WO2003040365A2 - Pna-konjugat oder pna-konjugat-gemisch zur therapie von mit hpv in zusammenhang stehenden erkrankungen - Google Patents

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Waldemar Waldeck
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Definitions

  • the present invention relates to peptide-nucleic acid (PNA) conjugates or PNA conjugate mixtures which inhibit the expression of the HPV genes E6 and / or E7 and are suitable for the therapy of diseases related to HPV, preferably cervical cancer.
  • PNA peptide-nucleic acid
  • HPVs Human papillomaviruses
  • HPVs Human papillomaviruses
  • HPVs are small DNA viruses that comprise a family of over 100 members and that infect epithelial cells such as skin cells and oral or genital mucosal cells.
  • Specific types of human papilloma viruses are closely associated with the development of malignant tumors. Their involvement in the development of cervical cancer is particularly well characterized and various findings indicate that HPVs play a causal etiology of this tumor.
  • sequences of oncogenic HPV types HPV16 in approximately 50-60% and HPV18 in approximately 10-20% of the cases
  • HPV 18 The complete nucleic acid sequence and genomic organization of HPV 18 are now known.
  • the HPV 18 genome contains 8 genes.
  • the genital HPV differ from the other human and animal PV in that they have a longer open EL reading frame and a characteristic control region (CR).
  • the viral DNA is mostly integrated into the tumor cells
  • E6 and E7 May have deletions and / or rearrangements, the early viral genes coding for E6 and E7 are always preserved and transcriptionally active. Experimentally, both E6 and E7 have transforming potential per se, their co-
  • P53 is a cellular tumor suppressor protein that normally plays an important role in maintaining the genomic stability of the cell. Among other things, it could be shown that p53 induces apoptotic cell death after DNA damage. In this context, the stimulation of the pro-apoptotic bax gene, for example, which is activated by p53 transcriptionally, could be of importance. In addition, there are indications that p53 can also have a pro-apoptotic effect independently of its function as a transcription factor. According to these models, inactivation of p53 could not only result in inefficient repair of acquired DNA damage, but could also prevent apoptotic elimination of genetically modified cells.
  • p53 serves as an important safety system that leads to the elimination of cells with a deregulated growth control.
  • the E6 protein of oncogenic HPV types forms a complex with this p53 protein, whereby this interaction leads to a rapid breakdown of p53 via ubiquitin-dependent proteolysis.
  • E6 is binding first to the cellular ubiquitin protein ligase E6-AP
  • the phenotype is the observation that the oncogenic E6 protein prevents apoptotic elimination of cells that are subject to the loss of growth control of the viral E7 oncoprotein, i.e. E6 and E7 work synergistically in HPV-associated cell transformation and cooperate in maintaining the malignant phenotype. In fact, by inhibiting the common transcription of the E6 / E7-
  • a conjugate or a conjugate mixture which comprises the following components: (a) a transport mediator for the cell membrane (“P"), (b) an address protein or peptide ("AP”) for import into the cell nucleus, and (c) one or more to be transported, with an HPV E6 gene and / or E7 gene of any HPV strain of known sequence, preferably an HPV16 or HPV18 E6 gene and / or E7 gene, hybridizable peptide nucleic acids (“PNAs”) that inhibit its expression.
  • P transport mediator for the cell membrane
  • AP address protein or peptide
  • HPV E6 gene and / or E7 gene of any HPV strain of known sequence, preferably an HPV16 or HPV18 E6 gene and / or E7 gene, hybridizable peptide nucleic acids (“PNAs”) that inhibit its expression.
  • PNAs hybridizable peptide nucleic acids
  • the components "P” and “AP” enable efficient and directed transport of the PNA to the target location and thus gene therapy. These components not only allow a fast and effective transport of the PNA through cell membranes of living cells into the cytoplasm, but also, after cytoplasmic activation of address peptide sequences, an efficient transport into the cell nucleus.
  • PNAs protease and nuclease resistant peptide nucleic acids
  • PNAs are oligonucleotide Derivatives, in which the sugar phosphate backbone is preferably substituted by ⁇ -amino-ethyl-glycine units linked by ethyl-amine, allows a stable and efficient blocking of the transcription of the desired genes due to their physico-chemical properties under physiological conditions.
  • an anti-gene strategy based on the antisense principle is pursued, in which, however, the target is not the mRNA but the gene itself, ie an episomal HPV DNA or the HPV DNA integrated into the host's genomic DNA.
  • the PNAs hybridize to the target DNA by forming a triple helix.
  • the target area can be a transcribed area of the E6 and / or E7 DNA on the one hand, and a regulatory area on the other hand, the blocking of which via the PNAs likewise inhibits transcription.
  • the conjugates or conjugate mixtures according to the invention represent a new type of pharmaceuticals which hybridize with specific HPV regions integrated into the host genome and bring about a stable inhibition of transcription. It could be shown that the conjugates or conjugate mixtures according to the invention were able to effectively inhibit the growth of S-HeLa cervical carcinoma cells, the genomic segment of the inserted viral DNA apparently being of critical importance for the triplex-forming PNAs.
  • the experiments leading to the present invention also show that the conjugates affect the reconstitution of the cytoskeleton.
  • the morphological change of suspension cells to adherent cells suggests a possible feedback mechanism of cytoskeleton, paxillin, E6 protein after administration of the E6 / E7 PNAs. Based on the results obtained, it can be assumed that (a) the inhibition of the expression of the HPV18 E6 and E7 genes with the growth inhibition of the S- HeLa cells is related, especially with the
  • the conjugates or conjugate mixtures according to the invention allow an individual active ingredient design and can be transported very efficiently to their destination, which also prevents or at least reduces the usual therapy-limiting side effects.
  • the aspect to be considered here is that the majority of the medicines currently in use do not develop their full effect due to their insufficient specificity. It can thus be assumed that the conjugate or conjugate mixture according to the invention permits efficient therapy of HPV or related diseases on a gene therapy basis, that is to say in a non-invasive manner.
  • HPV18 in particular has a very low evolution rate (a mutation in 300 bp over a period of several thousand years), so that the E6 and E7 genes are optimal molecular targets for anti-gene-directed strategies represent.
  • the present invention thus relates to a conjugate or conjugate mixture for inhibiting the expression of an HPV E6 gene and / or HPV E7 gene, the conjugate having the following components: (a) a transport mediator for the cell membrane, (b) an addressing protein or peptide for the Import into cell compartments, preferably the cell nucleus, and
  • PNAs peptide nucleic acids
  • the structure of the conjugate according to the invention is preferably: P / AP / HPV E6- or E7-PNA, even more preferably PSS-AP- (spacer optional ) -HPV E6- or E7-PNA, where -SS- denotes a disulfide bridge.
  • the transport mediator for the cell membrane is preferably a peptide or protein which can overcome the plasma membrane.
  • the length of this peptide or protein is not limited as long as it has the above property.
  • Examples of "P” are preferably from the transport peptide family or penetratin family (Derossi et al., Trends Cell Biol. £ (1988), pp. 84-87), are transportants or parts thereof (Pooga et al., The Faseb Journal 12. (1998), pp. 68 ff., The transmembrane peptide pAntp (43-58) or TPF (hum) (human transport peptide fragment: # 3723, # 3724 or # 3725 (Table 2).
  • the selected transport mediator is produced biologically (purification of natural transport mediator proteins or cloning and expression of the sequence in a eukaryotic or prokaryotic expression system), but preferably synthetically, for example according to the Merrifield method (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. £ 5_ (1963), 2149).
  • AP address protein or peptide
  • the choice of the address protein or peptide can be selected by the person skilled in the art using the known amino acid sequences for the import into the cell nucleus to control peptides or polypeptides.
  • the length of this address peptide or protein is not subject to any restriction, as long as it has the property of ensuring a cell nucleus-specific transport.
