WO2003046505A2 - Vorrichtung zur detektion von kohlendioxid und verfahren zur feststellung einer mikrobiologischen kontamination eines flüssigen mediums - Google Patents

Vorrichtung zur detektion von kohlendioxid und verfahren zur feststellung einer mikrobiologischen kontamination eines flüssigen mediums Download PDF

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WO2003046505A2
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microbiological contamination
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Manfred Schinkinger
Gert Fränzl
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Sy-Lab Vgmbh
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    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas

Definitions

  • the invention relates to a device for detecting carbon dioxide and a method for determining microbiological contamination of a liquid medium.
  • liquid media such as emulsions, solutions and liquid filterable mixtures
  • emulsions such as emulsions, solutions and liquid filterable mixtures
  • membrane filters impenetrable to microorganisms are then incubated in appropriate nutrient media for growing and visualizing any microorganisms present.
  • US Pat. No. 4,036,698 describes an integrated filtration system for a contamination-free sterility test of filterable ones Sterile products suggested.
  • the filtration, the rinsing of the filters, the introduction of the nutrient solutions and the subsequent incubation for the detection of any microbial contaminants that may be present are carried out in an arrangement of a filtration unit with feed and outlet openings and the corresponding connecting hoses in such a way that their combination forms a closed system sealed off from the outside ,
  • the membrane filter is located in a closed, sterile vessel which is at the same time intended to receive the nutrient solution for the incubation.
  • Test solution and optionally rinsing solutions are brought into the vessel by means of suitable pumps and filtered through the membrane filter.
  • the filtrate is collected in a collecting container on the non-sterile, downstream side of the filter.
  • the nutrient solution is also introduced into the filtration container via the hose and pump system and the membrane filter is covered with it.
  • test solution means that the nutrient medium is primarily clouded.
  • a visual evaluation is then no longer possible. In these cases, the evaluation must be carried out by an additional test step at the end of the prescribed incubation period using a subculture on solid nutrient media.
  • the membrane filter is washed with the nutrient medium before incubation. This prevents sterility from being simulated by the antimicrobial effect of inhibitors.
  • the European pharmacopoeia prescribes not only the use of filters with a maximum pore size of 0.45 ⁇ m, but also the validation of the inactivation of existing inhibitors using reference germs with a defined inoculation density. The exclusively visual evaluation, however, also allows only limited statements about the effect of the inactivation process in the context of the validation.
  • CO 2 as a terminal metabolic product is scientifically proven for all aerobically and microaerophilically growing microorganisms and is already widely used commercially for the detection of microorganisms.
  • Other detection systems use the change in the spectroscopic properties of the nutrient medium caused by the CO 2 formed , or the pressure increase in a closed system caused thereby.
  • the supernatant of microbial cultures is determined at regular intervals by radiometry or by infrared spectroscopy for the change in CO 2 (US Pat. No. 3,935,073).
  • the Szgn / ® blood culture system from Oxoid Ltd. (EP-A - 0 124 193) takes advantage of the increase in Pressure by the CO 2 formed in order to press culture fluid into a separate vessel superimposed on the culture medium, and thus offers an indication of contamination.
  • the Biomatic ® system (EP-A - 0 930 368) also uses a liquid sensor system separated by a semipermeable membrane, which lies directly in the tightly closed culture vessels, for the colorimetric detection of CO 2 absorption from the outside.
  • the object of the invention is to provide a device for the detection of CO which, using a known measuring technique, enables a significantly simplified, automated and objectified evaluation.
  • the device should be able to be used in the sterility test of liquid media, while maintaining the integrity of the system used for this and nevertheless being able to be used in conjunction with commercially available filtration units.
  • a means for the detection of carbon dioxide which means is located inside the device.
  • the inlet opening preferably has a membrane which is impermeable to liquids but permeable to carbon dioxide.
  • this membrane is a film made of polyethylene.
  • the agent for detecting carbon dioxide is preferably a KOH, NaOH or bicarbonate buffer solution which contains pH indicators for the indirect detection of carbon dioxide.
  • the means for the detection of carbon dioxide with measuring electrodes e.g. for measuring impedance, in connection.
  • the inlet opening is preferably designed such that it can be connected to a filtration unit, downstream of the filter of the filtration unit.
  • the advantage of this embodiment is that the device can be connected to filtration units retrospectively and without violating the integrity of the system, and the evaluation is thereby automated, objectified and significantly simplified.
  • the contact with the inner atmosphere of the filtration unit required for this is ensured by the membrane filter present, which enables the CO 2 to penetrate outside to the sensor unit, ie detection device, but at the same time prevents the penetration of microorganisms into the nutrient solution from the outside.
  • the escape of nutrient solution into the device according to the invention is prevented, for example, by the CO 2 -permeable membrane.
