WO2003035665A1 - Modifizierte l-nukleinsäure - Google Patents

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WO2003035665A1
WO2003035665A1 PCT/EP2002/011950 EP0211950W WO03035665A1 WO 2003035665 A1 WO2003035665 A1 WO 2003035665A1 EP 0211950 W EP0211950 W EP 0211950W WO 03035665 A1 WO03035665 A1 WO 03035665A1
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nucleic acid
modified
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linker
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PCT/EP2002/011950
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Christian Lange
Bernd Eschgfäller
Sven Klussmann
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Noxxon Pharma Ag
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Definitions

  • the present invention relates to modified L-nucleic acids, their use and methods for their production.
  • aptamers which have already been developed against a large number of different biomolecules.
  • aptamers which are characterized by a particularly high affinity for their target structure, are isolated in several stages by in vitro selection. Methods for producing such aptamers are described, for example, in European patent application EP 0 533 838.
  • the so-called Spiegelmeres are another form of functional nucleic acids.
  • the Spiegelmers also bind specifically to a target sequence, but here, using a D-nucleic acid library, selection is made against the enantiomeric form of the target and the D-nucleic acids that bind to it are then produced as L-nucleic acids and, as a result of the chiral reciprocity to the actual target and cannot bind to the enantiomeric form used for the selection process.
  • Methods for producing such Spiegelmers are described, for example, in international patent application WO 98/08856.
  • Spiegelmers are L-nucleic acids, typically L-oligonucleotides, which can practically not be broken down by natural enzymes due to their structure from L-nucleotides. In addition to the target molecule specificity, it qualifies this property for use in a wide variety of areas such as analysis of biological samples, diagnosis and therapy.
  • the object is achieved in a first aspect by an L-nucleic acid comprising an L-nucleic acid part and a non-L-nucleic acid part, the conjugation with the non-L-nucleic acid part resulting in a slow excretion from an organism or renal clearance leads compared to an L-nucleic acid comprising only the L-nucleic acid part.
  • the object on which the invention is based is achieved by a modified L-nucleic acid comprising an L-nucleic acid part and a non-L-nucleic acid part, the conjugation with the non-L-nucleic acid part resulting in an increased residence time in leads to an organism, compared to an L-nucleic acid comprising only the L-nucleic acid part.
  • the object on which the invention is based is achieved by a modified L-nucleic acid, in particular a modified L-nucleic acid according to the invention, comprising an L-nucleic acid part and a non-L-nucleic acid part, the non-L- Nucleic acid portion has a molecular weight greater than about 300 Da, preferably more than about 20,000 Da, and more preferably more than about 40,000 Da
  • the L-nucleic acid part is conjugated with the non-L-nucleic acid part and the non-L-nucleic acid part has a molecular weight of more than about 300 Da, preferably more than about 20,000 Da, and preferably more than about 40,000 Da.
  • the modified L-nucleic acid has a molecular weight of about 600 to 500,000 Da, preferably of about 10,000 to 400,000 Da, more preferably of about 50,000 to 300,000 Da.
  • the L-nucleic acid part has a molecular weight of 300 to 50,000 Da, preferably from 5,000 to 25,000 Da, more preferably from 7,000 to 15,000 Da.
  • the non-L-nucleic acid part is linked directly or indirectly to the L-nucleic acid part via a functional group of the L-nucleic acid part which is linked to one of the following Constituents of the L-nucleic acid are present or bound, the functional group being selected from the group consisting of terminal and non-terminal phosphates, terminal and non-terminal sugar fractions and natural and non-natural purine and natural and non-natural pyrimidine Bases includes.
  • the linkage of the non-L-nucleic acid part with the L-nucleic acid part via the 2'-OH, 3'-OH and / or 5'-OH Group or a derivative thereof one or more of the sugar portions of the L-nucleic acid portion is present.
  • the linkage is present via at least one of the positions 5
  • the linkage is present via at least one of the position 8 of the purine bases.
  • the linkage is present on one or more of the ex-cyclic and / or endocyclic amine groups and / or keto groups of the purine and / or pyrimidine bases and / or abasic position (s) ,
  • the non-nucleic acid part is selected from the group consisting of linear poly (ethylene) glycol, branched poly (ethylene) glycol, hydroxyethyl starch, peptides, proteins, polysaccharides, sterols, Polyoxypropylene, polyoxyamidates, poly (2-hydr [oxyethyl) -L-glutami ⁇ ij precise polyethylene glycol.
  • a linker is arranged between the L-nucleic acid part and the non-L-nucleic acid part.
  • the L-nucleic acid part comprises a nucleic acid according to SEQ ID NO. 1.
  • the L-nucleic acid part at the 5'-OH end has 6J-aminohexylphosphate as a linker.
  • polyethylene glycol is coupled to the free amine of the aminohexyl phosphate linker.
  • the object is achieved by using the L-nucleic acids according to the invention as a diagnostic or diagnostic agent.
  • the object on which the invention is based is achieved by using the modified L-nucleic acids according to the invention for the manufacture of a medicament.
  • the object is achieved by a method for providing a modified L-nucleic acid, in particular the nucleic acids according to the invention, comprising an L-nucleic acid part and a non-L-nucleic acid part, the following steps
  • the L-nucleic acid in step a) comprises a linker.
  • the non-L-nucleic acid part comprises a linker or that after providing the non-L-nucleic acid in step b) it is provided with a linker.
  • the present invention is based on the surprising finding that when L-nucleic acids are used in an organism, such as, for example, a mammalian organism, and very particularly in a mammal, which is preferably selected from the group consisting of humans, monkeys, dogs, cats and sheep , Goats, rabbits, guinea pigs, mice and rats, although L-nucleic acids are not metabolized, which is because that the nucleases normally occurring in such organisms do not recognize L-nucleic acids as a substrate due to their stereospecificity, the biological half-life of the L-nucleic acids in the said organism is nevertheless comparatively short.
  • an organism such as, for example, a mammalian organism, and very particularly in a mammal, which is preferably selected from the group consisting of humans, monkeys, dogs, cats and sheep , Goats, rabbits, guinea pigs, mice and rats
  • L-nucleic acids are not metabolized, which is because that the
  • the stability of the non-modified L-nucleic acids is significantly increased compared to the stability of non-modified D-nucleic acids. It has now surprisingly been possible to show that the modification increases the half-life of L-nucleic acids more than that of the modification of D-nucleic acids. Thus, as a result of the modification of nucleic acids, there is a completely unexpected change in the half-life of the modified L-nucleic acids compared to the half-life of the modified D-nucleic acids, whose half-lives are otherwise similar in the unmodified form.
  • GnRH Gonadotropin follicle-stimulating hormone
  • FSH Fluorescence Stimulation Hormone
  • LH Luteinizing Hormone
  • Spiegelmer-PEG conjugate provides an example of a modified L-
  • the GnRH-Spiegelmer corresponds to the L-nucleic acid part and the PEG to the non-L-nucleic acid part.
  • glomerular filtration rate of the kidneys with respect to the modified L-nucleic acids is significantly reduced compared to that of the unmodified L-nucleic acids, which leads to an increased retention time, ie biological half-life of the modified L-nucleic acid compared to the retention time of the corresponding but unmodified L-
  • the modified L-nucleic acid ie in particular the L-nucleic acid part thereof responsible for the target molecule specificity, has its specificity; obviously doesn't lose anything.
  • the modified L-nucleic acids according to the invention thus have, in a completely surprising manner, those properties which cannot otherwise be achieved with other pharmaceutically active compounds, namely that of extensive galenical formulations, for example in the form of depot preparations which gradually release the active ingredient, can be dispensed with and rather a direct modification of the active substance in question can be brought about without adversely affecting its biological activity, in the case of Spiegelmers in particular expressed as the specificity of the reaction or complex formation with its respective target molecule.
  • the modified L-nucleic acids according to the invention overcome the incompatibility of specific activity of the pharmaceutical active substance which otherwise exists in the case of pharmaceutically active substances and in particular in the case of small active substance molecules, with an increase in its residence time in an organism, in particular with a reduction in the excretion, for example in the glomerular form filtration rate. It is remarkable that the Affinity of the L-nucleic acid part remains essentially unchanged due to the conjugation with the non-L-nucleic acid part.
  • the diagnostic agent can be used in terms of its residence time, ie. H. its biological half-life, optimally adjusted
  • Nucleic acid can be adapted exactly to the requirements.
  • the non-L-nucleic acid part consists of one or more non-immunogenic compounds. Alternatively, but possibly also in addition to this, these can be lipophilic compounds as well as hydrophilic compounds. It is obvious to a person skilled in the art that Depending on the general conditions of the individual case, it may also be possible to use slightly immunogenic compounds, especially if the modified L-nucleic acid according to the invention is not to be administered over a longer period or several times, but only once.
  • this aspect is of particular importance when the modified L-nucleic acids according to the invention have to be administered over a longer period or several times. It will usually be ensured that the non-L-nucleic acid part. the modified L-nucleic acid does not produce an immune response when the modified L-nucleic acid is applied, which would lead to an immunological or allergic reaction if the same were administered again.
  • the non-L-nucleic acid part of the modified L-nucleic acid can also be designed in such a way that more than one non-L-nucleic acid part is bound or conjugated to one: ⁇ L-nucleic acid part.
  • the individual non-L-nucleic acid part is preferably a polymer, and the subunits of the polymer can have a comparatively low molecular weight. It is also within the scope of the present invention that more than one L-nucleic acid part is attached to a non-L-nucleic acid
  • nucleic acid is to address the Spiegelmers to certain
  • the specific ratios of the non-L-nucleic acid part can be adapted so that, regardless of the specificity of the binding of the
  • Mirror bucket or the modified L-nucleic acid which enriches the modified L-nucleic acid preferably in certain cells, tissues or organs.
  • the molecular weight of the non-L nucleic acid portion is between 300 and 500,000 Da.
  • the L-nucleic acid part can be coupled to the same or different sites of the L-nucleic acid part of the modified L-nucleic acid either individually, repeatedly, or in any combination with other non-L-nucleic acid parts. It is within the scope of the present invention that the molecular weight of the modified L-
  • Nucleic acid is strongly determined by the non-L-nucleic acid part.
  • the modified L-nucleic acid can have a molecular weight of about 600 to 50,000 Da, preferably from about 10,000 to 400,000 Da and more preferably from about 50,000 to
  • Conjugates are and often have a molecular weight of about 100 kDa to 500 kDa. In the event that the modified L-nucleic acids are PEG conjugates, this is preferred
  • non-L-nucleic acid part i
  • Polyethers and alkoxypolyethers e.g. linear or branched poly (ethylene) glycols (PEG),
  • Methoxypoly (ethylene) glycols Methoxypoly (ethylene) glycols, ethoxypoly (ethylene) glycols, precise PEG (being precise PEG a)
  • Is polyamide form (-NH-Y-NH-CO-X-CO-), with Y and X on each.
  • the position can be varied i as (-CH 2 CH 2 O-) p with different p in the range of 4-6), poly (2-hydroxyethyl) -L-glutamines and polyoxypropylenes, which are characterized in particular by the fact that they are not are metabolizable in vivo and in so far as the size, ie [the molecular weight of the modified L-nucleic acid effect of the controlled excretion is particularly pronounced and are not superimposed by degradation processes on the non-L-nucleic acid part.
  • Peptides, polypeptides and proteins such as e.g. Albumin, where these compounds can be both naturally existing and externally added substances.
  • hydroxyethyl starch preferably between 40 kDa and 400 kDa, preferably between 100 kDa and 300 kDa.
  • Hydroxyethyl starch has a molar degree of substitution from 0.1 to 0.8 and a ratio of C 2 : C 6 in the range from 2 to 20.
  • Sterols e.g. Cholesterol.
  • sterols are distinguished by a comparatively low molecular weight, this can also lead to an increase in the residence time of the L-nucleic acid modified therewith.
  • the Ni'cht-L nucleic acid part is also formed by one or more D-nucleosides or D-nucleotides, whereby these, individually or as a whole, may have further modifications, such as modifications to increase the Stability in biological
  • modifications represent, for example, the fluorination at the position 2 'of the sugar component of the nucleotides or nucleosides.
  • these D-nucleosides and D-nucleotides can be components of the various non-L-nucleic acids, in particular those of the abovementioned, but also part of one of the linkers described herein. It is within the scope of the present invention that one or more of the D-nucleosides or D-nucleotides can also comprise one or more abasic positions!
  • the linking of the L-nucleic acid part with one or more of the non-L-nucleic acid parts can in principle take place on all components or groupings of the two parts making up the modified L-nucleic acid, it also being possible to provide for derivatizations on one or more Make one or both parts, ie on the L-nucleic acid as well as the non-L-nucleic acid part (s).
  • the linkage can take place in particular on the 5 '-OH, 3' -OH or 2 '-OH group of the L-nucleic acid, in particular the ribose or deoxyribose part thereof.
  • the sugar constituents of the nucleotides that make up the L-nucleic acid can have a sugar other than ribose or deoxyribose.
  • Such sugars can be, for example, further pentoses such as arabinose, but also hexoses or tetroses or a Contain nitrogen atom as for example in a morpholino ring or aza or thio sugar or further sugar modifications as in locked nucleic acids (LNA) or peptide nucleic acids (PNA).
  • LNA locked nucleic acids
  • PNA peptide nucleic acids
  • These OH groups can be present as NH -, SH -, aldehyde- by suitable chemical modification. , Carboxy acid, phosphate, iodine, bromine or chlorine groups.
  • phosphate groups of the nuclide building up the modified L-nucleic acid have modifications.
  • modifications are, for example, phosphothioates, phosphodithioates, phosphoramidates, phosphonates and other modifications known to those skilled in the art.
  • the sugar part of the L-nucleic acid part can also be linked to the phosphate backbone, here as in connection with the link via the ribose or
  • the L-nucleic acid can also contain one or more non-natural bases, e.g. Isoguanidine, isocytidine, xanthosine, inosine, 2,4-diaminopyrimidine. It is within the scope of the present invention that any of the linkages described herein between the L-nucleic acid part and the non-nucleic acid part can take place directly or indirectly. An indirect link exists in particular if there is
  • a linker for example a linker described herein
  • linkers can be incorporated between the L-nucleic acid part and the non-L-nucleic acid part (s).
  • a linker typically consists of at least one functional group and a spacer.
  • the function of the linker can be to facilitate the coupling reaction.
  • it can have a function such that a spatial distance is built up between the L-nucleic acid part and the non-L-nucleic acid part of the modified L-nucleic acid.
  • Such a distance is advantageous under certain conditions, for example when there are interactions between the parts that make up the modified L-nucleic acid in particular between the L-nucleic acid part and the non-L-nucleic acid part or between two or more non-L-nucleic acid parts of the modified L-nucleic acid are to be prevented.
  • the linker itself can in turn comprise one or more functional groups and be coupled to the L-nucleic acid part at one of the above-mentioned sites.
  • the spacer typically consists, inter alia, of alkyl chains of different lengths, a chain length of 1 to 20, in particular 4 to 15 and very particularly 6 to 12 carbon atoms being preferred.
  • the alkyl chain can itself be branched or can carry further functional groups.
  • a typical embodiment of the spacer comprises ether linkages between individual monomers such as are present, for example, in the case of poly (ethylene) glycol or polyoxypropylene, the individual monomers often being present here in the polymers from 1 to 20 times. Even when the spacer is formed by polyamine alkyl or polyamidoalkyl chains, a frequency of the monomers comprising these 11 polymers with a value of 1 to 201 is common.
  • the linker can either be coupled to one of the L-nucleotides that form the L-nucleic acid part of the modified L-nucleic acid. Alternatively, the linker can also be incorporated into the resulting oligomer during the enzymatic or chemical synthesis of the L-nucleic acid. Furthermore, it is within the scope of the present invention that the L-nucleic acid is modified post-synthetically and thereby provided with a linker for the coupling of a non-L-nucleic acid part.
  • a linker is installed, for example, at an abasic position in a hairpin loop or at the 3 'or 5' end or another position.
  • the L-nucleic acid is a Spiegelmsr
  • the abasic position can be built in at a position of the mirror bucket that is not essential for the binding of the target molecule or for the structure of the mirror bucket.
  • the abasic position is intended to denote a position of the L-nucleic acid part which is analogous to a normal L nucleotide has the same backbone of phosphate and sugar in which the
  • nucleobase is substituted by a hydrogen atom or a linker, as is also shown in FIG. 24.
  • L-nucleic acid J conjugates can, as already from the list given above with regard to the
  • Acid amides can be made by reacting N-hydroxysuccinimide
  • Thioethers can be prepared from a halide and a thiol 3> 4 and then subject to oxidation to sulfoxide or sulfone 5> 6.
  • Halides in particular haloacetyl (iodoacetic acid, bromoacetic acid), can be coupled to any functional group of one of the two L-nucleic acid parts via an ester or acid amide bond and then the very reactive iodine or bromine group can be coupled with a free thiol.
  • Haloacetyl is therefore a special case of halide-thiol coupling. 1
  • Thioethers can also be prepared from maleimide and thiol '"",
  • em disulfide starting from a thiol and another thiol or a disulfide 21,22 5 hydrazones starting from a hydrazine and an aldehyde or a ketone, the hydrazone being further reduced to a stable modified hydrazine can be 23 5 phosphorothioates starting from a phosphate or an activated phosphoric acid such as phosphoroimidazolide and a thiol 2 5 phosphoramidate starting from a phosphate or an activated phosphoric acid such as phosphoroimidazolide or Phos-N-hydroxydbenzotriazole and an amine 24-27, it is im
  • the scope of the present invention is to first couple a linker to the L-nucleic acid part via a phosphoramidate or phosphothioate linkage and then to the non-L-nucleic acid part.
  • Such linkers can in particular
  • L-nucleic acid is used synonymously with the term L-oligonucleotides or L-polynucleotides and denotes, inter alia, both L-deoxyribonucleic acid and.
  • L-ribonucleic acid and combinations thereof ie that individual or a group of nucleotides is present as RNA and the other nucleotides that make up the nucleic acid are present as DNA and vice versa. It is also provided that other sugars form the sugar component of the nucleotide instead of deoxyribose or ribose.
  • nucleotides with further modifications at position 2 ' such as NH 2 , OMe, OEt, OAlkyl, NHAlkyl and the use of natural or unnatural nucleobases such as isocytidine, isoguanosine.
  • L-nucleic acid has so-called abasic positions, ie nucleotides that lack the nucleobase. Such abasic positions can be arranged both within the nucleotide sequence of the L-nucleic acid and at one or both of the ends, ie the 5 'and / or the 3' end.
  • the L-nucleic acid contains one or more D-nucleosides or D-nucleotides.
  • the one or more D-nucleosides or nucleotides can be arranged both within the L-nucleic acid and at one or both of the ends of the L-nucleic acid.
  • the individual D-nucleoside or D-nucleotide can carry one or more modifications, for example to increase the stability of the nucleoside or nuclotide or its binding to the L-nucleic acid.
  • the L-nucleic acid can in principle be double or single-stranded. Typically, it is a single-stranded L-nucleic acid, which, however, due to its primary sequence, can form defined secondary structures and thus also tertiary structures. In the secondary structure there are also double-stranded sections for a large number of L-nucleic acids.
