 -OH- d Gと略す）の精製方法、その測定方法、及びこれらを実施するための分析装置に関する。背景技術近年、生体内での活性酸素の作用について多くの研究がなされている ₍ 通常、活性酸素は生体内に異物が侵入した際、防御システムとして働いている。しかしながら、食品添加物（発ガン性物質）、大気汚染、喫煙. ストレス等によって過剰に活性酸素が発生すると、それらは D N Aの損傷を引き起こし、酸化的 D N A損傷産物の一種である 8 -〇H- d Gを生成する。この 8 -〇H- d Gは突然変異を誘発し、発癌過程で重要な役割を演じていると考えられている。また、活性酸素は、発癌だけでなく様々な疾患や老化の原因として注目されている。

そのため、生体内における活性酸素量を知ることにより、個人個人の発癌リスク評価や、活性酸素関連の様々な疾患の予測 · 診断、老化度、あるいは一般健康の評価を行うことができる。

しかしながら、生体内における活性酸素は不安定であり、それらを直接検出するのは困難である。そのため、活性酸素の指標として活性酸素によって生成される 8 - OH-d Gを測定することが提案されている。

これまでに報告されている 8- OH-d Gの分析方法は 6種類に大別できる？（ 1 ) 8 -O H-d Gに対する抗体を結合させたァフィ二ティ -力ラムで精製した分画を H P L C- E C Dで分析する方法、 ( 2 ) 3本又は 4本のカラムを接続してカラムスイッチング法により、最終的に 8 - 〇H- d Gを H P L C- E C Dにより検出する方法、（ 3 ) E L I S A法により尿を直接分析する方法、（ 4 ) G C- M S (内部標準物質が必要）による方法、（ 5 ) L C-M S-M S (内部標準物質が必要）による方法、（ 6 ) サンプリングインジェク夕一（一定分画を分取し、攪拌後, 一定量をカラムに注入する装置）を介してマルチファンクションカラム (逆相カラム、陽イオン交換カラムの機能を併せ持つゲル濾過カラム）と、逆相カラムを接続し E CDにより検出する方法が挙げられる。

しかしながら、（ 1 ) の方法は回収率が低いため、尿中濃度を計算するのに放射性の内部標準物質を用いる必要がある。

また、（ 2 ) の方法は前処理が煩雑である。また、バルブ切り替えのタイミングの決定が困難であり、 8 - OH-d Gのピーク付近に夾雑物が出る場合が多い。また、多量の溶離液、洗浄液が必要となるだけではなく、多量の有毒の廃液が生じるため環境面においても好ましくない。また、（ 3 ) の方法は、特異性に問題があり、再現性がよくない。

また、（ 4) および（ 5 ) の方法は、測定機器が高価であり経済的に好ましくなく、さらに回収率が不安定なため内部標準物質を必要とするが、それらは入手困難なものである。

また、（ 6 ) の方法は、一検体あたりの分析時間が 1 6 5分と長く、連続運転による大量処理が困難である。さらに、クロマトグラフィーによる分析の際、 8 -〇H- d Gのピークに重なるような夾雑物が検出される確率が高い。そのため、いずれの方法においても測定の精度が不十分である。本発明は、高精度で、再現性があり、且つ経済性および環境面に配慮した酸化的損傷グァニンヌクレオシド、特に 8 -0 H-d Gの精製方法、その測定方法、及びこれらを実施するための分析装置を提供することを目的とする。発明の開示本発明者は、陰イオン交換カラムを用いることにより 8 - OH- d G、 8 -ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（以下、 8 -〇H- r G u oと略す）等の酸化的損傷グァニンヌクレオシドを特異的に吸着 · 回収できることを見出した。更に、 8 - 0 H- d Gにおいては、 8 -〇H- r G u oを内部標準マーカ一として用いることにより 8 -〇H_d Gを正確に分取できること、その結果、 8 -〇H- d Gを高精度で、且つ再現性よく測定でき、さらに経済性および環境面にも優れていることを見出し、本発明を完成した。

