WO2003055545A1

WO2003055545A1 - Adsorbant de cytokine, procede d'elimination par adsorption et appareil correspondant

Info

Publication number: WO2003055545A1
Application number: PCT/JP2002/013207
Authority: WO
Inventors: Fumiyasu Hirai; Tamiji Fujimoto; Shigeo Furuyoshi
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2001-12-25
Filing date: 2002-12-18
Publication date: 2003-07-10
Also published as: EP1466636A1; US20050063935A1; EP1466636A4; JPWO2003055545A1

Description

明糸田書サイト力インの吸着材、吸着除去方法および吸着除去装置技術分野

本発明は体液よりインターロイキン一 4 (以下、 I L— 4という）、ィンタ一ロイキン— 1 0 (以下、 I L一 1 0という）およびインターロイキン一 1 3 (以下、 I L一 1 3という）からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着除去するための吸着材、これを用いた前記サィトカインの吸着除去方法および前記サイトカインの吸着器に関する。背景技術

免疫担当細胞は免疫応答を引き起こす際に種々の活性物質を産生する。その一部はサイトカインと呼ばれるタンパク質性物質であり、種々の抗原特異的、非特異的免疫炎症反応に深く関わる生体防御因子として非常に重要な役割を果たしている。本来サイトカインは生体の恒常性の維持に必要不可欠なものであるが、炎症などの病態では過剰に産生され、炎症の病態形成、遷延に関わっている。

I ー4は1 9 8 2年に Howardと Paulにより、また Vi tet taらによって、 B細胞を活性化する因子として報告された物質である。その後 B細胞以外の細胞にも作用することが明らかとなり I L— 4という名称になった。 I L一 4は分子量 2 0 k D aの糖タンパク質である。 I L一 4の産生細胞としては、 T細胞や肥満細胞などが知られている。 I L一 4の機能として、 B細胞の活性化、分化および増殖の誘導、 T細胞の増殖および T h 2細胞への分化の誘導、胸腺細胞増殖誘導、 NK細胞および L AK細胞の活性誘導、好酸球性抗腫瘍作用、マクロファージ抗炎症性作用、肥満細胞増殖誘導、線維芽細胞 ·血管内皮細胞接着分子発現増強、ならびに造血系細胞コロニー形成促進といった多くのものがある。

I L一 10は 1989年に Mosmaimらによりサイトカイン産生を抑制する因子として同定された物質である。当初、 I L—10はサイト力イン産生抑制因子と呼ばれていたが、これ以外にも多彩な活性を有することが判明し I L— 10と改名された。 I L一 10は分子量 35から 40 kDaの同型二量体の糖タンパク質である。 I L_ 10の産生細胞としては、 Th 0/Th 2細胞、活性化 T細胞、単球 Zマクロファージ、活性化 B細胞、メラニン細胞などが知られている。 I L一 10の機能としては、 T細胞からの I FN—ァ産生の抑制、 T細胞の増殖の誘導、 B細胞の増殖の誘導、単球 AD C C活性の増強、および単球 Zマク口ファ一ジのモノカイン産生抑制といったものがある。

I L— 13は 1993年にフランスの Mintyらおよびアメリカの Brownらによりクロ一ニングされた物質である。 I L—13遺伝子を COS細胞に導入すると分子量 17 kD aの糖タンパク質として発現される。 I L一 1 3の産生細胞としては活性化 T細胞が知られている。 I L一 13の機能としては、 LPSで刺激した単球における炎症性サイトカインの産生抑制、単球の生存日数延長、ならびに単球および B細胞表面での CD 23および MHCクラス I Iの発現誘導といったものがある。

これら I L一 4、 I L- 10および I L- 13といったサイ卜力インは抗炎症性サイト力インと呼ばれ、その機能として、マクロファージ抗炎症性作用、単球/マクロファージのモノ力イン産生抑制、 LPSで刺激した単球における炎症性サイトカインの産生抑制といった抗炎症的な作用を、共通に有している。

近年、侵襲に対して引き起こされる過剰な生体反応を全身性炎症反応症候群 (S I RS ： systemic inflammatory response syndrome) という新しい概念で包括される病態においては、インタ一ロイキン一 1 (以下、 I L— 1という）、インタ一ロイキン一 6 (以下、 I L- 6という) 、インターロイキン一 8 (以下、 I L一 8という）および腫瘍壌死因子一 α (以下、 TNF— αという）といった炎症性サイト力インと呼ばれるタンパク質が過剰に産生され、これらの作用が中心となって全身性の炎症反応が進行し、組織障害および多臓器不全が出現し、ひいては死にいたることが報告されている。

