WO2003076622A1

WO2003076622A1 - PRESYNAPTIC PROTEIN p120

Info

Publication number: WO2003076622A1
Application number: PCT/JP2003/002718
Authority: WO
Inventors: Toshihisa Ohtsuka; Etsuko Rikitsu; Marie Inoue; Eiji Inoue
Original assignee: Eisai Co., Ltd.
Priority date: 2002-03-08
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2003-09-18
Also published as: EP1482039A1; EP1482039A4; US7695920B2; US7297773B2; AU2003211819A1; US20040171810A1; KR100746141B1; CA2478016C; KR20040093112A; IL163733A0; CA2478016A1; JPWO2003076622A1; US20090087842A1; JP4187249B2

Description

明細書プレシナプス蛋白 pl20 技術分野

本発明は、シナプス細胞骨格に結び付いている新規な蛋白質に関するものであり、医学の分野で利用される。背景技術

神経シナプスの postsynaptic density (PSD)には、 PSD- 95などの scaf f oldin g moleculeや神経伝達物質受容体が数多く存在し、 PSDの形成と構造維持に重要な役割を果たしている。また、前シナプスの active zoneを構成する細胞骨格

(CAZ: Cytomatrix at Active Zone) には、 Bassoonや RIMなどの細胞骨格蛋白質が存在し、 active zoneの形成と構造維持に重要な役割を果たしている。神経シナプス間の効率よいシグナノレ伝達は学習や記憶の形成や維持に極めて重要であり、その破たんが各種精神疾患や神経変性疾患を引き起こすことは容易に想像できる。

ハエや線虫などを用いた解析から、これまで、神経細胞の軸索誘導の分子機構 (pathfinding) については、関与する分子群が数多く同定され一定の理解が進みっつある。しかし、その後のシナプス开成（synaptogenesis) にいたつては、時間的にまた空間的にどのような分子が関与し、成熟したシナプス結合が形成されていくのかについては依然不明な点が多い。発明の開示

本発明が解決しようとする課題は、シナプスが形成される過程で重要な役割を果たすと考えられる、新規な細胞骨格に結び付いている蛋白質を探し出すことにある。

本発明者らは、シナプス結合に濃縮している蛋白質を同定する目的で、ラット大脳から粗膜 (P2) 分画おょぴ PSD分画を調製し、尿素を含むバッファーで可溶化した。次いで、これら可溶化したサンプルを陰イオン交換カラムにかけて分離し、各溶出フラクションを電気泳動後染色して粗膜 (P2) 分画および PSD分画のパンドパターンを比較した。パンドパターンから PSD分画により濃縮している蛋白質を同定し、質量分析によりデータベースにヒットしない 2つの蛋白質（p500 蛋白及ぴ pl20蛋白）を見出した。（以下、 pl20蛋白という記載は本発明の蛋白質を示す。 )

これらをアミノ酸解析にかけたところ、 pl20蛋白由来の 4つのペプチド配列は KIM0378蛋白質の内部配列に一致し、更なる研究の結果、 pl20蛋白がシナプスのみに分布し細胞骨格に強く結合していることが明らかとなつた。また pl20 力シナプス可塑性において重要なはたらきをしている RIM1 (Castillo et al. , ature. 415 : 327-330， 2002;、 Schoch et al. , Nature. 415 : 321-326, 2002) を、シナプスに局在させるための足場蛋白質として機能していることも明らかとなった。

すなわち本発明は、

1 . 下記（a ) 又は（b ) の蛋白質。

( a ) 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。

( b ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質。

2 . 1に記載の蛋白質をコードする DNA。

3 . 配列番号 1に示す塩基配列を有する 2に記載の DNA。

4 . 下記（a ) 又は（b ) の DM。

( a ) 配列番号 1に示す塩基配列を有する DNA。

( b ) 配列番号 1に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシナプスに局在する蛋白質をコードする DNA₀

5. 下記（a) 又は（b) の DNA。

( a ) 配列番号 1に示す塩基配列を有する DNA。

(b) 配列番号 1に示す塩基配列と相同性が 90%以上の塩基配列を有し、かつシナブスに局在する蛋白質をコードする DNA。

6. 4〜5のいずれか 1項に記載の DNAがコードする蛋白質。

7. 2〜 5のいずれか 1項に記載の DMを含む組換えベクター。

8. 2〜 5のいずれか 1項に記載の DNAにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。

9. 8記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したシナプスに局在する蛋白質を培養物から採取することを含む、シナプスに局在する蛋白質の製造法

10. 1あるいは 6に記載の蛋白質と反応する抗体。

11. 10に記載の抗体を使用することを特徴とする、 1あるいは 6に記載の蛋白質を測定する方法。

12. 配列番号 1に示す塩基配列の少なくとも 15個の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、プライマーまたはプローブとして使用することを特徴とする、 1あるいは 6に記載の蛋白質をコードする DNAまたは RNAを測定する方法。