即ち、本発明の酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法は、 D N A又は R N A中のグァニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法であって、試料中に含まれる酸化的損傷グァニンヌクレオシドを陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第 1の精製工程を有することを特徴とする。また、上記酸化的損傷グァニンヌクレオシドが 8 - OH- d Gであることが好ましい。本発明の 8 - OH-d Gの精製方法は、試料中に含まれる 8 -ヒドロキシデォキシグァノシン（ 8 - OH- d G) の精製方法であって、予め、試料に 8 -ヒドロキシグアノシン（リポヌクレオシド）（ 8 -〇H- r G u o) を 8 -〇H- d Gの内部標準マ一力一として加えて、精製を行うことを特徴とする。本発明の 8 -〇H- d Gの精製方法は、試料中に含まれる 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 -OH- d G) の精製方法であって、予め、試料に 8 -ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド）（ 8 -OH- r G u 0 ) を加えて、該試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製する第 1 の精製工程と、第 1の精製工程で得られた 8 -〇H-d Gを含有する画分を逆相クロマトグラフィーによって更に精製する第 2の精製ェ程とを有することを特徴とする。また、上記酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法において、試料が尿であることが好ましい。また、上記 8 -〇H- d Gの精製方法において、試料が尿であることが好ましい。本発明の酸化的損傷グァニンヌクレオシドの測定方法は、更に、上記精製方法によって得られた精製酸化的損傷グァニンヌクレオシドを測定する測定工程を有することを特徴とする。本発明の 8 - OH-d Gの測定方法は、更に、上記精製方法によって得られた精製 8 -0 H-d Gを測定する測定工程を有することを特徴とする。また本発明の 8 -OH-d Gの測定方法は、前記精製 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 - O H - d G) の測定が、陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて（ 1 ) リボヌクレオシド 8 -0 H- r G u 0のピ一ク認識、（ 2 ) —定時間後の 8 -0 H - d G分取開始、（ 3 ) —定時間後の 8 - .0 H- d G分取終了、（ 4 ) 適宜、 8 -OH- d G分画のミキシング、の順序で行われ、ついで、逆相カラムへ注入して行われることを特徴とするものである。

本発明の分析装置は、 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 - OH- d G) の精製および測定を実施するための装置であって、

試料中に含まれる 8 - OH-d Gを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（H P L C— 1 ) と、

8 -ヒドロキシグアノシン（リポヌクレオシド）（ 8 -OH- r G u 0 ) の溶出位置を感知する UV検出器と、陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) から得られた 8 -〇H- d Gを含有する画分を更に精製する逆相カラム（H P L C-2 ) と、逆相カラム（H P L C- 2 ) から得られた精製 8 -OH- d Gを測定する検出器とを具備することを特徴とする。

本発明の制御プログラムは、試料中に含まれる 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン ( 8 - OH-d G) をカラムクロマトグラフィーにより回収する処理を制御するためのプログラムであって、予め試料中に加えておいたマーカ一（ 8 - OH- r Guo) のピークシグナルを UV検出器より受け、一定時間後の 8 -OH-d G溶出時にサンプラーに接続されたバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、次いで、得られた 8 -OH-d G分画を第二の精製カラムへ注入するためのシグナルを出力し、カラムから溶出する被検出物質 ( 8 -0 H-d G) を精製 ' 回収する処理をコンピュータに行わせることを特徴とする。図面の簡単な説明図 1は、 8 - OH- d Gの精製、測定を実施するための装置の一実施形態を示す模式図である。

図 2は、 8 〇H- d Gの精製、測定を実施するための装置の一実施形態を示す模式図である。

図 3は、陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) による尿と 8 -OH - d Gと 8 - OH- r G u oとの混合物の分離パターンの一例であり、マーカ一の位置確認を示す。

図 4は、陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) によるヒト尿の分離パターンの一例を示す。

図 5は、逆相カラム（H P L C- 2 ) によるヒト尿の分離パターンの一例を示す。

図 6は、陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) によるヒト尿の分離パ夕一ンの一例を示す。

図 7は、逆相カラム（H P L C-2 ) によるヒト尿の分離パターンの一例を示す。

図 8は、逆相カラム（H P L C-2 ) によるラット尿の分離パターンの一例を示す。

図 9は、逆相カラム（H P L C- 2 ) によるラット尿の分離パターンの一例を示す。符号の説明

1 1 陰イオン交換カラム（H P L C- 1 )

1 2 逆相力ラム（H P L C-2 )

1 3 検出器

1 4 UV検出器

1 5 スィッチングバルブ

1 6 スィツチングバルブ

1 7 オートサンプラー

2 7 サンプリングインジェクター発明を実施するための最良の形態本発明は、生体内における活性酸素量を評価するために、その指標となる酸化的損傷グァニンヌクレオシド、特に 8 -0 H - d Gを精度よく測定するための精製方法、その測定方法およびこれらを実施するための分析装置である。

8 - OH- d Gをはじめ酸化的損傷ヌクレオシドとは、生体内の活性酸素（酸素ラジカル）等によって D NAや RNAが損傷を受けた結果生じるものであり、活性酸素の指標として用いられる。 8 - ΟΗ-d G以外の酸化的損傷ヌクレオシドとしては、 2 -ヒドロキシデォキシアデノシン ( 2 -0 H-d A) 、 5 -ヒドロキシデォキシシチジン（ 5 - OH - d C) 5 -ホルミルデォキシゥリジン ( 5 -C H O-d U) 、 8 - OH - l- G u o 等が挙げられる。これら酸化的損傷ヌクレオシドは、不要物として尿により生体外へ排出される。また、これらのうち 8 -OH- d G、 8 - OH- r G u o等の酸化的損傷グァニンヌクレオシドは負の電荷を帯びているため、後段で説明する陰イオン交換カラムにより容易に精製、回収することができる。これらの中でも活性酸素の指標として、特に 8 -〇H-d Gを用いることが好ましい。なお、本明細書における酸化的損傷グァニンヌクレオシドとは、 D N A又は R N A中のグァニンが活性酸素によつて損傷を受けた結果生じるものであり、酸化的損傷とはヒドロキシ,ル化されることを示す。