  • the sterility test is thus carried out in a combined unit consisting of the filter cell and the detection device according to the invention, for example via the continuous registration of the change in the impedance properties of the means contained in the device for detecting the CO 2 , for example a detector gel containing electrodes.
  • the incubation and automatic registration of any germ growth which may be present can be carried out in the same container without violating its integrity.
  • the germ growth is determined, for example, as mentioned above, via an automated impedance measurement, which is the increase in the microbial metabolism formed Carbon dioxide registered.
  • Approaches with the primary opacities mentioned at the outset can thus be evaluated directly via an impedance measurement, since there is no influence on the opacification and a subculture is no longer required.
  • the meaningfulness of the necessary validation studies for the complete removal of inhibitors becomes objectively possible and comparable for the first time thanks to the continuous and objective recording of measured values.
  • the device according to the invention is particularly advantageous in connection with known filtration devices for the sterility testing of liquid media, it can also be used advantageously in other fields of technology in which the detection of carbon dioxide plays a role.
  • Another object of the invention is to provide a method for determining a microbial contamination of a liquid medium, with the aid of which a time-consuming and personnel-intensive visual assessment of the nutrient solutions can be replaced and the incubation time can be significantly reduced until positive samples are recognized.
  • the liquid medium is passed through a filtration unit which has a receiving space for the medium, a filter and an outlet opening located downstream of the filter, the microbiological contamination which may be present being retained by the filter after which the optionally microbiologically contaminated filter is brought into contact with a microbiological nutrient medium on the upstream side by bringing the nutrient medium into the receiving space of the filtration unit,
  • Carbon dioxide is preferably passed through the filter while the filter is in contact with nutrient medium with its upstream side.
  • FIG. 1 shows an embodiment of the invention
  • FIG. 2 shows the embodiment shown in FIG Illustrate connection with a filtration unit of the prior art in a schematic representation.
  • the device according to the invention has an inlet opening 1 for receiving carbon dioxide, which is adapted for connection to the outlet opening of a known filtration unit.
  • a membrane 3 is arranged in the inlet opening 1 and is permeable to CO 2 , but impermeable to liquids such as the nutrient medium.
  • a means for detecting CO 2 which comprises a layer of a detector gel 11 and two electrodes 2.
  • the detection principle on which the detection device is based is the change in the electrochemical properties of the detector gel 11 contained in the device, due to the production of CO 2 by the microorganisms present in the sample.
  • the detection system ie the means, consists of two electrodes 2, which are connected to the detector gel 11 via or through the outer shell of the device, and a device (not shown) for registering the change in the electrical properties of the detector gel, preferably the change in the Impedance due to the absorption of CO 2 .
  • the measurement can be carried out continuously at constant temperature or as an end point determination after comparison with a reference value and consideration of the sample temperature.
  • FIG. 2 shows the device in connection with a filter unit 5, which has a receiving space 7 for the liquid medium or the nutrient medium, a filter 6 and an outlet opening 8, via which the detection device according to the invention is connected to the filter unit.
  • the inlets 9 and 10 of the filter unit 5 serve to fill the receiving space 7 with the liquid medium or the nutrient medium and to vent and aerate.
  • the system shown in FIG. 2 is preferably suitable for carrying out the method according to the invention
  • the filtration unit is designed such that the membrane filter is integrated in the bottom of the unit.
  • the filtration cell is provided with a pressure connection, which allows connection to commercially available pumps and through which the test, rinsing and nutrient solution is brought into the filtration cell.
  • the filtration cell is also characterized by the fact that it is primarily sterile and that there is no access to the interior of the cell even after the filtration has taken place via the pressure connection. The compensation of those arising during filtration and filling as well as during incubation
  • the inlet opening of the sensor unit is provided with a CO-permeable, but liquid-tight membrane, such as a membrane thin film made of polyethylene, polypropylene, polytetrafluoroethylene or the like, closed.
  • the sensor unit contains the detection agent, which essentially consists of a solution of potassium hydroxide (KOH), sodium hydroxide (NaOH) or an alkaline bicarbonate buffer system and to which gelling agents such as agar-agar, agarose, gelatin, hydroxymethyl cellulose and the like have been added for solidification.
  • the detection means is surrounded by a non-electrically conductive, gas-tight capsule, which can be transparent or opaque.
  • two electrodes which can consist of an electrically conductive material (for example metal) or an electrically conductive film, are in contact with the detection means.
  • color indicators such as phenolphthalein, thymolphthalein, thymol blue, bromothymol blue, bromoxylenol blue, 4-nitrophenol, 3-nitrophenol, alizarin, phenol red, cresol red, litmus, xylenol, orthocresolphthalein or alpha Naphtolbenzene for optical visualization of the CO become.
  • the outer capsule surrounding the detection means must be transparent.
  • the electrical detection system essentially consists of an impedance measuring device, via which the two electrodes are contacted and the changes in impedance (increase in impedance) due to the absorption of CO 2 by the detection means are registered.