13. 10に記載の抗体を用いて、 1あるいは 6に記載の蛋白質を検出する方法。

14. 以下の工程、

(1) 9に記載の方法により製造した 1あるいは 6に記載の蛋白質、あるいは 8に記載の形質転換体と、被検物質を混合する工程、

(2)結合した、あるいは結合しなかった被検物質の量を測定する工程、を含んで成る、 1あるいは 6に記載の蛋白質と反応性を有する物質をスクリー二ングする方法。

1 5 . 以下の工程、

(1) 1あるいは 6に記載の蛋白質を発現している細胞に被検物質を添加し培養する工程、

(2)細胞に発現している 1あるいは 6に記載の蛋白質、あるいは該蛋白質をコードする mRNAを測定する工程、

を含んで成る、 1あるいは 6に記載の蛋白質の発現に影響を与える物質をスクリ一ユングする方法。

1 6 . 以下の工程、

(1) 1あるいは 6に記載の蛋白質の発現を制御するプロモータ領域を同定するェ程、

(2)被検物質がプロモータ活性に及ぼす影響を測定する工程、

1 7 . 以下の工程、

(2) 1あるいは 6に記載の蛋白質の分布を測定する工程、

を含んで成る、 1あるいは 6に記載の蛋白質の分布に影響を与える物質をスクリ一ユングする方法。

に関する。

以下、本発明を詳細に説明する。 '

本発明の蛋白質のうち、配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質は、後述の実施例に記載したように、シナプスに局在する蛋白質として特定された蛋白質である。一方、神経科学の分野では、例えばある蛋白質がシナプスに存在することを証明する場合、シナプスに存在することがすでに判明している蛋白質をシナブスのマーカーとして利用することが一般的である。また、シナプスの構造変化と疾患との関連性が知られている (Purpura, D. P. (1974) Dendritic spine〃d ysgenesis and mental retardation Science 186， 1126—128 ;、 Geinisman, Y.， de Toledo- Morrell, F. , Persina, I. S.， and Rossi, M. (1992) . Age-related loss of axospious stnapses formed by two afterent systems in the rat de ntate gyrus as revealed by the unoiased stereological dissector techniqu e. Hippocampus 2, 437-444) 。従って、本発明の蛋白質ゃ該蛋白質をコードする DNAは、シナプスのマーカーとして、研究または診断分野において利用できると考えられる。

蛋白質には同一の機能を有する変異体の存在が予測され、また、蛋白質のアミノ酸配列を適宜改変することによって、同一の機能を有する変異体を得ることができる。従って、配列番号 2に示すアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質も本発明の蛋白質に包含される。

蛋白質のアミノ酸配列の改変は、部位特異的変異誘発法などの周知の手段により蛋白質をコードする DNAの塩基配列を改変し、塩基配列が改変された DNAを発現させることによって行うことができる。シナプスに局在することは、当業者であれば蛍光抗体法により容易に確認できる。

本発明の蛋白質は、ダルタチオントランスフェラーゼ（GST) や Hisタグ、 GFP と融合させることにより融合蛋白質とされてもよく、融合蛋白を用いて局在を確認することもできる。

本発明の DNAは、本発明の蛋白質をコードする DNAである。本発明の DNAとしては、配列番号 1に示す塩基配列を有する DNAが挙げられる。この DMは後述の実施例において、塩基配列が決定された DNAである。遺伝子には、同一の産物をコードするが塩基配列の異なる遺伝子や、同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子の存在が予測され、また、塩基配列の改変により、同一の産物や同一の機能を有する変異体をコードする遺伝子を得ることができる。従って、本発明の DNAには、配列番号 1に示す塩基配列に類似する塩基配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質をコードする DNAも包含される。このような DNAが由来する生物としては、ヒト、ラット、マウス、線虫等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に線虫は、神経系の研究に関して、極めて有用なモデル生物である。本蛋白質が線虫に存在していることはすでに明らかになつている（Ohts uka T， et. al, J Cell Biol. 2002 5 ; 158 (3) : 577- 90参照) 。

類似の塩基配列を有する DNAとしては、配列番号 1に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズする DNA、または、配列番号 1または配列番号 3に示す塩基配列と相同性が 90%以上、好ましくは 95%以上、より好ましくは 98°/₀以上、さらに好ましくは 99%以上の塩基配列を有する DNAが挙げられる。

ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば 65。C 4 SSCにおけるハイブリダイゼーション、次いで 65°Cで 1時間 0. 1 X SSC中での洗浄である。また別法としてストリンジェントな条件は、 50%ホルムァミド中 42°C 4 X SSCである。また、 PerfectHyb™ (T0Y0B0) 溶液中 65°C2. 5時間ハイプリダイゼーシヨン、次いで 1) . 2xSSC, 0. 05% SDS溶液： 25°C5分、 2) · 2xSSC, 0. 05% SDS溶液： 25°C15 分、 3) . 0. 1xSSC, 0. 1% SDS溶液 50°C20分の洗浄といった条件も許される。

