WO2003027672A1 - Nouvelle methode de criblage au moyen du recepteur de prokineticine - Google Patents

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WO2003027672A1
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prokineticin
polypeptide
screening
cell death
therapeutic agent
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Shunichiro Matsumoto
Jun Takasaki
Tetsu Saito
Takatoshi Soga
Masazumi Kamohara
Hideki Hiyama
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Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening a substance that controls neuronal cell death and / or hyperalgesia using a prokineticin receptor.
  • Prokineticin is a bioactive peptide in which two subtypes of prokineticin 1 and prokineticin 2 exist in humans (Mol Pharmacol. 2001 59: 692-8). Prokineticin was originally identified by a French group in 1990 as a snake venom component of mamba (a large venomous snake of the cobra family from South Africa) and named ⁇ (Tox icon. 1990 28 : 847- 56), by a group of O over Austria after being purified molecules concerned than the force El skin was "Bv8j and naming (Eur J Pharmacol 1999 374:. 189-96) 0 mammalian Purokine ⁇ prestige In 1999, the mouse prokineticin 2 gene sequence was reported (FEBS Lett.
  • Prokineticins 1 and 2 are synthesized intracellularly as precursors consisting of 105 and 108 amino acids, respectively.In a mature molecule, removal of the signal peptide would result in 86 prokineticins 1 and 81 prokineticins 2 Have been. Prokineticins 1 and 2 have about 55% homology to each other, and have 50% or more homology to the corresponding molecules of mamba and force. Five SS bonds exist in the molecule, and the positions of these Gys are conserved in MIT1 and Bv8. Prokineticin has a very stable conformation and is resistant to protease treatment.
  • Prokineticin 1 has been analyzed from tissue expression analysis for brain, ovary, kidney, uterus, heart, testis Etc. show a broad expression pattern in central and peripheral tissues.
  • prokineticin 2 also shows broad tissue expression, but the mRNA transcription level is lower than that of prokineticin 1 (FEBS Lett. 1999 462: 177-81, Mol Pharmacol. 2001 59: 692-8).
  • central activities include neuronal death inhibitory activity (Eur J Neurosci. 2001 13: 1694-702) and hyperalgesia-inducing activity (Eur J Pharmacol. 1999 374: 189-96); Contractile action (Mo I Pharmacol. 2001 59: 692-8, FEBS Lett.
  • prokineticin has been reported as described above, its receptor has not been identified until recently, and a simple screening system for compounds that controls the central action of prokineticin has been established. Was not done.
  • TO01 / 163609 discloses a prokineticin receptor, it is described that the receptor is mainly expressed in testis. Therefore, endogenous receptor molecules for human prokineticins 1 and 2 that do not act on gastrointestinal contractile action or spermatogenesis, but act on the central action, especially on the action of inhibiting neuronal cell death and ⁇ or hyperalgesia. There is a long-awaited need for a method of identifying and further screening a neuronal cell death inhibitor and / or a therapeutic agent for hyperalgesia using the receptor. Disclosure of the invention
  • GPRg2 gene is expressed in human amygdala, hippocampus, corpus callosum, substantia nigra, thalamus, frontal lobe, and fetal brain, and is not expressed in stomach; small intestine and testis; and GPRg2 gene is projected to primary sensory nerve GPRg2 is expressed in the dorsal root ganglion, a nerve tissue that plays a role in transmitting pain stimuli perceived by nociceptors to the brain.
  • prokineticins 1 and 2 that does not act on the formation action but acts on the central action. It also enabled the expression and purification of GPRg2 and the production of transformed cells expressing GPRg2. In addition, they found that GPRg2-expressing cells change intracellular calcium concentration by prokineticin, and that prokineticin specifically binds to the membrane fraction of CH0 cells that stably express GPRg2, expressing GPRg2 and GPRg2. It has been found that cells serve as a screening tool for screening substances that control nerve cell death suppression and / or substances that control hyperalgesia.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in which 1 to 10 amino acids have been deleted, substituted and / or added.