本発明の酸化的損傷グァニンヌクレオシド（ 8 -OH- d Gを含む）の精製方法、及び測定方法に使用される試料としては、尿、血清、髄液、唾液、細胞培養後の培地等、全ての生体試料を挙げることができる。これらの中でも、尿は採取し易く、また尿中で酸化的損傷グァニンヌクレオシドは安定であるため、特に尿が好ましい。

以下、本発明の精製方法、測定方法、及びこれらを実施するための分析装置について、 8 - OH- d Gに則して説明する。

本発明の実施形態に係る 8 -0 H-d Gの精製及び測定を実施するための装置は、 8 -〇H-d Gを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) と、 8 - O H- d Gの溶出位置の指標となる 8 - O H- r G u o を感知する UV検出器と、陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) から得られた 8 -〇H- d Gを含有する画分を更に精製する逆相力ラム（H P L C- 2 ) と、逆相カラム（H P L C- 2 ) から得られた精製 8 -〇H- d G を測定する検出器を具備する。図 1は、分析装置の一例を示す模式図である。図中符号 1 1は陰ィオン交換力ラム（H P L C- 1 ) であり、 U V検出器 1 4、カラムスイッチングバルブ 1 6 を介して、逆相カラム (H P L C-2 ) 1 2 と接続している。また、陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) 1 1の上流には、試料を注入するォー 1、サンプラー 1 7が接続された力ラムスィツチングバルブ 1 5が接続している。

また、カラムに吸着した分子を溶出するための溶離液（陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) 1 1 に用いられる溶離液を A液、逆相カラム (H P L C- 2 ) 1 2に用いられる溶離液を B液とする）、上記カラムスイツチングバルブ 1 5に接続されたガードカラム（陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) 1 1 と同一の陰イオン交換樹脂を充填）を洗浄するための洗浄液（C液）を各カラムに送り込むためのポンプ 2 1、 2 2、 2 3が設けられ、ポンプ 2 1はオートサンプラー 1 7、ポンプ 2 2は力ラムスイッチングバルブ 1 6、ポンプ 2 3はカラムスイッチングバルブ 1 5に各々接続されている。

なお、図 1 において、オートサンプラー 1 7の代わりに、 8 -〇H - r G u oのピーク感知により、カラムスイッチングバルブ 1 6を自動的に作動させる機能を持つサンプリングインジェクター ( Γ 2 3 1 X L J 、ギルソン製）等を用いることができる。

なお、この方法を実施するために'、 2 3 1 XLに新たなプログラムを搭載して測定を行った。このプログラムは、（ 1 ) リポヌクレオシド 8 - O H - r G u oのピーク認識、（ 2 ) —定時間後の 8 - O H - d G分取開始、（ 3 ) —定時間後の 8 -0 H-d G分取終了、（ 4 ) H P L C- 2への注入を行うものである（図 6を参照）。より詳しくは、以下のフローにより機能を実現している。 ( 1 ) 2 3 1 XLにより試料を HPLC-1に注入する。

( 2 ) 設定時間（T1) だけシステムを待機させる。

( 3 ) 2 3 1 XLが UV検出器シグナルのモニタ一を開始する。

( 4 ) 設定 UVレベルを超える (ピーク感知) まで、システムを待機させる。

( 5 ) ピーク感知後、設定時間（T2) だけシステムを待機させた後、バルブへ接点信号を出力し、ループ内に分取を開始する。

( 6 ) 設定時間（T3) 後、バルブへ接点信号を出力し、分取を終了させると同時にループ内の分画を HPLC- 2に注入する。

後段でも説明するが、サンプリングインジェクター（「 2 3 1 X L」、ギルソン製）によれば、 8 - O H- r G u oとの相対的位置により自動的に 8 _〇 H- d Gの分取範囲（時間）が決定されるため、予め、 8 - O H - d Gの分取範囲（時間）を設定しておく必要がない。

上記陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) 1 1 は、試料中に含まれる 8 -〇H-d Gを特異的に吸着するので回収率が非常に高く、且つほとんどの夾雑物を取り除くことができるため、不純物の少ない画分を得ることができる。また、上述したように、陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) 1 1 によれば、負の電荷を帯びている 8 -〇H - l- G u o等の酸化的損傷グァニンヌクレオシドにおいても、容易に精製、回収することができる。陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) 1 1 としては、陰イオン交換樹脂を充填剤としたものであれば、特に制限はない。具体的な充填剤としては、スチレンジビニルベンゼン系ポリマ一に 4級アンモニゥム基が結合したもの、ポリヒドロキシメタクリレート系ポリマーに 4級アンモニゥム基が結合したもの等が挙げられる。また、市販品の充填剤としては、アミネックス H P X- 7 2 S (BioRad製）、 S h o d e xカラム充填剤（昭和電工（株）製）、 MCI GEL CA08F (三菱化成（株）製、ハミルトン RCX- 10) 等を挙げることができる。

