WO2003072778A1

WO2003072778A1 - Methode pour etudier une maladie allergique

Info

Publication number: WO2003072778A1
Application number: PCT/JP2003/000600
Authority: WO
Inventors: Naoko Nagata; Tadahiro Oshida; Yuji Sugita; Masato Kubo; Hirohisa Saito
Original assignee: Genox Research, Inc.; Japan As Represented By General Director Of Agency Of National Center For Child Health And Development
Priority date: 2002-02-27
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2003-09-04
Also published as: AU2003207273A1; EP1486562A1; US20030219796A1; JPWO2003072778A1

Description

明細書ァレルギ一性疾患の検査方法技術分野

本発明は、アレルギー性疾患の検査方法に関する。背景技術

ァレルギ一性疾患は、多因子性の病気 (multifactorial diseases)と考えられている。つまり気管支喘息ゃァトピー性皮膚炎は多くの異なる遺伝子の発現の相互作用によって起こり、これらの個々の遺伝子の発現は、複数の環境要因によって影響を受ける。このため、アレルギー性疾患を起こす特定の遺伝子を解明することは、非常に困難であった。

アレルギ一性疾患には、変異や欠損を有する遺伝子の発現や、特定の遺伝子の過剰発現や発現量の減少が関わっていると考えられている。病気に関して遺伝子発現が果たしている役割を解明するためには、遺伝子が発症にどのように関わり、薬剤などの外的な刺激が遺伝子発現をどのように変化させるのかを理解する必要力 ^sある。

さて、現在アレルギー性疾患の診断においては、一般に、問診、家族歴、そして本人の既往症の確認が重要な要素となっている。またアレルギーをより客観的な情報に基づいて診断するために、血液を試料とする試験方法や、アレルゲンに対する患者の免疫学的な応答を観察する方法も実施されている。前者の例として、アレルゲン特異的 I_gE測定、白血球ヒスタミン遊離試験、あるいはリンパ球幼若化試験等が挙げられる。アレルゲン特異的 IgEの存在は、そのアレ^^ゲンに対するアレルギー反応の証明である。しかし患者によっては、必ずしもアレルゲン特異的な IgEを検出できるとは限らない場合もある。また、その測定原理上、診断に必要なアレルゲンの全てに対して、試験を実施しなければならない。白血球ヒスタミン遊離試験ゃリンパ球幼若化試験は、免疫システムのアレルゲンに対する反応を in vitroで観察する方法である。これらの方法は、操作が煩雑である。一方、患者を実際にァレルゲンに接触させたときに観察される免疫応答をァレルギ一の診断に役立てる方法（後者）も公知である。プリック ·テスト、スクラツチ 'テスト、パッチ 'テスト、皮内反応、あるいは誘発試験等が、この種の試験に含まれる。これらの試験では、患者のアレルギー反応を直接診断することができる反面、実際に被検者をアレルゲンに曝露する侵襲性の高い検査であると言うことができる。

この他、アレルゲンに関わらず、アレルギー反応の関与を証明するための試験方法も試みられている。たとえば、血清 IgE値が高値である場合、その患者にはアレルギー反応が起きていると推定することができる。血清 IgE値は、アレルゲン特異 IgEの総量に相当する情報である。アレルゲンの種類に関わらず IgEの総量を決定することは容易であるが、非ァトピー型気管支炎等の疾患を持つ患者では、 IgEが低値となる場合がある。

したがって、患者に対する侵襲が少なく、しかも診断に必要な情報を容易に得ることができる、アレルギー性疾患のマーカーが提供されれば有用である。このようなマーカ一は、ァレルギ一性疾患の発症に深く関与していると考えられるので、診断のみならず、アレルギー症状のコントロールにおいても、重要な標的となる可能性がある。発明の開示

本発明は、特にァレルギ一性疾患の検査を可能とする指標遺伝子の提供を課題とする。さらに、本発明は該指標に基づく、アレルギー性疾患の検査方法おょぴァレルギ一性疾患治療薬のスクリ一ユング方法を提供することを課題とする。本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ァレルギ一性疾患の患者と健常者との間で発現レベルに差が見られる遺伝子を単離し、ァレルギー反応との関連性を明らかにすることにより、ァレルギ一性疾患治療の新たな標的を見出すことができるものと考えた。

このような考えに基づき、本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者と健常者との間で発現レベルの異なる遺伝子の探索を行った。また、遺伝子の発現状態を比較する生体試料としては、末梢血単核球を選択した。アトピー性疾患の患者への抗原刺激によって末梢血単核球からの IL-5、IL-6および IL-10の分泌が知られており、末梢血単核球はァレルギ一反応と密接に関係している (Jenmalm M. C. et al, Pediatr. Allergy Immunol. 10: 168-177， 1999)。つまり、末梢血単核球において発現レベルの異なる遺伝子は、アレルギー反応に深い関連性を有する遺伝子であると言える。さらに末梢血単核球は、収得するのが容易であるため偽陰性をなくすための高収量が期待でき、従って微量な遺伝子の発現を検出することが可能なものと考えられる。

本発明者らは、このような免疫応答システムを支える血液細胞における遺伝子発現の変化を観察することによって、ァレルギ一反応に関連する遺伝子を単離することができると考えた。本出願人は、このような考えかたに基づいて、花粉症患者の末梢血の血液細胞において発現レベルが変化している次の遺伝子の単離に成功し、特許出願している。

花粉症関連遺伝子 3 7 3 (WO00/65046) 花粉症関連遺伝子 4 1 9 (WO00/65045) 花粉症関連遺伝子 5 1 3 (WO00/65049) 花粉症関連遺伝子 5 8 1 (WO00/65048) 花粉症関連遺伝子 7 9 5 (WO00/65050) 花粉症関連遺伝子 6 2 7 (WO00/65051) 花粉症関連遺伝子 4 4 1 (WO00/73435) 花粉症関連遺伝子 4 6 5 (WO00/73439) 花粉症関連遺伝子 7 8 7 (WO00/73440)

あるいは本出願人は、アレルギー性疾患の患者末梢血 T細胞において、健常者と比較して発現レベルに差の見られる遺伝子として B1153を単離し、特許出願した (WO 02/50269)。 B1153はアレルギー性疾患と健常者の試料を用いたディファレンシャルディスプレイ法によって単離された遺伝子である。

更に本発明者らは、アトピー性皮膚炎患者の末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell;以下 PBMCと省略する）、特に T細胞において発現レベルが異なる遺伝子の探索を行った。

T細胞は免疫応答を決定している細胞である。したがって、アレルギー性疾患患者の T細胞において発現レベルが高い遺伝子には、重要な役割が予測される。免疫反応や炎症反応はインターロイキンゃィンターフェロンを含む多数のサイトカインによって制御される。サイト力インはその受容体、さらにその下流の Janus tyrosine kinase (JAK や signal tranceducer and activator of

transcription (STAT)を活性化することによって、作用を示す。 Suppressor of cytokine signaling (SOCS)はこのサイトカインシグナル経路を負に制御する因子として不可欠である。

本発明者らは SOCSフアミリ一分子がァトピー性皮膚炎において果たす役割を検討するために、末梢血 T細胞における mRNA発現を測定し、 SOCS3遺伝子がァトビー性皮膚炎患者の T細胞において、健常者よりも発現レベルが有意に高いことを明らかにした。これらの知見に基づいて、本発明者らは、 S0CS3遺伝子を指標としてアレルギー性疾患の検査、あるいはアレルギー性疾患の治療薬のスクリ一ユングが可能となることを見出し、本発明を完成した。すなわち本発明は、以下のアレルギーの検查方法、アレルギー性疾患の治療薬、そのスクリーニング方法、アレルギー性疾患のモデル動物、並びにこれらの方法のためのキットに関する。

〔1〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子が S0CS3である方法。

( a ) 被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程

( b ) 該発現レベルを、健常者の生体試料における該指標遺伝子の発現レべルと比較する工程 ( c ) 該被検者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルの有意な上昇が観察された場合に被検者がァレルギ一性疾患を有すると判定するェ程

〔2〕アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、〔1〕に記載の検査方法。〔3〕遺伝子の発現レベルを、 cDNAの PCRによって測定する〔1〕に記載の検査方法。

〔4〕遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する〔1〕に記載の検査方法。

〔5〕生体試料が末梢血 T細胞を含む試料である〔1〕に記載の方法。

〔6〕 SOCS3遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも 1 5塩基の長さを有するオリゴヌクレォチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。

〔 7〕 SOCS3遺伝子によってコードされるァミノ酸配列を含むぺプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。

〔8〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。

( 1 ) 指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程

( 2 ) 指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物を接触させない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

〔9〕細胞が T細胞である〔8〕に記載の方法。

〔1 0〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。

( 1 ) 被験動物に候補化合物を投与する工程、 ( 2 ) 被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

〔1 1〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。

( 1 ) 指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポータ一遺伝子を含むベクタ一を導入した細胞と候補物質を接触させる工程、

( 2 ) 前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

〔1 2〕次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。

( 1 )指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、

( 2 ) 前記蛋白質の活性を測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物と接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程

〔1 3〕〔8〕、〔1 0〕、〔1 1〕、〔1 2〕のいずれかに記載のスクリー二ング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、ァレルギ一性疾患の治療薬。

〔1 4〕指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも 15塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンス DNAを主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子である治療薬。

〔1 5〕指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子が SOCS3遺伝子または SOCS3と機能的に同等な遺伝子である治療薬。

〔1 6〕指標遺伝子の T細胞における発現強度を上昇させたトランスジエニック非ヒト脊椎動物のアレルギ一性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子である使用。

〔1 7〕指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも 1 5塩基の長さを有するオリゴヌクレォチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーユングするためのキットであって、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子であるキット。

〔1 8〕指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子であるキット。

また本発明は、以下の (A) - (C)のいずれかに示す化合物を投与する工程を含む、アレルギー性疾患の治療方法に関する。あるいは本発明は、以下の (A) - (C)のいずれかに示す化合物のアレルギー性疾患の治療薬の製造における使用に関する。

(A) 〔8〕、〔1 0〕、〔1 1〕、および〔1 2〕のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物

(B) SOCS3のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも 15塩基の配列に対して相補的な配列を含むァンチセンス DNA

(C) SOCS3遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体

更に本発明は、非ヒト脊椎動物における T細胞の SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子の発現強度を上昇させる工程を含む、ァレルギ一性疾患のモデル動物の製造方法に関する。あるいは本発明は、 SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子の発現強度を上昇させたトランスジェユック非ヒト脊椎動物のァレルギー性疾患のモデル動物としての使用に関する。

本発明において指標遺伝子とする SOCS3遺伝子の構造は既に明らかにされている。本発明の指標遺伝子である SOCS3は、 IL-6、 IFN- γのような炎症性サイト力イン、あるいは IL-10のような抗炎症性サイト力インによって誘導され、それらサイトカインの作用を負に制御することが報告されている（Yasukawa H., Sasaki A. ana foshimura, A. 2000. Negative regulation of cytokine signaling pathway. Annu. Rev. Immunol. 18: 143-164.) 。