抗炎症性サイトカインはこれら炎症性サイトカインの働きを抑えるとされてきたが、最近、代償性抗炎症性反応症候群 (CARS ： co即 ensatory anti-inflammatory response syndrome) という概念で包括される病態においては、過剰な抗炎症性サイト力インが産生され、その結果、免疫反応の抑制が起こり易感染状態となる。そのため敗血症などのように感染があつた場合には、臓器障害が併発される。

いずれにしてもサイトカインは本来局所で働くべきものであって、血液中の濃度が上昇することは人体にとって好ましくない。そこで、血液中からこれらサイトカインを除去する方法が望まれている。

炎症性サイトカインと呼ばれる、 I L— 1、 I L一 6、 I L一 8および TNF— αを除去する吸着材については既に開示されている（特開平 08 — 2571 15、特開平 08— 257398) 。この中で、水不溶性担体に 1 o gP値が 2. 50以上の.化合物を固定してなる吸着材でこれらの炎症性サイトカインが吸着除去できることが示されている。

本発明では、この水不溶性担体に 1 ogP値が 2. 50以上の化合物を固定してなる吸着材で、炎症についての生理活性の性質が前記炎症性サイトカインとは正反対である抗炎症性サイトカインの吸着除去が可能であることを新たに見出した。

本発明の目的は、体液中の I L— 4、 I L一 10および I L— 13からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去しうる吸着材、前記吸着材を用いた溶液中のサイトカインの吸着除去方法およびサイトカイン吸着器を提供することである。発明の開示

本発明者らは、体液中の I L_4、 I L— 10および I L一 13からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去しうる吸着材について鋭意検討した。その結果、水不溶性担体に l ogP値が 2. 50以上の化合物を固定してなる吸着材が体液中の I L一 4、 I L 一 10および I L- 13からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去しうることを見いだし、本発明を完成した。すなわち、本発明は水不溶性担体に 1 o g P (Pはォクタノ一ルー水系の分配係数）値が 2. 50以上の化合物を固定してなる I L一 4、 I L一 10および I L一 13からなる群より選択される少なくとも一種のサイト力インの吸着材に関する。

好適な実施態様においては、前記水不溶性担体は水不溶性多孔質担体である。

さらに本発明は、水不溶性担体に 1 o g P ( Pはォクタノ一ルー水系での分配係数）値が 2. 50以上の化合物を固定してなる、 I L— 4、 I L — 10および I L一 13からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの吸着材に、体液を接触させることを特徴とする、体液中の I L 一 4、 I L- 10および I L一 13からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの除去方法に関する。

さらに本発明は、液の入口および出口を有し、かつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性担体に l ogP (Pはォクタノール一水系での分配係数）値が 2. 50以上の化合物を固定してなる、 I L— 4、 I L一 1 0および I L - 1 3からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの吸着材を充填してなる前記の少なくとも一種のサイトカインの吸着器に関する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明のサイトカイン吸着器の一実施例の概略断面図である。図 1において、 1は液体の流入口、 2は液体の流出口、 3は本発明のサイトカイン吸着材、 4および 5は液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記サイト力イン吸着材は通過できないフィルター、 6はカラム、 7 はサイトカイン吸着器を示す。

図 2は、 3種類の材料を用いて流速と圧力損失との関係を調べた結果を示すグラフである。発明を実施するための最良の形態

本明細書において「 I L一 4」は、分子量が約 2 0 k D aの糖タンパク質である。

また、本明細書において「 I L _ 1 0」は、分子量が約 3 5から 4 0 k D aの同型二量体の糖タンパク質である。

さらに本明細書において「 I L— 1 3」は、分子量が約 1 7 k D aの糖タンパク質である。

さらに本明細書において体液とは、血液、血漿、血清、腹水、リンパ液、関節内液およびこれらから得られた分画成分、ならびにそのほかの生体由来の液体成分をいう。

本発明の吸着材は、 1 0 ^ ?値カ^ 2 . 5 0以上の化合物を水不溶性多孔質担体に固定化してなる。 l o g P値とは、化合物の疎水性のパラメ一夕であり、代表的なォク夕ノ一ルー水系での分配係数 Pは以下のように求められる。まず、化合物をォクタノール（もしくは水）に溶解し、これに等量の水（もしくはォク夕ノール）を加え、グリッフィン ·フラスク 'シェイカ一（Griffin flask shaker) (グリッフィン ·アンド ·ジョージ · リミテツド（Griffin & George Ltd.) 製）で 30分間振盪する。そののち 2000 r 111で1〜2時間遠心分離し、ォクタノール層および水層中の化合物の各濃度を、室温、大気圧下において分光学的または GLCなどの種々の方法で測定することにより次式から求められる。