また、陰イオン交換樹脂の粒子径としては、 7 ~ 1 2 m程度であることが好ましい。

上記陰ィオン交換樹脂を充填する力ラムの内径は、特に制限はないが、約 l mm〜 l . 5 mm程度であることが好ましい。また、カラムの内径が 2 . 0 〜 4. 6 mmの場合は、図 2に示すように、カラムスィッチングバルブ 1 6に接続したサンプリングインジェクター 2 7 ( 「 2 3 3 X L」、ギルソン製等）を用いて 8 -〇H-d Gを含有する画分を自動的に逆相カラム（H P L C - 2 ) 1 2に注入することが好ましい。なお、この方法を実施するために、 2 3 3 XLに新たなプログラムを搭載して測定を行った。このプログラムは、 ( 1 ) リポヌクレオシド 8 -〇 H- r G u 0のピーク認識、（ 2 ) —定時間後の 8 -O H- d G分取開始、（ 3 ) — 定時間後の 8 - O H- d G分取終了、（ 4) 8 - O H- d G分画のミキシング、（ 5 ) H P L C- 2への注入を行うものであるが、より詳しくは以下のフローにより機能を実現している。

( 1 ) 2 3 3 XLにより試料を HPLC-1に注入する。

( 2 ) 設定時間（T1)だけシステムを待機させる。

( 3 ) 2 3 3 XLが UV検出器シグナルのモニターを開始する。

( 4 ) 設定 UVレベルを超える（ピーク感知）まで、システムを待機させる。

( 5 ) ピーク感知後、設定時間（T2) だけシステムを待機させた後、 2 3 3 XLバイアルチューブ内に分取を開始する。

( 6 ) 設定時間（T3) 後、分取を終了させる。

( 7 ) 得られた分画を吸引、吐出により撹拌する。

( 8 ) 分画の一部を HPLC- 2に注入する。

上記陰イオン交換樹脂を充填するカラムの長さは、特に制限はないが. 陰イオン交換樹脂の粒子径、交換容量等によって、カラムを短くすることが可能であり、分析時間を短縮することができる。

上記 UV検出器 1 4は、陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) 1 1から溶出される画分をモニターし、試料中に含まれる 8 _〇H- r G u oの溶出位置を感知する。このように、 8 - O H- r G u oの溶出位置を U V 検出器 1 4でモニタ一することによって、正確な 8 - OH-d Gの溶出時間が把握でき、それに合わせてカラムスイッチングバルブ 1 6 を作動させることにより、確実に 8 -0 H- d Gを含有する画分を分取することができる。

上記逆相カラム（H P L C- 2 ) 1 2は、陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) 1 1から得られた 8 -OH-d Gを含有する画分を更に精製するものであり、逆相カラムの性質を有するものであれば、特に制限はない。市販品としては、 YMC-Pack ODS-AM (S- 5 ^ m) (YMC社）、 Shise ido Capcel 1 Pac C18 MG (S- 5 ^ m) ( (株）資生堂製）等が挙げられる。

上記検出器 1 3は、逆相カラム（H P L C- 2 ) から得られた精製 8 - 〇H- d Gを測定するものであり、逆相カラム（H P L C- 2 ) 1 2の下流に設けられている。上記検出器 1 3 としては、電気化学検出器（E C D) 、液体クロマトグラフィー質量分析装置（L CM S ) 等を用いることができる。また、上記電気化学検出器（E C D) に関しては、 2種類の設定電圧を選ぶことにより、 8 - OH- d Gのピークは固有の比率で表れるため、そのピークが 8 -OH-d Gであることを確認できる。

また、本発明の実施形態に係る 8 -OH-d Gの精製及び測定を実施するための分析装置は、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することが可能である。その場合、ガードカラム 3 5の洗い洗浄液（C液）は、 0. 5 M硫酸アンモニゥム：ァセトニトリル = 7 ： 3程度の組成であることが好ましい。

以上説明したように、本発明の実施形態に係る 8 -0 H-d Gの分析装置によれば、陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) 1 1が試料中に含まれる 8 -OH- d Gを特異的に吸着し、試料中に含まれる夾雑物の大半を一度に取り除くことができる。また、 UV検出器 1 4によって、 8 -〇 H- r G u oの溶出位置に基づき、確実に精製 8 -0 H-d Gを分取でき、回収率、再現性に優れているといえる。また、連続運転を行うことにより大量の試料を処理することができる。また、上述した分析装置は比較的安価なため経済性にも優れている。

以下、図 1 に示す分析装置を用いて 8 -〇H- d Gの精製方法及び測定方法の説明をする。（分取範囲（時間）の決定） 8 -〇H-d Gと 8 - O H- r G u oと尿との混合物を図 1示す分析装置に注入し、予め、 8 -〇 H-cl Gの分取範囲を決定しておく。図 3は、 8 -〇 H- d Gと 8 -〇 H- r G u oと尿との混合物の分離パターンの一例であり、 8 -〇H- d Gの内部標準マ一カーとなる 8 -〇H- r G u oの位置確認を示す。このように、分取範囲を予め決定しておくことにより、 8 -〇H-d Gの正確な溶出時間が把握でき、それに合わせて力ラムスィツチングバルブ 1 6を作動させるように設定することで、確実に 8 - OH-d Gを含有する画分を分取することができる。なお、上述したように、図 1 において、オートサンプラー 1 7の代わりに、サンプリングインジェクター（ 2 3 1 XL) を用いた場合は、ピーク感知により 8 -OH-r G u oとの相対的位置により自動的に 8 -OH- d Gの分取範囲（時間）が決定されるため、分取範囲（時間）の設定をしておく必要がない。