アレルギー反応においては、 IL-4や IL-5を産生する Th2に分化した T細胞が重要な要因となっている。発明者の一人である久保らは、 SOCS3が Th2細胞特異的に発現していることを見出した。さらに、 SOCS3のトランスジエニックマウスを作製し、 T細胞の機能分化を観察したところ Thl分化が顕著に抑制され、これに呼応して Th2分ィ匕が促進していた。そのメカニズムとしては、 IL-4によって誘導された SOCS3が Thlへの分化を促す IL-12受容体のシグナル伝達を抑制していることが原因と考えられた。

実際に、ナイーブ T細胞の Thl細胞または Th2細胞への分ィ匕には特定の SOCS分子の優位な発現が伴う。 Thl細胞では SOCS1の発現が， Th2細胞では SOCS3の発現の亢進が認められる。 Thl細胞では IL-4/STAT6のシグナル伝達が，また Th2細胞では IL-12/STAT4のシグナル伝達が抑制されていると考えられる (Egwuagu CE， Yu CR， Zhang M， Mahdi RM， Kim SJ， Gery I" J Immunol 2002 Apr l;168(7):3181-7, Suppressors of cytokine signaling proteins are differentially expressed in Thl and Th2 cells: implications for Th cell lineage commitment and maintenance. )o

以上のことから、ヒトの末梢血 T細胞における SOCS3の発現上昇によって Th2 細胞への分化が促進されることがァレルギ一発症の一因となっていると考えられた。

SOCS3に関しての特許はいくつか報告されている。し力し、いずれもサイトカィンシグナルを抑制するという一般的な機能の報告に留まり、ァレルギ一性疾患における役割を示すデータは示されていない。以下に代表的な特許を示した。

• WO200129178-A2, EP0877030A2 (SMITHKLINE BECKMAN

CORPORATION)

EPO primary response gene 1 (EPRG1)

Erythropoietin を増殖に必要とするヒト培養細胞株から分離された遺伝子が記載されている。血液疾患に関連する多くの疾患との関連性を指摘しているが、いずれの疾患についても、この遺伝子との関連性を裏付けるデータは無い。

• WO09923220-A1 (INCYTE PHERM INC.)

Human suppressor of cytokine signaling (HSCS-1)

遺伝子の塩基配列情報が記載されている。幅広い疾患との関連性が述べられているが、特定の疾患との関連性を裏付けるデータは無い。

• WO9820023-A1 (HALL INST MEDICAL RES WALTER & ELIZA)

Suppressor of cytokine signaling protein (S0CS)_o 癌、傷病、免疫関連疾患、高血圧についての記載がある。し力、し、やはりこれらの疾患との関連性を裏付けるデータを伴っていない。

更に、アトピー性皮膚炎患者末梢血 T細胞における CIS-1, SOCS1, SOCS3、 SOCS5の mRNA発現を測定した結果、 SOCS3は患者群において有意に発現が高く， SOCS3の発現量は血中 IgE値とも高い相関性が認められた（長田直子，押田忠弘，関陽一，杉田雄二，斎藤博久，久保允人第 32回（2002年 12月）日本免疫学会 1#演要 ^^Proceedings oi the Japanese Society for Immunology Vol. 32， 2002 ISSN0919-1984 page 198，「ァレルギ一性疾患患者における Suppressors of cytokine signaUng-3 (SOCS3) 分子の高発現」）。この知見は、特許出願後に本発明者らによつて発表された。本発明において、ァレルギ一性疾患 (allergic disease)とはァレルギ一反応の関与する疾患の総称である。より具体的には、アレルゲンが同定され、アレルゲンへの曝露と病変の発症に深レ、結びつきが証明され、その病変に免疫学的な機序が証明されることと定義することができる。ここで、免疫学的な機序とは、アレルゲンの刺激によって白血球細胞が免疫応答を示すことを意味する。アレルゲンとしては、ダニ抗原や花粉抗原等を例示することができる。

代表的なアレルギー性疾患には、気管支喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、花粉症、あるいは昆虫アレルギー等を示すことができる。アレルギー素因 (allergic diathesis)とは、アレルギー性疾患を持つ親から子に伝えられる遺伝的な因子である。家族性に発症するアレルギー性疾患はァトピー性疾患とも呼ばれ、その原因となる遺伝的に伝えられる因子がアトピー素因である。アトピー性皮膚炎は、アトピー性疾患のうち、特に皮膚炎症状を伴う疾患に対して与えられた総称である。

本発明において SOCS3遺伝子とは、本実施例において同定されたヒト SOCS3 遺伝子およびそれと同一の遺伝子座または他生物において相同の遺伝子座にある遺伝子を言う。例えば本発明において SOCS3遺伝子は、本実施例において同定されたヒト SOCS3遺伝子と同じまたは相同の遺伝子座にある任意の対立遺伝子が含まれる。本発明において SOCS3遺伝子には、具体的には、本実施例において同定されたヒト SOCS3遺伝子、その多型（SNPを含む）、変異体、スプライシングバリアント、および他生物のホモログを含む。これらの遺伝子は、ヒト SOCS3 遺伝子と実質的に同一または類似の発現制御を受けていると考えられることから、それらの発現を検出することにより、本発明のアレルギー性疾患の検査を行うことが可能である。

具体的には、本発明において SOCS3遺伝子は、以下の核酸からなる内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。内在性遺伝子とは、自然界の生物が元来保持している、人の手により改変されていない遺伝子を言い、それと同一の塩基配列からなる遺伝子は、内在性遺伝子と実質的に同一の遺伝子である。また「遺伝子」とは、ここでは転写産物またはそれをコードする核酸（DNAまたは RNAなど）を言う。

( a ) SOCS3遺伝子の塩基配列から選択された塩基配列を含む核酸。

( b ) SOCS3遺伝子のコード配列の塩基配列において、 1または複数の塩基が置換、欠失、およびノまたは挿入した塩基配列を含む核酸。

( c ) SOCS3蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも 15アミノ酸をコードする核酸。

( d ) SOCS3蛋白質のアミノ酸配列において、 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、およぴノまたは揷入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸。

( e ) SOCS3遺伝子の連続した少なくとも 50塩基を含み、 SOCS3遺伝子の塩基配列以外の配列を含まない核酸と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸。

( a ) に記載の核酸には、好ましくは SOCS3遺伝子（より好ましくはそのコード配列）に記載の塩基配列の連続した少なくとも 40塩基、より好ましくは 60塩基以上、より好ましくは 100塩基以上、より好ましくは 200塩基以上、より好ましくは 500塩基以上、より好ましくは 1000塩基以上、最も好ましくは全長を含む核酸が含まれる。このような核酸には、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およびスプライシングバリアントが含まれ得る。また（a ) に記載の核酸としては、 SOCS3遺伝子の塩基配列の連続した少なくとも 30塩基、より好ましくは 35塩基以上、より好ましくは 40塩基以上、より好ましくは 45塩基以上、より好ましくは 50塩基以上の塩基配列を含む核酸が挙げられる。塩基配列は、 SOCS3遺伝子のコ —ド配列から選択することが好ましい。塩基配列は、任意の数を選択することができる。複数の塩基配列を選択する場合には、オーバーラップしないように 2箇所以上、好ましくは 3箇所以上、より好ましくは 4箇所以上、より好ましくは 5箇所以上の連続した塩基配列を含む核酸がより好ましい。 ( b ) に記載の核酸には、好ましくは SOCS3遺伝子のコード配列において、全塩基数の 15%以内、より好ましくは 10%以内、より好ましくは 8%以内、より好ましぐは 5%以内、より好ましくは 1%以内の塩基が置換、欠失、および/ /または挿入した塩基配列を含む核酸が含まれる。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングバリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくは配列番号： 1のコード配列と 85%以上、より好ましくは 90%以上、より好ましくは 92%以上、より好ましくは 95%以上、より好ましくは 99%以上の同一性を有する塩基配列を含む核酸である。

塩基配列またはアミノ酸配列の同一性は、例えは *BLASTプログラム（Altschul, S. F. et al.， 1990， J. Mol. Biol. 215: 403-410) を用いて決定することができる。具体的には、塩基配列の同一性を決定するには blastnプログラム、アミノ酸配列の同一性を決定するには blastpプログラムを用い、例えば NCBI (National Center for Biothchnology Information) の BLASTのゥェブサイトにおいて Low complexityを含むフィルターは全て OFFにして、デフォルトのパラメータを用いて検索を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res. 7:649-656) 。例えば 2つの配列の比較を行う blast2sequencesプログラム (Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250) により、 2配列のァライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様に扱い、 SOCS3遺伝子のコード配列全体に対する同一性の値を計算する。

( c ) に記載の核酸には、好ましくは SOCS3蛋白質のアミノ酸配列の連続した少なくとも 20アミノ酸、より好ましくは 30アミノ酸以上、より好ましくは 50アミノ酸以上、より好ましくは 100ァミノ酸以上、より好ましくは 300ァミノ酸以上、より好ましくは 500ァミノ酸以上、最も好ましくは全長をコードする核酸が含まれる。このような核酸には、上記の（a ) と同様に、主に同一種内の遺伝子の多型、変異体、およぴスプライシングバリアントが含まれ得る。また（c ) に記載の核酸としては、 SOCS3蛋白質の塩基配列の連続した少なくとも 8アミノ酸、より好ましくは 10アミノ酸以上、より好ましくは 15アミノ酸以上、より好ましくは 20アミノ酸以上、より好ましくは 25アミノ酸以上のアミノ酸配列をコードする塩基配列部分を、オーバーラップしないように 2箇所以上、好ましくは 3箇所以上、より好ましくは 4箇所以上、より好ましくは 5箇所以上含む核酸がより好ましい。

( d ) に記載の核酸には、好ましくは SOCS3蛋白質のアミノ酸配列において、全アミノ酸数の 15%以内、より好ましくは 10%以内、より好ましくは 8%以内、より好ましくは 5 %以内、より好ましくは 1%以内のアミノ酸が置換、欠失、およびノまたは挿入したアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸が含まれる。この核酸は、非翻訳配列を含んでいてよい。このような核酸には、近縁の他種生物のカウンターパートの遺伝子、その多型、その変異体、およびそのスプライシングパリアントなどが含まれ得る。このような核酸は、好ましくは SOCS3蛋白質のァミノ酸配列と 85%以上、より好ましくは 90%以上、より好ましくは 92%以上、より好ましくは 95%以上、より好ましくは 99%以上の同一性を有するァミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸である。ギャップはミスマッチと同様に扱い、 SOCS3蛋白質のアミノ酸配列全体に対する同一性の値を計算する。アミノ酸配列の同一性は上記に従つて決定することができる。

( e ) に記載の核酸には、好ましくは SOCS3遺伝子（より好ましくはコード配歹 IJ) に記載の連続した少なくとも 80塩基、より好ましくは 100塩基以上、より好ましくは 120塩基以上、より好ましくは 200塩基以上を含み、 SOCS3遺伝子（より好ましくはコード配列）に記載した塩基配列以外の配列を実質的に含まない核酸と、ストリンジ-ントな条件下でハイブリダィズする核酸が含まれる。このような核酸は、例えば SOCS3遺伝子の塩基配列を含む核酸を铸型にして作製されたプローブと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であってよい。

50塩基から数百塩基の長さのプローブは、例えは NA合成により合成することもできるし、あるいはランダムプライム法、ニックトランスレーション、または PCR 法などにより作製することができる。