  • AP are generally selected which contain a cell-specific recognition signal and thereby direct the PNAs into the cell nucleus.
  • the pure address sequence is sufficient for the transport into the cell nucleus.
  • "AP” can also be selected which have a cell nucleus-specific peptide cleavage site.
  • this cleavage site lies within the signal sequence, but can also be added to it by additional amino acids in order to ensure that the address sequence is cleaved off after reaching the cell nucleus.
  • the selected "AP" sequence is produced biologically (purification of natural transport mediator proteins or cloning and expression of the sequence in a eukaryotic or prokaryotic expression system), but preferably synthetically, e.g. according to the Merrifield method (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. fL5_ (1963), 2149). Examples of suitable address proteins or peptides are:
  • the conjugate can also. optionally contain a spacer (abbreviated above with "SP"), which is preferably between the Address protein / peptide and the peptide to be transported
  • SP spacer
  • PNA Nucleic acid
  • the spacer serves to, if necessary, existing steric interactions between the
  • Spacer can for example be selected from polylysine,
  • PEG Polyethylene glycol
  • PVP polyvinyl pyrrolidone
  • a redox cleavage site between the transport mediator and the address protein / peptide e.g. -Cysteine-S-S-Cysteine-O-N-H-.
  • the bond that is formed between the transport mediator and the address protein is a redox coupling (gentle cell-inherent linkage using DMSO; Rietseh and Beckwith, Annu. Rev. Gent 3_2. (1998), 163-84):
  • the peptide nucleic acid (PNA) of the conjugates according to the invention allows the transcription of the HPV E6 and / or E7 genes to be inhibited, for example by hybridizing with a region of a gene that is transcribed or a regulatory region, ie, one Area responsible for the activation of the expression of the E6 and / or E7 gene. Suitable areas can be identified by the person skilled in the art on the basis of the known DNA sequences or their function.
  • the peptide nucleic acids preferably have a length of at least 15 bases, particularly preferred are peptide nucleic acids with a length of at least 18 bases, very preferably of at least 21 bases and most preferably of at least 23 bases.
  • the peptide nucleic acid can optionally also be labeled, for example radioactive, with a dye, with biotin / avidin or boron Derivatives, etc.
  • the synthesis of the conjugate constituents “P” and “AP” is preferably carried out synthetically by the Merrifield method (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85. (1963), 2149).
  • the coupling of the other constituents is done by covalent chemical bonding.
  • the redox gap between "P” and “AP” is chemically inserted through the redox coupling mentioned above.
  • a covalent bond preferably an acid amide bond, is also present between an optionally present spacer and the PNA or the address protein and the PNA.
  • Possible alternatives are ether or ester bonds, depending on the functional group (s) present in the substance to be conjugated.
  • the peptide nucleic acid comprises a sequence selected from the following group: (a) TTA CTT TTT GCT GCT, (b) GCT CGT GCT GTC CTT TCT,
  • the conjugate mixture according to the invention comprises a mixture of individual conjugates, each of the above sequence (a), (c) and
  • the present invention also relates to a conjugate or conjugate mixture according to the invention, optionally together with a medicament containing a suitable carrier, and to the use thereof for the prophylaxis or therapy of a disease associated with an HPV infection, preferably cervical cancer.
  • Preferred application routes are parenteral, transdermal or epicutaneous application.
  • Figure 1 Schematic representation of the inhibition of cell growth of S-HeLa cells depending on the administration of different PNA conjugates after an incubation period of 1 to 5 days
  • Figure 2 Graphical representation of the results of Figure 1
  • Figure 3 Flow cytometry analysis of the viability of HeLa-S cells depending on the administration of different PNA conjugates or conjugate mixtures after an incubation period of 24 h staining: propidium iodide.
  • Figure 4 Flow cytometry analysis of the viability of HeLa-S cells depending on the administration of different PNA conjugates or conjugate mixtures after an incubation period of 48 h conjugates used and staining: see Figure 3.
  • a cell line HeLa-S (control); Time: 24, 48 and 72 h;
  • DAPI (B) cell line: HeLa-S; Administration of E6 / E7 # PNA7 after an incubation period of 24, 48 and 72 h; Cell cycle;
  • Cell line S-HeLa; Incubation time: 30 min .; PNA FITC label; PNA conjugate used: # PNA7; embedded in Mowiol ® but not fixed; Excitation wavelength: 488 nm; Emission wavelength: 521 nm.
  • Cell line S-HeLa; Incubation time: 30 min .; PNA FITC label; PNA conjugate used: # PNA7; embedded in Mowiol ® , but not fixed.
  • the spin-HeLa (S-HeLa) cervical carcinoma suspension cell line was obtained from the DKFZ Tumor Bank (DKFZ, Heidelberg, Germany). S-HeLa cells were shown to contain HPV-18 genomes and to express the viral E6 and E7 proteins. Exponentially growing S-HeLa cells were grown at 37 ° C in an atmosphere with 5% CO 2 in MEM culture medium (Sigma Aldrich # 8028, Steinheim, Germany) containing 10% fetal bovine serum (FBS, Sigma, Kunststoff, Germany) and 2 mM glutamine (Gibco, Germany) was supplemented. The cell line were called suspension cells bred in a mycoplasma-free status via PCR
  • PNA Peptide nucleic acid
  • the side chain protecting groups were Lys (Boc), Asp (Obut), Ser (But), Cys (Trt) and Asn (Trt).
  • the protected peptidyl resin was treated with 20% piperidine in dimethylformamide.
  • the cleavage and cleavage of the protective groups was achieved by treatment with 90% trifluoroacetic acid, 5% ethanedithiol, 2.5% thioanisole and 2.5% phenol (vol. / Vol. / Vol.) For 2.5 hours at room temperature.
  • Cysteine groups of the transmembrane peptide pAntp (43-58) and the address protein (NLS) were in a range of 2 mg / ml in a 20% DMSO / Water solution oxidized. The reaction was complete after about 5 hours. The progress of the oxidation was monitored by an analytical C18 reverse phase HPLC (Tarn et al., J.Amer.Chem.Soc. 113 (1991)). The components were linked using the Merrifield method (Merrifield, J. Americ. Chem. Soc. JL5_ (1963), 2149).
  • DAPI DAPI stained cells.
  • the cells were obtained from native samples at room temperature under gentle shaking with 2.1% citric acid / 0.5% Tween ® 20 according to the method of de V Amsterdam et al. , Gynecol .Oncol. 44 (1992), 33-39, isolated with slight modifications.
  • DAPI-containing phosphate buffer 7.2 g Na 2 HP0 4 ⁇ 2 H 2 0 in 100 ml H 2 0), pH 8.0, was used for staining the cell suspensions.
  • Each histogram represents 30,000 to 100,000 cells for measuring the DNA index and the cell cycle.
  • the "Multicycle" program from Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, was used to analyze the histograms.
  • Human lymphocyte nuclei from healthy donors were used as internal standards to determine the diploid cell population.
  • the mean coefficient of variation (CV) of the diploid lymphocytes was 0.8 to 1.0.
  • the viability of the cells was determined using a new flow cytometry method. For this purpose, the cells were incubated with the PNA conjugates (100 pM) for 24 and 48 hours. Untreated cells served as controls. Analyzes were performed in a "FACS Calibur" flow cytometer (Becton Dickinson Cytometry Systems, San Jose, CA) using forward and sideways scattering and the relative fluorescence intensities of the native cells stained with propidium iodide were measured on the F2 channel at logarithmic grading , Dead cells are positive for propidium diiodide and colored red, living cells remain undyed. The positions in a logarithmic
  • Histograms are for unstained cells in the left corner, dead cells are in the right corner. In all experiments described, the same type of living was used
  • Target genes DNA region and PNA sequences Conjugate Target gene DNA region PNA (amino) sequence (carboxy)
  • Figures 1 and 2 show the average results of the Experiments.