  • a reference value is preferably determined immediately after the start of the measurement, which is registered by the device and serves as a comparison value for all subsequent measurements. If a certain nutrient medium-dependent and predefined difference of the measured values (threshold value) is exceeded in later measurements, this is a reliable indication of the growth of microorganisms in the sample.
  • the measurements can also be recorded automatically (online) at constant intervals over a certain period of time and the recorded measurement curves can be evaluated. Instead of changes in impedance, changes in conductivity, admittance or pH can also be registered.
  • the reading devices can be simple handheld measuring devices or integrated automats for online measurement value acquisition.
  • Example 1 Detection device with impedance measurement
  • a 500 ml sterile and a sterile, but artificially inoculated with 10 CFU of an overnight culture of Escherichia coli Ringer's solution were each filtered using the Millipore Steritest system.
  • the filters were then overlaid with 100 ml Caso broth (Merck, Darmstadt), the suction hoses clamped and cut off.
  • the detection device was connected to the outlet opening on the underside using a Luer lock.
  • the device consisted of a polystyrene capsule with a diameter of 2 cm, a wall thickness of 1 mm and a clear height of approx. 6 cm, the upper part of which was designed as a Luer adapter.
  • Two stainless steel electrodes were cast into the base of the capsule at a distance of 10 mm, which could be contacted from the outside.
  • the electrodes were surrounded by 1 ml sensor gel consisting of 0.2% (w / v) potassium hydroxide and 15 g / 1 agar agar, dissolved in distilled water.
  • the electrodes protruded through the polystyrene wall approx. 5 mm into the gel core.
  • the electrodes were contacted on the outside with an impedance measuring device (BacTrac 4300, SY-LAB).
  • the filtration units provided with the detection devices were incubated at 25 ° C. in an incubator.
  • the changes in the impedance in the sensor gel due to the absorption of the CO 2 formed by the growth of the bacteria were recorded over a period of about 70 hours via the impedance measuring device and evaluated using suitable evaluation software.
  • the recording was made as a relative change (decrease in conductivity) with respect to the reference value determined at the start of the measurement.
  • the threshold value of -10% M (M impedance value), which was determined in preliminary tests as a significant value to differentiate between sterile and non-sterile products, was reached after 29.67 hours and the contamination of the product was thus demonstrated. A significant turning point in the signal curve was already after about 8 Hours ascertainable. In the sterile sample, however, the threshold was not exceeded within the measurement time. The measurement signal showed an almost horizontal course with no turning point.
  • Example 2 Detection device with color detection of the pH change
  • the experiment described in Example 1 was repeated under identical conditions, but the KOH sensor gel was additionally mixed with 0.002% bromothymol blue and thus colored blue.
  • the sensor gel in the artificially contaminated sample was completely yellow, while the sterile sample showed no change in the color of the detector gel.

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Abstract

Eine Vorrichtung zu Detektion von Kohlendioxid ist durch die Kombination folgender Merkmale gekennzeichnet : - eine Einlassöffunung (1) zur Aufnahme von Kohlendioxid in das Innere (4) der Vorrichtung, welche Öffnung (1) für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durchlässig ist, und ein Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid, welches Mittel sich im Inneren (4) der Vorrichtung befindet. Diese Vorrichtung ist insbesondere bei der Sterilitätsprüfung flüssiger Medien einsetzbar, wobei die Integrität des dafür eingesetzten Systems erhalten bleibt und eine Verwendung in Verbindung mit handelsüblichen Filtrationseinheiten möglich ist .

Description

Vorrichtung zur Detektion von Kohlendioxid und Verfahren zur Feststellung einer mikrobiologischen Kontamination eines flüssigen Mediums
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Detektion von Kohlendioxid sowie ein Verfahren zur Feststellung einer mikrobiologischen Kontamination eines flüssigen Mediums.
Gemäß Stand der Technik werden flüssige Medien, wie Emulsionen, Lösungen und flüssige filtrierbare Gemische, zur Untersuchung ihrer Sterilität über für Mikroorganismen undurchdringbare Membranfilter filtriert und diese Filter anschließend in entsprechenden Nährmedien zur Anzucht und Visualisierung eventuell vorhandener Mikroorganismen inkubiert.
Zur Vermeidung der bei derartigen Untersuchungen häufig vorkommenden Sekundärkontaminationen, welche weitestgehend durch die vielfältigen Manipulationsschritte zur Durchführung, vor allem aber durch das Einbringen des Filters in die Nährlösung bedingt sind, wird in der US-A - 4,036,698 ein integriertes Filtrationssystem für eine kontaminationsfreie Sterilitätsprüfung von filtrierbaren Sterilproclukten vorgeschlagen. Die Filtration, die Spülung der Filter, das Einbringen der Nährlösungen und die anschließende Bebrütung zum Nachweis eventuell vorhandener mikrobieller Kontaminanten werden dabei in einer Anordnung einer Filtrationseinheit mit Zuführungsund Auslassöffnungen sowie den entsprechenden Verbindungsschläuchen derart durchgeführt, dass deren Kombination ein nach außen abgeschottetes, geschlossenes System bildet.