P = C o c t /Cw

Co c t ：ォクタノール層中の化合物濃度

Cw ：水層中の化合物濃度

本発明の吸着体は、前記のようにして求められる 1 o gP値が 2. 50 以上の化合物を水不溶性担体に固定してなる。

これまでに多くの研究者らにより種々の化合物の 1 ogP値が実測されているが、それらの実測値はシ一 ·ハンシュ（C.Hansch) らによって整理されている ( 「パ一ティション■コ一フイシェンッ 'アンド 'ゼァ ·ユージズ；ケミカル■レビューズ (PARTITION COEFFICIENTS AND THEIR USES

； Chemical Reviews) 、 71卷、 525頁、 1971年」参照）。

また実測値の知られていない化合物についてはアール'エフ ·レツ力一

(R.F.Rekker) がその著書「ザ ·ハイドロフォビック ·フラグメンタル · コンスタント（THE HYDROPHOBIC FRAGMENTAL CONSTANT) 」，エルセピア

•サイェンティフィック ·パブリッシング ·カンパ二一 ·アムステルダム

(Elsevier Sci. Pub. Cora. , Amsterdam) (1977) 中に示している疎水性フラグメント定数 f を用いて計算した値（∑ f) が参考となる。疎水性フラグメント定数は数多くの 1 ogP実測値をもとに、統計学的処理を行い決定された種々のフラグメントの疎水性を示す値であり、化合物を構成するおのおののフラグメントの f値の和は 1 o gP値とほぼ一致すると報告されている。

I L— 4、 I L- 10および I L一 13からなるサイトカインの吸着に有効な化合物の探索にあたり、 2. 50以上の 1 ogP値を有する化合物を水不溶性担体に固定した結果、化合物としてへキサデシルァミン (∑ f =7. 22) を水不溶性担体に固定した場合、吸着能は非常に高いことがわかった。この結果より、本発明の吸着材による前記サイト力イン吸着は、 1 o g P値が 2. 50以上の化合物の固定により担体上に導入された原子団と前記サイトカインとのあいだの疎水性相互作用によるものと考えられる。

本発明において、水不溶性担体に固定化される化合物としては、 l og P値が 2. 50以上の化合物であれば特別な制限なしに用いることができる。ただし、担体上に化合物を化学結合法によって結合する場合、化合物の一部が脱離することが多い。この脱離基が化合物の疎水性に大きく寄与している場合、すなわち脱離により担体上に固定される原子団の疎水性が ∑ f = 2. 50より小さくなるような場合には、本発明の主旨から考えて、本発明に用いる化合物としては不適当である。この代表例の一つとして、安息香酸イソペンチルエステル (∑ f = 4. 15) をエステル交換により水酸基を有する担体上に固定する場合があげられる。この場合実際に担体上に固定される原子団は C₆H₅CO—であり、この原子団の∑ f は 1以下である。このような化合物が本発明で用いる化合物として適当かどう力、は、脱離基の部分を水素に置き換えた化合物の 10 g P値が 2. 50以上かどうか、または、脱離により担体上に固定される原子団の疎水性が∑ f =2. 50以上であるかにより判断すれば良い。