  • a screening tool for neuronal death inhibitors a polypeptide whose activity can be confirmed by increasing intracellular calcium concentration in the presence of prokineticin
  • a screening tool for neuronal death inhibitors a polypeptide whose activity can be confirmed by increasing intracellular calcium concentration in the presence of prokineticin
  • a therapeutic agent for treating dementia a therapeutic agent for stroke, and / or a therapeutic agent for treating hyperalgesia, which is the polypeptide according to (1) or (2) and is a nerve cell death inhibitor;
  • neuronal cell death inhibitor screening tool dementia therapeutic agent, stroke therapeutic agent, and hyperalgesia therapeutic agent screening tool described in (1) to (3) are collectively referred to as polypeptide-type neuronal cell death inhibitory tools.
  • Agent screening tool
  • a nerve cell death inhibitor screening tool which is a cell expressing the polypeptide according to (1) or (2),
  • the cell according to (4) which is a neuronal cell death inhibitor, a therapeutic agent for dementia, a therapeutic agent for stroke, and / or a therapeutic agent screening tool for hyperalgesia (hereinafter, (4) to (5)
  • the above-described screening tool for neuronal cell death inhibitor, therapeutic agent for dementia, therapeutic agent for stroke, and hyperalgesia therapeutic agent screening tool are collectively referred to as a transformed cell-type neuronal death inhibitor screening tool).
  • a method for screening a neuronal cell death inhibitor characterized by the following:
  • a step of formulating a preparation using the substance obtained by the screening A method for producing a pharmaceutical composition for treating dementia, for treating stroke, and / or for treating hyperalgesia, which is for suppressing neuronal cell death.
  • screening tool refers to a substance used for screening (specifically, a cell expressing a polypeptide or a polypeptide used for screening).
  • the “nerve cell death inhibitor screening tool” refers to a method for screening a nerve cell death inhibitor of the present invention and / or a therapeutic agent for Z or hyperalgesia for screening a nerve cell death inhibitor and / or a therapeutic agent for hyperalgesia. In the method, it is a cell or polypeptide to which a test compound is brought into contact.
  • polypeptide or cell for screening a nerve cell death inhibitor and a therapeutic agent for Z or hyperalgesia is also included in the present invention.
  • the receptor disclosed in W00V163609 as a prokineticin receptor mainly expressed in the testis has 87% homology with the prokineticin receptor GPRg2 that can be used in the present invention.
  • various reports have been made on a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the same amino acid sequence as the prokineticin receptor GPRg2 which can be used in the present invention, and a deduced amino acid sequence encoded by the polynucleotide (W098). /46620.W001/3647U ⁇ / 53308, W001 / 68699,
  • the nerve cell death inhibitor screening tool As described above, the nerve cell death inhibitor screening tool, the nerve cell death inhibitor, and / or the hyperalgesia therapeutic agent screening method described in the present application, for treating dementia, for treating stroke, and / or hyperalgesia for inhibiting neuronal death Production of therapeutic pharmaceutical compositions
  • the method is the first invention made by the present inventors.
  • FIG. 1 is a graph showing the change over time in calcium concentration when HEK293 culture supernatant containing prokineticin 1 (PK1) or prokineticin 2 (PK2) was added to GH0 cells expressing prokineticin receptor GPRg2. .
  • PK1 prokineticin 1
  • PK2 prokineticin 2
  • FIG. 2 is a graph showing the time course of calcium concentration when GH0 cells expressing an empty vector were added to a HEK293 culture supernatant containing prokineticin 1 (PK1) or prokineticin 2 (PK2).
  • PK1 prokineticin 1
  • PK2 prokineticin 2
  • Prokineticin receptor refers to “prokineticin receptor protein”. “Prokineticin” includes “prokineticin 1” and “prokineticin 2”. “Diagonist” refers to a substance that promotes the activity of the prokineticin receptor in the presence and absence of prokineticin.
  • the nerve cell death inhibitor screening tool of the present invention includes a polypeptide-type nerve cell death inhibitor screening tool and a transformed cell-type nerve cell death inhibitor screening tool. Further, as a screening tool for a nerve cell death inhibitor, a therapeutic agent for a dementia, a therapeutic agent for a stroke, or a therapeutic agent for a hyperalgesia is included.