また相同性は、 ClustalW法により計算される相同性である。

本発明の DNAは、その一部をプライマーまたはプローブとして用いることにより、 pl20蛋白遺伝子解析や遺伝子の発現の解析に利用することができる。さらに、本発明の DNAは、その一部をプライマーまたはプローブとして用いることにより、シナプスの検出に使用できる。すなわち、本発明の DNAは、シナプスを検出するための研究用もしくは診断用の試薬またはキットとして利用できる。本発明のキットには、本発明の DNAの他に、 pl20のぺプチド断片をコードする DNA が含まれてもよい。該 pl20のぺプチド断片としては、 pl20と RIM1の結合を阻害可能な断片、例えば pl20と RIM1との結合に必要な 3つのアミノ酸 I を含む pl20の C末 10アミノ酸程度を有する断片が挙げられるが、これに限定されるものではない。

本発明において、「一部」とは、プライマーまたはプローブとして使用するォリゴヌクレオチドが本発明の DNA配列をもとに少なくとも 10個の対応する塩基配列を含むものからなり、好ましくは少なくとも 15個の塩基配列、さらに好ましくは少なくとも約 20〜30個の塩基配列を含むものからなる対応するポリヌクレオチドを意味する。またプローブとしては、さらに高分子のもの、全 DNAも使用することができる。

本発明の DNAは、明らかにされた塩基配列に基づき常法により得ることができる。例えば、化学合成法により合成してもよいし、適宜設定されたプライマーを用いて、神経細胞や脳組織から調整された mRNAか RT - PCR法により得ても良い。遺子操作法は成書 (Man i at is et al. , Molecular Cloing:A Laboratory Manu al, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) に記載されている方法に従って行うことができる。

本発明のベクターとしては、揷入した DNAを安定に保持するものであれば特に制限されず、例えば宿主に大腸菌を用いるのであれば、クローニング用ベクターとしては pBluescriptベクター (Stratagene社製）などが好ましい。本発明の蛋白質を生産する目的においてベクターを用いる場合には、特に発現ベクターが有用である。発現ベクターとしては、試験管内、大腸菌内、培養細胞内、生物個体内で蛋白質を発現するベクターであれば特に制限されないが、例えば、試験管内発現であれば pBESTベクター（プロメガ社製）、大腸菌であれば _PETベクター（ Invitrogen社製）、培養細胞であれば pME18S-FL3ベクター（GenBank Accessio n No. AB009864) 、生物個体であれば pME18Sベクター（Mol Cell Biol. 8 : 466 - 472 (1988) ) などが好ましい。ベクターへの本発明の DNAの揷入は、常法により、例えば、制限酵素サイトを用いたリガーゼ反応により行うことができる（Curr ent protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Section 11. 4-11. 11) 。

本発明の形質転換体は、本発明の DNAにより宿主を形質転換して得られる形質転換体であり、本発明の蛋白質を発現する。本発明のベクターが導入される宿主としては特に制限はなく、目的に応じて種々の宿主が用いられる。蛋白質を発現させるための宿主としては、例えば、細菌細胞（例：ストレプトコッカス、スタフイロコッカス、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌）、真菌細胞（例：酵母、ァスペルギルス）、昆虫細胞（例：ドロソフイラ S2、スポドプテラ SF9) 、動物細胞（例： CH0、 C0S、 HeLa、 C127、 3T3、 BHK、腿293、 Bowes メラノーマ細胞) および植物細胞を例示することができる。宿主細胞へのベクター導入は、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法（Current protocols in Molecul ar Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons. Secti on 9. 1-9. 9) 、リポフエクタミン法（GIBC0 - BRL社製）、マイクロインジェクション法などの公知の方法で行うことが可能である。

本発明の製造法は、本発明のシナプスに局在する蛋白質の製造法であり、本発明の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したシナプスに局在する蛋白質を培養物から採取することを含む。

培養は、形質転換体が本発明の蛋白質を発現する条件で行えばよく、培養物からの本発明の蛋白質の採取は、蛋白質の精製に通常に用いられる、種々のクロマトグラフィー、電気泳動、ゲルろ過などの方法を適宜組み合わせて行えばよい。本発明の蛋白質を GSTや Hisタグとの融合蛋白質として発現させる場合には、それぞれグルタチオンセファロースカラムやニッケルセファロースカラムを用いて精製することが可能である。精製された蛋白質は、例えば、抗体の製造に利用でさる。

本発明の P120蛋白の全部または一部をェピトープとして用いることで、抗体を製造できる。製された抗体を用いることで、当業者に周知の方法、例えば実施例 4に記載の方法により、シナプスを検出することが可能である。すなわち、本発明の抗体は、シナプスを検出するための研究用もしくは診断用の試薬またはキットとして利用できる。本発明のキットには、本発明の抗体の他に、 pl20のペプチド断片が含まれてもよい。