  • the L-nucleic acids can also denote modifications with respect to the individual nucleoids of the nucleic acid.
  • the 2'-OH group of the sugar portion j of the nucleotides can be present as methyl ether, as already disclosed above.
  • the L-nucleic acids or L-nucleic acid parts described herein are preferably functional nucleic acids.
  • the functional nucleic acids include aptamers, Spiegelmers, ribozymes and aptazymes.
  • the L-nucleic acids or L-nucleic acid parts are preferably Spiegelmers.
  • Spiegelmers are nucleic acids which bind to a target molecule or a part thereof and are composed of L-nucleotides, at least in which the target molecule
  • the individual strands are separated using suitable methods, so that one again becomes a single strand library reached, which is used for the in vitro selection process if it is a DNA selection (Bock, LC, Griffin, LC, Latham, JA, Vermaas, EH and Toole, JJ, 1992, Nature, Vol. 355, 564-566).
  • a DNA selection Bock, LC, Griffin, LC, Latham, JA, Vermaas, EH and Toole, JJ, 1992, Nature, Vol. 355, 564-566.
  • a T7 promoter has previously been introduced, also via a suitable DNA-dependent polymerase, e.g. B. the T7 RNA polymerase, an RNA library.
  • RNA molecules Each molecule from this library has a different sequence and therefore a different three .di.mensi.onal structure.
  • the targets can e.g. B. Viruses, proteins, peptides, nucleic acids, small molecules such as metabolites of metabolism, pharmaceutical agents or their metabolites or other chemical, biochemical or biological components such as gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. and Yarus, 1995, Annu. Rev. Biochem.
  • Chain reaction are amplified.
  • a reverse transcription must be carried out before the amplification step by means of the polymerase chain reaction.
  • a library enriched after a first selection round can then be used in a new selection round, so that the molecules enriched in the first selection round have the chance
  • the step of the polymerase chain reaction opens up the possibility of introducing new mutations in the amplification, for example by varying the salt concentration.
  • the binding molecules After a sufficient number of rounds of selection and amplification, the binding molecules have established themselves.
  • the result is an enriched pool, the representatives of which can be isolated by cloning and then determined with the usual methods of sequence determination of DNA in their primary structure.
  • the sequences obtained are then checked for their binding properties with respect to the target.
  • the process for producing such aptamers is also referred to as the SELEX process and is described, for example, in EP
  • the best binding molecules can be shortened to their essential binding domain by shortening the primary sequences and can be represented by chemical or enzymatic synthesis.
  • a special form of aptamers which can be produced in this way are the so-called Spiegelmers, which are essentially characterized in that they are at least partially, preferably completely, composed of the non-natural L-nucleotides.
  • Methods for producing such Spiegelmers are described in PCT / EP97 / 04726, the disclosure of which is hereby incorporated by reference.
  • the peculiarity of the method described therein lies in the generation of enantiomeric nucleic acid molecules, i.e. from L-
  • Nucleic acid molecules attached to a native i.e. bind in the natural form or configuration i present target or such a target structure.
  • the in vitro selection method described is used to first bind nucleic acids or sequences against the enantiomers, i.e. select non-naturally occurring structure of a naturally occurring target, for example in the case that the target molecule is a protein, against a D-protein.
  • the binding molecules thus obtained (D DNA, D-RNA or corresponding D derivatives) are determined in their sequence and the identical sequence is then synthesized with mirror-image nucleotide building blocks (L-nucleotides or L-nucleotide derivatives).
  • the mirror-image, enantiomeric nucleic acids thus obtained (L-DNA, L-RNA or corresponding L-derivatives), so-called Spiegelmers, have a mirror-image tertiary structure for reasons of symmetry and thus a binding property for the target in its natural form or configuration.
  • target molecules described above can be molecules
  • Nucleic acid part of a modified L-nucleic acid can be coupled to the L-nucleic acid part via the amine group and thus the modified L-nucleic acid according to the invention can be formed.
  • FIG. 2 shows further linkers, the structures referring to (2), (4) and (6) being the same
  • the phosphate part provided with the radical R preferably represents the L-nucleic acid part and, via the functional group denoted by X, the non-L-nucleic acid part the modified L-nucleic acid is coupled to 1 the L-nucleic acid.
  • oligo stands for an example
  • Oligonucleotide it also being within the scope of protection of the present invention that it or the L-nucleic acids or nucleic acid parts herein can generally be L-polynucleotides
  • ZZ 2 , Z 3 , Z 4 , Z 5 and Z 6 H, Me, alkyl, HO (CH 2 ) n , HOJ H 2 N (CH 2 ) n , H 2 N, F, where n is an integer between 1 and 20 and where alkyl is linear and branched hydrocarbon chains with preferably 1-20 C atoms, more preferably 1 to 4 C atoms and / or - (CH 2 ) n H, CH [(CH 2 ) n H] [(CH 2 ) m H], -C [(CH 2 ) n H] [(CH 2 ) m H] [(CH 2 ), H],
  • n, m, 1, k and j are independently integers between 1 and 8, preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • Fig. 3 shows an overview of different linkers that at different positions of the
  • Alkoxy denotes in particular linear and branched oxy-hydrocarbon chains with 1-20 C atoms, preferably 1 to 4 C atoms and / or -O (CH 2 ) n H, - OCH [(CH 2 ) n H] [(CH 2 ) m H], -OC [(CH 2 ) n E:] [(CH 2 ) m H] [(CH 2 ), H],
  • n, m, 1, k and j are, independently of one another, integers between 1 and 20, preferably 1 to 4 carbon atoms.
  • the actual linker structure for all four nucleosides shown is (1), (2), (3) and (4) Xp [Y] n , where n is an integer between 0 and 20.
  • Xi represents a functional group which is selected from the group comprising HO, H 2 N, HRN, HS, SSR, Hai, CHO, COOH, COOR and COHal.
  • n is likewise an integer between 0 and 20 and Z is, independently of other substituents, en eder O, NH, NR or S, where R is alkyl, as defined herein.
  • the linker R has the structure - [Y] n -X ⁇ and can preferably take the forms shown in the structures (2) to (9), Z here too, regardless of the choice of the other substituents O, NH, NHR or S can mean and n can be an integer between 1 and 20.
  • the functional group Xi is preferably selected from the group comprising HO, H 2 N, HRN, HS, SSR, shark, CHO, qOOH, COOR, COHal.
  • FIG. 5 shows in 1 the basic structure of cytosine, which can have different linker structures on its exocyclic amine.
  • the functional group Xi is preferably selected from the group comprising HO, H 2 N, HRN, HS, SSR, shark, CHO, COOH, COOR, COHal.
  • the modified L-nucleic acid is present, which in the above case comprises PEG as the non-L-nucleic acid part and as the L-nucleic acid in this specific case an oligonucleotide, a linker or spacer carrying an amino group being interposed between the two and there is an acid amide bond between the linker and the PEG.
  • the N-hydroxysuccinimide cleaved from PEG is obtained as a further reaction product.
  • radicals R, H, CH and generally alkyl chains with a length of 1-20 are preferred.
  • the functional group can in principle be the product of any of the reactions outlined above.
  • the configurations of the linker described there and in connection with the other figures, in particular FIGS. 2 and 3, also apply in this context.
  • the same also applies to the substituents and run variables such as n shown in the formula.
  • Fig. 7 shows the implementation of different PEG derivatives with different linkers.
  • reaction (1) the carboxyl group is present on the PEG and in reaction (2) the carboxyl group is present on an L-oligonucleotide provided with a linker.
  • the functional group of the corresponding reaction partner ie in the case of reaction (1) the L-nucleic acid provided with a linker
  • reaction (2) the PEG provided with an amine group.
  • reaction (1) where an acid amide group is present at the PEG
  • reaction (2) where the acid amide bond on the construct of linker and oligonucleotide, ie L-
  • L-nucleic acid part or attached to the L-nucleic acid part is provided with a linker and the linker carries a halide such as I, Br, Cl.
  • This derivatized L-nucleic acid is then reacted with a PEG provided with a thiol group, preferably a terminal thiol group.
  • a thioether bond between linker and PEG there is a thioether bond between linker and PEG.
  • reaction (2) oxidation can lead to the formation of a sulfoxide or a sulfone.
  • FIG. 9 shows the reaction of the PEG provided with a maleimide group with an L-
  • Nucleic acid there called oligo, which has a linker carrying a thiol group.
  • the reaction product is a thioether.
  • FIG. 10 shows the reaction of a phosphate-bearing L-nucleic acid with a PEG which is provided with a linker which carries a thiol group.
  • the reaction product is a phosphothioate.
  • Nucleic acid using an activated phosphate group preferably a terminal phosphate group of the L-nucleic acid.
  • a phosphorimidazolide (I) is produced, which is used using an ethylenediamine in the case of reaction (2) to form a 2-aminoethylene-1-phophoramidate (II) or in the case of [reaction (3) leads from cysteamine to 2-thioethylene-l-phophoramidate (III).
  • the compounds according to (II) and (III) can then be reacted with non-L nucleic acids, in particular the compounds disclosed herein.
  • Nucleic acid that carries a linker having a thiol group is Nucleic acid that carries a linker having a thiol group.
  • the reaction product is a thioether.
  • Fig. ⁇ 16 shows the reaction of an isothiocyanate group-containing PEG with a
  • Nucleic acid carrying a free OH group directly from the L-nucleic acid such as a phosphate group or the sugar: part of the nucleoside, i.e. H. the positions 2'-OH, 3'-OH or 5'-OH can originate. Alternatively, the i
  • the reaction product is a carbamate '
  • FIG. 19 shows the reaction of an aldehyde or keto group with an amino group, which in each case either on the non-L-nucleic acid part j (reaction (1)), in the illustrated case on PEG, or on the L-
  • the L-nucleic acid part preferably has a linker which carries the respective reactive group, ie the amino group or the carbonyl group.
  • reaction (1) The PEG carries the amino group, whereas the L-nucleic acid has a linker which carries a carbonyl group, and the reaction product imine obtained is then converted into an amine by reduction.
  • the group-bearing PEG is reacted with an L-nucleic acid which carries a linker which has an amino group, and the reaction product Imi hail is reduced and leads to an amine.
  • Nucleic acid which also carries a linker provided with a thiol group.
  • the reaction product is a modified L-nucleic acid which has a disulfide group between the PEG and the L-nucleic acid, more precisely the linker bound to it.
  • Nucleic acid that carries a linker comprising a carbonyl group In a first reaction step, a hydrazone is obtained, which then is reductively converted into a substituted hydrazine.
  • the statements made in connection with FIG. 6 apply to the remainder R.
  • reaction 22 shows in reaction (1) the reaction of a PEG provided with a conjugated diene with an L-nucleic acid which carries a linker with a so-called dienophile group.
  • the dienophile consists of a C -C double bond, which in turn has a substituent Z which comprises an electron-withdrawing group. It can preferably be N0 2 , CH 2 C1, COOR, CN or
  • Reaction (2) also an L- connected via a hexenyl group
  • R denotes an L-nucleic acid or an L-polynucleotide , OH or phosphate
  • R is an L-nucleic acid or an L-polynucleotide, OH or phosphate
  • X H, OH, OMe, OEt, NH 2.
  • the radical R denotes either the hydrogen atom instead of the
  • the functional group Xi is preferably selected from the group comprising HO, H 2 N, HRN, HS, SSR, Hai, CHO, (j ⁇ OOH, COOR, COHal. 25 shows an activity test of a GnRH-binding, PEGylated DNA Spiegelmer in male, orchidectomized rats.
  • FIG. 26a shows an activity test of a GnRH-binding PEGylift DNA Spiegelmer in vitro.
  • 26b 1 shows an activity test of a GnRH-binding non-PEGylated
  • Figure 28a shows a pharmacokinetic profile of PEGylated L-RNA after intravenous
  • Fig. 29 shows an activity test of a GnRH-binding DNA Spiegelmer in vivo in male orchidectomized rats.
  • L-nucleic acid-PEG conjugates starting from the L-nucleic acid and PEG shown in SEQ TD NO: 2, the PEG being modified in such a way that it was used “either as an NHS ester or as a primary amine Coupling to an amine or a phosphate was investigated.
  • the procedure was that the nucleic acid in was dissolved in an aqueous system.
  • the pH was adjusted to pH 6.5 using various buffers or bases such as NaHCO 3 , NaH 2 PO 4 / Na 2 HP0 4 , HEPES, MOPS, NH 4 OAc, triethylamine
  • PEG-NHS ester can be added in different ways.
  • PEG-NHS ester dissolved in a low-concentration acid such as, for example, in 0.01 N HCl, or slowly added dropwise in an organic solvent, such as DMF, or added as a solid.
  • the preferred form of adding PEG-NHS is in portions as a solid. The influence of the reaction temperature between 4 ° C-65 ° C was also tested.
  • Nucleic acids with the following sequences were used as nucleic acids. 5'-NH 2 -TAT TAG AGA C -3 '(SEQ JX> NO: 2), and 5'-PO 4 -TAT TAG AGA C -3' (SEQ. TD. No 3) and the nucleic acid according to SEQ. ID. No. 1. The yields of the reactions summarized above were between 5 - 78%.
  • the preferred reaction variant was the total of six additions of two equivalents of solid PEG-NHS ester at intervals of about 30 minutes to a nucleic acid dissolved in a solvent consisting of 60 parts H 2 O and 40 parts DMF with the addition of NaHCO 3 (0, 2 M), a pH of 8.0 and 37 °. These reaction conditions led to a yield of 78%.
  • the 5'-MMT-aminohexyl-Spiegelmer was cleaved from the solid phase by incubation in 33% ammonia solution at 65 ° C. for 8 hours and completely deprotected, then concentrated to dryness, taken up in 10 mM NaOH and taken up by RP-HPLC cleaned.
  • the monomethoxytrityl protective group was split off with 0.4%> trifluoroacetic acid (TFA) in 30 min at RT. TFA was associated with coevaporation twice
  • the 5'-amino-modified GnRH-Spiegelmer (5,000 OD, 7.5 ⁇ mol) was placed in 0.2 M NaHC0 3 , pH 8.5 / DMF 60:40 (v / v) (125 mL), heated to 37 ° C and in portions with powdered N-hydroxysuccinimidyl (NHS) activated ester of branched 40,000 Da poly (ethylene) glycol (add 2 eq (equivalents) every 30 min, a total of 12 eq, 6 x 600 mg, 180 ⁇ mol). The course of the reaction was followed by analytical gel electrophoresis (8% polyacrylamide, 8.3 M urea).
  • the crude product was first purified from excess PEG by ion exchange HPLC (Source Q 30; solvent A: H 2 O, solvent B: 2 M NaCl; flow rate 20 mL / min; loading the column and eluting free PEG with 10% o B ; Elution of the PEG-GnRH-Spiegelmer conjugate with 50% B), then
  • L-nucleic acids including the sequence according to SEQ.ID.No. 1 with different PEG (linear 10,000 daltons, linear 20,300 daltons, branched 20,000 daltons, linear 35,000 daltons), linked and purified.
  • Example 4 Synthesis of L-nucleic acid-FITC conjugates: coupling of fluorescein isothiocyanate to GnRH-Spiegelmer with a 5 ' -NH 2 -C 6 linker
  • the 5'-amino-modified GnRH-Spiegelmer prepared according to Example 3 was placed in 0.5 M NaHCO 3 pH 8.5, heated to 65 ° C. and an excess of florescein isothiocyanate (FITC, 10 eq) was added to the reaction mixture.
  • the reaction was followed by analytical RP-HPLC. It was shaken for 48 h at 65 ° C, excess FITC separated by Centri-SpinlO (Princeton Separations) and L-nucleic acid labeled with fluorescein purified using RP-HPLC. Lyophilization gave the desired product as a yellowish powder in quantitative yield.
  • Example 5 Activity test of a GnRH-binding, PEGylated DNA Spiegelmer in vivo in male, orchidectomized rats
  • the cell culture study described herein was performed on Chinese Hamster I Ovary (CHO) cells that express the human receptor for GnRH.
  • the intracellular release of Ca 2+ ions was measured since this release, which is important for signal transduction, takes place after the agonist-receptor complex has formed.
  • the Ca 2+ level was then determined using a Ca 2+ sensitive fluorescent dye.
  • the PEG-GnRH-DNA-Spiegelmer or the GnRH-Spiegelmer should intercept the agonist GnRH and thereby inhibit its binding to the receptor on the cell membrane.
  • the experiment was carried out in such a way that the agonist GnRH (2 nM) was preincubated for 20 min with the GnRH-Spiegelmer or with the PEG-GnRH-DNA-Spiegelmer in a concentration range from 100 pM to 1 ⁇ M. This solution was then added to the CHO cells loaded with fluorescent dye and the respective Ca 2+ concentration was determined on a fluroescence imaging plate reader (FLIPR).
  • FLIPR fluroescence imaging plate reader
  • the concentration-dependent determination gave a sigmoidal activity curve, which indicates that both the native, ie unmodified GnRH-Spiegelmer (filled squares) and the PEG-modified GnRH-DNA Spiegelmer (filled triangles) form the GnRH receptor Complex could inhibit 100%.
  • the IC 50 was 20 nM for the GnRH Spiegelmer and 30 nM for the PEG-GnRH-DNA Spiegelmer (Fig. 26b).
  • PEGylated DNA Spieglermers used. The group became parallel to. the groups for the i activity experiments (see Example 6) treated, ie castrated after an adaptation phase and after a further week (day 8), the animals received a single intravenous administration Administration of 800 nmol / kg PEG-GnRH-DNA-Spieglmer. The substance was dissolved in lxPBS, pH 7.4 (stock solution: 1 mM).
  • GnRH-binding, PEGylated DN ⁇ -Spiegelmer was extracted from the plasma by solid phase extraction with the aid of weak anion exchangers.
  • 50 ⁇ l EDTA plasma in buffer A 50 mM NaH2PO 4 , pH 5.5; 0.2 M NaClO 4 ; 20% (v / v) formamide and 5% (v / v) acetonitrile) in a total volume of 1 ml dissolved and kept until extraction at 4 ° C overnight or at -20 ° C for a maximum of 4 days.
  • Frozen samples were thawed at room temperature for at least two hours, mixed and then centrifuged.
  • Dimethylaminopropyl anion exchange columns (DMA 3 ml / 200 mg column material, Macherey & Nagel, Düren) on a Baker spe-12G vacuum apparatus (Mallinckrodt Baker, Griesheim) were used for solid phase extraction.
  • the buffers used consisted of: buffer A (50 mM NaH 2 PO 4 , pH 5.5; 0.2 M NaClO 4 ; 20% (v / v) formamide and
  • buffer B 80 mM NaH 2 PO 4 , pH 6.0; 50 mM Na 2 HPO 4 ; 2 M NaClO 4 ;
  • Preparation of the washing and elution buffer were mixed in a certain ratio so that the desired salt concentration was reached.
  • the anion exchangers were rinsed with 2 ml of buffer A.