  • # PNA1 E6 DNA region 3 '-375-389-5' map position
  • # PNA2 E6 DNA region 3 '-441-459-5' map position
  • # PNA3 E6 DNA range 3 '-463-488-5' map position
  • cell growth could be inhibited by about 40% after only 48 hours of incubation.
  • # PNA6 was used as a combination of the two anti-E6 conjugates # PNA1 and # PNA2. This combination led to a reduction in HeLa cells (60%) after 24 and 48 hours of incubation ( Figures 1 and 2).
  • a combination of # PNA1, # PNA3 and PNA4 resulted in approximately 90% inhibition of cell growth in culture compared to the control at an incubation time of 72 hours. After 24 hours of incubation, the cell growth is not yet greatly reduced, although it may be assumed that after incubation with # PNA7, the HeLa cells still have to go through a cell cycle. It is striking that the S-HeLa suspension cells showed a morphological change to adherent cells after administration of # PNA7 after 48 hours of incubation.
  • Example 3 Flow Cytometry Results
  • Figures 1 and 2 show that double treatments with # PNA1 (E6-DNA area 3 '-375-389-5') and # PNA2 (E6-DNA area 3'- 441-459-5 ') the viability of the HeLa-S cells could not affect.
  • # PNA4 E7 DNA region 3 '-597-612-5 #
  • Figures 1 and 2 also had no effect on the viability of the HeLa-S cells during the incubation period of 24 or 48 hours.
  • C Effect of double E6-PNA conjugates on cell growth
  • HeLa-S cells are highly proliferating diploid cells with a G0 / l peak, an S-phase fraction (approximately 30%) and a G2 + M phase (approximately 15%).
  • Apoptotic cell fractions are characterized by a sub-G0 / 1 peak, which is an indication of a reduced DNA content.
  • control cells there were no significant changes in the cell cycle distribution during the cultivation period. Only after 72 h was the amount of Zeil debris - as an effect of the breeding period - higher. In contrast, the number of treated cultured cells was clearly reduced after 24 hours. After 48 hours the cell count was the same as that in the control culture, but cell growth appeared to be reduced. After 72 h, a greatly reduced number of cells with no signs of growth was observed. In the control culture as well as in the treated cell culture, no clear apoptotic cell fraction could be detected as a Sub-Gl peak.

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Abstract

Beschrieben werden Peptid-Nukleinsäure(PNA)-Konjugate oder PNA-Konjugat-Gemische, die die Expression der HPV-Gene E6 und/oder E7 jeglicher HPV-Stämme bekannter Sequenz, vorzugsweise von HPV16 oder HPV18, hemmen und zur Therapie von mit HPV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, vorzugsweise Zervixkarzinom, geeignet sind.

Description

PNA-Konjugat oder PNA-Konjugat-Gemiseh zur Therapie von mit HPV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen
Die vorliegende Erfindung betrifft Peptid-Nukleinsäure (PNA) - Konjugate oder PNA-Konjugat-Gemische, die die Expression der HPV-Gene E6 und/oder E7 hemmen und zur Therapie von mit HPV in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, vorzugsweise Zervixkarzinom, geeignet sind.
Humane Papillomaviren (HPVs) sind kleine DNA-Viren, die eine Familie mit über 100 Mitgliedern umfassen und die Epithelzellen wie z.B. Hautzellen und orale oder genitale Mukosa-Zellen infizieren. Spezifische Typen humaner Papillomaviren sind eng mit der Entwicklung maligner Tumoren assoziiert. Besonders gut charakterisiert ist deren Beteiligung an der Entstehung des Zervixkarzinoms und verschiedene Befunde weisen darauf hin, daß HPVs eine kausale Ätiologie dieses Tumors spielen. Auf der molekularen Ebene sind in etwa 95% der Zervixkarzinom-Biopsien Sequenzen onkogener HPV-Typen (HPV16 in etwa 50-60% und HPV18 in etwa 10-20% der Fälle) nachweisbar. Die vollständige Nukleinsäuresequenz und genomische Organisation von HPV 18 sind inzwischen bekannt. Das HPV 18-Genom enthält 8 Gene. Die genitalen HPV unterscheiden sich von den anderen humanen und tierischen PV dadurch, daß sie einen längeren offenen El- Leserahmen und eine charakteristische Kontrollregion (CR) aufweisen. Die Kontrollregion von HPV 18, die sich zwischen dem ersten Stoppcodon von Ll und dem ersten ATG-Codon von E6 erstreckt, besteht aus 828 Basenpaaren und sollte - anhand der Analogie mit anderen PV - Sequenzen enthalten, die an der
Expression und Replikation beteiligt sind. Die virale DNA liegt in den Tumorzellen meist integriert in das
Wirtszellgenom vor. Obwohl die HPV-Sequenzen in den Tumoren
Deletionen und/oder Rearrangements aufweisen können, sind die frühen viralen, für E6 und E7 kodierenden Gene stets erhalten und transkriptionell aktiv. Experimentell weisen sowohl E6 als auch E7 transformierendes Potential per se auf, ihre Co-
Expression resultiert jedoch - als Hinweis auf eine funktioneile Kooperation der beiden Gene - in einer deutlich gesteigerten Transformationseffizienz .
Offensichtlich interagiert E6 mit dem Tumorsuppressor p53 und E7 mit dem Rb-Tumorsuppressorgen. Bei p53 handelt es sich um ein zelluläres Tumorsuppressorprotein, das normalerweise eine wichtige Rolle für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität der Zelle spielt. Es konnte unter anderem gezeigt werden, daß p53 nach DNA-Schädigung den apoptotischen Zelltod induziert. In diesem Rahmen könnte beispielsweise die Stimulation des pro-apoptotischen bax-Gens von Bedeutung sein, das durch p53 transkriptionell aktiviert wird, zusätzlich gibt es Hinweise darauf, daß p53 auch unabhängig von seiner Funktion als Transkriptionsfaktor pro-apoptotisch wirken kann. Nach diesen Modellen könnte eine Inaktivierung von p53 nicht nur in einer ineffizienten Reparatur erworbener DNA-Schäden resultieren, sondern auch zur Verhinderung der apoptotischen Eliminierung genetisch veränderter Zellen führen. Allgemein kann gesagt werden, daß p53 als wichtiges Sicherungssyste dient, das zur Eliminierung von Zellen mit einer deregulierten Wachstumskontrolle führt. Das E6-Protein onkogener HPV-Typen geht mit diesem p53-Protein einen Komplex ein, wobei diese Interaktion zu einem raschen Abbau von p53 über Ubiquitin-abhängige Proteolyse führt. Dabei bindet E6 zunächst an die zelluläre Ubiquitin-Protein-Ligase E6-AP
(„E6-associated protein,,) . Anschließend assoziert dieser
Komplex mit p53, das durch E6-AP für den proteolytischen
Abbau markiert wird. Neuere Befunde weisen allerdings darauf hin, daß eine E6-p53-Interaktion auch in Abwesenheit von E6-
AP stattfinden kann. Von besonderer Bedeutung für die mögliche Rolle von E6 für die Aufrechterhaltung des malignen
Phänotyps ist die Beobachtung, daß das onkogene E6-Protein die apoptotische Eliminierung von Zellen verhindert, die dem zur Verlust der Wachstumskontrolle führenden Einfluß des viralen E7-Onkoproteins ausgesetzt sind, d.h. E6 und E7 wirken bei der HPV-assoziierten Zelltransformation synergistisch und kooperieren bei der Aufrechterhaltung des malignen Phänotyps. In der Tat ist es experimentell gelungen, durch die Hemmung der gemeinsamen Transkription der E6/E7-
Gene bzw. durch E6/E7-Antisense-Konstrukte das Wachstum HPV- positiver Zellen zu inhibieren, allerdings nur zeitabhängig partiell.