  • polypeptide-type neuronal cell death inhibitor screening tool of the present invention examples include:
  • prokineticin preferably prokineticin 2
  • a functionally equivalent variant A polypeptide whose activity can be confirmed by changing the internal calcium concentration
  • screening polypeptides that can be used as the polypeptide-type neuronal cell death inhibitor screening tool of the present invention are collectively referred to as screening polypeptides.
  • the homologous polypeptide of the present invention comprises an amino acid sequence having a homology of 90 O / O or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and has an activity due to a change in intracellular calcium concentration in the presence of prokineticin.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is preferably 90 O / O or more, more preferably 95% or more, even more preferably, as long as it is a polypeptide that can be confirmed. It can be composed of an amino acid sequence having 98% or more homology.
  • the term “homology J” used herein refers to BLAST (Basic local aIngment search tool;
  • the BLAST search is performed using the bl2seq program (Tatiana A. Tatusova, Thomas and Thomas. Madden, FEMS) of the BLAST package [sgi32bit version, version 2.0.12; obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI)].
  • the screening polypeptide has been described above.
  • Examples of the polypeptide include “a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” and “polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2”. 1 to 10, preferably 1 to 7, and more preferably 1 to 5 amino acids consisting of an amino acid sequence in which deletion, substitution, and / or insertion has been performed, and intracellularly in the presence of prokinedisin Calcium concentration may fluctuate
  • polypeptide J whose activity can be confirmed by the above, is preferable, and “a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” is more preferable.
  • the screening polypeptide is not particularly limited as long as it is the above-mentioned polypeptide, and its origin is not limited to humans.
  • variants of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 include not only human variants of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but also functionalities derived from non-human organisms (eg, mouse, rat, hamster, or dog). Equivalent variants are included. Furthermore, those natural polypeptides (ie, variants derived from humans or functionally equivalent variants derived from non-human organisms), or amino acids of polypeptides consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 It includes polypeptides obtained by artificially modifying an acid sequence by genetic engineering. As used herein, the term “variant” (variation) refers to an individual difference in the same polypeptide in the same species, or a difference in the homologous polypeptide between several species. I do.
  • Mutants in humans of the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or functionally equivalent variants derived from organisms other than humans are represented by SEQ ID NO: 2 by those skilled in the art. It can be obtained based on information on the nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence (for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). Unless otherwise specified, the genetic recombination technology may be performed by a known method (for example, Maniat is, T. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manua l", Co. ld Spring Harbor Laboratory, NY, 1982).
  • the polypeptide for a screening tool that can be used as the screening tool for a polypeptide-type neuronal death inhibitor of the present invention can be obtained by various known methods.
  • a polynucleotide encoding a target protein can be obtained.
  • polynucleotide encoding the polypeptide for a screening tool examples include a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a polynucleotide encoding a functional variant, and Polynucleotides encoding homologous polypeptides can be mentioned.
  • polynucleotide includes both DMA and RNA.
  • the method for producing the polynucleotide encoding the polypeptide for a screening tool is not particularly limited.
  • A a method using PCR
  • B a conventional genetic engineering technique (ie, a method of selecting a transformant containing a desired cDNA from a transformant transformed with a GDNA library)
  • C a chemical synthesis method, etc.
  • each production method will be described sequentially.
  • MRNA is extracted from human cells or tissues capable of producing the prokineticin receptor of the present invention.
  • this mRNA as a type II, two types of primers sandwiching the receptor mRNA or a part of the mRNA region are prepared.
  • the prokineticin receptor cDNA or a part thereof can be obtained by performing reverse transcriptase-polymerase chain reaction (hereinafter, referred to as RT-PGR).
  • RT-PGR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • mRNAs including those encoding the protein are extracted from cells or tissues capable of producing the prokineticin receptor of the present invention, such as human brain, by a known method.
  • the extraction method include a guanidine dithiocyanate “hot phenol” method and a guanidine “thiocyanate-guanidine” hydrochloric acid method, and preferably, a guanidine dithiocyanate cesium chloride method.