  • the samples were added with -100 ⁇ ibar and washed with 2 ml of buffer A and 2 ml of washing buffer (0.4 M NaClO 4 ). After the i column material was dried by applying -200 mbar for 5 minutes, the
  • a 30mer DNA Spiegelmer was added to the samples before extraction, to which a 40kD polyethylene glycol molecule (PEG) was bound at the 5 'end.
  • the internal standard was brought to a volume of 360 ⁇ l in a concentration of 1 ⁇ g / ⁇ l with buffer and 10 ⁇ l of each was added to each sample.
  • NAP-25 columns (Amersham Pharmacia Biotech) were used. The eluates obtained are dried under vacuum and dissolved in 100 ml 10 mM Tris-Cl, pH 8.0.
  • the PEGylated mirror bucket was identified and quantified using
  • the concentration of PEGylated, GnRH-binding DNA Spiegelmer at the different times of sampling is shown in FIG. 27.
  • GnRH binding DNA Spiegelmer by intravenous injection is approximately 4 hours in rats.
  • Substance an intravenous single dose of 150 nmol / kg. 4 rats per substance i each received 150 nmol / kg as a single subcutaneous dose.
  • the substances were dissolved in lxPBS, pH 7.4 (stock solution: 383 ⁇ M).
  • blood samples were taken for the 'unmodified L-RNA before administration of the substance (0 min) and 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h after administration of substance and for analysis in EDTA-Eppendorf vessels transferred.
  • the amount of L-RNA or PEGylated L-RNA in the blood samples was determined using an ⁇
  • Hybridization assays were examined (see Drolet, DW et al. (2000) Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NX 1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys. Phamaceutical Res 17 (12): 1503-1510 .)
  • Immobilization of the oligonucleotide probe 100 ⁇ l of the capture probe (0.75 pmol / ⁇ l in coupling buffer: 500 mM Na 2 HPO 4 pH 8.5, 0.5 mM EDTA) were 'per well (well or '
  • hybridization buffer 1 0.5xSSC pH 7.0, 0.5% (w / v) SDS
  • I and 3 x 200 ul IxTBS / Tween 20 (20mM Tris-Cl pH 7.6, 137mM NaCl, 0.1% (v / v) Tween 20).
  • 1 ul streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (Promega) was diluted with 5 ml IxTBS / Tween 20. 100 ⁇ l of the diluted conjugate were added per well and incubated for 30 min at room temperature. Washing steps followed: 1 ⁇ 200 ⁇ l 1 ⁇ TBS / Tween 20 and 3 ⁇ 200 ⁇ l 1 ⁇ assay buffer (20 mM Tris-Cl pH 9.8, 1 mM MgCl 2 ).
  • FIGS. 28a and 28c The concentration-time curves of the PEGylated L-RNA with intravenous and subcutaneous administration are shown in FIGS. 28a and 28c.
  • the concentration profiles of the urimodified L-RNA with intravenous and subcutaneous administration are shown in FIGS. 28b and 28d.
  • the terminal half-life for the unmodified L-RNA is 50 minutes for which
  • PEGylated substance has a half-life of approx. 18 hours.
  • the terminal half-life for the unmodified L-RNA is 84 minutes, for that
  • PEGylated substance results in a very long elimination phase.
  • the modified L-nucleic acid according to the invention is advantageous over the urimodified L-nucleic acid.
  • This advantage also arises with regard to the prior art, for example described by Watson, SR et jal., Antisense nucleic acid drug dev. 10, 63-75 (2000).
  • a 2'-F-modified aptamer which binds to L-selectin, is examined.
  • the pharmacokinetic half-life of the intravenous PEGylated 2'-F-amers (40 kDa PEG) administered in vivo in SJprague-Dawley rats are bedridden 222288 mm: in and are thus significantly shorter than the L modified according to the invention
  • L-RNA has the following sequence:
  • the 5'-MMT-aminohexyl-L-RNA was cleaved from the solid phase by incubation in 41% strength methylamine solution at 65 ° C. for 30 minutes and the nucleobases were completely deprotected.
  • the 2 'position was deprotected by incubation in 1.5 ml DMSO, 0.75 ml triethylamine (TEA) and 1 ml TEA3HF for 2 h at 60 ° C.
  • TEA triethylamine
  • a first purification was carried out using RP-HPLC.
  • the monomethojxytrityl protective group was split off with 80% acetic acid in 70 min at RT.
  • Acetic acid was removed by coevaporation with ethanol twice and the 5'-aminohexyl-L-RNA according to) SEQ. ID. No.4 purified by precipitation in ethanol (yield: 220 OD, 60% pure).
  • the product was taken up in 1 M sodium acetate, pH 8.0 and desalted by means of size exclusion chromatography on a Sephadex G10 column or by Vivaspin 3000 (Vivascience, Hanover, Germany).
  • L-nucleic acids including] the sequence according to SEQ.TD.No. 1 with different PEG (linear 10,000 Dalton, linear 20.b ⁇ O Dalton, branched 20,000 Dalton, linear 35,000 Dalton), linked and purified.
  • Example 10 Activity test of a GnRH-binding DNA Spiegelmer in vivo in male orchidectomized rats
  • the LH levels in the GnRH-DNA-Spiegelmer group are low and reach their low point after 1.5 hours and remain for about 3 hours. This reduction is comparable with non-castrated rats or with Cetrorelix (standard Antagonist) treated rats.
  • the LH levels rise slowly and reach the level of the untreated control group within 24 hours.
  • oligonucleotides and deoxynucleotide triphosphates preparation and their interaction with the large (Klenow) fragment of Escherichia coli DNA polymerase I. Biochemistry 28, 4601-4607 (1989).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine modifizierte L-Nukleinsäure, umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L-Nukleinsäure-Teil, wobei der L-Nukleinsäure-Teil mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil konjugiert ist und die Konjugation des L-Nukleinsäure-Teils mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil zu einer verlangsamten Ausscheidung aus einem Organismus führt, verglichen mit einer L-Nukleinsäure umfassend nur den L-Nukleinsäure-Teil, wobei der L-Nukleinsäure-Teil ein Spiegelmer ist.

Description

Modifizierte L-Nukleinsäure
Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte L-Nukleinsäuren, deren Verwendung sowie Verfahren zu deren Herstellung.
Die Entwicklung neuer therapeutischer Konzepte greift neben der Verwendung von vergleichsweise kleinen organischen Molekülen zunehmend auch auf monoklonale Antikörper, Peptide und funktionale Nukleinsäuren zurück, d.h. solche Nukleinsäuren, die spezifisch an eine Zielstruktur binden. Typische Vertreter dieser funktionalen Nukleinsäuren sind die sogenannten Aptamere, die gegen eine Vielzahl verschiedener Biomoleküle bereits entwickelt wurden. Dabei wird ausgehend von einer D-Nukleinsäurebibliothek in mehreren Stufen durch in-vitro Selektion ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle, die sogenannten Aptamere, isoliert, die sich durch eine besonders hohe Affinität gegenüber ihrer Zielstruktur auszeichnen. Verfahren zur Herstellung derartiger Aptamere sind beispielsweise beschrieben in der europäischen Patentanmeldung EP 0 533 838.
In der Pharmakologie ist das Problem der Stabilität und biologischen Verfügbarkeit, ausgedrückt als die biologische Halbwertszeit, der verabreichten pharmazeutisch aktiven Wirkstoffe hinlänglich bekannt. Strategien, eine biologische Halbwertszeit zu erreichen, die die optimale Wirkung der verabreichten, pharmazeutisch aktiven Substanzen erlaubt, konzentrieren sich zum einen auf eine geeignete Modifikation der pharmazeutisch aktiven Wirkstoffe und zum anderen auf die Entwicklung geeigneter Darreichungsformen. Im ersteren Falle bestehen erhebliche Beschränkungen dergestalt, dass sichergestellt werden muss, dass die eine erhöhte biologische Halbwertszeit, d.h. Verweildauer im zu behandelnden Organismus, aufweisende Verbindung ihre pharmakologischen Eigenschaften nicht verliert, mit anderen Worten ihre Wirksamkeit sowie das Verursachen möglichst geringer Nebenwirkungen.
Neben den vorstehend genannten Aptameren existieren mit den sogenannten Spiegelmeren eine weitere Form der funktionalen Nukleinsäuren. Auch die Spiegelmere binden spezifisch an eine Zielsequenz, wobei hier jedoch unter Verwendung einer D-Nukleinsäurebibliothek gegen die enantiomere Form des Targets selektiert wird und die daran bindenden D-Nukleinsäuren sodann als L-Nukleinsäuren hergestellt werden und diese infolge der chiralen Reziprozität an das eigentliche Target und nicht an die für den Selektionsprozess verwendete enantiomere Form desselben binden können. Verfahren zur Herstellung derartiger Spiegelmere sind beispielsweise beschrieben in der internationale Patentanmeldung WO 98/08856.
Rein chemisch betrachtet sind Spiegelmere L-Nukleinsäuren, typischerweise L-Oligonukleotide, die von natürlichen Enzymen infolge ihres Aufbaus aus L-Nukleotiden praktisch nicht abgebaut werden können. Neben der Zielmolekül-Spezifϊtät qualifiziert sie diese Eigenschaft zur Anwendung in den verschiedensten Bereichen wie bspw. Analyse biologischer Probe, Diagnose und Therapie.
Ähnlich wie bei anderen chemischen Verbindungen, die in der Diagnostik sowie Therapie Anwendung finden, insbesondere solche, die in einem Organismus appliziert werden, besteht somit auch für Spiegelmere ein Bedarf, diese in eine Form zu überführen, welche erlaubt, dass die Spiegelmere über einen längeren Zeitraum in einem Organismus vorhanden und wirksam sind. Dabei ist es eine weitere der vorliegenden Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe, dass durch die Modifikation die für die Spiegelmere charakteristische Ziel-Molekül-Spezifität nicht beeinflusst wird.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch eine L-Nukleinsäure umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L-Nukleinsäure-Teil, wobei die Konjugation mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil zu einer verlangsamten Ausscheidung aus einem Organismus bzw. renalen Clearance führt, verglichen mit einer L-Nukleinsäure umfassend nur den L-Nukleinsäure-Teil.
In einem zweiten Aspekt wird die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe gelöst durch eine modifizierte L-Nukleinsäure umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L- Nukleinsäure-Teil, wobei die Konjugation mit dem Nicht-L-Nukleinsäureteil zu einer erhöhten Verweildauer in einem Organismus führt, verglichen mit einer L-Nukleinsäure umfassend nur den L-Nukleinsäure-Teil.
In einem dritten Aspekt wird die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe gelöst durch eine modifizierte L-Nukleinsäure, insbesondere eine erfindungsgemäße modifizierte L-Nukleinsäure, umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L-Nukleinsäure-Teil, wobei der Nicht-L- Nukleinsäure-Teil ein Molekulargewicht von mehr als etwa 300 Da, bevorzugterweise mehr als etwa 20.000 Da und bevorzugtererweise mehr als etwa 40.000 Da aufweist
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass der L-Nukleinsäure-Teil mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil konjugiert ist und der Nicht-L-Nukleinsäure-Teil ein Molekulargewicht von mehr als etwa 300 Da, bevorzugterweise mehr als etwa 20.000 Da und bevorzugtererweise mehr als etwa 40.000 Da aufweist.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass die modifizierte L-Nukleinsäure ein Molekulargewicht von etwa 600 bis 500,000 Da, bevorzugterweise von etwa 10,000 bis 400,000 Da bevorzugtererweise von etwa 50,000 bis 300,000 Da aufweist.
In einer noch weiteren Ausfuhrungsform der erfmdungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass der L-Nukleinsäure-Teil ein Molekulargewicht von 300 bis 50,000 Da, bevorzugterweise von 5,000 bis 25,000 Da bevorzugtererweise von 7,000 bis 15,000 Da aufweist.
Schließlich ist in einer Ausführungsform der erfmdungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren vorgesehen, dass der Nicht-L-Nukleinsäure-Teil an den L-Nukleinsäure-Teil über eine funktionale Gruppe des L-Nukleinsäure-Teils direkt oder indirekt verknüpft ist, die an einem der folgenden Bestandteile der L-Nukleinsäure vorhanden oder gebunden ist, wobei die funktionale Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die terminale und nicht-terminale Phosphate, terminale und nicht-terminale Zuckeranteile und natürliche und nicht-natürliche Purin- und natürliche und nicht-natürliche Pyrimidin-Basen umfasst.
In einer Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass die Verknüpfung des Nicht-L-Nukleinsäure-Teils mit dem L-Nukleinsäure-Teil über die 2'-OH-, 3'-OH- und/oder 5'-OH-Gruppe oder eines Derivates davon eines oder mehrerer der Zuckeranteile des L-Nukleinsäure-Teils vorliegt. In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass die Verknüpfung über mindestens eine der Positionen 5 |oder 6 der Pyrimidin- Base vorliegt.
In einer noch weiteren Ausfuhrungsform der erfmdungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass die Verknüpfung über mindestens einer der Position 8 der Purin-Basen vorliegt.
Schließlich ist in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren vorgesehen, dass die Verknüpfung an einer oder mehreren der ex zyklischen und/oder endozyklischen Amingruppen und/oder Ketogruppen der Purin- und/oder Pyrimidin-Basen und/oder abasischen Position(en) vorliegt.
In einer Ausführungsform der erfmdungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass der Nicht-Nukleinsäure-Teil ausgewählt ist aus der Gruppe, die lineares Poly(ethylen)glykol, verzweigtes Poly(ethylen)glykol, Hydroxyethylstärke, Peptide, Proteine, Polysaccharide, Sterole, Polyoxypropylen, Polyoxyamidate, Poly(2-hydr[oxyethyl)-L-glutamiιij precise Polyethylenglykol umfasst.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass zwischen dem L-Nukleinsäure-Teil und dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil ein Linker angeordnet ist.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass der L-Nukleinsäure-Teil eine Nukleinsäure umfasst gemäß SEQ ID NO. 1.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass der L-Nukleinsäure-Teil am 5'-OH-Ende als Linker 6J-Aminohexylphosphat aufweist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen modifizierten L- Nukleinsäuren ist vorgesehen, dass an das freie Arnin des Aminohexylphosphat-Linkers Polyethylenglykol gekoppelt ist. In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen L-Nukleinsäuren als Diagnostikum oder diagnostisches Mittel.
In einem fünften Aspekt wird die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgabe gelöst durch die Verwendung der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren zur Herstellung eines Medikaments.
In einem sechsten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Bereitstellung einer modifizierte L-Nukleinsäure, insbesondere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L-Nukleinsäure-Teil, wobei die folgenden Schritte
'I I1 vorgesehen sind:
a) Bereitstellen einer L-Nukleinsäure, welche dem L-Nukleinsäure-Teil oder einem Teil davon der modifizierte L-Nukleinsäure ausbildet; b) Bereitstellen einer Nicht-L-Nukleinsäure, welche den Nicht-L-Nukleinsäure-Teil oder einen Teil davon der modifizierte L-Nukleinsäure ausbildet; und c) Umsetzen der L-Nukleinsäure aus a) und der Nicht-L-Nukleinsäure aus b), und d) optional Isolieren der in Schritt c) erhaltenen modifizierten L-Niαkleinsäύre.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, dass die L- Nukleinsäure in Schritt a) einen Linker umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens] ist vorgesehen, dass nach dem Bereitstellen der L-Nukleinsäure in Schritt a) diese mit einem Linker versehen wird.
Es ist weiterhin im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Nicht-L-Nukleinsäure-Teil einen Linker umfasst bzw. das nach dem Bereitstellen der Nicht-L-Nukleinsäure in Schritt b) diese mit einem Linker versehen wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass bei der Verwendung von L-Nukleinsäuren in einem Organismus wie bspw. eine j Säugetierorganismus und ganz besonders bei einem Säugetier das bevorzugterweise ausgewählt ist aus der Gruppe, die Menschen, Affen, Hunde, Katzen, Schafe, Ziegen, Kaninchen, Meerschweine, Mäuse und Ratten umfasst, zwar L-Nukleinsäuren nicht metabolisiert werden, was darin begründet liegt, dass die in derartigen Organismen in der Regel vorkommenden Nukleasen L-Nukleinsäuren aufgrund ihrer Stereospezifität nicht als Substrat erkennen, die biologische Halbwertszeit der L- Nukleinsäuren im besagten Organismus nichtsdestotrotz vergleichsweise gering ist. So,, wurde festgestellt, dass bei in-vivo Verabreichung von unmodifizierten L-Nukleinsäuren mit einer Zufallsequenz in Ratten und Affen die Halbwertszeit zwischen 30 Minuten und 6 Stunden betrug. Auch bei der Verwendung einer L-Nukleinsäure, d.h. eines Spiegeimers, die gegen ein in dem untersuchten Organismus vorhandenes Zielmolekül gerichtet war,, bestätigte sich die vorstehende Beobachtung einer vergleichsweise kurzen biologischen Halbwertszeit, was bestätigt, dass diese sich nicht auf einem Artefact infolge der nicht-Spezifität der L-Nukleinsäure gründet. Weiterhin haben die vorliegenden Erfinder festgestellt, dass die Halbwertszeit von nicht-modifizierten L-Nukleinsäuren in etwa gleich groß ist wie die Halbwertszeit von nicht- modifizierten D-Nukleinsäuren. Dabei ist die Stabilität der nicht-modifizierten L-Nukleinsäuren deutlich erhöht gegenüber der Stabilität von nicht-modifizierten D-Nukleinsäuren. Es konnte nun überraschend gezeigt werden, dass sich durch die Modifizierung die Halbwertszeit von L- Nukleinsäuren stärker erhöht als bei der Modifizierung von D-Nukleinsäuren. Somit kommt es infolge der Modifizierung von Nukleinsäuren vollkommend unerwartet zx einer Änderung der, Halbwertszeit der modifizierten L-Nukleinsäuren verglichen mit der Halbwertszeit der modifizierten D-Nukleinsäuren, deren Halbwertszeiten sich ansonsten in der nicht-modifizierten Form ähneln. Mit anderen Worten, erst infolge der Modifizierung kann der erwünschte Effekt einer verlängerten Halbwertszeit von funktionalen Nukleinsäuren realisiert werden, was jedoch nur unter Verwendung modifizierter L-Nukleinsäuren und nicht etwa unter Verwendung i modifizierter D-Nukleinsäuren möglich ist. In dem konkret vorstehend beschriebenen Fall handelt es sich um ein Spiegeimer für den Hormon-Agonisten Gonadotropin-freisetzendes
Hormon (GnRH), welches männlichen, orchidektomierten Ratten verabreicht wurde. GnRH stimuliert die Synthese und Freisetzung der Gonadotropine Follikel-stimulierendes Hormon
(FSH) und luteinisierendes Hormon (LH). Bei männlichen, orchidektomierten Ratten liegen aufgrund des fehlenden Testosteron Feedback-Signals erhöhte FSH- und LH-Spiegel vor. Das spezifische Spiegeimer bedingte eine deutliche Absenkung des LH-Spiegels in einer ersten
Studie (100 mg/kg, s.c. Applikation), allerdings konnte bereits nach wenigen Stunden eine
Abnahme der Effektivität des Spiegeimers beobachtet werden. In einer Durchführung derselben
Studie mit dem korrespondierenden GnRH-Spiegelmer-PEG-Konjuga (150 mg/kg, i.v.