l ogP値が 2. 50以上の化合物の中でも不飽和炭化水素、アルコール、ァミン、チオール、力ルポン酸およびその誘導体、ハロゲン化物、ァルデヒド、ヒドラジド、イソシアナ一ト、グリシジルェ一テルなどのォキシラン環含有化合物、ハロゲン化シラン等のように担体への結合に利用できる官能基を有する化合物が好ましい。この様な化合物の代表例としては n—へプチルァミン、 n—ォクチルァミン、デシルァミン、ドデシルアミン、へキサデシルァミン、ォクタデシルァミン、 2—アミノォクテン、ナフチルァミン、フエ二ルー n—プロピルァミン、ジフエニルメチルァミンなどのアミン類、 n—へプチルアルコール、 n—ォクチルアルコール、ドデシルアルコール、へキサデシルアルコール、 1ーォクテン— 3—オール、ナフトール、ジフエニルメタノール、 4—フエ二ルー 2—ブタノールなどのアルコール類ならびにこれらのアルコールのグリシジルェ一テル類、 n —オクタン酸、ノナン酸、 2—ノネン酸、デカン酸、ドデカン酸、ステアリン酸、ァラキドン酸、ォレイン酸、ジフエニル酢酸、フエニルプロピオン酸などのカルボン酸類ならびにこれらの酸ハロゲン化物、エステル、ァミドなどのカルボン酸誘導体、塩化ォクチル、臭化ォクチル、塩化デシル、塩化ドデシルなどのハロゲン化物、オクタンチオール、ドデカンチオールなどのチオール類、 n—才クチルトリクロロシラン、ォクタデシルトリクロロシランなどのハロゲン化シラン類、 n—ォクチルアルデヒド、 n _力プリンアルデヒド、ドデシルアルデヒドなどのアルデヒド類などがあげられる。

これらの他にも、前記の例示化合物の炭化水素部分の水素原子がハ口ゲン、窒素、酸素、ィォゥなどのへテロ原子を含有する置換基、他のアルキル基などで置換された化合物のうち、 l o g P値が 2 . 5 0以上の化合物、前述のシー 'ハンシュ（C. Hansch) らの総説「パーティシヨン'コーフィシェンッ ·アンド ·ゼァ 'ユージス、；ケミカル ·レビューズ (PARTITION COEFFICIENTS AND THEIR USES； Chemical Reviews) 、 7 1巻、 5 2 5頁、 1 9 7 1年」中の 5 5 5ページから 6 1 3ページの表に示されている 1 o g P値が 2 . 5 0以上の化合物などを用いることができるが、本発明においてはこれらのみに限定されるものではない。

なお、これらの化合物はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の 2種類以上を組み合わせてもよく、さらには l o g P値が 2 . 5 0未満の化合物との組み合わせで用いてもよい。

本発明の吸着材における水不溶性担体とは、常温常圧で固体であり水不溶性であることを意味する。また、本発明における水不溶性担体は粒状、板状、繊維状、中空糸状等があるが形状は問わず、その大きさもとくに限定されない。

たとえば、本発明の吸着材が粒状である場合、平均粒子径は 5 m以上、 1 0 0 0 I m以下であることが好ましい。平均粒子径が 5 x mより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に細胞が通過し得る間隔が得られない傾向にある。平均粒子径が 1 0 0 0 / mをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から平均粒径は 2 5 m以上、 1 0 0 0 以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から 4 0 m以上、 6 0 0 m以下が特に好ましい。特に、体液が血液である場合には、血球が通過しやすい点から平均粒径は 2 0 0 m以上、 1 0 0 0 m以下であることが好ましく、吸着能が得られる点から 2 0 0 x m以上、 6 0 0 /z m以下がさらに好ましい。また、圧力損失の増大を引き起こさないなどの理由から、粒径分布は狭い方が好ましい。

また、本発明の吸着材が繊維状でかつ中空である場合、その内径は m以上、 5 0 0 z m以下であることが好ましい。内径が 1 mより小さいと、体液に細胞が含まれる場合に充分に細胞が通過しない傾向にある。内径が 5 0 0 mをこえると、体積あたりの吸着能が充分得られない傾向にある。細胞がスムーズに通過できる点から内径が 2 ^ m以上、 5 0 0 m 以下がさらに好ましく、より細胞が通過しやすくまた吸着能が得られる点から 5 ^ m以上、 2 0 0 m以下が最も好ましい。

本発明の吸着材における水不溶性担体としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリァクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や結晶性セルロ一ス、架橋セルロース、架橋ァガロース、架橋デキストリンなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機一有機、有機一無機などの複合担体などが代表例としてあげられる。なかでも、親水性担体が非特異吸着が比較的少なく、サイト力インの吸着選択性が良好であるため好ましい。ここでいう親水性担体とは、担体を構成する化合物を平板状にしたときの水の接触角が 6 0度以下の担体を指す。水の接触角の測定方法は種々知られているが、たとえば池田がその著書（実験化学選書 ·コロイド化学，第 4章，界面の熱力学， 7 5頁から 1 0 4頁，裳華房（1 9 8 6 ) ) に示しているごとく、化合物の平板上に水滴を置き測定する方法が最も一般的である。上記の方法で測定した水の接触角が 6 0度以下である化合物としては、セルロース、ポリビニルアルコール、エチレン—酢酸ビエル共重合体けん化物、ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸グラフト化ポリエチレン、ポリアクリルアミドグラフト化ポリエチレン、ガラスなどからなる担体が代表例としてあげられる。