Was die Therapie des Zervixkarzinoms anbelangt, so konnte diese bisher im Prinzip nur als invasive Therapie, z.B. Konisation, durchgeführt werden und leider gibt es bisher keine therapeutischen Ansätze bezüglich der wesentlich wünschenswerteren. Zielsetzung, einer nicht-invasiven Therapie, die nicht nur einen Wachstumsstop HPV-positiver Zellen bewirkt, sondern auch eine Eliminierung der Tumorzellen. Zwar wurde in jüngster Zeit ein HPV-ImpfStoff entwickelt, es ist jedoch noch offen, ob und wann dieser therapeutisch einsetzbar ist. Auch wurden auf Antisense-RNA basierende Strategien zur Hemmung der E6- bzw. E7-Genexpression entwickelt, diese führten aber nur zu einer sehr begrenzten und zeitlich stark limitierten Hemmung der E6- bzw. E7- Genexpression. Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Mittel bereitzustellen, die eine wirksame nich -invasive Therapie von mit einer HPV-Infektion in Zusammenhang stehenden Erkrankungen, insbesondere des Zervixkarzinoms, ermöglichen.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgte durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen .
Von den Erfindern wurde zur Erzielung der Lösung des technischen Problems ein Konjugat bzw. ein Konjugat-Gemisch entwickelt, das die folgenden Komponenten umfaßt: (a) einen Transportvermittler für die Zellmembran ("P"), (b) ein Adressprotein bzw. -peptid ("AP") für den Import in den Zellkern, und (c) eine oder mehrere zu transportierende, mit einem HPV E6-Gen und/oder E7-Gen jeglichen HPV-Stamms bekannter Sequenz, vorzugsweise einem HPV16 oder HPV18 E6-Gen und/oder E7-Gen, hybridisierbare Peptid-Nukleinsäuren (,,PNAs„), die dessen bzw. deren Expression hemmen.
Diese modular aufgebauten Konjugate weisen zwei entscheidende Vorteile auf:
(a) Mittels der Komponenten „P„ und „AP„ wird ein effizienter und gerichteter Transport der PNA zu dem Zielort und somit eine Gentherapie ermöglicht. Diese Komponenten erlauben nicht nur einen schnellen und effektiven Transport der PNA durch Zellmembranen lebender Zellen ins Zytoplasma, sondern auch, nach zytoplasmatischer Aktivierung von Adresspeptidsequenzen, einen effizienten Transport in den Zellkern.
(b) Der Einsatz der protease- und nukleaseresistenten Peptid- Nukleinsäuren (,,PNAs„), bei denen es sich um Oligonukleotid- Derivate handelt, bei denen das Zuckerphosphat-Rückgrat bevorzugt durch Ethyl-Amin verbundene α-Amino-Ethyl-Glycin- Einheiten substituiert ist, erlaubt aufgrund ihrer physiko- chemischen Eigenschaften unter physiologischen Bedingungen eine stabile und effiziente Blockierung der Transkription der gewünschten Gene. Mit diesen PNAs wird eine auf dem Antisense-Prinzip basierende Anti-Gen-Strategie verfolgt, bei der jedoch nicht die mRNA, sondern das Gen selbst, d.h. eine episomale HPV DNA oder die in genomische DNA des Wirts integrierte HPV-DNA das Ziel ist. Dabei hybridisieren die PNAs über die Bildung einer Triple-Helix an die Ziel-DNA. Der Zielbereich kann einerseits ein transkribierter Bereich der E6- und/oder E7-DNA sein, andererseits ein regulatorischer Bereich, dessen Blockierung über die PNAs ebenfalls die Transkription hemmt.
Die erfindungsgemäßen Konjugate bzw. Konjugat-Gemische stellen eine neue Art von Pharmaka dar, die mit spezifischen in das Wirtsgenom integrierten HPV-Bereichen hybridisieren und eine stabile Hemmung der Transkription bewirken. Es konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Konjugate bzw. Konjugat-Gemische das Wachstum von S-HeLa- Zervixkarzinomzellen wirksam hemmen konnten, wobei offensichtlich das genomische Segment der inserierten viralen DNA für die eine Triplex bildenden PNAs von kritischer Bedeutung ist. Die zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimente zeigen außerdem, daß die Konjugate die Rekonstitution des Zytoskeletts beeinflussen. Die morphologische Veränderung von Suspensionszellen zu haftenden Zellen legt einen möglichen Rückkopplungsmechanismus von Zytoskelett, Paxillin, E6-Protein nach Verabreichung der E6/E7-PNAs nahe. Aufgrund der gewonnenen Ergebnisse kann davon ausgegangen werden, daß (a) die Hemmung der Expression der HPV18 E6- und E7-Gene mit der Wachstumshemmung der S- HeLa-Zellen in Zusammenhang steht, wobei vor allem mit den
Konjugat-Gemischen die Reaktivierung des Rb-Proteins und die
Repression der E2F-abhängigen Gene erreicht werden kann, (b) da die Zellzyklusmaschinerie komplex und dynamisch ist, die
Regulation des Zellzyklus sehr stark von den E6- und E7-
Proteinen abhängt, und (c) da die Tumorsuppressor-Gene p53 und plOδ1^ durch die Konjugate rekonstituiert werden können, diese beiden Tumorsuppressoren in S-HeLa-Zellen funktioneil intakt sind.
Die erfindungsgemäßen Konjugate bzw. Konjugat-Gemische erlauben ein individuelles Wirkstoff-Design und können sehr effizient an ihr Ziel transportiert werden, wodurch auch die üblichen Therapie-limitierenden Nebenwirkungen verhindert oder zumindest verringert werden. Hierbei ist noch der Aspekt zu beachten, daß der größte Teil der momentan gebräuchlichen Medikamente aufgrund derer unzureichenden Spezifität nicht die volle Wirkung entfaltet. Somit kann davon ausgegangen werden, daß das erfindungsgemäße Konjugat bzw. Konjugat- Gemisch eine effiziente Therapie von HPV bzw. damit in Zusammenhang stehenden Erkrankungen auf einer gentherapeutischen Basis, also auf nicht-invasive Weise, erlaubt. Schließlich ist auch hierbei noch von Vorteil, daß vor allem HPV18 eine sehr geringe Evolutionsrate aufweist (eine Mutation in 300 bp über einen Zeitraum von mehreren tausend Jahren) , somit die E6- und E7-Gene optimale molekulare Ziele für anti-Gen-gerichtete Strategien darstellen.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Konjugat oder Konjugat-Gemisch zur Hemmung der Expression eines HPV E6-Gens und/oder HPV E7-Gens, wobei das Konjugat die folgenden Komponenten aufweist: (a) einen Transportvermittler für die Zellmembran, (b) ein Adressprotein bzw. -peptid für den Import in Zellkompartimente, vorzusgweise den Zellkern, und
(c) eine oder mehrere zu transportierende, mit einem HPV E6-
Gen und/oder HPV E7-Gen hybridisierbare bzw. gegen diese Gene gerichtete Peptid-Nukleinsäuren (PNAs) .
Bezüglich Verfahren zur Herstellung der einzelnen Komponenten der Konjugate und zu deren Verknüpfung wird auf die deutsche Patentanmeldung Nr. 199 33 492.7 verwiesen. Die Synthese von PNAs ist dem Fachmann bekannt und z.B. auch in Nielsen et al., Science 254 (1991), 1497-1500, beschrieben.
Der Aufbau des erfindungsgemäßen Konjugats ist vorzugsweise: P / AP / HPV E6- oder E7-PNA, noch mehr bevorzugt P-S-S-AP- (Spacerfakultativ) -HPV E6- oder E7-PNA, wobei -S-S- eine Disulfidbrücke bezeichnet.