Applikation) konnte hingegen eine vollständige Absenkung des LH-Spiegels beobachtet werden, der über einen Zeitraum von 24 Stunden nach wie vor vollständig abgesenkt blieb. Das GnRH-
Spiegelmer-PEG-Konjugat stellt ein Beispiel für eine erfindungsgemäße modifizierte L- Nukleinsäure dar. Das GnRH-Spiegelmer entspricht dabei dem L-Nukl|einsäure-Teil und das PEG dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil.
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glomeruläre Filtrationsrate der Nieren hinsichtlich der modifizierten L-Nukleinsäuren gegenüber derjenigen der nicht-modifizierten L-Nukleinsäuren signifikant verringert ist, was zu einer erhöhten Verweildauer, d. h. biologischen Halbwertszeit der modifizierten L-Nukleinsäure verglichen mit der Verweildauer der korrespondierenden, aber nicht-modifizierten L-
Nukleinsäure führt.
Besonders beachtlich ist in diesem Zusammenhang die Tatsache, dass trotz der vorgenommenen Modifikation die modifizierte L-Nukleinsäure, d.h. insbesondere der für die Ziel-Molekül- Spezifität verantwortliche L-Nukleinsäure-Teil davon, an ihrer Spezifitäi; offensichtlich nichts einbüßt. Damit weisen die erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren in vollkommen überraschender Weise jene Eigenschaften auf, wie man sie ansonsten bei anderen pharmazeutisch aktiven Verbindungen normalerweise nicht realisieren kann, dass nämlich auf umfangreiche galenische Formulierungen, bspw. in Form von Depotpräparaten, die sukzessive den Wirkstoff abgeben, verzichtet und vielmehr eine direkte Modifizierung des in Frage stehenden Wirkstoffes herbeigeführt werden kann, ohne dass dabei dessen biologische Aktivität, im Falle der Spiegelmere insbesondere ausgedrückt als Spezifität der Reaktion oder Komplexbildung mit ihrem jeweiligen Zielmolekül, nachteilig beeinflusst wird. Mit anderen Worten, die erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren überwinden die ansonsten bei pharmazeutisch aktiven Wirkstoffen und insbesondere bei kleinen Wirkstoffmolekülen existierende Unvereinbarkeit von spezifischer Aktivität des pharmazeutischen Wirkstoffes mit einer Erhöhung seiner Verweildauer in einem Organismus, insbesondere mit einer Verringerung der Ausscheidung wie bspw. der glomerulären Filtrationsrate. Dabei is^ beachtlich, dass die Affinität des L-Nukleinsäure-Teils durch die Konjugation mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil im wesentlichen unverändert bleibt.
Das vorstehend Gesagte gilt selbstverständlich nicht nur für den Fall der Anwendung modifizierter L-Nukleinsäuren wie Spiegelmere als therapeutisch wirksame Agenzien, sondern ι auch für deren Verwendung als diagnostische Mittel, insbesondere bei deren Verwendung als in- vivo Diagnostika. Ein typisches Beispiel der Verwendung von Spiegelmeren als in-vivo Diagnostika stellt das in-vivo Imaging dar und hierbei insbesondere die Verwendung von Radionuklid tragenden Spiegelmeren für die Positronen-Emissionstomographie. Bei dieser Anwendung wird darauf abgestellt, dass das Radionuklid für einen genau definierten Zeitrahmen im Körper erhalten bleibt. Würde das Radionuklid und damit die Radioaktivität über einen längeren Zeitraum im Organismus verbleiben, wobei länger so zu verstehe! ist, wie erforderlich, um die jeweilige Untersuchung durchzuführen, würde dies mit einer für den Patienten unnötigen, in einigen Fällen möglicherweise sogar gesundheitsgefährdenden Exposition mit radioaktiver Strahlung einhergehen. Andererseits würde für den Fall, dass die Ausscheiduηg des diagnostischen Mittels und damit der radioaktiven Markierung aus dem Körper zu schnell erfolgt, dazu fuhren, dass keine geeignete Diagnose oder diagnostische Aussage möglich wäre. Mit der Verfügbarkeit der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren kann in Abhängigkeit von den jeweiligen Erfordernissen das diagnostische Mittel hinsichtlich seiner Verweildauer, d. h. seiner biologischen Halbwertszeit, optimiert eingestellt | werden. Dies gründet sich maßgeblich mit auf der Beobachtung, dass die glomeruläre Filtrationsrate ab einem
Molekulargewicht von größer als etwa 45.000 Da stark eingeschränkt wird. Ansonsten ist die Ausscheidung, insbesondere die glomeruläre Filtrationsrate eindeutig m !i.t der Molekülgröße korreliert. Durch die Verwendung eines geeigneten Nicht-L-Nukleinsäure-Teils wie beispielsweise den hierin beschriebenen kann die Verweildauer dpr modifizierten L-
Nukleinsäure exakt auf die Erfordernisse angepasst werden.
Die chemisch Natur des Nicht-L-Nukleinsäure-Teils der modifizierten L-Nukleinsäure kann im
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Rahmen bestimmter Grenzen praktisch frei gestaltet werden. Eine Anforderung an die modifizierte Nukleinsäure, die einem Organismus verabreicht wird, die in der Vielzahl der Anwendungsfälle der modifizierten L-Nukleinsäure gegeben sein sollte, besteht darin, dass der Nicht-L-Nukleinsäure-Teil aus einer oder mehreren nicht-immunogenen Verbindungen besteht. Alternativ, aber ggf. auch ergänzend hierzu, kann es sich dabei um lippphile Verbindungen ebenso wie um hydrophile Verbindungen handeln. Es ist für den Fachmann offensichtlich, dass in Abhängigkeit von den Rahmenbedingungen des Einzelfalles möglicherweise auch leicht immunogene Verbindungen herangezogen werden können, insbesondere dann, wenn die Verabreichung der erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäure nicht über einen längeren Zeitraum oder mehrfach erfolgen soll, sondern lediglich einmalig. Umgekehrt ist dieser Aspekt besonders dann von Bedeutung, wenn die erfindungsgemäßen modifizierten L-Nukleinsäuren über einen längeren Zeitraum oder mehrfach verabreicht werden müssen. Dabei wird in der Regel sicherzustellen sein, dass durch den Nicht-L-Nukleinsäure-Tei . der modifizierte L- Nukleinsäure keine Immunantwort bei Applikation der modifizierten L-Nukleinsäure iβrzeugt wird, die bei erneuter Verabreichung derselben zu einer immunologisqhen oder allergischen Reaktion fuhren würde.
Die Ausgestaltung des Nicht-L-Nukleinsäure-Teils der modifizierte L-Nukleinsäure kann dabei auch so erfolgen, dass mehr als ein Nicht-L-Nukleinsäure-Teil an eine:ι L-Nukleinsäure-Teil gebunden oder konjugiert wird. Beispielsweise ist es möglich, dass zwei oder mehrere Nicht-L- Nukleinsäure-Teile an den L-Nukleinsäure-Teil gebunden werden. Der einzelne Nicht-L- Nukleinsäure-Teil ist bevorzugterweise ein Polymer, wobei die Untereinheiten des Polymers ein vergleichsweise geringes Molekulargewicht aufweisen können. Es ist auch im Rahmen der i vorliegenden Erfindung, dass mehr als ein L-Nukleinsäure-Teil an einen Nicht-L-Nuklemsäure-
Teil gebunden ist.
Ein werferer Aspekt, der bei der Auswahl des Nicht-L-Nukleinsäure-Teils der modifizierte Lτ
Nukleinsäure zu berücksichtigen ist, besteht in dem Adressieren der Spiegelmere an bestimmte
Verbindungen, insbesondere an bestimmte Organe oder Zellen. Hier kann in Abhängigkeit von i den spezifischen Verhältnissen der Nicht-L-Nukleinsäure-Teil so angepasst werden, dass sich, unabhängig von der durch den L-Nukleinsäure-Teil bedingten Spezifität der Bindung des
Spiegeimers oder der modifizierten L-Nukleinsäure, die modifizierte L-Nukleinsäure bevorzugt in bestimmten Zellen, Geweben oder Organen anreichert.
Typischerweise beträgt das Molekulargewicht des Nicht-L-Nukleinsäure-Teils zwischen 300 und 500.000 Da. Der L-Nukleinsäure-Teil kann entweder einzeln, mehrfach, oder in allen beliebigen Kombinationen mit anderen Nicht-L-Nukleinsäure-Teilen an gleiche oder verschiedene Stellen des L-Nukleinsäure-Teils der modifizierte L-Nukleinsäure gekoppelt werden. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Molekulargewicht der modifizierten L-
Nukleinsäure stark von dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil bestimmt wird. Grundsätzlich kann die modifizierte L-Nukleinsäure ein Molekulargewicht von etwa 600 bis 5P0.000 Da aufweisen, i bevorzugterweise von etwa 10.000 bis 400.000 Da und bevorzugtererweise von etwa 50.000 bis
300.000 Da. Geringere Molekulargewichtebereiche werden beispielsweise durch solche modifizierten L-Nukleinsäuren realisiert, die Chlosterol-Konjugate sind und typischerweise ein
Molekulargewicht von etwa 10 kDa bis 25 kDa aufweisen. Höhere Molekulargewichtsbereiche werden beispielsweise durch solche modifizierten L-Nukleinsäuren realisiert, die HES-
Konjugate sind und oftmals ein Molekulargewicht von etwa 100 kDa bis 500 kDa aufweisen. Für den Fall, dass die modifizierten L-Nukleinsäuren PEG-Konjugate sind, ist das bevorzugte
Molekulargewicht etwa 40 bis 70 kDa.
Als Nicht-L-Nukleinsäure-Teil kann beispielsweise verwendet werden: i
- Polyether und Alkoxypolyether, wie z.B. lineare oder verzweigte Poly(e'thylen)glykole (PEG),
Methoxypoly(ethylen)glykole, Ethoxypoly(ethylen)glykole, precise PEG (wobei precise PEG ein
Polyamid der Form (-NH-Y-NH-CO-X-CO-) ist, wobei Y und X an jeder. Stelle variiert werden i können als (-CH2CH2O-)p mit unterschiedlichen p im Bereich von 4-6), Poly(2-hydroxyethyl)-L- glutamine und Polyoxypropylene, die sich insbesondere dadurch auszeichnen, dass sie ihrerseits nicht in vivo metabolisierbar sind und insoweit der durch die Größe, d.h. [das Molekulargewicht der modifizierten L-Nukleinsäure bedingte Effekt der kontrollierten Aujsscheidung besonders nachhaltig ausgeprägt ist und nicht durch Abbauprozesse an dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil überlagert werden.
- Peptide, Polypeptide und Proteine wie z.B. Albumin, wobei es sich bei diesen Verbindungen sowohl um natürlicherweise vorhandene als auch um von außen hinzugefügte Substanzen handeln kann.
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- Polysaccharide, wie z.B. Hydroxyethylstärke, Dextrane, sind ihrerseits metabolisierbar und können infolge der genau kontrollierbaren Abbaurate auch die Verweildauer sehr spezifisch beeinflussen. Das Molekulargewicht der in einer Ausführungsform verwendeten Hydroxyethylstärke liegt zwischen 10 kDa, bevorzugterweise zwischen 40 kDa und 400 kDa, bevorzugterweise zwischen 100 kDa und 300 kDa. Hydroxyethylstärke hat einen molaren Substitutionsgrad von 0.1 bis 0.8 und ein Verhältnis von C2 : C6 im Bereich von 2 bis 20. Hinsichtlich der Kopplung der Polysaccharide an den L-Nukleinsäure-Telil der modifizierten L- Nukleinsäure gilt das hierin im Zusammenhang mit dem Zuckeranteil der L-Nukleinsäuren hinsichtlich der Verwendung der OH-Gruppen und deren Derivatisierung Gesagte.
- Sterole, wie z.B. Cholesterin. Zwar zeichnen sich Sterole durch ein vergleichsweise geringes Molekulargewicht aus, jedoch kann auch dieses bereits zu einer Erhöhung der Verweilzeit der damit modifizierten L-Nukleinsäure führen. Von größerer Bedeutung in diesem Zusammenhang ist jedoch das Verhalten der Sterole, insbesondere von Cholesterin zu bewerten, das in vivo einen nicht kovalenten Komplex mit Lipoproteinen wie zum Beispiel HDL bildet, wodurch eine Molekülvergrößerung und damit eine längere Halbwertszeit in vivo erreicfit wird.
Grundsätzlich ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass der Ni'cht-L-Nukleinsäureteil auch von einem oder mehreren D-Nukleosiden bzw. D-Nukleotiden ausgebildet wird, wobei diese einzeln oder insgesamt weitere Modifizierungen aufweisen können, wie beispielsweise Modifizierungen zur Erhöhung der Stabilität in biologischen | Systemen. Derartige Modifizierungen stellt beispielsweise die Fluorierung an der Position 2' dss Zuckerbestandteiles der Nukleotide bzw. Nukleoside dar. Weiterhin können diese D-Nukleoside und D-Nukleotide Bestandteil der verschiedenen Nicht-L-Nukleinsäuren darstellen, insbesondere derjenigen der vorstehend genannten, aber auch Teil eines der hierin beschriebenen Linkers. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass einzelne oder mehrere der D-Nukleoside oder D- Nukleotide auch eine oder mehrere abasische Positionen umfassen können!
Die Verknüpfung des L-Nukleinsäure-Teils mit einem oder mehreren der Nicht-L-Nukleinsäure- Teile kann grundsätzlich an allen Bestandteilen oder Gruppierungen der beiden die modifizierte L-Nukleinsäure aufbauenden Teile erfolgen, wobei auch vorgesehen sein kann, dass Derivatisierungen an einer oder mehreren Stellen eines oder beider Teile, d.h. an der L- Nukleinsäure ebenso wie dem/den Nicht-L-Nukleinsäure-Teil(en), erfolgen. Die Verknüpfung kann insbesondere an der 5 '-OH-, 3 '-OH- oder 2 '-OH-Gruppe der L-Nukleinsäure, insbesondere des Ribose- oder Desoxyribose-Teils davon, erfolgen.
Dabei ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass zumindest ein Teil der Zuckerbestandteile der die L-Nukleinsäure aufbauenden Nukleotide einen anderen Zucker als Ribose oder Deoxyribose aufweisen kann. Derartige Zucker können beispielsweise weitere Pentoseh wie zum Beispiel Arabinose sein aber auch Hexosen oder Tetrosen oder auch ein Stickstoffatom enthalten wie zum Beispiel in einem Morpholino-Ring oder Aza- oder Thiozucker oder weitere Zuckermodifikationen wie in locked Nukleinsäuren (LNA) oder Peptid Nukleinsäuren (PNA) Diese OH-Gruppen können durch geeignete chemische Modifizierung vorliegen als NH -, SH-, Aldehyd-, Carboxysäure-, Phosphat-, Jod-, Brom-, oder Chlorgruppen.
Dem Fachmann sind weitere funktionale Gruppen, die eine Kopplung an den L-Nukleinsäure- i
Teil erlauben, bekannt. Sofern hierin die Verknüpfung eines Nicht-L-Nukleinsäure-Teils mit einer L-Nukleinsäure beschrieben wird, gelten die Ausführungen sinngeηiäß auch für den Fall, dass mehr als ein Nicht-L-Nukleinsäure-Teil an den L-Nukleinsäure-Teil gebunden wird oder daran gebunden vorliegt, sofern keine gegenteiligen Aussagen getroffen werden.
Es ist weiter im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass zumindest ein Teil der Phosphatgruppen der die modifizierte L-Nukleinsäure aufbauenden Nukl sotide Modifikationen aufweisen. Derartige Modifikationen sind beispielsweise Phosphothioate, Phosphodithioate, Phosphoramidate, Phosphonate und weitere den Fachleuten bekannte Modifikationen.
Neben der Verknüpfung des L-Nukleinsäure-Teils an den Nicht-L-Nukleinsäure-Teils über den
Zucker-Teil des L-Nukleinsäure-Teils kann die Verknüpfung ebenso am Phosphat-Rückgrat erfolgen, wobei auch hier wie im Zusammenhang mit der Verknüpfung über den- Ribose- oder
Deoxyribose-Anteil der L-Nukleinsäure angegeben, eine entsprechende Modifizierung erfolgen kann. Schließlich sind Verknüpfungen über die Position 5 und/oder 6 der Pyrimidinbase(n),
Position 8 der Purinbase(n) sowie die exo- und endozyklischen Amin- und Ketogruppen der jeweiligen Nukleobasen möglich, ggf. auch nach funktioneller Modifikation derselben, wie vorstehend ausgeführt. Neben natürlichen Basen kann die L-Nukleinsäure auch eine oder mehrere nicht-natürliche Basen enthalten, wie z.B. Isoguanidin, Isocytidin, Xanthosin, Inosin, 2,4-Diaminopyrimidin. Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine jegliche der hierin beschriebenen Verknüpfungen zwischen dem L-NukleinsäureJTeil und dem Nicht- Nukleinsäure-Teil direkt oder indirekt erfolgen kann. Eine indirekte Verknüpfung liegt insbesondere dann vor, wenn zwischen dem L-Nukleinsäure-Teil | und dem Nicht-L- Nukleinsäure-Teil ein Linker, beispielsweise ein hierin beschriebener Linker angeordnet ist und dieser eine oder beide der funktionalen Gruppen zur Verfügung stellt.
Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass zwischen dem L-Nukleinsäure-Teil und dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil(en) ein oder mehrere sogenannter Linker eingebaut werden kann. Ein derartiger Linker besteht typischerweise aus mindestens einer funktionalen Gruppe sowie einem Abstandshalter oder Spacer. Die Funktion des Linkers klann zum einen darin bestehen, die Kopplungsreaktion zu erleichtem. In Ergänzung oder alternativ dazu kann ihm eine Funktion dergestalt zukommen, dass eine räumliche Distanz zwischen dem L-Nukleinsäure-Teil und dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil der modifizierte L-Nukleinsäure aufgebaut wird. Eine derartige Distanz ist unter bestimmten Bedingungen von Vorteil, bspw. dann, wenn Wechselwirkungen zwischen den die modifizierte L-Nukleinsäure aufbauenden Teilen, ι| insbesondere zwischen dem L-Nukleinsäure-Teil und dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil oder zwischen zwei oder mehreren Nicht-L-Nukleinsäure-Teilen der modifizierten L-Nukleinsäure verhindert werden sollen.
