WO2003074510A1 - Dithiolan-derivate zur immobilisierung von biomolekülen auf edelmetallen und halbleitern - Google Patents

Dithiolan-derivate zur immobilisierung von biomolekülen auf edelmetallen und halbleitern Download PDF

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WO2003074510A1
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dithiolane
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dithiolane derivative
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Hartmut Seliger
Tobias Prokein
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Universitaet Ulm
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q2565/607—Detection means characterised by use of a special device being a sensor, e.g. electrode

Definitions

  • Dithiolane derivatives for immobilizing biomolecules on precious metals and semiconductors are Dithiolane derivatives for immobilizing biomolecules on precious metals and semiconductors
  • the present invention relates to dithiolane derivatives, conjugates of the dithiolane derivatives with organic chemical or biochemical molecules, processes for producing the dithiolane derivatives and the conjugates, a coated noble metal or semiconductor structure which comprises a noble metal coated substrate or a semiconductor carrier and a dithiolan derivative immobilized thereon or a conjugate according to the invention, a biochip which contains the noble metal or semiconductor structure according to the invention and the use of the dithiolan derivatives according to the invention for immobilizing organochemical or biochemical Molecules on precious metals, precious metal alloys or semiconductors.
  • oligonucleotide chips or "DNA microarrays” or “oligonucleotide microarrays”
  • biomolecules that are immobilized on different types of, for example, particulate, in particular spherical, carriers. It is not relevant whether the biomolecules such as oligonucleotides from monomeric or oligomeric synthons 1968
  • the anchoring on the surface is stable and functional, i.e. It is ensured, for example, that the immobilized organic-chemical or biological-chemical molecules, such as oligonucleotides, peptides, etc., do not detach even under repeated or multiple use under the conditions of use.
  • the grafted (immobilized) molecule e.g. can also be split off for the purpose of analysis under certain conditions.
  • the binding energy of the interaction of elemental gold with (alkane) thiols is of the order of about 30 to about 40 kcal / mol (Nuzzo et al. (1986) J. Am. Chem. Soc. 109: 2358-2368; Nuzzo et al. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 558-569).
  • the interaction of gold and other noble metals with vicinal dithiol compounds should be considerably more stable, since the binding energy per molecule increases here (Wang et al. (1998) J. Phys. Chem. B, 102: 9922-9927; Cheng et al. (1995) Anal. Chem. 67: 2767-2775).
  • lipoic acid constructs are known in the prior art which are used in particular for immobilizing biomolecules on gold surfaces; see. e.g. Madoz et al. (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 1043-1051; Blonder et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120: 9335-9341; Stevenson et al. (2002) J. Nanosci. Nanotech. 2; 397-404; Kim et al. (2002) Langmuir 18: 1460-1462.
  • these lipoic acid conjugates have significant disadvantages.
  • Et al the (bio) molecule to be conjugated with the lipoic acid derivative must first be derivatized accordingly in order to make it accessible for reaction with the lipoylation reagent.
  • Holupirek (dissertation, University of Ulm, section Polymers, 1976) describes the possibility of attaching lipoic acid as a substituent to oligonucleotides and using these substituents to purify the target oligonucleotide from the product mixture of solid-phase synthesis via affinity chromatography on organic mercury columns.
  • the method proved to be impractical, which was due in particular to the very inefficient introduction of the lipoic acid residue into oligonucleotides.
  • regeneration of the lipoylated oligonucleotide was difficult after affinity purification.
  • the bridge link R 1 does not have to be present, but can consist of an optionally substituted or unsubstituted aliphatic or heteroaliphatic chain, which can be saturated or unsaturated, straight-chain or branched, but can also be an aromatic radical or contain aromatic radicals and will typically include between 0 and 20 carbon atoms.
  • Preferred bridge members are, for example, corresponding single or multiple methylene groups such as methylene, di-, tri-, tetra-, penta- and hexamethylene.
  • a particularly preferred bridge member R 1 is a tetramethylene group.
  • R 2 and R 3 of the diol spacer can be the same or different and are in principle not particularly restricted. They can be selected independently of one another from aliphatic and heteroaliphatic groups, which can be saturated or unsaturated, straight-chain or branched and / or optionally substituted and usually comprise 1 to 10 C atoms. However, R 2 and R 3 can also be corresponding substituted or unsubstituted aromatic groups or contain them.
  • R 1 , R 2 and R 3 are preferably selected such that a number of C atoms differ from the dithiolane Group up to the group -OR 4 or -OR 5 results from about 5 to about 20, with saturated aliphatic or heteroaliphatic groups being preferred as sterically less problematic groups.
  • the radical R 2 of the diol spacer is therefore preferably selected from (CH 2 ) n groups, where n is an integer from 1 to 10, more preferably 1 to 5. Spacers in which R 2 is methylene (CH 2 ) are particularly preferred.
  • the hydroxyl groups of the diol spacer in the dithiolane derivative of the above formula A according to the invention are identical or differently substituted or unsubstituted.
  • the radicals R 4 and R 5 can therefore both be, for example, both an H atom or an acid-labile protective group, for example dimethoxytrityl or a related group.
  • the radicals R 4 and R 5 are preferably different.
  • R 4 is H and R 5 is an acid-labile protective group or vice versa (cf. in this connection the specific examples of the reaction schemes shown in FIGS. 1 to 3).
  • Suitable acid-labile protective groups such as dimethoxytrityl and similar groups, are known to a person skilled in the art and are described, for example, by Seliger in Beaucage et al. (Ed.) Current Protocols in Nucleic Acid and Chemistry, Vol. 1: 2.3.1-2.3.34, Wiley & Sons, New York, 2000. The relevant disclosure content of this document is hereby incorporated in full by reference into the present invention.
  • Protective groups of this type are particularly suitable for coupling reactions with nucleic acids such as oligonucleotides.
  • Further substituents of the hydroxyl groups of the diol spacer are amino and / or hydroxy coupling groups.
  • Coupling groups of this type are known in the prior art and are correspondingly activatable residues, for example those residues which are used to anchor biomolecules, in particular oligonucleotides, but also low molecular weight organic chemical molecules, on supports containing amino or hydroxyl groups, for example appropriate polymer carriers, for example long-chain amino-CPG, in particular aminopropyl-CPG, can be used.
  • Such coupling groups are in particular dicarbonyl groups such as a succinyl group.
  • Other amino and / or hydroxy coupling groups which are preferably used in accordance with the present invention are phosporamidite groups, for example a beta-cyanoethoxy-diisopropylaminophosphane radical.
  • the coupling group as an activatable radical, enables the dithiolane bridge-spacer unit to be linked to a hydroxyl or amino group.
  • Particularly preferred dithiolane derivatives of the present invention are those in which R 4 is H or an acid-labile protective group, for example a dimethoxytrityl group, and R 5 is a dicarbonyl group, in particular a succinyl group. Conversely, it can also be R 5 H or an acid-labile protective group and R 4 can be a dicarbonyl group.
  • Particularly preferred embodiments of such a dithiolane derivative are designed such that the dicarbonyl group, for example a succinyl group, is covered with a polymer carrier an amide or ester bond is connected.
  • Such a particularly preferred dithiolane derivative of the present invention is a dithiolane modifier shown in the following formula I, in this case a lipoic acid modifier:
  • R 4 in the above formula AH or again an acid-labile protective group (for example a dimethoxytrityl group) and R 5 in the above formula A is a phosphoramidite group, where the substituents R 4 and R 5 may also be reversed.
  • An N, N-diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidite as R 5 or R 4 is very particularly preferred.
  • the dithiolane derivative according to the invention is excellently suitable for introducing dithiolane groups (with an attached bridge member) into (low molecular weight) organochemical compounds and biochemical molecules which have amino and / or hydroxyl groups.
  • Another object of the present invention therefore forms a conjugate of the dithiolane derivative as defined above and an organic chemical or biochemical molecule containing at least one amino or hydroxyl group, which conjugate the group via the amino or hydroxyl group -R 4 or the group -R 5 in formula A above.
  • the corresponding lipoic acid derivative is particularly suitable for this inventive use of the dithiolane derivative, since this substituent, when applied to a noble metal surface, such as a gold surface, provides high binding energy.
  • derivatives of the present invention derived from lipoic acid form particularly easily controllable SAMs.
  • lipoic acid is easily available as a starting material and at an affordable price.
  • the lipoic acid substituent is a naturally occurring biological molecule, which is why this substituent is used, for example, in medical-therapeutic or medical-diagnostic applications of immobilized or non-immobilized corresponding conjugates, for example oligonucleotides, especially one Antisense or antigen therapy poses less or no risk of toxicity.
  • other compounds which have the characteristic dithiolane radical can also be used as a substituent in the dithiolane derivative according to the invention and thus also in the conjugate according to the invention.
  • the organic-chemical or biological-chemical molecule in the conjugate according to the invention is generally understood to mean any such compound which has at least one amino or hydroxyl group.
  • the organic-chemical molecule is, for example, a low-molecular organic-chemical compound with a molecular weight of, for example, ⁇ 1500 Da to understand.
  • Biochemical molecules in the conjugate according to the invention are, in particular, those which have at least a portion which comes from a naturally occurring compound.
  • biochemical molecules are accordingly peptides, oligopeptides, polypeptides, in particular proteins, monosaccharides, oligosaccharides, polysaccharides, lipids and their constituents, in particular fatty acids, and also nucleic acids and their constituents, that is to say nucleosides, nucleotides, oligonucleotides and polynucleotides.
  • Mixed forms of the above-mentioned biochemical molecules can of course also be used in general, for example lipoproteins, glycoproteins etc.
  • nucleic acids and their building blocks that is to say nucleosides, nucleotides, oligonucleotides and polynucleotides. These can be deoxyribonucleotide species as well as ribonucleotide species and their mixed forms.
  • nucleic acid species according to the invention can be single-stranded or double-stranded or both single-stranded and double-stranded.
  • oligonucleotide or polynucleotide also encompasses analog structures, such as, for example, peptide nucleic acids.
  • oligonucleotide-analog structures can be used in the conjugate according to the invention, which have at least one chemical modification compared to naturally occurring molecules.
  • chemical modification means that the nucleic acid species containing the conjugate according to the invention is changed by replacing, adding or removing individual or more atoms or groups of atoms in comparison to naturally occurring nucleic acid species.
  • the chemical modification is preferably designed such that the nucleic acid contains at least one analog of naturally occurring nucleotides.
  • nucleotide analogs that can be used according to the invention are phosphoramidates, phosphorothioa- te, peptide nucleotides, methylphosphonates, 7-deazaguanosine, 5-methylcytosine and inosine and 2-alkoxy-substituted ribonucleotide species.