Das Membranfilter befindet sich gemäß US-A - 4,036,698 in einem geschlossenen, sterilen Gefäß, welches gleichzeitig für die Aufnahme der Nährlösung für die Inkubation vorgesehen ist. Prüflösung und gegebenenfalls Spüllösungen werden mittels geeigneter Pumpen in das Gefäß gebracht und über das Membranfilter filtriert. Das Filtrat wird dabei auf der unsterilen, stromabwärts gelegenen Seite des Filters in einem Auffangbehälter gesammelt. Die Nährlösung wird abschließend ebenfalls über das Schlauch- und Pumpensystem in den Filtrationsbehälter eingebracht und das Membranfilter damit überschichtet.
Unabhängig davon, ob für die Probenvorbereitung ein integriertes System, wie gemäß US-A — 4,036,698, verwendet wurde oder ob die Filter nach der Probenfiltration in die entsprechenden Nährlösungen überführt wurden, kommt es im Fall einer mikrobiellen Kontamination zum Anwachsen der Keime in den Nährlösungen während einer 7-14 tägigen Bebrütung bei 20-37°C. Diese ist mit freiem Auge über die Trübung der Nährlösungen feststellbar. Die Nährlösungen werden zu diesem Zweck während der Bebrütungsdauer mehrmals visuell kontrolliert.
Hierbei kommt es jedoch zu Problemen, wenn der Charakter der Prüflösung bedingt, dass das Nährmedium primär getrübt wird. Eine visuelle Auswertung ist dann nicht mehr möglich. In diesen Fällen muss die Auswertung durch einen zusätzlichen Untersuchungsschritt am Ende der vorgeschriebenen Inkubationszeit mittels Subkultur auf festen Nährböden erfolgen.
Sind in der Prüflösung keimwachstumshemmende Substanzen (Antibiotika oder Konservierungsmittel, sogenannte Hemmstoffe) wird das Membranfilter vor der Inkubation mit dem Nährmedium gewaschen. So wird ausgeschlossen, dass durch die antimikrobielle Wirkung von Hemmstoffen eine Sterilität vorgetäuscht wird. Die europäische Pharmakopoe schreibt für diesen Zweck neben der Verwendung von Filtern mit einer maximalen Porenweite von 0,45 μm auch die Validierung der Inaktivierung von vorhandenen Hemmstoffen unter Verwendung von Referenzkeimen mit definierter Inokulationsdichte vor. Die ausschließlich visuelle Auswertung ermöglicht aber auch im Rahmen der Validierung nur bedingte Aussagen über die Wirkung des Inaktivierungsprozesses.
Die Produktion von CO2 als terminales Stoffwechselprodukt gilt für sämtliche aerob und mikroaerophil wachsende Mikroorganismen als wissenschaftlich gesichert und wird auch bereits vielfach zum Nachweis von Mikroorganismen kommerziell eingesetzt.
Das Prinzip der Detektion von CO über die indirekte konduktimetrische Bestimmung nach Absorption in stark alkalischen Lösungen wurde für die analytische Mikrobiologie unter Standardkulturbedingungen in verschiedenen Nährlösungen durch Owens (GB 9 711 429) bereits 1987 beschrieben und wird technisch auch in mehreren kommerziellen Systemen eingesetzt (BacTrac®, Malthus® und Rabit®).
Andere Nachweissysteme wiederum nützen die durch das gebildete CO2 hervorgerufene Änderung der spektroskopischen Eigenschaften des Nährmediums oder den dadurch hervorgerufenen Druckanstieg in einem geschlossenen System. So wird z.B. im Bactec®- Gerät der Überstand von mikrobiellen Kulturen in regelmäßigen Intervallen radiometrisch oder mittels Infrarotspektroskopie auf die Änderung von CO2 bestimmt (US-A - 3,935,073). Das Szgn /®-Blutkultursystem von Oxoid Ltd. (EP-A - 0 124 193) nützt die Zunahme des Drucks durch das gebildete CO2, um Kulturflüssigkeit in ein separates, dem Kulturmedium überlagertes Gefäß zu pressen, und bietet dadurch eine Indikation für eine Kontamination.
Weitere Detektionssysteme für den Nachweis von Mikroorganismen unter Verwendung des mikrobiell gebildeten CO basieren auf der kolorimetrischen Detektion der Änderung des pH- Werts von alkalischen Lösungen nach Absorption von CO2 . Die US-A - 5,094,955 beschreibt einen im Inneren des Kulturgefäßes liegenden CO2-Sensor, der im wesentlichen auf der Farbänderung verschiedener pH-Indikatoren nach CO2-Aufnahme beruht, die über ein transparentes Fenster von außen reflektometrisch gemessen werden kann.