Der Linker selbst kann wiederum eine oder mehrere funktioneile Gruppen umfassen und an einer der oben genannten Stellen des L-Nukleinsäure-Teils an diesen gekoppelt sein. Typischerweise besteht der Spacer, u.a. aus unterschiedlich langen Alkylketten, wobei eine Kettenlänge von 1 bis 20, insbesondere 4 bis 15 und ganz besonders 6 bis 12 C-Atomen bevorzugt ist. Die Alkylkette kann selbst verzweigt sein oder weitere funktionelle Gruppen tragen. Eine typische Ausführungsform des Spacers umfasst Etherverknüpfungen zwischen einzelnen Monomeren wie diese bspw. bei Poly(ethylen)glykol oder Polyoxypropylen vorhanden sind, wobei hier oftmals die einzelnen Monomeren in den Polymeren 1- bis 20-mal vorhanden sind. Auch bei der Ausbildung des Spacers durch Polyaminalkyl- oder Polyamidoalkyl-Ketten ist eine Häufigkeit der diese 11 Polymeren aufbauenden Monomeren mit einem Wert von 1 bis 201 üblich.
Der Linker kann entweder an eines der L-Nukleotide gekoppelt sein, die den L-Nukleinsäure- Teil der modifizierte L-Nukleinsäure ausbilden. Alternativ kann der Linker auch während der enzymatischen oder chemischen Synthese der L-Nukleinsäure in das entstehende Oligomer eingebaut werden. Desweiteren ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die L- Nukleinsäure post-synthetisch modifiziert und dadurch mit einem Linker für die Kopplung eines Nicht-L-Nukleinsäure-Teils versehen wird.
Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein Linker zum Beispiel an eine abasische Position in einem Hairpin-Loop oder am 3'- oder 5 '-Ende oder einer anderen Position, eingebaut wird. Handelt es sich bei der L-Nukleinsäure um ein Spiegelmsr kann die abasische Position an einer Position des Spiegeimers eingebaut sein, die nicht für die Bindung des Zielmoleküls bzw. für die Struktur des Spiegeimers essentiell wichtig ist. Mit abasischer Position soll hierin eine Stelle des L-Nukleinsäure-Teils bezeichnet werden, die analog zu einem normalen L-Nukleotid das gleiche Rückgrat aus Phosphat und Zucker besitzt, bei der die
Nukleobase jedoch durch ein Wasserstoffatom oder einen Linker substituiert ist, wie dies auch in Fig. 24 dargestellt ist.
Die modifizierten L-Nukleinsäuren, die hierin auch als L-Nukleinsäure-JKonjugate bezeichnet werden, können, wie bereits aus der oben angegebenen Aufstellung hinsichtlich der
Verknüpfungsorte zwischen dem L-Nukleinsäure-Teil und dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil ersichtlich, durch eine Vielzahl von Reaktionen hergestellt werden, wie im folgenden detaillierter ausgeführt wird
Säureamide können hergestellt werden durch Umsetzung von N-Hydroxysuccinimid
(NHS) oder ähnlichen Aktivierungen von Carbonsäuren, wie Anhydrid, Säurechlorid, Ester,
1 p
Succinimid und Maleimid mit einem primären oder sekundären Amin 1>2.
Thioether können ausgehend von einem Halogenid und einem Thiol hergestellt werden 3>4 und anschließend Gegenstand einer Oxidation zu Sulfoxid oder Sulfon sein 5>6 . Halogenide, insbesondere Haloacetyl (Iodessigsäure, Bromessigsäure), können an eine' beliebige funktionale Gruppe eines der beiden L-Nukleinsäure-Teile per Ester- oder Säureamidbindung gekoppelt werden und anschließend die sehr reaktive Iod- oder Bromgruppe mit einem- freien Thiol gekoppelt werden. Haloacetyl stellt somit einen Spezialfall der Halogenid-Thiol-Kopplung dar. 1
. Thioether können außerdem ausgehend von Maleimid und Thiol hergestellt werden '"",
Isothioharnstoff aus Isothiocyanat und Amin 10, Isoharnstoff ausgehend von Isocyanat und
Amin H, Carbamat ausgehend von Isocyanat und Alkohol 2, C-C-Verknüpfungen mittels
Diels-Alder-Reaktion 13, Heterocyclen durch 1,3-dipolare Cycloaddition 13, Amine durch ι ι reduktive Aminierung, im Anschluss an die Umsetzung von beispielsweise Aldehyd oder Keton mit einem Amin unter anschließender Reduktion 14, Säureamid ausgehend von einer Säure und einem Amin 15,16^ Ester ausgehend von Carbonsäure oder den oben erwähnten aktivierten Carbonsäuren und Alkohol, Sulfonamid ausgehend von Amin und Sulfonylchlorid 17, sekundäre Amine ausgehend von einem Epoxid und einem Amin °> 9} Thioether ausgehend von einem Epoxid und einem Thiol 20? em Disulfid ausgehend von einem Thiol und einem weiteren Thiol oder einem Disulfid 21,225 Hydrazone ausgehend von einem Hydrazin und einem Aldehyd oder einem Keton, wobei das Hydrazon weiter zu einem stabilen modifizierten Hydrazin reduziert werden kann 235 Phosphothioate ausgehend von einem Phosphat oder einer aktivierten Phosphorsäure wie beispielsweise Phosphoroimidazolid und einem Thiol 2 5 Phosphoramidat ausgehend von einem Phosphat oder einer aktivierten Phosphorsäure wie beispielsweise Phosphoroimidazolid oder Phos-N-Hydroxydbenzotriazol und einem Amin 24-27, Dabei ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist, zuerst einen Linker über eine Phosphoramidat- oder Phosphothioat- Verknüpfung an den L-Nukleinsäure-Teil zu koppeln und anschließend an den Nicht-L-Nukleinsäure-Teil. Derartige Linker können insbesondere | Ethylendiamin oder Cysteamin sein.
Die vorstehenden Ausführungen gelten grundsätzlich sowohl für den Fall, dass die erstgenannte reaktive Ausgangsgruppe am Nicht-L-Nukleinsäure-Teil angeordnet ist, wie für den Fall, dass diese am L-Nukleinsäure-Teil angeordnet ist. Die entsprechende Modifikation der L- Nukleinsäure in dem Sinne, dass eine entsprechende reaktive Gruppe bereitgestellt wird, ist den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Gleiches gilt für den Nicht-L-Nuk insäure-Teil.
Der Begriff L-Nukleinsäure wird hierin synonym zu dem Begriff L-Oligonukleotide oder L- Polynukleotide verwendet und bezeichnet, unter anderem, sowohl L-Desoxyribonukleinsäure wie auch. L-Ribonukleinsäure und Kombinationen davon, d. h. dass einzelne oder eine Gruppe von Nukleotiden als RNA vorliegt und die weiteren die Nukleinsäure aufbauenden Nukleotide als DNA vorliegen und umgekehrt. Dabei ist auch vorgesehen, dass anstelle von Desoxyribose oder Ribose andere Zucker die Zuckerkomponente des Nukleotids ausbilden. Weiterhin umfasst ist die Verwendung von Nukleotiden mit weiteren Modifikationen an Position 2' wie NH2, OMe, OEt, OAlkyl, NHAlkyl und die Verwendung von natürlichen oder unnatürlichen Nukleobasen wie zum Beispiel Isocytidin, Isoguanosin. Es ist dabei auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die L-Nukleinsäure sogenannte abasische Positionen aufweist, d. h. Nukleotide, denen die Nukleobase fehlt. Derartige abasische Positionen können sowohl innerhalb der Nukleotidsequenz der L-Nukleinsäure angeordnet sein, wie auch an einem oder beiden der Enden, d. h. dem 5'- und/oder dem 3'- Ende.
Weiter ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die L-Nukleinsäure ein oder mehrere D-Nukleoside oder D-Nukleotide enthält. Dabei kann das eine oder die mehreren D-Nukleoside oder Nukleotide sowohl innerhalb der L-Nukleinsäure angeordnet sein, wie auch an einem oder beiden der Enden der L-Nukleinsäure. Das einzelne D-Nukleosid oder D-Nukleotid kann dabei eine oder mehrere Modifizierungen tragen, beispielsweise zur Erhöhung der Stabilität des Nukleosids bzw. Nuklotids bzw. dessen Bindung an die L-Nukleinsäure.
Die L-Nukleinsäure kann grundsätzlich doppel- oder einzelsträngig vorliegen. Typischerweise handelt es sich um eine einzelsträngige L-Nukleinsäure, die jedoch bedingt durch ihre Primärsequenz definierte Sekundärstrukturen und damit auch Tertiärstn uren ausbilden kann. In der Sekundärstruktur liegen bei einer Vielzahl von L-Nukleinsäurenj auch doppelsträngige Abschnitte vor.
Die L-Nukleinsäuren können neben der hierin insbesondere beschriebenen hoch-molekularen Modifizierung auch Modifikationen hinsichtlich der einzelnen Nukleoiide der Nukleinsäure bezeichnen, wobei hier z. B. die 2'-OH-Gruppe des Zuckeranteilsj der Nukleotide als Methylether vorliegen kann, wie bereits vorstehend offenbart.
Bei den hierin beschriebenen L-Nukleinsäuren bzw. L-Nukleinsäure-Teilen handelt es sich bevorzugterweise um funktionale Nukleinsäuren. Zu den funktionalen Nukleinsäuren gehören unter anderem Aptamere, Spiegelmere, Ribozyme und Aptazyme. Bevorzugterweise sind die L- Nukleinsäuren bzw. L-Nukleinsäure-Teile Spiegelmere. Wie eingangs bereits erwähnt, sind Spiegelmere Nukleinsäuren, die an ein Zielmolekül oder einen Teil davon binden und aus L- Nukleotiden aufgebaut sind, zumindest in dem das Zielmolekül | bindenden Teil der Nukleinsäure. Sie sind bevorzugterweise das Ergebnis des Kontaktierens einer Nukleinsäurebibliothek, insbesondere einer statistischen Nukleinsäurebibliothek, mit dem Zielmolekül sind.
Für ein« Selektionsverfahren zur Entwicklung funktionaler Nukleinsäuren werden zünächsf kombinatorische DNA-Bibliotheken hergestellt. In der Regel handelt es sich um die Synthese von DNA-Oligonukleotiden, die zentral einen Bereich aus 10 -100 randomisierten Nukleotiden enthalten, die von zwei primer-Bindungsregionen 5'- und 3'-terminal flankiert werden. Die Herstellung derartiger kombinatorischer Bibliotheken ist bspw. beschrieben in Conrad, R.C., Giver, L., Tian, Y. and Ellington, A.D., 1996, Methods Enzymol., Vol 267 J 336-367. Eine solche chemisch synthetisierte einzelsträngige DNA-Bibliothek lässt sich über die Polymerase- Kettenreaktion in eine doppelsträngige Bibliothek überführen, die für sichj genommen schon für eine Selektion eingesetzt werden kann. In der Regel erfolgt jedoch mit geeigneten Methoden eine Separation der einzelnen Stränge, so dass man wieder zu einer Einzelstrangbibliothek gelangt, die für das in vitro Selektions verfahren eingesetzt wird, wenn es sich um eine DNA- Selektion handelt (Bock, L.C., Griffin, L.C., Latham, J.A., Vermaas, E.H. und Toole, J.J., 1992, Nature, Vol. 355, 564-566). Es ist jedoch ebenso möglich, die chemisch synthetisierte DNA- Bibliothek direkt in die in vitro Selektion einzusetzen. Darüber hinaus kann prinzipiell aus doppelsträngiger DNA, wenn zuvor ein T7 Promotor eingeführt worden ist, auch über eine geeignete DNA-abhängige Polymerase, z. B. die T7 RNA Polymerase, eine RNA-Bibliothek erzeugt werden. Mit Hilfe der beschriebenen Verfahren ist es möglich, Bibliotheken von 1015 und mehr DNA- oder RNA-Molekülen zu erzeugen. Jedes Molekül aus dieser Bibliothek hat eine andere Sequenz und somit eine andere drei .di.mensi.onale Struktu ιr. Ü ..ber das in vitro Selektionsverfahren ist es nun möglich, aus der erwähnten Bibliothek durch mehrere Zyklen von Selektion und Amplifikation sowie gegebenenfalls Mutation ein oder mehrere DNA-Moleküle zu isolieren, die gegen ein gegebenes Target eine signifikante Bindungseigenschaft aufweisen. Die Targets können z. B. Viren, Proteine, Peptide, Nukleinsäuren, kleine Moleküle wie Metaboliten des Stoffwechsels, pharmazeutische Wirkstoffe oder deren Metaboliten oder andere chemische, biochemische oder biologische Komponenten sein wie beis ielsweise in Gold, L., Polisky, B., Uhlenbeck, O. und Yarus, 1995, Annu. Rev. Biochem. Vol. 64, 763-797 und Lorsch, J.R. und Szostak, J.W., 1996, Combinatorial Libraries, Synthesis, Screening and application Potential, ed. Riccardo Cortese, Walter de Gruyter, Berlin, beschrieben. Das Verfahren Wird in der Weise durchgeführt, dass bindende DNA- oder RNA-Moleküle aus der ursprünglich eingesetzten Bibliothek isoliert werden und nach dem Selektionsschrift mittels Polymerase-
I
Kettenreaktion amplifϊziert werden. Bei RNA-Selektionen ist vor dem Amplifikationsschritt durch Polymerase-Kettenreaktion eine reverse Transkription vorzuschalten. Eine nach einer ersten Selektionsrunde angereicherte Bibliothek kann dann in eine erneute Selektionsrunde eingesetzt werden, so dass die in der ersten Selektionsrunde angereicherten Moleküle die Chance
I haben, durch Selektion und Amplifikation sich emeut durchzusetzen! und mit noch mehr Tochtermolekülen in eine weitere Selektionsrunde zu gehen. Gleichzeitig eröffnet der Schritt der Polymerase-Kettenreaktion die Möglichkeit, neue Mutationen bei der Amplifikation z.B. durch die Variation der Salzkonzentration einzubringen. Nach genügend vielen Selektions- und Amplifikationsrunden haben sich die bindenden Moleküle durchgesetzt. Es ist so ein angereicherter Pool entstanden, dessen Vertreter durch Klonierung vereinzelt und anschließend mit den gängigen Methoden der Sequenzbestimmung von DNA in ihrer Primärstruktur bestimmt werden können. Die erhaltenen Sequenzen werden dann auf ihre Bindungseigenschaften hinsichtlich des Targets überprüft. Das Verfahren zur Erzeugung derartiger Aptamere wird auch als SELEX-Verfahren bezeichnet und ist bspw. beschrieben in EP| 0 533 838, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Die besten Bindungsmoleküle können durch Verkürzung der Primärsequenzen auf ihre wesentliche Bindungsdomäne hin verkürzt und durch chemische oder nzymatische Synthese dargestellt werden.
Eine besondere Form von solchermaßen herstellbaren Aptameren sind die sogenannten Spiegelmere, die sich im wesentlichen dadurch auszeichnen, dass sie zumindest teilweise, bevorzugt vollständig aus den nicht-natürlichen L-Nukleotiden aufgebaut sind. Verfahren zur Herstellung derartiger Spiegelmere sind beschrieben in PCT/EP97/04726, deren Offenbarung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Besonderheit des darin beschriebenen Verfahrens liegt in der Erzeugung von enantiomeren Nukleinsäuremqlekülen, d.h. von L-
Nukleinsäuremolekülen, die an ein natives, d.h. in der natürlichen Form oder Konfiguration i vorliegendes Target oder eine derartige Targetstruktur binden. Das oben! beschriebene in vitro Selektionsverfahren wird dazu eingesetzt, bindende Nukleinsäuren oder Sequenzen zunächst gegen die Enantiomere, d.h. nicht natürlich vorkommenden Struktur eines natürlicherweise i * vorkommenden Targets zu selektieren, beispielsweise im Falle, dass das Zielmolekül ein Protein ist, gegen ein D-Protein. Die so erhaltenen Bindungsmoleküle (D DNA, D-RNA bzw. entsprechende D-Derivate) werden in ihrer Sequenz bestimmt und die identische Sequenz wird dann mit spiegelbildlichen Nukleotidbausteinen (L-Nukleotide bzw. L-Nukleotidderivate) synthetisiert. Die so erhaltenen spiegelbildlichen, enantiomeren Nukleinsäuren (L-DNA, L-RNA bzw. entsprechende L-Derivate), sogenannte Spiegelmere, haben aus Symmetriegründen eine spiegelbildliche Tertiärstruktur und somit eine Bindungseigenschaft für das in der natürlichen Form oder Konfiguration vorliegende Target.
Die vorstehend beschriebenen Zielmoleküle, auch als Target bezeichnet, können Moleküle
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Komponenten.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Figuren und Beispiele weiter erläutert, aus denen sich weitere Vorteile, Ausgestaltungsformen und Merkmale der Erfindung ergeben. Fig. 1
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Nukleinsäureteil einer modifizierten L-Nukleinsäure. Über' die Amingruppe kann der Nicht-L-Nukleinsäure-Teil an den L-Nukleinsäure-Teil gekoppelt und damit die erfindungsgemäße modifizierte L-Nukleinsäure ausgebildet werden.
Fig. 2 zeigt weitere Linker, wobei die mit (2), (4) und (6) beze jhneten Strukturen den
Linkem gemäß (1), (3) und (5) entsprechen, wobei bei letzteren jedoch der mit dem Rest R versehene Phosphatteil bevorzugterweise den L-Nukleinsäure-Teil darstellt und über die mit X bezeichnete funktionelle Gruppe der Nicht-L- Nukleinsäure-Teil der modifizierten L-Nukleinsäure an1 die L-Nukleinsäure gekoppelt wird. Die Bezeichnung „Oligo" steht dabei beispielhaft für ein
Oligonukleotid, wobei es auch im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist, dass es sich dabei bzw. bei den L-Nukleinsäuren oder Nukleinsäure-Teilen hierin allgemein um L-Polynukleotide handeln kann Die verschiedenen
Substituenten bezeichnen dabei die folgenden reaktiven Gruppen, die einzeln und jeweils unabhängig voneinander sind:
X = OH, NH2, HS, Hai, CHO, COOH Y = O, NH, NMe, S, CH2
Z Z2, Z3, Z4, Z5 und Z6 = H, Me, Alkyl, HO(CH2)n, HOJ H2N (CH2)n, H2N, F, wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist und wobei Alkyl lineare und verzweigte Kohlenwasserstoffketten mit bevorzugterweise 1-20 C- Atomen bevorzugtererweise 1 bis 4 C-Atomen und/oder -(CH2)nH, CH[(CH2)nH][(CH2)mH], -C[(CH2)nH][(CH2)mH][(CH2),H],
-(CH2)n(CH)m[(CH2),H][(CH2)kH], -(CH2)n(C)m[(CH2 ),H| [(CH2)kH][(CH2)jH], bezeichnet, wobei n, m, 1, k und j unabhängig voneinander ganze 'Zahlen zwischen 1 und 8, bevorzugterweise 1 bis 4 C-Atome sind.