  • the dithiolane derivative in particular a lipoic acid derivative
  • the dithiolane derivative can be via the 5-C atom of the corresponding nucleo - Sids / nucleotides or conjugated via the terminal 5'-C atom of the oligo- or polynucleotide (where the nucleoside, nucleotide, oligo- or polynucleotide replaces the group -OR 5 in the above formula A) or it can be conjugated via the 3'-C atom of the nucleoside / nucleotide or via the terminal 3'-C atom of the oligo- or polynucleotide (the nucleoside, nucleotide, oligo- or polynucleot
  • a dithiolane derivative is particularly suitable, such as a corresponding lipoic acid derivative, which is bonded to a suitable polymer support via a corresponding coupling group according to the invention.
  • a particularly preferred example of a dithiolane derivative which is particularly suitable for the 3'-terminal conjugation is shown in the formula I above.
  • a dithiolane-substituted, preferably lipoic acid-substituted, phosphorous ester amide reagent is particularly suitable for conjugating a dithiolane derivative as defined above with biomolecules, in particular oligonucleotides and polynucleotides, which enables the dithiolane residue, for example a lipoic acid residue, to be attached terminally and / or internally at any desired position of oligonucleotide chains.
  • Corresponding molecules, in particular oligonucleotides can thus be dithiolanylated, in particular lipoylated, one or more times with the aid of the present invention.
  • a specific example of a particularly suitable dithiolane derivative of the present invention is shown in Formula II above.
  • conjugates according to the invention are advantageous, for example, over known thiol conjugates in that they can easily be stored for a long time, while the conventional thiol conjugates are stable only under inert conditions.
  • the present invention further relates to a process for the preparation of the dithiolane derivative defined above, comprising the steps: (a) providing a dithiolane compound of the formula B.
  • R 2 , R 3 and Y are as defined in Formula A above.
  • the radicals R 4 and R 5 are further introduced into the dithiolane-diol compound formed by processes known to a person skilled in the art.
  • the activation of the carbonyl or sulfonyl group of the dithiolane compound according to formula B above takes place by converting it to an activated ester, in particular to a dicarboximide ester, such as an NHS ester.
  • a suitable dicarboximide such as hydroxysuccinimide
  • the dithiolane compound according to the above formula B can be converted to a corresponding acid halide, for example by reacting the dithiolanoic acid compound with oxalyl chloride to give the corresponding acid chloride. Since the acid chloride formed is often not very stable, steps (b) and (c) above are advantageously carried out simultaneously by adding the appropriate agent for the preparation of the acid halide and the corresponding diol spacer compound to the compound of the formula B.
  • FIG. 3 shows an example of the process according to the invention for the preparation of the dithiolane derivative with the aid of the conversion of lipoic acid to an NHS ester, the further synthesis steps to a 3'-lipoic acid modifier CPG or one Lipoic acid phosphoramidites are shown.
  • the preparation of lipoic acid aminopropanediol is an example of the preparation of the dithiolane derivative according to the invention from the dithiolanoic acid, in this case Lipoic acid, using oxalyl chloride and reaction with aminopropane-1, 2-diol in scheme 4 (Fig. 4).
  • the present invention comprises a method for producing the conjugate according to the invention, which comprises the steps:
  • the dithiolane derivative is preferably provided by the production process defined above.
  • the organochemical or biochemical compound containing at least one amino or hydroxyl group is preferably one of the compounds specified above.
  • the process according to the invention for producing the conjugate is particularly preferred if a dithiolane derivative is used which contains a dicarbonyl group which connects the dithiolane bridge-spacer construct to a polymer support via an amide or ester bond.
  • a dithiolane derivative which contains a dicarbonyl group which connects the dithiolane bridge-spacer construct to a polymer support via an amide or ester bond.
  • a specific example of such a compound is shown in Formula I above.
  • the lipoic acid residue is connected via an amide bond to the amino group of a 3-aminopropane-1,2-diol spacer.
  • One of the hydroxyl groups of the spacer is substituted with a protective group, here dimethoxytrityl, which is split off selectively before the construction of an oligonucleotide chain.
  • the further hydroxyl group of the 3-aminopropane-1, 2-diol spacer is, for example, a succinyl residue with a group known from the prior art which is used for anchoring oligonucleotides to polymer supports containing amino or hydroxyl groups.
  • the structure of the oligonucleotide chain is generated from this exposed hydroxyl group in accordance with the prior art, it being irrelevant whether this structure of 3'- or 5 - End of ago.
  • a corresponding nucleic acid chain for example an oligonucleotide chain
  • the residue containing the lipoic acid or dithiolane group remains bound to the oligonucleotide chain via the spacer.
  • Another preferred method for producing a conjugate according to the invention uses the dithiolane derivative in which R 4 is H or an acid-labile protective group, for example a dimethoxytrityl group, and R 5 is a phosphoramidite group, in particular N, N-diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidite , is.
  • R 4 is H or an acid-labile protective group
  • R 5 is a phosphoramidite group, in particular N, N-diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidite
  • a specific embodiment of a dithiolane derivative according to the invention in this case a lipoic acid derivative, is shown in Formula II above.
  • a hydroxyl group of the spacer is protected with a corresponding protective group, for example dimethoxytrityl.
  • the second hydroxyl group is connected to an activatable radical known from the prior art, for example a phosphoramidite radical, in formula II a (beta-cyanoethoxy) diisopropylaminophosphane radical.
  • an activatable radical known from the prior art, for example a phosphoramidite radical, in formula II a (beta-cyanoethoxy) diisopropylaminophosphane radical.
  • this activatable radical enables attachment to a hydroxyl or amino group.
  • the dimethoxytrityl protective group is split off in accordance with known processes.
  • the hydroxyl function obtained in this way can then optionally be used to attach a further nucleotide unit.
  • the dithiolane derivatives according to the invention are therefore very particularly suitable for producing corresponding nucleic acid conjugates, oligonucleotides being particularly preferred.
  • the dithiolane derivative of the present invention comprising the specific bridging member diol spacer structure, has the advantage over the reagents known in the prior art that it can easily be used in standard nucleic acid synthesis processes, such as, for example, in the phosphoramidite method and anchoring to polymer supports etc., can be set.
  • standard nucleic acid synthesis processes such as, for example, in the phosphoramidite method and anchoring to polymer supports etc.
  • Such methods are described, for example, by Gait (Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, 1987), and the relevant disclosure content of this document is fully incorporated into the present invention.
  • Gait Oligonal synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, 1987
  • the course of a synthesis cycle in the phosphoramidite method is shown by way of example in FIG. 6.
  • the dithiolane derivative according to the invention is particularly suitable for immobilizing organic chemical or biological chemical molecules on noble metals or noble metal alloys and on semiconductors.
  • a coated noble metal structure is also provided, which
  • (c) comprises at least one dithiolane derivative according to the invention immobilized at least in regions on the noble metal layer and / or at least one conjugate according to the invention immobilized at least in regions on the noble metal layer as defined above.
  • a coated semiconductor structure comprising a thiol-binding semiconductor carrier and at least one dithiolane derivative according to the invention immobilized at least in regions on the semiconductor and / or at least one conjugate according to the invention immobilized at least in regions on the semiconductor as defined above.
  • Preferred semiconductor structures according to the invention are those in which gallium arsenide or indium phosphide is coated with dithiolane derivatives or conjugates according to the invention; with regard to the binding of thiols on semiconductors cf. eg Lunt et al. (1991) J. Appl. Phys. 70: 7449; Gu et al.
  • Layer structures in which the immobilized dithiolane derivative and / or the immobilized conjugate form / form a self-assembled monolayer (SAM) are preferred according to the invention.
  • This embodiment of the coated noble metal or semiconductor structure according to the invention provides a controlled layer of the immobilized molecules, for example biomolecules such as oligonucleotides.
  • SAM self-assembled monolayer
  • the layer structure can be formed according to the invention in such a way that, in addition to the dithiolane derivative according to the invention or the conjugate, for example, a spacer (cf. Southern et al. (1999) The Chiping Forecast 21: 5- 9; Southern et al. (1997) Nucl. Acid Res. 25: 1155-1161).
  • the hybridization efficiency can be increased, for example, by using probe oligos loosely packed on the surface (Southern et al. (1997), supra).
  • a so-called mixed oligo-SAM can be formed in the conjugated oligonucleotides according to the invention, in addition to the dithiolane derivative according to the invention or the conjugate thereof with an oligonucleotide, a customary alkanethiol for controlling the density of the desired oligo-SAM is added.
  • a customary alkanethiol for controlling the density of the desired oligo-SAM is added.
  • Gold has a binding capacity of lipoic acid of 7.1 x 10 "10 mol / cm 2 (Pirrung (2002) Angew. Chem. 114: 1326-1341).
  • the layer structures according to the invention are those from the prior art, particularly conventional ones thiol-modified oligonucleotide layers, in that, due to the presence of the vicinal dithiol group, the dithiolane derivative of the present invention has a higher binding energy on the carrier material, which is why a more stable connection can be expected from the double anchoring (see Wang et al. (1998 ), supra; Cheng et al. (1995), supra).
  • coated noble metal or semiconductor structures according to the invention are further distinguished by the fact that the constituents and the structure itself can be produced by standard synthesis processes.
  • conventional thiol-modified oligonucleotides from the prior art require elaborate treatment or workup so that the -SH group desired for chemisorption of the corresponding conjugate is released.
  • noble metals such as gold, silver, copper, platinum, palladium, ruthenium and iridium and alloys of noble metals are suitable for the coated noble metal structure according to the invention.
  • a particularly preferred noble metal according to the invention is gold.
  • the coated noble metal structure according to the invention can be designed in such a way that the substrate is at least partially flat.
  • glass, plastics, semiconductors (in particular silicon) and metals, preferably those which differ from the noble metal of the coating are used as carrier materials.
  • the surface of the carrier material can be treated or coated in accordance with a method known to a person skilled in the art in order to bind the noble metal or the noble metal alloy to be applied. Glass carriers are currently used as standard for biochips, in particular microarrays.
  • particles made of precious metals or Precious metal alloys or particulate carrier materials coated therewith in question there are also particles made of precious metals or Precious metal alloys or particulate carrier materials coated therewith in question, so that the substrate can also be designed in particulate form according to the invention.
  • materials such as polymers, for example polystyrene, glass, silica, etc., are particularly suitable.
  • the noble metal or semiconductor structure is particularly suitable for use as a nucleic acid array, in particular as a DNA microarray, on biochips.
  • a biochip is also provided according to the invention, which comprises the coated noble metal / semiconductor structure according to the invention.
  • FIG. 1 shows in a synthesis scheme the preparation of a dithiolane derivative according to the invention, in the present case a CPG modifier reagent according to formula I (scheme 1).
  • a CPG modifier reagent according to formula I (scheme 1).
  • Lipoic acid is reacted with aminopropane-1,2-diol with activation by DCC, giving the corresponding propane-2,3-diol-1,2-dithiolane-3-pentanoic acid amide.
  • one of the hydroxyl groups is protected with 4,4'-dimethoxytrityl chloride.
