WO2003044196A1

WO2003044196A1 - Proteines postsynaptiques

Info

Publication number: WO2003044196A1
Application number: PCT/JP2002/012102
Authority: WO
Inventors: Osamu Ohara; Takahiro Nagase; Michio Ohishi; Hiroshi Yokota; Yasuko Arai
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co.,Ltd.; Kazusa Dna Research Institute Foundation
Priority date: 2001-11-20
Filing date: 2002-11-20
Publication date: 2003-05-30
Also published as: JPWO2003044196A1; EP1466975A4; AU2002355016A1; EP1466975A1; US20060252677A1; CA2492536A1

Description

明細書ボストシナプス蛋白質

5 技術分野

本発明は、 PDZ ドメインを保有しており N—メチル一D—ァスパラギン酸（N 一 me t hy l— D— a s p a r t a t e) (以下、 NMD Aと略称する）受容体と複合体を形成し得るポストシナプスデンシティ一蛋白質（以下、蛋白質 Aと略称する）および蛋白質 Aと相互作用する蛋白質（以下、蛋白質 Bと称する）、並ぴに蛋白質 Aと NMDA受容体との複合体形成の阻害または促進を特徴とする N MD A受容体のシグナル伝達 ( s i g n a l t r a n s d u c t i o n) の調節剤（阻害剤または促進剤）、蛋白質 Aと蛋白質 Bとの相互作用の阻害または促進特徴とする NMD A受容体のシグナル伝達の調節剤、蛋白質 Aと NMD A受容体との複合体形成の阻害または促進による NMD A受容体のシグナル伝達の調節方5 法、および蛋白質 Aと蛋白質 Bとの相互作用の阻害または促進による NMD A受容体のシグナル伝達の調節方法に関する。さらに詳しくは、蛋白質 Aまたは蛋白質 Bのアミノ酸配列の全部または一部を有するポリべプチドまたはべプチド、該ポリべプチドまたはべプチドをコードする塩基配列、またはその相補的塩基配列を含むポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、該組換えベクターを含む形質転換体、該ポリぺプチドまたはぺプチドに対する抗体、該ポリべプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用する化合物、これらの 1種以上を含む医薬組成物、該ポリペプチドまたはペプチドの製造方法、該ポリぺプチドまたは該ポリヌクレオチドと相互作用する化合物の同定方法、該ポリべプチドまたは該ポリヌクレオチドの測定方法、並びに試薬キットに関する。背景技術

ポストシナプスデンシティ一蛋白質（P o s t s y n a p t i c D e n s i t y P r o t e i n) (以下、 P SDと略称する）は、神経細胞間情報伝達においてシナプスの情報を受け取るシナプス後細胞に存在するボストシナプスデンシティ一を構成する蛋白質である。 P SDは、シナプス後膜において受容体やイオンチャネル等の機能性膜蛋白質の局在化や集積または生体マルチソームの形成に関与していると考えられている。

一方、シナプスやタイトジャンクションのような複雑な細胞膜構造の形成と維持、膜蛋白質の集積、情報伝達、複合体の形成および細胞極性の維持等の生体機能に関与する蛋白質が、蛋白質間相互作用を担うモジュールとしてこれら機能に関与すると考えられるぺプチド結合ドメインを保有することが報告された（非特許文献 1)。このドメインは PDZドメインと呼ばれ、 90乃至 1 00アミノ酸残基からなる。これら生体機能の中で、特定の蛋白質を細胞内の特定の部位に局在させる、あるいは PDZ ドメイン自身が含まれる蛋白質と標的蛋白質との結合を促進するといつた機能に、 PDZドメインがより重要な役割を果たしていると考えられている。例えば、 PDZ ドメインによるシグナル伝達蛋白質の細胞膜上の蛋白質複合体への局在化が適切なシグナル伝達に必要であると考えられる。

PDZドメインは、蛋白質間相互作用において標的蛋白質の最も C末端のアミノ酸配列を認識する。その標的蛋白質は膜貫通型の受容体やチャネルであることが多い。例えば、脊椎動物または無脊椎動物のシナプスに存在する MAGUK蛋白質、 memb r a n e a s s o c i a t e d g u a n y l a t e k i n a s e p r o t e i n) ファミリーに属する P S D— 9 5、 P SD—9 3 ( c h a p s y n 1 1 0または KAP— 5) およぴショウジョゥバエ d 1 g蛋白質のヒトにおけるホモログである h d 1 gは、その第 2番目おょぴ第 3番目の PD Z ドメインにより、 NMD A受容体およびシェーカー型カリウムイオンチヤネノレ K i r 1. 4の C末端を認識することが報告されている（非特許文献 2)。

PDZドメインを有する蛋白質のインビボでの局在と、インビトロの生化学的解析から同定された膜貫通型の標的蛋白質の局在との解析により、 P SD— 95、 P SD— 93および h d 1 gが、全て NMD A受容体または力リゥムイオンチャネルと同じ局在を示すことが、各組織あるいは神経系の各細胞種において確認されている（非特許文献 3、非特許文献 4、非特許文献 5および非特許文献 6)。また、 P S D— 95と NMD A受容体あるいはカリウムイオンチャネルとを線維芽細胞に共発現させると、細胞表面上にこれら蛋白質のクラスタ一形成が見られるが、それぞれ単独で発現させたときは分散した局在しか示さない（非特許文献 4)。一方、 P SD— 95が認識する C末端のアミノ酸モチーフ（SZTXV) を欠失したスプライシングァイソフォームは分散した局在を示す（非特許文献 7)。これらから、 MAGUK蛋白質が PD Zドメインを介した相互作用によって、細胞膜蛋白質の架橋と集積に直接関与していると考えられる。

さらに、 K i rを導入した線維芽細胞において PKA (P r o t e i n K i n a s e A) を活性化するとァミノ酸配列第 440番目のセリン（S 440) がリン酸化され、 K i rと P SD— 9 5が乖離し、力リゥムイオン電導率が低下する。 S 440をァラニンに置換すると、 PKAのこの効果は見られない。これらの結果は、 K i rへの P S D- 95の結合がチャネルをクラスター化させるだけでなく、チャネル電導率に PK A感受性を付与することを示している。

卩 30—9 5は、ポストシナプスデンシティ一蛋白質の 1つであり、数々の機能、例えば胚の発生、神経の発生、神経伝達、情報伝達および蛋白質複合体の形成等への関与が知られている。また、トランスフヱラーゼ活性、キナーゼ活性、アンカー蛋白質として膜蛋白質、例えば受容体やイオンチャネル等を細胞骨格に連結する作用、および細胞の集合や接合に関与するアドへシン/ァグルチニンとしての作用が報告されている（非特許文献 4および非特許文献 8)。これらから、 P S D— 95は、神経伝達物質放出の制御、あるいは細胞増殖やがんの抑制に関与していると考えられている（非特許文献 9、非特許文献 1 0および非特許文献 P S D— 9 5のアミノ酸配列中には、 3つの PDZ ドメイン、 1つめ SH3 ドメン（S r c h omo l o g y r e g i o n 3 d oma i n)、 1つの GKドメイン（グァ-レートキナーゼドメイン）（g u a n y l a t e k i n a s e d oma i n) 力 S存在する。

P SD— 95は、その PD Zドメインを介して、シナプス後膜に存在する NM DA受容体の構成因子である 2 Bサブユニットと結合する（非特許文献 2、非特許文献 1 2、非特許文献 1 3および非特許文献 14)。このことから、 P SD— 9 5は該受容体のシグナル伝達等に関与する細胞骨格蛋白質の 1つであると考えられている。

また、 P SD 9 5がその GKドメインを介して、 P SD 95/S AP 90関連蛋白質 3 (P SD 9 5ZSAP 90— a s s o c i a t e d p r o t e i n— 3) (以下、 SAPAP— 3と略す）と相互作用することが、ラットにおいて報告されている（非特許文献 1 5)。ラット SAP AP— 3は神経細胞に特異的に発現しており、ボストシナプスデンシティ一画分に豊富に存在する。この報告では、ラット SAPAP— 3は、ポストシナプスデンシティ一の構成要素、例えば P SD 9 5/SAP 90等、を膜領域に集合させることによりポストシナプスデンシティ一の構造維持に関与していると考えられている。

一方、 NMD A受容体は、グルタミン酸受容体の 1種であり、リガンド依存性イオンチャネルに共通する高次構造を有することから、細胞膜上においてイオンチャネルを形成していると考えられている。該イオンチャネルはカルシウムィォン透過性をもち、シナプス後膜内のカルシウム濃度を上昇させる生理的機能を有する。通常は、シナプス間隙中のマグネシウムイオンによって閉塞されており、単発のシナプス伝達には関与しないと考えられているが、頻回興奮等によって膜電位が脱分極状態にあるとマグネシウムイオンによる閉塞が解かれて活性化する。生体内でのリガンドとしてはグルタミン酸およびァスパラギン酸が挙げられる。 NMD A受容体の阻害剤として知られているアミノホスホノ吉草酸や MK— 8 0 1等を哺乳動物脳に直接投与することにより記憶障害が起きることから、 NMD A受容体の記憶成立への関与が示唆されている。

上記のように、 PDZ ドメインの機能は、かなり広範囲の生命現象において利用されていると予想される。したがって、 PDZドメインを有する蛋白質によつ 02

5 て形成される複合体や、その複合体に関わる蛋白質の解明とその制御により、蛋白質相互作用、例えば細胞骨格構造の形成、膜蛋白質の集積、シグナル伝達、複合体の形成および細胞極性の維持等、の異常に起因する疾患の防止、治療おょぴ診断が可能になる。例えば、 PDZドメインを有する新規な P SDを見出すことにより、該 P SDの異常が関与する疾患、例えば神経変性疾患の解明、並びにそれらの防止、治療および診断が可能になる。すなわち、蛋白質相互作用や PDZ ドメインの認識機構の研究、並びに医薬品開発の分野において、 PDZ ドメインを有する蛋白質および該蛋白質と相互作用する蛋白質、並びに両蛋白質の相互作用を制御する方法を見出すことが必要である。

以下に、本背景技術の説明に引用した文献を列記する。

非特許文献 1 ：「細胞工学」、 200 1年、第 20卷、 ρ· 1 345— 1 349。非特許文献 2 ：ニーサマー (N i e t h a mm e r , M. ) ら、「ジャーナルォプニューロサイエンス (J o u r a n l o f N e u r o s c i e n c e)」、 1 9 96年、第 1 6卷、 p. 2 1 5 7— 2 1 63。

非特許文献 3 ：コーナゥ（Ko r n a u, H. C.) ら、「サイエンス（S c i e n c e)」、 1 99 5年、第 26 9巻、 p. 1 73 7— 1 740。

非特許文献 4 ：キム（K i m, E.) ら、「ネイチヤー（Na t u r e)」、 1 9 9 5年、第 378卷、 p. 8 5— 88。

非特許文献 5 ：キム（K i m, E.) ら、「ニューロン（N e u r o n)」、 1 9 9 6年、第 1 7卷、 ρ· 1 0 3— 1 1 3。

非特許文献 6 ：ミラー（M i 1 1 e r， B . M. ) ら、「ジャーナルォブニュ一口サイエンス (J o u r a n l o f Ne u r o s c i e n c e)」、 1 9 9 5年、第 1 5卷、 ρ· 23 54— 2366。

非特許文献 8 ：スタサキス（S t a t h a k i s , D.) ら、「ゲノミクス（G e n om i c s)」、 1 99 7年、第 44卷、 p. 7 1— 82。

非特許文献 9 ：ハナダ（Ha n a d a, T.) ら、「ジャーナルォブバイオ口ジカノレケミストリー（J o u r n a l o f B i o l o g i c a l Ch e 2102

6

m i s t r y)」、 2000年、第 27 5卷、 p. 28774— 28784。

非特許文献 1 0 ：ミゴード（M i g a u d, M.) ら、「ネイチヤー（N a t u r e)」、 1 99 8年、第 396卷、 p. 433— 439。

非特許文献 1 1 :サットラー（S a t t l e r , R.) ら、「サイエンス（S c i e n c e)」、 1 999年、第 284卷、 p. 1 845— 1 848。

非特許文献 1 2 ：モンヤー（Mo n y e r , H.) ら、「サイエンス（S c i e n c e)」、 1 992年、第 256卷、 p. 1 2 1 7— 1 22 1。

非特許文献 1 3 :イシイ（ I s h i i , T.) ら、「ジャーナルォブバイオ口ジカノレケミストリー（J o u r n a l o f B i o l o g i c a l Ch e m i s t r y)」、 1 993年、第 26 8卷、 p. 2836— 2843。

非特許文献 14 ：シヱン（S h e n g , M.) ら、「ネイチヤー（N a t u r e)」、 1 9 94年、第 368卷、 p. 144— 147。

非特許文献 1 5 ：タケゥチ（T a k e u c h i , M.) ら、「ジャーナルォブバィ才ロジカノレケミストリー (J o u r n a l o f B i o l o g i c a l Ch em i s t r y)」、 1 9 9 7年、第 272卷、 p. 1 1 943— 1 1 9 5 1。発明の開示

本発明は、蛋白質間相互作用を担うモジュールとして作用する PDZ ドメインを保有し NMD A受容体と複合体を形成し得る特定のァミノ酸配列からなる蛋白質 Aおよぴ該蛋白質 Aと相互作用する蛋白質 B、並びにこれらをそれぞれコードする遺伝子を見出し、これらを利用することにより達成したものである。

すなわち、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと NMD A受容体との結合を阻害または促進し、および Zまたは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、 NMD A受容体のシグナル伝達の調節剤である。また、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなる 02 12102

7 ポリペプチドと NMD A受容体との結合を阻害し、および Zまたは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、 N M D A受容体のシグナル伝達の阻害剤である。

さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと NMD A受容体との結合を促進し、および/または、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、 NMD A受容体のシグナル伝達の促進剤である。

さらにまた、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと NMD A受容体との結合を阻害または促進し、および Zまたは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、 N M D A受容体のシグナル伝達の調節方法である。

またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと NMD A受容体との結合を阻害し、および Zまたは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、 NMD A受容体のシグナル伝達の阻害方法である。

また、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと NMD A受容体との結合を促進し、および Zまたは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、 NMD A受容体のシグナル伝達の促進方法である。

さらに、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドである； i ) 配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、

ii) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

iii) 前記 i ) のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約 70%の相同性を有し、かつ NMDA受容体 /2 Bサブュニットと結合するポリべプチド、、

および

iv) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または揷入という変異を有し、かつ NMDA受容体/ / 2 Bサブュニットと結合するポリぺプチド。

さらにまた、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリべプチドであって、 NMDA受容体 / 2 Bサブュニットと結合するポリべプチドである；

i ) 配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、

ϋ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

iii) 前記 i ) のポリペプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 70 %の相同性

. を有するポリペプチド、

および

iv) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または揷入という変異を有するポリペプチド。またさらに、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドである； i ) 配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチド、 ϋ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

iii) 前記 i ) のポリぺプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 70 %の相同性を有し、かつ配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリべプチドと相互作用するポリペプチド、

および

iv) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または揷入という変異を有し、かつ配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドと相互作用するポリぺプチド。

また、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドと相互作用するポリぺプチドである；

i ) 配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、 ii ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

iii ) 前記 i ) のポリペプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有するポリペプチド、 .

および

iv ) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。さらに、本発明の一態様は、下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの共存下で、 NM D A受容体のシグナル伝達を増幅するポリべプチドである；

i ) 配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチド、 ii ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

iii ) 前記 i ) のポリペプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有するポリペプチド、

および

iv ) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または揷入という変異を有するポリペプチド。さらにまた、本発明の一態様は、下記のポリペプチドであって、 NMD A受容体 / 2 Bサブユニットと結合し、かつ配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドと相互作用しないポリべプチドである；

i ) 配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有するポリぺプチド、

または

ϋ ) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または揷入という変異を有するポリペプチド。またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチドである。

また、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチドであつて、 NMD A受容体と結合するペプチドである。

さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと相互作用するぺプチドである。

さらにまた、本発明の一態様は、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチドである。

またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるペプチドであって、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドと相互作用するぺプチド、。

また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリぺプチドまたはべプチドを有効量含んでなる NMD A受容体のシグナル伝達の調節剤である。 ' さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリべプチドまたはべプチドを有効量含んでなる NMD A受容体のシグナル伝達の阻害剤である。さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリべプチドまたはべプチドを有効量含んでなる NMD A受容体のシグナル伝達の促進剤である。

またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、 NMD A受容体のシグナル伝達の調節方法である。

また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリぺプチドまたはぺプチドを使用することを特徴とする、 N M D A受容体のシグナル伝達の阻害方法である。

さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび上記ペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、 NMD A受容体のシグナル伝達の促進方法である。

さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドまたは上記ペプチドのいずれかをコードする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチドである。

またさらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 4または配列番号 5に記載の塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。また、本発明の一態様は、配列表の配列番号 6に記載の塩基配列またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。

さらに、本発明の一態様は、上記ポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイプリダイゼーションするポリヌクレオチドである。

さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリヌクレオチドを含有する組換えべクターである。

またさらに、本発明の一態様は、組換えベクターが発現組換えベクターである上記組換えベクターである。

また、本発明の一態様は、上記組換えベクターを導入されてなる形質転換体である。 T JP02/12102

12

さらに、本発明の一態様は、上記組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または上記組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、上記ポリべプチドまたは上記べプチドの製造方法である。

さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドおよび/または上記べプチドを免疫学的に認識する抗体である。

またさらに、本発明の一態様は、上記抗体であって、上記ポリペプチドの機能を阻害する抗体である。

また、本発明の一態様は、上記抗体であって、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドの相互作用を阻害する抗体である。

さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および Zまたは、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記ポリべプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、および上記抗体のうちの少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする化合物の同定方法である。

さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および Zまたは、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、化合物と該ポリぺプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ポリぺプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、化合物が該ポリべプチドまたはポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリぺプチドの機能または該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法である。

またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および Zまたは、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記形質転換体と化合物とを接触させ、該ポリペプチドの発現または機能の有無を検出することのできるシグナルおよび/またはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび/またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ポリペプチドの発現または機能を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法である。

また、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと N—メチル一 D—ァスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記ポリペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、および上記抗体のうちの少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする化合物の同定方法である。

さらに、本発明の一態様は、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 3に記载のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの相互作用を阻害または促進する化合物の同定方法であって、上記ポリべプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、および上記抗体のうちの少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする化合物の同定方法である。

さらにまた、本発明の一態様は、上記いずれかの同定方法で同定され化合物である。

またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用し、その機能を阻害または促進する化合物である。

また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用し、当該ポリペプチドと配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの相互作用を阻害または促進する化合物である。

さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチドと相互作用し、当該ポリべプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドの共存下における N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の増幅を阻害または促進する化合物である。

さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物である。

またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる医薬組成物である。

また、本発明の一態様は、上記ポリぺプチド、上記ぺプチド、上記ポリヌタレォチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤である。

さらに、本発明の一態様は、上記ポリぺプチド、上記べプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる記憶再生の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤である。 ■

さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる神経変性疾患の防止剤、治療剤、または改善剤である。

またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなるアルツハイマー病の防止剤、治療剤、または改善剤である。また、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレォチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とする N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法である。

さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とする記憶再生の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法である。

さらにまた、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、およぴ上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とする神経変性疾患の防止方法、治療方法、または改善方法である。

またさらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体、上記化合物、上記調節剤、上記阻害剤、および上記促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とするアルツハイマー病の防止方法、治療方法、または改善方法である。

また、本発明の一態様は、上記ポリペプチドまたは上記ポリヌクレオチドを、定量的あるいは定性的に測定する方法である。

さらに、本発明の一態様は、上記ポリペプチド、上記ペプチド、上記ポリヌクレオチド、上記組換えベクター、上記形質転換体、上記抗体を少なくとも 1っ以上含んでなる試薬キットである。図面の簡単な説明

第 1図は、新規 P S D ( P r o t e i n— Xと称する）と P S D— 9 5について、アミノ酸配列の特徴を比較した模式図である。

第 2図は、新規 P SD (P r o t e i n— X) と 6 XH i s— t a gとの融合蛋白質を大腸菌で 3 7 °C培養にて発現させたときの電気泳動図である。