本発明において、ェピトープとは、ポリペプチドの抗原決定基を意味し、一般に少なくとも 6個のアミノ酸で構成され、 6個のアミノ酸で構成されるポリぺプチドが抗体と結合することは公知である（公表特許公報 60 - 500684号）。本蛋白質の抗原ペプチドは、本発明のアミノ酸配列に基づいて、連続してなる少なくとも 6個のアミノ酸、好ましくは連続してなる少なくとも 8個のアミノ酸、より好ましくは連続してなる少なくとも約 15個のアミノ酸、さらに好ましくは連続してなる少なくとも約 20個のアミノ酸からなるポリペプチドを意味する。

本発明の抗体は、本発明の製造法により得られる本発明の蛋白質を免疫した動物から得ることができる。ポリクローナル抗体であれば上記免疫動物の血清より、モノクローナル抗体であれば上記免疫動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、本発明の蛋白質に強い特異性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより調製される。

免疫抗原としては、本発明の製造法により得られる本発明の蛋白質を用いることができる。また別法として、免疫抗原は、配列番号 2に示すアミノ酸配列から適宜選択した部分構造を有するフラグメントあるいはペプチドであってもよい。抗原とキャリア蛋白の複合体の調製は種々の縮合剤を用いることができるが、グルタルアルデヒド、カルポジイミド、マレイミド活性エステル等が使用できる。キャリア蛋白は牛血清アルブミン、サイログロブリン、へモシァニン等の常用されているものでよく、通常 1〜5倍量の割合でカツプリングさせる方法が用いられる。

免疫される動物としてはマウス、ラット、ゥサギ、モルモット、ハムスターなどがあげられ、接種方法は皮下、筋肉あるいは腹腔内に投与される。投与に際しては完全フロイントアジュバンドゃ不完全フロイントアジュパンドと混和して投与してもよく、投与は通常 2〜5週毎に 1回ずつ行われる。免疫された動物の脾臓あるいはリンパ節から得られた抗体産生細胞は骨髄腫細胞と細胞融合させられハイプリドーマとして単離される。骨髄重細胞としてはマウス、ラット、ヒト等由来のものが使用され、抗体産生細胞と同種由来のものであることが好ましいが、異種間においても可能な場合もある。

細胞融合の操作は既知の方法、たとえばケーラーとミルスタインの方法（Natu re, 256, 495, 19,75) に従い実施できる。融合促進剤としてはポリエチレンダリコールやセンダイウィルスなどが挙げられるが、通常 20〜50%程度の濃度のポリエチレングリコール（平均分子量 1000〜4000) を用いて 20〜40°C、好ましくは 30〜37°Cの温度下、抗体産生細胞数と骨髄腫細胞数の比は通常 1 ： 1〜： 10 : 1 程度、約 1〜10分間程度反応させることにより細胞融合を実施することができる抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の免疫化学的方法が使用できる。たとえば、本発明の蛋白質をコートしたマイクロプレートを用いる ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 法、几免投クロブリン抗体 ¾：コートしたマイクロプレートを用いる EIA (Enzyme immunoassay) 法、本発明の蛋白質を含むサンプルを電気泳動後-トロセルロース転写膜を用いるィムノプロット法などがあげられる。

このようなゥエルから更に例えば限界希釈法によってクローユングを行ヽク口ーンを得る。ハイプリドーマの選別、育種は通常 HAT (ヒポキサンチン、ァミノプテリン、チミジン）を添加して、 10〜20%牛胎児血清を含む動物細胞用培地（例、 RPMI1640) で行われる。このようにして得られたクローンはあらかじめプリスタンを投与した SCIDマウスの腹腔内へ移植し、 10〜： L4日後にモノクローナル抗体を高濃度に含む腹水を採取し、抗体精製の原料とすることができる。また、該クローンを培養し、その培養物を抗体精製の原料とすることもできる。モノクローナル抗体の回収は免疫グロプリンの精製法として既知の方法を用いればよく

、たとえば、硫安分画法、 PEG分画法、エタノール分画法、陰イオン交換体の利用、さらにァフィ-ティクロマトグラフィーなどの手段により容易に達成することができる。

本発明によって得られたモノクローナル抗体を用いる免疫学的方法により生体試料中の本発明の蛋白質の定性、定量を行うことができる。免疫学的方法としては、生体試料を必要に応じて適切に処理、たとえば細胞の分離、抽出操作などした試料について、免疫組織染色法、酵素免疫測定法、凝集法、競合法、サンドィツチ法など既知の方法を適用することができる。免疫組織染色法は、例えば標識化抗体を用ヽる直接法、該抗体に対する抗体の標識化されたものを用いる間接法などにより行い得る。標識化剤としては蛍光物質、放射性物質、酵素、金属、色素など公知の標識物質はいずれも使用できる。