  • Succinic anhydride is added to the free hydroxyl group, a succinyl residue and then a p-nitrophenyl ester is produced by activation with DCC.
  • the ester activated in this way is reacted with amino-CPG to give the dithiolane derivative of the formula I coupled to the polymer support.
  • FIG. 2 shows in synthesis scheme 2 the preparation of a dithiolane derivative according to the invention which has a phosphoramidite group on a hydroxyl oxygen of the diol spacer, propane-2,3-diol-1,2- dithiolan-3-pentanoic acid amide is assumed, which can be shown according to Scheme 1 of FIG. 1.
  • the lipoic acid amide-spacer conjugate is reacted with chlorine-N, N-diisopropyl-beta-cyanophosphine and N, N-diisopropylamine in dry dichloromethane to give the compound of formula II.
  • the corresponding S'-lipoic acid modifier-CPG or a lipoic acid phosphoramidite for example, can then be produced, as shown in FIG. 1 (Scheme 1) or FIG. 2 (Scheme 2).
  • FIG. 4 shows another embodiment of the production of lipoic acid aminopropanethiol in a further synthesis scheme (Scheme 4).
  • lipoic acid is reacted with oxalyl chloride to give the corresponding acid chloride, thus obtaining an activated compound which reacts with aminopropane-1,2-diol to give the desired product.
  • 5A shows a schematic representation of the immobilization of oligonucleotide-lipoic acid conjugates according to the invention, the lipoic acid derivative being linked to the 3'-C atom of the terminal nucleotide.
  • FIG. 5B shows, in a representation corresponding to FIG. 5A, the conjugation of the lipoic acid derivative to the terminal 5'-C atom of the conjugated oligonucleotide.
  • D L-alpha-lipoic acid, 4-pyrrolidinopyridine, 3-aminopropane-1, 2-diol, dicyclohexylcarbodiimide, dichloromethane, 4,4 , -dimethoxytriphenylmethyl chloride, pyridine (dry), methanol, dimethylaminopyridine, succinic anhydride, ethyl acetate, di oxane, p-nitrophenol, triethylamine, aminopropyl-CPG (for production see Amino-CPG, http://www.interactiva.de), dimethylformamide, acetic anhydride, diethyl ether.
  • the derivatized carrier was washed carefully with dimethylformamide, methanol and diethyl ether and dried.
  • the lipoic acid carrier was capped with a solution of acetanhydride / pyridine / dimethylaminopyridine (10: 90: 1). It was then washed thoroughly with methanol and diethyl ether and thoroughly dried under high vacuum.
  • propane-2,3-diol-0-4-4'-dimethoxytriphenylmethyl-1,2-dithiolane-3-pentanoic acid amide which is produced, for example, according to the first exemplary embodiment.
  • Propane-2,3-diol-3-0-4-4'-dimethoxytriphenylmethyl-1,2-dithiolane-3-pentanoic acid amide (1.25 mmol, 2.2 ⁇ g) and dry N, N-diisopropylethylamine ( 6 mmol, 0.78 g) were dissolved in 45 ml of dry dichloromethane under argon. Chloro-N, N-diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidite (2.5 mmol, 0.6 g) was slowly added to this solution within 5 min and the mixture was stirred under argon for 1 h.
  • the desired product could be methane / hexane / triethylamine (50: 50: 1%) are eluted isocratically (check by TLC, eluent: dichloromethane / hexane / triethylamine (50: 50: 1%), detection: UV light, with the trityl group under HCI vapor can be made visible).
  • the solvent was spun in and the purified lipoic acid phosphoramidite was dried in vacuo. The synthesis is shown in Scheme 2 (Fig. 2).
  • oligonucleotide syntheses were carried out according to a standard protocol on an Expedite TM Syntheziser (PerSeptive Biosystems). All synthesized oligonucleotides were then purified using HPLC as standard. The syntheses of 3'-, ⁇ '-lipoylated oligonucleotides could be confirmed by MALDI.
  • Oligonucleotides (lip oligonucleotides) modified with 3'-C and 5'-C were added to 1, 2, 5, 10, 15 and 30 pmol in 3 ⁇ l of 1 M NaH 2 PO 4 (pH 4.1) with lipoic acid cleaned gold carrier applied. The gold carriers were leave saturated chamber for 2 h. After immobilization, the liquid drops were pipetted off and rinsed thoroughly with double-distilled water.
  • the gold carrier was incubated with lip oligonucleotides for the prevention of non-specific binding in a 1 mM solution of thio-polyethylene glycol MW 5000 (Rapp Polymers) for 45 min. It was then rinsed carefully with double-distilled water. Remaining water drops were blown off with nitrogen.
  • the coated slide was hybridized with radioactive labeled oligonucleotides, which had the complementary sequence to the immobilized nucleotides (hybridization with 32 P, 1 M NaCI-TE buffer, overnight at room temperature).
  • the immobilization of lipoylated oligonucleotides was confirmed with the help of X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) studies.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Dithiolan-Derivate der Formel A Konjugate aus den Dithiolan-Derivaten mit organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen, Verfahren zur Herstellung der Dithiolan-Derivate und der Konjugate, eine beschichtete Edelmetall- bzw. Halbleiter-Struktur, die ein Edelmetall-beschichtetes Substrat oder einen Halbleiterträger und ein darauf immobilisiertes Dithiolan-Derivat bzw. ein erfindungsgemäßes Konjugat umfasst, einen Biochip, der die erfindungsgemäße Edelmetall- oder Halbleiter-Struktur enthält sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivate zur Immobilisierung von organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen auf Edelmetallen, Edelmetalllegierungen oder Halbleitern.

Description

Dithiolan-Derivate zur Immobilisierung von Biomolekülen auf Edelmetallen und Halbleitern
Die vorliegende Erfindung betrifft Dithiolan-Derivate', Konjugate aus den Dithiolan- Derivaten mit organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen, Verfahren zur Herstellung der Dithiolan-Derivate und der Konjugate, eine beschichtete Edelmetall- bzw. Halbleiter-Struktur, die ein Edelmetall-beschichtetes Substrat oder einen Halbleiterträger und ein darauf immobilisiertes Dithiolan-Derivat bzw. ein erfindungsgemäßes Konjugat umfasst, einen Biochip, der die erfindungsge- mäße Edelmetall- oder Halbleiter-Struktur enthält sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivate zur Immobilisierung von organischchemischen oder biologisch-chemischen Molekülen auf Edelmetallen, Edelmetalllegierungen oder Halbleitern.
Die Chemie der Verankerung von biologisch-chemischen Molekülen, insbesondere Oligonukleotiden, an Oberflächen spielt eine entscheidende Rolle für viele analytische und biomedizinische Anwendungen. Dies gilt bspw. für die Herstellung von Oligonukleotid-Bibliotheken auf Flachmaterial-Trägern ("Oligonukleotid-Chips" bzw. "DNA-Mikroarrays" bzw. "Oligonukleotid-Mikroarrays"), die mittlerweile un- entbehrliche Werkzeuge der modernen biomedizinischen Diagnostik geworden sind (Niemeyer et al. (1999) Angew. Chem. 19: 3039- 3043), ebenso aber auch für Biomoleküle, die an andersartigen, bspw. partikelförmigen, insbesondere kugelförmigen Trägern immobilisiert sind. Dabei ist es nicht relevant, ob die Biomoleküle wie bspw. Oligonukleotide aus monomeren oder oligomeren Synthonen 1968
an der Oberfläche zusammengesetzt werden oder ob sie als bereits fertiggestellte Ketten der monomeren Einheiten, bspw. als Oligonukleotidketten, nach erfolgter Synthese auf die Oberfläche aufgebracht werden. Entscheidend ist jedoch, dass die Verankerung an der Oberfläche stabil und funktionsgerecht ist, d.h. dass bspw. gewährleistet ist, dass sich auch bei mehr- oder vielmaligem Gebrauch unter den Gebrauchsbedingungen die immobilisierten organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Moleküle, wie Oligonukleotide, Peptide usw., nicht ablösen. Andererseits ist es jedoch bei manchen Anwendungen erwünscht, dass das aufgepfropfte (immobilisierte) Molekül z.B. zum Zwecke der Analyse unter bestimmten Bedingungen auch abgespalten werden kann.
Im Stand der Technik sind bereits eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Herstellung von auf Glas, Kunststoffen und anderen nicht-metallischen Trägern aufgebrachten Biomolekülen, insbesondere Oligonukleotiden beschrieben worden (Wölfl (2000) BioChip-Technologien, Laborwelt, Transkript 3: 12-20). Von besonderem Interesse sind dabei u.a. Oligonukleotid-Chips auf Edelmetall-, vorzugsweise Gold- Oberflächen, aufgrund ihrer einfachen Handhabung und der Möglichkeit, sog. "Self-Assembled Monolayers" (SAM) zu erzeugen, die eine effiziente Kontrolle der Dichte der immobilisierten Moleküle ermöglichen, wodurch eine hohe Signalinten- sität erreicht werden kann. Diese SAM von organischen Molekülen auf Edelmetalloberflächen werden üblicherweise durch Reaktion mit Thiolen erzeugt (Bain et al. (1988) J. Am. Chem. Soc. 111: 321-335), die dann ihrerseits als Ankergruppen die Immobilisierung der gewünschten Moleküle wie bspw. Oligonukleotiden vermitteln (Herne et al., J. Am. Chem. Soc. 119: 8916 - 8920).
Die Bindungsenergie der Wechselwirkung von elementarem Gold mit (Alkan-) Thiolen liegt in der Größenordnung von etwa 30 bis etwa 40 kcal/mol (Nuzzo et al. (1986) J. Am. Chem. Soc. 109: 2358-2368; Nuzzo et al. (1990) J. Am. Chem. Soc. 112: 558-569). Wesentlich stabiler sollte jedoch die Wechselwirkung von Gold und anderen Edelmetallen mit vicinalen Dithiol-Verbindungen sein, da sich hier die Bindungsenergie pro Molekül erhöht (Wang et al. (1998) J. Phys. Chem. B, 102: 9922-9927; Cheng et al. (1995) Anal. Chem. 67: 2767-2775). Letsinger et al. (Bioconjugate Chem. 11: 289-291 , 2000) beschreiben eine vicina- le Dithiol-Verbindung und deren Wechselwirkung mit Goldoberflächen. Die Ankergruppe ist allerdings ein synthetisch nur schwer zugängliches Steroid-Derivat. Bei Verwendung derartiger, sterisch problematischer Gruppen ist es kaum möglich, auf der Edelmetalloberfläche SAM zu erzeugen, weshalb die in diesem Stand der Technik beschriebenen Verbindungen nicht zur Herstellung von Biochips verwendet wurden.