(精製方法）

本発明の 8 - OH- d Gの精製方法は、試料を陰イオン交換クロマトグラフィ一によって精製する第 1の ίき製工程を有することを特徴とする。また、上述したように、 8 - OH- d Gのみならず、 8 - OH- r G u o等の負の電荷を有する酸化的損傷グァニンヌクレオシドにおいても、陰ィオン交換クロマトグラフィーによって容易に精製、回収することができる。

第 1 の精製工程における溶出条件としては、カラム温度は 6 0〜 6 5 °C、内径 l mmのカラムの場合、流速が l Y S O z l Zminとすることが好ましい。

また、本発明の 8 - OH-d Gの精製方法は、予め、試料に 8 -0 H - r G u oを 8 -〇H-d Gの内部標準マ一カーとして加えて、精製を行うことが好ましい。 8 -OH- r G u oを試料中に予め添加しておくと、 8 - O H- r G u oが溶出された後、一定時間後に 8 - O H - d Gが溶出されるため、 8 -〇H-r G u oの溶出位置を UV検出器 1 4でモニターすることによって、正確な 8 - OH- d Gの溶出位置（時間）が把握でき、確実に 8 -〇H- d Gを含有する画分を分取することができる。また、本発明の 8 -OH-d Gの精製方法は、予め、試料に 8 - OH-r G u oを 8 -〇H- d Gの内部標準マーカ一として加えて、陰イオン交換クロマトグラフィーによる第 1の精製工程を行い、第 1の精製工程で得られた 8 - OH- d Gを含有する画分を更に精製すること（第 2の精製ェ程）が好ましい。 '

上記第 2の精製工程としては、逆相ク口マトグラフィ一により精製することが好ましい。逆相クロマトグラフィーに用いられる溶出液（ B 液）、温度条件等は、使用する逆相カラム（H P L C- 2 ) 1 2 によつて異なるため、それらは適宜決定される。例えば、逆相カラムとして、 YMC-Pack ODS-AM (S- 5 u rn) (YMC社）を用いてヒト尿を分析する場合は、カラム温度が約 4 0 ° ( 、流速が 0. 9 ml/min程度とすることが好ましい。

(測定方法）

本発明の測定方法は、上述した精製方法によって得られた精製 8 -〇 H-d Gの量を測定する測定工程を有し、上述した電気化学検出器（E C D) 、液体クロマトグラフィー質量分析装置（L CM S ) 等を用いて精製 8 -〇H- d G量を測定できる。なお、上記測定方法は、 8 - OH-cl Gのみならず、 8 -OH- r G u o等の精製酸化的損傷グァニンヌクレオシドの測定にも適用できる。

また、連続運転を行う場合、図 1 に示すようなオートサンプラー 1 7 を具備した装置においても、図 2に示すようなサンプリングインジェクター 2 7 を具備した装置においても、定期的に 8 -0 H-d Gの溶出位置をチェックすることが好ましい。

以上説明したように、本発明の酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法によれば、精製酸化的損傷グァニンヌクレオシドを回収率良く得られる。更に、第 1 の精製工程における陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) の流速が微量であるため、溶離液（A液、 B液）、洗浄液（C 液）の消費が極めて少なく、精製後の廃液量も少量で済むため、環境保全の面からも好ましい。本発明の 8 - OH-d Gの精製方法によれば、確実に精製 8 -〇H- d Gを分取でき、 8 -〇H- d Gのピーク付近において夾雑物がほとんどない画分を得ることができる。また、連続運転を行つても、 8 -〇H- r G u oピーク感知により、サンプル毎の分取範囲のズレに対応して、確実に 8 -〇H_d Gを含有する画分を分取することができる。また、本発明の測定方法は、上記精製方法によって得られた精製 8 -〇H- d G又は 8 - OH-r G u o等の精製酸化的損傷グァニンヌクレオシドを測定するので、非常に精度が高く、再現性を有する。

なお、本発明の技術範囲は、上記実施形態に限定されるものではなく . 本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更を加えることが可能である。例えば、溶離液（A液、 B液）、洗浄液（C液）の組成等は、使用するカラム（充填剤）により適宜変更可能である。

本発明の酸化的損傷グァニンヌクレオシドの測定方法は、例えば、個人個人の発癌リスクの評価、活性酸素関連の様々な疾患（糖尿病等）の予測 ' 診断、老化度、あるいは一般的健康の評価に用いることができる上記測定方法により得られた結果の評価方法として、例えば 8 - O H - d Gの場合、 8 -0 H- d G標準溶液を随時、尿試料の他に分析装置に注入し、そのピーク面積との比較により算出された試料中の 8 -OH-d G 濃度をクレアチニンなどの標準物質の濃度で割った値、あるいは 2 4時間分の尿中の 8- OH-d G量として算出する。実施例以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