これらの水不溶性担体は、適当な大きさの細孔を多数有する、すなわち多孔構造を有する担体であることがより好ましい。多孔構造を有する担体には、基礎高分子母体が微小球の凝集により 1個の球状粒子を形成する際に微小球の集塊によって形成される空間（マクロポア一）を有する担体だけでなく、基礎高分子母体を構成する 1個の微小球内の核と核との集塊の間に形成される細孔を有する担体、あるいは三次元構造（高分子網目）を有する共重合体が親和性のある有機溶媒で膨潤された状態の時に存在する細孔（ミクロポア一）を有する担体が含まれる。

また吸着材の単位体積あたりの吸着能から考えて、多孔構造を有する水不溶性担体は、表面多孔性よりも全多孔性が好ましく、また空孔容積および比表面積は、吸着性が損なわれない程度に大きいことが好ましい。

これらの好ましい要件を満たす担体として、多孔質セルロースゲルがあげられる。多孔質セルロースゲルは、（1 ) 機械的強度が比較的高く、強靭であるため撹拌などの操作により破壊されたり微粉を生じたりすることが少なく、カラムに充填した場合体液を高速で流しても圧密化したりしないので高流速で流すことが可能となり、また細孔構造が高圧蒸気滅菌などによって変化を受けにくい、（2 ) ゲルがセルロースで構成されているため親水性であり、リガンドの結合に利用しうる水酸基を多数存在し、非特異的吸着も少ない、（3 ) 空孔容積を大きくしても比較的強度が高いため軟質ゲルに劣らない吸着容量が得られる、（4 ) 安全性が合成高分子ゲル等に比べて高いなどの優れた点を有しており、本発明に用いる最も適した担体の 1つである。しかしながら本発明においてはこれらのみに限定されるものではなく、さらに上述の担体はそれぞれ単独で用いてもよいし、任意の 2種類以上を混合して用いてもよい。

またこのような多孔構造を有する水不溶性担体は、吸着対象の物質はある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他のタンパク質の侵入はできる限り起こらない特徵を有することがより好ましい。すなわち本発明の吸着材の吸着対象である I L— 4は分子量約 2 0 k D aのタンパク質であり、 I L - 1 0は分子量約 3 5から 4 0 k D aのタンパク質、さらに I L一 1 3は分子量約 1 7 k D aのタンパク質であるため、これらのタンパク質を効率よく吸着するためには前記サイトカインはある程度大きな確率で細孔内に侵入できるが、他の夕ンパク質の侵入はできる限り起こらないことがより好ましい。細孔内に侵入可能な物質の分子量の目安としては、排除限界分子量が一般に用いられている。排除限界分子量とは成書（たとえば、波多野博行、花井俊彦著、実験高速液体クロマトグラフ、化学同人）などに述べられているごとく、ゲル浸透ク口マトグラフィ一において細孔内に侵入できない（排除される）分子の内最も小さい分子量をもつものの分子量をいう。排除限界分子量は一般に球状タンパク質、デキストラン、ポリエチレングリコールなどについてよく調べられているが、本発明に用いる担体の場合、球状タンパク質を用いて得られた値を用いるのが適当である。種々の排除限界分子量の担体を用いて検討した結果、前記サイトカインの吸着に適当な球状夕ンパク質の排除限界分子量の範囲は 5千以上 6 0万以下であることが明らかとなった。すなわち球状タンパク質の排除限界分子量が 5千未満である担体を用いた場合には、前記サイトカインの吸着量は小さくその実用性が低下し、また 6 0万を超えるものでは、前記サイト力イン以外のタンパク質 (主としてアルブミン) の吸着が大きくなり、選択性の点でその実用性が低下する。従って本発明に用いる担体の球状タンパク質の排除限界分子量は 5千以上、 6 0万以下が好ましい。より効果的な吸着量と選択性が得られる点から 6千以上、 4 0万以下がさらに好ましく、 1万以上、 3 0万以下が最も好ましい。