( e ) に記載の核酸における、ストリンジエンドな条件とは、好ましくは 0.5 〜0.9 M程度の NaCl を含むハイブリダィゼーシヨン溶液中、 60°C、好ましくは 62で、より好ましくは 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを行い、その後ハイブリダイゼーシヨンと同じ温度で I X SSC中、好ましくは 0.5 XSSC中、より好ましくは 0.2 X SSC中、より好ましくは 0.1 X SSC中で、 1時間洗浄する条件である。伹し、ストリンジエンシーを大きく左右するハイブリダィゼーシヨンや洗浄の温度条件は、プローブの融解温度 (Tm)に応じて調整することができる。 Tmはハイブリダィズする塩基対に占める構成塩基の割合、プローブの鎖長、ハイブリダィゼーシヨン溶液組成（塩濃度おょぴホルムアミド濃度）によって変動する。したがつて、当業者であればこれらの条件を考慮して同等のストリンジエンシーを与える条件を経験的に設定することができるノ、イブリダィゼーシヨン溶液としては、例えば 4XSSC、または好ましくは ExpressHyb (登録商標） Hybridization Solution (Clontech社製）などを用いることができる。

本発明のァレルギ一性疾患の検査方法は、被検者の生体試料における SOCS3 遺伝子の発現レベルを測定し、健常者の測定値と比較する工程を含む。両者の比較の結果、健常者よりも発現が亢進している場合には、被検者がアレルギー性疾患であると判定される。発現レベルの比較のためには、通常、たとえば健常者における前記指標遺伝子の発現レベルに基づいて、標準値が設定される。この標準値をもとに、たとえば ± 2 S.D.の範囲が許容範囲とされる。指標遺伝子の測定値に基づいて、標準値や許容範囲を設定する手法は公知である。被検者における指標遺伝子の発現レベルが許容範囲よりも高ければ、その被検者はアレルギー性疾患を有すると判定される。またその発現レベルが許容範囲内であれば、アレルギ一性疾患を有する可能性は低いと予想される。本発明において、アレルギー性疾患の指標とすることができる SOCS3遺伝子を指標遺伝子と言う。

指標遺伝子は、 SOCS3のみならず、他のアレルギー性疾患の指標となる遺伝子と組み合わせることもできる。指標遺伝子として複数の遺伝子を組み合わせて測定することによって検査精度を高めることができる。アトピー性皮膚炎患者等のアレルギー性疾患患者は、ヘテロジーニアス（不均一）な集団なので、複数の遺伝子を指標とすることにより、より確実な診断を行うことができる。

本発明において、指標遺伝子の発現レベルとは、遺伝子の mRNAへの転写、並びに蛋白質への翻訳を含む。したがって本発明によるァレルギ一性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子に対応する mRNAの発現強度、あるいは前記指標遺伝子によってコードされる蛋白質の発現レベルの比較に基づいて行われる。

本発明におけるアレルギー性疾患の検査における指標遺伝子の発現レベルの測定は、公知の遺伝子解析方法にしたがって実施することができる。具体的には、たとえばこの遺伝子にハイブリダイズする核酸をプロ一ブとしたハイブリダイゼーション技術、または本発明の遺伝子にハイブリダイズする DNAをプライマーとした遺伝子増幅技術等を利用することができる。

本発明の検査に用いられるプローブまたはプライマーは、前記指標遺伝子の塩基配列に基づいて設定することができる。たとえばヒト SOCS3遺伝子の塩基配列は、 GenBank Ac NO.AB006967として公知である。 SOCS3遺伝子の塩基配列を配列番号： 1に、またこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号： 2に示した。

なお一般に高等動物の遺伝子は、高い頻度で多型を伴う。また、スプライシングの過程で相互に異なるアミノ酸配列からなるアイソフォームを生じる分子も多く存在する。多型やアイソフォームによつて塩基配列に変異を含む遺伝子であつても、前記指標遺伝子と同様の活性を持ち、アレルギーに関与する遺伝子は、いずれも本発明の指標遺伝子に含まれる。プライマーあるいはプローブには、前記指標遺伝子の塩基配列からなるポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な少なくとも 1 5ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを利用することができる。ここで「相補鎖」とは、 A:T (RNAの場合は U) 、 G:Cの塩基対からなる 2本鎖 DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも 15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも 70%、好ましくは少なくとも 80% 、より好ましくは 90% 、さらに好ましくは 95%以上の塩基配列上の相同性を有すればよい。塩基配列の相同性は、 BLAST等のアルゴリズムにより決定することができる。

このようなポリヌクレオチドは、指標遺伝子を検出するためのプローブとして、また指標遺伝子を増幅するためのプライマーとして利用することができる。ブライマ一として用いる場合には、通常、 15bp〜： I00bp、好ましくは 15bp〜35bpの鎖長を有する。また、プローブとして用いる場合には、指標遺伝子（またはその相補鎖）の少なくとも一部若しくは全部の配列を有し、少なくとも 15bpの鎖長の DNAが用いられる。プライマーとして用いる場合、 3'側の領域は相補的である必要があるが、 5'側には制限酵素認識配列ゃタグなどを付加することができる。なお、本発明における「ポリヌクレオチド」は、 DNAあるいは RNAであることができる。これらポリヌクレオチドは、合成されたものでも天然のものでもよレ、。また、ハイブリダィゼーシヨンに用いるプローブ DNAは、通常、標識したものが用いられる。標識方法としては、例えば次のような方法を示すことができる。なお用語オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのうち、重合度が比較的低いものを意味している。オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに含まれる。

• DNAポリメラーゼ Iを用いるニックトランスレーションによる標識

•ポリヌクレオチドキナーゼを用いる末端標識

' クレノーフラグメントによるフィルィン末端標識（Berger SL， Kimmel AR. (1987) Guide to Molecular Cloning Techniques, Method in Enzvmology, Academic Press; Hames BD， Higgins SJ (1985) Genes Probes: A Practical Approach. IRL Press; Sambrook J， Fritsch EF， Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press)

• RNAポリメラーゼを用いる転写による標識（Melton DA, Krieg,PA,

Rebagkiati MR, Maniatis T， Zinn K， Green MR. (1984) Nucleic Acid Res., 12,7035-7056)

•放射性同位体を用いない修飾ヌクレオチドを DNAに取り込ませる方法（Kricka LJ. (1992) Nonisotopic DNA Probing Techniques. Academic Press;

ハイブリダイゼーション技術を利用したァレルギ一性疾患の検査は、例えば、ノ一ザンハイブリダイゼーション法、ドットブロット法、 DNAマイクロアレイを用いた方法などを使用して行うことができる。さらには、 RT-PCR法等の遺伝子増幅技術を利用することができる。 RT-PCR法においては、遺伝子の増幅過程において PCR増幅モニター法を用いることにより、本発明の遺伝子の発現について、より定量的な解析を行うことが可能である。

PCR遺伝子増幅モニター法においては、両端を互いの蛍光を打ち消し合う異なつた蛍光色素で標識したプローブを用い、検出対象（DNAもしくは RNAの逆転写産物）にハイブリダィズさせる。 PCR反応が進んで Taqポリメラーゼの 5'-3'ェクソヌクレアーゼ（exonuclease) 活性により同プローブが分解されると二つの蛍光色素が離れ、蛍光が検出されるようになる。この蛍光の検出をリアルタイムに行う。検出対象についてコピー数の明らかな標準試料について同時に測定することにより、 PCR増幅の直線性のあるサイクル数で目的試料中の検出対象のコピ一数を決定する（Holland, P.M. et al.， 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA

88:7276-7280; Livak, K. J. et al., 1995, PCR Methods and Applications

4(6):357-362; Heid, C. A. et al" Genome Research 6:986-994; Gibson, E. M. U. et al., 1996, Genome Research 6:995-1001)。 PCR増幅モニター法においては、例えば、 ABI PRISM7700 (PEバイオシステムズ社）を用いることができる。また本発明のアレルギー性疾患の検査方法は、前記指標遺伝子によりコ一ドされる蛋白質を検出することにより行うこともできる。以下、本明細書において、前記指標遺伝子によりコードされる蛋白質を指標蛋白質と記載する。このような検査方法としては、例えば、これら指標蛋白質に結合する抗体を利用したウェスタンブロッテイング法、免疫沈降法、 ELISA法などを利用することができる。この検出に用いる前記指標蛋白質に結合する抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、あるいはモノクローナル抗体（Milstein C, et al.,1983, Nature 305は 934): 537-40) であることができる。例えば、指標蛋白質に対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血液を取り出し、この血液から公知の方法により血清を分離する。ポリクローナル抗体としては、ポリクローナル抗体を含む血清を使用することができる。あるいは必要に応じてこの血清からポリクローナル抗体を含む画分をさらに単離することもできる。また、モノクローナル抗体を得るには、上記抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させる。こうして得られたハイプリドーマをクローユングして、その培養物から抗体を回収しモノクロ一ナル抗体とすることができる。

指標蛋白質の検出には、これらの抗体を適宜標識して用いればよい。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテイン Aやプロティン Gを標識して間接的に検出することもできる。具体的な検出方法としては、例えば、 ELISA法を挙げることができる。

抗原に用いる蛋白質もしくはその部分べプチドは、例えば該遺伝子もしくはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作成し、該形質転換体を培養して組み換え蛋白質を発現させ、発現させた組み換え蛋白質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、これらの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、あるいは全長 cDNAによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴぺプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。

更に本発明においては、指標遺伝子の発現レベルのみならず、生体試料における指標蛋白質の活性を指標として、ァレルギ一性疾患の検査を行うこともできる。指標蛋白質の活性とは、各蛋白質が備える生物学的な活性を言う。前記指標蛋白質の活性は、公知の方法に基づいて検出することができる。

本発明の検査方法においては、通常、被検者の生体試料を試料とする。生体試料としては、末梢血 T細胞等を用いることができる。末梢血から T細胞を得る方法は公知である。すなわち、末梢血を希釈してフイコールを利用して遠心分離することにより PBMCを分取することができる。分離した PBMCを試料として指標遣伝子あるいは指標蛋白質を測定することにより、本発明の検査方法を実施することができる。 PBMCには、リンパ球 (lymphocyte)や単球 (monocyte)が含まれる。しかし、実施例にも示すように、これらの血液細胞においては、指標遺伝子は T 細胞で高い発現が見られる。したがって、他の細胞の存在は指標遺伝子や指標蛋白質の測定結果にほとんど影響を与えない。あるいは抗 CD3抗体を固定したマイク口ビーズで T細胞を特異的に吸着し分離することもできる。

血液細胞を破壊し、細胞中の指標遺伝子の mRNA、あるいは指標蛋白質を測定することができる。また血中に存在する指標蛋白質を測定すること.もできる。 T 細胞のライセートや mRNAの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。例えば、 RNeasy Mini (登録商標）（Qiagen製）または ISOGEN (登録商標）（二ツボンジーン)等を用いることができる。

T細胞における指標遺伝子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正により、細胞における遺伝子の発現レベルの変化を比較することができる。測定値の補正は、 T細胞に発現し、かつ細胞の状態に関わらず発現レベルが大きく変動しない遺伝子（ハウスキーピング遺伝子）の発現レべルの測定値に基づいて、本発明において指標とすべき遺伝子の発現レベルの測定値を補正することによって行われる。このような遺伝子としては、 /3 -ァクチン（/3 -actin)遺伝子、およびダリセルアルデヒド 3リン酸脱水素酵素 (GAPDH)遺伝子が挙げられる。