Während das System gemäß US-A - 5,094,955 nur für Flüssigkeiten offenbart ist, wird ein derartiges System gemäß US-A - 5,976,827 für den Nachweis vereinzelter Mikroorganismenkolonien durch Zugabe von Gelierungsmittel zu mit Nährmedium versetzten Proben verwendet. Auch hierbei liegt das Sensorsystem im Inneren des Probengefäßes und das Detektionssystem ist ähnlich wie das in der US-A - 5,094,955 beschriebene System (Farbänderung eines durch eine semipermeable Membran vom Nährmedium abgetrennten Sensorsystems nach CO -Aufnahme und reflektometrische Detektion von außen über ein transparentes Fenster).
Auch das Biomatic®-Syste (EP-A - 0 930 368) verwendet ein über eine semipermeable Membran abgetrenntes, flüssiges Sensorsystem, welches direkt in den dicht verschlossenen Kulturgefäßen liegt, für den kolorimetrischen Nachweis der CO2-Aufnahme von außen.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, eine Vorrichtung zur Detektion von CO bereitzustellen, die unter Ausnutzung einer bekannten Messtechnik eine wesentlich vereinfachte, automatisierte und objektivierte Auswertung ermöglicht. Insbesondere soll die Vorrichtung bei der Sterilitätsprüfung flüssiger Medien einsetzbar sein, wobei die Integrität des dafür eingesetzten Systems erhalten bleibt und trotzdem eine Verwendung in Verbindung mit handelsüblichen Filtrationseinheiten möglich ist.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Kombination folgender Merkmale gelöst:
- eine Einlassöffnung zur Aufnahme von Kohlendioxid in das Innere der Vorrichtung, welche Öffnung für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durchlässig ist, und
- ein Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid, welches Mittel sich im Inneren der Vorrichtung befindet. Vorzugsweise weist die Einlassöffnung eine Membran auf, die für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durchlässig ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist diese Membran eine Folie aus Polyethylen.
Das Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid ist bevorzugt eine KOH-, NaOH- oder Bicarbonatpufferlösung, die pH-Indikatoren zum indirekten Nachweis von Kohlendioxid enthält.
In einer anderen bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung steht das Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid mit Messelektroden, z.B. zur Messung der Impedanz, in Verbindung.
Vorzugsweise ist die Einlassöffnung so gestaltet, dass sie an eine Filtrationseinheit, stromabwärts des Filters der Filtrationseinheit, angeschlossen werden kann.
Der Vorteil dieser Ausfuhrungsform liegt darin, dass die Vorrichtung nachträglich und, ohne die Integrität des Systems zu verletzen, an Filtrationseinheiten angeschlossen werden kann, und dadurch die Auswertung automatisiert, objektiviert und wesentlich vereinfacht wird. Der dazu erforderliche Kontakt zur inneren Atmosphäre der Filtrationseinheit wird über das vorhandene Membranfilter gewährleistet, welches die Penetration des CO2 nach außen zur Sensoreinheit, d.h. Detektionsvorrichtung, ermöglicht, gleichzeitig jedoch das Eindringen von Mikroorganismen in die Nährlösung von außen verhindert. Das Austreten von Nährlösung in die erfindungsgemäße Vorrichtung wird dabei z.B. durch die CO2- durchlässige Membran verhindert.
Die Untersuchung auf Sterilität wird somit in einer kombinierten Einheit aus Filterzelle und erfindungsgemäßer Detektionsvorrichtung z.B. über die kontinuierliche Registrierung der Änderung der Impedanzeigenschaften des in der Vorrichtung enthaltenen Mittels zum Nachweis des CO2, beispielsweise eines Elektroden enthaltenden Detektorgels, durchgeführt.
Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung gemeinsam mit dem z.B. in der US-A - 4,036,698 beschriebenen integrierten Filtrationssystem kann die Bebrütung und automatische Registrierung eines eventuell vorhandenen Keimwachstums im selben Behältnis vorgenommen werden, ohne dessen Integrität zu verletzen. Die Ermittlung des Keimwachstums erfolgt dabei beispielsweise, wie oben erwähnt, über eine automatisierte Impedanzmessung, welche die Zunahme des durch den mikrobiellen Stoffwechsel gebildeten Kohlendioxids registriert. Auch Ansätze mit den eingangs erwähnten Primärtrübungen können damit direkt über eine Impedanzmessung ausgewertet werden, da bei dieser keine Beeinflussung über die Trübung erfolgt und eine Subkultur nicht mehr erforderlich ist. Letztlich wird durch die kontinuierliche und objektive Messwerterfassung auch die Aussagekraft der erforderlichen Validierungsstudien für die vollständige Entfernung von Hemmstoffen erstmals objektiv möglich und vergleichbar.