(実施例 1 )

〈尿試料 1の調製〉

ヒトの尿を l m 1 ずつ 2本のエツペンドルフチューブに取り、 - 2 0 °Cで凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その 1 0 0 1 を取り、微酸性溶液（組成； 0. 6 mM硫酸を 9 6 m 1 、ァセトニトリル 4 m l ) で 2倍に希釈し、 8 -0 H- d G及び 8 -〇 H- 1- G u oを各 1 2 ^ g加えた。更に 2 M酢酸ナトリウム（ pH4. 5 ) を 6. 7 1 加え、 pHを 7以下にした。これをよく攪拌した後、 1 5 0 0 0回転、 5分間遠心分離を行い、その上清を尿試料 1 とした。

上記のように調製した尿試料 1 を 1 0 1 陰イオン交換カラム（充填剤（Bio Rad製）の粒径 1 2 xm、内径 1 mm、ガードカラムの長さ 4 c m、本カラムの長さ 1 2 c m) によって精製した。この分離パターンを図 3に示す。なお、この分離パターンは、 UV検出器（「UV- 8 0 2 0」、東ソ一製）（吸光波長 2 5 4 nm) を用いて検出した。

図 3に示すように、 8 - OH_d Gは、 8 -OH-r G u oの溶出から一定の時間差を置いて溶出された。そのため、 8 -〇 H- r G u oの溶出をモニターすることにより、正確な 8 - OH- d Gの溶出位置を把握でき、確実に 8 -〇H- d Gを有する画分を得ることが可能である。

(実施例 2 )

〈尿試料 2の調製〉

ヒ卜の尿を 1 m 1 ずつ 2本のエツペンドルフチューブに取り、 - 2 0 °Cで凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その 1 0 0 1 を取り、微酸性溶液（組成； 0. 6 mM硫酸を 9 6 m 1、ァセトニトリル 4 m l ) で 2倍に希釈し、 8 - OH- r G u o l 2 /z g加えた。更に 2 M酢酸ナトリウム（ pH4. 5 ) を 6. 7 l 加え、 pHを 7以下にした。これをよく攪拌した後、 1 5 0 0 0回転、 5分間遠心分離を行い. その上清を尿試料 2とした。

〈陰イオン交換クロマトグラフィ一による精製〉

陰イオン交換カラムを用いて、ヒトの尿試料 2の精製を行い、 8 - 0 H-d Gを含有する画分（ 3 4〜 4 1分）を得た。なお、 0. 3 mM硫酸、 2 %ァセトニトリル溶離液（ A液）を用い、カラム温度は 6 5 °C、 3007

11 流速は 1 7 1 /m i nとした。このときの分離パターンを図 4に示す _c なお、上記陰イオン交換カラムは、アミネックス H P X- 7 2 Sカラム

(Bio Rad製）（ 3 0 0 X 7. 8 mm、粒径 1 2 /i m、架橋度 8 %、 su lfate型）の充填剤を内径 l mmのカラム（ガードカラムの長さ 4 c m、本カラムの長さ 1 2 c m) に詰めかえて作製したものである。また、この分離パターンは、 UV検出器（「UV- 8 0 2 0」、東ソー製）（吸光波長 2 5 4 n m) を用いて検出した。

〈逆相クロマトグラフィ一による精製〉

陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た 8 -OH-d Gを含有する画分（ 3 4〜 4 1分） 1 1 9 1 を自動的に逆相クロマトグラフィーに注入した。なお、逆相カラムとして、 Shiseido Capcel 1 Pak C18 M G ( S - 5 m) ( 2 5 0 X 4. 6 mm) を用い、 l O mMリン酸緩衝液

( H 6. 7 ；これは 0. 1 Mリン酸緩衝液（ pH6. 7 ) を希釈して調製したものであり、 pHは多少異なる）、 5 %M e OH溶離液（ B液）を用い、カラム温度は 4 0 ° (：、流速 0. 8 m 1 Z m i nとした。その分離パターンを図 5 に示す。なお、この分離パターンは、電気化学検出器

( TESA Coulochem II」、 e s a社）（電圧：ガードセル 3 5 0 m V ；チャンネル 1 、 1 5 0 m V；チャンネル 2、 3 0 O mV)を用いて検出した。'

(実施例 3 )

< イオン交換クロマトグラフィ一による精製〉

ヒト尿試料 2のほかの分離例を図 6 に示す。ヒト尿試料 2 を 2 0 I 注入した。分離条件は、カラム MCI GEL CA08F ( 7 m) ；内径 1 . 5 mm、長さ（ガードカラム） 5 c m、（本カラム） 1 5 c m ; 温度、 6 5 °C ; 流速、 3 6 1 /分；溶離液、 0. 3 mM硫酸、 2 %ァセトニトリル（A液）であり、 UV検出器（「UV- 8020」、東ソー製）（吸光波長 254 nm) を用いて検出した。