第 3図は、新規 P SD (P r o t e i n— X) と 6 XH i s— t a gとの融合蛋白質の、 3 7°Cにて培養した大腸菌の可溶性画分中の発現量が少ないことを確認した電気泳動図である。

第 4図は、新規 P SD (P r o t e i n— X) と 6 XH i s— t a gとの融合蛋白質が、 2 5 °Cにて培養した大腸菌の可溶性画分に発現することを示した電気泳動図である。

第 5図は、新規 P SD (P r o t e i n— X) またはその PDZドメイン欠失変異体と 6 XH i s - t a gとの融合蛋白質の発現と発現量を確認したゥエスタンプロッティングの結果を示す。

第 6図は、 NMD A受容体 /2 Bサブュニットと G S Tとの融合蛋白質の発現を確認したウェスタンプロッティングの結果を示す。

第 7図は、 NMDA受容体 /2 Bサブユニットと G S Tとの融合蛋白質および

GSTの発現および発現量を確認したウェスタンブロッティングの結果を示す。第 8図は、新規 P S D (P r o t e i n— X) が NMD A受容体 /2 Bサブュニットと結合するが、新規 P SD (P r o t e i n— X) の PDZ ドメイン欠失変異体は結合しないことをオーバーレイ法で検討した結果を示す。

第 9図は、新規 P SD (P r o t e i n— X) およびその PDZ ドメイン欠失変異体が、 GSTとは結合しないことを示す。

第 1 0図は、新規 P SD (P r o t e i n—X) の PDZ ドメイン欠失変異体と 6 XH i s— t a gとの融合蛋白質を大腸菌で 3 7 °C培養にて発現させたときの電気泳動図である。

第 1 1図は、新規 P SD (P r o t e i n—X) の PDZ ドメイン欠失変異体と 6 XH i s - t a gとの融合蛋白質が、 3 7 °Cにて培養した大腸菌の可溶性画分に発現することを示した電気泳動図である。第 1 2図は、 NMD A受容体 / 2 Bサブュニットと G S Tとの融合蛋白質の発現を確認した電気泳動図である。

第 1 3図は、新規 P SD (P r o t e i n— X) 遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。

第 14図は、 NMD A受容体 2 Bサブユニット遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。

第 1 5図は、 NMD A受容体 I遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。

第 1 6図は、 P SD— 9 5遺伝子を保持するベクターの制限酵素地図である。第 1 7図は、新規 P SD (P r o t e i n— X) により、 NMDA受容体刺激により発生した電気応答が増強されることを示す。

第 1 8図 Aは、 H i s— t a gを付加したヒト P J 0 1 08 7蛋白質（P r o t e i n— Yと称することもある）の大腸菌における発現誘導を、抗 H i s抗体を用いてウェスタンブロッテイングにより確認した電気泳動図である。図中、矢印はヒト P J 0 1 087蛋白質（P r o t e i n— Y) を示す。

第 1 8図 Bは、 G S Tを付加したヒト P J 0 1 08 7蛋白質（P r o t e i n -Y) の大腸菌における発現誘導を、抗 G S T抗体を用いてウェスタンプロッテイングにより確認した電気泳動図である。図中、矢印はヒト P J 0 1087蛋白質（P r o t e i n— Y) を示す。

第 1 9図は、ヒト P J 0 1 08 7遺伝子（配列表の配列番号 6) を保持するべクタ一の制限酵素地図である。

第 20図は、ヒト P J 0 1 08 7蛋白質（P r o t e i n—Y) 力 NMD A 受容体刺激により発生した電気応答に対する、新規 P SD (p r o t e i n— X) による増強効果をさらに強化するが、 P SD— 9 5による増強効果は強化しないことを示す。

第 2 1図は、ヒト P J 0 1 08 7蛋白質（P r o t e i n—Y) により、 NM D A受容体刺激により発生した電流変化量の新規 P S D (p r o t e i n-X) による増強がさらに強化されることを示す。

第 22図は、ヒト P J 0 1 08 7蛋白質（P r o t e i n— Y) と H i s— t a gとを融合させた蛋白質および新規 P SD (p r o t e i n— X) (h j 025 3 7) と GSTとを融合させた蛋白質を混合して抗 GST抗体で免疫沈降し、その後抗 G S T抗体で免疫沈降された蛋白質を検出した結果を示す。

第 23図は、ヒト P J 0 1 0 8 7蛋白質（P r o t e i n— Y) と H i s— t a gとを融合させた蛋白質および新規 P SD (p r o t e i n— X) ( h j 025 3 7) と GSTとを融合させた蛋白質を混合して抗 GST抗体で免疫沈降し、その後抗 H i s - t a gで免疫沈降された蛋白質を検出した結果を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、参照によりここに援用されるところの、日本特許出願番号第 200 1一 3 546 78号、同第 200 2-46786号および同第 2002- 229 8 6 3号からの優先権を請求するものである。

本明細書中で使用されている技術的およぴ科学的用語は、別途定義されていない限り、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者（当業者）により普通に理解される意味を持つ。本明細書中では当業者に既知の種々の方法が参照されている。そのような引用されている公知の方法を開示する刊行物等の資料はそれらを引用することにより本明細書中にそれらの全体が完全に記載されているものとして導入される。

以下、本発明について、発明の実施の態様をさらに詳しく説明する。以下の詳細な説明は例示であり、説明のためのものに過ぎず、本発明を何ら限定するものではない。

(新規 P SDおよび該 P SDと相互作用する蛋白質）

本発明においては、新規なヒト P SDおよび該 P SDと相互作用する蛋白質、並びにこれらをそれぞれコードする遺伝子を提供する。

新規ヒト P SDは、ヒト脳由来長鎖 c DNAライブラリーから、 PDZ ドメイ TJP02/12102

19

ン、 SH3 ドメインおよび GKドメインを有する遺伝子として選出したクローン h j 025 3 7がコードする蛋白質である。当該蛋白質は、 h j 0253 7遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを導入した大腸菌で発現させて得た。

以下、本発明に係るヒト P SDを P r o t e i n— X、当該 P SDをコードする遺伝子を P r o t e i n—X遺伝子と呼ぶ。 P r o t e i n— X遺伝子は 49 4 1塩基（配列表の配列番号 4) からなり、そのオープンリーディングフレーム (ORF)全長は 1 73 1塩基、該遺伝子の遺伝子産物は 576アミノ酸残基（配列表の配列番号 1) からなる。 P r o t e i n— Xは既知 P S Dと同様に、そのァミノ酸配列中の第 1 39番目イソロイシン（l i e) から第 2 1 9番目グリシン（G 1 y) に PDZ ドメインを、第 23 1番目メチォニン（Me t) 力ら第 2 9 6番目アルギニン（A r g) に SH3 ドメインを、および第 404番目トレオニン（Th r) から第 500番目ァスパラギン（A s n) に GKドメインを保有している。このことから、 P r o t e i n— Xは P SD— 9 5が含まれる DLG 様 PDZ蛋白質のホモログ（h omo 1 o g)であると推定した（第 1図を参照）。したがって、 P r o t e i n— Xは、 P SD— 95と同様の作用を持つと考えられ、膜受容体 .イオンチャネル近傍に存在して器官（a p p a r a t u s) を形成し、細胞間での情報伝達や神経伝達物質放出の制御に係わると想定される。実際、 P r o t e i n— Xは、 P S D— 95と同様に P D Z ドメインで NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットと結合し、さらに NMDA受容体のリガンド刺激によるシグナルに対して P S D— 9' 5よりも強い増幅作用を示した。すなわち、 P r o t e i n _Xは NMD A受容体と複合体を形成し、 NMDA受容体のシグナル伝達を促進すると考えられる。しかし、？ ]： 0 ₆ 1 11 — ^：と？ 30— 95は保有する PDZドメイン数が異なり、 P SD— 95には 3つ存在するのに対して、 P r o t e i n— Xにおいては 1つである。このこと力ら、 P r o t e i n— X は P S D— 95と異なる受容体シグナルを担う可能性がある。あるいは、 P r o t e i n— Xは、 P S D— 9 5様のシグナル伝達の捕足や、 PDZ ドメイン数による他の受容体等への結合選択性を現すことが考えられるまた、本発明においては、 P r o t e i n— Xの N末端側 8 5アミノ酸残基が欠失したポリペプチド（配列表の配列番号 2) を提供する。該ポリペプチドは、ヒト脳海馬由来長鎖 c DN Aライブラリーから得られた遺伝子クローン p 〗 02 6 77がコードするものである。 p j 0 26 77は 43 70塩基からなるポリヌクレオチド（配列表の配列番号 5) であり、 49 1アミノ酸からなるポリぺプチド（配列表の配列番号 2) をコードする。 p j 026 77がコードするポリプチドのアミノ酸配列は、 P r o t e i n— Xと比較して、 N末端側 85アミノ酸残基が欠失している他は同一である。したがって、そのアミノ酸配列中に PDZドメイン、 SH3 ドメイン、および GKドメインをそれぞれ 1つ保有しており、このことから P r o t e i n— Xと同様に NMD A受容体 / 2 Bサブュニットと結合し、同様の生理活性を示すものと推定される。 p j 026 7 7は、脳、例えば小脳等、心臓、肝臓、骨格筋、腎臓、膝臓、脾臓、脊髄等、各種臓器で広範に発現していることを確認した。 p j 026 77は上記 h ] 025 3 7の 5 '末端側塩基配列が欠失したものと考えられることから、 P r o t e i n— X遺伝子も同様にこれらの臓器で発現していると考えられる。

一方、 P r o t e i n_Xと相互作用する蛋白質は、かずさ DNA研究所のヒト脳由来長鎖 c DNA解析情報データベースから、ラット P SD 95/S AP 9 0—ァソシエーティッドプロテイン一 3 (SAPAP— 3) (G e n B a n k ：ァクセッション番号： U6 7 1 3 9) と 96 %の相同性を有する遺伝子として抽出したクローン P J 01 08 7がコードする蛋白質である。当該蛋白質は、 P J 0 1 08 7遺伝子を組み込んだ発現プラスミドを導入した大腸菌で発現させて得た。以下、この蛋白質を P J 0 1 08 7蛋白質、該蛋白質をコードする遺伝子を P J 0 1 08 7遺伝子と呼ぶ。また、 P J 0 1 087蛋白質を P r o t e i n - Yと称することもある。 P J 0 1 08 7遺伝子は 3 705塩基（配列表の配列番号 6) からなり、その ORF全長は 2940塩基、該遺伝子の遺伝子産物は 97 9アミノ酸残基（配列表の配列番号 3) からなる。また、 P J 0 1 0 8 7蛋白質は脳に特異的に発現していることが、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT— PC R ) および酵素免疫固相法（E L I S A) により判明した。

P J 0 1 0 8 7蛋白質は、 P r o t e i n— Xの共存下で NMD A受容体からのシグナルを著しく増幅した。 P J 0 1 0 8 7蛋白質と P r o t e i n— Xとによる該シグナルの増幅は、 P r o t e i n— X単独による増幅よりも格段に大きかった。一方、 P S D— 9 5の共存下では P J 0 1 0 8 7蛋白質による上記シグナルの増幅は認められなかった。これらから、 P J 0 1 0 8 7蛋白質が P r o t e i n— Xと相互作用すること、およぴ該相互作用により NMD A受容体リガンド刺激によるシグナル伝達が著しく増幅されることが判明した。

本明細書中で、 P J 0 1 0 8 7蛋白質が P r o t e i n— Xと相互作用するとは、両蛋白質がある様式により互いに作用を及ぼし、その結果、それぞれの蛋白質の機能が促進されることを意味する。それぞれの蛋白質の機能としては、例えば膜受容体 ·イオンチャネルの生理機能の促進、具体的には当該膜受容体の安定化や当該受容体のシグナル伝達の促進等が挙げられる。かかる膜受容体 ·イオンチャネルとしては、例えば NMD A受容体が例示できる。相互作用する様式としては、結合、一過性の結合、あるいは他の物質を介した複合体の形成等が例示されるが、これらに限定されない。 P J 0 1 0 8 7蛋白質と P r o t e i n—Xとの結合が免疫沈降法による分析では認められなかったことから、両蛋白質の相互作用は結合による様式ではなく、何らかの別様式によるものと考えている。

これらから、 P r o t e i n— Xの過剰発現により、あるいはその生理活性、例えば他の蛋白質との相互作用やグァニレートキナーゼ活性の促進により、膜受容体、例えば NMD A受容体のシグナルの増幅が可能になると考えられる。また、 P r o t e i n— Xの発現阻害により、あるいはその生理活性、例えば他の蛋白質との相互作用やグァニレートキナーゼ活性の阻害により、膜受容体、例えば N MD A受容体の異常シグナルを正常化できると考えられる。同様に、 P J 0 1 0 8 7蛋白質の過剰発現により、あるいはその生理活性の促進により、膜受容体シグナルの増幅が可能になる。また、 P J 0 1 0 8 7蛋白質の発現阻害により、あるいはその生理活性の阻害により、膜受容体の異常シグナルを正常化できる。す 2

22

なわち、 P r o t e i n—Xと膜受容体または当該受容体のシグナル伝達に関与する蛋白質等との相互作用の阻害または促進により、膜受容体のシグナル伝達等を調節することが可能である。ここで、「調節」とは、「阻害」または「促進」を意味する。また「促進」には、「増強」および「増幅」という意味も含まれる。例えば、 P r o t e i n— Xと NMD A受容体との相互作用の阻害または促進、あるいは P 3： 0 1 6 1 11— と？】 0 1 0 8 7蛋白質との相互作用の阻害または促進により、 NMD A受容体のシグナル伝達等を調節できる。したがって、 P r o t e i n— X自体、 P J 0 1 0 8 7蛋白質自体、並びにそれらの発現あるいは生理活性の阻害剤および促進剤は、 P r o t e i n _ Xの異常、 P J 0 1 0 8 7蛋白質の異常、両蛋白質の異常、または両蛋白質の相互作用の異常に起因する疾患の防止、改善、または治療に適用できる。すなわち、これら疾患の防止剤、改善剤、または治療剤、および防止方法、改善方法、または治療方法に使用できる。かかる疾患として、例えば P r o t e i n— Xおよび/または P J 0 1 0 8 7蛋白質が係わる膜受容体のシグナル伝達等の異常に基づく疾患が挙げられる。具体的には、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病おょぴポリグルタミン病等を例示できるが、これらに限定されない。

(ポリぺプチドまたはべプチド）

本明細書において、ポリペプチドとは、ペプチド結合または修飾されたぺプチド結合により互いに結合している 2個またはそれ以上のアミノ酸を含む任意のぺプチドのうち、蛋白質等の長鎖ペプチドを意味し、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称する短鎖ぺプチドを単にべプチドとレ、う。本明細書においてはァミノ酸を 3文字表記することもある。

本発明に係るポリペプチドは、 P r o t e i n— X遺伝子の遺伝子産物であり、該遺伝子を大腸菌等の細胞で発現させて得られたポリべプチドである。また当該ポリべプチドのアミノ酸配列に基づいて、ィ匕学合成して得られるポリべプチドゃ、細胞またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するポリぺプチドであつてもよい。当該ポリペプチドは、配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のアミノ酸配列と同一、または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリぺプチドであり得る。配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のァミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、少なくとも NMD A受容体/ " 2 Bサブュニットと結合し得るポリペプチドである限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドを含有するポリペプチドであり得る。あるいは、配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のポリぺプチドと、ァミノ酸配列上で約 7 0 %以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有し、かつ NMD A受容体 / 2 Bサブュニットと結合し得るものであってもよい。さらに、グァニレートキナーゼ活性を有するものがより好ましい。加えて、 P D Z ドメィンを 1つ保有するものがさらに好ましい。 NMD A受容体 / 2 Bサブュニットとの結合は、例えば後述する実施例に示したように、オーバーレイ法等の公知の方法により測定できる。また、グァニレートキナーゼ活性は自体公知の方法で測定できる。ァミノ酸配列の相同性を決定する技術は自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、 c D N Aの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。なお、。ヒト以外の動物種の相同遺伝子産物も当然本発明の範囲に包含される。さらに、このように特定されたポリべプチドを基にして、 NMD A受容体 / 2 Bサブュニットとの結合および Zまたはグァニレートキナーゼ活性を指標にすることにより、 1個以上、例えば 1個乃至 1 0 0個、好ましくは 1個乃至 3 0個、より好ましくは 1個乃至 2 0個、さらに好ましくは 1個乃至 1 0個、特に好ましくは 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、および Zまたは揷入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供できる。これらポリペプチドも、配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列からなるポリペプチドに含まれる。このようなポリペプチドとして、例えば、配列表の配列番号 2に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドは、配列番号 1に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリぺプチドである。上記変異を有するペプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよい。さらにまた、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリべプチドであって、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと相互作用しないポリペプチドも、本発明の範囲に包含される。かかるポリペプチドは、 P r o t e i n—Xと競合することにより、 P r o t e i n _ Xと P J 0 1 0 8 7蛋白質との相互作用を阻害すると推定できる。このため、かかるポリペプチドは、 NMD A受容体のシグナル伝達を阻害できると考えられる。

本発明に係る別のポリペプチドは、 P J 0 1 0 8 7遺伝子の遺伝子産物であり、該遺伝子を大腸菌等の細胞で発現させて得られたポリペプチドである。また当該ポリぺプチドのアミノ酸配列に基づいて、化学合成して得られるポリぺプチドゃ、細胞またはそれらの細胞が存在するあらゆる組織に由来するポリペプチドであつてもよい。当該ポリぺプチドは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列と同一、または実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリペプチドであり得る。配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、少なくとも配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと相互作用するポリペプチドである限りは特に限定されず、例えば、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドを含有するポリぺプチドであり得る。あるいは、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと、アミノ酸配列上で約 7 0 %以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、さらに好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有し、かつ配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと相互作用するものであつてもよい。また、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドの共存下で NMD A受容体のシグナル伝達を増幅するものであってもよい。このとき、 S A P A P— 3のアミノ酸配列は本発明の範囲に含まれない。また、相互作用するペプチドは、蛋白質の立体構造から決まる構造単位で、しばしば機能単位としても働くモジュールの概念から考えると、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列の少なくとも 5個の連続するアミノ酸配列を有するものも利用できる。モジュールのアミノ酸残基数は平均 1 5として知られているが、抗原となり得る機能等を考えるとァミノ酸残基 5個でも充分機能単位となり得ると考えている。配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドとの相互作用は、例えば当該ポリペプチド、被検対象であるポリペプチド、および NMD A受容体を細胞に共発現させ、 NMD A受容体のリガンド刺激による細胞内シグナル伝達を公知の方法を利用して測定することにより検定可能である（実施例 4 参照）。アミノ酸配列の相同性を決定する技術は自体公知であり、例えばアミノ酸配列を直接決定する方法、 c D N Aの塩基配列を決定後これにコードされるアミノ酸配列を推定する方法等が可能である。このように特定されたポリペプチドを基にして、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドとの相互作用、具体的には例えば NMD A受容体のシグナル伝達の促進、または配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドの共存下における N MD A受容体のシグナル伝達の増幅を指標にすることにより、 1個以上、例えば 1個乃至 1 0 0個、好ましくは 1個乃至 3 0個、より好ましくは 1個乃至 2 0個、さらに好ましくは 1個乃至 1 0個、特に好ましくは 1個乃至数個のアミノ酸の欠失、置換、付加、および/または挿入といった変異を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが提供される。これらポリペプチドも、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列からなるポリぺプチドに含まれる。このとき、上記 S A P A P— 3のアミノ酸配列は本発明の範囲に含まれない。上記変異を有するぺプチドは天然に存在するものであってよく、また変異を導入したものであってもよレ、。

欠失、置換、付加、および/または挿入といった変異の導入方法は自体公知であり、例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはポリメラーゼ連鎖増幅法（P C R ) を単独でまたは適宜組み合わせて、サムブックら編 [モレキュラークローニング，了ラボラトリーマ二ユアノレ第