Obwohl die erfindungsgemäße Vorrichtung im Zusammenhang mit bekannten Filtrationseinlieiten bei der Sterilitätsprüfung flüssiger Medien besonders vorteilhaft ist, kann sie auch auf anderen Gebieten der Technik, bei denen die Detektion von Kohlendioxid eine Rolle spielt, mit Vorteil eingesetzt werden.
Die Erfindung stellt sich ferner die Aufgabe, ein Verfahren zur Feststellung einer mikrobiellen Kontamination eines flüssigen Mediums bereitzustellen, mit dessen Hilfe eine zeit- und personalaufwändige visuelle Beurteilung der Nährlösungen ersetzt und die Inkubationszeit bis zum Erkennen von positiven Proben deutlich verkürzt werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Kombination folgender Maßnahmen gelöst, nämlich dass: das flüssige Medium durch eine Filtrationseinheit geführt wird, welche einen Aufnahmeraum für das Medium, ein Filter und eine stromabwärts des Filters befindliche Auslassöffnung aufweist, wobei die gegebenenfalls vorhandene mikrobiologische Kontamination vom Filter zurückgehalten wird, wonach das gegebenenfalls mikrobiologisch kontaminierte Filter an der stromaufwärts befindlichen Seite mit einem mikrobiologischen Nährmedium in Kontakt gebracht wird, indem das Nährmedium in den Aufnahmeraum der Filtrationseinheit gebracht wird,
- bei Anwesenheit einer mikrobiologischen Kontamination Kohlendioxid gebildet wird, das gebildete Kohlendioxid zumindest teilweise durch das Filter geführt wird und
- das durch das Filter geführte Kohlendioxid detektiert wird.
Vorzugsweise wird Kohlendioxid durch das Filter geführt, während das Filter mit seiner stromaufwärts befindlichen Seite mit Nährmedium in Kontakt ist.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung näher erläutert, wobei Fig. 1 eine Ausführungsform der Erfindung und Fig. 2 die in Fig. 1 gezeigte Ausfuhrungsform in Verbindung mit einer Filtrationseinheit des Standes der Technik in schematischer Darstellung veranschaulichen.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Einlassöffnung 1 zur Aufnahme von Kohlendioxid auf, die zum Anschluss an die Auslassöffnung einer bekannten Filtrationseinheit angepasst ist. In der Einlassöffnung 1 ist eine Membran 3 angeordnet, die für CO2 durchlässig, für Flüssigkeiten, wie das Nährmedium, jedoch impermeabel ist. Im Inneren 4 der Vorrichtung befindet sich ein Mittel zum Nachweis von CO2, welches eine Schicht eines Detektorgels 11 und zwei Elektroden 2 umfasst.
Das der Detektionsvorrichtung zugrundeliegende Detektionsprinzip ist dabei die Änderung der elektrochemischen Eigenschaften des in der Vorrichtung enthaltenen Detektorgels 11, bedingt durch die Produktion von CO2 der in der Probe vorhandenen Mikroorganismen. Das Detektionssystem, d.h. das Mittel, besteht aus zwei Elektroden 2, die mit dem Detektorgel 11 über oder durch die äußere Hülle der Vorrichtung verbunden sind, und einem (nicht dargestellten) Gerät zur Registrierung der Änderung der elektrischen Eigenschaften des Detektorgels, vorzugsweise der Änderung der Impedanz, infolge der Aufnahme von CO2. Die Messung kann hierbei kontinuierlich bei konstanter Temperatur oder als Endpunktbestimmung nach Abgleich gegen einen Referenzwert und Berücksichtigung der Probentemperatur erfolgen.
In Fig. 2 ist die Vorrichtung in Verbindung mit einer Filtereinheit 5 dargestellt, die einen Aufnahmeraum 7 für das flüssige Medium bzw. das Nährmedium, ein Filter 6 und eine Auslassöffnung 8 aufweist, über welche die erfindungsgemäße Detektionsvorrichtung an die Filtereinheit angeschlossen ist. Die Einlasse 9 und 10 der Filtereinheit 5 dienen dem Befallen des Aufnahmeraums 7 mit dem flüssigen Medium bzw. dem Nährmedium sowie dem Ent- und Belüften. Das in Fig. 2 dargestellte System ist bevorzugt zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet
Genaue Beschreibung einer Ausführungsform der Erfindung
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung ist die Filtrationseinheit so gestaltet, dass das Membranfilter in den Boden der Einheit integriert ist. Die Filtrationszelle ist mit einem Druckanschluss versehen, der den Anschluss an handelsübliche Pumpen erlaubt und über den die Prüf-, Spül- und Nährlösung in die Filtrationszelle verbracht wird. Die Filtrationszelle zeichnet sich weiters dadurch aus, dass sie primär steril ist und auch über den Druckanschluss nach erfolgter Filtration kein Zugang zum Inneren der Zelle besteht. Der Ausgleich der bei der Filtration und Befüllung sowie während der Bebrütung entstehenden | v^ M i n - —
Druckdifferenzen erfolgt über eine mit einem separaten Filter (Porengröße 0,45 μm) verschlossene Öffnung. Unterhalb des Membranfilters befindet sich eine Auslassöffnung, über die mittels einen Steckadapters die erfindungsgemäße Detektionsvorrichtung angeschlossen wird.