さらに、担体にはリガンドの固定化反応に用いうる官能基を有していることが好ましい。これらの官能基の代表例としては水酸基、アミノ基、ァルデヒド基、力ルポキシル基、チオール基、シラノール基、アミド基、ェポキシ基、ハロゲン基、スクシ二ルイミド基、酸無水物基などがあげられるが、これらに限定されるわけではない。

本発明に用いる担体としては硬質担体、軟質担体のいずれも用いることができるが、体外循環用の吸着材として使用する場合には、カラムに充填し、通液する際などに目詰まりを生じないことが重要であり、そのためには充分な機械的強度が要求される。したがつて本発明に用いる担体は硬質担体であることがより好ましい。ここでいう硬質担体とは、たとえば粒状ゲルの場合、後記参考例に示すごとく、ゲルを円筒状カラムに均一に充填し、水性流体を流した際の圧力損失△ Pと流量の関係が 0. 3 k g / c m ²までの直線関係にあるものをいう。

本発明の吸着材は 1 o g P値が 2. 50以上の化合物を水不溶性多孔質担体に固定して得られるが、その固定化方法としては公知の種々の方法を特別な制限なしに用いることができる。しかしながら、本発明の吸着材を体外循環治療に供する場合には、滅菌時あるいは治療時においてのリガンドの脱離溶出を極力抑えることが安全上重要であり、そのためには共有結合法により固定化することが好ましい。

本発明の吸着材における 1 o g P値が 2. 50以上の化合物の固定量は、 1 o 1 /g—湿重量以上、 5000/xmo l/g—湿重量以下が好ましい。固定量が 1 zmo lZg—湿重量より少ないと、前記サイト力インの吸着が充分でなくなる傾向にある。固定量が 5000 umo lZg—湿重量をこえると、液体が血液である場合に、血小板などの粘付着が起こる傾向にある。効果的な吸着能力があり、血小板付着がより少ないという点から 5 mo 1 Zg—湿重量以上、 3000 ^mo 1 /g—湿重量以下がさらに好ましい。

本発明による吸着材を用レゝて体液中より前記サイトカインを吸着除去する方法には種々の方法がある。最も簡便な方法としては体液を取り出してバッグなどに貯留し、これに吸着材を混合して前記サイ卜力インを吸着除去した後、吸着材を濾別して前記サイトカインが除去された体液を得る方法がある。次の方法は体液の入口と出口を有し、出口には体液は通過するが吸着材は通過しないフィルタ一を装着した容器に吸着材を充填し、これに体液を流す方法がある。いずれの方法も用いることができるが、後者の方法は操作も簡便であり、また体外循環回路に組み込むことにより患者の体液、とくに血液から効率よくオンラインで前記サイトカインを除去することが可能であり、本発明の吸着材はこの方法に適している。

ここでいう体外循環回路では本発明の吸着材を単独で用いることもできるが、他の体外循環治療システムとの併用も可能である。併用の例としては、人工透析回路などがあげられ、透析療法との組み合わせに用いることもできる。

つぎに、前記サイトカイン吸着材を用いた本発明のサイトカイン吸着器を、一実施例の概略断面図である図 1に基づき説明する。図 1中、 1は液体の流入口、 2は液体の流出口、 3は本発明のサイトカイン吸着材、 4および 5は液体および液体に含まれる成分は通過できるが前記サイトカイン吸着材は通過できないフィルタ一、 6はカラム、 7はサイト力イン吸着器を示す。しかしながら、サイト力イン吸着器はこのような具体例に限定されるものではなく、液の入口、出口を有し、かつサイト力イン吸着材の容器外への流出防止具を備えた容器内に前記吸着材を充填したものであれば、どのようなものでもよい。