本発明における指標遺伝子は、健常者とアトピー性皮膚炎患者との比較において、患者の T細胞で高い発現量を示した。従って、指標遺伝子の発現レベルを指標として、ァトピー性皮膚炎などのァレルギ一性疾患の検査を行うことができる。本発明におけるアレルギー性疾患の検査とは、たとえば以下のような検査が含まれる。アトピー性皮膚炎の症状を示しながら、一般的な検査ではアレルギー性疾患と判定できない患者であっても、本発明に基づく検查を行えばアレルギー性疾患の患者であることが容易に判定できる。より具体的には、アレルギー性疾患が疑われる症状を示す患者における指標遺伝子の発現の上昇は、その症状の原因がアレルギー性疾患である可能性が高いことを示している。皮膚炎症状には、ァレルギ一反応が原因となっているものと、そうでないものがある。両者の治療方法はまったく異なるので、いずれの原因によって皮膚炎の症状がもたらされているのかを診断することは、治療上、たいへん重要な工程である。本発明の検査方法は、皮膚炎の原因の特定において、きわめて重要な情報を提供することができる。

あるいは、アレルギ一症状が改善に向かっているのかどうかを判断するための検査が可能となる。本発明の指標遺伝子は、アレルギー性疾患患者の T細胞において発現量の増加を示した。 T細胞は免疫応答において司令塔としての役割を果たす細胞である。したがって、免疫応答を掌る T細胞で発現が高まる遺伝子は、治療効果の判定に有用である。より具体的には、アレルギー性疾患と診断された患者における指標遺伝子の発現の上昇は、アレルギーの症状が進行している可能性が高いことを示している。

また本発明は、 T細胞における、指標遺伝子 SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを上昇させたトランスジヱニック非ヒト動物のァレルギ一性疾患モデル動物としての使用に関する。アレルギー性疾患モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のァレルギ一性疾患モデル動物は、ァレルギ一性疾患の治療薬の評価に有用である。

本発明によって、 T細胞において前記指標遺伝子の発現レベルが、上昇することが明らかとなった。したがって、 T細胞において SOCS3遺伝子、または SOCS3 遺伝子と機能的に同等な遺伝子の発現レベルを人為的に増強した動物は、アレルギ一性疾患のモデル動物として利用することができる。本発明においてトランスジエニック動物とは、ゲノム DNAにおける 1または複数のヌクレオチドの挿入、置換、および/または欠失を伴う、遺伝的に改変された動物（genetically modified animals) を言う。このアレルギー性疾患モデル動物は、アレルギーにおける生体内の変化を明らかにするために有用である。更に、本発明のアレルギー性疾患モデル動物は、ァレルギ一性疾患の治療薬の評価おょぴスクリ一ユングに有用である。なお T細胞における発現レベルの上昇とは、血液細胞全体における指標遺伝子の発現レベルの上昇を含む。すなわち、前記指標遺伝子の発現レベルを上昇させるのは T細胞のみである場合のみならず、血液細胞全体において、あるいは全身性に前記遺伝子の発現レベルが上昇している場合を含む。

本発明において SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子とは、指標遺伝子

SOCS3によってコードされる蛋白質（指標蛋白質）の活性と同等の活性を備えた蛋白質をコードする遺伝子である。このような遺伝子としては、ヒト SOCS3遺伝子または他の生物のそのカウンターパートの人為的な改変体などが含まれる。例えば、ある遺伝子を発現ベクターに挿入する場合には、 N末端または C末端の数ァミノ酸を欠失させたり、タグぺプチドの配列または発現べクター由来の他のァミノ酸配列を付加することが頻繁に行われる。このような蛋白質は天然の細胞が持つ内在性蛋白質とアミノ酸配列が異なるが、その活性は実質的に内因性蛋白質と同等である。本発明においてこのような蛋白質をコードする遺伝子は、内因性遺伝子と機能的に同等な遺伝子と称する。

本発明における指標蛋白質の活性としては JAK阻害活性が挙げられる。例えばヒト SOCS3蛋白質の 1または複数のアミノ酸を欠失、挿入、および/または置換した蛋白質であって、 JAK阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を、本発明のトランスジエニックモデル動物の作製のために用いることができる。このような改変体蛋白質は、ヒト SOCS3蛋白質のアミノ酸配列に対して、たとえば 90% 以上、望ましくは 95%以上、更に望ましくは 99%以上の相同性を有する蛋白質である。また、 SOCS3遺伝子の塩基配列を含む DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含む遺伝子であって、 JAK阻害活性を有する蛋白質をコードする遺伝子も、 SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子として用いることができる。

あるいはヒト SOCS3タンパク質のアミノ酸配列に対して、たとえば 9 0 %以上、望ましくは 9 5 %以上、更に望ましくは 9 9 %以上の相同性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、 SOCS3遺伝子と機能的な遺伝子として示すことができる。また、実施例において用いた配列番号： 1と配列番号： 2に記載の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドをプライマーとして増幅することができる遺伝子であつて、 T細胞において発現が増大する遺伝子も、機能的に同等な遺伝子である。

本発明のモデル動物は、例えば（a ) 該モデル動物の表現型を検出する工程、および（b ) 該モデル動物と比べ T細胞における該指標遺伝子の発現レベルが低い動物（対照）の対応する表現型に対する違いをアレルギー疾患と関連付けるェ程により、アレルギー疾患のモデルとして使用することができる。対照の動物としては、該モデル動物と同じ遺伝背景を持つ非トランスジェユック動物、または空のベクタ一を導入したトランスジエニック動物などが挙げられる。表現型としては、例えば皮膚炎、鼻炎、または喘息等のアレルギー症状、あるいは免疫系細胞の活性化または遺伝子発現の変化などを含む、所望の表現型が挙げられる。本発明において、指標遺伝子 SO CS3の T細胞における発現レベルを上昇させることによって得ることができるトランスジエニック動物をアレルギ一性疾患モデル動物として使用し、この遺伝子の役割や、この遺伝子を標的とする薬剤を評価することには大きな意義がある。また本発明によるアレルギー性疾患モデル動物は、後に述べるアレルギ一性疾患の治療または予防のための医薬品のスクリー二ングに有用であると同時に、アレルギー性疾患のメカニズムの解明、さらにはスクリーニングされた化合物の安全性の試験にも有用である。たとえば本発明によるアレルギー性疾患モデル動物がァトピー性皮膚炎またはァレルギ一性喘息を発症したり、何らかのアレルギー性疾患に関連した測定値の変化を示せば、それを回復させる作用を持った化合物を探索するスクリーニングシステムが構築できる。本発明において、発現レベルの上昇とは、目的とする遺伝子が外来遺伝子として導入され強制発現している状態、宿主が備える遺伝子の転写および/または蛋白質への翻訳が増強されている状態、並びに翻訳産物である蛋白質の分解が抑制された状態のいずれかを意味する。遺伝子の発現レベルは、たとえば実施例に示すような定量的な PCRにより確認することができる。また翻訳産物である蛋白質の発現量または活性は、正常な状態と比較することにより確認することができる。代表的なトランスジエニック動物は、目的とする遺伝子を導入し強制発現させた動物である。この他のトランスジエニック動物には、たとえば mRNAの非翻訳領域（UTR) の配列などから RNA不安定ィ匕の要因となる配列を除去して mRNA の半減期を伸ばしたりすることができる。また、指標遺伝子のコード領域に変異を導入し、その活性を増強したり、あるいは分解されにくいアミノ酵配列に改変することなどを示すことができる。アミノ酸配列の変異には、置換、欠失、挿入、あるいは付カ卩を示すことができる。その他、遺伝子の転写調節領域を変異させることにより、指標遺伝子の発現そのものを上昇させることもできる。

特定の遺伝子を対象として、トランスジエニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第 4873191号）、胚性幹細胞（ES細胞）に遺伝子を導入する方法などによってトランスジエニック動物を得ることができる。その他、レトロウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、および、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子べクタ一法等も開発されている。精子べクタ一法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーシヨン等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、この精子を卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（M. Lavitranoetら， Cell, 57， 717， 1989)

本発明のアレルギー性疾患モデル動物として用いるトランスジエニック動物は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作成することができる。具体的には、マウス、ラット、ゥサギ、ミニブタ、ャギ、ヒッジ、サル、あるいはゥシ等の脊椎動物において様々な遺伝子の導入や発現レベルを改変されたトランスジヱニック動物が作り出されている。

更に本発明は、アレルギー性疾患治療薬のスクリーニング方法に関する。本発明において、指標遺伝子は、アレルギー性疾患患者の T細胞において有意に発現レベルが上昇している。したがって、これらの遺伝子の発現レベルを低下させることができる化合物を選択することによって、ァレルギ一性疾患の治療薬を得ることができる。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、遺伝子の転写、翻訳、タンパク質の活性発現のいずれかのステップに対して阻害的に作用する作用を持つ化合物である。

本発明のァレルギ一性疾患治療薬のスクリ一ユング方法は、 in wVoで行なうことも in vitroで行うこともできる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。なお本発明のスクリーニング方法における指標遺伝子とは、 SOCS3遺伝子に加え、 SOCS3遺伝子と機能的に同等ないずれかの遺伝子を含む。

( 1 ) 被験動物に、候補化合物を投与する工程、 ( 2 ) 被験動物の生体試料における前記指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物を投与しない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

本発明のスクリーニング方法における被験動物としては、たとえばアレルギー性疾患モデル動物を利用することができる。ァレルギ一性疾患モデル動物は公知である。たとえば人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、 NC/Ngaマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このマウスの耳介にダニ抗原 ( 5 /z g/耳）を 2-3日間隔で計 8回投与すると、 2週間以降にはヒトのアトピー性皮膚炎に酷似した症状を誘発することができる。この系に候補化合物を投与し、本発明の指標遺伝子の発現レベルの変化を追跡することによつて本発明によるスクリーニングを実施することができる。

このようにして被験動物に薬剤候補化合物を投与し、被験動物の生体試料における指標遺伝子の発^■に対する化合物の作用をモニターすることにより、指標遺伝子の発現レベルに与える薬剤候補化合物の影響を検出することができる。被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現レベルの変動は、前記本発明の検査方法と同様の手法によってモニターすることができる。更にこの検出の結果に基づいて、指標遺伝子の発現レベルを低下させる薬剤候補化合物を選択すれば、薬剤候補ィ匕合物をスクリーニングすることができる。

より具体的には、被験動物から、生体試料を採取し、前記指標遺伝子の発現レベルを候補化合物を投与しない対照と比較することにより、本発明によるスクリ一ユングを実施することができる。生体試料としては、全血、 PBMC、あるいは T細胞等を利用することができる。これらの生体試料の採取方法、および調製方法は公知である。

このようなスクリーニングにより、指標遺伝子の発現に様々な形で関与する薬剤を選択することができる。具体的には、たとえば次のような作用を持つ薬剤候補化合物を見出すことができる。