Den Transportvermittler für die Zellmembran (vorstehend mit "P" abgekürzt) stellt vorzugsweise ein Peptid bzw. Protein dar, das die Plasmamembran überwinden kann. Die Länge dieses Peptids bzw. Proteins unterliegt keiner Beschränkung, solange es die obige Eigenschaft aufweist. Beispiele für "P" stammen vorzugsweise aus der Transportpeptidfamilie oder Penetratin- Familie (Derossi et al., Trends Cell Biol. £ (1988), S. 84- 87), sind Transportan bzw. Teile davon (Pooga et al., The Faseb Journal 12. (1998), S. 68 ff.), das Transmembranpeptid pAntp (43-58) oder TPF(hum) (humanes Transportpeptidfragment : #3723, #3724 oder #3725 (Tabelle 2).
Hergestellt wird der ausgewählte Transportvermittler auf biologischem Weg (Reinigung natürlicher Transportvermittlerproteine oder Klonierung und Expression der Sequenz in einem eukaryotisehen oder prokaryotisehen Expressionssystem) , bevorzugt aber auf synthetischem Weg, z.B. nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc . £5_ (1963 ) , 2149) .
Die Auswahl des Adressproteins bzw. -peptids (vorstehend mit "AP" abgekürzt) kann der Fachmann anhand der bekannten Aminosäuresequenzen für den Import in den Zellkern steuernde Peptide bzw. Polypeptide auswählen. Prinzipiell unterliegt die Länge dieses Adresspeptids bzw. -proteins keiner Beschränkung, solange es die Eigenschaft aufweist, einen zellkernspezifischen Transport zu gewährleisten. Für die Einbringung der PNAs werden im allgemeinen "AP" ausgewählt, die ein zellkernspezifisches Erkennungssignal enthalten und dadurch die PNAs in den Zellkern dirigieren. Grundsätzlich ist für den Transport in den Zellkern die reine Adressequenz ausreichend. Es können aber auch "AP" ausgewählt werden, die über eine zellkernspezifische Peptidasespaltstelle verfügen. Diese Spaltstelle liegt im günstigsten Fall innerhalb der Signalsequenz, kann aber auch an diese durch zusätzliche Aminosäuren angefügt werden, um nach Erreichen des Zellkerns das Abspalten der Adressequenz sicherzustellen. Hergestellt wird die ausgewählte "AP"-Sequenz auf biologischem Weg (Reinigung natürlicher Transportvermittlerproteine oder Klonierung und Expression der Sequenz in einem eukaryontisehen oder prokaryontisehen Expressionssystem) , bevorzugt aber auf synthetischem Weg, z.B. nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. fL5_ (1963), 2149). Beispiele für geeignete Adressproteine bzw. - peptide sind:
-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val; und
H3N+-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-
(= „Nuclear localisation sequence,, aus SV40-T-Antigen)
Weiter kann das Konjugat . ggf. einen Spacer (vorstehend mit "SP" abgekürzt) enthalten, der sich vorzugsweise zwischen dem Adressprotein/-peptid und der zu transportierenden Peptid-
Nukleinsäure (PNA) befindet. Er kann aber zusätzlich oder alternativ auch zwischen dem Transportvermittler und dem
Adressprotein vorliegen. Der Spacer dient dazu, ggf. vorhandene sterische Wechselwirkungen zwischen den
Komponenten aufzuheben bzw. günstig zu beeinflussen. Der
Spacer kann beispielsweise ausgewählt sein aus Polylysin,
Polyethylenglykol (PEG) , Derivate der Poly-Methacrylsäure oder Polyvinylpyrrolidon (PVP) .
Zwischen dem Transportvermittler und dem Adressprotein/- peptid befindet sich vorzugsweise eine Redoxspaltstelle, z.B. -Cystein-S-S-Cystein-O-N-H- . Die zwischen Transportvermittler und Adressprotein entstehende Bindung ist eine Redoxkopplung (schonende zellimmanente Verknüpfung mittels DMSO; Rietseh und Beckwith, Annu. Rev. Gent 3_2. (1998) , 163-84) :
Cystein-SH SH-Cystein > Cystin-S-S-Cystin
Die Peptid-Nukleinsäure (PNA) der erfindungsgemäßen Konjugate erlaubt die Hemmung der Transkription der HPV E6- und/oder E7-Gene, z.B. dadurch, daß sie mit einem Bereich eines Gens hybridisiert, der transkribiert wird, oder einem regulatorischen Bereich, d.h., einem Bereich, der für die Aktivierung der Expression des E6- und/oder E7-Gens verantwortlich ist. Geeignete Bereiche können vom Fachmann anhand der bekannten DNA-Sequenzen bzw. deren Funktion identifiziert werden. Vorzugsweise weisen die Peptid- Nukleinsäuren eine Länge von mindestens 15 Basen auf, besonders bevorzugt sind Peptid-Nukleinsäuren mit einer Länge von mindestens 18 Basen, ganz bevorzugt von mindestens 21 Basen und am meisten bevorzugt von mindestens 23 Basen. Die Peptid-Nukleinsäure kann ggf. auch markiert sein, z.B. radioaktiv, mit einem Farbstoff, mit Biotin/Avidin oder Bor- Derivaten usw.
Die Synthese der Konjugatbestandteile "P" und "AP" erfolgt vorzugsweise synthetisch nach dem Merrifield-Verfahren (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85. (1963) , 2149) Die Ankopplung der anderen Bestandteile (z.B. Spacer und/oder PNA) daran erfolgt durch kovalente chemische Bindung. Die Einfügung der Redoxspaltstelle zwischen "P" und "AP" erfolgt auf chemischen Wege durch die oben erwähnte Redoxkopplung . Auch zwischen einem ggf. vorhandenen Spacer und der PNA bzw. dem Adressprotein und der PNA liegt eine kovalente Bindung vor, bevorzugt eine Säureamid-Bindung. Mögliche Alternativen sind Ether- oder Ester-Bindungen, je nach den in der zu konjugierenden Substanz vorhandenen funktioneilen Gruppe (n) .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Konjugats bzw. Gemischs umfaßt die Peptid- Nukleinsäure (PNA) eine Sequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe: (a) TTA CTT TTT GCT GCT, (b) GCT CGT GCT GTC CTT TCT,
(c) TTG CTG CGT CTC TTT GTG TTC ATA TT und (d) TCT CCT TCT TTT GCT (Orientierung: N-Terminus/Sequenz/C-Terminus) .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Konjugat-Gemisch ein Gemisch aus einzelnen Konjugaten, die jeweils die vorstehende Sequenz (a) , (c) und
(d) enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft schließlich auch ein erfindungsgemäßes Konjugat oder Konjugat-Gemisch, gegebenenfalls zusammen mit einem geeigneten Träger, enthaltendes Arzneimittel sowie dessen Verwendung zur Prophylaxe oder Therapie von mit einer HPV-Infektion in Zusammenhang stehenden Erkrankung, vorzugsweise des Zervixkarzinoms. Bevorzugte Applikationswege sind die parenterale, transdermale oder epicutane Applikation.
Legenden zu den Figuren:
Figur 1: Schematische Darstellung der Hemmung des Zellwachstums von S-HeLa-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung unterschiedlicher PNA-Konjugate nach einer Inkubationsperiode von 1 bis 5 Tagen
Figur 2: Graphische Darstellung der Ergebnisse von Figur 1
Figur 3 : Durchflusszytometrie-Analyse zur Lebensfähigkeit von HeLa-S-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung unterschiedlicher PNA-Konjugate bzw. Konjugatgemische nach einer Inkubationsperiode von 24 h Anfärbung: Propidiumjodid.
Figur 4: Durchflusszytometrie-Analyse zur Lebensfähigkeit von HeLa-S-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung unterschiedlicher PNA-Konjuαate bzw. Konjugatgemische nach einer Inkubationsperiode von 48 h verwendete Konjugate und Anfärbung: siehe Figur 3.