(実施例 4)

く逆相ク口マトグラフィ一による精製〉

陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た 8 -〇H-d Gを含有する画分を逆相ク口マトグラフィ一により分析した他の例を図 7 に'示す。なお、逆相カラムとして、 YMC- Pack 0DS-AM ( S - 5 m) ( 2 5 0 X 4. 6 mm) を用い、 1 0 mMリン酸緩衝液（ ρ Η 7. 2 ; これは 0 . 1 M リン酸緩衝液（ ΡΗ7. 2 ) を希釈して調製したものであり、 pHは多少異なる）、 5 %M e〇H溶離液（B液）を用い、力ラム温度は 4 0 、流速 0. 9 m 1 /m i n とした。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（「ESA

Coulochem II」、 e s a社）（電圧：ガ一ドセル 3 5 0 m V ；チャンネル 1、 1 5 0 mV；チャンネル 2、 3 0 0 mV)を用いて検出した。

図 5及び図 7から明らかなように、上述した方法によれば、精製 8 - 〇H- d Gのピーク付近には夾雑物がなく、 8 -〇 H-d Gの測定の精度に (実施例 5 )

〈尿試料 3の調製〉

ラットの尿を l m 1 ずつ 2本のエツペンドルフチューブに取り、 - 2 0 °Cで凍結した。凍結した尿を解凍して均一な液とした後、その 1 0 0 1 を取り、微酸性溶液（組成； 0. 6 mM硫酸を 9 6 m 1 、ァセトニトリル 4 m 1 ) で 2倍に希釈し、 8 -0 H- r G u o 1 2 g加えた。更に 2 M酢酸ナトリウム（ pH4. 5 ) を 6. 7 l ilQえ、 pHを 7以下にした。これをよく攪拌した後、 1 5 0 0 0回転、 5分間遠心分離を行い，その上清を尿試料 3 とした。

〈陰イオン交換クロマトグラフィ一による精製〉陰イオン交換カラムを用いて、ラットの尿試料 3の精製を行い、 8 - O H- d Gを含有する画分を得た。なお、 0. 3 mM硫酸、 2 %ァセトニトリル溶離液（A液）を用い、カラム温度は 6 5 °C、流速は 1 7 〃 1 / m i nとした。また、上記陰イオン交換カラムは、アミネックス H P X- 7 2 Sカラム（Bio Ra d製）（ 3 0 0 X 7. 8 mm、粒径 1 2 m、架橋度 8 %、 sulfate型）の充填剤を内径 1 mmのカラム（ガードカラムの長さ 5 c m、本カラムの長さ 1 5 c m) に詰めかえて作製したものである。

〈逆相ク口マトグラフィ一による精製〉

上記陰イオン交換クロマトグラフィーにより得た 8 -〇H-d Gを含有する画分を自動的に逆相力ラムに注入し分析した。その分離パターンを図 8 に示す。なお、逆相カラムとして、 YMC- Pack 0DS-AM ( S - 5 m) ( 3 0 0 X 4. 6 mm) を用い、 1 0 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 2 ; これは 0. 1 Mリン酸緩衝液（ pH7. 2 ) を希釈して調製したものであり、 pHは多少異なる）、 5 %M e OH溶離液（B液）を用い、力ラム温度は 4 0 °C、流速 0. 9 m l /m i nとした。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（「ESA Coulochem II」、 e s a社）（電圧：ガードセル 3 5 0 m V ；チャンネル 1、 1 5 0 mV；チャンネル 2. 3 0 0 m V)を用いて検出した。

(実施例 6 )

ラット尿の陰イオン交換クロマトグラフィー（MCI、 7 m粒子）により得た 8 - OH-d Gを含有する画分を逆相クロマトグラフィーにより分析したほかの例を図 9に示す。尚、逆相カラムとして、 Shiseido Capce 11 Pak C18 MG (S-5 m) (250 X 4. 6 mm) を用い、 l O mMリン酸緩衝液（ pH6. 0 ; これは 0. 1 Mリン酸緩衝液（ pH6. 0 ) を希釈して調製したものであり、 pHは多少異なる）、 2 %MeOH溶液を用い、カラム温度は、 4 6 °C、流速 0. 7 5 m l /分とした。なお、この分離パターンは、電気化学検出器（ESA Coulochem II, ESA社）（電圧：ガ —ドセル 4 0 0 mV ; チャンネル 1、 2 8 0 mV ; チャンネル 2、 3 5 0 mV) を用いて検出した。

図 8及び図 9から明らかなように、ラットの尿試料 3 においても、 8 -〇 H - d Gの測定が可能であった。 TJP03/03007

13 産業上の利用性本発明の陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製方法は、 8 - O H - d G、 8 -O H- r G u o等の酸化的損傷グァニンヌクレオシドを回収率良く、精製 · 回収できる。