指標遺伝子の転写活性を低下させる作用、

指標遺伝子の転写産物からの翻訳を低下させる作用、

指標遺伝子の翻訳産物の活性を阻害する作用、

指標遺伝子の転写産物の安定化を低下もしくは分解を促進する作用等、また前記スクリーニング方法において、候補化合物の投与前およびまたは投与後に、被験動物をアレルゲンで刺激する工程を含む方法も本発明に含まれる。候補ィヒ合物の投与前にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激後の免疫応答を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリ一ユングによって得ることができる化合物には、ァレルギ一性疾患の治療効果を期待できる。また候補化合物の投与後にアレルゲンで刺激した場合には、候補化合物の、アレルゲン刺激による免疫応答の開始を抑制する作用を検出することができる。このようなスクリーニングによって得ることができる化合物には、ァレルギ一性疾患の予防効果を期待できる。本発明のスクリーニング方法に用いることができるアレルゲンとしては、公知のアレルゲン性の物質を用いることができる。具体的には、ダニ、ハウスダスト、植物の花粉、あるいは各種の食品由来のタンパク質等がアレルゲン性物質として公知である。これらのアレルゲンは、天然に由来するものであっても良いし、遺伝子組換えなどの手法によって合成されたものであっても良い。またアレルゲンは、タンパク質の断片であることもできる。精製アレルゲンの調製方法も公知である。

また、 in vitroでのスクリーニングにおいては、例えば、指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させ、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する方法が挙げられる。このスクリーニングは、たとえば以下のような工程にしたがって実施することができる。

( 2 ) 指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および ( 3 ) 候補化合物を接触させない対照と比較して、指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

本発明において、指標遺伝子を発現する細胞は、指標遺伝子を適当な発現べクターに挿入し、該ベクターを適当な宿主細胞に導入することにより得ることができる。利用できるベクター、および宿主細胞は、本発明の遺伝子を発現し得るものであればよい。宿主一ベクター系における宿主細胞としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞等が例示でき、それぞれ利用できるベクターを適宜選択することができる。

ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウィルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（HVJ (センダイゥィルス)、ポリエチレングリコール（PEG)、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクシヨン法、エレクト口ポレーシヨン法、ジーンパーティクルガン（gene gun) を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、 DEAEデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。

指標遺伝子を発現する細胞として、たとえば株化 T細胞 Molt4、あるいはヒト急性白血病 T細胞 Jurkat(ATCC Number TIB-152)は、本発明のスクリ一二ング方法に好適である。この細胞は、 ATCCより購入することができる。

本発明のスクリーニングの方法は、まず前記細胞株に候補化合物を添加する。その後、該細胞株における指標遺伝子の発現レベルを測定し、該遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する。

なお本発明のスクリーニング方法において、指標遺伝子の発現レべは、これらの遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルのみならず、対応する mRNAを検出することにより比較することもできる。 mRNAによって発現レベルの比較を行うには、タンパク質試料の調製工程に代えて、先に述べたような mRNA試料の調製工程を実施する。 mRNAやタンパク質の検出は、先に述べたような公知の方法によって実施することができる。

さらに本発明の開示に基づいて本発明の指標遺伝子の転写調節領域を取得し、レポーターアツセィ系を構築することができる。レポ一ターアツセィ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアツセィ系をいう。

すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリー二ング方法であって、指標遺伝子が、 SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。

( 1 ) 指標遺伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポータ一遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、

( 2 ) 前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物を接触させない対照と比較してレポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

転写調節領域としては、プロモーター、ェンハンサ一、さらには、通常プロモ ―タ一領域に見られる CAATボックス、 TATAポックス等を例示することができる。またレポーター遺子としては、 CAT(chloramphenicol acetyltransferase) 遺伝子、ルシフェラーゼ (luciferase)遺伝子、成長ホルモン遺伝子等を利用することができる。

マウスゃラット SOCS3遺伝子の転写調節領域についての報告 (Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Jun 8;96(12):6964-9, Autoregulation of pituitary corticotroph SOCS-3 expressionrcharacterization of the murine SOCS-3 promoter.

Auernhammer CJ, Bousquet C， Melmed S.; Eur J Biochem 2000 Oct; 267 (19):5849-57, Regulation of expression of the rat SOCS-3 gene in hepatocytes by growth hormone, interleukin-6 and glucocorticoids mRNA analysis and promoter characterization. Paul C， Seiliez I, Thissen JP， Le Cam A.; J Biol Chem 2002 Jan 18;277(3):2345-52, Regulation of Socs gene expression by the proto-oncoprotein GFI-1B: two routes for STAT5 target gene induction by erythropoietin.Jegalian AG, Wu H.)では、その転写が成長ホルモンゃ IL-6によつて誘導されること、転写調節領域には STAT-1/STAT-3結合配列や、特徴的なシスエレメントが存在することが報告されている。ヒトにおいても同様な実験が可能である。つまり、 SOCS3の転写調節領域の下流にルシフェラーゼゃ CATなどのレポーター遺伝子を結合し、 SOCS3の発現量を測定するアツセィ系を構築することができる。

たとえば、本発明のスクリーニングに用いる転写調節領域は、次のようにして取得することもできる。すなわち、まず本発明で開示した指標遺伝子の塩基配列に基づいて、 BACライブラリー、 YACライブラリ一等のヒトゲノム DNAライブラリー力ら、 PCRまたはハイブリダィゼーションを用いる方法によりスクリ一二ングを行い、該 cDNAの配列を含むゲノム DNAクローンを得る。得られたゲノム DNAの配列を基に、本発明で開示した cDNAの転写調節領域を推定し、該転写調節領域を取得する。得られた転写調節領域を、レポーター遺伝子の上流に位置するようにクローユングしてレポーターコンストラクトを構築する。得られたレポ一ターコンストラクトを培養細胞株に導入してスクリーニング用の形質転換体とする。この形質転換体に候補化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を制御する化合物のスクリーニングを行うことができる。

また、指標遺伝子の転写調節領域の制御下に連結されたレポーター遺伝子を含む細胞は、いわゆるノックイン動物の細胞であってもよい。ノックイン動物とは、内在性標的遺伝子の蛋白質コード領域に他の外来遺伝子が挿入された遺伝子改変動物を言う。ノックインされたこの外来遺伝子は、標的遺伝子の転写調節領域の下流に挿入されるため、内在性標的遺伝子と同様の発現制御を受けて発現する。ノックイン遺伝子としてレポーター遺伝子を用い、得られたノックイン動物またはその動物から得た細胞を使ってスクリーニングを行うことができる。ノックィン動物を用いてスクリーニングを行う方法は、（a ) 指標遺伝子部位にレポータ一遺伝子がノックインされた動物に候補化合物を投与する工程、（b ) 該レポーター遣伝子の発現レベルを測定する工程、および（c ) 該候補化合物を投与しない対照と比較して該レポ一タ一遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。例えば候補化合物を投与した場合および投与しない場合で、該ノックイン動物の白血球好ましくは T細胞における該レポーター遺伝子の発現レベルを測定し、その発現を低下させる化合物を選択する。またノックイン動物からの細胞を用いたスクリーニングは、（a ) 指標遺伝子部位にレポーター遺伝子がノックインされた動物からの細胞に候補化合物を接触させる工程、（b ) 該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程、および（c ) 該候補化合物を接触させない対照と比較して該レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程、を含む。例えば候補化合物の存在下または非存在下でノックイン動物から得た白血球好ましくは T細胞における該レポータ一遺伝子の発現レベルを測定し、該発現レベルを低下させる化合物を選択する。これらのスクリーニングは本発明の方法に含まれる。特に個体を用いたスクリーニングにおいては、指標遺伝子本来の機能を完全に欠損させないように、片方のアレルは正常のままにして指標遺伝子が発現するようにして、もう片方のァレルにレポーター遺伝子がノックインされているヘテロノックイン接合体を用いてスクリーニングを行うことが好ましい。

SOCS3の発現阻害剤として、たとえばドミナントネガティブ (dominant negative)を利用することができる。具体的には、 SOCS3の N-terminal kinase inhibitory region(KIR)領域に点突然変異を有する遺伝子は、ドミナントネガティブとして働き、 SOCS3の発現を阻害することがよく知られている。

in vitroでの本発明によるスクリーニング方法として、指標蛋白質の活性に基づくスクリーニング方法を利用することもできる。すなわち本発明は、次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法に関する。

( 1 ) 指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させる工程、

( 2 ) 前記蛋白質の活性を測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物を接触させない対照と比較して前記蛋白質の活性を低下させる化合物を選択する工程

ここで指標遺伝子と機能的に同等な遺伝子としては、上記のように内在性

SOCS3遺伝子の人為的な改変体などが含まれる。

このようなスクリーニングは、例えば指標遺伝子を外来的に細胞で発現させ、その細胞内における指標蛋白質の活性を測定することにより実施することができる。このためには、指標遺伝子を発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な哺乳動物細胞などに導入する。ベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウィルスベクタ一を使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（HVJ (センダイウィルス)、ポリエチレングリコール（PEG) 、電気的細胞融合法、微少核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロボレ一シヨン法、ジーンパ一ティクルガン（gene gun) を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソ一ム法、 DEAEデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。本発明における指標蛋白質である SOCS3には、たとえば IL-10のような抗炎症性サイトカインの作用を負に制御することが報告されている (Yasukawa H.， Sasajd A. and Yoshimura, A. 2000. Negative regulation of cytokine signaling pathway. Annu. Rev, Immunol. 18: 143-164.)。あるいは SOCS3は、 T細胞の Th2 への分化を誘導する機能を有する。その他、 SOCS3はレセプター自身、あるいはその下流の因子である Janus family of protein tyrosine kinase protein (JAK)と結合することによってレセプターからのシグナルを阻害する活性を有する。したがって、 SOCS3とレセプタ一との結合、または JAK蛋白との結合を指標として、 S0CS3の阻害活性を測定することができる。また、 JAK、 STAT系においては、キナーゼである JAKのキナーゼ活性、または転写因子である STATの転写活性を指標として SOCS3の活性を測定することができる。

例えば、 Thlの分化に重要な IL-12レセプターの下流では、 JAK2と STAT4が働いている。 SO CS3は JAK2と結合して JAK2のキナーゼ活性を阻害する (Genes Cells 1999 Jun;4(6):339-51 Cytokine-inducible SH2 protein-3 (CIS3/SOCS3) inhibits Janus tyrosine kinase by binding through the N-terminal kinase inhibitory region as well as SH2 domain.Sasaki A, Yasukawa H, Suzuki A, Kamizono S, Syoda T, Kinjyo I, Sasaki M， Johnston JA, Yoshimura A.)。従つて、 SOCS 3と JAK2との結合を測定する、または、 JAK2のキナーゼ活性を測定すれば、 SOCS3の働きを測定することができる。また、 JAK2の活性阻害の結果として STAT4が持つ転写活性の阻害が起こる。 STAT4が持つ転写活性の測定は STAT4レスポンシブエレメントをプロ一モーターとしてもちいたレポーターァッセィ系を用いれば、容易である。以上のような方法で IL-12下流のシグナルを阻害する SOCS3の活性を測定できる。

これらの活性を指標として、その活性を阻害する活性を有する化合物をスクリ一ユングすることができる。このようにして得ることができる化合物は、 SOCS3 の働きを抑制する。その結果、 T細胞において発現が誘導された指標蛋白質の阻害を通じて、ァレルギ一性の免疫応答を制御することができる。