前記流出防止具には、メッシュ、不織布、綿栓などのフィルタ一があげられる。また、容器の形状、材質、大きさにはとくに限定はないが、形状としては筒状容器が好ましい。容器の材質として好ましいのは耐滅菌性を有する素材であるが、具体的にはシリコンコートされたガラス、ポリプロピレン、塩化ビニール、ポリ力一ポネート、ポリサルフォン、ポリメチルぺンテンなどがあげられる。容器の容量は 5 O m l以上、 1 5 0 O m 1以下で、直径は 2 c m以上、 2 O c m以下が好ましい。容器の容量が 5 0 m 1より小さいと吸着量が充分でなく、 1 5 0 O m 1より大きいと体外循環量が多くなるので好ましくない。容器の直径が 2 c mより小さいと線速が大きくなるため圧力損失が大きくなり好ましくない。 2 0 c mより大きいと取り扱いにくくなるうえ線速が小さくなるため凝固の危険性があり好ましくない。効果的な吸着量があり、安全性に優れているという点から容量は 100 m 1以上、 800ml以下で、直径は 3 c m以上、 15 c m以下がさらに好ましく、容量は 15 Oml以上、 400m l以下で、直径は 4 cm以上、 10 cm以下が特に好ましい。

以下、実施例において本発明についてさらに詳細に述べるが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。両端に孔径 15 mのフィル夕一を装着したガラス製円筒カラム（内径 9mm、カラム長 150mm) にァガロース材料（バイオラッド (B i o — r a d) 社製の B i o g e 1 A— 5m、粒径 50〜 100メッシュ）、ビニル系高分子材料（東ソ一（株）製のトヨパ一ル HW_ 65、粒径 50 -100 urn) およびセルロース材料（チッソ (株) 製のセル口ファイン GC_ 700m、粒径 45〜： 105 m) をそれぞれ均一に充填し、ペリスタティックポンプにより水を流し、流量と圧力損失 ΔΡとの関係を求めた。その結果を図 2に示す。

図 2に示すごとく、トヨパール HW— 65およびセル口ファイン GC— 700mが圧力の増加にほぼ比例して流量が増加するのに対し、 B i o g e 1 A_ 5mは圧密化を引き起こし、圧力を増加させても流量が増加しないことがわかる。本明細書においては前者のごとく、圧力損失 ΔΡと流量の関係が 0. 3 k g/ cm²までの直線関係にあるものを硬質材料という。実施例 1

セルロース系多孔質ゲルであるセル口ファイン GC— 200m (チッソ (株）製、粒径 45〜105 um, 球状タンパク質の排除限界分子量 14 0, 000) 170m 1に水を加えて全量 340m 1としたのち、 2M水酸化ナトリウム水溶液 9 Omlを加え 40°Cとした。これにェピクロルヒドリン 3 lmlを加え、 4 Otで攪拌下 2時間反応させた。反応終了後、充分に水洗し、エポキシ化ゲルを得た。

このエポキシ化ゲル 10m 1に n—へキサデシルァミン（∑ f = 7. 2 2) 200mgを加え、エタノール中、 45°Cで静置下、 6日間反応させ、固定化した。反応終了後、エタノール、水の順に充分洗浄し、 n—へキサデシルァミン固定化ゲルを得た（n—へキサデシルァミン固定量： 45 mo 1 / g—湿堇量) 。

この固定化ゲル 0. 5mlに対し、健常人血清（大日本製薬（株）製）にヒト遺伝子組換え I L一 4、 I L— 10および I L— 13 (いずれもァ —ル ·アンド ·ディ一 ·システムズ（R&D systems) 社製）を加えて調製したサイトカイン加健常人血清 3m 1を加え、 37 °Cで 2時間インキュべ ―トした。ィンキュベ一ション後の上清の各サイトカイン濃度をヒト I L _ 4測定キット、ヒト I L一 10測定キットおよび I L— 13測定キット (いずれもバイオソース（Biosouece) 社製）を用いて測定した。結果を表 1に示す。

実施例 2

n一へキサデシルァミンを n—ォクチルァミン ( 1 o gP = 2. 90) に、固定化反応の媒体をエタノールから 50 (v/v) %エタノール水溶液に変えたほかは実施例 1と同様にして n—才クチルァミン固定化ゲルを得た（n—才クチルァミン固定量： 43 mo lZg—湿重量）。この固定化ゲルを用いて実施例 1と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表 1に示す。

比較例 1

n—才クチルァミンを n—へキシルァミン（ 1 o gP = 2. 06) に変えたほかは、実施例 2と同様にして n—へキシルァミン固定化ゲルを得た (n—へキシルァミン固定量： 46 /xmo l/g_湿重量）。この固定化ゲルを用いて実施例 1と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表 1に示す。