  • Cells or tissues capable of producing the protein can be obtained by Northern blotting using a gene having a nucleotide sequence encoding the protein or a part thereof, It can be identified by Western plotting using an antibody.
  • the mRNA may be purified according to a conventional method.
  • the mRNA can be adsorbed onto an oligo (dT) cellulose column and purified.
  • mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like.
  • a commercially available extracted mRNA may be used without extracting the mRNA.
  • the purified mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of a random primer or an oligo dT primer to synthesize first-strand GDNA.
  • This synthesis can be performed by a conventional method.
  • a commercially available cDNA may be used without synthesizing GDNA as in Examples 1 and 2.
  • polymerase chain reaction (Saiki, RK et al. (1988) Science 239, 487-491; below) using two types of primers sandwiching a partial region of the target gene. PGR) to amplify the desired prokineticin receptor DMA.
  • the obtained DNA is fractionated by agarose gel electrophoresis or the like. If desired, the DNA fragment can be obtained by cutting the DNA with restriction oxygen or the like and connecting the DNA fragments.
  • a single-stranded cDNA is synthesized using reverse transcriptase with the mRNA prepared by the method using the above-mentioned PGR as a type II, and then a double-stranded GDNA is synthesized from the single-stranded GDNA.
  • the method include the S1 nuclease method (Efstratiadis, et al., Cell, 7, 279-288, 1976) and the Land method (Land, H. et al., Ucleic Acids Res., 9, 2251-2266,
  • a recombinant plasmid containing the double-stranded cDNA After preparing a recombinant plasmid containing the double-stranded cDNA, it is introduced into Escherichia coli (for example, strain DH5) for transformation, and for example, a recombinant is selected using drug resistance to tetracycline or ampicillin as an index.
  • Escherichia coli for example, strain DH5
  • a recombinant is selected using drug resistance to tetracycline or ampicillin as an index.
  • the transformation of the host cell may be performed by the method of Hanahan (Hanahan, DJ, Mol.
  • Biol., 166, 557-580, 1983), that is, GaGI 2 , MgCI 2 or RbGI can be carried out by adding the above-mentioned recombinant DNA to a recombinant cell prepared in the presence of
  • phage vectors such as lambda strains can be used as vectors.
  • a knife can also be used.
  • Methods for selecting a transformant having the desired GDNA from the thus obtained transformants include, for example, the following (1) a screening method using a synthetic oligonucleotide probe, and (2) a method prepared by PGR. A screening method using the probe thus obtained, and (3) a method of producing a target polypeptide in other animal cells and screening the same.
  • a transformant having a target GDNA can be selected by the following procedure. That is, an oligonucleotide corresponding to all or a part of the polypeptide of the present invention was synthesized, and this was used as a probe (labeled with 32 P or 33 P), and a nitrocellulose filter denatured and immobilized with the DNA of the transformant strain. And search for the obtained positive strain and select it.
  • a nucleotide sequence derived from codon usage can be used, or a plurality of nucleotide sequences obtained by combining possible nucleotide sequences can be used. Can also. In the latter case, the type can be reduced by including inosine.
  • a transformant having a target cDNA can be selected by the following procedure.
  • DNA fragments encoding all or part of the target polypeptide are synthesized by synthesizing oligonucleotides of sense primers and antisense primers corresponding to a part of the polypeptide of the present invention and performing PGR by combining them.
  • cDNA or genomic DNA synthesized by reverse transcription reaction from mRNA of a cell producing the polypeptide of the present invention can be used.
  • the thus prepared DMA fragment is labeled with, for example, 32 P or 33 P, and is used as a probe for colony hybridization or plaque hybridization to obtain the cDNA of interest. Select a transformant.
  • a transformant having a target GDNA can be selected by, for example, the following procedure. That is, the transformant is cultured, the polynucleotide is amplified, the polynucleotide is transfected into animal cells, and the polypeptide encoded by the polynucleotide is produced on the cell surface.
  • a plasmid capable of self-replication and containing a transcription promoter region, or a plasmid that can be integrated into the chromosome of an animal cell can be used.
  • a transformant having the cDNA of interest is selected from the original transformants.