これらスクリーニングに用いる被験候補化合物としては、ステロイド誘導体等既存の化学的方法により合成された化合物標品、コンビナトリァルケミストリーにより合成された化合物標品のほか、動 ·植物組織の抽出物もしくは微生物培養物等の複数の化合物を含む混合物、またそれらから精製された標品などが挙げられる。

本発明による各種のスクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、あるいはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。より具体的には、たとえば指標遺伝子を発現する細胞と、これらの指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬とで構成される。指標遺伝子の発現レベルを測定するための試薬としては、たとえば少なくとも 1つの指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、若しくはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも 1 5塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドが用いられる。あるいは、少なくとも 1つの指標蛋白質のァミノ酸配列を含むぺプチドを認識する抗体を試薬として用いることができる。これらのキットには、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地や容器、陽性や陰性の標準試料、更にはキットの使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。

本発明のスクリーニング方法によって選択される化合物は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。あるいは、本発明における指標遺伝子の発現を抑制することができるアンチセンス DNAも、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。好ましくはこのようなアンチセンス DNAは、本発明における指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも 20塩基、より好ましくは 25塩基以上、より好ましくは 30塩基以上、より好ましくは 40塩基以上、より好ましくは 50塩基以上、より好ましくは 100塩基以上の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンス DNAである。アンチセンス領域としては、指標遺伝子の転写産物（プロセッシング前、中間産物、またはプロセッシング後のいずれの転写産物でもよい）の任意の部位のアンチセンスであってもよい。このような部位としては、例えば翻訳開始コドンを含む領域などが挙げられる。更に、本発明における指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体は、アレルギー性疾患の治療薬として有用である。本発明の治療薬として有用な好ましい抗体として、例えば JAKとの相互作用ドメインに結合する抗体などを示すことができる。本発明のアレルギー性疾患の治療薬は、前記スクリーニング方法によって選択された化合物、該アンチセンス DNA、または該抗体を少なくとも 1つの主成分として含み、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合することによって製造することができる。本発明のアレルギー性疾患の治療剤は、アレルギー症状の改善を目的として、経口、あるいは非経口的に投与することができる。

経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を示すことができる。

また、投与すべき化合物がタンパク質からなる場合には、それをコードする遺伝子を遺伝子治療の手法を用いて生体に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である。

あるいはアンチセンス DNAは、適当なプロモーター配列の下流に組み込み、ァンチセンス RNA発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターをァレルギ一疾患患者の T細胞へ導入すれば、これらの遺伝子のァンチセンスを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によってアレルギーの治療効果を達成することができる。 T細胞への発現べクタ一の導入としては、 in vivo,あるいは ex vivo で行う方法が公知である。

投与量は、患者の年齢、性別、体重および症状、治療効果、投与方法、処理時間、あるいは該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人一人あたり、一回につき 0.1 mgから 500 mgの範囲で、好ましくは 0.5 mg から 20 mgの範囲で投与することができる。し力し、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で充分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。図面の簡単な説明

図 1は、健常人、及ぴアトピー性皮膚炎軽症、中等症、重症患者の T細胞における SOCSフアミリー (SOCSl、 SOCS3、 SOCS5、 CIS1) 遺伝子の発現レベルを示す図。縦軸は、 T細胞の RNA l ng当たりの各 SOCSの mRNAのコピー数を、横軸は試料を示す。 * ： p<0.05, * * ： p<0.01

図 2は、皮膚炎モデルマウスの作製、並びにプレドニゾロン軟膏の投与のスケジュールである。

図 3は、ダニ抗原感作期間中における、皮膚炎モデルマウスの耳浮腫の変化を測定した結果である。上は感作 1 4日後解剖分、下は感作 2 8日後解剖分の結果である。縦軸は耳浮腫率（％) を、横軸は感作期間（週）を示す (n=10， Mean土 S.E.)。

耳浮腫率（％) = (感作後の耳の厚さ/感作前の耳の厚さ）

図 4は、皮膚炎モデルマウスにおける Total IgE濃度の測定結果を示す (n=10， Mean±S.E.)。縦軸は、血中の総 IgE濃度 (ng/mL)を、横軸は感作期間（週）を示す。各カラムは左から順に非感作対照群、感作対照群、およぴプレドニゾロン投与群の測定結果に対応している。

図 5は、 NC/Ngaダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介における SOCS3の mRNA発現レベルを定量した結果を示す。縦軸は、 mRNAの発現レベル (copy/ng RNA), 横軸はダニ抗原感作開始後の日数を示す。各カラムは左から順に非感作対照群、感作対照群、およぴプレドニゾロン投与群の測定結果に対応している。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。

〔実施例 1〕患者および健常者からの血液採取アレルギー性疾患特異的に発現が異なる遺伝子を単離する目的で、症例を解析し、選出された患者および健常者から血液を採取した。健常者として 10名、アトピー性皮膚炎軽症患者として 7名、アトピー性皮膚炎中等症患者として 10名、ァトピ一性皮膚炎重症患者として 12名から血液を採取した。

〔実施例 2〕血液試料からのリンパ球画分の調製

血液 10mlから、以下のようにして T細胞を調製した。まずノポ社製等のへパリン lmlで注射筒壁を万遍なく処理し、最終濃度 50unit/mlのへパリンを含む 10ml 注射筒に採血した。このとき一人の採血に 22G針を 2本準備した。注射針をはずし、 50mlの遠心チューブ（ポリプロピレン製）に移した。 1500rpm、室温で 5分間遠心し、できるだけ表面近くから 1.1mlを採取し、 15000rpmで 5分間、 4°Cで遠心して上清 lmlを血漿 (plasma)として回収した。血漿を回収した残りに 3%のデキストラン（ナカライ社製）を含む 0.9% NaClを等量（9ml) 加え、静かに数回転倒させて混和した。その後 30分間室温で静置した。

PRP(Platelet rich plasma,血小板に富む血漿)を別の 15ml遠心チューブに移し、 1200rpm (トミー社製の遠心機で 150 Xgに相当する）で 5分間、室温で遠心した。遠心後、血小板は上清にあった。沈殿した細胞をギブコ社等から入手した Ca、 Mg不含の HBSS 5mlに懸濁した。これを、パスツールピペットを用いて Ficol Paque (フアルマシア社製)が 5mlが入ったチューブ（ファルコンチューブ： 2006または 2059；ポリプロピレン製） 1本に上層した。 1200rpmで 5分間遠心後、

1500rpm (Tomy社製の遠心機で 400 Xgに相当する）で 30分間室温で遠心した。その結果、顆粒細胞 (granulocytes 赤血球 (erythrocyte)が沈殿し、フイコール層を挟んで中間層にリンパ球 (lymphocyte)、単球 (monocyte),血小板 (platelet)が含まれた。

パスツールピぺットで中間層を回収し、 2〜3倍の容量の BSA/PBS(0.5% BSA， 2mM EDTA in PBS, pH7.2；使用直前に脱気した)を添加し、 1200rpm、 4でで 5 分間遠心した。沈殿を回収し、 BSA/PBSで 2回洗浄した。 2回目の洗浄後、細胞を 5mlに懸濁し、その一部をトリパンブルーで 2倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約 1 X 10⁷であった。これをリンパ球画分とした。

〔実施例 3〕リンパ球画分からの T細胞の分離

実施例 2で得たリンパ球画分を 1200rpmで 4°C、 5分間遠心し、 100 1あたり 10⁸ になるように BSA/PBSに懸濁した。容量は約 20 μ 1になった。これをエツベンドルフチューブ（1.5ml) に移し、 CD3マイクロビーズ液を添加した。その後、 30 分間 4〜： LO^Cに放置した（このとき氷上には置かなかった）。この試料をマグネチックセルソーター (MACS) (Miltenyi Biotech In 製）で以下のように処理した。

MS+/RS+カラムを 1^111 ]\^ 8または¥&1^0 ]^ 〇8セパレーションュニットに装着した（針は付けなかった）。 500 μ 1の BSA/PBSをカラムに静かにアプライし、バッファ一は流し出した。次に CD3マイク口ビーズ標識した細胞を力ラムにァプライした。カラムを 500 1で 3回洗浄した（Β細胞画分）。カラムをセパレーシヨンユニット力らはずし、溶出液を集めるチューブ上に置いた。 1mlの BSA/PBS をカラムにアプライし、カラム添付のプランジャーを用いポジティブ細胞を急速に流し出した。これを T細胞画分とした。

得られた T細胞画分について、 1200rpm、5分間 4°Cで遠心した。沈殿を BSA/PBS で 2回洗浄した。 2回目の洗浄後、細胞を lmlに懸濁し、その一部をトリパンブル一で 2倍に希釈して細胞数を測定した。全細胞数は約 4 X 10⁶であった。

〔実施例 4〕 T細胞からの^ RNAの調製

T細胞からの全 RNAの調製は RNeasy Mini (Qiagen製）を用い、原則として添付のマニュアルに従い行った。操作はすべて手袋を着用して、室温で行った。またゥォッシュバッファ一 RPEに 4倍量のエタノールを加えた。リシスバッファー RLTには 10 1/mlの 2-メルカプトェタノールを加えた。

細胞浮遊液を 1000〜： L200rpmで 5分間遠心し、上清をァスピレーションで除いた。沈殿に 350 /i lのリシスバッファー RLT(2-メルカプトエタノールを含む）溶液を加えた。この段階で、 RLTバッファ一中の細胞のライセ一トは、 -70°Cで保存可能であった。細胞のライセートを冷凍保存していた場合は、 37°Cで 10〜： 15分間ィンキュペートして、不溶物が見えるようなら最大速度で 3分間遠心し、上清のみを回収した。このライセートを 20Gの力テラン針を付けた注射筒でホモゲナイズ後、キアシュレッダー (QIAshredder)で処理した。すなわち、ピペットマンを用いて 350 1の細胞のライセートをキアシュレッダ一ュニットにアプライした。これを 1500rpmで 2分間遠心し、流出液を回収した。 350 1の 70%エタノールを加え、ピペッティングしてよく混ぜた。

RNeasyスピンカラムを添付の 2mlチュ一ブに装着し、細胞のライセート混合物をアプライし、 8000 Xg(11500rpm)で 1分間遠心し、流出液は捨てた。ゥォッシュバッファ一 RW1 700 / lをカラムにアプライし、 5分間フタをした形で立てた。

11500rpmで 15秒間遠心し、流出液は捨てた。カラムを新しい 2mlチューブに装着し、ゥォッシュバッファー RPE (エタノールを含む） 500 /x lをカラムにァプラィした後、 11500rpmで 15秒間遠心し、流出液は捨てた。ゥォッシュバッファー RPE 500 /z lをカラムにアプライし、最大速度で 2分間遠心した。カラムを新しい 1.5mlチューブに装着し、 DEPC処理した水 30 i lをアプライし、フタをして 10分間立てた。 11500rpmで 10分間遠心し、全 RNAを得た。濃度を測定し、量が少ないようなら、再度カラムを新しレ、 1.5mlチューブに装着し、 DEPC処理した水 30 μ ΐをアプライし、フタをして 10分間立て、 11500rpmで 10分間遠心した。

〔実施例 5〕全 RNAの DNase処理

T細胞から調製した全 RNAから DNAを除くため、 DNase処理を行った。反応は 2ュニットの DNase (二ツボンジーン社）および 50ュニットの RNaseインヒビタ一（フアルマシア社）を含む 100 /z lの I X DNaseバッファー（二ツボンジーン社）中で行った。これを 37°C15分間ィンキュベートした後、等量の PCI (フエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール =25:24:1)を加え、ボルテックスした。