本発明のモノクローナル抗体は Fc，あるいは Fc領域を除去した Fal)，あるいは Fab画分、あるいはその重合体を用いてもよい。またそのキメラ抗体、ヒト化抗体であってもよい。

本発明の蛋白質の発現に影響を与える薬剤のスクリーニングは以下のように実施できる。

本発明の蛋白質を発現する細胞株を、ノーザンプロッティング · RT - PCR等により選択する。また、上に述べた方法により得られた抗体を用いて蛍光抗体法 · 酵素抗体法等により選択しても良い。

選択した細胞を被験薬剤の存在下に培養し、 mRNA発現量をノーザンプロッテイング ·スロットプロットハイブリダィゼーシヨン ' RT- PCR等により、あるいは発現量を蛍光抗体法 ·酵素抗体法等により定量し、被験薬剤の本発明の蛋白質の発現に対する影響を測定する。

また、より容易に大量の薬剤をスクリ一二ングできるように以下のような工夫をしても良い。ヒト DNAライブラリーより、本発明の蛋白質の cDNA 5'領域とハィプリダイズするクローンを選び出し、適当なプロモータースクリーユングシステムに挿入してプロモーター活性を持ったクローンを選択する。場合によっては、ここでプロモータ一活性に必須の領域を絞り込んでも良い。

ここで選択した本発明の蛋白質のプロモータ一領域を持つた DNAを、活性の測定が容易な酵素、例えばルシフェラーゼ ·アルカリフォスファターゼなどをコードする DNAの上流に揷入してレポーター遺伝子を構築する。このレポーター遺伝子を Nee/, hyg¹"などの適当な耐性遺伝子と共に培養が可能な細胞、例えば HeLa 細胞等に導入後、耐性遺伝子に対応した薬剤で選択し、本発明の蛋白質を発現させるプロモーターの活性を測定できる細胞株を確立する。この細胞株に薬剤を作用させて導入した酵素の活性を測定し、本発明の蛋白質の発現に影響を与える薬剤のスクリーユングを実施する。

別のスクリーニング系として、本発明の蛋白質の細胞内局在に影響を与える化合物の選択に利用することができる。スクリーニング法の一例として、本発明の蛋白質を発現する細胞株または本発明の形質転換体を、上に述べた方法により得られた抗体を用いて蛍光抗体法 ·酵素抗体法等により染色して、顕微鏡下に観察して、被験薬剤の本発明の蛋白質の細胞内局在に対する影響を測定する。たとえば、実施例 3および 6に記載した方法に準ずることができる。

さらに、別のスクリーニング系として、本発明の蛋白質と結合するィ匕合物の選択に利用することができる。結合する化合物は本発明の蛋白質の機能に影響を与える可能性を有し、また実施例に示されるように本発明の蛋白質の分布に外分泌腺特異性が見られることから、本発明の蛋白質に対する結合能に特異性を有する化合物であれば、臓器特異的な作用を発現する可能性がある。さらに、本発明の蛋白質と結合する化合物は、シナプスの検出に利用できる。例えば、被検体に標識ィ匕した該化合物を接触または投与することによって、シナプスを検出することができる。このように本発明は、シナプスを検出するための研究用または診断用試薬をスクリーニングする方法もまた提供する。スクリーユング法の一例として、本発明の形質転換体またはその細胞骨格あるいは単離された本発明の蛋白質またはその部分ペプチドなどが使用される。適切な条件下で、本発明の蛋白質と試験化合物とを反応させ両者の結合の有無を測定すればよい。測定手法は例えば標識物質を適宜利用することにより測定することができる。

なお、本発明が構造解析した P120蛋白はラット由来であるが、本発明の pl20 蛋白遺伝子解析方法およぴスクリーユング方法はヒト由来の pl20蛋白を使用した場合も本発明の範囲に含まれるものである。図面の簡単な説明

図 1は、 P2および PSD分画の MonoQ陰イオン交換カラム溶出フラクションの電気泳動後パンドパターンを示す写真である。 P120は PSD分画特異的に認められた。

図 2は、 A： pl20アミノ酸配列中の coiled- coil ドメイン， B ： pl20 cDNAよりゥサギ網状赤血球抽出液で発現させた P120蛋白、及び内在性 pl20蛋白と電気泳動を示す図おょぴ写真である。 cDNAより発現させた pl20は内在性 pl20と同じ移動度を示した。

図 3は、 A： pl20蛋白の臓器分布、 B ：細胞各分画中の pl20蛋白の分布、 C ：非イオン性界面活性剤及びイオン性界面活性剤による P120の可溶化を示す写真である。 pl20はシナプスに分布し、細胞骨格に強く結合していると考えられた。