Im Stand der Technik sind einige Liponsäure-Konstrukte bekannt, die insbesonde- re zur Immobilisierug von Biomolekülen auf Goldoberflächen verwendet werden; vgl. z.B. Madoz et al. (1997) J. Am. Chem. Soc. 119: 1043-1051; Blonder et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 120: 9335-9341; Stevenson et al. (2002) J. Nanosci. Nanotech. 2; 397-404; Kim et al. (2002) Langmuir 18: 1460-1462. Diese Lipon- säure-Konjugate weisen jedoch deutliche Nachteile auf. U.a. muß das mit dem Liponsäure-Derivat zu konjugierende (Bio-)Molekül zunächst entsprechend deri- vatisiert werden, um es der Umsetzung mit dem Lipoylierungsreagenz zugänglich zu machen. Darüber hinaus ist es mit den bekannten Lipoylierungsreagenzien nicht möglich, Liponsäure-Reste unter Verwendung standardchemischer Verfahren in beliebige Amin- oder Hydroxyl-Gruppen einzuführen.
Holupirek (Dissertation, Universität Ulm, Sektion Polymere, 1976) beschreibt die Möglichkeit, Liponsäure als Substituent an Oligonukleotiden anzubringen und diesen Substituenten dazu zu benutzen, um aus dem Produktgemisch der Festphasensynthese das Ziel-Oligonukleotid über eine Affinitätschromatografie an Orga- noquecksilber-Säulen aufzureinigen. Das Verfahren erwies sich allerdings als nicht praktikabel, was insbesondere auf die nur sehr uneffiziente Einführung des Liponsäure-Rests in Oligonukleotide zurückzuführen war. Darüber hinaus war die Regeneration des lipoylierten Oligonukleotids nach der Affinitätsaufreinigung schwierig.
Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, zur Ausbildung von SAM auf Edelmetall- oder Halbleiteroberflächen besonders geeignete Verbindun- gen bereitzustellen, die sich in die zu immobilisierenden organisch-chemischen bzw. biologisch-chemischen Moleküle einfach und effizient einführen lassen.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungs- formen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß ein Dithiolan-Derivat der Formel A
Figure imgf000006_0001
Formel A
bereitgestellt.
Im Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung ist ein Dithiolan-Ring kovalent über ein Brückenglied R1 mit einer von einem Säurerest abgeleiteten Carbonyl - (X=0) oder Sulfonylfunktion (X=S) verbunden. Das Brückenglied R1 muß nicht vorhanden sein, kann aber aus einer gegebenenfalls substituierten oder unsubsti- tuierten aliphatischen oder heteroaliphatischen Kette, die gesättigt oder ungesät- tigt, geradkettig oder verzweigt sein kann, bestehen, aber auch ein aromatischer Rest sein oder aromatische Reste enthalten und wird typischerweise zwischen 0 und 20 C-Atome umfassen. Bevorzugte Brückenglieder sind bspw. entsprechende Ein- oder Mehrfach-Methylengruppen wie Methylen, Di-, Tri-, Tetra-, Penta- und Hexamethylen. Ein besonders bevorzugtes Brückenglied R1 ist eine Tetramethy- len-Gruppe. Die dem Säurerest zugehörige Carbonyl- oder Sulfonylgruppe ist über eine Amid- (Y=NH) oder Esterbindung (Y=0) mit der Aminogruppe oder Hydroxyl-Gruppe eines Diol-Spacers verbunden.
Die Reste R2 und R3 des Diol-Spacers können gleich oder unterschiedlich sein und sind grundsätzlich nicht besonders eingeschränkt. Sie können unabhängig voneinander aus aliphatischen und heteroaliphatischen Gruppen ausgewählt sein, die gesättigt oder ungesättigt, geradkettig oder verzweigt und/oder gegebenenfalls substituiert sein können und üblicherweise 1 bis 10 C-Atome umfassen. R2 und R3 können jedoch auch entsprechende substituierte oder unsubstituierte a- romatische Gruppen sein oder diese enthalten. Unter dem Gesichtspunkt der Ausbildung von SAM durch das erfindungsgemäße Dithiolan-Derivat bzw. daraus hergestellten Konjugaten auf entsprechenden Oberflächen, wie Edelmetallen, sind R1, R2 und R3 vorzugsweise derart gewählt, daß sich eine Anzahl an C- Atomen von der Dithiolan-Gruppe bis zur Gruppe -OR4 bzw. -OR5 von etwa 5 bis etwa 20 ergibt, wobei insbesondere als sterisch wenig problematische Gruppen entsprechende gesättigte aliphatische oder heteroaliphatische Gruppen bevorzugt sind. Der Rest R2 des Diol-Spacers ist daher vorzugsweise aus (CH2) n-Gruppen ausgewählt, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10, mehr bevorzugt 1 bis 5, ist. Besonders bevorzugt sind Spacer, bei denen R2 Methylen (CH2) ist. Der Rest R3 ist dementsprechend vorzugsweise aus (CH2)m-Gruppen ausgewählt, wobei m eine ganze Zahl von 1 bis 10, mehr bevorzugt 1 bis 5, ist. Besonders bevorzugt sind Spacer mit R3 = Methylen. Als Diol-Spacer besonders bevorzugt ist 3- Aminopropan-1,2-diol oder allgemein ein Spacer, bei dem R2 und R3 Methylen sind.
Die Hydroxyl-Gruppen des Diol-Spacers im erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat der obigen Formel A sind gleich oder unterschiedlich substituiert bzw. nicht substituiert. Daher können die Reste R4 und R5 erfindungsgemäß z.B. beide ein H-Atom oder eine säurelabile Schutzgruppe, bspw. Dimethoxytrityl oder eine verwandte Gruppe, sein. Vorzugsweise sind die Reste R4 und R5 unterschiedlich. Bei einer besonders bevorzugten Auführungsform, die sich beispielweise als Ausgangs- punkt für eine weitere Derivatisierung zur Gewinnung besonders vorteilhafter Li- poylierungsreagenzien eignet, ist R4 H und R5 ist eine säurelabile Schutzgruppe ist oder umgekehrt (vgl. in diesem Zusammenhang die in Fig. 1 bis 3 gezeigten spezifischen Beispiele der Reaktionsschemata). Geeignete säurelabile Schutz- gruppen, wie Dimethoxytrityl und ähnliche Gruppen, sind einem Fachmann bekannt und werden z.B. von Seliger in Beaucage et al. (Hrsg.) Current Protocols in Nucleic Acid and Chemistry, Vol. 1: 2.3.1-2.3.34, Wiley & Sons, New York, 2000, beschrieben. Der diesbezügliche Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift ist hiermit vollumfänglich durch Bezugnahme in die vorliegende Erfindung aufgenom- men. Derartige Schutzgruppen eignen sich insbesondere für Kopplungsreaktionen mit Nukleinsäuren wie Oligonukleotiden. Weitere Substituenten der Hydroxyl- Gruppen des Diol-Spacers sind Amino- und/oder Hydroxy-Kopplungsgruppen. Derartige Kopplungsgruppen sind im Stand der Technik bekannt und sind entsprechend aktivierbare Reste, bspw. solche Reste, die zur Verankerung von Bio- molekülen, insbesondere von Oligonukleotiden, aber auch niedermolekularen organisch-chemischen Molekülen, an Amino- oder Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Trägern wie bspw. entsprechenden Polymerträgern, z.B. Long-Chain Amino-CPG, insbesondere Aminopropyl-CPG, verwendet werden. Solche Kopplungsgruppen sind insbesondere Dicarbonylgruppen wie bspw. eine Succinyl-Gruppe. Andere Amino- und/oder Hydroxy-Kopplungsgruppen, die entsprechend der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendet werden, sind Phosporamidit-Gruppen, bspw. ein beta-Cyanoethoxy-diisopropylaminophosphan-Rest. Somit ermöglicht die Kopplungsgruppe als aktivierbarer Rest die Anknüpfung der Dithiolan-Brückenglied- Spacer-Einheit an eine Hydroxyl- oder Aminogruppe.
Besonders bevorzugte Dithiolan-Derivate der vorliegenden Erfindung sind solche, bei denen R4 H oder eine säurelabile Schutzgruppe, bspw. eine Dimethoxytri- tylgruppe, ist und R5 eine Dicarbonyl-Gruppe, insbesondere eine Succinyl- Gruppe, ist. Es kann aber auch umgekehrt R5 H oder eine säurelabile Schutz- gruppe sein und R4 eine Dicarbonyl-Gruppe sein. Besonders bevorzugte Ausführungsformen eines derartigen Dithiolan-Derivats sind derart ausgestaltet, dass die Dicarbonyl-Gruppe, bspw. eine Succinyl-Gruppe, mit einem Polymerträger über eine Amid- oder Ester-Bindung verbunden ist. Ein derartiges besonders bevorzugtes Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung ist ein in der folgenden Formel I dargestellter Dithiolan-Modifier, in diesem Fall ein Liponsäure-Modifier:
Figure imgf000009_0001
Formel I (DMT = Dimethoxytrityl)
Bei einer anderen spezifischen Ausführungsform des Dithiolan-Derivats der vorliegenden Erfindung ist R4 in der obigen Formel A H oder wiederum eine säurelabile Schutzgruppe (z.B. eine Dimethoxytrityl-Gruppe) und R5 in der obigen Formel A eine Phosphoramidit-Gruppe, wobei die Substituenten R4 und R5 auch umgekehrt vorliegen können. Dabei ist ein N,N-Diisopropyl-beta- cyanoethoxyphosphoramidit als R5 bzw. R4 ganz besonders bevorzugt.
Eine spezifische Ausführungsform des Dithiolan-Derivats ist ein Liponsäure- substituiertes Phosphoramidit-Reagenz der folgenden Formel:
Figure imgf000009_0002
Formel II (DMT = Dimethoxytrityl) Das erfindungsgemäße Dithiolan-Derivat eignet sich in hervorragender Weise zur Einführung von Dithiolan-Gruppen (mit angefügtem Brückenglied) in (niedermolekulare) organisch-chemische Verbindungen und biologisch-chemische Moleküle, welche Amino- und/oder Hydroxy-Gruppen aufweisen. Daher bildet einen weiteren Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Konjugat aus dem Dithiolan- Derivat gemäß vorstehender Definition und einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltenden organischen-chemischen oder biologischchemischen Molekül, das somit über die Amino- oder Hydroxyl-Gruppe die Grup- pe -R4 oder die Gruppe -R5 in der obigen Formel A ersetzt.
Zu dieser erfindungsgemäßen Anwendung des Dithiolan-Derivats eignet sich das entsprechende Liponsäure-Derivat ganz besonders, da dieser Substituent, wenn er auf einer Edelmetalloberfläche, wie einer Goldoberfläche aufgebracht wird, ei- ne hohe Bindungsenergie bereitstellt. Darüber hinaus bilden von Liponsäure abgeleitete Derivate der vorliegenden Erfindung besonders gut steuerbare SAM aus. Darüber hinaus ist Liponsäure als Ausgangsmaterial leicht und zu günstigem Preis zugänglich. Weiterhin handelt es sich bei dem Liponsäure-Substituenten um ein in der Natur vorkommendes biologisches Molekül, weshalb dieser Substituent bspw. bei medizinisch-therapeutischen oder medizinisch-diagnostischen Anwendungen von immobilisierten oder nicht-immobilisierten entsprechenden Konjuga- ten, bspw. Oligonukleotiden, insbesondere bei einer Antisense- oder Antigen- Therapie ein geringeres oder kein Toxizitätsrisiko darstellt. Selbstverständlich können aber auch andere Verbindungen, welche den charakteristischen Dithiolan- Rest aufweisen, als Substituent im erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat und somit auch im erfindungsgemäßen Konjugat eingesetzt werden.