12000rpmで室温、 10分間遠心し、上層（水層）を新しい 1.5mlチューブに移した。

1/10量の 3M酢酸ナトリゥム (pH 5.2)を加え、 2.5倍量の 100%エタノールおよびエタ沈メイトを加えて、転倒混和させた。 -20°Cで 15分間静置させた後、 12000rpmで 4°C、 15分間遠心し、上清を除去し、 70%エタノールを加えた。沈殿がはがれる程度にタッピングした後、上清をきれいに除去した。 3分間乾燥させ、 10〜20 / lのDDW(DNaseぉょびRNase不含)に溶解させた。濃度を測定し、使用まで- 80°Cに保存した。

〔実施例 6〕 ABI7700による発現量の定量

上記 T細胞より調製した全 RNA試料の一部を、 ABI-PRISM7700を用いる

TaqMan法による遺伝子発現定量 RT-PCRに使用した。この TaqMan法は、 PCR 増幅された DNA鎖を蛍光色素を用いてリアルタイムに定量検出するシステムである。

各 SOCS遺伝子の塩基配列を基にして作製したプライマーセットを使用した (表 1 ) 。また、 TaqManプロ一ブは 5'端を FAM (6-carboxy-fluorescein)で、 3' 端を TAMRA (6-carboxy-N，N,N'，N'-tetramethylrhodamine)で蛍光標識して用いた。使用したプライマーセット、および TaqManプローブの塩基配列を以下に示す。

CIS1プライマー

AF025947-f： ACCTGCAGAAGATGCCAGAAG (配列番号： 3 )

AF025947-r： TCGGCATACTCAATGCGTACA (配列番号： 4 ) ,

CIS1プローブ

AF025947p： TGTTCACGCTGTCAGTGAAAACCACTCG (配列番号： 5 )

SOCS1プライマー

■326-f ： AGACCCCTTCTCACCTCTTGAG (配歹 IJ番号： 6 )

U88326-r： AGAGGTAGGAGGTGCGAGTTCA (配列番号： 7 )

SOCS1プローブ

U88326p： TCCCCCTGGTTGTTGTAGCAGCTTAACT (配列番号： 8 ) SOCS3プライマー AB006967-f： CTTCAGCATCTCTGTCGGAAGA (配列番号： 9 )

ΑΒ006967-Γ： ATCGTACTGGTCCAGGAACTCC (配列番号： 10)

SOCS3プローブ

AB006967p： AACGGCCACCTGGACTCCTATGAGAAAG (配列番号： 1 1)

SOCS5プライマー

AF073958-f： GGCAGAAGCAGCGTCAGATAT (配列番号： 1 2)

AF073958-r： TGTGTGTGGACTTTCCAAGCT (配列番号： 1 3)

SOCS5プローブ

AF073958p： TGGAGACAGCCATACCCATGTTAGCAGA (配列番号： 1 4) PCR増幅のモニタリングのための反応液の組成は表 1に示した。各遣伝子のコピー数の標準として、以下に示すプラスミドを用いた。各プラスミドには、上記プライマ一によって増幅される断片が挿入されている。増幅される断片のサイズを 0 内に記載した。

CIS1 /pGEM-T easy(120bp)

SOCS1 /pCR2(120bp)

SOCS3 /pGEM-T easy(102bp)

SOCS5 /pGEM-T easy(76bp)

ABI-PRISM 7700の反応組成（ 1ゥエルあたりの反応量）

AmpErase UNG (lU/^ L) 0.5 テンプレート溶液 5

終里 50

SOCSフアミリーの遺伝子発現量を表 2および図：示す。

表 2 番号病態 SOCS3 SOCS5 SOCS1 CIS1

1 健常 1458.08 1601 .815 2329.491 3188.494

2 健常 351 .9105 1017.66 1406.479 2750.802

3 健常 968.497 3172.139 1844.762 3096.75

4 健常 495.7142 628.7065 2062.804 1227.037

5 健常 380.9607 703.5109 657.1982 2736.331

6 健常 500.85 627.0444 1513.615 3672.791

7 健常 481 .6213 810.591 1 659.7459 3926.74

8 健常 1249.566 1308.318 1749.39 6959.8

9 健常 1788.941 1360.944 2352.998 6168.417

10 健常 728.3886 1268.932 853.7053 7641 .104

1 1 軽症 807.0501 368.1823 719.6516 1976.83

12 軽症 41 .45852 472.873 649.9721 884.8137

13 軽症 319.5918 610.1423 1014.481 5270.148

14 軽症 312.6483 791 .68 627.4481 3760.644

15 軽症 370.994 982.9265 631 .1635 2547.374

16 軽症 842.0954 1251 .164 1814.699 1835.22

17 軽症 1035.245 974.4081 1 124.799 5343.038

18 中等 1555.719 1207.168 1692.552 3037.704

19 中等 4262.705 1870.288 1788.896 7820.949

20 中等 783.5549 809.9576 702.009 1 160.63

21 中等 2895.489 1423.61 1538.51 1 9594.791

22 中等 2418.919 2964.095 1865.82 7750.703

23 中等 326.0805 713.1234 963.3022 1835.058

24 中等 787.6964 799.9439 1 126.562 4280.359

25 中等 3129.147 983.0927 801 .9961 3274.252

26 中等 2037.736 681.7354 1015.533 4577.659

27 中等 41 12.386 1014.482 1227.672 2573.053

28 重症 586.8573 610.7941 488.507 2457.098

29 重症 1304.636 1061 .391 879.1024 2663.894

30 重症 3846.91 1503.684 1032.858 7322.066 31 重症 1308.956 2727.006 1299.147 6285.055

32 重症 544.8535 328.1689 338.7977 2238.208

33 重症 408.0696 283.592 670.1861 2852.863

34 重症 2886.85 1955.84 1327.421 9790.364

35 重症 4092.8 414.1079 638.445 3032.142

36 重症 2847.757 1296.949 799.8222 3102.048

37 重症 943.9513 1017.548 1443.823 2287.345

38 重症 2826.906 1278.804 2537.089 8966.379

39 重症 496.8299 1 137.852 1816.787 2102.247 以上の結果から明らかなように、 SOCSファミリーのうち、 SOCS3のみが患者試料で有意に高い発現を示した。健常と中等症間、健常と重症間、さらに軽症と中等症間、軽症と重症間でも有意差が認められた。

〔実施例 7〕 NC/Ngaダニ抗原誘発皮膚炎モデルマゥス耳介における SOCS3の mRNAの定量

人間のアトピー性皮膚炎に近いモデルとして、 NC/Ngaマウスを用いた皮膚炎自然発症モデルが報告されている。このモデル動物における SOCS3の mRNAの発現レベルの変化を観察した。

( 1 ) NC/Ngaマウスを用いたダニ抗原誘発皮膚炎モデルマゥスの作製

1. 皮膚炎モデル作製物質

皮膚炎を作製するための感作物質としてダニ抽出物- Dp (LSL社、 Lot No.

756112)を使用した。ダニ抽出物- Dpはャケヒヨウダニ（チリダニ科）の成虫から抽出した凍結乾燥粉末である。ダニ抽出- Dpは注射用水（大塚製薬工業、 Lot No. 1F76N) を用いて 5 mg/ml濃度に調整した。

2. 被験物質

作製した皮膚炎モデルに対する既存薬の効果を確認するために、プレドニゾロン軟膏 0. 5% (大正薬品工業、 Lot No. P715, P317, PE15) を使用した。

3.その他の薬物

RNA抽出の前処理に IS0GEN (和光純薬工業、 Lot No. 780011, 78001H, 800011) および麻酔薬としてジェチルエーテル（和光純薬工業、 Lot No. DMK2137) を使用した。

[使用動物]

試験には、 5週齢の NC/Nga雄性マウス（日本チヤ一ルス ' リバ一）を 6 5匹購入し、 6週齢で使用した。マウスは室温 20〜26°C (実測値 20. 0〜25. 1°C) 、湿度 40〜70% (実測値 35· 8〜73. 6%) 、照明時間 12時間 · 日（7時〜 19時）に設定した飼育室で飼育し、固形飼料 F-2 ( &橋農場）と水道水をそれぞれ自由摂取させた。試験には入荷時より 6日間以上予備飼育した後、一般状態の良好なものを使用した。

[試験群構成]

試験は、 3群構成で行った（非感作対照群、感作対照群、プレドニゾロン投与群）。ダニ抗原投与開始から 14日後、 28日後に各群 10匹ずつを解剖した。

[試験方法]

1. 皮膚炎モデルの作製

マウスを 1群 10匹として使用した。感作対照群およぴプレドニゾ口ン投与群は、左右の耳介および予め毛刈した背部 2箇所（計 4箇所）にダニ抗原 5 /z g/site (1 ；/ 1/site)を 3日間隔で皮内投与した（ダニ抗原投与開始 14日後解剖:計 5回投与、ダニ抗原投与開始 28日後解剖：計 9回投与）。本実施例の皮膚炎モデルの作製スケジユーノレを図 2に示す。

2. プレドニゾロン軟膏の投与

プレドニゾロン投与群の動物に対して、ダニ抗原投与開始 9日後よりプレドニゾロン軟膏を経皮投与した。プレドニゾロン軟膏の投与量は各ダニ抗原投与部位について 30mg (30m_gX 4箇所、 120mg/匹/回）とした。投与スケジュールを図 2に示した。

3. 耳浮腫の測定

試験期間中全群について、週 1回 dial thickness gaugeを用いて左右の耳の厚さを測定した。測定スケジュールを図 2に示した。

4. 背部皮膚（ダニ抗原投与部位）の症状観察

試験期間中全群について、週 1回ダニ抗原投与部位の症状観察を行った。観察はヒトァトピー性皮膚炎の臨床症状の評価基準を参考にスコア化した。観察スケジュールを図 2に示した。

評価項目：①搔痒症、 ②発赤 ·出血、 ③浮腫、 ④擦傷 ·組織欠損、 ⑤乾燥スコア： 0=無症状、 1 =軽度、 2=中等度、 3 =高度

それぞれの項目についてスコア化して、その総和を個体のスコアとした。

5. 血中 Total IgE濃度の測定

ダニ抗原感作 28日後解剖の動物について、ダニ抗原投与前、投与開始 14日（眼窩静脈より採血）および 28日後（腹部大静脈より採血）に採血し、遠心分離した後、血清を- 80°Cで保存した。保存した血清はマウス IgE測定キット（ャマサ EIA， Lot No. P102：ャマサ醤油（株)）を用いて血中 Total IgE濃度を測定した。測定スケジュールを図 2に示した。

6. 病理組織学的検査

ダニ抗原投与開始 14日に屠殺（エーテル麻酔下に脱血屠殺）してダニ抗原投与部位（左右の耳介および背中の皮膚 2箇所）、胸腺、脾臓およびリンパ節を摘出した。耳介および背中の皮膚のそれぞれ 1箇所および胸腺、脾臓、リンパ節は RNA 抽出用とした。残り耳介および皮膚（各 1箇所）は、 10%中性緩衝ホルマリン液で固定した後、定法に従ってパラフィンブロックを作製し、へマトキシリン 'ェォジン染色、トルイジンブルー染色およびコンゴ一レツド染色を施して光学顕微鏡的に検査した。検查スケジュールを図 2に示した。