2版] コールド 'スプリング 'ハーパー · ラボラトリー .プレス、 1 9 8 9年、村松正實編 [ラボマニュアル遺伝子工学] 丸善株式会社、 1 988年、エールリッヒ， HE. 編 [PCRテクノロジー， DNA増幅の原理と応用] ストックトンプレス、 1 9 8 9年等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばウルマー（U 1 me r) の技術〔「サイエンス (S c i e n c e)J、 1 9 8 3年、第 21 9卷、 p. 6 66—〕を利用することができる。このような変異の導入において、ポリぺプチドの基本的な性質（物性、機能、生理活性または免疫学的活性等）を変化させないという観点からは、例えば、同族ァミノ酸（極性ァミノ酸、非極性ァミノ酸、疎水性ァミノ酸、親水性ァミノ酸、陽性荷電アミノ酸、陰性荷電アミノ酸および芳香族アミノ酸等）の間での相互置換は容易に想定される。さらに、これらポリペプチドは、その構成アミノ基またはカルボキシル基等を修飾する等、機能の著しい変更を伴わない程度に改変が可能である。

配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリぺプチドは、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと比較して、その機能や作用がより促進されたものあるいは低下したものであり得る。例えば、 NMD A受容体との複合体形成能、グァニレートキナーゼ活性、および Zまたは配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用の程度が異なるものであり得る。より具体的には例えば、 N M D A受容体のシグナル伝達を促進する機能の強度が異なるもの、例えば機能がより促進されたもの、あるいは機能が低下したものであり得る。

配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリぺプチドは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリべプチドと比較して、その機能や作用がより促進されたものあるいは低下したものであり得る。例えば、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用の程度が異なるもの、例えば相互作用がより促進されたもの、あるいは相互作用が低下したものであり得る。より具体的には、例えば NMDA 受容体のシグナル伝達を促進する機能の強度が異なるもの、例えば機能がより促進されたもの、あるいは機能が低下したものであり得る。

本発明の範囲には、上記ポリペプチドに別種の蛋白質または物質、例えばキヤリア等を結合したものも包含される。例えば、本発明に係るポリペプチド等の検出または精製を容易にするために、または別の機能を付加するために、その N末端側や C末端側に別種の蛋白質またはべプチド、例えばアル力リホスファターゼ、 β —ガラクトシダーゼ、グルタチオン S—トランスフェラーゼ ( G S T )、ィムノグロブリン G ( I g G ) 等の免疫グロブリン F c断片、ヒスチジン一タグ（H i s— t a g ) またはフラッグ一タグ（F L A G— t a g ) 等を、直接的にまたはリンカーぺプチド等を介して間接的に遺伝子工学的手法等の公知方法を用いて付加することもできる。

また、本発明は、配列表の配列番号 1または配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの部分配列を有するポリべプチドまたはべプチドを包含する。当該部分配列を有するポリぺプチドまたはぺプチドは、その最小単位として 5個以上のアミノ酸、好ましくは 8個以上のアミノ酸、より好ましくは 1 2個以上、さらに好ましくは 1 5個以上の連続するアミノ酸からなるものである。例えば、 P r o t e i n— Xまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質の機能に関わる最小活性単位（領域またはドメイン）からなるポリペプチドまたはペプチドも本発明において提供される。上記部分配列を有するポリペプチドまたはペプチドは、例えば P r o t e i n— Xおよび/または P J 0 1 0 8 7蛋白質の機能を阻害するために使用できる。具体的には例えば、 NMD A受容体 Z 2 Bサブユニットと結合し得る上記べプチドは、 P r o t e i n— Xと NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットとの結合を阻害できる。また、例えば、 P r o t e i n— Xまたは P J 0 1 0 8 7 蛋白質の部分べプチドであって、両蛋白質の相互作用に関与する領域を含むぺプチドは、当該相互作用を阻害できる。あるいは、 P J 0 1 0 8 7蛋白質と P r o t e i n— Xの共存下における NMD A受容体のシグナル伝達の増幅を阻害できる。したがって、かかるペプチドは、 NMD A受容体のシグナル伝達の促進を阻害することができる。また、上記部分配列を有するポリペプチドまたはペプチド PC蘭画 02

28 は、 P r o t e i ！！— または r o t e i n— Xと同様の生理活性、例えば N MD A受容体 / 2 Bサブユニットとの結合、グァニレートキ ^ "一ゼ活性、および Zまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質との相互作用を有する上記ポリぺプチドの生理活性を調節する物質の同定等に使用する試薬として有用である。さらに、 P J 0 1 0 8 7蛋白質または P J 0 1 0 8 7蛋白質と同様の生理活性、例えば P r o t e i n— Xとの相互作用を有する上記ポリべプチドの生理活性を調節する物質の同定等に使用する試薬として有用である。免疫学的に認識され得るペプチド、例えばェピトープペプチドであれば、後述するように、例えば P r o t e i n—Xまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質に特異的な抗体を作成するための抗原として単独でまたはキヤリ了 (例えば、キーホールリンぺットへモシァニンまたは卵白アルブミン）と結合して使用できる。

(ポリヌクレオチド）

一つの態様において、本発明に係るポリヌクレオチドは、本発明に係るポリべプチドまたはぺプチドをそれぞれコードする塩基配列またはその相補的塩基配列を含むポリヌクレオチドを意味する。例えば、配列表の配列番号 1、配列番号 2 または配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドであり得る。好ましくは、配列表の配列番号 4、配列番号 5または配列番号 6に記載の塩基配列、またはその相捕的塩基配列からなるポリヌクレオチドである。本発明において、相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドを相補鎖と称することもある。

別の態様において本発明は、上記ポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号 4、配列番号 5または配列番号 6に記載の塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドの、対応する領域にストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドを包含する。ハイプリダイゼーションの条件は、例えばサムブルック等編 [モレキュラークローニング，ァラボラトリーマニュアル第 2版] コールド ·スプリング ·ハーバー ·ラボラトリー'プレス、 1 9 8 9年等に従うことができる。これらのポリヌクレオチドは目的のポリヌクレオチド、好ましくは配列表の配列番号 4、配列番号 5または配列番号 6に記載の塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドに、ハイプリダイゼーシヨンするものであれば必ずしも相補的配列でなくともよい。例えば、配列表の配列番号 4、配列番号 5または配列番号 6に記載の塩基配列、またはその相補的塩基配列からなるポリヌクレオチドに対する相同性において、少なくとも約 7 0 %以上、好ましくは約 8 0 %以上、より好ましくは約 9 0 %以上、さらに好ましくは約 9 5 %以上のものであればよい。このとき、 S A P A P— 3遺伝子の塩基配列は本発明の範囲には含まれない。また本発明に係るポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドの指定された塩基配列領域に対応する連続する 1 0 個以上のヌクレオチド、好ましくは 1 5個以上、より好ましくは 2 0個以上のヌクレオチドからなる塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを包含する。

これらポリヌクレオチドは、本発明に係るポリべプチド等の製造に有用な遺伝子情報を提供するものであり、あるいは核酸に関する試薬または標準品としても利用できる。例えば、 P r o t e i n— Xまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質をコードする核酸、例えばその遺伝子または m R N Aの検出のためのプローブまたはプライマ一として、または遺伝子発現を調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド等として利用できる。その意味で、本発明に係るポリヌクレオチドおよびォリゴヌクレオチドは翻訳領域のみでなく、非翻訳領域に対応するものも包含する。ここで、上記本発明に係るポリぺプチドをコードするポリヌクレオチドの選別は、例えば公知の蛋白質発現系を利用して発現蛋白質の確認を行い、その生理活性を指標にして実施できる。指標にする生理活性は、例えば NMD A受容体 Z 2 Bサブユニットとの結合、グァ-レートキナーゼ活性、あるいは配列表の配列番号 1 または配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用等が挙げられる。相互作用は、例えば NMD A受容体のシグナル伝達を促進させる機能の測定により評価できる。具体的には、配列表の配列番号 1および配列番号 3 に記載のそれぞれのアミノ酸配列からなる 2種のポリべプチドの共存下で、 NM 12102

30

DA受容体のシグナル伝達を増幅する機能を指標にして測定可能である。公知の蛋白質発現系としては、例えば、胚芽または家兎網状赤血球等由来のリボソーム系の技術を利用した無細胞蛋白質発現系〔「ネイチヤー（N a t u r e)J、 1 95 7年、第 1 79卷、 p. 1 60- 1 6 1) を例示できる。

(組換えベクター）

本発明に係るポリヌクレオチドを適当なベクター DNAに組込むごとにより、組換えベクターが得られる。用いるベクター DNAは、宿主の種類および使用目的により適宜選択される。ベクター DNAは、天然に存在するものを抽出したもののほか、増殖に必要な部分以外の DN Aの部分が一部欠落しているものでもよい。例えば、染色体、ェピソームおよびウィルス由来のベクター、例えば細菌プラスミド由来、パクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母ェピソーム由来、揷入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、例えばバキュ口ウィルス、パポバウィルス、 S V 40、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ゥィルス、仮性狂犬病ウィルスおよびレト口ウィルス等のウィルス由来のベクター、並びにそれらを組み合わせたベクター、例えばプラスミドおよぴバクテリオファージの遺伝学的エレメント由来のベクター、例えばコスミドおよびファージミド等が挙げられる。また、目的により発現ベクターやクローニングベクター等を用いることができる。

組換えベクターは、目的の遺伝子配列と複製そして制御に関する情報を担持した遺伝子配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、ターミネータ一、シグナル配列、ェンハンサ一等とを構成要素とし、これらを自体公知の方法により糸且み合わせて作製する。前記ベクター DNAに本発明に係るポリヌクレオチドを組込む方法は、自体公知の方法を適用できる。例えば、適当な制限酵素を選択、処理して DNAを特定部位で切断し、次いで同様に処理したベクターとして用いる DNAと混合し、リガ一ゼによって再結合する方法が用いられる。あるいは、目的のポリヌクレオチドに適当なリンカーをライゲーションし、これを目的に適したベクターのマルチクローニングサイトへ揷入することによつても、所望の組換えベクターが得られる。

(形質転換体）

上記ポリヌクレオチドが組み込まれたベクター DN Aを、自体公知の宿主に自体公知の方法で導入することにより形質転換体が得られる。宿主に導入するべクター DNAは、 1種のベクター DNAであってもよく、 2種以上のベクター DN Aを導入してもよい。例えば、配列表の配列番号 4に記載のポリヌクレオチドを含むベクター DN Aと配列番号 6に記載のポリヌクレオチドを含むベクター DN Aの、一方を導入してもよいし、両方を導入することもできる。宿主としては、例えば大腸菌、酵母、枯草菌、昆虫細胞または動物細胞等が例示できる。遺伝子の導入を行う場合、より好ましい系としては、遺伝子の安定性を考慮するならば染色体内へのインテグレート法が挙げられるが、簡便には核外遺伝子を利用した自律複製系を使用できる。ベクター DN Aの宿主細胞への導入は、例えば、サムブノレックら ΐ [モレキュラークローニング，了ラボラトリーマ二ユアノレ] コールド ·スプリング ·ハーパー . ラボラトリー 'プレス、 1 9 8 9年等に記載されている標準的な方法により実施できる。具体的には、リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 DEAE—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、マイクロインジェクシヨン、陽イオン脂質媒介トランスフエクシヨン、エレクト口ポレーション、形質導入、スクレープ負荷（s c r a p e l o a d i n g)、バリスティック導入（b a l l i s t i c i n t r o d u c t i o n) および感染等が挙げられる。

宿主に導入するベクター DN Aとして発現ベクターを使用すれば、本発明に係るポリべプチドまたはべプチドを提供可能である。上記ポリヌクレオチドが組み込まれた発現ベクター D N Aを導入した形質転換体は、各々の宿主に最適な自体公知の培養条件および培養方法で培養する。培養は、形質転換体により発現される本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの機能、例えば NMDA受容体 Z2 Bサブユニットとの結合、グァニレートキナーゼ活性、あるいは配列表の配列番号 1または配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を指標にして実施できる。あるいは、宿主中または宿主外に産生された該ポリぺプチドまたはぺプチド量を指標にして培養してもよく、培地中の形質転換体量を指標にして継代培養またはバッチ培養を行ってもよい。

(ポリべプチドおよびぺプチドの回収おょぴ Zまたは精製）

上記形質転換体を培養した培地からの本発明に係るポリぺプチドまたはぺプチドの回収おょぴ zまたは精製は、当該ポリペプチドまたはペプチドの機能、例えば NMD A受容体 Z 2 Bサブユニットとの結合、グァニレートキナーゼ活性、あるいは配列表の配列番号 1または配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用を指標にして実施できる。回収および/または精製の方法としては、硫安やアルコール等を用いた溶解度差に基づく分画手段、ゲルろ過、イオンカラムクロマトグラフィー、ァフィ二テイクロマトグラフィ一等が挙げられ、これらを単独でまたは組み合わせて使用する。好ましくは、回収および Zまたは精製しようとするぺプチドのアミノ酸配列の情報に基づき、これらに特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を作成し、該抗体を用いて特異的に吸着回収する方法を使用する。

(抗体）

抗体は、上記ポリペプチドまたは上記ぺプチドを抗原として用いて作製する。抗原は上記ポリべプチドまたは上記べプチド、あるいはそれらの断片でもよく、少なくとも 8個、好ましくは少なくとも 1 0個、より好ましくは少なくとも 1 2 個、さらに好ましくは 1 5個以上のアミノ酸で構成される。上記ポリペプチドおよび Zまたは上記べプチドに特異的な抗体を作成するためには、該ポリべプチドまたは該ぺプチドに固有なアミノ酸配列からなる領域を用いることが好ましい。この領域のアミノ酸配列は、必ずしも上記ポリべプチドまたは上記ぺプチドに記載のものと相同または同一である必要はなく、蛋白質の立体構造上の外部への露出部位が好ましく、露出部位のアミノ酸配列が一次構造上で不連続であっても、該露出部位について連続的なアミノ酸配列であればよい。抗体は免疫学的に、上記ポリぺプチドぉよび/または上記ぺプチドを結合または認識する限り特に限定 P T腕/ 12102

33 されない。この結合または認識の有無は、公知の抗原抗体結合反応によって決定できる。

抗体の産生には、自体公知の抗体作製法を利用できる。例えば、上記抗原をァジュバントの存在下または非存在下で、単独でまたは担体に結合して動物に投与し、体液性応答および/または細胞性応答等の免疫誘導を行うことにより抗体が得られる。担体はそれ自体が宿主に対して有害作用を示さずかつ抗原性を増強せしめるものであれば特に ^定されず、例えばセルロース、重合アミノ酸、アルブミンおよびキーホールリンペットへモシァニン（KLH) 等が例示される。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント (F C A), フロイント不完全ァジュバント（F I A)、 R i b i (MP L), R i b i (TDM), R i b i (MP L + TDM)、百日咳ワクチン（B o r d e t e 1 1 a p e r t u s s i s v a c c i n e )、ムラミルジぺプチド（MD P)、アルミニウムアジュバント（A LUM)、およびこれらの組み合わせが例示される。免疫される動物は、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ゥマ等が好適に用いられる。

ポリクローナル抗体は、上記免疫手段を施された動物の血清から自体公知の抗体回収法によって取得される。好ましい手段として免疫ァフィ二テイクロマトグラフィ一法により得られる。

モノクローナル抗体は、上記免疫手段が施された動物から抗体産生細胞（例えば、脾臓またはリンパ節由来のリンパ球）を回収し、自体公知の永久増殖性細胞 (例えば、 P 3— X 6 3— A g 8株等のミエローマ株）への形質転換手段を導入することにより生産できる。例えば、抗体産生細胞と永久増殖性細胞とを自体公知の方法で融合させてハイプリドーマを作成してこれをクローン化し、上記ポリぺプチドおよび zまたは上記ぺプチドを特異的に認識する抗体を産生するハイブリドーマを選別し、該ハイプリドーマの培養液から抗体を回収する。

かくして得られた上記ポリペプチドおよぴまたは上記ペプチドを認識して結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、上記ポリべプチドまたはペプチドの精製用抗体、試薬または標識マーカー等として利用できる。上記ポリべプチドおよび Zまたは上記ぺプチドを認識して結合するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のうち、例えば、直接 P r o t e i n—Xに結合してその生理活性、例えば NMD A受容体等の他の蛋白質との結合活性、グァニレートキナーゼ活性、および/または P J 0 1 0 8 7蛋白質との相互作用を阻害する抗体は、 P r o t e i n—Xおよび Zまたはその機能の異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善、または治療のために有用である。また、例えば、直接 P J 0 1 0 8 7蛋白質に結合して、その機能、例えば少なくとも P r o t e i n— Xとの相互作用を阻害するものは、 P J 0 1 0 8 7蛋白質おょぴ Zまたはその機能の異常に起因する各種疾患の解明、防止、改善、または治療に有用である。かかる抗体として例えば、 P r o t e i n— Xと P J 0 1 0 8 7蛋白質の相互作用による、 NMD A受容体のシグナル伝達の促進を阻害する抗体が例示できる。より具体的には例えば、 P r o t e i n— Xと P J 0 1 0 8 7蛋白質の共存下における、 N M D A受容体のシグナル伝達の増幅を阻害する抗体が挙げられる。

(化合物の同定方法）

本発明に係るポリペプチドまたはべプチド、本発明に係るポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを組み込んだベクター、該ベクターが導入されてなる形質転換体、これらを用いる蛋白質合成系、または該ポリペプチドおよび/または該ぺプチドを免疫学的に認識する抗体は、単独でまたは複数を組み合わせることによつて、上記ポリぺプチドまたは上記べプチドの機能の阻害剤または促進剤、および/または上記ポリヌクレオチドの発現の阻害剤もしくは促進剤の同定に有効な方法を提供する。該方法は、自体公知の医薬品スクリーニングシステムを利用して実施可能である。本発明に係る同定方法によれば、例えば上記ポリペプチドまたは上記ペプチドの立体構造に基づくドラッグデザインによる拮抗剤の選別、蛋白質合成系を利用した遺伝子レベルでの発現の阻害剤または促進剤の選別、または抗体を利用した抗体認識物質の選別等が可能である。

例えば、 P r o t e i n— Xに由来するポリペプチドまたはペプチドを用いて、被検化合物とこれらポリべプチドまたはぺプチドとの間の相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下でこれらポリべプチドまたはぺプチドと該化合物とを接触させて、その相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、 P r o t e i n— Xおよび P r o t e i n— Xと実質的に同一のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの活性を促進する化合物または阻害する化合物を同定可能である。このとき、該ポリペプチドまたは該ペプチドと結合する他の蛋白質、例えば N M D A受容体との相互作用を測定するアツセィ系を用い、ここに被検化合物を加えて当該相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、 P r o t e i 11—Xと例えば NMDA受容体との相互作用を促進する化合物または阻害する化合物を同定可能である。かかるァッセィ系は、自体公知のスクリーニングシステムを利用して構築可能であるが、例えば後述する実施例 3に記載した方法が使用可能である。また、 P r o t e i n—Xのグァニレートキナーゼ活性を指標にして、該グァ二レートキナーゼ活性を促進する化合物または阻害する化合物が同定できる。グァニレートキナーゼ活性の測定は、自体公知の方法により行うことができる〔クック（C o o k, P. F.) ら「バイオケミストリー（B i o c h em i s t r y)」、 1 982年、第 2 1卷、 p. 5 7 94— ；ライト（Wr i g h t , D. E.) ら、「プロシーディングォブナショナルアカデミーォブサイエンス（P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA)」、 1 98 1年、第 78卷、 p. 6048— ；コービン（C o r b i n， J . D.) ら「メソッズインェンザィモ口ジー (M e t h o d s i n e n z y m o 1 o g y )」、 1 9 74年、第 38卷、 p . 287—〕。また、 P J 0 1 08 7蛋白質に由来するポリべプチドまたはぺプチドを用いて、上記同様に、 P J 0 1 087蛋白質および同様の生理活性を有するポリべプチドの活性を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。 P r o t e i n— Xに由来するポリぺプチドまたはべプチドと P J 0 1 08 7蛋白質に由来するポリペプチドまたはペプチドとを用いて、それらの相互作用を測定するアツセィ系を用い、ここに被検化合物を加えて当該相互作用により生じるシダナルの存在、不存在または変化を検出することにより、当該相互作用を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。具体的には、例えば P r ο t e i n— X と P J 0 1 0 8 7蛋白質の相互作用による NMD A受容体のシグナル伝達の促進を阻害する化合物またはさらに促進する化合物を同定可能である。あるいは、例えば P 1： 0 1 6 1 11 _ と卩：1 0 1 0 8 7蛋白質の共存下における NMD A受容体のシグナル伝達の増幅を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。かかるアツセィ系は、自体公知のスクリーニングシステムを利用して構築可能であるが、例えば後述する実施例 6に記載した方法が使用可能である。