Unter dem organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekül im erfindungsgemäßen Konjugat ist generell jede derartiger Verbindungen zu verstehen, die mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe aufweist. Erfindungsgemäß ist unter dem organisch-chemischen Molekül bspw. eine niedermolekulare organisch-chemische Verbindung mit einem Molekulargewicht von bspw. < 1500 Da zu verstehen. Biologisch-chemische Moleküle im erfindungsgemäßen Konjugat sind insbesondere solche, die mindestens einen Anteil aufweisen, der aus einer natürlich vorkommenden Verbindung stammt. Bevorzugte biologisch-chemische Moleküle sind demnach Peptide, Oligopeptide, Polypeptide, insbesondere Protei- ne, Monosaccharide, Oligosaccharide, Polysaccharide, Lipide und deren Bestandteile, insbesondere Fettsäuren, sowie Nukleinsäuren und deren Bestandteile, also Nukleoside, Nukleotide, Oligonukleotide und Polynukleotide. Selbstverständlich können ganz allgemein auch Mischformen der vorstehend genannten biologischchemischen Moleküle verwendet werden, bspw. Lipoproteine, Glykoproteine usw. Besonders bevorzugte biologisch-chemische Moleküle im erfindungsgemäßen Konjugat sind Nukleinsäuren und deren Bausteine, also Nukleoside, Nukleotide, Oligonukleotide und Polynukleotide. Dabei kann es sich sowohl um Desoxyribo- nukleotid-Spezies als auch um Ribonukleotid-Spezies sowie deren Mischformen handeln. Des weiteren können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Spezies einzelsträngig oder doppelsträngig oder sowohl einzelsträngig als auch dop- pelsträngig vorliegen. Darüber hinaus umfasst der Begriff Oligonukleotid bzw. Po- lynukleotid aber auch analoge Strukturen, wie bspw. Peptidnukleinsäuren. Somit sind im erfindungsgemäßen Konjugat auch alle möglichen Oligonukleotid- analogen Strukturen verwendbar, die gegenüber natürlich vorkommenden Mole- külen mindestens eine chemische Modifikation aufweisen. Der Begriff "chemische Modifikation" bedeutet, dass die erfindungsgemäßen Konjugat enthaltende Nukleinsäure-Spezies durch Ersetzen, Anfügen oder Entfernen einzelner oder mehrerer Atome oder Atomgruppen im Vergleich zu natürlich vorkommenden Nuklein- säurespezies verändert ist.
Vorzugsweise ist die chemische Modifikation dabei derart ausgestaltet, dass die Nukleinsäure mindestens ein Analoges natürlich vorkommender Nukleotide enthält.
In einer keineswegs abschließenden Aufzählung können als Beispiele erfindungsgemäß verwendbarer Nukleotidanaloga Phosphoramidate, Phosphorthioa- te, Peptidnukleotide, Methylphosphonate, 7-Deazaguanosin, 5-Methylcytosin und Inosin sowie 2-Alkoxy-substituierte Ribonukleotid-Spezies genannt werden.
Im Fall des erfindungsgemäßen Konjugats aus dem Dithiolan-Derivat und den vorstehend Nukleosid/Nukleotid-Spezies (also Mononukleoside, Mononukleotide, Oligonukleotide und Polynukleotide) kann das Dithiolan-Derivat, insbesondere ein Liponsäure-Derivat, über das 5-C-Atom des entsprechenden Nukleo- sids/Nukleotids bzw. über das endständige 5'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleo- tids konjugiert sein (wobei das Nukleosid, Nukleotid, Oligo- oder Polynukleotid die Gruppe -OR5 in der obigen Formel A ersetzt) oder es kann über das 3'-C-Atom des Nukleosids/Nukleotids bzw. über das endständige 3'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleotids konjugiert sein (wobei das Nukleosid, Nukleotid, Oligo- oder Polynukleotid die Gruppe -OR4 in der vorstehenden Formel A ersetzt).
Für die 3'-endständige Dithiolan-Konjugation von Nukleinsäure-Spezies eignet sich insbesondere ein Dithiolan-Derivat, wie ein entsprechendes Liponsäure- Derivat, das über eine entsprechende erfindungsgemäße Kopplungsgruppe an einen geeigneten Polymerträger gebunden ist. Ein besonders bevorzugtes Beispiel eines für die 3'-endständige Konjugation besonders geeigneten Dithiolan- Derivats ist in der obigen Formel I gezeigt.
Zur erfindungsgemäßen Konjugation eines Dithiolan-Derivats obiger Definition mit Biomolekülen, insbesondere Oligonukleotiden und Polynukleotiden, eignet sich besonders ein Dithiolan-substituiertes, vorzugsweise Liponsäure-substituiertes, Phosphorigsäureester-Amidreagenz, das es ermöglicht, den Dithiolan-Rest, bspw. einen Liponsäure-Rest, terminal und/oder intern an jeder gewünschten Position von Oligonukleotidketten anzubringen. Somit können mit Hilfe der vorliegenden Erfindung entsprechende Moleküle, insbesondere Oligonukleotide, ein- oder mehrfach dithiolanyliert, insbesondere lipoyliert werden. Ein spezifisches Beispiel eines hierfür besonders geeigneten Dithiolan-Derivats der vorliegenden Erfindung ist in der obigen Formel II gezeigt. Die erfindungemäßen Konjugate, z.B. lipoylierte Oligonukleotide, sind bspw. dadurch gegenüber bekannten Thiol-Konjugaten vorteilhaft, daß sie ohne weiteres längere Zeit gelagert werden können, während die üblichen Thiol-Konjugate nur unter inerten Bedingungen stabil sind.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend definierten Dithiolan-Derivats, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Dithiolan-Verbindung der Formel B
Figure imgf000013_0001
Formel B
wobei R1 und X wie in der vorstehenden Formel A definiert sind und Z=NH oder O ist,
(b) Aktivieren der Carbonyl- oder Sulfonylgruppe der Dithiolan-Verbindung und (c) Umsetzen der aktivierten Dithiolan-Verbindung mit einer Verbindung der Formel C
Figure imgf000013_0002
Formel C
wobei R2, R3 und Y wie in der vorstehenden Formel A definiert sind.
Die weitere Einführung der Reste R4 und R5 in die entstehende Dithiolan-Diol- Verbindung erfolgt durch einem Fachmann bekannte Verfahren. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Aktivierung der Carbonyl- oder Sulfonyl-Gruppe der Dithiolan- Verbindung gemäß obiger Formel B durch deren Umsetzung zu einem aktivierten Ester, insbesondere zu einem Dicarbonsäureimid-Ester, wie einem NHS-Ester. Durch die Aktivierung der Verbindung gemäß Formel B, bspw. von Liponsäure, mittels einem geeigneten Dicarbonsäureimid, wie Hydroxysuccinimid, zum entsprechenden Ester gelingt eine wesentliche Steigerung der Ausbeute in der Synthese der zentralen Verbindung gemäß obiger Formel C. Alternativ kann die Aktivierung der Dithiolan-Verbindung gemäß obiger Formel B bspw. auch mit einer Carbodiimid-Verbindung, wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) erfolgen. Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens kann die Dithiolan-Verbindung gemäß obiger Formel B zu einem entsprechenden Säurehalogenid umgesetzt werden, bspw. indem die Dithiolansäure-Verbindung mit Oxalylchlorid zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt wird. Da das ent- stehende Säurechlorid häufig wenig stabil ist, erfolgen vorteilhafterweise die vorstehenden Schritte (b) und (c) gleichzeitig, indem zur Verbindung der Formel B das entsprechende Agens zur Herstellung des Säurehalogenids und die entsprechende Diol-Spacer-Verbindung zugefügt werden.
Die Herstellung des erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats mittels Aktivierung der Dithiolan-Ausgangsverbindung durch ein Carbodiimid ist nachstehend am Beispiel der Herstellung des Dithiolan-Derivats der vorstehenden Formel I aus Liponsäure, Aminopropan-1 ,2-diol und Amino-CPG gezeigt (Schema 1 gem. Fig. 1). In einem weiteren Schema ist die entsprechende Herstellung des vorstehenden Phospho- ramidit-Derivats gemäß Formel II angegeben (Schema 2 gem. Fig. 2). Das nachstehende Schema 3 (Fig. 3) zeigt beispielhaft das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Dithiolan-Derivats mit Hilfe der Umsetzung von Liponsäure zu einem NHS-Ester, wobei auch die weiteren Syntheseschritte zu einem 3'- Liponsäure-Modifier-CPG bzw. eines Liponsäure-Phosporamidits gezeigt sind. Die Herstellung von Liponsäureaminopropandiol ist als Beispiel der Herstellung des erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats aus der Dithiolansäure, in diesem Fall Liponsäure, mittels Oxalylchlorid und Umsetzung mit Aminopropan-1 ,2-diol im Schema 4 (Fig. 4) dargestellt.
Des weiteren umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäßen Konjugats, welches die Schritte:
(i) Bereitstellen des erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats und (ii) Umsetzen des Dithiolan-Derivats mit einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltenden organisch-chemischen oder biologischchemischen Molekül umfasst.
Das Bereitstellen des Dithiolan-Derivats erfolgt dabei vorzugsweise durch das vorstehend definierte Herstellungsverfahren. Die mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltende organisch-chemische oder biologisch-chemische Verbindung ist vorzugsweise eine der vorstehend angegebenen Verbindungen.
Besonders bevorzugt ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung des Konjugats, wenn ein Dithiolan-Derivat verwendet wird, das eine Dicarbonyl- Gruppe enthält, welche über eine Amid- oder Ester-Bindung das Dithiolan- Brückenglied-Spacer-Konstrukt mit einem Polymerträger verbindet. Ein spezifisches Beispiel für eine derartige Verbindung ist in obiger Formel I gezeigt.