図 4は、 A：抗 pl20抗体及ぴ抗 synaptotagmin I抗体によるマウス海馬領域の免疫組織染色、 B ：抗 pl20抗体、抗 bassoon抗体または抗 PS- 95抗体によるラット海馬初代培養神経細胞の免疫組織染色、 C：抗 pl20抗体によるシナプスの免疫電顕像を示す写真である。

図 5は、 A：抗 pl20抗体により免疫沈降した pl20， bassoon, RIM1、 B ：抗 b T JP03/02718

- 1 4 - assoon抗体により免疫沈降した _P120， bassoon, RIM1を示す写寘である。 pl20 は bassoon, RIM1と共に免疫沈降し、互いに結合活性を有すると考えられた。図 6は、 A： pl20の各ドメインと共に免疫沈降する RIM1、 B ： RIM1の各ドメインと共に免疫沈降する P120を示す図および写真である。 pl20は、その C末端のドメインで、 RIM1の PDZ ドメインと結合していると考えられた。

図 7は、 pl20全体と RIM1との結合活性の有無を示す図である。

図 8は、 RIM1との結合活性を持たない pl20 (pl20-2) と EGFPの融合蛋白の分布を示す写真である。 pl20は RIM1との結合活性とは無関係にシナプス active z oneに分布し 7こ。

図 9は、 RIM1全体（RIM1) 、 PDZ ドメインを欠失した RIM1 (RIM1 ΔΝ) 、 RIM1 の PDZ ドメイン（RIM1 PDZ) と Mycの融合蛋白の分布を示す写真である。 RIM1 がシナプス active zoneに分布するためには、 PDZ ドメインが必要であった。発明を実施するための最良の形態

以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。

[実施例 1 ] pl20蛋白をコードする DNAのクローユング

シナプス結合に濃縮している蛋白質を同定する目的で、ラット大脳から粗膜 (P 2)分画おょぴ PSD分画をショ糖密度勾配遠心法（Cohen et al. , J. Cell Biol. 74: 181-203 1977) によって調製し、各分画を尿素を含むバッファーで可溶化した。次に、これら可溶化したサンプルをそれぞれ Mono Q陰イオン交換カラム（フアルマシア社製）にかけて分離した。 P2および PSD分画の各溶出フラクションを電気泳動後染色し、パンドのパターンを比較し、 PSD分画により濃縮してる蛋白質を 20個同定した。これらのいくつかを図 1に示す。

質量分析により、 20個の蛋白質のうちほとんどはシナプスに局在することがすでに報告されているものであつたが、うち 2つが質量分析のデータベースにヒットしなかった（p500蛋白おょぴ pl20蛋白：図 1参照）。

次に、これらをアミノ酸解析にかけたところ、 p500蛋白由来の 2つのべプチド配列が CAZ蛋白質である piccoloの内部配列に一致した。また、 pl20由来の 4 つのべプチド配列は KIM0378蛋白質の内部配列に一致した。 KIM0378についてはその部分シークェンスが登録されているものの、機能も未知の蛋白であることから、 pl20についてさらに解析を進めた。

登録してある KIM0378の cDNAをかずさ DNA研究所の長瀬博士より分与していただき、これをもとに配列番号 3及び 4に記載のプライマーを設計し、 PCRにてプローブを作製した。本プローブを用いて、ラット海馬の cDNAライプラリーをスクリーニングし、 10個以上のクローンを得た。これらのうち、最も長い配列を含む 2つのクローンをつなげて全長とした。その塩基配列を配列番号 1に、予測されるアミノ酸配列を配列番号 2に記載した。

cDNAにコードされている蛋白質は 957アミノ酸からなり、いくつかの coiled - coil ドメインを有していた（図 2A) 。特に知られているドメイン構造は有していなかつたが、 C末端領域にヒスチジンの繰り返し配列が存在した。クローニングした cDNAが本来精製してきた pl20蛋白の全長のアミノ酸をコードしていることを確かめるために、 cDNAを発現ベクターに組み込み、 mRNAを抽出してゥサギの網状赤血球抽出液を用いて発現させた（プロメガ社製）。実施例 2で作製した抗体は内在性の _P120蛋白とも反応し、 cDNAがコードする蛋白質は内在性の pl20 蛋白と電気泳動上ほぼ同じ移動度を示した（図 2B) 。以上の結果より、本 cDNA が pl20蛋白の全長のアミノ酸をコードしていると結論した。

[実施例 2 ] pl20蛋白に対する抗体の作製

_P120蛋白に対するゥサギポリクローナル抗体を作製した。抗体は配列番号 2 の 183〜380のァミノ酸を Glutathione S- transferase (GST) に融合させた融合蛋白をコードする遺伝子を発現ベクターに組み込んで、大腸菌（JM109) に導入し、発現させた融合蛋白質をダルタチオンセファロースカラムで精製後、ゥサギ T JP03/02718