また、本発明に係るポリヌクレオチドと被検化合物との間の相互作用を可能にする条件を選択し、該条件下でこれらポリヌクレオチドと該化合物とを接触させて、該ポリヌクレオチドの発現を検出できるシグナルおよびまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび/またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、これらポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。得られた化合物から、さらに形質転換体を用いた下記の方法により、これらポリヌクレオチド、例えば P r o t e i n— Xまたは P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。

さらに、本発明に係る形質転換体を用いて、被検化合物または上記同定された化合物と適当な条件下で接触させ、本発明に係るポリヌクレオチド、例えば P r o t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現の有無または変化を検出することにより、該ポリヌクレオチド、例.えば P r o t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。 P r o t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現の有無または変化の検出は、簡便には、発現される遺伝子産物の機能を測定することにより実施できる。例えば、 P r o t e i n— X遺伝子発現の有無または変化の検出は、グァニレートキナーゼ活性を指標として測定することにより実施できる。あるいは、 P r o t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現の有無または変化を検出するために、検出のためのシグナルまたはマーカーを使用する自体公知の系を導入し、このシグナルまたはマーカーの存在、不存在または変化を検出してもよい。ここでシグナルとは、そのもの自体がその物理的性質または化学的性質により直接検出されるものを指し、マーカーとはそのものの物理的性質または生物学的性質を指標として間接的に検出されるものをいう。シグナルとしてはルシフェラーゼゃグリーン蛍光蛋白質（G F P ) 等、マーカーとしては、レポーター遺伝子、例えばク口ラムフエニコールァセチルトランスフェラーゼ（C A T ) 遺伝子等、または検出用のタグ、例えば H i s— t a g等、公知のものが利用できる。これらのシグナルまたはマーカーを目的の遺伝子配列に付加した後にベクターに組込み、得られたベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を作成すればよい。また、これらのシグナルまたはマーカーの利用方法おょぴ検出方法は、当業者には周知のものである。

具体的には、例えば後述する実施例に準じて P r o t e i n— Xまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質と H i s - t a gとの融合蛋白質を例えば大腸菌で発現させて H i s - t a gを検出する実験系において、ここに被検化合物を加えることにより、 P J 0 1 0 8 7蛋白質または P J 0 1 0 8 7蛋白質の発現または機能を阻害する化合物または促進する化合物を同定できる。

また別の具体例として、例えば P r o t e i n— X遺伝子、 P J 0 1 0 8 7蛋白質遺伝子およぴ NMD A受容体遺伝子を細胞に導入して共発現させ、被検化合物を加えて、 NMD A受容体のリガンド刺激による細胞内シグナル伝達を公知の方法を利用して測定する方法が挙げられる。上記遺伝子を共発現させたかかる細胞を用いれば、 P r o t e i n— Xまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質の機能を阻害する化合物または促進する化合物の他に、 P r o t e i n— Xまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質の発現を阻害する化合物または促進する化合物を同定可能である。

上記例示した同定方法おょぴ実験系は、これらを具体的に説明するために例示したものであり、本発明に係る化合物の同定方法おょぴ該方法に用いる実験系はこれらに限定されない。

( P J 0 1 0 8 7蛋白質と P r o t e i n— Xとの相互作用調節剤および医薬組成物）

本発明においては、 P r o t e i n— Xが NMD A受容体 Z 2 Bサブュ-ットと結合して NMD A受容体のシグナル伝達を増幅すること、並びに P J 0 1 08 7蛋白質が P r o t e i n— Xの共存下で、膜受容体、例えば NMDA受容体のシグナル伝達を著しく増幅することを見出した。このことから、 P J 0 1 08 7 蛋白質は、膜受容体 'イオンチャネル、例えば NMD A受容体がそのリガンド等により刺激を受けると該受容体近傍に集積し、 P r o t e i n_Xとの相互作用により、例えば当該受容体を安定化する、および/または、当該受容体のシグナル伝達を促進すると推察した。 P r o t e i n— Xおよび P J 0 1 08 7蛋白質は、これらが関わる膜受容体、例えば NMD A受容体のシグナル伝達の結果引き起こされる生理機能、例えば神経伝達物質放出等に関わると考えられる。したがつて、 P J 0 1 087蛋白質と P r o t e i n— Xの相互作用の阻害または促進により、 P J 0108 7蛋白質および P r o t e i n— Xが関わる生理機能、例えば少なくとも NMD A受容体のシグナル伝達を調節することができる。また、 NMD A受容体と P r o t e i n— Xとの結合の阻害または促進により、 NMD A受容体のシグナル伝達を調節可能である。

かくして、本発明においては、 P r o t e i n— Xと NMD A受容体との結合を阻害するまたは促進する手段、および/または、 1： 0 1 6 1 11— と？】 0

1 08 7蛋白質の相互作用を阻害するまたは促進する手段を導入された NMDA 受容体のシグナル伝達の調節剤および調節方法を提供する。ここで、調節剤とは阻害剤、拮抗剤または促進剤等を総称的にいうものである。また調節方法とは、阻害方法または促進方法等を意味する。 P r o t e i n— Xと NMD A受容体との結合の促進には、例えば P r 0 t e i n— X自体またはその遺伝子を用いることができる。 P r 0 t e i n— Xおよびまたは P J 0 1 087蛋白質の相互作用の促進には、これら蛋白質自体またはそれらの遺伝子を用いることができる。例えば、 P r o t e i n— Xまたは P r o t e i n— Xと P J 0 1 08 7蛋白質を過剰発現させることにより、あるいはそれらの機能を促進することにより、 P PC漏 2/12102

39

r o t e i n— Xと NMD A受容体との結合または P r o t e i n— Xと P J O 1 08 7蛋白質の相互作用が促進されるため、 NMD A受容体のシグナル伝達を促進することができる。 P r o t e i n— Xと NMD A受容体との結合の阻害、または P r o t e i n— Xおよび/または P J 0 1 087蛋白質の相互作用の阻害は、例えば P r o t e i n— Xおよび/または P J 0 1 08 7蛋白質の発現を阻害することにより実現可能である。蛋白質発現の阻害、あるいはそれらの機能の阻害により受容体の異常シグナルを正常化できる。

P r o t e i n— Xと NMD A受容体の結合、または P r o t e i n—Xと P J 0 1 08 7蛋白質の相互作用を阻害または促進する手段としては、その他に、例えば上記方法により同定された化合物が挙げられる。当該化合物は、例えば P r o t e i n— Xと NMD A受容体の結合の阻害剤または促進剤、 P r o t e i η— Xと P J 0 1 087蛋白質の相互作用の阻害剤または促進剤として用いることができ、さらに NMD A受容体のシグナル伝達の阻害剤または促進剤として利用可能である。より具体的には、本発明に係る P ]： ₀ 1： 6 1 ₁1— と？：[ 0 1 0 87蛋白質の共存下における NMD A受容体シグナル伝達の増幅の阻害剤または促進剤として利用可能である。阻害剤として使用できる化合物としては、本発明に係る上記ポリペプチドの機能に関わる最小活性単位（領域またはドメイン）からなるポリべプチドまたはぺプチドであって、 P r o t e i n_Xと P J 0 1 0 8 7蛋白質の相互作用を阻害できるものが例示できる。このようなポリペプチドまたはペプチドは、例えば P J 0 1 0 8 7蛋白質のアミノ酸配列から設計し、自体公知のぺプチド合成法によって合成し、上記同定方法で試験することにより同定可能である。また、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列からなるポリべプチドであって、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリべプチドと相互作用しないポリべプチドが阻害剤として利用できる。さらに、 P J 0 1 087蛋白質と P r o t e i n— Xの相互作用を阻害する抗体も上記化合物の 1つとして例示できる。

上記選別された化合物、上記調節剤は、単独でまたは複数組み合わせて使用することにより、試薬として、あるいは医薬組成物の成分として使用できる。これらは、 P r o t e i n— Xおよびノまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質、並びにそれらの遺伝子が関与する生体機能あるいは疾患の解明、例えば NMD A受容体のシグナル伝達機構の解明あるいは N M D A受容体のシグナル伝達異常に起因する疾患や神経変性疾患の解明に使用できる。

また、上記方法により同定された化合物は、 P r o t e i n— Xまたは P r o t e i n—Xと同様の生理活性を有するポリペプチドの活性、例えば NMD A受容体等の他の蛋白質との結合活性やグァニレートキナーゼ活性の調節剤、例えば阻害剤、拮抗剤または促進剤の候補化合物として利用可能である。また、 P r o t e i n— Xまたは P r o t e i n— Xと同様の生理活性を有するポリペプチドの遺伝子レベルでの発現に関する調節剤、例えば阻害剤、拮抗剤または促進剤の候補化合物としても利用可能である。あるいは P J 0 1 0 8 7蛋白質または P J 0 1 0 8 7蛋白質と同様の生理活性を有するポリペプチドの活性、例えば！³ r o t e i n— Xとの相互作用の調節剤、例えば阻害剤、拮抗剤または促進剤の候補化合物として利用可能である。また、 P J 0 1 0 8 7蛋白質または P J 0 1 0 8 7蛋白質と同様の生理活性を有するポリぺプチドの遺伝子レベルでの発現に関する調節剤、例えば阻害剤、掊抗剤または促進剤の候補化合物としても利用可能である。これらの発現を阻害する化合物としては、例えば P r o t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドが例示できる。当該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、 P r 0 t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現系を用いて、 P r o t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の塩基配列を基に設計したオリゴヌクレオチドから、 P r o t e i n—X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現を特異的に阻害するものを選択することにより得られる。ここで「P r o t e i n _ X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現を特異的に阻害する」とは、 P r o t e i n— X遺伝子または P J 0 1 0 8 7遺伝子の発現を強く阻害し、他の遺伝子の発現は阻害しないか、または弱く阻害することを意味する。かくして選別された候補化合物は、生物学的有用性と毒性のバランスを考慮してさらに選別することにより、医薬組成物として調製可能である。また、本発明に係るポリぺプチドまたはべプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相捕鎖を含むベクター、並びに本発明に係るポリペプチドまたはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を本発明に係るポリべプチドの発現や機能の異常に起因する各種病的症状、例えば神経変性疾患の解明、診断、防止、改善、または治療に使用できる。すなわち本発明は、上記物質を単独でまたは複数組み合わせて使用することにより、これらのうち少なくとも 1つを含有する医薬組成物を提供する。

発現の異常としては発現の過剰または低下が挙げられる。機能の異常としては、例えば、 P r o t e i n— Xと NMD A受容体の結合の異常、あるいは P r o t e i n— Xと P J 0 1 08 7蛋白質の相互作用の異常等が挙げられる。これら異常の結果として、例えば NMD A受容体のシグナル伝達の異常、具体的には例えば NMD A受容体シグナル伝達の過剰、低下または欠失等が起きる。神経変性疾患としては、次に挙げる例に限定されるものではないが、例えば、アルッハイマ一病、パーキンソン病およびポリグルタミン病等が挙げられる。

また、 P r o t e i n—Xは、 P SD— 9 5が 3つ有する PDZ ドメインを 1 つ有する。この 1つの PD Zドメインも NMDA受容体 2 Bサブュ-ットと結合することが示されたことより、 P SD— 9 5様のシグナル伝達の補足や、 PD Zドメイン数による他の受容体等への結合選択性を現すことが考えられる。この想定される機能に由来するシグナルの強化や異常シグナルの正常化の工夫も利用できる。

本発明に係る P r o t e i n— Xおよび/または P J 0 108 7蛋白質の発現、および Zまたはその機能の低下または欠失等に関連する異常な症状の治療には、 1つの方法として P r o t e i n— Xおよび Zまたは P J 01 087蛋白質自体もしくはこれら蛋白質と同様の機能を有するポリぺプチド、またはこれらをコードする遺伝子を活性化する治療上有効量の化合物を医薬上許容される担体とともに投与し、そのことにより異常な症状を改善することを特徴とする方法が挙げられる。あるいは、遺伝子治療を用いて、対象中の細胞内で P r 0 t e i n— Xおよび/または P J 0 1 0 8 7蛋白質自体もしくはこれら蛋白質と同様の機能を有するポリペプチドを生成なさしめてもよい。遺伝子治療は、公知の方法が利用できるが、例えば、上記のごとく本発明に係るポリヌクレオチドを組み入れた複製欠損レトロウイルスベクターを作成して遺伝子治療に利用すればよい。また、例えば、目的とする蛋白質をコードしている D N Aまたは R N Aを用いて、例えばレトロウィルスプラスミドベクターを用いることによりェクスビボ（e x V i v o ) において対象由来の細胞を処理し、次いで細胞を対象に導入することもでさる。

P r o t e i n— Xおよび/または P J 0 1 0 8 7蛋白質の発現、および Zまたはその機能が過剰である場合、有効量の上記阻害剤化合物を医薬上許容される担体とともに対象に投与してこれら蛋白質の機能、例えば P r o ' t e i n— Xと NMD A受容体の結合、および/または P r o t e i n—XとP J 0 1 0 8 7蛋白質の相互作用による NMD A受容体シグナル伝達の促進を阻害し、そのことにより異常な症状を改善することもできる。さらに、発現プロック法を用いて内在性の当該ポリべプチドをコ一ドしている遺伝子の発現を阻害してもよい。細胞内で生成させた、あるいは別個に投与された当該遺伝子のアンチセンス配列からなるオリゴヌクレオチドを使用して当該遺伝子の発現を阻害できる。これらオリゴヌクレオチドは、上記本発明に係るポリヌクレオチドを基にして設計し合成できる。当該オリゴヌクレオチドはそれ自体投与することができ、あるいは関連オリゴマーをインビボで発現させることもできる。

P r o t e i n— Xおよび/または P J 0 1 0 8 7蛋白質の発現、および/または機能の過剰、低下もしくは欠失等の機能障害は、 P r o t e i n— Xおよび Zまたは P J 0 1 0 8 7蛋白質が関わる生理機能、例えば膜受容体のシグナル伝達の結果引き起こされる神経伝達物質放出等の制御の異常をきたし、病的症状を引き起こす。したがって、本発明は、 P r 0 t e i _n—Xおよび/または P J 0 108 7蛋白質の関与する生体機能の解明、例えば細胞内シグナル伝達や神経伝達物質放出の制御の解明に有用である。さらに、本発明は、 P r 0 t e i n— X および/または P J 0 1 08 7蛋白質の関与する細胞内シグナル伝達や神経伝達物質放出の制御の異常により引き起こされる疾患、例えば NMD A受容体のシグナル伝達異常に起因する疾患や神経変性疾患の、防止剤、改善剤、または治療剤および防止方法、改善方法、または治療方法、さらに該疾患の診断手段として用 V、る測定法に非常に有用なものである。

最近、ノックアウトマウスを用いた実験により、脳内の記憶再生メカニズムに関し知見が得られた。つまり、海馬の C A 3領域の NMD A受容体が記憶再生に重要な役割を演じていた〔ナカザヮ（Na k a z a w a, K.) ら、 '「サイエンス (S c i e n c e)」、 2002年、第 29 7卷、第 5 5 79号、 p. 2 1 1— 2 1 8〕。この NMD A受容体の機能は、その機能を正常化したり、亢進すると、記憶再生に関わる疾患、例えばアルツハイマー病等の記憶力が低下する症状を防止、改善、または治療できる。このことから本発明は、記憶再生に関わる疾患、例えばアルツハイマー病等の防止、改善、または治療に用いられる薬剤の開発を可能にする。

本発明に係る医薬組成物、調節剤、防止剤、治療剤、または改善剤の処方は、適当な医薬担体と組み合わせて処方することが好ましい。かかる処方は、治療上有効量の本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相捕鎖を含むベクター、並びに本発明に係るポリぺプチドまたはべプチドを免疫学的に認識する抗体、上記化合物、上記調節剤、上記防止剤、上記治療剤、上記改善剤、または上記医薬組成物、さらに医薬上許容される担体または賦形剤を含む。かかる担体としては、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの混合物が挙げられるがこれらに限らない。処方は投与経路に適したものを選択すればよく、該処方は当業者によく知られている。これら医薬組成物、調節剤、防止剤、治療剤、または改善剤は、単独で使用してもよく、あるいは治療に必要な他の化合物または医薬と一緒に使用してもよい。本発明に係る医薬組成物、調節剤、防止剤、治療剤、または改善剤の投与形態は、全身投与であっても局所投与であってもよい。全身投与の好ましい一態様は、注射、例えば静脈注射が挙げられる。皮下、筋肉内または腹腔内のような他の注射経路を用いることもできる。投与の別の態様は、腸溶処方またはカプセル処方がうまく処方されるならば、経口投与も可能である。さらに、胆汁酸塩またはフシジン酸または他の界面活性剤のような浸透剤を用いる経粘膜投与もしくは経皮投与を用いることもできる。局所的な投与においては、膏薬、パスタ、ゲル等の形態での投与であってもよい。

必要な用量範囲は、本発明に係るポリペプチドまたはペプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、該ポリヌクレオチドまたはその相補鎖を含むベクター、並びに本発明に係るポリべプチドまたはべプチドを免疫学的に認識する抗体、上記化合物、上記調節剤、上記防止剤、上記改善剤、上記治療剤、または上記医薬組成物の有効性、投与経路、処方の性質、対象の症状の性質、および担当医師の判断による。具体的には、適当な用量は、例えば対象の体重 l k g あたり 0 . 1 μ g乃至 1 0 0 μ gの範囲である。しかしながら、当該分野においてよく知られた最適化のための一般的な常套的実験を用いてこれらの用量の変更を行うことができる。

製剤化にあたっては、例えばペプチド、蛋白質、オリゴヌクレオチド、抗体、または化合物等各対象の物性に応じた公知の製剤化手段を導入すればよい。具体的には、例えば散剤、丸剤、錠剤、カプセル製剤、水溶液製剤、エタノール溶液製剤、リボソーム製剤、脂肪乳剤、またはシクロデキストリン等の包接体等の製剤化方法が利用できる。

散剤、丸剤、カプセル剤および錠剤は、ラクトース、グルコース、シユークロースおよびマンニトール等の賦形剤、澱粉おょぴアルギン酸ソーダ等の崩壌剤、マグネシウムステアレートおょぴタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロースおよびゼラチン等の結合剤、脂肪酸ェステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑剤等を用いて製造できる。錠剤やカプセルを製造するには、固体の製薬担体が用いられる。

懸濁剤は、水、シユークロース、ソルビトールおよびフラクトース等の糖類、 P E G等のダリコール類、油類を使用して製造できる。

注射用の溶液は、塩溶液、グルコース溶液、または塩水とグルコース溶液の混合物からなる担体を用いて調製可能である。

リボソーム化は、例えばリン脂質を有機溶媒（クロ口ホルム等）に溶解した溶液に、当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液を加えた後、溶媒を留去し、これにリン酸緩衝液を加え、振とう、超音波処理おょぴ遠心処理した後、上清をろ過処理して回収することにより行い得る。

脂肪乳剤化は、例えば当該物質、油成分（大豆油、ゴマ油おょぴォリーブ油等の植物油並びに M C T等）、乳化剤（リン脂質等）等を混合、加熱して溶液とした後に、必要量の水を加え、乳化機（ホモジナイザー、例えば高圧噴射型や超音波型等）を用いて、乳ィヒ ·均質化処理して行い得る。また、これを凍結乾燥化することも可能である。なお、脂肪乳剤化するとき、乳化助剤を添加してもよく、乳化助剤としては、例えばグリセリンゃ糖類（例えばブドウ糖、ソルビトールぉよび果糖等）が例示される。