  • the method of collecting the polynucleotide of the present invention from the obtained transformant of interest can be obtained by a known method (for example, Mania is, T. et al., "Molecular Cloning—A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory). , NY, 1982). For example, it can be carried out by separating a fraction corresponding to plasmid DMA from cells and cutting out a cDNA region from the obtained plasmid DNA.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by binding a DNA fragment produced by the chemical synthesis method.
  • Each DMA can be synthesized using a DNA synthesizer [for example, Oligo 1000 DNA Synthesizer (manufactured by Beckman) or 394 DNA / RNA Synthesizer (manufactured by Applied Biosystems)].
  • the polynucleotide of the present invention can be prepared on the basis of the information of the polypeptide of the present invention, for example, by the phosphite-triester method (Hunkapi Iler, ⁇ ⁇ et al., Nature, 10, 105-111, 1984). According to the method, it can also be produced by chemical synthesis of nucleic acid.
  • the codon for the desired amino acid is known per se and may be selected arbitrarily. For example, it can be determined according to a conventional method in consideration of the codon usage of the host to be used (Grantham, et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981).
  • partial modification of the codons of these nucleotide sequences can be performed by a site-directed mutagenesis method (Mark, DF et al.) Using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide coding for the desired modification in a conventional manner. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).
  • the polypeptide for a screening tool of the present invention can be obtained by the following method.
  • a host cell preferably a eukaryote, particularly preferably a GH0 cell or a 293-EBNA cell
  • a host cell can be reintegrated into a suitable vector DNA by re-integrating the polynucleotide encoding the isolated screening tool polypeptide.
  • the polypeptide for a screening tool produced on the cell surface of the cell can be obtained by various known separation operations utilizing the physical properties, biochemical properties, etc. of the polypeptide. It can be separated and purified by the method. Specifically, for example, after solubilizing a membrane fraction containing a receptor protein, treatment with a normal protein precipitant, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ionization Examples include various liquid chromatography such as exchanger chromatography, affinity chromatography, high performance liquid chromatography (HPLG), dialysis, and combinations thereof.
  • the membrane fraction can be obtained according to a conventional method.
  • the prokineticin receptor of the present invention can be obtained by culturing cells expressing the prokineticin receptor of the present invention on the surface thereof, suspending them in a buffer, homogenizing, and centrifuging.
  • a solubilizing agent that is as mild as possible (GHAPS, Triton X-100, dichitonin, etc.)
  • the properties of the receptor can be maintained after solubilization.
  • the expression of the polypeptide for a screening tool of the present invention in fusion with a marker sequence in frame allows confirmation of expression of the polypeptide for a screening tool, confirmation of intracellular localization, purification, and the like.
  • Marker sequences include, for example, FLAG epitope ⁇ Hexa-His idi ne tag. Hemagglut inin tag, mycepi tope, and the like.
  • proteases such as enterokinase, Factor Xa, and thrombin is inserted between the marker sequence and the prokineticin receptor.
  • the marker sequence can be cleaved and removed by these proteases.
  • transformed cells for screening tools examples include:
  • the transformed cell for a screening tool can be prepared, for example, by re-incorporating a polynucleotide encoding the polypeptide for a screening tool isolated by the method described above into an appropriate vector DNA, thereby obtaining a host cell (preferably a host cell). It can be obtained by transforming a eukaryote, particularly preferably GH0 cell or 293-EBNA cell. In addition, by introducing an appropriate promoter and a sequence related to expression into these vectors, the polynucleotide can be expressed in each host cell.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it contains a polynucleotide encoding the polypeptide for a screening tool.
  • the expression vector may be selected from known expression vectors appropriately selected according to the host cell to be used. An expression vector obtained by inserting a nucleotide can be mentioned.
  • the transformed cell for a cleaning tool is transformed with the expression vector, contains a polynucleotide encoding a polypeptide for a screening tool, and is used as a screening tool for a transformed cell-type nerve cell death inhibitor.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide for a screening tool may be a cell integrated into the chromosome of a host cell.
  • it may be a cell containing an expression vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide for a screening tool.
  • the transformed cell for a screening tool can be obtained, for example, by transforming a desired host cell with an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide for a screening tool.