- 1 6 - に免疫して pl20蛋白に対する抗体を作製した。

[実施例 3 ] pl20蛋白の分布の生化学的検討

最初に P120蛋白の各臓器での分布を検討した。プロテアーゼインヒビターを含む PBS溶液でラットを還流し、各種臓器を取り出した。テフロンホモジナイザ一もしくはポリトロンホモジナイザーで各臓器を破砕し、ホモジネートを調製した。蛋白質定量の後、それぞれ 20 /z gのホモジネートを電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に転写後、上記抗 pl20抗体を用いてウェスタンプロットを行った。脳のホモジネートに約 120 kDaのパンドが検出された（図 3 A) 。心臓、脾臓、肺、骨格筋、腎臓および精巣にはパンドは検出されず、 P120は脳に特異的に発現していることが示唆された。

次いで、脳における細胞内の局在について検討した。 Subcellular fractionat ion法 (Cohen et al. , J. Cell Biol. 74: 181 - 203 1977) により分離した膜分画を電気泳動後、抗 pl20抗体でウェスタンプロットを行った。 pl20蛋白はコントロールとした NMDAレセプターと同様に PSD分画に濃縮していた（図 3 B) 。 pl20蛋白を各種の界面活性剤を用いて可溶化する実験を行った。 P2分画を CH APS、 NP40、 Triton X-100、 SDSもしくは DOCにて室温で 30分処理した。各サンプルを超遠心（100, 000 xg) にかけ、上清と沈澱に分けた。等量の上清と沈澱を電気泳動にかけ、抗 ρ120抗体を用いてウェスタンプロットを行った。

ρ120蛋白は非イオン性の界面活性剤である CHAPS、 NP40および Triton X - 100 では可溶ィ匕されず、沈澱に回収された（図 3 C) 。しかし、イオン性の界面活性剤である SDSおよび D0Cで可溶化され上清に回収された。以上の結果より、 pl20 蛋白はシナプス結合に局在しその細胞骨格に強く結合していることが示唆された

[実施例 4 ] pl20蛋白の組織分布

上記の生化学的データは P120がシナプス蛋白質であることを示唆するものであつたので、実際の組織においてもシナプスに局在するかどうかを検討した。 03 02718

- 1 7 - 抗 pl20抗体を用い、プレシナプスのシナプス小胞蛋白質 synaptotagmin Iをコントロールとして、マウス海馬領域の免疫組織染色を行った。 pl20のシグナルは海馬の CA3と呼ばれる領域に最も強く見られた（図 4A) 。この領域は stra turn lucidumとよばれ、 mossy fiberの神経終末と錐体細胞の樹状突起がシナプスを形成している領域であり、 P120がシナプスに局在することが示唆された。ラット海馬初代培養神経細胞を用いて、 pl20のシナプスへの局在を更に検討した。 Embryonic day 19のラット大脳から海馬を取り出し、トリプシンで細胞を処理したあと、 B - 27培地（ギブコ社製）で培養した。培養 21 日目の細胞を 4% パラフオルムアルデヒドで固定し、 0. 2% Triton X- 100で処理し、抗 pl20抗体と抗 bassoon抗体または抗 PS - 95抗体を同時に細胞とィンキュベーションして、その後 2次抗体でそれぞれの蛋白質の局在を検出した。 pl20は bassoonおよび P S - 95と共に樹状突起にそってシナプスパターンの像を示し（図 4 B) 、 _P120はシナプスに局在することが強く示唆された。

更に免疫電子顕微鏡を用いた解析から、 P120は海馬 CA3領域のプレシナプスの act ive zoneに極めて近レ、ところに局在することが明らかとなった（図 4 C)。

[実施例 5 ] pl20の結合蛋白質の同定

active zoneにおける pl20の機能を解析する目的で、 _P120に結合する蛋白質の同定を試みた。

P120の抗体を用いて P2分画の免疫沈降実験を行ったところ、 active zone蛋白質である RIMlおよび bassoonが共沈してきた（図 5 ) 。 bassoonは分子量が 4 00万以上あり、生化学的解析が困難であるため、 RIM1との結合についてさらに解析を行った。

RIM1は 1997年に、低分子量 G蛋白質 Rab3Aの標的蛋白質として単離されたが、その機能については不明であった（Wang et al.， Nature. 388 : 593-598, 1997 ) 。最近、 RIM1のノックアウトマウスが報告され、 RIM1がシナプス可塑性において極めて重要なはたらきをしていることが明らかとなったが、当初予想されていたような active zone形成には関与していなかった（Castillo et al. , Natur e. 415 : 327-330, 2002;、 Schoch et al. , Nature. 415 : 321—326， 2002) 。