比較例 2

n—ォクチルァミンを n—プチルァミン（ 1 o gP= 0. 9 7) に変えたほかは、実施例 2と同様にして n—プチルァミン固定化ゲルを得た (n ーブチルァミン固定量： 48 mo lZg—湿重量）。この固定化ゲルを用いて実施例 1と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表 1に示す。

比較例 3

リガンドを固定化していないセル口ファイン GC— 2 0 Omを用いて実施例 1と同様にして吸着実験を行い、各サイト力イン濃度を測定した。結果を表 1に示す。表 1

表 1より、実施例 1および 2では比較例 1、 2および 3と比べて、上清中の各サイトカイン濃度が大きく低下していることがわかる。

実施例 3

酢酸セルロースをジメチルスルホキシドとプロピレングリコールの混合溶剤に溶解し、この溶液を特開昭 6 3 - 1 1 7 0 3 9号公報に記載された方法（振動法）により液滴化し、凝固させて、酢酸セルロースの球形のヒドロゲル粒子を得た。このヒドロゲル粒子を水酸化ナトリゥム水溶液と混和し、加水分解反応を行い、セルロースのヒドロゲル粒子（平均粒子径 4 60^m、球状タンパク質の排除限界分子量 5万）を得た。実施例 1と同様に、ェピクロルヒドリンを反応させ、さらに n—へキサデシルァミンを固定化し、 n一へキサデシルァミン固定化粒子を得た (n_へキサデシルアミン固定量： 35 /1 mo lZg—湿重量）。この固定化粒子を用いて実施例 1と同様にして吸着実験を行い、各サイト力イン濃度を測定した。結果を表 2に示す。

実施例 4

n—へキサデシルァミンを n—才クチルァミンに、固定化反応の媒体をエタノールから 50 (v/v) %エタノール水溶液に変えたほかは実施例 3と同様にして n—才クチルァミン固定化粒子を得た（n—才クチルアミン固定量： 33 ^mo 1/g—湿重量）。この固定化粒子を用いて実施例 1と同様にして吸着実験を行い、各サイト力イン濃度を測定した。結果を表 2に示す。

比較例 4

実施例 3で作製した、リガンドを固定化していないセル口一スのヒドロゲル粒子を用いて実施例 1と同様にして吸着実験を行い、各サイトカイン濃度を測定した。結果を表 2に示す。表 2

サイトィン濃度（p g/m 1 )

I L-4 I L- 10 I L- 13 実施例 3 10 70 170 実施例 4 20 80 270 比較例 4 260 390 2300 表 2より、実施例 3および 4では比較例 4と比べて、上清中の各サイト力ィン濃度が大きく低下していることがわかる。産業上の利用可能性

本発明の方法による水不溶性担体に 1 o g P値 2. 50以上の化合物を固定化した吸着材を用いることで、 I L— 4、 1 _10ぉょび1し— 1 3からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを効率よく吸着除去することができる。

Claims

言青求の範囲

1. 水不溶性担体に l o g P ( Pはォクタノール一水系での分配係数）値が 2 . 5 0以上の化合物を固定してなる、インタ一ロイキン一 4、イン夕一ロイキン一 1 0およびインターロイキン一 1 3からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着材。

2. 該水不溶性担体が水不溶性多孔質担体であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の吸着材。

3. 7j不溶性担体に 1 o g P ( Pはォクタノ一ルー水系での分配係数）値が 2 . 5 0以上の化合物を固定してなる、イン夕一ロイキン一 4、インターロイキン一 1 0およびインターロイキン— 1 3からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着材に、体液を接触させることを特徴とする、体液中のインタ一ロイキン一 4、イン夕一ロイキン— 1 0およびインタ一ロイキン— 1 3からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインの除去方法。

4. 液の入口および出口を有し、かつ、吸着材の容器外への流出防止手段を備えた容器内に、水不溶性担体に l o g P (Pはォクタノール—水系での分配係数）値が 2 . 5 0以上の化合物を固定してなる、インタ一口ィキン— 4、インタ一ロイキン一 1 0およびインターロイキン一 1 3からなる群より選択される少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着材を充填してなる前記の少なくとも一種のサイトカインを吸着するための吸着器。

5. 体液からインターロイキン一 4、インターロイキン一 1 0およびインターロイキン一 1 3からなる群より選択される少なくとも一種のサイト力インを吸着除去するための、水不溶性担体に l o g P ( Pはォクタノ一ルー水系での分配係数）値が 2 . 5 0以上の化合物を固定してなる吸着材の使用。