Fig. 3 zeigt eine Übersicht verschiedener Linker, die an verschiedene Positionen der
Nukleobasen gekoppelt sind. Dabei ist beachtlich, dass ι der Zuckeranteil des jeweils dargestellten Nukleosids eine Ribose, eine Desoxyribose oder eine modifizierte Ribose bzw. modifizierte Desoxyribose sein kann und der Rest X = H, HO, H2N, MeO, EtOH oder Alkoxy sein kann. Alkoxy bezeichnet dabei insbesondere lineare und verzweigte Oxykohlenwasserstqffketten mit 1-20 C- Atomen, bevorzugterweise 1 bis 4 C-Atomen und/oder -O(CH2)nH, - OCH[(CH2)nH][(CH2)mH], -OC[(CH2)nE:][(CH2)mH][(CH2),H],
-O(CH2)n(CH)m[(CH2),H][(CH2)kH], -O(CH2)n(C)m[(CH2),H]
[(CH2)kH][(CH )jΗ], wobei n, m, 1, k und j unabhängig von inander ganze Zahlen zwischen 1 und 20, bevorzugterweise 1 bis 4 C-Atome sind. Die eigentliche Linkerstruktur ist bei allen vier dargestellten Nukleosiden (1), (2), (3) und (4) Xp [Y]n, wobei n eine ganze Zahl zwischen 0 und 20 ist. Xi stellt eine funktionelle Gruppe dar, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die HO, H2N, HRN, HS, SSR, Hai, CHO, COOH, COOR und COHal umfasst. Bei den in den Strukturformeln (5-12) angegebenen Linkern ist n ebenfalls eine ganze Zahl zwischen 0 und 20 und Z bedeutet unabhängig von anderen Substituenten, en eder O, NH, NR oder S, wobei R für Alkyl steht, wie hierin definiert.
Fig. 4 zeigt mögliche Linker an Position 5 von Pyrimidin-Nukleosiden bzw. -
Nukleotiden. Hinsichtlich der Reste R', R" und R'" gilt das im Zusammenhang mit Fig. 5 Ausgeführte sinngemäß. Der Linker R weist die Struktur -[Y]n-Xι auf und kann bevorzugterweise die in den Strukturen (2) bis (9) gezeigten Formen annehmen, wobei auch hier Z unabhängig von der Wahl der anderen Substituenten O, NH, NHR oder S bedeuten kann und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 sein kann. Die funktionelle Gruppe Xi ist bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe, die HO, H2N, HRN, HS, SSR, Hai, CHO, qOOH, COOR, COHal aufweist.
Fig. 5 zeigt in 1 den grundsätzlichen Aufbau von Cytosin, welches an seinem exocyclischen Amin verschiedene Linkerstrukturen aufweisen kann. Dabei bezeichnet R' eine L-Nukleinsäure oder ein L-Polynukleoti 1, OH oder Phosphat, R" eine L-Nukleinsäure oder ein L-Polynukleotid, OH oder Phosphat und R"' H, OH, OMe, OEt, NH2. Der Rest R bezeichnet dabei den Linker, der die Grundstruktur-[Y]n-Xι aufweist und die in (2) bis (9) gezeigten Strukturformeln aufweisen kann, wobei Z = O, NH, NR, S und n eine ganzej Zahl zwischen 1 und 20 sein kann. Die funktionelle Gruppe Xi ist bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe, die HO, H2N, HRN, HS, SSR, Hai, CHO, COOH, COOR, COHal aufweist.
Fig. 6 zeigt die Ausbildung einer erfindungsgemäß modifizierten JL-Nukleinsäure durch
Reaktion von PEG-NHS mit einer mit einem Linker versehenen L-Nukleinsäure. Nach erfolgreicher Kopplung liegt die modifizierte L-Nukleinsäure vor, die im vorstehenden Fall als Nicht-L-Nukleinsäure-Teil PEG umfasst und als L- Nukleinsäure in diesem konkreten Falle ein Oligonukleotid, wobei zwischen beiden ein eine Aminogruppe tragender Linker bzw. Spacer zwischengeschaltet ist und es zwischen dem Linker und dem PEG zu einer Säureamidbindung kommt. Neben der modifizierten L-Nukleinsäure wird als weiteres Reaktionsprodukt das von PEG abgespaltene N-Hydroxysuccinimid erhalten. Als mögliche Reste R sind H, CH und allgemein Alkylketten mit einer Länge von 1- 20 bevorzugt. Die funktionelle Gruppe kann prinzipiell das Produkt einer jeden der hierin vorstehend ausgeführten Reaktionen sein. Insoweit gelten die dort und in Verbindung mit den weiteren Figuren, insbesondere Fig. 2 und 3, beschriebenen Ausgestaltungen des Linkers auch in diesem Zusammenhang. Gleiches gilt auch für die in der Formel dargestellten Substituenten und Laufvariablen wie n.
Fig. 7 zeigt die Umsetzung verschiedener PEG-Derivate mit verschiedenen Linkern.
Dabei unterscheiden sich die beiden Reaktionen (1) und (2) lediglich darin, dass bei Reaktion (1) die Carboxylgruppe am PEG und in Reaktion (2) die Carboxylgruppe an einem mit einem Linker versehenen L-Oligonukleotid vorhanden ist. Bei der fύnktionellen Gruppe des jeweils korrespondierenden Reaktionspartners, d. h. im Falle der Reaktion (1) der mit einem Linker versehenen L-Nukleinsäure, im Falle der Reaktion (2) der mit einer Amingruppe versehenen PEG. Damit wird die im Zusammenhang mit den verschiedenen oben angeführten Reaktionen, die zwischen L-Nukleinsäure-Teil und Nicht-L- Nukleinsäure-Teil, ggf. unter Beteiligung eines oder mehrerer zwischengeschalteter Linker, möglich sind, gemachte Aussage bestätigt, dass grundsätzlich die genannten reaktiven Gruppen bei allen beteiligten Reaktionspartnern vorhanden sein können. Die letzten Endes erhaltenen Strukturen werden sich entsprechend unterscheiden, so im Falle der Reaktion (1), wo eine Säureamidgruppe am PEG vorhanden ist, und im Falle der Reaktion (2), wo die Säureamidbindung am Konstrukt aus Linker und Oligonukleotid, d. h. L-
Nukleinsäure, vorhanden ist. Hinsichtlich der Substituenten R gilt das im Zusammenhang mit Fig. 6 Gesagte entsprechend.
Fig. 8 zeigt die Reaktion eines Halogenids mit einem Thioester, die entweder am Nicht-
L-Nukleinsäure-Teil bzw. am L-Nukleinsäure-Teil angebracht sind. Bei den Reaktionen (1) bis (3) ist dabei vorgesehen, dass die L-Nukleinsäure, hier Wie bei allen Figuren verkürzend als oligo bezeichnet, mit einem Linker versehen ist und der Linker ein Halogenid, wie beispielsweise I, Br, Cl trägt. Diese derivatisierte L-Nukleinsäure wird sodann mit einem mit einer Thiolgruppe, bevorzugt einer terminalen Thiolgruppe, versehenen PEG umgesetzt. Im Falle der Reaktion (1) kommt es dabei zu einer Thioetherbindung zwischen Linker und PEG. Durch Oxidation kann es, wie in Reaktion (2) dargestellt, zur Ausbildung eines Sulfoxids bzw. eines Sulfons kommen. Bei den Reaktionen gemäß (4) bis (6) erfolgt ebenfalls eine Umsetzung zwischen einem Thiol und einem Halogenid, wobei in diesen Fällen die L-Nukleinsäure mit der Thiolgruppe versehen ist und der Linker das Halogenid trägt. Entsprechend kommt es zur Ausbildung von Verbindungen, bei denen der Schwefel zwischen der L-Nukleinsäure und dem Linker angeordnet ist und dieser, wie in den Reaktionen (5) und (6) dargestellt, wiederum zu den entsprechenden Derivaten oxidiert werden kann.
Fig. 9 zeigt die Reaktion des mit einer Maleimid-Gruppe versehenen PEG mit einer L-
Nukleinsäure, dort als oligo bezeichnet, die einen eine Thiol-Gruppe tragenden Linker aufweist. Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um einen Thioether .
Fig. 10 zeigt die Reaktion einer Phosphat-tragenden L-Nukleinsäure mit einem PEG, das mit einem eine Thiol-Gruppe tragenden Linker versehenen ist. Das Reaktionsprodukt ist ein Phosphothioat.
Fig. 11 zeigt die Reaktion einer mit einem Phosphatrest - ggf. terminal - versehenen L-
Nukleinsäure mit einem PEG, das mit einem ein Amin aufweisenden Linker versehenen ist. Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um ein Phosphoramidat. Hinsichtlich des Restes R gilt das im Zusammenhang mit Flg. 6 Ausgeführte.
Fig. 12 zeigt den Einbau einer reaktiven Amino- bzw. Thiolgruppe in eine L-
Nukleinsäure unter Verwendung einer aktivierten Phosphatgruppe, bevorzugterweise einer terminalen Phosphatgruppe der L-Nukleinsäure. Hierbei wird in einem ersten Schritt ein Phosphorimidazolid (I) hergestellt, welches unter Verwendung eines Ethylendiamins im Falle der Reaktion (2) zur Ausbildung eines 2-Aminoethylen-l-phophoramidat (II) bzw. im Falle [der Reaktion (3) unter Verwendung von Cysteamin zu 2-Thioethylen-l-phophoramidat (III) führt. Die Verbindungen gemäß (II) und (III) können sodann mit Nicht-L-Nukleinsäuren, insbesondere den hierin offenbarten Verbindungen, umgesetzt werden.
Fig. 13 zeigt die Reaktion eines mit einer Sulfonylchlorid-Gruppel versehenen PEGs mit einer L-Nukleinsäure, die einen Linker aufweist, der eine Amingruppe trägt. Das i Reaktionsprodukt ist ein Sulfonamid. Hinsichtlich des Restes R gilt das im
Zusammenhang mit Fig. 6 Ausgeführte.
Fig. 14 zeigt die Reaktion eines mit einer Epoxid-Gruppe versehenen PEG mit einer L-
Nukleinsäure, welche einen mit einer Amin-Gruppe versenenen Linker aufweist i unter Ausbildung eines Amins. Hinsichtlich des Restes ]R gilt das zu Fig. 6 Ausgeführte.
Fig. 15 zeigt die Reaktion eines mit einer Epoxid-Gruppe versehenen PEG mit einer L-
Nukleinsäure, die einen eine Thiol-Gruppe aufweisenden Linker trägt. Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um einen Thioether.
Fig. 16 ι zeigt die Reaktion eines eine Isothiocyanat-Gruppe aufweisenden PEG mit einer
L-Nukleinsäure, die einen eine Amin-Gruppe aufweisenden Linker trägt. Das Reaktionsprodukt ist ein Isothioharnstoff. Hinsichtlich de^ Restes R gilt das im Zusammenhang mit Fig. 6 Ausgeführte.
Fig. 17 zeigt die Reaktion eines mit einer Isocyanat-Gruppe versehenen PEG mit einer L-
Nukleinsäure, die einen eine Amin-Gruppe tragenden Linker aufweist, unter Ausbildung eines Isohamstoffes. Hinsichtlich des Restes R gilt das im Zusammenhang mit Fig. 6 Ausgeführte.
Fig. 18 zeigt die Reaktion eines mit einer Isocyanat-Gruppe versehenen PEG mit einer L-
Nukleinsäure, die eine freie OH-Gruppe trägt, die direkt vcn der L-Nukleinsäure, wie beispielsweise einer Phosphatgruppe oder dem Zucker :eil des Nukleosids, d. h. den Positionen 2'-OH, 3'-OH oder 5'-OH stammen kann. Alternativ kann die i
OH-Gruppe an die L-Nukleinsäure über einen geeigneten Linker verknüp'ft sein. Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um ein Carbamat'
Fig. 19 zeigt die Reaktion einer Aldehyd- oder Keto-Gruppe mit einer Amino-Gruppe, die jeweils entweder an dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil j (Reaktion (1)), im dargestellten Falle an PEG, oder an dem L-Nukleinsäure-Teil (Reaktion (2) vorhanden ist. Der L-Nukleinsäure-Teil weist dabei bevorzugterweise einen Linker auf, der die jeweilige reaktive Gruppe, d. h. die Amino-Gruppe oder die Carbonyl-Gruppe, trägt. Im Falle der Reaktion (1) trägt das PEG die Amino- Gruppe, wohingegen die L-Nukleinsäure einen Linker aufweist, der eine Carbonyl-Gruppe trägt. Das unmittelbar erhaltene Reaktionsprodukt Imin wird sodann durch Reduktion in ein Amin überführt. Im Falle der Reaktion (2) wird das eine Carbonyl-Gruppe tragende PEG mit einer L-Nukleinsäure umgesetzt, die einen Linker trägt, der eine Amino-Gruppe aufweist. Das Reaktionsprodukt Imiή wird reduziert und fuhrt zu einem Amin. Hinsichtlich des Restes R gilt das zu Fig. 6 Ausgeführte.
Fig. 20 zeigt die Reaktion eines mit einer Thiol-Gruppe versehenen PEG mit einer L-
Nukleinsäure, die einen ebenfalls mit einer Thiol-Gruppe versehenen Linker trägt. Bei dem Reaktionsprodukt handelt es sich um eine modifizierte L-Nukleinsäure, die über eine Disulfid-Gruppe zwischen dem PEG und der L-Nukleinsäure, genauer gesagt dem daran gebundenen Linker, verfügt.
Fig. 21 zeigt die Reaktion eines mit einer Hydrazin-Gruppe versehenen PEG mit einer L-
Nukleinsäure, die einen eine Carbonyl-Gruppe umfassenden Linker trägt. In einem ersten Reaktionsschritt wird ein Hydrazon erhalten, welches sodann reduktiv in ein substituiertes Hydrazin überfuhrt wird. Hinsichtlich des Restes R gilt das im Zusammenhang mit Fig. 6 Ausgeführte.
Fig. 22 zeigt in Reaktion (1) die Umsetzung eines mit einem konjugierten Dien versehenen PEG mit einer L-Nukleinsäure, die einen Linker mit einer sogenannte dienophile Gruppe trägt. Das Dienophil besteht aus einer C -C-Doppelbindung, die wiederum einen Substituenten Z aufweist, der eine elektronenziehende Gruppe umfasst. Dabei kann es sich bevorzugterweise um N02, CH2C1, COOR, CN oder
Maleimid handeln. Hinsichtlich des Restes R gilt das zu Fig. 6 Ausgeführte.
Infolge dieser Reaktionen kommt es zur Ausbildung einer modifizierten L- i Nukleinsäure, die zwischen dem PEG und der mit einem! Linker versehenen L-
Nukleinsäure eine Hexenyl-Gruppe. Die in Reaktion (2) gezeigte Diels-Alder-
Reaktion geht von einem PEG aus, welches ein Dienophil mit dem Substituenten
Z aufweist, das mit einer L-Nukleinsäure, die einen Linker umfasst, 'der ein konjugiertes Dien trägt. Hinsichtlich des Substitueηten Z gilt das im
Zusammenhang mit Reaktion (1) Gesagte. Das Reaktionsprodukt ist bei dieser
Reaktion (2) ebenfalls ein über eine Hexenyl-Gruppe verbundenes L-
Nukleinsäure-Konjugat.
Fig. 23 zeigt die Struktur der verwendeten verzweigten und linearen mPEG-NHS-Ester.
Fig. 24 zeigt in (1) den grundsätzlichen Aufbau eines abasischen Ii-Nukleosides, welches i anstelle der Nukleobase entweder ein Wassertstoffatom oder eine oder mehrere, optional verschiedene, Linkerstrukturen aufweisen kann, Dabei bezeichnet R' eine L-Nukleinsäure oder ein L-Polynukleotid, OH oder Phosphat, R" eine L- Nukleinsäure oder ein L-Polynukleotid, OH oder Phosphat und X = H, OH, OMe, OEt, NH2. Der Rest R bezeichnet entweder das Wasserjstoffatom anstelle der
Nukleobase oder den Linker, der die in (2) bis (8) gezeigten Strukturformeln aufweisen kann, wobei Z = CH2, O, NH, NR, S und n eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 sein kann. Die funktionelle Gruppe Xi ist bevorzugterweise ausgewählt aus der Gruppe, die HO, H2N, HRN, HS, SSR, Hai, CHO, (j∑OOH, COOR, COHal aufweist. Fig. 25 zeigt einen Aktivitätstest eines GnRH bindenden, PEGylierten DNA-Spiegelmers in männlichen, orchidektomierten Ratten.
Fig. 26a zeigt einen Aktivitätstest eines GnRH bindenden PEGylieiften DNA-Spiegelmers in vitro.
Fig. 26b1 zeigt einen Aktivitätstest eines GnRH bindenden njicht-PEGylierten und
PEGylierten DNA-Spiegelmers in vitro.
Fig. 27 zeigt eine Pharmakokinetik eines GnRH bindenden,, PEGylierten DNA-
Spiegelmers in Ratten.
Fig. 28a zeigt ein pharmakokinetisches Profil von PEGylierter L-RNA nach intravenöser
Gabe an Ratten.
Fig. 28b zeigt ein pharmakokinetisches Profil von nicht PEGylierter L-RNA nach intravenöser Gabe an Ratten.
Fig. 28c zeigt ein pharmakokinetisches Profil von PEGylierter L-RNA nach subkutaner
1 Gabe an Ratten.
Fig. 28d zeigt ein pharmakokinetisches Profil von nicht PEGylierter L-RNA nach subkutaner Gabe an Ratten.
Fig. 29 zeigt einen Aktivitätstest eines GnRH bindenden DNA-Spiegelmers in vivo in männlichen, orchidektomierten Ratten.
Beispiel 1 : Synthese von L-Nukleinsäure-PEG-Konjugaten
Die Bedingungen für die Synthese von L-Nukleinsäure-PEG-Konjugaten [ausgehend von der in SEQ TD NO:2 dargestellten L-Nukleinsäure und PEG, wobei das PEG dergestalt modifiziert war, dass es „entweder als NHS-Ester oder als primäres Amin zur Kopplung an ein Amin bzw. ein Phosphat vorlag, wurden untersucht. Dabei wurde so vorgegangen, dasp die Nukleinsäure in einem wässrigen System gelöst wurde. Der pH wurde durch verschiedene Puffer oder Basen wie zum Beispiel NaHCO3, NaH2PO4/Na2HP04, HEPES, MOPS, NH4OAc, Triethylamin auf pH 6.5
- 9.0 eingestellt. Der Einfluss eines Zusatzes von verschiedenen organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel DMF, DMSO, Acetonitril und anderen wurde ausgetestet, ! wobei der Anteil des
I organischen Lösungsmittels zwischen 0-100% variiert wurde. Anschli essend erfolgte die Zugabe
! von verschiedenen PEG-Derivaten wie zum Beispiel verzweigtem mPEG2-NHS-Ester, linearem mPEG-NHS -Ester oder mPEG-NH2 (Shearwater Corporatiόns) verschiedener Molekulargewichte zwischen 10.000 Da und 40.000 Da. Die Zugabe von PEG-NHS-Ester kann auf unterschiedliche Weisen erfolgen. So kann beispielsweise PEG-NHS-Ester in einer niedrig konzentrierten Säure wie zum Beispiel in 0,01 N HC1 gelöst oder in einem organischen Lösungsmittel wie zum Beispiel DMF gelöst langsam zugetropft oder als Feststoff zugegeben werden. Die bevorzugte Form der Zugabe von PEG-NHS ist portionsweise als Feststoff. Weiter wurde der Einfluss der Reaktionstemperatur zwischen 4°C-65°C getestet. Als Nukleinsäuren wurden Nukleinsäuren mit den folgenden Sequenzen verwendet. 5'-NH2-TAT TAG AGA C -3' (SEQ JX> NO:2), und 5'-PO4-TAT TAG AGA C -3' (SEQ. TD. No 3) sowie die Nukleinsäure gemäß SEQ. ID. No. 1. Die Ausbeuten der oben zusammengefassten Reaktionen lagen zwischen 5 - 78%.