それぞれの GST融合蛋白質を作成し、お互いの結合ドメインの決定を行ったところ、 RIM1の PDZ ドメインと P120の C末が直接結合することが明らかとなり（図 6 ) 、特に、最後の IWA (Ile-Trp-Ala) のアミノ酸が結合に必須であった。以上の結果から、 pl20が active zoneでの RIMlの足場蛋白質として機能していることが示唆された。

最後に、ラット海馬初代培養神経細胞を用いて、 pl20が RIM1の実際に神経細胞において、足場蛋白質として機能するか否かを検討した。 pl20および RIM1を神経細胞に共発現させたところ、シナプスのマーカー蛋白質である synaptophys inと共局在した（図 7およぴ図 8 ) 。 pl20を単独で発現させた場合も、同様の結果が得られ、また、 RIM1と結合することができない C末の IWAアミノ酸を欠失させたミュータント pl20もシナプスに局在することができた。従って、 P120 のシナプスへの局在には RIMlを必要としないことが明らかとなった。

次に RIM1のシナプスへの局在に pl20が必要か否かについて検討を行った。 RI Ml単独を発現させた場合、 bassoonと共局在した（図 9 ) 。しかし、 pl20との結合に必要な PDZ ドメィンを欠失したミュータントはシナプスに局在することができず、一方で、 PDZ ドメインは pl20を共発現させると、両者はシナプスで、 b assoonと共局在した。以上の結果から、 RIM1はその PDZ ドメインを介して pl²0 の IWA配列と結合することにより、シナプスに局在することが明らかとなつた。本研究で、われわれは pl20が RIM1の局在をきめる重要な active zone蛋白質であることを明らかにした。このような active zone蛋白質間の相互作用に基づいた分子複合体の形成は、 active zone形成の分子基盤に大きく寄与しているのではないかと考えられる。産業上の利用の可能性シナプスに局在し細胞骨格に強く結合している P120蛋白をコードする mRNA及ぴ pl20蛋白の検出 .定量が可能となった。更に pl20が、 RIM1をシナプスに局在させるための足場として機能し、 active zone形成の分子基盤として寄与していることが明らかとなった。また、本発明によって、シナプスの検出に利用できるマーカー、プローブ、および抗体が提供できるようになった。さらに、本発明によって、シナプスの検出に利用できる化合物のスクリーニング方法が提供できるようになった。

Claims

請求の範囲

I. 下記（a) 又は（b) の蛋白質。

(a) 配列番号 2に示すアミノ酸配列を有する蛋白質。

( ) 配列番号 2に示すァミノ酸配列において 1もしくは数個のァミノ酸が欠失置換もしくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつシナプスに局在する蛋白質。

2. 請求項 1に記載の蛋白質をコードする DNA。

3. 配列番号 1に示す塩基配列を有する請求項 2に記載の DNA。

4. 下記（a) 又は（b) の DNA。

( a ) 配列番号 1に示す塩基配列を有する DNA。

(b) 配列番号 1に示す塩基配列に相補的な塩基配列を有する DNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつシナプスに局在する蛋白質をコードする

5. 下記（a) 又は（b) の DNA。

( a ) 配列番号 1に示す塩基配列を有する DNA。

6. 請求項 4〜 5のいずれか 1項に記載の DNAがコードする蛋白質。

7. 請求項 2〜 5のいずれか 1項に記載の DNAを含む組換えベクター。

8. 請求項 2〜 5のいずれか 1項に記載の DNAにより宿主を形質転換して得られる形質転換体。

9. 請求項 8記載の形質転換体を培養し、該形質転換体が発現したシナプスに局在する蛋白質を培養物から採取することを含む、シナプスに局在する蛋白質の製造法。

10. 請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質と反応する抗体。

I I. 請求項 10に記載の抗体を使用することを特徴とする、請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質を測定する方法。

1 2 . 配列番号 1に示す塩基配列の少なくとも 15個の連続する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを、プライマーまたはプローブとして使用することを特徴とする、請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質をコードする DNAまたは R NAを測定する方法。

1 3 . 請求項 1 0に記載の抗体を用いて、請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質を検出する方法。

1 4. 以下の工程、

(1)請求項 9に記載の方法により製造した請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質、あるいは請求項 8に記載の形質転換体と、被検物質を混合する工程、

(2)結合した、あるいは結合しなかつた被検物質の量を測定する工程、

を含んで成る、請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質と反応性を有する物質をスクリーニングする方法。

1 5 . 以下の工程、

(1)請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質を発現している細胞に被検物質を添加し培養する工程、

(2)細胞に発現している請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質、あるいは該蛋白質をコードする mRNAを測定する工程、

を含んで成る、請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質の発現に影響を与える物質をスクリーニングする方法。

1 6 . 以下の工程、

(1)請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質の発現を制御するプロモータ領域を同定する工程、

1 7 . 以下の工程、

(2)請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質の分布を測定する工程、を含んで成る、請求項 1あるいは請求項 6に記載の蛋白質の分布に影響を与える物質をスクリーニングする方法。