Figur 5: Durchflusszytometrie-Analyse zur Lebensfähigkeit von HeLa-S-Zellen in Abhängigkeit von der Verabreichung unterschiedlicher PNA-Konjugate bzw. Konjugatgemische nach einer Inkubationsperiode von 72 h Verwendete Konjugate und Anfärbung: siehe Figur 3.
Figur 6: Durchflusszytometrie-Analyse zur
Zellzyklusverteilung
(A) Zellinie: HeLa-S (Kontrolle); Zeit: 24, 48 und 72 h;
Zellzyklus; Anfärbung: DAPI (B) Zellinie: HeLa-S; Verabreichnung von E6/E7#PNA7 nach einer Inkubationszeit von 24, 48 und 72 h; Zellzyklus;
Anfärbung: DAPI; effektive Konzentration: 100 pM.
Figur 7 : CLSM-Aufnähme
Zellinie: S-HeLa; Inkubationszeit: 30 Min.; PNAFITC- Markierung; verwendetes PNA-Konjugat : #PNA7; in Mowiol® eingebettet, jedoch nicht fixiert; Anregungswellenlänge: 488 nm; Emmissionswellenlänge: 521 nm.
Figur 8 : DIC-Aufnähme
Zellinie: S-HeLa; Inkubationszeit: 30 Min.; PNAFITC- Markierung; verwendetes PNA-Konjugat: #PNA7; in Mowiol® eingebettet, jedoch nicht fixiert.
Die Erfindung wird weiter anhand der nachfolgenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1 Allgemeine Verf hren
(A) Zellkultur
Die Cervixkarzinom-Suspensionszellinie Spin-HeLa (S-HeLa) wurde von der DKFZ-Tumorbank (DKFZ, Heidelberg, Deutschland) erhalten. Für S-HeLa-Zellen konnte gezeigt werden, daß sie Genome von HPV-18 enthalten und die viralen E6- und E7- Proteine exprimieren. Exponentiell wachsende S-HeLa-Zellen wurden bei 37°C in einer Atmosphäre mit 5% C02 in MEM Kulturmedium (Sigma Aldrich #8028, Steinheim, Deutschland) gezüchtet, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Sigma, München, Deutschland) und 2 mM Glutamin (Gibco, Deutschland) supplementiert war. Die Zellinie wurden als Suspensionszellen bei einem Mykoplasma-freien Status gezüchtet, der über PCR
(Mykoplasma PCR-Primersatz, Stratagene, Deutschland) überwacht wurde.
(B) Peptidsynthese
Peptidnukleinsäure (PNA) imitiert eine DNA und wurde ursprünglich als Reagens zur sequenzspezifischen Erkennung doppelsträngiger DNA über eine konventielle Tripelhelix- Bildung entwickelt. Für die Festphasensynthese wurde die Fmoc-Strategie mittels einem vollautomatisierten Synthesegerät (Syro II, Multisyntech, Witten, Deutschland) verwendet. Die Synthese wurde an einem 0,05 mmol Fmoc-AS- Polystyrenharz (1% quervernetzt) durchgeführt. Als Kopplungreagenz wurde 2- (lH-Benzotriazol-1-yl) -1, 1, 3, 3- Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HBTU) verwendet. Die Seitenketten schützenden Gruppen waren Lys(Boc), Asp(Obut), Ser(But), Cys(Trt) und Asn(Trt) . Das geschützte Peptidylharz wurde mit 20% Piperidin in Dimethylformamid behandelt. Die Spaltung und Abspaltung der Schutzgruppen wurde durch Behandlung mit 90% Trifluoressigsäure, 5% Äthandithiol , 2,5% Thioanisol und 2,5% Phenol (Vol . /Vol . /Vol . ) für 2,5 Stunden bei Raumtemperatur erzielt. Alle Produkte wurden in Äther präzipitiert und über präparative HPLC (Shimazu LC-8A, Shimazu, Duisburg, Deutschland) auf einer YMC ODS-A 7A S-7 μm Umkehrphasen-HPLC-Säule (20 x 250 mm) unter Verwendung von 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser (A) und 60% Acetonitril in Wasser (B) als Elutionsmittel gereinigt. Die Peptide wurde mit einem linearen Gradienten von 25% B bis 60% B innerhalb von 40 Min. bei einer Durchflußrate von 10 ml/Min. eluiert. Die dem gereinigten Konjugat entsprechenden Fraktionen wurden lyophilisiert . Sequenzen von Einzelmolekülen sowie das vollständige bimodulare Konstrukt wurden über analytische HPLC (Shimadzu LC-10) und Laser-Desorptionsmassen- spektroskopie (Finnigan Vision 2000, Finnigan MAT, San Jose, CA, USA) wie nachstehend angegeben charakterisiert. Das
Zufalls-PNA-Konstrukt wurde mit einem identischen
Trägerkonjugat hergestellt.
Peptidreinigung :
Gradient: analyt. 5%->80% (in einem Zeitraum von 35 Min. präparativ: 5%-80% (in einem Zeitraum von 40 Min.
Reinheit: >90% (pAntp (43-58)),
Gradient: analyt. 5%-80% (in einem Zeitraum von 35 Min. präparativ: 5%->80% (in einem Zeitraum von 40 Min.
Reinheit: >90% (NLS (SV40-T) ;
Gradient: analyt. 5%→80% (in einem Zeitraum von 35 Min. präparativ: 5%—»80% (in einem Zeitraum von 40 Min.
Reinheit: >90%.
Peptidverknüpfunge :
Cysteingruppen des Transmembranpeptids pAntp (43-58) und des Adressproteins (NLS) (Kalderon, D. et al., Cell 39, S. 499- 509 (1984)) wurden in einem Bereich von 2 mg/ml in einer 20% DMSO/Wasser-Lösung oxidiert. Die Reaktion war nach etwa 5 Stunden vollständig abgelaufen. Das Fortschreiten der Oxidation wurde über eine analytische C18 Umkehrphasen-HPLC überwacht (Tarn et al., J.Amer.Chem.Soc. 113 (1991)). Die Komponenten wurden nach der Merrifield-Methode verknüpft (Merrifield, J. Americ. Chem. Soc. JL5_ (1963) , 2149) .
(C) Messungen des Zellwachstums
Messungen des Wachstums der S-HeLa-Zellen in Abhängigkeit von den verabreichten PNA-Konjugaten wurden mittels einem „FACS Calibur Flowcytometer,, (Becton Dickinson Cytometry Systems, San Jose, CA) durchgeführt.
(D) Durchflußzytometrie Die Auswirkung der PNA-Konjugate auf die Lebensfähigkeit der
Zellen und die Zellzyklusverteilung wurden über
Durchflußzytomterie bestimmt. Die Durchflußzytomterie-
Analysen wurden mit einem „PAS II„ -Durchflußzytometer
(Partec, Münster, Deutschland) durchgeführt, der mit einer 100 Watt Quecksilberdampflampe ausgerüstet war und Filterkombinationen für mit 2,4-Diamidino-2-Phenylindol
(DAPI) gefärbten Zellen. Die Zellen wurden von nativen Proben bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln mit 2,1% Zitronensäure / 0,5% Tween® 20 gemäß dem Verfahren von de Villiers et al . , Gynecol .Oncol . 44 (1992), 33-39, mit leichten Modifikationen isoliert. Für die Färbung der Zellsuspensionen wurde DAPI enthaltender Phosphatpuffer (7,2 g Na2HP04 x 2 H20 in 100 ml H20) , pH-Wert 8,0) verwendet. Jedes Histogramm repräsentiert 30.000 bis 100.000 Zellen zur Messung des DNA-Index und des Zellzyklus. Zur Analyse der Histogramme wurde das „Multicycle,, -Programm von Phoenix Flow Systems, San Diego, CA, verwendet. Humane Lymphozyten-Nuclei von gesunden Spendern wurden als interne Standards zur Bestimmung der diploiden Zellpopulation verwendet. Der mittlere Variationskoeffizient (CV) der diploiden Lymphozyten betrug 0,8 bis 1,0.
Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde über ein neues Durchflußzytometrieverfahren bestimmt. Dazu wurden die Zellen mit den PNA-Konjugaten (100 pM) 24 bzw. 48 Stunden inkubiert. Als Kontrolle dienten unbehandelte Zellen. Die Analysen wurden in einem „FACS Calibur,, -Durchflußzytometer (Becton Dickinson Cytometrie Systems, San Jose, CA) unter Verwendung der Vorwärts- und Seitwärtsstreuung durchgeführt und die relativen Fluoreszenzintensitäten der mit Propidiumjodid gefärbten nativen Zellen auf dem F2-Kanal bei logarithmischer Gradeinteilung gemessen. Tote Zellen sind für Propidiumdijodid positiv und gefärbte rote, lebende Zellen bleiben ungefärbt. Die Positionen in einem logarithmischen
Histogramm sind für ungefärbte Zellen in der linken Ecke, tote Zellen sind in der rechten Ecke plaziert. Bei allen beschriebenen Experimenten wurde die gleiche Art von lebenden
HeLa-Zellen verwendet.
(E) Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) Die Aufnahme und der zelluläre Transport der gegen ein HPV18 E6- und/oder E7-Gen gerichteten PNA-Konjugate wurden in lebenden Zellen mittels CLSM überwacht. Mit PNA-Konjuga en inkubierte S-HeLa-Suspensionstumorzellen wurden auf mit „Cell-Tak®„ (Becton Dickinson, Katalog-Nr. 354240) behandelten Glasträgern immobilisiert, die in „quadriPERM® plus,, Petrischalen (Heraeus Instruments GmbH, 37520 Osterode, Deutschland) eingebettet waren. Lebende Zellen wurden entweder mittels konventioneller Epifluoreszenzmikroskopie (Zeiss, Oberkochen, Deutschland,) oder CLSM (Leitz, Wetzlar, Deutschland,) analysiert. Während der CLSM wurde zur Mini isierung der Störung lebender Zellen durch Laserlicht die Ausgangsleistung verringert. Zur Steigerung des Kontraste der optischen Sektionen wurde der Mittelwert aus 12 bis 20 Einzelbelichtungen verwendet.
Beispiel 2
Ergebnisse der Bestimmung der Lokalisierung und zellulären
Aufnahme der PNA-Konjugate über CSLM
Es wurde der Einfluß des PNA-Tranports in den Nukleus auf das Wachstumsverhalten von HeLa-Zellen mittels CLSM untersucht (Tabelle 1; #PNA7 (E6-DNA-Bereiche 3' -375-389/463-488-5' und £?7-DNA-Bereich 3' -597-612-5' )) . Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt, die den Transport von #PNA7 und dessen Effizienz dokumentiert. Figur 8 zeigt außerdem eine DIC(Differentielle Interferenz-Phasenkontrastmikroskopie) -
Aufnahme, die belegt, daß das Konstrukt #PNA7 von jeder Zelle aufgenommen wird.
Beispiel 3 Bestimmung der Auswirkung der PNA-Konjugate auf das
Zellwachstum
Es wurde die Wachstumshemmung von S-HeLa-Zellen durch sieben unterschiedliche PNA-Konstrukte (#PNAl-7) untersucht. Um sicherzustellen, daß bei diesen Untersuchungen die in den S- HeLa-Zellen exprimierten E6 bzw. E7-Konjugate funktioneil waren, wurde die Fähigkeit zur Beeinträchtigung der transkriptionellen Aktivierung von E6/E7 untersucht. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt und dreimal wiederholt. Die Auswirkungen der anti-Gen-PNA-Moleküle mit randomisierten PNA-Sequenzen und unbehandelte Kontrollzellen wurden verglichen (Figuren 1 und 2) .
Tabelle 1
Zielgene, DNA-Bereich und PNA- Sequenzen Konjugat Zielgen DNA-Bereich PNA(amino) -Sequenz- (carboxy)
#1 ES 375-389 TTA CTT TTT GCT GCT #2 E6 441-459 GCT CGT GCT GTC CTT TCT
#3 Ξ6 463-488 (Stop-TAA) TTG CTG CGT CTC TTT GTG TTC ATA TT
#4 E7 597-612 TCT CCT TCT TTT GCT #5 Zufal1ssequenz - CTA ATC GCT ATC CCT
TTC TCT
#6 E6 1/E6 2 375-389/441-459 PNA #1 + PNA #2 #7 E6 1/E6 3/E7 4 375-389/463- PNA #1 + PNA #3 +
488/597-612 PNA #4
#8 unbehandelte Zellen Tabelle 2
Chemisches Design der verwendeten Transportmodule (CLSM, DIC)
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Schematisch können die beschriebenen Konjugate wie folgt dargestellt werden:
Zielgen Spacer Adresspeptid spaltbarer Spacer Transportpetid E6 -K-K -NLS-Cys- S-H H-S Cys-TPUhum
(A) Auswirkung des Zufalls-PNA-Konjugats auf das Zellwachstum Zur Identifizierung eines unspezifischen PNA-Effekts auf das Wachstum der S-HeLa-Zellen wurde eine randomisierte PNA- Sequenz verwendet (Tabelle 1; #PNA5) . Die Verabreichung wurde unter identischen Behandlungsbedingungen durchgeführt. Bei allen angewandten Verfahren konnte kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Zellzahl und des Zellzyklusverhaltens zwischen mit #PNA5 behandelten und unbehandelten S-HeLa-Zellen beobachtet werden.
(B) Auswirkung eines Einzel-E6-PNA-Konjuqats auf das
Zellwachstum
Figuren 1 und 2 zeigen die durchschnittlichen Ergebnisse der Experimente. #PNA1 (E6-DNA-Bereich 3' -375-389-5' Map- Position) und #PNA2 (E6-DNA-Bereich 3' -441-459-5' Map- Position) konnten die Proliferation von S-HeLa-Zellen leicht reprimieren. Mit #PNA3 (E6-DNA-Bereich 3' -463-488-5' Map- Position) konnte das Zellwachstum bereits nach 48 Stunden Inkubationszeit zu etwa 40% gehemmt werden.
(C) Auswirkung doppelter E6-PNA-Konjugate auf das Zellwachstum
Zur Erhöhung des biologischen Effekts der E6-PNA-Konjugate auf S-HeLa-Zellen wurde #PNA6 als Kombination der beiden gegen E6 gerichteten Konjugate #PNA1 und #PNA2 verwendet. Diese Kombination führte zu einer Reduktion der HeLa-Zellen (60%) nach 24 bzw. 48 Stunden Inkubationszeit (Figuren 1 und 2).
(D) Auswirkung eines E7-PNA-Konjugats auf das Zellwachstum #PNA7 (E7-DNA-Bereich 3' -597-612-5' (Figur 1 und 2) allein führt zu einer leichten Repression des Wachstums von S-HeLa- Zellen innerhalb 24 bzw. 48 Stunden Inkubationszeit.