Die bevorzugte Reaktionsvariante war die insgesamt sechsmalige Zugabe von je zwei Äquivalenten festem PEG-NHS-Ester im Abstand von etwa 30 Minuten zu einer Nukleinsäure gelöst in einem Lösungsmittel bestehend aus 60 Teilen H2O und 40 Teilen DMF unter Zusatz von NaHCO3 (0,2 M), einem pH von 8,0 und 37°. Diese Reaktionsbedingungen führten zu einer Ausbeute von 78 %.
Beispiel 2: Synthese eines L-Nukleinsäure-Phosphoramidat-PEG-Konjugajes
Ausgehend von einer L-Nukleinsäure mit der Sequenz 5'-PO4-TAT TAÖ AGA C-3' (SEQ D
NO:3) wurde ein entsprechendes Phosphoramidat-PEG-Konjugat hergestellt. Die L-
Nukleinsäure (10 OD) wurde mit PEG-NH2 (20.000 Da, linear, 1 - 10 Äquivalente) in wässriger
Lösung mit EDCI bei 50°C zu einem L-Nukleinsäure-Phosphoramidat-PEG-Konjugat i umgesetzt. Die Analyse und Aufreinigung verlief analog zu der PEGylierung von L-
Nukleinsäuren mit PEG-NHS, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Reaktionsbedingungen wurden nicht optimiert und führten zu einer Ausbeute von < 8 %. Beispiel 3: PEGylierung eines GnRH-Spiegelmer-Liganden
Figure imgf000029_0001
S i d i N kl i d di ifi h p H bi d d folgende Sequenz aufweist:
5' - CCA AGC TTG CGT AAG CAG TCT CCT CTC AGG GGA GGT TGG GCG GTG CGT AAG CAC CGGTTT GCA GGG G - 3' (SEQD NO:l)
Die Synthese des Spiegeimers mit der vorstehend aufgezeigten Sequejnz wurde auf einem Amersham Pharmacia Biotech Oligopilot II DNA-Synthesiser im 780-μMol Maßstab an einer 1000Ä CPG-Festphase (Controlled Pored Glass) nach der 2-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Chemie (Sinha et al. NAR, 12, 1984, p. 4539ff) durchgeführt. Anschließend wurde 6- (Monomethoxytritylamino)-hexyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-diiospropyl)-phosphoramidit an das 5'- Ende des Spiegelmeres (5'-MMT-Aminohexyl-Spiegelmer) gekoppelt, umj die post-synthetische Konjugation mit PEG zu ermöglichen.
Nach Beendigung der Synthese wurde das 5'-MMT-Aminohexyl-Spiegelmer durch 8-stündige Inkubation in 33%iger Ammoniaklösung bei 65°C von der Festphase abgespalten und komplett entschützt, danach zur Trockene eingeengt, in lOmM NaOH aufgenommen und mittels RP- HPLC gereinigt. Die Abspaltung der Monomethoxytrityl-Schutzgruppe erfolgte mit 0.4%> Trifluoressigsäure (TFA) in 30 min bei RT. TFA wurde durch zweimalige Koevaporation mit
Ethanol entfernt und das 5'-Aminohexyl-Spiegelmer gemäß SEQ. ID. No.l wurde durch Fällung in Ethanol gereinigt (Ausbeute: 5,000 OD, 7.5 μmol). Der Produktpeak wurde aufgesammelt und mittels Größenausschlußchromatographie über eine Sephadex G10 Säule oder durch Ultrafiltration (Labscale TFF System, Millipore) entsalzt.
Das solchermaßen 5 '-Amino-modifizierte GnRH-Spiegelmer (5,000 OD, 7.5 μmol) wurde in 0.2 M NaHC03, pH 8.5 / DMF 60:40 (v/v) (125 mL) vorgelegt, auf 37°C erwärmt und portionsweise mit pulverförmigem N-Hydroxysuccinimidyl (NHS) - aktiviertem Ester von verzweigtem 40,000 Da Poly(ethylen)glykol versetzt (2 eq (Äquivalente) alle 30 min zugeben, insgesamt 12 eq, 6 x 600 mg, 180 μmol). Der Reaktionsverlauf wurde durch analytische Gelektrophorese (8% Polyacrylamid, 8,3 M Harnstoff) verfolgt. Das Rohprodukt wurde zunächst durch Ionenaustausch-HPLC von überschüssigem PEG gereinigt (Source Q 30; Laufmittel A: H2O, Laufmittel B: 2 M NaCl; Flussrate 20 mL/min; Beladen der Säule und Eluieren von freiem PEG mit 10%o B; Elution des PEG-GnRH-Spiegelmer-Konjugates mit 50% B), anschließend wurde
I durch RP-HPLC PEGyliertes GnRH-Spiegelmer von nicht-PEGyliertem GnRH-Spiegelmer getrennt (Source RPC 15; Laufmittel A: 100 mM Triethylammonium acetat (TEAA), Laufmittel B: 100 mM TEAA in H2O/Acetonitril 5:95; Flussrate 40 mL/min; Beladen der Säule mit 10% B; Gradient von 10% auf 70% B in 10 Säulenvolumen, Elution von PEG-GnRH-Spiegelmer bei 45- 50% B), umgesalzt (Source Q 30; Laufmittel A: H2O, Laufmittel B: 2 M NaCl; Flussrate 20 mL/min; Beladen der Säule und Eluieren von freiem PEG mit 10% B; Elution von PEG-GnRH- i
Spiegeimer mit 50% B) und anschließend durch Gelfiltration (Sephadex j G10; Laufmittel H2O;
Flussrate 5 mL/min) oder Ultrafiltration (Labscale TFF System, Millipore) entsalzt. Durch
! Lyophilisation erhielt man das gewünschte Produkt als weißes Pulver (3,900 OD, 375 mg, 78%).
In analoger Weise wurden weitere L-Nukleinsäuren, einschließlich der Sequenz gemäß SEQ.ID.No. 1 mit verschiedenen PEG (linear 10.000 Dalton, linear 20.300 Dalton, verzweigt 20.000 Dalton, linear 35.000 Dalton), verknüpft und aufgereinigt.
I
Beispiel 4: Synthese von L-Nukleinsäure-FITC-Konjugaten: Kopplung von Fluorescein- Isothiocyanat an GnRH-Spiegelmer mit einem 5 '-NH2-C6-Linker
Das gemäß Beispiel 3 hergestellte 5 '-Amino-modifizierte GnRH-Spiegelmer wurde in 0.5 M NaHCO3 pH 8.5 vorgelegt, auf 65°C erwärmt und ein Überschuss Flύorescein-Isothiocyanat (FITC, 10 eq) wurde zum Reaktionsgemisch hinzugegeben. Die Reaktion wurde mittels analytischer RP-HPLC verfolgt. Es wurde für 48 h bei 65°C geschüttelt, überschüssiges FITC durch Centri-SpinlO (Princeton Separations) abgetrennt und mit Fluorescein markierte L- Nukleinsäure mit RP-HPLC aufgereinigt. Lyophilisation lieferte das gewünschte Produkt als gelbliches Pulver in quantitativer Ausbeute.
Beispiel 5: Aktivitätstest eines GnRH bindenden, PEGylierten DNA-Spiegelmers in vivo in männlichen, orchidektomierten Ratten
Männliche Ratten wurden orchidektomiert, wodurch der LH-Pegel der Ratten infolge des fehlenden Testosteron-Feedback-Signals über die folgenden acht Tage kontinuierlich anstieg. Am Tag 8 wurde das PEG-GnRH-DNA-Spiegelmer, d. h. das Konjugat iaus PEG und GnRH- Spiegelmer, sieben Ratten (150 mg/kg) intravenös verabreicht. Blutproben wurden am Tag 0 (vor der Orchidektomie), am Tag 8 (0 Stunden vor i. v. Applikation des PEG-GnRH- Spiegelmers), sowohl 0,5 Std., 1,5 Std., 3 Std., 6 Std. als auch 24 Std. nach der i. v. Applikation entnommen und der jeweilige LH-Spiegel mittels Radioimmunoassay (RIA) bestimmt. Parallel hierzu wurde sieben männlichen, orchidektomierten Ratten nur das Vehikel (PBS-Puffer, pH 7,4) i. v. als Negativ-Kontrolle und sieben männlichen orchidektomierten Ratten(der Standard- Antagonist Cetrorelix (100 μg/kg) als Positiv-Kontrolle s. c. verabreicht. D|as Ergebnis ist in Fig. 25 dargestellt.
Mit Ausnahme der Negativ-Kontrolle (in Fig. 25 mit Dreiecken bezeichnejt) kommt es unter der i Einwirkung des PEG-GnRH-Spiegelmers auch nach 24 Stunden noch zu einem LH-Spiegel, der vergleichbar ist demjenigen von nicht-orchidektomierten Ratten bzw. solchen Ratten, denen man den Standard-Antagonisten Cetrorelix verabreicht hatte. Dies belegt die Eignung des PEG- GnRH-DNA-Spiegelmers, die Wirkung des GnRH über einen langen Zeitraum nachhaltig zu beeinflussen. Dass die vorstehend beschriebene Wirkung des PEG-GnRH-DNA-Spiegelmers auf die PEGylierung des GnRH-Spiegelmers zurückgeht, ergibt sich aus der Tatsache, dass bei Applikation des GnRH-Spiegelmers ohne entsprechende Modifizierung bei subkutaner Applikation von 100 mg/kg bereits nach wenigen Stunden eine Abnahme der Aktivität des GnRH-Spiegelmers beobachtet werden konnte. Das Ergebnis ist ebenfalls in Fig. 29 dargestellt. Beispiel 6: Aktivitätstest von GnRH bindenden, PEGylierten und nicht PEGylierten DNA- Spiegelmeren in vitro in CHO-Zellen
Die hierin beschriebene Zellkulturstudie wurde an Chinese Hamster I Ovary (CHO)-Zellen durchgeführt, welche den Humanrezeptor für GnRH exprimieren. Dabei wurde die intrazelluläre Freisetzung von Ca2+-Ionen gemessen, da diese für die Signaltransduktioh wichtige Freisetzung nach Bildung des Agonist-Rezeptor-Komplexes erfolgt. Der Ca 2+ -Spieg i el wurde dann durch einen Ca2+-sensitiven Fluoreszenzfarbstoff bestimmt. Das PEG-GnRH-DNA-Spiegelmer bzw. das GnRH-Spiegelmer sollte den Agonisten GnRH abfangen und dadurch dessen Bindung an den Rezeptor auf die Zellmembran inhibieren. Dabei wurde experimentel so vorgegangen, dass der Agönist GnRH (2 nM) für 20 min mit dem GnRH-Spiegelmer bzw. mit dem PEG-GnRH- DNA-Spiegelmer in einem Konzentrationsbereich von 100 pM bis 1 μM präinkubiert wurde. Diese Lösung wurde sodann jeweils zu den mit Fluoreszenzfarbstoff beladenen CHO-Zellen gegeben und die jeweilige Ca2+-Konzentration an einem Fluroescence Imaging Plate Reader (FLIPR) bestimmt. Das Ergebnis des PEG-GnRH-DNA-Spiegelmers (ausgefüllte Dreiecke) und eines Standardantagonisten (ausgefüllte Vierecke), der hier als Positiv-Kontrolle verwendet wurde, ist in Fig. 26a dargestellt.
Die konzentrationsabhängige Bestimmung ergab eine sigmoidale Akti itätskurve, die darauf hinweist, dass sowohl das native, d. h. nicht modifizierte GnRH-Spiegelmer (ausgefüllte Vierecke), wie auch das mit PEG modifizierte GnRH-DNA-Spiegelmer (ausgefüllte Dreiecke) die Bildung des GnRH-Rezeptor-Komplexes zu 100 % inhibieren konnte. Der IC50 betrug 20 nM für das GnRH-Spiegelmer und 30 nM für das PEG-GnRH-DNA-Spiegelmer (Fig. 26b).
Beispiel 7: Pharmakokinetik eines GnRH bindenden, PEGylierten DNA-Spiegelmers in Ratten
Sieben männliche Wistar Ratten (Tierzucht Schönwalde GmbH Deutschland, Gewicht: 250-
300 g) wurden zur Bestimmung der pharmakokinetischen Eigenschaften des GnRH bindenden,
PEGylierten DNA-Spieglermers verwendet. Die Gruppe wurde parallel zu. den Gruppen für die i Aktivitätsversuche (s. Beispiel 6) behandelt, d.h. nach einer Adaptierurigsphase kastriert und nach einer weiteren Woche (Tag 8) erhielten die Tiere eine einmalige, intravenös verabreichte Gabe von 800 nmol/kg PEG-GnRH-DNA-Spieglmer. Die Substanz wuijde in lxPBS, pH 7,4 aufgelöst (Stammlösung: 1 mM).
Zur Analyse wurden Blutproben vor Substanzgabe (0 h) sowie 1 hj 6 h und 8 h nach Substanzgabe entnommen und als EDTA-Plasma analysiert.
Aus dem Plasma wurde GnRH bindendes, PEGyliertes DNÄ-Spiegelmer durch Festphasenextraktion mit Hilfe von schwachen Anionenaustauschem extrahiert. Dazu wurden je 50 μl EDTA-Plasma in Puffer A (50 mM NaH2PO4, pH 5,5; 0,2 M NaClO4; 20% (v/v) Formamid und 5% (v/v) Acetonitril) in einem Gesamtvolumen von 1 ml aufgelöst und bis zur Extraktion bei 4°C über Nacht bzw. bei -20°C für maximal 4 Tage aufbewahrt. Eingefrorene Proben wurden bei Raumtemperatur mindestens zwei Stunden lang aufgetaut, gemischt und anschließend zentrifugiert.
Zur Festphasenextraktion wurden Dimethylaminopropyl-Anionenaustauscher-Säulen (DMA 3 ml/ 200 mg Säulenmaterial, Macherey & Nagel, Düren) auf einer Baker spe-12G Vakuumapparatur (Mallinckrodt Baker, Griesheim) verwendet. Die verwendeten Puffer bestanden aus: Puffer A (50 mM NaH2PO4, pH 5,5; 0,2 M NaClO4; 20% (v/v) Formamid und
5% (v/v) Acetonitril) und Puffer B (80 mM NaH2PO4, pH 6,0; 50 mM Na2HPO4; 2 M NaClO4;
20% (v/v) Formamid und 5% (v/v) Acetonitril), wobei die beiden Puffer A und B für die
Herstellung des Wasch- und des Elutionspuffers in einem bestimmten Verhältnis so gemischt wurden, dass die gewünschte Salzkonzentration erreicht wurde. Die Anionenaustauscher wurden mit 2 ml Puffer A gespült. Die Proben wurden unter Anlage von -100 πibar dazugegeben und mit 2 ml Puffer A sowie 2 ml Waschpuffer (0,4 M NaClO4) gewaschen. Nachdem das i Säulenmaterial durch Anlegen von -200 mbar für 5 Minuten getrocknet wurde, wurde das
PEGylierte, GnRH bindende DNA-Spiegelmer mit 3 x 0,5 ml Elutionspuffer (0,9 M NaClO4) eluiert, wobei der Puffer vor der Elution auf 70°C erhitzt wurde. Die Eluaj: e wurden bei 4°C bis zur Gelfiltration aufgewahrt.
Als interner Standard wurde den Proben vor der Extraktion ein 30mer DNA-Spiegelmer zugegeben, an das am 5 ' Ende ein 40kD Polyethylenglykol-Molekül (PEG) gebunden war. Der interne Standard wurde mit Puffer auf ein Volumen von 360 μl in einer Konzentration von 1 μg/μl gebracht und jeweils 10 μl davon jeder Probe zugegeben. Um die Proben vor der HPLC-Analyse zu entsalzen, wurden NAP-25 Säulen (Amersham Pharmacia Biotech) verwendet. Die erhaltenen Eluate werden unter Vakμum getrocknet und in 100 ml lOmM Tris-Cl, pH 8,0 gelöst.
Die Identifizierung und Quantifizierung des PEGylierten Spiegeimers erfolgte mittels
Anionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung eines Waters JAlliance 2695 HPLC
Systems und der Detektion bei 254 nm. Die Bedingungen waren wie folgt:
Vorsäule: DNAPac PA- 100 (504 mm, Dionex)
Hauptsäule: DNAPac PA-100 (2504 mm, Dionex)
Eluent A: 10 mM NaOH, 1 mM EDTA, 10 % (v/v) Acetonitril in Wasser
Eluent B: 375 mM NaCl in Eluent A
Temperatur: 25° C
Injektionsvolumen: 20 μl
Gradient und Flussraten: 0 - 1 min 10 % Eluent B mit 0,5 ml/min; 1 - 2 min 10 % Eluent B mit
2 ml/min; 2 - 3 min 30 % Eluent B mit 2ml/min; 3 - 13 min 60 % Eluent B mit 2 ml/min; 13 -
19 min 10 % Eluent B mit 2 ml/min.
Die Konzentration von PEGyliertem, GnRH bindendem DNA-Spiegelmer zu den Verschiedenen Zeitpunkten der Probennahme ist in Fig. 27 dargestellt. Die Halbwertszeit des PEGylierten,
GnRH bindenden DNA-Spiegelmers bei intravenöser Injektion beträgt in Ratten ungefähr 4 Stunden.
Beispiel 8: Pharmakokinetisches Profil von unmodifizierter und PEGylierter L-RNA in Ratten
Nukleotidsequenzen:
L-RNA, 40mer (NOX_M039)
5' uaa gga aac ucg guc uga ugc ggu agc gcu gug cag agc u 3' (SEQ. ID. No. 4)
40kDalton PEG-L-RNA, 40 mer (NOX_M041)
PEG 5' uaa gga aac ucg guc uga ugc ggu agc gcu gug cag agc u 3' (SEQ. ip. No.5)
Das pharmakokinetische Profil der nicht PEGylierten L-RNA (NOXJVΪ039) und PEGylierten L-RNA (NOX_M041) wurde in männlichen Ratten (CD®, Charles River Deutschland GmbH; Gewicht: 280-318 g) untersucht. Nach einer 7tägigen Eingewöhnungszeii erhielten 3 Tiere pro
Substanz eine intravenös applizierte Einmalgabe von 150 nmol/kg. Je 4 Ratten pro Substanz i erhielten jeweils 150 nmol/kg als einmalige subkutane Gabe. Die Substanzen wurden in lxPBS, pH 7,4 aufgelöst (Stammlösung: 383 μM). Nach intravenöser Gabe wurden für die ' unmodifizierte L-RNA vor der Substanzgabe (0 min) und 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h nach Substanzgabe Blutproben entnommen und zur Analyse in EDTA-Eppendorfgefäße überführt. Nach intravenöser Gabe wurden für die PEGylierte L-RNA vor der Substanzgabe (0 min) und 5 min, 30 min, 1 h, 3 h, 8 h, 16 h, 24 h, 36 h sowie 48 h nach Substanzgabe Blutproben entnommen und zur Analyse in EDTA-Eppendorfgefäße überführti Bei den subkutan behandelten Tiere wurden für die unmodifizierte L-RNA vor der Substanzgabe (0 min) und 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h nach Substanzgabe Blutproben entnormmen und zur Analyse in EDTA-Eppendorfgefäße überfuhrt. Bei den subkutan behandelten Tieren wurden für die
PEGylierte L-RNA vor der Substanzgabe (0 min) und 1 h, 3 h, 8 h, 16 bj, 24 h, 36 h und 48 h nach Substanzgabe Blutproben entnommen und zur Analyse in EDTA-Eppendorfgefäße überführt.