シクロデキストリン包接化は、例えば当該物質を溶媒（エタノール等）に溶解した溶液に、シクロデキストリンを水等に加温溶解した溶液を加えた後、冷却して析出した沈殿をろ過し、滅菌乾燥することにより行い得る。この際、使用されるシクロデキストリンは、当該物質の大きさに応じて、空隙直径の異なるシクロデキストリン（α、 β、 τ/型）を適宜選択すればよい。

(診断のための測定方法および試薬）

本発明に係るポリべプチドまたはべプチド、本発明に係るポリヌクレオチドまたはその相補鎖、または当該ポリペプチドもしくはペプチドを免疫学的に認識する抗体は、それ自体を単独で、診断マーカーや試薬等として使用できる。これらは試薬であるとき、緩衝液、塩、安定化剤、および Ζまたは防腐剤等の物質を含んであってもよい。本発明に係るポリペプチドまたはペプチドは、これらを遺伝子工学的手法で発現させた細胞、無細胞系合成産物、化学合成産物、または当該細胞や生体試料から調製したものであってよく、これらからさらに精製されたものであってもよい。また、本発明に係るポリペプチドまたはペプチドの機能、例えば NMD A受容体との結合、 P r o t e i n— Xとの相互作用、または P J 0 1 087蛋白質との相互作用、または該相互作用における例えば NMD A受容体のシグナル伝達の増幅が阻害されなければ、 N末端側や C末端側に別の蛋白質またはペプチド、例えば ]3—ガラクトシダーゼ、 I g G等の免疫グロブリン F c断片、 H i s— t a g、 My c— t a g、 HA— t a gまたは FLAG— t a g等力直接またはリンカ一ペプチド等を介して間接的に、遺伝子工学的手法等を用いて付加されたものであってもよい。本発明に係るポリヌクレオチドはその機能、例えばコードするポリべプチドの発現や、発現されたポリぺプチドの機能が阻害されなければ、 5' 末端側や C' 末端側に、ルシフェラーゼゃグリーン蛍光蛋白質（GFP) 等のシグナル、あるいはクロラムフエ-コールァセチルトランスフエラーゼ（CAT) 遺伝子等のレポーター遺伝子が付加されたものでもよい。また本発明は、これらのうちの 1種またはそれ以上を充填した、 1個またはそれ以上の容器を含んでなる試薬キットを提供する。なお、製剤化にあたっては、自体公知のポリペプチドまたはペプチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、または抗体等それぞれに応じた製剤化手段を導入すればよい。

これら試薬および試薬キットは、本発明に係る同定方法に使用できる。また、当該試薬および試薬キットは、本発明に係るポリペプチド、ペプチドまたはこれらのいずれか 1つをコードするポリヌクレオチドの定量的おょぴ Zまたは定性的な測定に使用できる。当該測定のための方法は、当業者に周知の方法を利用して構築できる。ポリペプチドまたはペプチドの測定に利用できる方法としては、ラジオイムノアツセィ、競争結合アツセィ、ウェスタンプロット分析および E L I S Aアツセィ等を例示できる。また、ポリヌクレオチドは、例えば増幅、 PCR、 RT— P CR、 RNァーゼ保護、ノーザンブロッテイングおょぴその他のハイブリダイゼーション法を用いて核酸レベル、例えば R N Aレベルで検出および定量が可能である。

上記試薬、試薬キットおよび測定方法は、本発明に係るポリペプチドまたはべプチド、例えば P r 0 t e i n—Xおよび/または P J 0 1 0 8 7蛋白質の発現、およびそれらの機能の異常に起因する疾患の検出方法に適用できる。または、これらをコードする D N Aの変異等に起因する各種病的疾患の検出方法に使用でき .る。当該疾患としては、例えば神経変性疾患、より具体的には、アルツハイマー病、パーキンソン病およびポリグルタミン病が例示できる。

測定される試料は、個体由来の、例えば細胞、血液、尿、唾液、髄液、組織生検または剖検材料等が挙げられる。また、測定される核酸は上記各試料から自体公知の核酸調製法により得られる。核酸は、ゲノム D N Aを検出に直接使用してもよく、あるいは分析前に P C Rまたはその他の増幅法を用いることにより酵素的に増幅してもよい。 R N Aまたは c D N Aを同様に用いてもよい。正常遺伝子型との比較において、増幅生成物のサイズ変化により欠失およぴ揷入を検出することができる。増幅 D N Aを、標識した本発明に係るポリペプチドをコードする D N Aにハイプリダイゼーシヨンさせることにより点突然変異を同定できる。すなわち、個体由来の試料について、例えば当該ポリペプチドまたは当該ぺプチドをコードするポリヌクレオチドとの相互作用や反応性を利用して、相応する核酸の存在を検出すること、その存在量を決定すること、および Zまたはその変異を同定すること、並びに当該ポリペプチドまたはペプチドについて個体中の生体内分布を決定すること、当該ポリぺプチドまたはべプチドの存在を検出すること、その存在量を決定すること、およびノまたはその変異を検出することによつて、上記疾患の診断が可能である。

さらに、本発明に係るポリペプチドもしくはペプチドまたはこれらのいずれか 1つをコードする核酸を診断マーカーとして定性的にあるいは定量的に測定することにより、上記疾患の検査および診断が可能である。すなわち、上記検出方法を利用して、されに上記疾患の検查方法または診断方法が実施可能である。 TJP02/12102

48

実施例

以下に実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例 1

(新規 P S D遺伝子（P r o t e i n— X遺伝子）の単離 ·同定）

本発明に係る P r o t e i n— X遺伝子は、かずさ DN A研究所のヒト脳由来長鎖 c DNA解析情報データベースから、バイオインフォ一マテイクス（b i o i n f o r m a t i c s ) により、 P D Z ドメイン、 S H 3 ドメインおよび GK ドメインを有する遺伝子として抽出したクローン h j 0 2 5 3 7に基づいて、ヒト脳由来 mRNAから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT— P CR) により作成した c DNAを錶型としてクローニングを行うことにより、生体におけるその発現を確認した。

まず、ヒト脳由来 mRNAを用い、スーパースクリプト Π (S u p e r s c r i p t Π)キット（G i b c o B R L社）を使用して逆転写反応を行った。ヒト脳由来 mRNA ( 1 μ g/ μ 1 ) 0. 2 μ 1、オリゴ（d T)プライマー（0. 5 μ μ 1 ) 1 μ 1、 Η₂0 1 0. 8 μ 1を混合し、 7 0 °Cで 1 0分間加熱し、氷冷後に 5 X ファーストストランドバッファー（F i r s t s t r a n d b u f f e r ) 4 β I 0. 1M ジチォスレイトール（DTT) 2 ^ 1、 1 0 mM デォキシヌクレオチド三リン酸（d NT P) ミックス 1 μ 1を添カロした。続いてスーパースクリプト Π ( 2 0 0 U/μ 1 ) を 1 /_t 1添加し、室温で 1 0分間、 4 2°Cで 5 0分間、 7 0°Cで 1 5分間反応させて、 c DNAを調製した。

つぎに、クローン h j 0 2 5 3 7の塩基配列に基づいて、下記プライマーを設計して合成した。プライマーの配列中、下線で示した ATGは翻訳開始コドンで ¾>る。マー〉

P r -H J f (配列番号 7) ：

5' 一 TT A

ATGC C AGCTTTGT C AACGG

P r— H J r (配列番号 8) ：

5 一 GGGGAC

CAT C TTGGAGATAGAGC GG ポリメラーゼ連鎖反応（P CR) はアドバンテージ 2 P CRキット（A d v a n t a g e 2 P CR k i t ) (C l o n t e c h社）を用いて行った。 1 0 X アドバンテージ 2 P CRバッファー 2 2 1、上記 P r — H J f ( 5 3. 0 9 p m o I / μ 1 ) 0. 2 1、上記 P r —H J r ( 3 8. 5 9 p m o I / μ 1 ) 0. 3 μ 1、上記調製した c DNAを 1 1、 1. 2 5 mM d NTPミックス 1. 6 μ 1、 5 0 X ポリメラーゼミックス 0. 4 μ 1、 Η₂〇 1 4. 5 μ 1 を混合し（合計 2 0 1 )、下記条件で P CR反応を行った。

< P CR運転条件 >

刖ステップ ( p r e ) 9 5°C 1分間

ステップ 1 9 5°C 3 0秒間

2 6 8 °C 2分間

(ステップ 1〜2を 2 5

後ステップ（p o s t ) 6 8 °C 5分間得られた P C R産物を用いて、ゲイトウエイシステム (G a t e w a y _s y s t e m) ( I n v i t r o g e n社）を使用してクローニングを行った。 P C R産物 1 6 ^ 1を T Eバッファーで 1 0 0 _μ 1 とし、 3 0 % P E G 8 0 0 0ノ 3 0 mM M g C 1 ₂を 5 0 1添加して、室温で遠心（1 5， 0 0 0 r p mで 1 0分間）した後、ペレットを 7 0%エタノールで洗浄して乾燥し、 TEパッファー 3 0 1に溶解した。その後、 B Pクロナーゼ反応バッファー（ c 1 o n a s e r e a c t i o n b u f f e r ) 1 μ I ^ P C R産物 1 μ 1、エントリ一べクタ一（_{e n} t r y ν Θ θ ί ο Γ ) (ρ ϋΟΝΚ 2 0 1 : 1 5 0 η ,α 1 ) 0. 5 μ 1、 ΤΕバッファー 1. 5 μ 1を氷上で混合し（合計 4 μ 1 )、 Β Ρクロナーゼ酵素ミックス (c l o n a s e e n z ym e m i x) Ι μ ΐ添カロ後、 2 5°Cで 4. 5時間反応させた。反応後、プロティナーゼ K (p r o t e i n a s e K) を 0. 5 μ 1添加し、 3 7。Cで 1 0分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液 1 μ 1をコンビテント細胞（c omp e t e n t c e l l ) JM1 0 9にトランスフォーメーション（ t r a n s f o r m a t i o n) し、 p DONR S O lZh j O S S S T ?および p D〇NR 2 0 1/h j 0 2 5 3 7 # 9を得た。これらクローンの塩基配列から、脳における発現が確認された。実施例 2

(新規 P SD (P r o t e i n— X) の発現）

P r o t e i n— Xを発現させるために、大腸菌発現ベクターおよび発現系をゲイトウェイシステム（ I n V i t r o g e n社）を用いて構築した。クローン h j 0 2 5 3 7を鏡型とし、了ドパンテージ 2 P CRキットを用いて蛋白質翻訳領域の増幅を行った。 1 0 X アドバンテージ 2 P CRバッファー 2 ^ 1、実施例 1で作成した P r— H J f (5 3. 0 9 pmo \ / μ 1 ) 0. 2 ^ 1およぴ P r— H J r (3 8. 5 9 p m o I / μ 1 ) 0. 3 μ 1、クローン h j 0 2 5 3 7 ( 1 n g/ μ 1 ) 2 μ I , 1. 2 5 mM d NTPミックス 1. 6 ^ 1、 5 0 X ポリメラーゼミックス 0. 4 ^ 1、 Η₂Ο 1 3. 5 μ Iを混合し（合計 2 0 μ 1を 2本調製した）、実施例 1と同様に P C R反応を行った。

P CR産物 3 5 / 1を TEバッファーで 1 0 0 1 とし、 3 0% P EG 8 0 0 0/3 0 mM M g C 1 ₂を 5 0 1添加し、室温で遠心（ 1 5, 0 0 0 r ρ 2

51 mで 1 0分間）後、ペレットを 7 0 %エタノールで洗浄して乾燥し、 TEバッファー 5 0 ^ 1に溶解した。その後、 B Pクロナーゼ反応バッファー 1 1、 P C R産物 1 1、エントリ一ベクター（p DONR 2 0 1： 1 5 0 η g/μ 1 ) 0. 5 ί 1、 ΤΕバッファー 1. 5 /x lを氷上で混合し（合計 4 μ 1 )、 Β Ρクロナーゼ酵素ミックスを 1 μ 1添加後、 2 5°Cでー晚反応させた。反応後にプロティナーゼ Kを 0. 5 /i l添カ卩し、 3 7°Cで 1 0分間インキュベーションして酵素ミツクスを失活させた。この反応液 1 ^ 1をコンビテント細胞（ J M 1 0 9 ) にトランスフォーメーションし、 p DONR 2 0 1 /h j 0 2 5 3 7 # 1を得た。

次に p DONR 2 0 1 /h j 0 2 5 3 7 # 1を用い、 6 XH i s— t a gとの融合蛋白質として P r o t e i η— Xを発現するベクターを構築した。 L Rクロナーゼ反応バッファー 1 μ 1、 p DONR 2 0 1 /h j 0 2 5 3 7 # 1 ( 5 0 η g/ μ 1 ) 1 μ I 6 XH i s — t a g発現ベクター（p D E S T 1 7 ： 1 5 0 n g/μ 1 ) 0. 5 1、 TEバッファー 1. 5 z 1を氷上で混合し（合計 4 μ 1 )、 L Rクロナーゼ酵素ミックスを 1 1添加後、 2 5 °Cで 2時間反応させた。反応後にプロティナーゼ Kを 0. 5 ^ 1添加し、 3 7°Cで 1 0分間インキュベーシヨンして酵素ミックスを失活させた。この反応液 1 μ 1をコンビテント細胞（Β L 2 1 - S I ) にトランスフォーメーションし、 3クローン（p DE S T 1 7/ h j 0 2 5 3 7 # 9、 p D E S T 1 7Zh j 0 2 5 3 7 # 1 0、 p D E S T 1 7 Zh j 02 5 3 7 # l l) を得た。

上記 3クローンについて、 N a C 1による目的蛋白質の産生誘導の有無および可溶性蛋白質の調製について検討した。各大腸菌を、アンピシリンを含む L B培地（以下、 L B— Am pという）であって N a C l非添加（N a C 1—）のもの 2m 1で 3 7 °Cにてー晚振とう培養した。この前培養液を 3 0 0 μ 1添加した L Β— Am p (N a C l -)合計 3 πχ 1で 3 7 °Cにて 2時間振とう培養後、 5M N a C lを Ι 8 0 μ 1添加し（終濃度 0. 3 Μ)、さらに 3 7 °Cで 2時間振とう培養した。コントロールとして N a C 1の代わりに H₂0を 1 8 0 1添加して同様に培養した。その後、培養液を 1. 2 m 1ずつサンプリングしたものを 2本作製して遠心（4°Cにて 1 5, 000 r pmで 1 0分間）し、上清（以下、可溶性画分という）とペレツトとに分けた。該ぺレツトは 2 % SD S/2 OmM T r i s (p H 7. 4) または 2 OmM T r i s (p H 7. 4) 200 μ 1にけん濁後、超音波処理し、再度遠心（1 0°Cまたは 4°Cにて 1 5， O O O r pmで 1 0分間）した。この遠心上清（以下、不溶性画分ということもある）を 1 0% β 一メルカプトエタノーノレ (ME) を含む 2 X サンプルバッファー [2 % SD

5 / 50 mM T r i s (p H 6. 8 ) / 30 % グリセ口ール Z 0. 0 1% ブ口モフヱノールブルー（B P B)〕と等量ずつ混合し、 2分間煮沸後、 7. 5% ポリアタリルァミドゲルにて S D S—ポリアクリルァミドゲル電気泳動（S D S— PAGE) を行い、クマシ一ブリリアントブルー（CBB) 染色により蛋白質を検出した。また、上記可溶性画分についても同様に S D S— PAGEにより蛋白質の検出を行った。その結果、第 2図に示すように、ヒト P r o t e i n— Xと、

6 XH i s— t a gとの融合蛋白質と思われる約 6 5. 8 k D aのバンドが検出された。当該融合蛋白質は、上記培養された大腸菌の可溶性画分には少なく（第 3図）、不溶性画分に多量に存在すると考えられた。

P r o t e i n— Xと 6 XH i s— t a gとの融合蛋白質の可溶性画分での発現を検討するため、上記大腸菌の培養を 25 °Cで行った。各大腸菌を LB— Am p (N a C 1 -) 2m 1で 25°Cにてー晚振とう培養した。この前培養液を 20 0 μ 1添加した LB— Amp (Na C I—）合計 2. 2 m Iで 25 °Cにて 4時間振とう培養後、 5M Na C lを 1 32 1添加し（終濃度 0. 3 M)、さらに 2 5 °Cで 2時間振とう培養した。コントロールとして、 & 1の代ゎりに；《₂0 を 1 32 μ 1添加して同様に培養した。その後、培養液を 1 m 1ずつサンプリングしたものを 2本調製して遠心し（4°Cにて 1 5， 000 r p mで 10分間）、上清とペレットとに分けた。ペレットを 2% SD S/2 OmM T r i s (p H 7. 4) および 2 OmM T r i s (p H 7. 4) 200 /^ 1にけん濁し、超音波処理後に再度遠心（1 0°Cまたは 4°Cにて 1 5， 000 r 111で1 0分間）した。遠心上清を 1 0% —MEを含む 2 X サンプルバッファーと等量ずつ混合し、 2分間煮沸後、 7. 5 % ポリアクリルアミドゲルにて S DS-PAGE を行い、上記同様に融合蛋白質を検出した。第 4図に示すように、 25°Cにおける培養では、 P r o t e i n— Xと 6 XH i s— t a gとの融合蛋白質は可溶性画分にも発現された。

上記のようにクローン h j 025 37を基にして得られたヒト P r 0 t e i n 一 Xは、配列表の配列番号 1に記載したように 5 76残基のァミノ酸からなり、そのアミノ酸配列の第 1 39番目 I 1 eから第 2 1 9番目01 に？0∑ドメィン、第 23 1番目 Me tから第 296番目 Ar gに SH3 ドメイン、第 404番目 Th rから第 500番目 A s nに GKドメインを有していた。実施例 3

(新規 P SD (P r o t e i n— X) の NMDA受容体 /2 Bサブュニットへの結合）

P r o t e i n— Xの NMD A受容体ノ 2 Bサブュ-ットへの結合作用を、ォ一パーレイ（Ov e r l a y) 法により検討した。

まず、 P r o t e i n— Xと 6 XH i s _ t a gとの融合蛋白質を発現する大腸菌（pDE ST l Zh j 025 3 7 # 1 1) を LB— Amp (N a C 1—） 2 m 1で 25 °Cにてー晚培養した。この前培養液を 200 /^ 1添加した L B— A mp (N a C I—）合計 2. 2 m 1で 25 °Cにて 4時間本培養後、 5M N a C 1を 1 32 μ 1添加（終濃度 0. 3Μ) し、さらに 25°Cで 2時間培養して、 P r o t e i n— Xの産生を誘導した。培養後に大腸菌を集菌して、抽出バッファ一〔 1 % T r i t o n X/ 1 0 mM T r i s (pH 7. 5) Zl 50 mM N a C 1 / 1 mM PMS F (フエニルメチルスルホニルフルオリド）〕を 200 μ 1添加し、超音波処理後に、氷上で 20分間インキュベーション後、遠心（4°C にて 1 5 , 000 r p mで 1 0分間）した。遠心上清を回収し、 P r o t e i n 一 Xを含む試料として用いた。また、遠心上清の一部を用い、実施例 2に記載したのと同様に SD S— PAGEを行って、 P r o t e i n— Xの発現と発現量をウェスタンプロッティング法により確認し（第 5図）、用いる試料の量を決定した。ウェスタンブロッテイングは以下のように行った。まず、泳動後に、湿潤化（w e t t i n g ) 処した P V D F ( t r a n f e r m e n b r a n e ) にセミドライ法で転写し（1 0 0111 で1時間）、 5 % スキムミルク ZTB S— Tで室温にて 1時間ブロッキングした。その後、マウス抗 H i s抗体（Am e r s h a m p h a r m a c i a b i o t e c h社) を 5⁰/o スキムミノレク Τ B S— Τで 1 0 0 0倍希釈して添加し、室温にて 1時間反応させた。反応後、該転写膜を T B S _ Τを用いて室温で 1 0分間洗浄し、該洗浄を 3回行った後に、二次抗体〔抗マウス I g G抗体一ホースラデイシュパーォキシダーゼ（HR P) (C e l l s i g n a 1 i n g社）〕を 5 % スキムミルク ΖΤ B S _ Tで 3 0 0 0倍希釈して添加し、室温にて 1時間反応させ、その後 T B S— Τによる 1 0 分間洗浄を室温で 3回行った。その後、 E C Lキットおよびハイパーフィルム（Η y p e r f i l m) を用いてシグナルを検出した。 .