Gemäß dieser besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Liponsäure-Rest über eine Amidbindung mit der Aminogruppe eines 3-Aminopropan-1 ,2-diol-Spacers verbunden. Eine der Hydroxyl-Gruppen des Spacers ist substituiert mit einer Schutzgruppe, hier Dimethoxytrityl, die vor dem Aufbau einer Oligonukleotidkette selektiv abgespalten wird. Die weitere Hydroxyl- Gruppe des 3-Aminopropan-1 ,2-diol-Spacers ist mit einer aus dem Stand der Technik bekannten Gruppe, die zur Verankerung von Oligonukleotiden an Amino- oder Hydroxyl-Gruppen enthaltenden Polymerträgern verwendet wird, bspw. ein Succinylrest. Nach Abspaltung der 4,4'-Dimethoxytritylgruppe nach einem im Stand der Technik bekannten Verfahren erfolgt von dieser freigelegten Hydroxyl-Gruppe aus der Aufbau der Oligonukleotidkette entsprechend dem Stand der Technik, wobei es unerheblich ist, ob dieser Aufbau von 3'- oder vom 5-Ende her erfolgt. Nach dem Aufbau einer entsprechenden Nukleinsäurekette, bspw. einer Oligonukleotidkette, mit der im Stand der Technik bekannten Abspaltung vom Polymerträger, bspw. mit Ammoniak oder Aminen, verbleibt erfindungsgemäß der die Liponsäure- bzw. Dithiolangruppe enthaltende Rest über den Spacer an die Oligonukleotidkette gebunden.
Ein weiteres bevorzugtes Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Konjugats verwendet das Dithiolan-Derivat, bei dem R4 H oder eine säurelabile Schutzgruppe, bspw. eine Dimethoxytritylgruppe, ist und R5 eine Phosphoramidit- Gruppe, insbesondere, N,N-Diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidit, ist. Eine spezifische Ausführungsform eines erfindungsgemaßen Dithiolan-Derivats, in diesem Fall eines Liponsäure-Derivats, ist in der obigen Formel II dargestellt. Auch hier ist wiederum eine Hydroxyl-Gruppe des Spacers mit einer entsprechenden Schutzgruppe, z.B. Dimethoxytrityl, geschützt. Die zweite Hydroxyl- Gruppe ist mit einem aus dem Stand der Technik bekannten aktivierbaren Rest, bspw. einem Phosphoramidit-Rest, in der Formel II einem (beta-Cyanoethoxy)- diisopropylaminophosphan-Rest, verbunden. Dieser aktivierbare Rest ermöglicht erfindungsgemäß die Anknüpfung an eine Hydroxyl- oder Aminogruppe. Im Anschluß an diesen Reaktionsschritt wird die Dimethoxytrityl-Schutzgruppe entsprechend bekannter Verfahren abgespalten. Die so erhaltene Hydroxylfunktion kann dann ggf. zur Anknüpfung einer weiteren Nukleotideinheit verwendet werden. Die erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivate eignen sich daher ganz besonders zur Herstellung entsprechender Nukleinsäurekonjugate, wobei insbesondere Oligonukleotide bevorzugt sind. Das Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung, umfassend die spezifische Brückenglied-Diol-Spacer-Struktur, weist gegenüber den im Stand der Technik bekannten Reagenzien den Vorteil auf, daß es in einfacher Weise in Nukleinsäure-Standardsyntheseverfahren, wie z.B. bei der Phosphoramidit-Methode und der Verankerung an Polymerträgern usw., einge- setzt werden kann. Derartige Verfahren sind bspw. von Gait (Oligonucleotide syn- thesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, 1987) beschrieben, und der diesbezügliche Offenbarungsgehalt dieser Druckschrift ist vollständig in die vorliegende Erfindung aufgenommen. Der Ablauf eines Synthesezyklus bei der Phospho- ramidit-Methode ist beispielhaft in der Fig. 6 dargestellt.
Das erfindungsgemäße Dithiolan-Derivat eignet sich insbesondere zur Immobilisierung von organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekülen auf Edelmetallen oder Edelmetall-Legierungen sowie auf Halbleitern.
Somit wird erfindungsgemäß auch eine beschichtete Edelmetall-Struktur bereitgestellt, die
(a) ein Substrat aus einem Trägermaterial,
(b) mindestens eine mindestens bereichsweise auf dem Substrat ausgebildete Schicht eines oder mehrerer Edelmetalle und/oder Edelmetall-Legierungen und
(c) mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes erfindungsgemäßes Dithiolan-Derivat und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes er- findungsgemäßes Konjugat gemäß obiger Definition, umfasst.
Des weiteren wird erfindungsgemäß eine beschichtete Halbleiter-Struktur bereitgestellt, umfassend einen Thiol-bindenden Halbleiterträger und mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiter immobilisiertes erfindungsgemäßes Dithiolan-Derivat und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiter immobilisiertes erfindungsgemäßes Konjugat gemäß obiger Definition. Bevorzugte erfindungsgemäße Halbleiter-Strukturen sind solche, bei denen Galli- umarsenid oder Indiumphosphid mit erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivaten bzw. -Konjugaten beschichtet ist; hinsichtlich der Bindung von Thiolen auf Halbleitern vgl. z.B. Lunt et al. (1991) J. Appl. Phys. 70: 7449; Gu et al. (1995) Langmuir 11: 1849-1851; Zerulla et al. (1999) Langmuir 15, 5285-5294. Erfindungsgemäß bevorzugt sind dabei solche Schicht-Strukturen, bei denen das immobilisierte Dithiolan-Derivat und/oder das immobilisierte Konjugat einen Self- Assembled-Monolayer (SAM) ausbilden/ausbildet. Diese Ausführungsform der erfindungsgemäßen beschichteten Edelmetall- bzw. Halbleiter-Struktur stellt eine kontrollierte Schicht der immobilisierten Moleküle, bspw. Biomoleküle wie Oligonukleotide, bereit. Durch die Ausbildung eines SAM ist es möglich, die Dichte der immobilisierten Moleküle so zu steuern, daß ein möglichst ausgewogenes Verhältnis zwischen einer hohen Dichte von bspw. in einem Array verwendeten Sondenmolekülen (d.h. eine möglichst große Anzahl von Bindungsstellen für potentielle Bindungspartner (Zielmoleküle) pro Flächeneinheit) und deren Zugänglichkeit für die zu untersuchenden Zielmoleküle resultiert, was beim Einsatz in einem Biochip (z.B. einem entsprechenden Mikroarray) eine hohe Signalintensität ergibt. Insbesondere zur Steigerung der Hybridisierungseffizienz bei immobilisierten Sonden-Oligonukleotiden kann erfindungsgemäß die Schichtstruktur derart ausgebildet werden, dass neben dem erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat bzw. dem Konjugat bspw. ein Spacer (vgl. Southern et al. (1999) The Chiping Forecast 21: 5-9; Southern et al. (1997) Nucl. Acid Res. 25: 1155-1161) zugefügt wird. Des weiteren kann die Hybridisierungseffizienz bspw. durch die Verwendung von an der Oberfläche locker gepackter Sondenoligos gesteigert werden (Southern et al. (1997), supra).
Im Vergleich zu anderen Immobilisierungsstrategien kann bei den erfindungsgemäß konjugierten Oligonukleotiden ein sogenanntes gemischtes Oligo-SAM aus- gebildet werden, indem neben dem erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivat bzw. dem Konjugat aus diesem mit einem Oligonukleotid ein übliches Alkanthiol zur Steuerung der Dichte des erwünschten Oligo-SAM zugegeben wird. Hierdurch läßt sich ebenfalls erreichen, dass das verwendete Oligonukleotid für eine effiziente Hybridisierung gut zugänglich ist. Durch diese Maßnahmen läßt sich die Hybridisierungseffizienz auf bis zu 100% steigern (Levicky (1998) JACS. 120: 9787-9792). Ein weiterer großer Vorteil der auf einem Edelmetall immobilisierten Dithiolan- modifizierten Moleküle, insbesondere von Liponsäure-modifizierten Oligonukleotiden, ist die hohe Bindungskapazität auf dem Edelmetall. Bspw. weist Gold eine Bindungskapazität von Liponsäure von 7,1 x 10"10 mol/cm2 auf (Pirrung (2002) Angew. Chem. 114: 1326-1341). Des weiteren sind die erfindungsgemäßen Schichtstrukturen solchen aus dem Stand der Technik, insbesondere üblichen thiolmodifizierten Oligonukleotid-Schichten, dadurch überlegen, dass aufgrund des Vorhandenseins der vicinalen Dithiolgruppe das Dithiolan-Derivat der vorliegenden Erfindung eine höhere Bindungsenergie auf dem Trägermaterial aufweist, weshalb sich durch die Zweifachverankerung eine stabilere Anbindung zu erwarten ist (vgl. Wang et al. (1998), supra; Cheng et al. (1995), suprä).
Die erfindungsgemäßen beschichteten Edelmetall- bzw. Halbleiter-Strukturen zeichnen sich des weiteren dadurch aus, dass die Bestandteile sowie die Struktur selbst durch Standard-Synthese-Verfahren hergestellt werden können. Demgegenüber erfordern übliche thiolmodifizierte Oligonukleotide aus dem Stand der Technik eine aufwendige Behandlung bzw. Aufarbeitung, damit die zur Chemi- sorption des entsprechenden Konjugats gewünschte -SH-Gruppe frei wird.
Für die erfindungsgemäße beschichtete Edelmetall-Struktur kommen zahlreiche Edelmetalle, wie Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium, Ruthenium und Iridium sowie Legierungen von Edelmetallen in Frage. Ein erfindungsgemäß besonders bevorzugtes Edelmetall ist bspw. Gold. Die erfindungsgemäße beschichtete Edelmetall-Struktur kann derart ausgestaltet sein, dass das Substrat mindestens bereichsweise flächig ausgebildet ist. Als Trägermaterialien kommen dabei insbesondere Glas, Kunststoffe, Halbleiter (insbesondere Slizium) und Metalle, vorzugsweise solche, die vom Edelmetall der Beschichtung verschieden sind, zum Einsatz. Dabei kann erforderlichenfalls die Oberfläche des Trägermaterials gemäß einem Fachmann bekannter Verfahren behandelt bzw. beschichtet sein, um das aufzubringende Edelmetall oder die aufzubringende Edelmetall-Legierung zu binden. Standardmäßig werden derzeit für Biochips, insbesondere Mikroarrays, Glasträger verwendet. Andererseits kommen auch Partikel aus Edelmetallen oder Edelmetall-Legierungen bzw. hiermit beschichtete partikuläre Trägermaterialien in Frage, so dass das Substrat erfindungsgemäß auch partikelförmig ausgebildet sein kann. Bei einer partikelförmigen Ausgestaltung der erfindungsgemäßen beschichteten Edelmetall-Struktur sind bspw. Materialien wie Polymere, z.B. Po- lystyrol, Glas, Kieselsäure usw. besonders geeignet.
Im Fall flächig ausgebildeter Strukturen eignet sich die Edelmetall- bzw. die Halbleiter-Struktur besonders zur Verwendung als Nukleinsäure-Array, insbesondere als DNA-Mikroarray, auf Biochips.
Daher wird erfindungsgemäß ebenfalls ein Biochip bereitgestellt, welcher die erfindungsgemäße beschichtete Edelmetall-/Halbleiter-Struktur umfasst.