  • eukaryotic host cells include cells of vertebrates, insects, yeasts, etc.
  • vertebrate cells include, for example, monkey COS cells (Gluztnan, Y. (1981) Cell, 23 175-182) and Chinese ⁇ /, Musta ovary cell (GH0) deficient dihydrofolate reductase (Urlaub, G. and Chasin, LA (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 ), Human embryonic kidney-derived HEK293 cells and
  • Epstein Barr Virus EBNA-1 gene-transfected 293-EBNA cells (Inv manufactured by Rogen) and the like are often used, but are not limited thereto.
  • a vertebrate cell expression vector one having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, etc., which is usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. It may have a starting point.
  • the expression vector include pSV2dhfr having the early promoter of SV40 (Subramani, S. et al. (1981) Mo, Cel I. Biol., 1, 854-864), and human elongation factor promoter.
  • PEF-BOS izushima, S. and Nagata, S.
  • the expression vector has the SV40 origin of replication, is capable of autonomous replication in G0S cells, and has a transcriptional motor, a transcription termination signal, and an RNA splice. Those having a site can be used.
  • pME18S (Maruyama, K. and Takebe, Y. (1990) Med. Immunol., 20, 27-32)
  • pEF-BOS Mizushima, S. and Nagata, S.
  • the expression vector is a DEAE-dextran method (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308), a calcium phosphate-DNA coprecipitation method (Graham, FL and van der Ed, AJ (1973) Virology, 52, 456-457), a method using FuGENE6 (Boeringer Mannheim), and an electric pulse perforation method (Neumann, E. et al.
  • the desired transformant obtained above can be cultured according to a conventional method, and the culture produces the polypeptide for screening of the present invention in the cell or on the cell surface.
  • the medium used for the culture can be appropriately selected from those commonly used depending on the host cell used.
  • RPMI-1640 medium or Dulbecco's modified minimum can be used.
  • a medium obtained by adding a serum component such as fetal bovine serum (FBS) to a medium such as essential medium (DMEM), if necessary, can be used.
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM essential medium
  • Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium supplemented with serum components such as fetal bovine serum (FBS)
  • a medium obtained by adding G418 to a medium such as (DME) can be used.
  • Polypeptide for screening tool or transformation for screening tool When cells are used, substances (compounds, peptides and antibodies) that can modify the activity of the polypeptide for screening tools can be detected and screened.
  • the activity of the polypeptide for screening is changed by measuring an index of the activity according to the physiological characteristics of the receptor protein used for screening.
  • the activity as an indicator is, for example, the activity of binding to a ligand or the response to a stimulus caused by the binding of a ligand.
  • a detection method as described below can be shown.
  • the polypeptide for screening a cell expressing the polypeptide, a membrane fraction of the cell, a purified preparation of a protein comprising the polypeptide, or the like can also be used.
  • Test compounds for the screening method according to the present invention include commercially available compounds, various known compounds and peptides registered in a chemical file, combinatorial chemistry technology (Terrett, N., et al. (1995) ) Tetrahedron, 51, 8135-8137) and the phage display method (FeIiGi, F., et al. (1991) J. MoI. Biol., 222, 301). -310) can be used.
  • culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants and marine organisms, and animal tissue extracts are also targets for screening.
  • a compound or peptide obtained by chemically or biologically modifying the compound or peptide selected by the screening method of the present invention may be used, but is not limited thereto. a) Screening method using ligand binding assay
  • Substances that bind to the screening polypeptide of the present invention can be rescreened by the ligand binding assay.
  • a cell membrane expressing the screening polypeptide or a purified protein preparation comprising the screening polypeptide is prepared.
  • a labeled ligand e.g. 125 1-labeled Purokinetishin (rather preferably is 125 1-labeled Purokinetishin 2) for a predetermined time incubation with the test drug.
  • a substance (compound, peptide, and antibody) having an agonist activity of the polypeptide for screening or a substance (compound, peptide, and antibody) having an antagonistic activity can be screened using the inhibition of gand binding as an index. .