ネガティブコントロールとして用いるために、 NMD A受容体 /2 Bサブュニットとの結合領域である PD Z ドメインを欠失させた変異体（mu t a n t ) を発現する大腸菌 p D E S T 1 7Zh j P D Z (—） # 2を後述するように作製し、 L B-Am p (N a C l—） 2 m 1で 3 7 °Cにてー晚培養した。この前培養液を 2 ◦ 0 i 1添加した L B— Am p (N a C l—）合計 2. 2 m lで 3 7°Cにて 4 時間本培養後、 H ₂ Oを 1 3 2 μ 1添加し、さらに 3 7 で 2時間培養して、 Ρ r o t e i n— X変異体の産生を誘導した。培養後大腸菌を集菌して、上記同様に処理して P r o t e i n— X変異体を含む試料を調製した。また、上記同様にその発現と発現量を確認した（第 5図）。

G S Tと NMDA受容体 Z2 Bサブユニットとの融合蛋白質（以下、 G S T— NMDA受容体 Z2 Bサブュニットとレ、うこともある）を発現する大腸菌 p DE S T 1 5/NMDA r e c e p t o r # 5を後述するように作製し、 L B— Am P (N a C l -) 2 m 1で 3 7°Cにてー晚培養した。この前培養液を 3 0 0 1 添加した L B— Amp (N a C l -) 合計 3 m 1で 3 7 °Cにて 4時間本培養後、 TJP02/12102

55

5M N a C lを 1 80 μ 1添加し（終濃度 0. 3 Μ)、さらに 37 °Cで 2時間培養して、 G S Tと NMD A受容体 Z 2 Bサブユエットとの融合蛋白質の産生を誘導した。コントロールとして Na C 1の代わりに H₂Oを添加して同様に培養した。培養後に大腸菌を集菌して、 2% S D S/2 OmM T r i s (pH 7. 5) を 200 μ I添加して超音波処理した後に遠心（1 0°Cにて 1 5， 000 r pmで 1 0分間）した。遠心上清を回収し、 NMDA受容体 Z2 Bサブユニットを含む試料として用いた。また、目的とする蛋白質の発現と発現量を確認するために、遠心上清の一部を採り、 2% SD S/2 OmM T r i s (pH7. 5) で X I倍、 X 1Z2倍希釈した。希釈した各遠心上清と 1 0%3— MEを含む 3 X サンプルバッファー（NEB社）を 2 ： 1の割合で混合し、 2分間煮沸後に 5 %_ 20 %のポリアクリルアミドゲルで泳動した。泳動後、湿潤化処理した P VD F転写膜〔P o l y s c r e e n (NEN社）〕に転写し（液槽、 300m Aで 1. 5時間）、 5%スキムミルク ZTB S— T (TB S— T： 1 OmM T r i s (p H 7. 5) / 1 50 mM Na C l /O. 05% Tw e e n 20) で室温にて 1時間ブロッキングした。その後、ャギ抗 GST抗体（Ame r s h a m p h a r ma c i a b i o t e c h社）を 5% スキムミルク /TB S— Tで 1000倍希釈して添加し、室温で 1時間反応させた。反応後に、該転写膜を TB S— Τを用いて室温にて 1 0分間洗浄し、該洗浄を 3回行った後に、二次抗体（抗ャギ I g G抗体一 HR Ρ) ( S a n t a c r u z b i o t e c h n o l o g y社）を 5% スキムミルク/ TB S— Tで 2000倍希釈して添加し、室温にて 1時間反応させ、その後 T B S— Τによる 1 0分間洗浄を室温で 3回行つた。その後 E C Lキットおよびハイパーフィルム（Am e r s h am p h a r ma c i a b i o t e c h社）を用いてシグナルを検出した（第 6図）。また、ネガティブコントロールとして用いるため、 GSTのみを発現する大腸 ¾ D H 5 a (Am e r s h am p h a rma c i a b i o t e c h社の p G EX—4T— 3由来）を LB— Amp 8 m 1で 37 °Cにてー晚培養した。この前培養液を 2m 1添加した LB— Amp合計 22 m 1で、 OD 600が 1. 0前 PC寶議 ₁₀₂

56

後となるまで 37°Cにて 1. 5時間本培養した後に、 500mM I PTG (ィソプロピル 1一チォー j3— D—ガラクトシド）を 42 μ 1添加（終濃度 I mM) し、さらに 3 7°Cで 2時間培養した。培養後 1. 5m 1ずつサンプリングして集菌した。この大腸菌に上記同様の処理を行い、得られた遠心上清を試料として用いた。また、目的とする蛋白質の発現と発現量を確認するために、遠心上清の一部を採り、 2% S D S/2 OmM T r i s (p H 7. 5) で X 1/40、 X 1/8 0、 X 1 Z 1 60、 X 1 Z 3 20、 X 1 Z 640、 X 1 Z 1 28 0倍に希釈した。希釈した各遠心上清を用いて、上記同様に GSTの発現を確認した（第 7図）。

次に、オーバーレイ法により P r o t e i n— Xと NMD A受容体 / 2 Bサブュニットとの結合について検討した。上記調製した G S T— NMDA受容体 Z2 Bサブユニット（Na C 1により誘導したものと未誘導のもの）または GSTを含む試料は、発現量を上記のようにウェスタンプロッティングで確認した結果（第 6図および第 7図）に基づいて、 GST— NMDA受容体/2 Bサブュ-ット（誘導、未誘導）を含む試料は原液を、 GSTを含む試料は 2% SD S/2 OmM T r i s (p H 7. 5) で 640倍希釈したものを用いた。各試料と 1 0% β — MEを含む上記 3 X サンプルバッファー（NEB製）を 2 ： 1の割合で混合して 2分間煮沸後、 5%— 20%のポリアクリルアミドゲルにて電気泳動を行つた。泳動後、湿潤化処理した PVD F転写膜に転写（液槽、 300mAで 1. 5 時間）し、 5% スキムミルク ZTB S— Tで室温にて 2時間ブロッキングした。次いで、上記調製した P r o t e i n— Xを含む試料 20 μ 1 と抽出バッファ一 40 μ 1、または上記調製した P r o t e i n— X変異体を含む試料 60 μ 1 にそれぞれ ImM PMS F/TB S— Tを 3m 1添加して混合した。コント口ールとして、抽出バッファー 60 μ 1に 1 mM PMS FZTB S— Tを 3m l 添加して混合したものを用いた。各混合物を用いて、上記各転写膜に 4°Cで 2時間反応させて結合させた。その後、 TB S—Tによる 5分間の洗浄を室温にて 3 回行い、再度 5% スキムミルク/ TB S—Tで室温にて 1時間ブロッキングし PC謂 2/12102

57

た。ブロッキング後、マウス抗 H i s抗体 (Am e r s h am p h a r ma c i a b i o t e c h社）を 5% スキムミルク/ T B S— Tで 1 000倍希釈して添加し、室温にて 1時間反応させた。反応後に、転写膜を TB S— Τを用いて室温にて 1 0分間洗浄し、該洗浄を 3回行った後、二次抗体（抗マウス I g G 抗体一 HRP) (C e l l s i g n a 1 i n g社）を 5 % スキムミルク ZTB S— Τで 3000倍希釈して添加し、室温にて 1時間反応させ、 TB S— Τによる 1 0分間の洗浄を室温で 3回行った。その後 ECLキットおょぴハイパーフィルムを用いてシグナルを検出した。

その結果、 P r o t e i n— Xを結合させた転写膜において、全長 GST— N MDA受容体 Z2 Bサブユニットのバンドの位置（ 1 89. 2 kD a) にシグナルが検出されたことから、 P r o t e i n— Xと NMD A受容体ノ 2 Bサブュ- ットとの結合が認められた。コントロールおよび P r o t e i n— X変異体を用いたときにはシグナルは検出されず、すなわち結合は確認されなかった（第 8図）。また G S Tに対する結合を検討した転写膜ではいずれもバンドは検出されず、 G S Tに対する結合は確認されなかった（第 9図）。これらのこと力、ら、 P r o t e i n— Xはその PDZドメインで NMD A受容体 / 2 Bサブュニットと結合していることが示唆された。また、 NMD A受容体 / 2 Bサブユニットは分解しやすい蛋白質であることが第 6図から示唆されたが、上記実験の結果から全長 NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットのバンドの位置でのみシグナルが検出されたこと (第 8図）、並びに GSTが N末に位置しているということから、 P r o t e i n 一 Xとの結合領域は NMD A受容体 / 2 Bサブュニットの C末端であることが予想され、これは文献情報と一致していた〔ナガノ（Na g a n o, T.) ら、「ジャーナノレォブノィオケミストリー、 J o u r n a l o f B i o c h e m i s t r y)」、 1 9 98年、第 1 24卷、 p. 86 9— 875〕。 PDZ ドメインを持つ蛋白質は標的蛋白質の C末端 3残基のアミノ酸がセリン（S e r) あるいはトレオニン（Th r)、その次は他のアミノ酸、その次がパリン（Va I ) (S XVまたは TXV) の配列（t SXVモチーフ）を認識する。本実施例で用いた NMD A受容体 / 2 Bサブュ-ットの C末端アミノ酸配列は S DVであった。 (新規 P S D (P r o t e i n _X) 変異体の調製）

P r o t e i n— Xから NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットとの結合領域である P D Z ドメインを欠失させた変異体の調製は、下記のように行った。

まず、クローン h j 0 2 5 3 7の塩基配列に基づいて、下記プライマーを設計して合成した。マー >

P r -D p d z - F l (配列番号 9 )：

CAG CAAAGAGGAGACAC CAT CAAA- 3' つぎに、クローン h j 0 2 5 3 7を鎳型としてアドバンテージ 2 P CRキットを用いて P C Rを行った。 1 0 X アドバンテージ 2 P CRバッファー 2 1、 P r -D p d z - F l (5 8. 6 4 p m o I / β 1 ) 0. 2 μ 1 , P r — H J r ( 3 8. 5 9 p m o \ / μ 1 ) 0. 3 μ 1、クローン h j 0 2 5 3 7 ( 1 n g μ 1 ) 1 μ 1、 1. 2 5 mM d NT Pミックス 1. 6 μ 1、 5 0 X ポリメラーゼミックス 0. 4 / l、 H₂0 1 4. 5 ^ 1を混合し（合計 2 ϋ μ 1 )、実施例 1に記載の条件で P C R反応を行った。

その後、 P CR産物 1 6 μ 1を T Eバッファーで 5 0 μ 1 とし、 3 0 % Ρ Ε G 8 0 0 0/ 3 0 mM M g C 1 ₂を 2 5 ^ 1添加して、室温で遠心（1 5， 0 O O r p mで 1 0分間）した後に、ペレットを 7 0 %エタノールで洗浄して乾燥し、 T Eバッファー 3 0 μ 1に溶解した。その後、 Β Ρクロナーゼ反応バッファ一 1 μ 1、 P CR産物 1 1、エントリ一ベクター（p DONR 2 0 1 : 1 5 0 n gZ 1 ) 0. 5 μ し Τ Εバッファー 1. 5 μ 1 を氷上で混合（合計、 4 μ 1 ) し、 Β Ρクロナーゼ酵素ミックスを 1 μ 1添加後、 2 5°Cにて 2. 7時間反応させた。反応後、プロティナーゼ Kを 0. 5 1添加して 3 7°Cにて 1 0分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液 1； u 1 をコンビテント細胞（DH 5 a) にトランスフォーメーションし、 p D〇NR 2 1 0Zh j P D Z (-) # 2を得た。

続いて、 p DONR 2 1 0/h j P D Z (—） # 2を用レヽ、 P D Z ドメインを欠失させた P r o t e i n— X変異体と 6 XH i s - t a gとの融合蛋白質を発現するベクターを構築した。 L Rクロナーゼ反応バッファー 1 1 、 p DONR 2 0 1 /h j PD Z (-) # 2 ( 5 0 n g 1 ) 1 1 、 6 XH i s - t a g 発現ベクター（p D E S T 1 7 : 1 5 0 n gノ^ 1 ) 0. 5 _μ 1 、 ΤΕバッファ一 1. 5 μ 1を氷上で混合し（合計 4 μ 1 )、 L Rクロナーゼ酵素ミックスを 1 μ 1添加後 2 5°Cで 0. 5時間反応させた。反応後にプロティナーゼ Kを 0. 5 μ 1添加し、 3 7°Cで 1 0分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液 1 β 1をコンビテント細胞（B L 2 1 — S I ) にトランスフォーメーシヨンし、 3クローン [p D E S T l 7 / h j P D Z (_) # 1、 p D E S T 1 7 h j P D Z (— ) # 2、 p D E S T 1 7Z h j P D Z (—） # 3〕を得た。

上記 3クローンについて、 N a C 1による目的蛋白質の産生誘導の有無おょぴ可溶性蛋白質の調製について検討した。各大腸菌を L B— Amp (N a C l —） 2 m 1で 3 7 °Cにてー晚振とう培養した。この前培養液を 3 0 0 1添加した L B— Am p (N a C 1 -)合計 3. 3 m 1で 3 7 °Cにて 2時間振とう培養した後、 5M N a C 1を 1 8 0 μ 1添加（終濃度 0. 3 Μ) し、さらに 3 7°Cにて 2時間振とう培養した。コントロールとして H₂0を 1 8 0 μ 1添加して同様に培養した。その後、培養液を 1. 5 m 1ずつサンプリングしたものを 2本調製して遠心（4°Cにて 1 5， 0 0 0 r p mで 1 0分間）し、ペレットを 2 % S D S/2 0 mM T r i s (p H 7. 4) および 2 0 mM T r i s (p H 7. 4) 1 5 0 ix 1にけん濁して、超音波処理後に再度遠心（1 0°Cまたは 4°Cにて 1 5 , 0 O O r p mで 1 0分間）した。遠心上清を 1 0 % ]3— MEを含む 2 X サンプルバッファーと等量ずつ混合し、 2分間煮沸後に 5 %— 2 0 %ポリアクリルァミドゲルにて SDS— PAGEを行い、実施例 2と同様に目的蛋白質の検出を行つた。その結果、第 1 0図に示すように、ヒト P r o t e i n_X変異体蛋白質と 6 XH i s - t a gとの融合蛋白質と思われる約 4 1. 7 k D aのバンドが検出された。当該融合蛋白質は、上記培養された大腸菌の可溶性画分にも不溶性画分にも認められた。さらに、培養を 25°Cで行ったときにも可溶性画分にその発現が認められた（第 1 1図）。

(NMDA受容体 Z2 Bサブュニットの調製）

NMD A受容体 2 Bサブユニットの調製は、その一部を含むクローン f j 0 7108 (かずさ DNA研究所）を用いて、下記のように行った。クローン f j 071 08は N末側 347アミノ酸残基が欠けていたため、まずこの領域を、ヒト脳由来 mRN Aを铸型として、 RT— PCRによりサブクローニングした。ヒト脳由来 mRNAをスーパースクリプト Πでオリゴ（dT) プライマーおよびランダムプライマーを用いて逆転写した c DNAを錶型として、開始コドン上流および組換えを勘案してクローン f j 0 7 1 08の第 3 5 2番目の A f 1 Π部位下流の塩基配列に基づいて P CR用プライマー〔下記 P r一 NMDAR 2 B f 、 P r -NMDAR 2 B (R V)〕を設計し、ァドバンテージ 2 P CRキットを使用して、実施例 1と同様に P CRを行った。その後、卩〇1 産物を81：1^キット (Ta Ka R a社）を用いて平滑末端化およびリン酸化処理し、 p B l u e s c r i p t (SK— ) (Sma I消化）に導入後、 p B S (SK— ) /NMD A r― N# 1 0、 p B S (SK— ) /NMD A r _N# 25を得た。塩基配列の確認を行ったところ、 p B S (SK— ) /NMDA r— N# 1 0は P CRによる変異が 2個所存在していたがアミノ酸置換には至らなかった。しかし、塩基配列中第 1 44 b p 目のグァニン（G) が 1 b p欠失していたため、 p B S (SK— ) /N MDAr— N# 25を用い、その領域の下流に存在する S m a I部位および p B l u e s c r i p t ( S K _) の B a mH I部位を利用して組み換えを行い、新たに p B S (SK—）ノ NMDA r—N# 3を得た。その塩基配列を確認したところ、 G e n B a n kに登録されている NMDA受容体 /2 Bサブユニット（ァクセッション番号： NM— 0 0 0 8 4 3) と一致した。

<プライマー >

P r -NMD AR 2 B f (配列番号 1 0 ) ：

5' -TTTGG C TT C TACAAAC CAAGGGAG- 3'

P r -NMD AR 2 B (R V) (配列番号 1 1 ) :

5' -T C CAAT CATAC CATT C CAGGTT C CA- 3' その後、クローン f j 0 7 1 0 8のマルチクローニングサイト（MC S) ( p B 1 u e s c r i p t ) を X h o I消化後、ブランティングキット（B 1 u n t i n g k i t ) (T a K a R a社）を用いて平滑末端処理し、 A f 1 Π消化した。次に、 p B S (S K—） ZNMD A r _N# 3の MC Sを X b a I消化して平滑末端処理後に A f 1 Π消化した約 1. 5 k b ρ断片を、上記 A f 1 Π消化したクローン f j 0 7 1 0 8に導入して p B S/NMD A r # 2を得た。 p B S/NM DA r # 2は全長 NMD A受容体 /2 Bサブュニットを含有するベクターである _c 上記 p B S/NMD A r # 2を鎵型としてアドバンテージ HF 2 P C Rキット（C 1 o n t e c h社）を用い、目的遺伝子の蛋白質翻訳領域の増幅を行つた。プライマーは N M D A受容体 Z 2 Bサブュニットの全長塩基配列から設計し、合成した。 1 0 X 了ドバンテージ HF 2 P CRバッファー 2. 5 μ 1 、 P r - 2 B f ( 5 2. 9 4 p m o \ / μ 1 ) 0. 4 // 1、 P r — 2 B r ( 3 7. 44 p m o \ / 1 ) 0. 6 μ 1、 p B S/NMDA r # 2 (0. 4 8 μ g / μ 1 ) 0. 2 μ 1 d NT Pミックス 2. 5 ^ 1、 5 0 X ポリメラーゼミックス 0. 5 μ 1 、 Η₂0 1 8. 3 μ 1を混合（合計 2 5 μ I ) し、 P C Rを行つた。

(以下余白） 2

62

マー〉

P r - 2 B f (配列番号 1 2) :

5 - C TT A

ATGAAGCCCAGAGCGGAG一 3

P r— 2 B r (配列番号 1 3) :

5' -GGGG AC

CTGTTCCCTCACTCAGAC一 3

< P CR運転条件〉

目 ijステップ ( r e ) 95°C 1分間

ステップ 1 9 5°C 30秒間

2 58°C 30秒間

3 72°C 5分間

〜 3

ステップ 4 95 °C 30秒間

ステップ 5 68°C 5分間

(ステップ 4〜5を 2◦サイクル）

後ステップ (p o s t) 68°C 5分間次に PC R産物を電気泳動（1% ァガロースゲル）して目的遺伝子の約 4. 5 k b pバンドを分離し、 G e n e l u t e E t B r m i n u s s p i n c o l umn (S I GMA社）で抽出、精製、乾燥後、 TEバッファー 1 0 μ 1に溶解した。続いて TEバッファーで 1 00 μ 1 とし、 30% PEG 80 00/30 mM M g C 1 ₂を 5 0 1添加し、室温で遠心（1 5, 000 r p mで 1 0分間）後、ペレットを 70%エタノールで洗浄して乾燥し、 TEバッファー 20 i 1に溶解した。その後 B Pクロナーゼ反応バッファー 1 /_ί 1、 PCR 産物 1 1、エントリ一ベクター（pDONR 20 1 ： 1 50 n g/,u 1 ) 0. JP02/12102