Weitere Vorteile der erfindungsgemäßen Beschichtung von Edelmetallen, insbe- sondere Gold, mit Dithiolan-Derivaten und davon abgeleiteten Konjugaten, insbesondere von Oligonukleotiden, sind eine besonders gute Bindungskapazität (Wölfl (2000) Transkript Laborwert 3), die Möglichkeit der Ausbildung von SAM (Bamdad (1998) Biophys. J. 75: 1997-2003), d.h. die kontrollierte Anbindung von Analysemolekülen, insbesondere DNA, zum Einsatz in der Diagnostik, sowie die Möglich- keit der schnellen Produktion eines Biochips, da die Immobilisierung der erwünschten Analysemoleküle, wie bspw. DNA-Oligonukleotide, und die Blockierung der Chipoberfläche innerhalb von etwa 3 Stunden möglich ist.
Die Figuren zeigen:
Fig. 1 zeigt in einem Syntheseschema die Herstellung eines erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats, vorliegend eines CPG-Modifier- Reagenz gemäß Formel I (Schema 1). Liponsäure wird unter Aktivierung durch DCC mit Aminopropan-1 ,2-diol umgesetzt, wobei sich das entsprechende Propan-2,3-diol-1,2-dithiolan-3-pentansäureamid ergibt. In einer weiteren Reaktion wird eine der Hydroxyl-Gruppen mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid geschützt. Durch Umsetzung mit Bernsteinsäureanhydrid wird an die freigebliebene Hydroxyl-Gruppe ein Succinyl-Rest angefügt und sodann durch Aktivierung mit DCC ein p-Nitrophenylester hergestellt. Schließlich wird der so aktivierte Ester mit Amino-CPG umgesetzt, um das am Polymerträger gekop- pelte Dithiolan-Derivat der Formel I zu ergeben.
Fig. 2 zeigt in einem Syntheseschema 2 die Herstellung eines erfindungsgemäßen Dithiolan-Derivats, das eine Phosphoramidit-Gruppe an einem Hydroxyl-Sauerstoff des Diol-Spacers aufweist, wobei von dem DMT-geschützten Propan-2,3-diol-1,2-dithiolan-3- pentansäureamid ausgegangen wird, das gemäß Schema 1 der Fig. 1 dargestellt werden kann. Das Liponsäureamid-Spacer-Konjugat wird mit Chlor-N,N-diisopropyl-beta-cyanophosphin und N,N- Diisopropylamin in trockenem Dichlormethan umgesetzt, um die Verbindung der Formel II zu ergeben.
Fig. 3 zeigt in einem weiteren Syntheseschema die Kopplung von Liponsäure mit Aminopropan-1 ,2-diol in einer alternativen Herstellungsweise von S'-Liponsäure-Modifier-CPG bzw. Liponsäure- Phosphoramidit (Schema 3). Zunächst wird Liponsäure mittels
Hydroxysuccinimid zum Liponsäure-N HS-Ester aktiviert. Der NHS- Ester wird dann mit Aminopropan-1 ,2-diol in Dichlor- methan/Triethylamin umgesetzt, um wieder das Liponsäureamid- Spacer-Derivat zu ergeben. Sodann erfolgt die Anbringung einer 4,4,-Dimethoxytrityl-Schutzgruppe am endständigen Hydroxylrest.
Ausgehend von diesem geschützten Derivat kann dann bspw. das entsprechende S'-Liponsäure-Modifier-CPG oder ein Liponsäure- Phosphoramidit, wie in Fig. 1 (Schema 1) bzw. Fig. 2 (Schema 2) gezeigt, hergestellt werden.
Fig. 4 zeigt in einem weiteren Syntheseschema eine andere Ausführungsform der Herstellung von Liponsäureaminopropanthiol (Schema 4). In diesem Fall wird Liponsäure mit Oxalylchlorid zum entsprechenden Säurechlorid umgesetzt, um somit eine aktivierte Verbindung zu erhalten, die mit Aminopropan-1 ,2-diol reagiert, um das gewünschte Produkt zu ergeben.
Fig. 5A zeigt in einer schematischen Darstellung die Immobilisierung von erfindungsgemäßen Oligonukleotid-Liponsäure-Konjugaten, wobei das Liponsäure-Derivat mit dem 3'-C-Atom des endständigen Nukleotids verbunden ist.
Fig. 5B zeigt in einer der Fig. 5A entsprechenden Darstellung die Konjugation des Liponsäure-Derivats an das endständige 5'-C-Atom des konjugierten Oligonukletids.
Fig. 6 zeigt in einem Syntheseschema den Oligonukleotid-Synthese-
Zyklus, der bei der Phosphoramidit-Methode durchlaufen wird (vgl. Gait (1987), supra).
Die nachstehenden Ausführungsbeispiele erläutern die vorliegende Erfindung weiter, ohne sie einzuschränken.
1. Ausführungsbeispiel
Herstellung von 3'-Liponsäure-Modifier-CPG
Literatur:
Nelson et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 7179-7186; Nelson et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 7187-7194 Verwendete Chemikalien:
D,L-alpha-Liponsäure, 4-Pyrrolidinopyridin, 3-Aminopropan-1 ,2-diol, Dicyclohexylcarbodiimid, Dichlormethan, 4,4,-Dimethoxytriphenylmethylchlorid, Pyridin (tro- cken), Methanol, Dimethylaminopyridin, Bernsteinsäureanhydrid, Ethylacetat, Di- oxan, p-Nitrophenol, Triethylamin, Aminopropyl-CPG (Herstellung siehe unter Amino-CPG, http://www.interactiva.de), Dimethylformamid, Acetanhydrid, Diethy- lether.
Herstellung von Propan-2.3-diol-1.2-dithiolan-3-pentansäureamid
Zu einem Gemisch, bestehend aus 3-Aminopropan-1 ,2-diol (5 mmol, 0,5 g), 4- Pyrrolydinopyridin (5 mmol, 0,7 g) und Dicyclohexylcarbodiimid (10 mmol, 1,9 g) in 20 ml Dichlormethan, wurde D,L-alpha-Liponsäure (5 mmol, 1 g) gegeben und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer verdampft.
Herstellung von Propan-2,3-diol-3-0-4,4'-dimethoxydiphenylmethyl-1 ,2-dithiolan- 3-pentansäureamid
Das zähflüssige, unreine Produkt wurde in 10 ml trockenem Pyridin gelöst und mit 4,4,-Dimethoxytriphenylmethylchlorid (5 mmol, 1,69 g) umgesetzt und bei Raumtemperatur über Nacht gerührt.
Anschließend wurden 10 ml Methanol zugefügt, für weitere 10 min gerührt und unter Vakuum getrocknet.
Das Produkt wurde mittels einer Kieselgel-Säule (5 x 20 cm) gereinigt (Ausbeute 61%, Elutionsgemisch: Dichlormethan/Hexan/Triethylamin (50/50/1%)) und mittels Dünnschichtchromatographie (DC) überprüft (Laufmittel: Dichlor- methan/Hexan/Triethylamin, 50/50/1%), Detektion: UV-Licht (Die Tritylgruppe kann unter HCI-Dampf sichtbar gemacht werden.). Herstellung von 3'-üponsäure-Modifier-CPG
Zu einer Lösung von Propan-2,3-diol-3-0-4,4'-dimethoxytriphenylmethyl-1,2- dithioian-3-pentansäureamid (1 mmol, 0,61 g) und Dimethylaminopyridin (0,9 mmol, 200 mg) in trockenem Pyridin (12 ml) wurde Bernsteinsäureanhydrid (3 mmol, 300 mg) gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde in Ethylacetat (100 ml) gelöst, mit einer 0,5 M Natriumchlorid-Lösung (3 x 100 ml) und einer gesättigten Natriumchlorid-Lösung (1 x 100 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und das Produkt unter Vakuum getrocknet.
Das trockene Bernsteinsäurederivat, p-Nitrophenol (2,5 mmol, 350 mg) und 0,5 ml trockenes Pyridin wurden in 10 ml trockenem Dioxan gelöst. Zum Gemisch wurde anschließend Dicyclohexylcarbodiimid (4,8 mmol, 1,0 g) gegeben und unter milden Bedingungen 3 h gerührt. Der dabei entstandene Dicyclohexylharnstoff wurde abfiltriert.
1 g Aminopropan-CPG wurde im Filtrat suspendiert, 1 ml Triethylamin wurden hinzugefügt und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt.
Der derivatisierte Träger wurde mit Dimethylformamid, Methanol und Diethylether sorgfältig gewaschen und getrocknet.
Schließlich wurde der Liponsäure-Träger mit einer Lösung von Acetan- hydrid/Pyridin/Dimethylaminopyridin (10:90:1) gecappt. Daraufhin wurde mit Methanol und Diethylether gründlich gewaschen und unter Hochvakuum eingehend getrocknet.
Die Synthese ist im Schema 1 (Fig. 1) gezeigt. 2. Ausführungsbeispiel
Herstellung von Liponsäure-Phosphoramidit
Literatur:
Nelson et al. (1989) Nucl. Acids Res. 17: 7179-7186
Verwendete Chemikalien:
N,N-Diisopropylethylamin, Dichlormethan (trocken), Chlor-N,N-diisopropyl-beta- cyanoethoxyphosphoramidit, Methanol, Ethylacetat, Hexan, Triethylamin
Auszugehen ist von Propan-2,3-diol-0-4-4'-dimethoxytriphenylmethyl-1 ,2- dithiolan-3-pentansäureamid, das bspw. gemäß dem ersten Ausführungsbeispiel hergestellt wird.
Herstellung von Propan-2,3-diol-2-0-rN,N-diisopropyl-beta-cvanoethoxyphosphor- amidit1-3-0-r4,4'-dimethoxydiphenylmethvn-1 ,2-dithiolan-3-pentansäureamid
Unter Vakuum getrocknetes Propan-2,3-diol-3-0-4-4'-dimethoxytriphenylmethyl- 1,2-dithiolan-3-pentansäureamid (1,25 mmol, 2,2 μg) und trockenes N,N- diisopropylethylamin (6 mmol, 0,78 g) wurden in 45 ml trockenem Dichlormethan unter Argon gelöst. Zu dieser Lösung wurde langsam innerhalb von 5 min Chlor- N,N-diisopropyl-beta-cyanoethoxyphosphoramidit (2,5 mmol, 0,6 g) beigefügt und für 1 h unter Argon gerührt. Danach wurde Methanol (1 ml) zugeführt und für weitere 10 min gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde zwischen eiskaltem Ethylacetat (170 ml) und 10% eiskaltem Natriumhydrogencarbonat (275 ml) partitioniert. Die organische Phase wurde mit 10% kalter Natriumhydrogencarbonat-Lösung (275 ml) gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt wurde, wurde der gummiartige Rest mittels einer Kieselgel- Säule (5 x 10 cm) aufgereinigt. Das gewünschte Produkt konnte mit Dichlor- methan /Hexan/Triethylamin (50:50:1%) isokratisch eluiert werden (Überprüfung mittels DC, Laufmittel: Dichlormethan/Hexan/Triethylamin (50:50:1%), Detektion: UV-Licht, wobei unter HCI-Dampf die Tritylgruppe sichtbar gemacht werden kann). Das Lösungsmittel wurde einrotiert und das gereinigte Liponsäure- Phosphoramidit im Vakuum getrocknet. Die Synthese ist im Schema 2 (Fig. 2) dargestellt.