Damit das in der Filtereinheit gebildete CO2 in der Sensoreinheit, d.h. Detektionsvorrichtung, nachgewiesen werden kann, letztere aber nicht durch aus der Filtereinheit austretendes Nährmedium beeinfiusst werden kann, ist die Einlassöffhung der Sensoreinheit mit einer CO -permeablen, aber flüssigkeitsdichten Membran, wie z.B. einer dünnen Folie aus Polyethylen, Polypropylen, Polytetrafluorethylen oder dergleichen, verschlossen.
Die Sensoreinheit enthält das Detektionsmittel, welches im Wesentlichen aus einer Lösung von Kaliumhydroxid (KOH), Natriumhydroxid (NaOH) oder einem alkalischen Bikarbonatpuffersystem besteht und dem zur Verfestigung Gelierungsmittel, wie Agar-Agar, Agarose, Gelatine, Hydroxymethylcellulose und dergleichen zugegeben wurden. Nach außen ist das Detektionsmittel durch eine nicht elektrisch leitende, gasdichte Kapsel umgeben, die transparent oder opak sein kann. Über oder durch diese äußere Kapsel stehen zwei Elektroden, die aus einem elektrisch leitenden Material (z.B. Metall) oder einer elektrisch leitenden Folie bestehen können, mit dem Detektionsmittel in Kontakt. Darüber hinaus können dem Detektionsmittel Farbindikatoren, wie Phenolphthalein, Thymolphthalein, Thymolblau, Bromthymolblau, Bromxylenolblau, 4-Nitrophenol, 3-Nitrophenol, Alizarin, Phenolrot, Kresolrot, Lackmus, Xylenolblau, Orthokresolphthalein oder Alpha- Naphtolbenzene zur optischen Visualisierung der CO2-Absorption zugegeben werden. In diesem Fall muss die äußere, das Detektionsmittel umgebende Kapsel allerdings transparent ausgeführt sein.
Das elektrische Detektionssystem besteht im Wesentlichen aus einem Impedanzmessgerät, über welches die beiden Elektroden kontaktiert werden und die Impedanzänderungen (Zunahme der Impedanz) infolge der Aufnahme von CO2 durch das Detektionsmittel registriert werden. Bevorzugt wird dabei unmittelbar nach dem Beginn der Messung ein Referenzwert bestimmt, welcher vom Gerät registriert wird und als Vergleichswert für alle nachfolgenden Messungen dient. Wird bei späteren Messungen eine bestimmte nährmedienabhängige und vordefmierte Differenz der Messwerte (Schwellenwert) überschritten, so ist dies ein sicheres Indiz für das Wachstum von Mikroorganismen in der Probe. Die Messungen können aber auch automatisch (online) in konstanten Intervallen über einen bestimmten Zeitraum aufgezeichnet und die dabei registrierten Messkurven ausgewertet werden. Anstelle der Änderungen in der Impedanz können auch die Änderung der Leitfähigkeit, der Admittanz oder des pH- Werts registriert werden. Bei den Ablesegeräten kann es sich um einfache Handmessgeräte oder aber um integrierte Automaten zur Online- Messwerterfassung handeln.
Bei Verwendung von Farbindikatoren für die CO2 -Detektion ist eine Änderung der Farbe (abhängig vom verwendeten Farbstoff) für den Fall, dass Mikroorganismen in der Probe angewachsen sind, mit freiem Auge feststellbar.
Beispiel 1 : Detektionsvorrichtung mit Impedanzmessung
Eine 500 ml sterile sowie eine sterile aber künstlich mit 10 KBE einer Übernachtkultur von Escherichia coli beimpfte Ringerlösung wurden jeweils mittels des Steritest-Systems von Millipore filtriert. Die Filter wurden anschließend mit je 100 ml Caso-Bouillon (Merck, Darmstadt) überschichtet, die Ansaugschläuche abgeklemmt und abgeschnitten. Über die Auslassöffnung auf der Unterseite wurde mittels Luer-Lock die Detektionsvorrichtung angeschlossen. Die Vorrichtung bestand aus einer Polystyrolkapsel mit einem Durchmesser von 2 cm, einer Wandstärke von 1 mm und einer lichten Höhe von ca. 6 cm, deren Oberteil als Luer- Adapter ausgeführt war. Im Boden der Kapsel waren zwei Edelstahlelektroden mit einem Abstand von 10 mm eingegossen, die von außen kontaktiert werden konnten. Die Elektroden waren von 1 ml Sensorgel, bestehend aus 0,2 % (w/v) Kaliumhydroxid und 15 g/1 Agar-Agar, gelöst in destilliertem Wasser, umgeben. Die Elektroden ragten durch die Polystyrolwand ca. 5 mm in den Gelkern hinein. Die Elektroden wurden außen mit einem Impedanzmessgerät (BacTrac 4300, Fa. SY-LAB) kontaktiert. Die mit den Detektionsvorrichtungen versehenen Filtrationseinheiten wurden bei 25°C in einem Brutschrank bebrütet. Über das Impedanzmessgerät wurden die Änderungen der Impedanz im Sensorgel , bedingt durch die Absorption des durch das Wachstum der Bakterien gebildeten CO2, über einen Zeitraum von ca. 70 Stunden registriert und über eine geeignete Auswertesoftware ausgewertet. Die Aufzeichnung erfolgte dabei als relative Änderung (Abnahme der Leitfähigkeit) in Bezug auf den zu Beginn der Messung ermittelten Referenzwert.