7. R A抽出の前処理

摘出した耳介および背部皮膚のそれぞれ 1個所（約 1平方センチメートル）およぴ胸腺、脾臓、リンパ節を 15mLのファルコンチューブに入れた。次いで IS0GEN 5mLを注入し、ホモジナイザー（NS-310E; (株）日音医理科器械製作所）を用いて氷冷下にホモジナイズした。ホモジナイズ終了後液体窒素に浸し、凍結した。サンプルは RNA抽出まで- 80°Cで保管した。

[試験結果]

1. 耳浮腫の測定

ダニ抗原感作期間中における、皮膚炎モデルマゥスの耳浮腫の変化を測定した結果を図 3に示す。ダニ抗原投与 14日後解剖（図 3上）および 28日後解剖（図 3 下）のいずれの試験においても、非感作対照群では、耳浮腫は認められなかった。感作対照群では、ダニ抗原投与 1週間後より明らかな耳の肥厚を示し、 2週間後以降高値を持続した。プレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与 1週間後より明らかな耳の肥厚を示し、 2週以降の耳浮腫の増加を抑制した。

2. 背部皮膚の症状観察

ダニ抗原投与 14日後解剖および 28日後解剖のいずれの試験においても、ダニ抗原投与 2週間後より皮膚炎の症状を緩める個体が出現した。

3. 血中 Total IgE濃度の測定

図 4に Total IgE濃度の測定結果を示す。血中ダニ抗原を投与している感作対照群およびプレドニゾロン投与群では、ダニ抗原投与 2週間後より血中 Total IgE濃度の上昇が認められた。

4. 耳介皮膚の病理組織学的検査

ダニ抗原投与 14日後解剖

非感作対照群では、 1/10例で表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤 (主にリンパ球）、浮腫および結合組織の増生が認められたが、いずれも軽度な変化であった。残り 9/10例には異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生おょぴ肥満細胞の脱顆粒が軽度〜中等度で観察された。また 6/10例では潰瘍形成を伴っていた。

プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤 (好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒が軽度〜中等度の変化で観察された。なお、 6/10例では潰瘍形成を伴っていた。

ダニ抗原投与 28日後解剖

非感作対照群では、表皮、真皮および皮下組織において異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が軽度〜中等度の変化で観察された。さらに、 9/10例では潰瘍形成を伴っていた。

プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤 (好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が軽度〜中等度の変化で観察され、いずれも潰瘍形成を伴つていた。

5. 背部皮膚の病理組織学的検査

ダニ抗原投与 14日後解剖

非感作対照群では、異常所見は認められなかった。感作対照群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤（好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒力観察された。なお、 3/10例は潰瘍形成を伴っていた。

プレドニゾロン投与群では、表皮の肥厚、真皮と皮下組織には炎症性細胞浸潤 (好中球、好酸球、組織球ならびにリンパ球等）、浮腫、結合組織の増生および肥満細胞の脱顆粒等が観察された。なお、 1/10例で潰瘍形成を伴っていた。

ダニ抗原投与 28日後解剖

非感作対照群では、異常所見は認められなかった。感作対照群では、ダニ抗原投与 14日後解剖と同程度の変化が認められた。

プレドニゾ口ン投与群では、ダニ抗原投与 14日後と同程度の変化が観察された。 ( 2 ) NC/Ngaダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介における S0CS3 mRNA定量上記（1 ) で作製した NC/Ngaモデルマウスにおける、 S0CS3の mRNAを定量した。ダニ抗原投与 14日後解剖および 28日後に解剖したマゥスの耳介を ISOGENで凍結し、サンプルとした。

耳介組織からの cDNA合成

ISOGEN凍結サンプルを氷上で融解し、 20Gカテラン注射針（テルモ）にてホモジナイズした。得られたホモジネート 5mLのうち 600 Lを 1. 5mL tubeに分取し、 ISOGEN製品プロトコルに従い、 total RNAを抽出した。抽出した RNAについて、 RNeasyカラム（QUIAGEN) 処理を製品プロトコルに従って行った。次いで、 DNase

(RTグレード、二ツボンジーン）処理を製品プロトコルに従って行った。得られた Total 匪の 1 /z gにっき、 Random primers (GIBCO BRL) , Super script II (Invitrogen)を用い、製品プロトコルに従って cDNA合成後、 RNase H処理を行った。

mRNA定量

マウス試験群各 10匹分の cDNAを同濃度ずつ混合した。混合 cDNA 5ngにっき、 ABI7700を用いてマウス S0CS3の mRNA定量を行った。定量値について、マウス - actinの定量値を内部標準として補正を行った。定量実験に用いたプライマーおよびプローブの塩基配列を以下に示す。

マウス S0CS3 (accession No. U88328)

Forward primer (配列番号： 1 5 ) : 5' -CTTTCTTATCCgCgACAgCTC-3'

Reverse primer (配列番号： 1 6 ) : 5，- CACTggATgCgTAggTTCTTg- 3'

Probe (配列番号： 1 7 ) ： 5' -FAM- CACTggATgCgTAggTTCTTg- TAMRA- 3'

マウス - actin (accession No. X03672)

Forward primer (配列番号： 1 8 ) ： 5'- ACTATTGGCAACGAGCGGTTC -3'

Reverse primer (配列番号： 1 9 ) ： 5'- GGATGCCACAGGATTCCATACC - 3，

Probe (配列番号： 2 0 ) : 5' -FAM- CCTGAGGCTCTTTTCCAGCCTTCCTTCT -TAMRA-3' NC/Ngaダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介における S0CS3の mRNA発現を定量した結果を図 5に示した。 NC/Ngaダニ抗原誘発皮膚炎モデルマウス耳介において、ダニ抗原刺激開始 14日後、 28日後のいずれの時点においても S0CS3 mRNA発現は非感作対照群と比較して感作対照群、プレドニゾロン投与群において高い値を示した。プレドニゾロン塗布による明らかな発現変化は認められなかったが、プレドニゾロン投与群の血中 Total IgE濃度は感作群と同程度に高値を示しており、また病理組織学的知見においてもプレドニゾロン塗布によるダニ抗原誘発皮膚炎症状の改善も認められていないことより、 S0CS3 mRNA発現は皮膚炎症状を反映しているものと考えることができる。

以上の結果より、ヒト末梢血 T細胞における S0CS3 mRNA発現が皮膚炎患者で有意に高いことがマウス皮膚炎モデルにおいても確認されたと考えることができる。産業上の利用の可能性

本発明により、アトピー性皮膚炎患者の T細胞において有意に発現レベルが上昇する遺伝子 SOCS3が提供された。本発明の指標遺伝子に基づいて、アレルギー性疾患の検査、および治療薬のスクリーニングを行うことが可能となった。

本発明によって提供されたアレルギー疾患関連遺伝子は、アレルゲンの種類に関わらず、簡便にその発現レベルを知ることができる。したがって、アレルギー反応の病態を総合的に把握することができる。

また本発明によるアレルギーの検查方法は、末梢血単核球を試料としてその発現レベルを解析することができるので、患者に対する侵襲性が低い。しかも遺伝子発現解析に関しては、たとえば ECPなどの蛋白質測定と異なって、微量サンプルによる高感度な測定が可能である。遺伝子解析技術は、年々ハイスループット化、低価格化が進行している。したがって本発明によるアレルギーの検査方法は、近い将来、ベッドサイドにおける重要な診断方法となることが期待される。この意味でこれらの病態関連遺伝子の診断的価値は高い。

Claims

請求の範囲次の工程を含む、アレルギー性疾患の検査方法であって、指標遺伝子が S OCS3である方法。 ( a ) 被検者の生体試料における、指標遺伝子の発現レベルを測定する工程( b ) 該発現レベルを、健常者の生体試料における該指標遺伝子の発現レべルと比較する工程 ( c ) 該被検者の生体試料における該指標遺伝子の発現レベルの有意な上昇が観察された場合に被検者がアレルギー性疾患を有すると判定するェ程アレルギー性疾患がアトピー性皮膚炎である、請求項 1に記載の検査方法遺伝子の発現レベルを、 cDNAの PCRによって測定する請求項 1に記載の検查方法。遺伝子の発現レベルを、前記遺伝子によってコードされる蛋白質の検出によって測定する請求項 1に記載の検査方法。生体試料が末梢血 T細胞を含む試料である請求項 1に記載の方法。 SOCS3遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも 1 5塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドからなる、アレルギー性疾患検査用試薬。 SOCS3遺伝子によってコードされるァミノ酸配列を含むぺプチドを認識する抗体からなる、アレルギー性疾患検査用試薬。次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。 ( 1 ) 指標遺伝子を発現する細胞に候補化合物を接触させる工程 ( 2 ) 指標遺伝子の発現レベルを測定する工程、および ( 3 ) 候補化合物を接触させなレ、対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程細胞が T細胞である請求項 8に記載の方法。次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。 ( 1 ) 被験動物に候補化合物を投与する工程、 ( 2 ) 被験動物の生体試料における指標遺伝子の発現強度を測定する工程、および ( 3 ) 候補化合物を投与しない対照と比較して指標遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程次の工程を含む、ァレルギ一性疾患の治療薬のスクリ一ユング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。

( 1 ) 指標遣伝子の転写調節領域と、この転写調節領域の制御下に発現するレポータ一遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補物質を接触させる工程、

( 2 ) 前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、および

( 3 ) 候補化合物と接触させない対照と比較して前記レポータ一遺伝子の発現レベルを低下させる化合物を選択する工程

次の工程を含む、アレルギー性疾患の治療薬のスクリーニング方法であつて、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3遺伝子と機能的に同等な遺伝子である方法。

( 1 ) 指標遺伝子によってコードされる蛋白質と候補物質を接触させるェ程、 ( 2 ) 前記蛋白質の活性を測定する工程、および

請求項 8、 1 0、 1 1、 1 2のいずれかに記載のスクリーニング方法によって得ることができる化合物を有効成分として含有する、アレルギー性疾患の治療薬。

指標遺伝子のセンス鎖の塩基配列の連続する少なくとも 15塩基の配列に対して相補的な配列を含むアンチセンス DNAを主成分として含む、ァレルギ一性疾患の治療薬であって、指標遺伝子が SOCS3 または SOCS3 と機能的に同等な遺伝子である治療薬。

指標遺伝子によってコードされる蛋白質に結合する抗体を主成分として含む、アレルギー性疾患の治療薬であって、指標遺伝子が SOCS3遺伝子または SOCS3と機能的に同等な遺伝子である治療薬。

指標遺伝子の T細胞における発現強度を上昇させたトランスジヱニック非ヒト脊椎動物のアレルギー性疾患のモデル動物としての使用であって、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子である使用。指標遺伝子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列を有する少なくとも 1 5塩基の長さを有するオリゴヌクレォチドと、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングするためのキットであって、指標遺伝子が SOCS3または SOCS3と機能的に同等な遺伝子であるキット。

指標遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなるペプチドを認識する抗体と、指標遺伝子を発現する細胞からなる、アレルギー性疾患の治療薬をスクリーユングするためのキットであって、指標遺伝子が SOCS3 または SOCS3と機能的に同等な遺伝子であるキット。