63

5 μ 1、 TEバッファー 1. 5 μ 1を氷上で混合し（合計 4 μ 1 )、 Β Ρクロナ一ゼ酵素ミックスを 1 1添加後、 25°Cにて 1. 7時間反応させた。反応後、プロティナーゼ Kを 0. 5 μ 1添加し、 3 7°Cにて 1 0分間インキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液 1 μ 1をコンビテント細胞（DH 5 α) にトランスフォーメーションし、 p DONR 201 /NMD A r e c e p t o r # 1を得た。

p DONR 210/NMD A r e c e p t o r # lの塩基酉 S列を確認したところ、 PCRによるエラーと思われる変異が数箇所存在しており、アミノ酸置換を伴う変異も存在していた。そこで、 PDONR 2 1 0/NMD A r e c e p t o r # 1を Mf e Iおよび A a t Πで消化して変異領域を除き、 p B S/NMDA r # 2を Mf e Iおよび Aa t Π消化した約 3. 4 k b p断片を導入して、 pD ONR 21 0/NMD A r e c e p t o r # 2を得た。クローン f j 0 7 1 08 由来の蛋白質翻訳領域には、 G e n B a n kにァクセッション番号 NM一 000 843として登録されている NMD A受容体 2 Bサブュニットのものと異なる塩基配列が 2箇所〔開始コドンより第 26 64 b p番目の塩基（C→T ； Th r →T h r ) および第 3499 b p目の塩基（A→G； I 1 e→V a 1)〕存在していたため、ヒト脳由来 mRNAを用いて、下記のプライマー P r— R 2 B— 5と P r -NMD A r一 R 8、 P r—R 2 B— 7と P r -NMD A r— R 1 2のプライマ一の組み合わせを使用して RT— PCRによりサブクローニングを行った後に、 p B S/NMDA r # 2の塩基配列を確認した。その結果、ヒト脳由来 mR NAから RT— P CRでサブクローニングして得られた塩基配列が、クローン f j 07 1 08と一致することが確認された。

(以下余白）マー〉

P r— R 2 B— 5 (配列番号 1 4) :

P r— NMDA r— R 8 (配列番号 1 5 ) ：

5' -GTCACAGTCGTAGAGCCCTA- 3'

P r— R 2 B— 7 (配列番号 1 6) :

5' -AGTTCCGAACAAAGGAGAACTCAC- 3'

P r— NMD A r— R 1 2 (配列番号 1 7) :

5 ' 一 GAGTTCTGAC C CGTCACCGTCGTGG— 3, 次に、 NMDA受容体 /2 Bサブュニットと G STとの融合蛋白質を発現するベクターを構築した。 LRクロナーゼ反応バッファー 1 1、 p DONR 2 0 1 /NMD A r e c e p t o r # 2 ( 5 0 n g / μ 1 ) 1 μ 1、 G S T発現べクタ一（p DE S T 1 5 : 1 5 0 n g/ i l ) 0. 5 / l、 TEバッファー 1. 5 μ 1を氷上で混合し（合計 4 1 )、 L Rクロナーゼ酵素ミックスを 1 μ 1添; ¾口後、 2 5 °Cで 1時間反応させた。反応後、プロティナーゼ Kを 0. 5 ^ 1添加し、 3 7°Cで 1 0分間ィンキュベーションして酵素ミックスを失活させた。この反応液 1 μ 1 をコンビテント細胞（B L 2 1— S I ) にトランスフォーメーションし、 3クローン（p DE S T l 5/NMD A r e c e p t o r # 4、 p D E S T 1 5 /NMD A r e c e p t o r # 5、 p DE S T l 5/NMD A r e c e p t o r # 6) を得た。

上記 3クローンについて N a C 1による目的蛋白質の産生誘導について検討した。各大腸菌を LB— Amp (N a C 1 -) 2 m 1で 3 7 °Cにて一晚振とう培養した。この前培養液を 3 0 0 μ 1添加した LB— Amp (N a C l _) 合計 3 m 1を 3 7 で 4時間振とう培養後、 5M N a C lを 1 8 0 1添加（終濃度 0. 3M) し、さらに 3 7°Cで 2時間振とう培養した。コントロールとして H₂0を 1 8 0 μ 1添加して同様に培養した。その後、培養液を遠心し（4°〇にて1 5， 0212102

65

000 r p mで 1 0分間）、ペレットを 2 % S D S / 20 mM T r i s (p H 7. 4) 200 ^ 1にけん濁して、超音波処理を行い、その後遠心（1 0°Cにて 1 5, O O O r pmで 10分間）した。遠心上清を 1 0% j3— MEを含む 2 X サンプルパッファーと等量ずつ混合し、 2分間煮沸後に 5 %— 20 %ポリアクリノレアミドゲルにて SD S— PAGEを行い、抗 GST抗体を用いて上記同様に目的蛋白質の検出を行った。その結果、第 1 2図に示すように、 NMDA受容体 Z 2 Bサブュニットと GSTとの融合蛋白質と思われる約 1 8 9. 2 k D aのバンドが検出された。実施例 4

(新規 P SD (P r o t e i n -X) の NMD A受容体における機能解析） P r o t e i n— Xを NMD A受容体と共にアフリカッメガエル卵母細胞で共発現させ、 NMDA受容体に対するリガンド刺激による電流応答を測定し、 NM D A受容体シグナルへの P r o t e i n— Xの作用を検討した。

本検討に、下記プラスミドを用いた。

<新規卩 S D遺伝子（P r o t e i n— X遺伝子）を含むプラスミド DNA〉ヒト幼若化骨髄細胞株 ( i mm a t u r e my e l o i d c e l l 1 i n e ) KG- 1から文献〔ノムラ（Nomu r a, Ν·) ら、「ディーェヌエーリサーチ（DNA R e s e a r c h)」、 1 994年、第 1卷、 p. 27— 35〕に記載の方法で調製された c DNAライプラリーより、実施例 1で抽出したクローン h j 025 3 7に相当するものを選択して使用した（第 1 3図）。当該クローンの配列に関する情報は、これまで開示されていない。

く NMDA受容体 Z2 Bサブュニット遺伝子を含むプラスミド DNA>

実施例 3で調製した p B S/NMDA rを用いた（第 1 4図）。

く NMDA受容体 I遺伝子を含むプラスミド DNA>

ヒト脳由来 mRNAをスーパースクリプト Πでオリゴ（dT) プライマーおよびランダムプライマーを用いて逆転写した c DNAを錄型として、 NMDA受容体 Iの塩基配列に基づいて P CR用プライマーを設計して合成し、ァドバンテージ 2 P CRキットを使用して、実施例 1 と同様に PC Rを行った。その後、得られた P CR産物を用いて、 p GEM— T E a s y Ve c t o r s y s t em s (P r ome g a社）を使用して T Aクローニングを行い、 p GEM— T E a s yベクターを得た（第 1 5図）。当該ベクターは、 E c o R Iの 2 b p (C C) 下流から S p e lの 2 b p (GG) 上流の間に、 NMD A受容体 Iの翻訳領域 2658 b pを保持する。

< P S D- 9 5遺伝子を含むプラスミド DNA>

上記同様にヒト脳由来 mRNAから調製した c DNAを錶型として、 P S D— 9 5遺伝子の塩基配列に基づいて PCR用プライマーを設計して合成し、アドバンテージ 2 PCRキットを使用して、実施例 1と同様に P CRを行った。その後、得られた P CR産物を用いて、 p GEM— T E a s y V e c t o r s y s t em s ( P r o m e g a社）を使用して T Aクローニングを行い、 p GE M— T Ε a s yベクターを得た (第 1 6図）。当該ベクターは、 S p e Iの 3 b p (GAG) 下流から E c o R Iの 4 b p (TTCC) 上流の間に、 P SD— 9 5の翻訳領域 26 5 7 b pを保持する。

まず、 NMDA受容体 I遺伝子を含むプラスミド DNAを S a 1 Iで、その他の遺伝子を含むプラスミド DNAを No t Iでそれぞれ処理して直線化し、フエノール/クロ口ホルム精製を行った。得られた DNAを铸型として用い、 MEG A s c r i p tキット（Amb i o n社）を使用して製品指示書に従って、 RN A合成反応を行った。このとき、 RNAポリメラーゼとして、 30— 9 ⁵遺伝子については S P 6を、それ以外の遺伝子については T 7を使用した。 RNA合成反応終了後、 DNAa s e処理によって铸型 DNAを除去した。 RNA合成反応産物を 1% ァガロースゲル電気泳動にて確認後、フエノール/クロ口ホルム精製を行った。精製後の合成 RNAは滅菌水に溶解し、全ての RNA濃度が 1 μ g/μ Lになるよう調製した。 RNA濃度は吸光度法により求めた。

アフリカッメガエルは志木家田化学株式会社から購入し、数週間の肥育後、卵母細胞を摘出した。卵母細胞はコラゲナーゼで処理した後に一晩培養し、上記調製した NMD A受容体の RN Aを自体公知の方法でマクロインジェクションした。このとき、 NMDA受容体 /2 Bサブュ-ットの RNAと NMDA受容体 Iの R NAとを 1 ： 2の割合で混合して細胞当たり 2 O n gとなるように調製したものを用いた。インジェクション後の卵母細胞は、培地中（1 1 5mM N a C l、 2. 5 mM KC 1、 1. 8 mM B a C l ₂、 1 0 mM HEPE S, p H 7. 2) で 20°Cにて 48時間インキュベーションした。

P r o t e i n— Xまたは P SD— 9 5を NMD A受容体と共発現させるときには、 NMD A受容体の RN Aを上記同様にインジェクション後、 24時間目に P r o t e i n— Xの RNAまたは P SD— 9 5の RNAを 1細胞あたり 1 0 n _g再インジェクションした。その後、培地中で 20°Cにて 24時間インキュベーションした。

卵母細胞で発現させた NMD A受容体にリガンドを作用させ、その結果 NMD A受容体イオンチャネルが開口して起きる陽イオン流入を、電気生理学的計測法により電流の変化として測定した。ここでは、二電極膜電位固定法により、参考論文（「フエブス'レター（FEB S L e t t e r) 1 999年、第 45 8卷、 p. 295 - 298) に従って計測を実施した。計測用のバッファーには B Aパッファー（N a C l 1 1 5mM, KC 1 2. 5 mM, B a C 1₂ 1. 8 m M，および HE PE S 1 0mM， pH7. 2) を用い、膜電位は一 70 mVに固定した。

リガンドとして L一グルタミン酸（G l u) とグリシン（G l y) の混合液を用い、卵母細胞に直接滴下して NMD A受容体に作用させた。なお、電流の大きさを定量化するときは、リガンド刺激後の内向き電流の最大値から刺激前のリ一ク電流の平均値を減算した値を用いた（以下、電流変化量という）。電流応答の測定は実験毎に 5〜 6個の細胞を用いて行った。同一実験において、各細胞間で電流応答の結果生じる波形のパターンに大きな差異は認められなかった。

まず、 NMD A受容体 RNAをインジヱクシヨンした卵母細胞に、リガンドを異なる濃度（1 0 G 1 u+ 1 0 μΜ G l y、 1 0 0 μΜ G l u+ 1 0 μΜ G l y、または Ι Ο Ο Ο μΜ G l u+ Ι Ο μΜ G l y) で作用させてリガンドの濃度依存性を確認し、構築した実験系が NMD A受容体シグナルの測定に妥当であることを検証した。なお、本実験ではリガンド溶液を添加した後、洗浄による除去を行わなかったため、特に高濃度刺激の場合では波形パターンが参考文献（「フエブス ' レター（FEB S L e t t e r )」、 1 9 9 9年、第 4 5 8卷、 p . 2 9 5 - 2 9 8) とは異なり、内向き電流が一過性になりにくかった。これはリガンドと受容体が結合し続けているので、 NMD A受容体チャネルが開口したままになり、その結果陽イオン流入が続いているためと考えられる。

次に、リガンドとして 1 0 0 0 0 1 11と 1 0 ^1 G l yとの混合液を用い、 P r o t e i n— XのRNAまたはP S D— 9 5の RN Aと NMD A受容体の RN Aとを共にィンジェクションした卵母細胞における電流応答を測定した。その結果を第 1 7図および表 1に示す。 P r o t e i n— Xまたは P S D_ 9 5 を NMD A受容体と共発現させることにより、 NMD A受容体単独のときと比較して、リガンド刺激に対する電流応答が大きくなる傾向が認められた。また、 P r o t e i n—Xを発現させたときには、 P SD— 9 5を発現させたときと比較して約 1. 5倍の電流応答が得られた。

(以下余白）

電流変化量（μ Α)

NMD A-R NMD A-R NMD A-R

P S D— 9 5 P r o t e i n - X

# 1 0. 1 7 0. 5 0 0. 6 0

# 2 0. 0 7 0. 2 7 0. 8 1

# 3 0. 0 6 0. 3 2 0. 3 8

# 4 0. 1 3 0. 3 1 0. 5 7

# 5 0. 2 3 0. 4 8 0. 4 1

# 6 0. 5 4

平均 0. 1 3 0. 3 8 0. 5 5

標準偏差 0. 0 7 0. 1 1 0. 1 5 上記電気生理学的測定の結果から、 P r o t e i n— Xが、 NMD A受容体/ 2 B受容体と結合して器官（a p p a r a t u s ) を形成すること、および NM D A受容体刺激により発生するシグナル、例えば受容体イオンチャネルの開口とそれに伴う陽イオンの流入、およびその促進に関与していることが判明した。実施例 5

(P J 0 1 0 8 7遺伝子（P r o t e i n— Y遺伝子）の単離 .同定）本発明に係る遺伝子は、かずさ DNA研究所のヒト脳由来長鎖 c DNA解析情報（b i o i n f o r m a t i c s ) により、ラット P S D 9 5 /S AP 9 0— ァソシエーティッドプロテイン一 3 (S APA P— 3) と 9 6 %の相同性を有する遺伝子として抽出したクローン P J 0 1 0 8 7に基づいて、単離'同定した。まず、クローン P J 0 1 0 8 7を保持する p B l e s c r i p t S K + ベクターを、 DH aコンビテント細胞に遺伝子導入して増幅し、 N o ΐ I /S a 1 I切断によるインサートの長さが約 3. 7 k bであることを確認した。これを鎵型とし、下記プライマーを用いて、 PCRを行った。プライマーは、上記情報データベースから得られた p j 01 08 7の塩基配列に基づいて設計し合成した。 PCRはアドバンテージ 2 PCRキット（Ad v a n t a g e 2 PCR k i t) (C 1 o n t e c h社）を用いて、使用説明書に準じて実施した。

<プライマー >

フォワードプライマー（配列番号 1 8) ： TGAGGGGTTACCATGGC- 3'

リバースプライマー（配列番号 1 9) ：

TACGGGTGGAGAACCG- 3' その結果、 P J 0 1 08 7クローンの OR F全長を含む約 2 · 9 ¾: 13の？〇1 産物が得られた。この P CR産物を用い、ゲイトウエイシステム（ I n V i t r o g e n社）を使用して、エントリ一ベクター p DONR^TM20 1へのクローニングを行った。クローユングは、同システムの使用説明書に準じて実施した。 (P J 0 1 087遺伝子の発現）

得られたベクター中のインサート部分の全長（約 2. 9 k b) の塩基配列に間違いがないことを確認した。その後、大腸菌において N末端に H i s— t a gを付加した蛋白質として発現可能な発現ベクター p DE ST^TM1 7、および GS T 一 t a gを付加した蛋白質として発現可能な発現ベクター p DE ST^TMl 5への組み換えを行った。，組み換えは、ゲイトウエイシステム（ I n V i t r o g e n社）を用いて、使用説明書に準じて実施した。

P J 0 1 0 8 7を組み込んだ p DE S T^TM1 7または p DE ST^TMl 5を保持する大腸菌から、 P J 0 1 087クローン蛋白質の発現誘導を行った。アンピシリンを含む LB培地中で 3 7°Cにて、 OD 600が 0. 5〜1. 0になるまで振とうしながら前培養した。この前培養液 300 μ 1に、 Na C lを終濃度0. 3Μになるよう添加し〔N a C 1 ( + )〕、 3 7°Cで 4時間振とう培養して蛋白質発現を誘導した。コントロールとして Na C 1の代わりに H 2〇を添加して同様に培養した〔N a C 1 (—）〕。その後、各培養液を遠心処理して菌体を回収した。この菌体をリン酸緩衝生理食塩水（PB S) に懸濁し、 1 0秒間の超音波処理を 3回行い、再度遠心処理（ 1 0°Cまたは 4°Cにて 1 5， 000 r p で 1 0分間）して、上清（以下、可溶性画分という）とペレットに分けた。ペレットは PB S に再懸濁した（不溶性画分とよぶ）。

各画分について、 H i s— t a gおよび G S T- t a gに対する抗体を用いたウェスタンブロッテイング法で蛋白質の検出を行った。その結果、 H i s - t a gおよび GST— t a gのいずれを用いた検討においても、 N a C 1で発現誘導した大腸菌の不溶性画分に、約 1 1 5 kD aの目的蛋白質と、その他にその分解産物と思われる蛋白質の発現誘導が観察された（第 1 8図 Aおよび B)。無細胞蛋白質発現系の一つとして、大腸菌の蛋白質発現システムを応用したラビッドトランスレーシ aンシステム (R a p i d T r a n s l a t i o n S y s t em) RTS 5000 (R o c h e D i a g n o s t i c s社）を用いて蛋白質発現の検討を行ったが、目的蛋白質はやはり不溶性画分に見出された。

かくして得られたヒト蛋白質は、配列表の配列番号 3に記載したように 9 7 9 残基のアミノ酸からなる。また、該蛋白質をコードする遺伝子は、配列表の配列番号 6に記載したように 3 705塩基からなる。実施例 6

(P J 0 1 08 7遺伝子産物（P r o t e i n— Y遺伝子産物）の NMD Α受容体における機能解析）

P J 0 1 08 7遺伝子は SAP AP— 3と 96%の相同性を有する。 SAP A P— 3がラット P SD— 95/SAP 90関連蛋白質であることから、 P J 0 1 TJP02/12102

72

087遺伝子産物が、ヒト P SD— 95と複合体を形成すること、およびポストシナプス ·デンシティ一の構成に関与していることを予想した。 P SD— 9 5は NMD A受容体のシグナル伝達に関与することが報告されているため、 P J 0 1 087遺伝子と P S D— 9 5遺伝子を NMD A受容体遺伝子と共にアフリカッメガエル卵母細胞で共発現させ、 NMD A受容体に対するリガンド刺激による電流応答を測定し、 NMDA受容体シグナルへの P J 0 1 08 7蛋白質の作用を検討した。このとき、 P SD— 95と同様に PDZドメイン、 SH3 ドメイン、および GKドメインを有し、 NMD A受容体に結合してシグナル伝達に関わると推定される新規 P SD蛋白質（p r o t e i n_X) (配列表の配列番号 1) をコードする遺伝子（配列表の配列番号 4) を、 P SD— 9 5の代わりに用いて、同様に検討した。検討に用いた方法は、実施例 4に記載の方法と全く同様の方法を用いた。

本検討には、下記プラスミドを使用した。

< P J 0 1 08 7遺伝子を含むプラスミド DNA〉

ヒト幼若化骨髄細胞株 KG— 1から、文献〔ノムラ（Nomu r a, N.) ら、「ディーェヌエーリサーチ（DNA R e s e a r c h)」、 1 994年、第 1 卷、 p. 27 - 3 5) に記載の方法で調製された c DN Aライプラリーより、実施例 5で抽出したクローン P J 0 1 0 8 7に相当するものを選択して使用した (第 1 9図）。

く P r o t e i n— Xを含むプラスミド DNA>

実施例 4に記載のプラスミド DNAを用いた（第 1 3図）。

<NMD A受容体 Z2 Bサブュニット遺伝子を含むプラスミド DNA〉

実施例 3で調製したプラスミド p B SZNMDAr (第 14図）を用いた。く NMDA受容体 I遺伝子を含むプラスミド DNA>

実施例 4で調製したプラスミド DNAを用いた（第 1 5図）。

実施例 4で調製したプラスミド DN Aを用いた（第 1 6図） NMD A受容体シグナルに対する P r o t e i n— Xおよび P J 01 08 7蛋白質の作用は、実施例 4と同様の方法で試験した。