3. Ausführungsbeispiel:
Synthese von 3'-, 5'-lipoylierten Oligonukleotiden
Die Oligonukleotidsynthesen erfolgten gemäß einem Standardprotokoll auf einem Expedite TM Syntheziser (PerSeptive Biosystems). Alle synthetisierten Oligonukleotide wurden anschließend mittels HPLC standardgemäß aufgereinigt. Die Synthesen von 3'-, δ'-lipoylierten Oligonukleotiden konnten per MALDI bestätigt werden.
4. Ausführungsbeispiel:
Immobilisierung lipoylierter Oligonukleotide auf goldbeschichteten Trägern
Goldträger
Als Substrat wurden handelsübliche Objektträger verwendet, die mit 10 nm Wolf- ram/Titan (Adhäsions-Schicht) und 100 nm Gold besputtert wurden. Die Goldträger wurden mit Piranha-Lösung (70% H2S04: 30% H202) gereinigt.
Immobilisierung
Es wurden 1, 2, 5, 10, 15 bzw. 30 pmol in 3 μl 1 M NaH2P04 (ph 4,1) mit Liponsäure an 3'-C und 5'-C modifizierte Oligonukleotide (Lip-Oligonukleotide) auf gereinigte Goldträger aufgebracht. Die Goldträger wurden in einer wasserdampfge- sättigten Kammer 2 h belassen. Nach Immobilisierung wurden die Flüssigkeitstropfen abpipettiert und gründlich mit bidestilliertem Wasser gespült.
Passivierung der Träger-Peripherie
Der Goldträger wurde nach der Immobilisierung mit Lip-Oligonukleotiden zur Verhinderung unspezifischer Bindung in einer 1 mM Lösung von Thio- Polyethylenglycol MW 5000 (Rapp Polymers) für 45 min inkubiert. Anschließend wurde sorgfältig mit bidestilliertem Wasser gespült. Verbliebene Wassertropfen wurden mit Stickstoff abgeblasen.
Nachweis der Immobilisierung
Zum Nachweis der Immobilisierung wurde der beschichtete Objektträger mit ra- dioaktiv markierten Oligonukleotiden, welche die komplementäre Sequenz zu den immobilisierten Nukleotiden aufwies, hybridisiert (Hybridisierung mit 32P, 1 M NaCI-TE-Puffer, über Nacht bei Raumtemperatur). Zusätzlich konnte eine Immobilisierung von lipoylierten Oligonukleotiden mit Hilfe von Röntgen- Photoelektronen-Spektroskopie- (XPS) Untersuchungen bestätigt werden.

Claims

Patentansprüche
Dithiolan-Derivat der Formel A
Figure imgf000028_0001
Formel A wobei
R1 nichts oder ein geradkettiger oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter, substituierter oder unsubstituierter aliphatischer, heteroaliphatischer Rest mit 1 bis 20 C-Atomen oder ein entsprechender substituierter oder unsubstituierter aromatscher Rest ist,
R2, R3 jeweils unabhängig voneinander ein geradkettiger oder verzweigter, gesättigter oder ungesättigter, substituierter oder unsubstituierter aliphatischer oder heteroaliphatischer Rest mit 1 bis 10 C-Atomen oder ein entsprechender substituierter oder unsubstituierter aromatischer Rest ist,
R4, R5 jeweils unabhängig voneinander aus der Gruppe, bestehend aus, H, säurelabilen Schutzgruppen, und Amino- und/oder Hydroxy-Kopplungsgruppen, ausgewählt sind,
X O oder S ist und
Y NH oder O ist.
Dithiolan-Derivat nach Anspruch 1 , wobei R1 Tetramethylen ist. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 1 oder 2, wobei X=0 und Y=N ist.
Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei R2 (CH2)n ist, wobei n eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere von 1 bis 5 ist
Dithiolan-Derivat nach Anspruch 4, wobei R2 Methylen ist.
Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei R3 (CH2)m ist, wobei m eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere von 1 bis 5 ist.
Dithiolan-Derivat nach Anspruch 6, wobei R3 Methylen ist.
Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R4 H ist und R5 eine säurelabile Schutzgruppe ist oder umgekehrt.
Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R4 H oder eine säurelabile Schutzgruppe ist und R5 eine Dicarbonyl-Gruppe ist oder umgekehrt.
Dithiolan-Derivat nach Anspruch 9, wobei die Dicarbonyl-Gruppe mit einem Polymerträger über eine Amid- oder Ester-Bindung verbunden ist.
Dithiolan-Derivat nach Anspruch 10, das die folgende Formel aufweist:
Figure imgf000029_0001
Formel I wobei DMT eine Dimethoxytrityl-Gruppe ist.
2. Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei R4 H oder eine säurelabile Schutzgruppe ist und R5 eine Phosphoramidit-Gruppe ist oder umgekehrt. 3. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 12, wobei die Phosphoramidit-Gruppe N,N-Diisopropyl-ß-cyanoethoxyphosphoramidit ist. 4. Dithiolan-Derivat nach Anspruch 13, das die folgende Formel aufweist:
Figure imgf000030_0001
Formel II wobei DMT eine Dimethoxytrityl-Gruppe ist.
15. Konjugat aus mindestens einem Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl- Gruppe enthaltenden organisch-chemischen oder biologischchemischen Molekül, das über die Amino- oder Hydroxyl-Gruppe die Gruppe -OR4 oder die Gruppe -OR5 in der Formel A gemäß Anspruch 1 ersetzt.
16. Konjugat nach Anspruch 15, wobei das biologisch-chemische Molekül aus der Gruppe, bestehend aus Nukleosiden, Nukleotiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden, ausgewählt ist.
17. Konjugat nach Anspruch 16, wobei das Dithiolan-Derivat über das 5'-C-
Atom des Nukleosid/Nukleotids bzw. über das endständige δ'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleotids konjugiert ist und die Gruppe -OR5 in der Formel A gemäß Anspruch 1 ersetzt.
18. Konjugat nach Anspruch 16, wobei das Dithiolan-Derivat über das 3'-C-
Atom des Nukleosid/Nukleotids bzw. über das endständige 3'-C-Atom des Oligo- oder Polynukleotids konjugiert ist und die Gruppe -OR4 in der Formel A gemäß Anspruch 1 ersetzt.
19. Verfahren zur Herstellung eines Dithiolan-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 14, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer Dithiolan-Verbindung der Formel B
Figure imgf000031_0001
Formel B
wobei R1 und X wie in Formel A gemäß Anspruch 1 definiert sind und Z=NH oder O ist, (b) Aktivieren der Carbonyl- oder Sulfonyl-Gruppe der Dithiolan- Verbindung und (c) Umsetzen der aktivierten Dithiolan-Verbindung mit einer Verbindung der Formel C
Figure imgf000032_0001
Formel C
wobei R2, R3 und Y wie in Formel A gemäß Anspruch 1 definiert sind.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei im Schritt (b) die Verbindung der Formel B zu einem aktivierten Ester umgesetzt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, wobei der aktivierte Ester ein Dicarbon- säureimid-Ester ist.
22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei im Schritt (b) die Verbindung der Formel B zum Säurehalogenid umgesetzt wird.
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Schritte (b) und (c) gleichzeitig erfolgen.
24. Verfahren zur Herstellung des Konjugats nach einem der Ansprüche 15 bis 18, umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen des Dithiolan-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und
(ii) Umsetzen des Dithiolan-Derivats mit einem mindestens eine Amino- oder Hydroxyl-Gruppe enthaltenden organisch-chemischen oder biologisch-chemischen Molekül. W
31
25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Bereitstellen des Dithiolan- Derivats durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23 erfolgt.
26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Dithiolan-Derivat gemäß Anspruch 10 oder 11 definiert ist.
27. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Dithiolan-Derivat gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14 definiert ist.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei das biologischchemische Molekül aus der Gruppe, bestehend aus Nukleosiden, Nukleotiden, Oligonukleotiden und Polynukleotiden, ausgewählt ist.
29. Beschichtete Edelmetall-Struktur, umfassend
(A) ein Substrat aus einem Trägermaterial,
(B) mindestens eine mindestens bereichsweise auf dem Substrat ausgebildete Schicht eines oder mehrerer Edelmetalle und/oder Edelmetalllegierungen und (C) mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf der Edelmetallschicht immobilisiertes Konjugat nach einem der Ansprüche 15 bis 18.
30. Edelmetall-Struktur nach Anspruch 29, wobei das immobilisierte Dithiolan-Derivat und/oder das immobilisierte Konjugat einen Self-Assembled- Monolayer ausbilden/ausbildet.
31. Edelmetall-Struktur nach Anspruch 29 oder 30, wobei das Edelmetall aus der Gruppe, bestehend aus Gold, Silber, Kupfer, Platin, Palladium, Ruthenium und Iridium, sowie Legierungen dieser Edelmetalle, ausgewählt ist.
32. Edelmetall-Struktur nach Anspruch 31 , wobei das Edelmetall Gold ist.
33. Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei das Substrat mindestens bereichsweise flächig ausgebildet ist.
34. Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei das Substrat partikelförmig ausgebildet ist
35. Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis .34, wobei das Trägermaterial Glas, Kunststoff, ein Halbleiter oder ein Metall ist.
36. Beschichtete Halbleiter-Struktur, umfassend einen Thiol-bindenden
Halbleiterträger und mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiterträger immobilisiertes Dithiolan-Derivat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und/oder mindestens ein mindestens bereichsweise auf dem Halbleiterträger immobilisiertes Konjugat nach einem der An- sprüche 15 bis 18.
37. Halbleiter-Struktur nach Anspruch 36, wobei der Halbleiter Galliumar- senid oder Indiumphosphid ist.
38. Halbleiter-Struktur nach Anspruch 36 oder 37, wobei das immobilisierte
Dithiolan-Derivat und/oder das immobilisierte Konjugat einen Self- Assembled-Monolayer ausbilden/ausbildet.
39. Biochip, umfassend die Edelmetall-Struktur nach einem der Ansprüche 29 bis 35 und/oder die Halbleiter-Struktur nach einem der Ansprüche 36 bis 38. Verwendung des Dithiolan-Derivats nach einem der Ansprüche 1 bis 14 zur Immobilisierung von organisch-chemischen oder biologischchemischen Molekülen auf Edelmetallen, Edelmetalllegierungen und Halbleitern.
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