(E) Auswirkung gemischter E6/E7rPNA-Konjugate auf das
Zellwachstum
Eine Kombination von #PNA1, #PNA3 und PNA4 (= #PNA7) führte zu einer etwa 90%igen Hemmung des Zellwachstums in Kultur im Vergleich zu der Kontrolle bei einer Inkubationszeit von 72 Stunden. Nach 24 Stunden Inkubationszeit ist das Zellwachstum noch nicht sehr stark herabgesetzt, wobei man u.U. davon ausgehen kann, daß nach Inkubation mit #PNA7 die HeLa-Zellen noch einen Zellzyklus durchlaufen müssen. Auffällig ist, daß die S-HeLa-Suspensions-Zellen nach Verabreichung von #PNA7 nach 48 Stunden Inkubation eine morphologische Veränderung zu anhaftenden Zellen zeigten. Beispiel 3 Ergebnisse der Durchflußzytometrie
Zur weiteren Untersuchung der Möglichkeit einer auf anti-Gen- PNAs basierenden Therapie des Zervixkarzinoms und zur Unterstützung der Daten aus Beispiel 2 wurde die Auswirkung von HP18 E6 und E7 anti-Gen-PNAs auf die humane Zervixkarzinom-Suspensionszellinie S-HeLa weiter untersucht. Dazu wurde der Effekt der PNAs auf integriertes HPV 18 E6/E7 mittels des FACS-Analyseverfahrens bestimmt. Bei allen Studien wurde eine PNA-Konzentration von 100 pM wie vorstehend beschrieben verwendet, wobei eine helle Färbung bei der CLSM erhalten wurde und ein Durchflußzytometrie- Signal, das von den durch PNA-Zufallssequenzen und unbehandelten Zellen ausgelösten Signalen leicht unterschieden werden konnte.
(A) Auswirkung des Zufalls-PNA-Konjugats auf das Zellwachstum Die Verabreichung des Zufalls-Konjugats #PNA5 erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie für die übrigen Konjugate. Es konnte kein signifikanter Unterschied zwischen mit Zufalls- PNA behandelten und unbehandelten HeLa-S-Zellen hinsichtlich Zellzahl und Lebensfähigkeit der Zellen nachgewiesen werden.
(B) Auswirkung eines Einzel-E6-PNA-Konjugats und eines Einzel-E7-Kon ugats auf das Zellwachstum
Die Figuren 1 und 2 zeigen, daß Doppelbehandlungen mit #PNA1 (E6-DNA-Bereich 3' -375-389-5' ) und #PNA2 (E6-DNA-Bereich 3'- 441-459-5') die Lebensfähigkeit der HeLa-S-Zellen nicht beeinflussen konnten. Auch die EinzelVerabreichung von #PNA4 (E7-DNA-Bereich 3' -597-612-5#) (Figuren 1 und 2) hatte keine Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der HeLa-S-Zellen während der Inkubationsdauer von 24 bzw. 48 Stunden. (C) Auswirkung doppelter E6-PNA-Konjugate auf das Zellwachstum
Mittels Durchflusszytometrie-Analysen wurde die Beteiligung von #PNA6 (PNA1 E6 λ3-375-389-5' , PNA2 E6 3-441-459-5 ' ) an der Lebensfähigkeit von kultivierten Zervix-HeLa-S- Suspensionszellen untersucht. Es konnte kein Einfluß auf die Lebensfähigkeit der HeLa-S-Zellen beobachtet werden.
(D) Auswirkung gemischter E6/E7-PNA-Konjugate auf das
Zellwachstum
Mittels Durchflußzytometrie konnte nachgewiesen werden, daß #PNA7 nach 24 Stunden Inkubation eine partielle Apoptose von Cervixarzinom-Suspensionszellen S-HeLa induzieren konnte. Überraschenderweise waren haftende S-HeLa-Zellen nach 24 Stunden Inkubation mit #PNA7 nachweisbar. Eine apoptotische Zellfraktion konnte mittels Durchflußzytometrie nicht beobachtet werden. Die Daten der Durchflußzytometrie- Verfahren legen jedoch eine morphologische Veränderung der Zellmembran nahe. Diese Ergebnisse liefern eine mögliche Erklärung für den anti-Gen-Effekt gegen E6- und E7-Gene und dessen Rolle bei der Zytoskelettprotein-Interaktion.
Beispiel 4 Ergebnisse der Untersuchungen zur Zellzyklusverteilung und
Apoptose
HeLa-S-Zellen sind stark proliferierende diploide Zellen mit einem G0/l-Peak, einer S-Phase-Fraktion (zu etwa 30%) und einer G2+M-Phase (zu etwa 15%) . Apoptotische Zellfraktionen zeichnen sich durch einen Sub-G0/1-Peak aus, was ein Anzeichen für einen verringerten DNA-Gehalt ist. In Kontrollzellen zeigten sich während des ZüchtungsZeitraums keine signifikanten Änderungen hinsichtlich der Zellzyklusverteilung. Lediglich nach 72 h war die Menge an Zeil-Debris - als eine Auswirkung der Züchtungsdauer - höher. Im Gegensatz dazu war die Zellzahl behandelter gezüchteter Zellen nach 24 h eindeutig verringert. Nach 48 h glich die Zellzahl der in der Kontrollkultur, das Zellwachstum schien jedoch verringert zu sein. Nach 72 h war eine stark verringerte Zellzahl ohne Anzeichen von Wachstum zu beobachten. Sowohl in der Kontrollkultur als auch bei der behandelten Zellkultur konnte keine eindeutige apoptotische Zellfraktion als Sub-Gl-Peak nachgewiesen werden.
Auswirkung zweier unabhängiger kombinierter E6/E7-Konjugate auf die Zellzyklusverteilung und Apoptose: Mit #PNA7 behandelte HeLa-S-Zellen zeigen nach der Verabreichung des Konjugats eine Veränderung der Zellzyklusverteilung. Außerdem konnten mittels Durchflusszytometrie nach 48 h keine apoptotischen Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Verabreichung der kombinierten, gegen das E6- und E7-Gen gerichteten #PNA7-Konstrukte HeLa-S-Zellen von dem HPV18 E6/E7-vermittelten Wachstum durch Hemmung der Expression der E6- und E7-Gene befreien kann.

Claims

Patentansprüche
1. Konjugat oder Konjugat-Gemisch zur Hemmung der Expression eines HPV E6-Gens und/oder HPV E7-Gens, wobei das Konjugat die folgenden Komponenten aufweist: einen Transportvermittler für die Zellmembran, ein Adressprotein bzw. -peptid für den Import in den Zellkern, und eine oder mehrere zu transportierende, mit einem HPV E6- Gen und/oder HPV E7-Gen hybridisierbare Peptid- Nukleinsäuren (PNAs) .
2. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 1, wobei der Transportvermittler ein Peptid oder Protein ist, das die Plasmamembran überwinden kann.
3. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Transportvermittler das Tranömembranpeptid pAntp (43-58) oder TPF(hum) ist.
4. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Adressprotein bzw. -peptid ausgewählt ist aus :
-Pro-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val- ; und H3N+-Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-
5. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Konjugat folgende Struktur hat: Transportvermittler -Adressprotein -Peptid-Nukleinsäure (PNA) .
6. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei außerdem ein Spacer vorhanden ist.
7. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 6, wobei sich der Spacer zwischen dem Adressprotein und der Peptid-Nukleinsäure (PNA) befindet.
8. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 6 oder 7, wobei der Spacer Polylysin, Polyethylenglykol oder Polyvinylpyrrolidon ist.
9. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach Anspruch 8, wobei die Peptid-Nukleinsäure eine Sequenz ausgewählt aus der folgenden Gruppe umfaßt:
(a) TTA CTT TTT GCT GCT;
(b) GCT CGT GCT GTC CTT TCT;
(c) TTG CTG CGT CTC TTT GTG TTC ATA TT; und
(d) TCT CCT TCT TTT GCT.
10. Konjugat-Gemisch nach Anspruch 9, das ein Konjugat mit der Sequenz (a) , ein Konjugat mit der Sequenz (c) und ein Konjugat mit der Sequenz (d) umfaßt.
11. Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das HPV HPV16 oder HPV18 ist.
12. Arzneimittel, ein Konjugat oder Konjugat-Gemisch nach einem der Ansprüche 1 bis 11 enthaltend.
13. Verwendung eines Konjugats oder Konjugat-Gemischs nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Prophylaxe oder Therapie des Zerviskarzinoms .
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