Der Schwellenwert von -10% M (M = Impedanzwert), der in Vorversuchen als signifikanter Wert zur Unterscheidung von sterilen und nicht sterilen Produkten ermittelt wurde, wurde bereits nach 29,67 Stunden erreicht und die Kontamination des Produkts somit nachgewiesen. Ein signifikanter Wendepunkt in der Signalkurve war dabei bereits nach ca. 8 Stunden feststellbar. Bei der sterilen Probe wurde der Schwellenwert innerhalb der Messzeit hingegen nicht durchschritten. Das Messsignal zeigte einen beinahe waagrechten Verlauf ohne Wendepunkt.
Beispiel 2: Detektionsvorrichtung mit Farbdetektion der pH-Änderung Das in Beispiel 1 beschriebene Experiment wurde unter identischen Bedingungen wiederholt, allerdings wurde das KOH-Sensorgel zusätzlich noch mit 0,002% Bromthymolblau versetzt und somit blau eingefärbt. Das Wachstum der Mikroorganismen in der verkeimten Probe war in diesem Fall durch die Änderung des pH- Werts im Detektorgel und den Farbumschlag des Indikators Bromthymolblau von blau nach gelb feststellbar (Umschlagpunkt von Bromthymolblau blau/gelb: pH=6,0).
Nach Ablauf der 70-stündigen Inkubationszeit war das Sensorgel bei der künstlich kontaminierten Probe vollständig gelb, während die sterile Probe keine Änderung der Farbe des Detektorgels zeigte.

Claims

Patentansprüche :
1. Vorrichtung zur Detektion von Kohlendioxid, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Merkmale eine Einlassöffnung (1) zur Aufnahme von Kohlendioxid in das Innere (4) der Vorrichtung, welche Öffnung (1) für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durchlässig ist, und ein Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid, welches Mittel sich im Inneren (4) der Vorrichtung befindet.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Einlassöffnung (1) eine Membran (3) aufweist, welche für Flüssigkeiten undurchlässig, aber für Kohlendioxid durchlässig ist.
3. Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Membran (3) eine Folie aus Polyethylen ist.
4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid eine KOH-, NaOH- oder Bicarbonatpufferlösung ist, die pH-Indikatoren zum indirekten Nachweis von Kohlendioxid enthält.
5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Nachweis von Kohlendioxid mit Messelektroden, z.B. zur Messung der Impedanz, in Verbindung steht.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Einlassöffnung (1) so gestaltet ist, dass sie an eine Filtrationseinheit (5), stromabwärts des Filters (6) der Filtrationseinheit (5), angeschlossen werden kann.
7. Verfahren zur Feststellung einer mikrobiologischer Kontamination eines flüssigen Mediums, gekennzeichnet durch die Kombination der Maßnahmen, dass das flüssige Medium durch eine Filtrationseinheit (5) geführt wird, welche einen Aufnahmeraum (7) für das Medium, ein Filter (6) und eine stromabwärts des Filters (6) befindliche Auslassöffnung (8) aufweist, wobei die gegebenenfalls vorhandene mikrobiologische Kontamination vom Filter (6) zurückgehalten wird, wonach das gegebenenfalls mikrobiologisch kontaminierte Filter (6) an der stromaufwärts befindlichen Seite mit einem mikrobiologischen Nährmedium in Kontakt gebracht wird, indem das Nährmedium in den Aufnahmeraum (7) der
Filtrationseinheit (5) gebracht wird,
Kohlendioxid bei Anwesenheit einer mikrobiologischen Kontamination gebildet wird, das gebildeten Kohlendioxids zumindest teilweise durch das Filter (6) geführt wird und das durch das Filter (6) geführte Kohlendioxid detektiert wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass Kohlendioxid durch das Filter (6) geführt wird, während das Filter (6) mit seiner stromaufwärts befindlichen Seite mit Nährmedium in Kontakt ist.
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