Die Menge an L-RNA bzw. PEGylierter L-RNA in den Blutproben wurde mittels eines ι
Hybridisierungsassays untersucht (s. Drolet, D.W. et al. (2000) Pharmacokinetics and safety of an anti-vascular endothelial growth factor aptamer (NX 1838) following injection into the vitreous humor of rhesus monkeys. Phamaceutical Res 17 (12): 1503-1510.) Der Hybridisierungsassay basiert auf folgendem Prinzip: das nachzuweisende L-RNA Molekül wird an eine immobilisierte L-DNA-Oligonukleotid-Sonde (= Capture-Sonde; hier: 5'- CCG CAT CAG ACC GAG TTT CCT TA T TTT TTT TT -(C7) NH2 -3' (SEQ. ID. No. 6)) hybridisiert und mit einer biotinylierten Nachweis-L-DNA Sonde (= Detektor-Sonde; hier: 5'- (BB)TTT TTT TT A GCT CTG CAC AGC GCT -3' (SEQ. ID. No. 7)) detektiert. Dazu wird ein Stepdavidin- Alkalische-Phosphatase-Konjugat in einem weiteren Schritt an den Komplex gebunden. Nach Zugabe eines Chemilumineszenz-Substrats wird Licht generiert und in | einem Luminometer gemessen.
Immobilisierung der Oligonucleotid-Sonde: lOOμl der Capture-Sonde (0,75 pmol/μl in Kopplungspuffer: 500 mM Na2HPO4 pH 8,5, 0,5 mM EDTA) wurden 'pro well (Napf oder'
Vertiefung in einer Platte) in DNA BIND Platten (COSTAR) überführt unji über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde 3 x mit je 200μl Kopplungspuffer gewaschen und für lh bei 37°C mit je 200μl Blockierungspuffer (0,5 % (w/v) BSA in Kopplungspuffer) inkubiert. Nach nochmaligem Waschen mit 200μl Kopplungspuffer und 3 x 200μl Hybridisierungspuffer 1 (0,5 x SSC pH 7,0; 0,5 % (w/v) SDS) können die Platten zum Nachweis verwendet werden.
Hybridisierung und Nachweis: Es wurde eine 20 pmol/μl Lösung der Nächweis-L-DNA Sonde (= Detektor-Sonde) in lOmM Tris-Cl pH 8,0 hergestellt. lOμl EDTÄ Plasma (oder bidest. Wasser) wurden mit 90μl Hybridisierungspuffer 1 (0,5x SSC pH 7,0, 0,5 % (w/v) SDS) gemischt und zentrifugiert. Anschließend wurden 2μl der Nachweis-Sonden-Lösung (20 pmol/μl) dazugegeben, gemischt und zentrifugiert. Es folgte ein Denaturierungsschritt bei 95°C für 10 min im Thermocycler (MJ Research). Die Ansätze wurden in die entsprechend vorbereiteten DNA-BIND wells (siehe oben) transferiert und für 2 h bei 50°C inkubiert. Danach
! folgten Waschschπtte: 2 x 200 μl Hybridisierungspuffer 1 (0,5xSSC pH 7,0, 0,5 % (w/v) SDS)
I und 3 x 200 μl IxTBS/Tween 20 (20 mM Tris-Cl pH 7,6, 137 mM NaCl, 0,1 % (v/v) Tween 20).
1 μl Streptavidin- Alkalische Phosphatase-Konjugat (Promega) wurden mit 5 ml IxTBS/Tween 20 verdünnt. lOOμl des verdünnten Konjugats wurden pro well zugegeben und für 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es folgten Waschschritte: lx 200 μl lx TBS/Tween 20 und 3x 200 μl lx Assay Puffer (20 mM Tris-Cl pH 9,8, 1 mM MgCl2). Abschließend wurden 100 μl CSPD "Ready-To-Use Substrate" (Applied Biosystems) zugegeben, 30 mini bei Räumtemperatur inkubiert und die Chemilumineszenz in einem POLARstar Galaxy Multidetektions- Plattenlesegerät (BMG Labtechnologies) gemessen.
Die Konzentrations-Zeit-Kurven der PEGylierten L-RNA bei intravenöser und subkutaner Gabe sind in Fig. 28a und Fig. 28c dargestellt. Die Konzentrationsprofile der urimodifizierten L-RNA bei intravenöser und subkutaner Gabe sind in Fig. 28b und Fig. 28d dargestellt. Bei intrayenöser
Gabe beträgt die terminale Halbwertszeit für die unmodifizierte L-RNA 50 Minuten, für die
PEGylierte Substanz ergibt sich dagegen eine Halbwertszeit von ca. 18 Stunden. Bei subkutaner i Gabe beträgt die terminale Halbwertszeit für die unmodifizierte L-RNA 84 Minuten, für die
PEGylierte Substanz ergibt sich dagegen eine sehr lange Eliminierungsphase.
Damit zeigt sich, dass die erfindungsgemäße modifizierte L-Nukleirisäure gegenüber der urimodifizierten L-Nukleinsäure von Vorteil ist. Dieser Vorteil ergibt sich auch mit Blick auf den Stand der Technik, so beispielsweise beschrieben von Watson, S. R. et jal., Antisense nucleic acid drug dev. 10, 63 - 75 (2000). In dieser Publikation wird ein 2'-F-modifιziertes Aptamer, welches an L-Selektin bindet, untersucht. Die pharmakokinetische Halbwertszeit des intravenös verabreichten PEGylierten 2'-F-Aρtamers (40 kDa PEG) in vivo in SJprague-Dawley-Ratten bbeettrrääggtt 222288 mm:in und ist somit deutlich kürzer als die erfindungsgemäß modifizierten L
Nukleinsäuren.
Beispiel 9: Allgemeine Methode zur PEGylierung von L-Ribonukleinsäuren
Eine L-Ribonukleinsäure wurde erzeugt zur Untersuchung des pharmakologischen Profils von unmodifϊzierter und PEGylierter L-RNA in Ratten. Die L-RNA weist die folgende Sequenz auf:
5'-UAA GGA AAC UCG GUC UGAUGC GGUAGC GCUGUG CAGAGC U - 3' (SEQ ID NO:4)
Die Synthese der L-RNA mit der vorstehend aufgezeigten Sequenz wurde auf einem ÄKTA Pilot
10 Synthesizer (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) im 20 μmol Maßstab an einer
1000Ä CPG-Festphase nach der 2-Cyanoethyl-Phosphoramidit-Chemie durchgeführt.
Anschließend wurde 6-(Monomethoxytritylamino)-hexyl-(2-cyanoethyl)-(N,N-diiospropyl)- i phosphoramidit an das 5 '-Ende der L-RNA (5'-MMT-Aminohexyl-L-RNA) gekoppelt, um die post-synthetische Konjugation mit PEG zu ermöglichen.
Nach Beendigung der Synthese wurde die 5'-MMT-Aminohexyl-L-RNA durch 30- minütige Inkubation in 41%iger Methylamin-Lösung bei 65°C von der Festphase abgespalten und die Nukleobasen komplett entschützt. Entschützung der 2 '-Position erfolgte durch Inkubation in 1,5 ml DMSO, 0,75 ml Triethylamin (TEA) und 1 ml TEA3HF für 2 h ibei 60°C. Eine erste Aufreinigung erfolgte mittels RP-HPLC. Die Abspaltung der Monomethojxytrityl-Schutzgruppe erfolgte mit 80% Essigsäure in 70 min bei RT. Essigsäure wurde durch zweimalige Koevaporation mit Ethanol entfernt und die 5'-Aminohexyl-L-RNA gemäß) SEQ. ID. No.4 durch Fällung in Ethanol gereinigt (Ausbeute: 220 OD, 60% rein). Das Produkt wurde in 1 M Natriumacetat, pH 8.0, aufgenommen und mittels Größenausschlußchromatographie über eine Sephadex G10 Säule oder durch Vivaspin 3000 (Vivascience, Hannover, Deutschland) entsalzt.
Die solchermaßen 5 '-Amino-modifizierte L-RNA (530 OD, 60% rein) Jwurde in wässrigem Universalpuffer nach Theorell und Stenhagen (33 mM Natriumeitrat, 33 mM Natriumphosphat, 57 mM Natriumborat, pH 7.5) (7.5 mL) vorgelegt, auf 37°C erwärmt, DMF (5 ml) zugegeben und portionsweise mit pulverfδrmigem N-Hydroxysuccinimidyl (NHS) - aktiviertem Ester von verzweigtem 40,000 Da Poly(ethylen)glykol versetzt (2 eq alle 45 min |zugeben, insgesamt 18 eq). Der Reaktionsverlauf wurde durch analytische Gelektrophorese (8% Polyacrylamid, 8,3 M Harnstoff) oder analytische lonenaustausch-HPLC verfolgt. Das Rohprodukt wurde durch lonenaustausch-HPLC zunächst von überschüssigem PEG gereinigt (Source Q; Laufmittel A: 10 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 7,5, Laufmittel B: 10 mM Natriumhydrogencarbonat, pH 7,5, 2 M Natriumchlorid; Beladen der Säule und Eluieren von freiem PEG mit 5% B; Flussrate
!
20 mL/min; Trennung und Elution des PEG-L-RNA-Konjugates von nicht umgesetzter L-RNA mit Gradient auf 35% B über 20 Säulenvolumen; Flussrate 50 mL/mir), anschließend wurde ι I' durch Ultrafiltration (Labscale TFF System, Millipore) entsalzt. Durch Lyophilisation erhielt man das gewünschte Produkt als weißes Pulver (254 OD, 48% (80% bezogen auf Reinheit des Ausgangsproduktes)) .
In analoger Weise wurden weitere L-Nukleinsäuren, einschließlich ] der Sequenz gemäß SEQ.TD.No. 1 mit verschiedenen PEG (linear 10.000 Dalton, linear 20.bθO Dalton, verzweigt 20.000 Dalton, linear 35.000 Dalton), verknüpft und aufgereinigt.
Beispiel 10: Aktivitätstest eines GnRH bindenden, DNA-Spiegelmers in vivo in männlichen, orchidektomierten Ratten
Männliche Ratten wurden orchidektomiert, wodurch der LH-Pegel dέr Ratten infolge des fehlenden Testosteron-Feedback-Signals über die folgenden acht Tage kontinuierlich anstieg. Am Tag 8 wurde das GnRH-DNA-Spiegelmer (NOX 1255) fünf Ratten '(100 mg/kg) subkutan verabreicht. Blutproben wurden am Tag 0 (vor der Orchidektomie), am Tag 8 (0 Stunden vor s.c. Applikation des GnRH-Spiegelmers), sowohl 0,5 Std., 1,5 Std., 3 Std., 6! Std. als auch 24 Std. nach der s.c. Applikation entnommen und der jeweilige LH-Spiegel mittels Radioimmunoassay (RIA) bestimmt. Parallel hierzu wurde fünf männlichen, orchidektomierten Ratten nur das Vehikel (PBS-Puffer, pH 7,4) s.c. als Negativ-Kontrolle und fünf männlichen orchidektomierten Ratten der Standard- Antagonist Cetrorelix (100 μg/kg) als Positiv-Kontrolle s. c. verabreicht. Das Ergebnis ist in Fig. 29 dargestellt.
Die LH-Pegel sind bei der GnRH-DNA-Spiegelmer-Gruppe (in Fig. 29 mit Kreis bezeichnet) erniedrigt und erreichen ihren Tiefpunkt nach 1,5 Std. und bleibt über ca. 3 Std. erhalten. Diese Absenkung ist vergleichbar mit nicht-kastrierten Ratten bzw. mit Cetrorelix (Standard- Antagonist) behandelten Ratten. Sechs Stunden nach GnRH-DNA-Spiegelmer-Gabe steigen die LH Spiegel langsam an und erreichen das Niveau der unbehandelten Kqntrollgruppe innerhalb von 24h.
Somit ist der biologische Effekt des GnRH-DNA-Spiegelmer über einen Zeitraum von 3 Stunden zu beobachten, während das PEGylierte GnRH-DNA-Spiegelmer über einen Zeitraum von 24 Stunden aktiv ist (siehe Bsp. 5).
Die im folgenden angegebene Literaturstellen entsprechen den hierin angegebenen, mit hochgestellten Nummern versehenen Literaturhinweisen.
Literatur
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Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen sowie den, Zei hnungen offenbarten
! Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die
Verwirkl ι ichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen w I esentlich sein ι.,

Claims

Ansprüche
Modifizierte L-Nukleinsäure umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L- Nukleinsäure-Teil, wobei der L-Nukleinsäure-Teil mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil konjugiert ist und die Konjugation des L-Nukleinsäure-Teils mit dem Nicht-L- Nukleinsäure-Teil zu einer verlangsamten Ausscheidung aus einem Organismus führt, verglichen mit einer L-Nukleinsäure umfassend nur den L-Nukleinsäure-Teil und wobei der L-Nukleinsäure-Teil ein Spiegeimer ist.
2. Modifizierte L-Nukleinsäure umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L- Nukleinsäure-Teil, wobei der L-Nukleinsäure-Teil mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil i konjugiert ist und die Konjugation des L-Nukleinsäure-Teils mit dem Nicht-L- Nukleinsäureteil zu einer erhöhten Verweildauer in einem Organismus führt, verglichen mit einer L-Nukleinsäure umfassend nur den L-Nukleinsäure-Teil und wobei der L- Nukleinsäure-Teil ein Spiegeimer ist.
3. Modifizierte L-Nukleinsäure, insbesondere nach Anspruch 1 und/oder Anspruch 2, umfassend einen L-Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L-Nukleinsäure-Teil, wobei der L- Nukleinsäure-Teil mit dem Nicht-L-Nukleinsäure-Teil konjugiert ist und der Nicht-L- Nukleinsäure-Teil ein Molekulargewicht von mehr als etwa 300 Da, bevorzugterweise mehr als etwa 20.000 Da und bevorzugtererweise mehr als etwa 40ι000 Da aufweist.
4. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die modifizierte L-Nukleinsäure ein Molekulargewicht von ietwa 600 bis 500,000 Da, bevorzugterweise von etwa 10,000 bis 400,000 Da bevorzugtererweise von etwa 50,000 bis 300,000 Da aufweist.
5. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der L-Nukleinsäure-Teil ein Molekulargewicht von 300 bis 50,000 Da, bevorzugterweise von 5,000 bis 25,000 Da bevorzugtererweise von 7,000 bis 15,000 Da aufweist.
6. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 5, daldurch gekennzeichnet, dass der Nicht-L-Nukleinsäure-Teil an den L-Nukleinsäure-Teil über eine funktionale i Gruppe des L-Nukleinsäure-Teils direkt oder indirekt verknüpft ist, die an einem der folgenden Bestandteile der L-Nukleinsäure vorhanden oder gebunden ist, wobei die funktionale Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe, die terminale und nicht-terminale
Phosphate, terminale und nicht-terminale Zuckeranteile und natürliche und nicht- natürliche Purin- und natürliche und nicht-natürliche Pyrimidin-Bas'en umfasst.
7. Modifizierte L-Nukleinsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung des Nicht-L-Nukleinsäure-Teils mit dem L-Nukleinääure-Teil über die 2'- OH-, 3'-OH- und/oder 5 '-OH-Gruppe oder eines Derivates d^von oder eines oder mehrerer der Zuckeranteile des L-Nukleinsäure-Teils vorliegt.
8. Modifizierte L-Nukleinsäure nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die ι I
Verknüpfung über mindestens eine der Positionen 5 oder 6 der Pyrimidin-Base vorliegt.
9. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung über mindestens eine der Purin-Basen1 vorliegt, wobei die Verknüpfung bevorzugterweise an der Position 8 vorliegt.
10. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verknüpfung an einer oder mehreren der exozyklischen und/oder endozyklischen Amingruppen und/oder Ketogruppen der Purin-j und/oder Pyrimidin- Basen und oder abasischen Position(en) vorliegt.
11. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Nicht-Nukleinsäure-Teil ausgewählt ist aus der Gruppe, die lineares Poly(ethylen)glykol, verzweigtes Poly(ethylen)glykol, Hydroxyethylstärke, Peptide, Proteine, Polysaccharide, Sterole, Polyoxypropylen, Po yoxyamidate, Poly(2- hydroxyethyl)-L-glutamin, precise Polyethylenglykol umfasst.
12. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem L-Nukleinsäure-Teil und dem Nicht-L-Nukleinsäure- Teil ein Linker angeordnet ist.
13. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der L-Nukleinsäure-Teil eine Nukleinsäure umfasst gemäß SEQ ID NO. 1.
14. Modifizierte L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche jl bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der L-Nukleinsäure-Teil am 5'-OH-Ende als Linker 6- Aminohexylphosphat aufweist.
15. Modifizierte L-Nukleinsäure nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass an das freie Amin des Aminohexylphosphat-Linkers Polyethylenglykol gekoppelt ist.
16. Verwendung der modifizierten L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 15 als Diagnostikum.
17. Verwendung der modifizierten L-Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 15 zur Herstellung eines Medikamentes.
18. Verfahren zur Herstellung einer modifizierten L-Nukleinsäurej umfassend einen L- Nukleinsäure-Teil und einen Nicht-L-Nukleinsäure-Teil, insbesondere einer modifizierten Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 1 bis 15, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer L-Nukleinsäure, welchen den L-Nukleinsäure-Teil oder einen Teil davon der modifizierten L-Nukleinsäure ausbildet; b) Bereitstellen einer Nicht-L-Nukleinsäure, die den Nicht-L-Nukleinsäure-Teil oder einen Teil davon der modifizierten L-Nukleinsäure ausbildet; c) Umsetzen der L-Nukleinsäure aus a) und der Nicht-L-Nukleinsäure aus b); und d) optional Isolieren der in Schritt c) erhaltenen modifizierten [L-Nukleinsäure, wobei der L-Nukleinsäure-Teil ein Spiegeimer ist
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die L-Nukleinsäure in Schritt a) einen Linker umfasst.
0. yerfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass nach [dem Bereitstellen der L-Nukleinsäure in Schritt a) diese mit einem Linker versehen wird.
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