また、特に 8 - O H-d Gの精製においては、予め、試料に 8 - OH - r G u 0を 8 -OH- d Gの内部標準マーカ一として加えることにより、正確な 8 -〇 H - d Gの溶出時間が把握でき、確実に 8 -〇 H - d Gを含有する画分を分取することができる。更に、第 1の精製工程における陰ィォン交換カラム（H P L C- 1 ) の流速が微量であるため、溶離液（A 液）、洗浄液（C液）の消費が極めて少なく、精製後の廃液量も少量で済むため、環境保全の面からも好ましい。また、本発明の測定方法は、上記精製方法によって得られた精製 8 -OH_d G、又は 8 - OH- r G u o等の精製酸化的損傷グァニンヌクレオシドを測定するので、非常に精度が高く、再現性を有する。本発明の 8 - OH- d Gの分析装置によれば陰イオン交換カラム（H P L C- 1 ) が、試料中に含まれる 8 -OH - d Gを特異的に吸着するため回収率が非常に高く、試料中にふくまれる夾雑物を一度に取り除くことができる。また、連続運転を行うことによつて大量処理が可能である。また、この分析装置は比較的安価なため、経済性にも優れている。

Claims

請求の範囲

1. D N A又は R N A中のグァニンが損傷を受けた結果生じる酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法であって、試料中に含まれる酸化的損傷グァニンヌクレオシドを陰イオン交換クロマトグラフィ一によって精製する第 1の精製工程を有することを特徴とする酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法。

2. 前記酸化的損傷グァニンヌクレオシドが、 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 - OH-d G) であることを特徴とする請求項 1記載の酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法。

3. 試料中に含まれる 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 - OH-d G) の精製方法であって、予め、試料に 8 -ヒドロキシグアノシン（リポヌクレオシド）（ 8 - OH-r G u o ) を 8 -0 H- d Gの内部標準マ一カーとして加えて、精製を行うことを特徴とする 8 -〇H-d Gの精製方法。

4. 試料中に含まれる 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 -〇H - d G) の精製方法であって、予め、試料に 8 -ヒドロキシグアノシン（リボヌクレオシド） ( 8 - O H - r G u o ) を加えて、該試料を陰イオン交換クロマトグラフィ一によって精製する第 1の精製工程と、第 1の精製工程で得られた 8 -OH-d Gを含有する画分を逆相ク口マトグラフィーによって更に精製する第 2の精製工程とを有することを特徴とする 8 - OH-d Gの精製方法。

5. 前記試料が尿であることを特徴とする請求項 1又は 2に記載の酸化的損傷グァニンヌクレオシドの精製方法。

6. 前記試料が尿であることを特徴とする請求項 3又は 4に記載の 8 - ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8- OH-d G) の精製方法。

7. 更に、請求項 1、 2又は 5記載の精製方法によって得られた酸化的損傷グァニンヌクレオシドを測定する測定工程を有することを特徴とする酸化的損傷グァニンヌクレオシドの測定方法。

8. 請求項 3、 4又は 6記載の精製方法によって得られた精製 8 -ヒド口キシデォキシグアノシン（ 8 - OH- d G) を測定する測定工程を有することを特徴とする 8- OH-d Gの測定方法。

9. 前記精製 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 -〇H- d G) の測定が、陰イオン交換クロマトグラフィ一において ( 1 ) リポヌクレオシド 8 - OH- r G u oのピーク認識、

( 2 ) —定時間後の 8 -OH- d G分取開始、

( 3 ) 一定時間後の 8 - OH- d G分取終了、

( 4) 適宜、 8 - OH- d G分画のミキシング、

の順序で行われ、ついで、

逆相カラムへ注入して行われることを特徴とする請求項 8に記載の 8 - 〇H-d Gの測定方法。

1 0. 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 -〇H- d G) の精製および測定を実施するための装置であって、

試料中に含まれる 8 -OH-d Gを特異的に吸着する陰イオン交換カラム（H P L C— 1 ) と、

8 -ヒドロキシグアノシン (リポヌクレオシド） ( 8 - O H - r G u o ) の溶出位置を感知する UV検出器と、陰イオン交換カラム（H P L C - 1 ) から得られた 8 -〇H- d Gを含有する画分を更に精製する逆相カラム（H P L C- 2 ) と、逆相カラム（H P L C- 2 ) から得られた精製 8 -〇H- d Gを測定する検出器とを具備することを特徴とする分析装

1 1. 試料中に含まれる 8 -ヒドロキシデォキシグアノシン（ 8 - 0 H - d G) をカラムクロマトグラフィーにより回収する処理を制御するためのプログラムであって、

予め試料中に加えておいたマーカ一（ 8 _〇H- r Guo) のピ一クシグナルを UV検出器より受け、一定時間後の 8 -〇H- d G溶出時にサンブラ一に接続されたバルブを開くシグナルを出力し、分取を開始し、更に一定時間後に分取終了シグナルを出力し、

次いで、得られた 8 - O H- d G分画を第二の精製力ラムへ注入するためのシグナルを出力し、カラムから溶出する被検出物質（ 8 - OH-d G) を精製 · 回収する処理

をコンピュータに行われるための制御プログラム。