P J 01 08 7、 P SD— 95、および Zまたは p r o t e i n— Xを NMD

A受容体と共発現させるときには、 NMD A受容体の RNAを実施例 4と同様にアフリカッメガエル欄母細胞にインジェクション後、 24時間目に P J 0 1 08

7、 P SD— 9 5、および/または p r o t e i n— Xの RNAを 1細胞あたり

1 0 n g再インジェクションした。その後、培地中で 20°Cにて 24時間インキュべーションしに。卵母細胞で発現させた NMD A受容体にリガンドを作用させ、その結果 NMD A受容体イオンチャネルが開口して起きる陽イオン流入を、実施例 4に記載の方法と同様の方法で測定した。その結果を第 20図および第 21図に示す。実施例 4で示したように、 P SD—95または P r o t e i n—Xを NMD A受容体と共発現させることにより、 NMD A受容体単独のときと比較して、リガンド刺激に対する電流応答が大きくなることが認められた。また、 P J 0 1 08 7 (P r o t e i n— Y) と P S D— 95とを NMD A受容体と共発現させても、 P SD 一 9 5を発現させたときに観察された電流応答と比べて変化はなかった。一方、 P J 0 1 08 7 (P r o t e i n— Y) を P r o t e i n— Xと共発現させたときには、 P r o t e i n— Xを発現させたときの約 7倍〜約 8倍の電流応答が得られた。

上記電気生理学的測定の結果から、 P J 0 1 08 7は P r o t e i n— Xの共存下で、 NMD A受容体のシグナル伝達を著しく増幅することが分かった。このことから、 P J 0 1 087は、 PDZ ドメインを有しており NMDA受容体 Z2 Bサブュニットと結合する P r o t e i n— Xとの相互作用により、 NMDA受容体刺激によつて発生する細胞内シグナルを増幅すること、ひいては NMD A受容体イオンチャネルの開口とそれに伴う陽イオンの流入の促進に関与していることが判明した。実施例 Ί

(P J 0 1 08 7蛋白質（P r o t e i n— Y) と P r o t e i n— Xとの結合の有無）

P J 0 1 08 7蛋白質と P r o t e i n— Xとの結合を免疫沈降法で検討するために、下記蛋白質を調製した。

< P J 0 1 08 7蛋白質〉

H i s - t a gとの融合蛋白質として発現させた大腸菌の 2m 1培養分のペレット（実施例 5参照）に、 1 % T r i t o n-X/20 mM T r i s (p H 7. 4) 200 μ 1を添加して超音波処理、 1 5、 000 r p mで 5分間遠心処理し、その上清を試料とした（H i s— p j 0 1 08 7)。

ぐ P r o t e i n— X>

実施例 1に記載したクローン h j 0253 7を用い、実施例 5と同様の方法で P r o t e i n-Xと GSTとの融合蛋白質を発現させた大腸菌の 2 m 1培養分のペレツトに、 1 % T r i t o n-X/20 mM T r i s (p H 7. 4) 2 00 μ 1を添加して超音波処理、 1 5、 000 r p mで 5分間遠心処理し、その上清を試料とした（GST— h j 025 3 7)。また、 P r o t e i n— Xのグァ二レートキナーゼドメインを欠失させた変異体を GSTとの融合蛋白質をして発現させた大腸菌を用い、当該変異体蛋白質を同様に調製した〔GST— h j (GK -）〕。

< G S T >

コントロールとして G S Tのみを発現させ同様に試料調製した（Ame r s h am b i o s c i e n c e s社、 p GEX_4T— 3由来）。

く各蛋白質試料の処理 >

上記各上清に 1 % T r i t 0 n-X/20 mM T r i s (p H 7. 4) で平後 ΐィ匕したプロティン G—セファロース（p r o t e i nG— s e p h a r o s e) 30 μ 1を添加し、 4°Cで 1時間撹拌した。撹拌後に遠心処理し、その上清を結合試験に用いた。ぐ結合試験 >

上記各上清を①〜④のように分注し、 1 % T r i t o n-X/20 mM T r i s (p H 7. 4) で 2 0 0 i 1 として 4°Cでー晚撹拌した。 ① H i s 一 p j 0 1 0 8 7 1 +GS T- j 0 2 5 3 7 1 6 ^ 1

② H i s— p j 0 1 0 8 7 2 5 i 1 +G S T-h j (GK—） 1 00 ^ 1

③ H i s— p j 0 1 0 8 7 2 5 i 1 +G S T 4 n 1

④ H i s - p j 0 1 0 8 7 2 5 1 G S T抗体（S I GMA社） 1 μ 1を添加して 4 °Cで 1時間撹拌した後、さらに p r o t e i n G— s e p h a r o s e 3 0 /^ 1を添加し、 4。Cで 6時間撹拌した。その後、遠心処理して上清を除き、 p r o t e i n G- s e p h a r o 3 6を1 % T r i t o n-X/ 2 0 mM T r i s (p H 7. 4) 5 0 0 ^ 1 で 3回洗浄した。洗浄後に p r o t e i nG— s e p h a r o s eに 2—メノレ力プトエタノールを含む 2 X サンプルバッファー（2% S D S / 5 0 mM T r i s ( p H 6. 8 ) / 3 0 % グリセロール Ζθ. 0 1 % ブロムフエノールブルー） 3 0 μ 1を加えて混合し、 2分間煮沸後、 5 %— 2 0 % ポリアクリルアミドゲルにて泳動し、 PVDF膜に転写後、抗 G S T抗体および抗 H i s— t a g抗体でウェスタンブロッテイングを行った。

その結果、 P r o t e i n— X (GS T— : h j 0 2 5 3 7) および P r o t e i n— X変異体〔G S T— h j (GK―)〕の p r o t e i n G— s e p h a r o s eへの吸着は認められた（第 2 2図のレーン 5およぴ 6)。し力し、 P J 0 1 0 8 7蛋白質（H i s— p j 0 1 0 8 7) と P r o t e i n_X (G ST-h j 0 2 5 3 7) または P r o t e i n— X変異体〔G S T— h j (GK—）〕とを反応させて抗 GS T抗体で免疫沈降した後に抗 H i s - t a g抗体で検出したときに、 P J 0 1 0 8 7蛋白質のバンドは検出されず、 P J 0 1 0 8 7蛋白質と P r o t e i n— Xの結合があるとの結果は得られなかった（第 2 3図のレーン 5または 6)。産業上の利用可能性

かずさ DN A研究所のヒト長鎖 c DN A解析情報データベースから、パイオインフォーマテイクスにより、 PDZ ドメイン、 SH3 ドメインおよび GKドメインを有する新規遺伝子として h j 02537を抽出し、この遺伝子（配列番号 4) の遺伝子産物（配列番号 1) が NMDA受容体 /2 Bサブユニットと結合する新規蛋白質（P r o t e i n -X)であることを見出した。 P r o t e i n— Xは、そのアミノ酸配列の特徴から、？ 30— 95と同様に、細胞膜関連蛋白質であるグァニレートキナーゼファミリーの 1つであると考えられる。また、 P r o t e i n— Xが、 NMDA受容体刺激により発生するシグナルに関与し、その促進作用を有することを見出した。

また同様に、ラット P S D 9 5/S AP 90—ァソシエーティッドプロティン一 3 (SAPAP— 3) と 9 6 %の相同性を有する遺伝子としてクローン P J 0 1 087を抽出した。そしてこの遺伝子（配列番号 6) の遺伝子産物（配列番号 3) 、 p r o t e i n— X (配列番号 1 ) との相互作用により、 NMDA受容体から伝達されたシグナルを著しく増幅する作用を有することを見出した。 N MD A受容体シグナル伝達は、 P r o t e i n—X単独のときよりも、 p r o t e i n— Xと P J 0 1 08 7蛋白質の共存下のほうが、より強く増幅された。これらから、本発明は、 p r o t e i n— Xおよび P J 0 1 08 7蛋白質、並びにそれらの遺伝子が関与する生体機能あるいは疾患の解明、例えば NMDA受容体のシグナル伝達機構の解明、記憶再生機構の解明、さらには NMDA受容体のシグナル伝達異常や記憶再生の異常に起因する疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病おょぴポリグルタミン病等の神経変性疾患の解明、並びにそれら疾患の防止、治療、または改善を可能にするために非常に有用なものである。配列表フリーテキスト

配列表の配列番号 7 ：配列番号 4に記載の配列に基づいて設計されたプライマ一として用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 8 ：配列番号 4に記載の配列に基づいて設計されたプライマ一として用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 9 ：配列番号 4に記載の配列に基づいて設計されたプライマ一として用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 0 ： NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットの部分塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 1 ： NMD A受容体 / 2 Bサブュニットの部分塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 2 ： NMD A受容体 / 2 Bサブュニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 3 ： NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 4 ： NMD A受容体/ / 2 Bサブュニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 5 ： NMD A受容体 / 2 Bサブュニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 6 ： NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1. 7 ： NMD A受容体 Z 2 Bサブュニットの塩基配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 8 ：配列番号 6に記載の配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

配列表の配列番号 1 9 ：配列番号 6に記載の配列に基づいて設計されたプライマーとして用いるポリヌクレオチド

Claims

請求の範囲

1 . 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進し、および Zまた 5 は、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドとの相互作用を阻害または促進することを特徴とする、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節剤。

2 . 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと N—メチ L0 ルー D—ァスパラギン酸受容体との結合を阻害し、および/または、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリペプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の阻害剤。

5 3 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体との結合を促進し、および Zまたは、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝 0 達の促進剤。

4 . 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進し、および/または、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリべプチドとの相互作用 5 を阻害または促進することを特徴とする、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の調節方法。

5 . 配列表の配列番号 1に記载のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体との結合を阻害し、および/または、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドとの相互作用を阻害することを特徴とする、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の阻害方法。

配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドと N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体との結合を促進し、および/または、配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドとの相互作用を促進することを特徴とする、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の促進方法。

下記の群から選ばれるポリペプチド；

i ) 配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチド、

ii ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

iii ) 前記 i ) のポリぺプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有し、かつ N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体 2 Bサブュニットと結合するポリべプチド、

および

iv ) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有し、かつ N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体ノ 2 Bサブュニットと結合するポリべプチド。下記の群から選ばれるポリペプチドであって、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体 / 2 Bサブュニットと結合するポリべプチド；

ii ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、 iii ) 前記 i ) のポリペプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有するポリべプチド、

および

iv) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または揷入という変異を有するポリペプチド。下記の群から選ばれるポリペプチド；

iii ) 前記 i ) のポリペプチドとアミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有し、かつ配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと相互作用するポリべプチド、

および

. 下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドと相互作用するポリべプチド； i ) 配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、 ii ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

iii ) 前記 i ) のポリぺプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有するポリべプチド、

および

iv) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。

. 下記の群から選ばれるポリペプチドであって、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドの共存下で、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達を増幅するポリべプチド；

1 ) 配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチド、 ϋ ) 前記 i ) のポリペプチドを含有するポリペプチド、

および

iv ) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または揷入という変異を有するポリペプチド。

1 2 . 下記のポリペプチドであって、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体

2 Bサブュニットと結合し、かつ配列表の配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと相互作用しないポリべプチド；

i ) 配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドとァミノ酸配列上少なくとも約 7 0 %の相同性を有するポリぺプチド、

または

ii ) 前記 i ) のポリペプチドのアミノ酸配列において 1個乃至数個のァミノ酸の欠失、置換、付加または挿入という変異を有するポリペプチド。

1 3 . 配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチド。

1 4 . 配列表の配列番号 1または配列番号 2に記載のァミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチドであって、 N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体と結合するぺプチド。

1 5 . 配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチドであって、配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと相互作用するぺプチド。

1 6 . 配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチド。

1 7 . 配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列のうち少なくとも 5個の連続するアミノ酸残基からなるぺプチドであって、配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと相互作用するぺプチド。

1 8 . 請求の範囲第 7項から第 1 7項に記載のポリペプチドまたはペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリペプチドまたはペプチドを有効量含んでなる請求の範囲第 1項に記載の調節剤。

1 9 . 請求の範囲第 1 2項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のぺプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリべプチドまたはべプチドを有効量含んでなる請求の範囲第 2項に記載の阻害剤。

2 0 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドおよぴ請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリぺプチドまたはべプチドを有効量含んでなる請求の範囲第 3項に記載の促進剤。

2 1 . 請求の範囲第 7項から第 1 7項に記載のポリペプチドまたはペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリぺプチドまたはべプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第 4項に記載の調節方法。

2 2 . 請求の範囲第 1 2項に記載のポリペプチドおよび請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のぺプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第 5 項に記載の阻害方法。

2 3 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドおよぴ請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチドから選ばれる少なくとも 1種のポリペプチドまたはペプチドを使用することを特徴とする、請求の範囲第 6項に記載の促進方法。

2 4 . 請求の範囲第 7項、第 8項もしくは第 1 2項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第 1 3項から第 1 5項のいずれか 1項に記載のペプチドをコードする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。

2 5 . 配列表の配列番号 4または配列番号 5に記載の塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列からなるポリヌクレオチド。

2 6 . 請求の範囲第 2 4項または第 2 5項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼ——ンョンするポリヌクレオチド。

2 7 . 請求の範囲第 9項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第 1 6項もしくは第 1 7項に記載のぺプチドをコ一ドする塩基配列、またはそれらの相補的塩基配列を含んでなるポリヌクレオチド。 2 8 . 配列表の配列番号 6に記載の塩基配列またはその相捕的塩基配列からなるポリヌクレオチド。

2 9 .請求の範囲第 2 7項または第 2 8項に記載のポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイゼ——ン 3ンするポリヌクレオチド。

3 0 . 請求の範囲第 2 4項から第 2 6項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。

3 1 . 組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第 3 0項に記載の糸且換えベクター。

3 2 . 請求の範囲第 2 7項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。

3 3 . 組換えベクターが発現組換えベクターである請求の範囲第 3 2項に記載の組換えベクター。

3 4 . 請求の範囲第 3 0項または第 3 1項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。

3 5 . 請求の範囲第 3 2項または第 3 3項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体。

3 6 . 請求の範囲第 3 0項または第 3 1項に記載の組換えベクター、および請求の範囲第 3 2項または第 3 3項に記載の組換えベクターのいずれか 1つの組換えベクターを導入されてなる形質転換体。

3 7 . 請求の範囲第 3 1項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求の範囲第 3 0項もしくは第 3 1項に記載の組換えベクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、請求の範囲第 7項、第 8項もしくは第 1 2項に記載のポリぺプチドまたは請求の範囲第 1 3項から第 1 5項のいずれか 1項に記載のぺプチドの製造方法。

3 8 . 請求の範囲第 3 3項に記載の組換えベクターを導入されてなる形質転換体を培養する工程、または請求の範囲第 3 2項もしくは第 3 3項に記載の組換えべクターを利用した無細胞蛋白質合成手段を含む、請求の範囲第 9項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドまたは請求の範囲第 1 6項もしくは第 1 7項に記載のぺプチドの製造方法。

3 9 . 請求の範囲第 7項、第 8項もしくは第 1 2項に記載のポリペプチドおよび

/または請求の範囲第 1 3項から第 1 5項のいずれか 1項に記載のぺプチドを免疫学的に認識する抗体。

4 0 . 請求の範囲第 7項、第 8項もしくは第 1 2項に記載のポリペプチドおよび /または請求の範囲第 1 3項から第 1 5項のいずれか 1項に記載のぺプチドを免疫学的に認識する抗体であって、該ポリぺプチドの機能を阻害する抗体。

4 1 . 請求の範囲第 9項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドおよぴ Zまたは請求の範囲第 1 6項もしくは第 1 7項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体。

4 2 . 請求の範囲第 9項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドおよび/または請求の範囲第 1 6項もしくは第 1 7項に記載のペプチドを免疫学的に認識する抗体であって、配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 3に記载のァミノ酸配列からなるポリべプチドの相互作用を阻害する抗体。

4 3 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および Zまたは、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、および請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。

4 4 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および/または、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、化合物と該ポリぺプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用を可能にする条件下で、該ポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドと化合物とを接触させ、次いで、化合物と該ポリペプチドまたは化合物と該ポリヌクレオチドとの相互作用により生じるシグナルの存在、不存在または変化を検出することにより、化合物が該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドと相互作用して、該ポリべプチドの機能または該ポリヌクレオチドの発現を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法。

4 5 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドと相互作用してその機能を阻害または促進する化合物、および Zまたは、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体と化合物とを接触させ、該ポリぺプチドの発現または機能の有無を検出することのできるシグナルおよぴ zまたはマーカーを使用する系を用い、このシグナルおよび/またはマーカーの存在、不存在または変化を検出することにより、該化合物が該ポリペプチドの発現または機能を阻害または促進するかどうかを決定する化合物の同定方法。

4 6 . 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと N—メチル _ D—ァスパラギン酸受容体との結合を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第 7項または第 8項に記載のポリべプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 6項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項または第 3 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項に記載の形質転換体、および請求の範囲第 3 9項または第 4 0項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。

4 7 . 配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドと配列表の配列番号 3に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの相互作用を阻害または促進する化合物の同定方法であって、請求の範囲第 7項から第 1 1 項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3 項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6 項のいずれか 1項に記載の形質転換体、および請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体のうちの少なくともいずれか 1つを用いることを特徴とする化合物の同定方法。

4 8 . 請求の範囲第 4 3項から第 4 7項のいずれか 1項に記載の同定方法で同定された化合物。

4 9 . 請求の範囲第 7項または第 8項に記載のポリペプチドと相互作用し、その機能を阻害または促進する化合物。

5 0 . 請求の範囲第 2 4項から第 2 6項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。

5 1 .請求の範囲第 9項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドと相互作用し、当該ポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの相互作用を阻害または促進する化合物。

. 請求の範囲第 9項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチドと相互作用し、当該ポリぺプチドと配列表の配列番号 1に記載のァミノ酸配列からなるポリぺプチドの共存下における N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の増幅を阻害または促進する化合物。

. 請求の範囲第 2 7項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチドと相互作用してその発現を阻害または促進する化合物。

. 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、および請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる医薬組成物。

. 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、および請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる N—メチル _ D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。 5 6 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、およぴ請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる記憶再生の異常に起因する疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。

5 7 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、および請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなる神経変性疾患の防止剤、治療剤、または改善剤。

5 8 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、および請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを有効量含んでなるアルツハイマー病の防止剤、治療剤、または改善剤。

. 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、および請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とする N—メチルー D—ァスパラギン酸受容体のシグナル伝達の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。

. 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、およぴ請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とする記憶再生の異常に起因する疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。

6 1 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項'または第 1 9項に記載の阻害剤、および請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とする神経変性疾患の防止方法、治療方法、または改善方法。

6 2 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体、請求の範囲第 4 8項から第 5 3項のいずれか 1項に記載の化合物、請求の範囲第 1項または第 1 8 項に記載の調節剤、請求の範囲第 2項または第 1 9項に記載の阻害剤、および請求の範囲第 3項または第 2 0項に記載の促進剤のうちの少なくともいずれか 1つを適用することを特徴とするアルツハイマー病の防止方法、治療方法、または改善方法。

6 3 . 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、または請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレォチドを定量的あるいは定性的に測定する方法。

. 請求の範囲第 7項から第 1 1項のいずれか 1項に記載のポリペプチド、請求の範囲第 1 3項から第 1 7項のいずれか 1項に記載のペプチド、請求の範囲第 2 4項から第 2 9項のいずれか 1項に記載のポリヌクレオチド、請求の範囲第 3 0項から第 3 3項のいずれか 1項に記載の組換えベクター、請求の範囲第 3 4項から第 3 6項のいずれか 1項に記載の形質転換体、および請求の範囲第 3 9項から第 4 2項のいずれか 1項に記載の抗体を少なくとも 1 つ以上含んでなる試薬キット。