  • the substance having the antagonist activity of the polypeptide for screening selected by the screening method of the present invention is useful, for example, for treating or preventing hyperalgesia. Further, the substance having an agonist activity of the screening polypeptide selected by the screening method of the present invention is useful for suppressing neuronal cell death, for example, for treating or preventing dementia and stroke.
  • the screening method of the present invention can be carried out by the screening method using the ligand binding assay described in WO 01/19986.
  • the ligand of LTGs 4 to Purokinetishin, receptor replaces the LTGs 4 receptor Purokinetishin receptor (i.e. polypeptide for a screening). More specifically, it can be carried out by the method described in Example 7.
  • Substances that modify the activity of the screening polypeptide of the present invention can be rescreened by the GTP rS binding method (Lazareno, S. and Birdsal).
  • GTP rS binding method Lazareno, S. and Birdsal.
  • I NJM (1993) Br. J. Pharmacol. 109, 1 120-1 127) 0 Cell membrane expressing the polypeptide for screening was treated with 20 mM HEPES (pH 7.4), 100 m ⁇ NaG I, inverted MgC I 2 , Mix in a 50 mM GDP solution with 35 S labeled GTP S 400p.
  • Substances (compounds, peptides, and antibodies) having the agonist activity of the polypeptide for screening can be screened using the increase in specific GTP rS binding in the presence of the test drug as an index.
  • a substance (compound, peptide, and antibody) having the antagonistic activity of the polypeptide for screening is screened by using as an index the suppression of an increase in GTP rS binding by the oral kineticin (preferably prokineticin 2) in the presence of the test drug. be able to.
  • the Ga 2+ concentration can be measured indirectly by detecting the transcription activity of a gene whose transcription amount is regulated depending on the Ga 2+ concentration.
  • the Ga 2+ concentration can be measured by the following method. First, a reporter gene linked to a serum responsive element is introduced into cells in which the screening polypeptide has been expressed, and the test drug is added to the culture medium of the cells.
  • the reporter gene any gene that can generate a detectable signal can be used.
  • the luciferase gene is desirable as a reporter gene. After incubation at 37 ° C for 4 hours, remove the medium, lyse the cells, and measure luciferase activity.
  • substances (compounds, peptides, and antibodies) having agonist activity of the polypeptide for screening can be screened using the induction of luciferase activity upon addition of the test drug as an index.
  • prokineticin preferably prokineticin 2
  • prokineticin 2 at a final concentration of 5 to 500 nM is added, and the luciferase activity is measured in the same manner.
  • prokineticin preferably prokineticin 2
  • substances (compounds, peptides, and antibodies) having a screening polypeptide antagonist activity were identified. Can be screened.
  • a substance (compound, peptide, and antibody) or the like is allowed to act on cells expressing the protein and host cells not expressing the protein (control cells) for a certain period of time to directly control the Ga 2+ concentration. Alternatively, it is measured indirectly.
  • substances having an agonist activity can be screened using an increase or decrease of the cell-specific Ga 2+ concentration expressing the protein as an index.
  • a substance (a compound, a peptide, a peptide, a peptide, or the like) having the antagonist activity of the screening polypeptide may be used, based on the inhibitory effect of prokineticin (preferably prokineticin 2) on the increase or decrease of the Ga 2+ concentration in the presence of the test drug.
  • prokineticin preferably prokineticin 2
  • the screening method of the present invention is preferably performed under the conditions described in Example 4.
  • test drug by adding the test drug to the Atsushi conditions described in Example 4, that is, a substance having an IG50 of 10 juM or less under the conditions of Example 4, and preferably a substance having an IG50 of 1 M or less is obtained. More preferably, substances having an IG50 of 0.1 j or less can be selected as substances having antagonist activity.
  • the present invention comprises: a step of screening using the screening method of the present invention; and a step of formulating a preparation using the substance obtained by the screening.
  • a method for producing a pharmaceutical composition for treating hypersensitivity is included.
  • Formulations containing a substance obtained by the screening method of the present invention as an active ingredient are prepared using carriers, excipients, and / or other additives commonly used in the formulation of the active ingredient, depending on the type of the active ingredient. Can be prepared.
  • Administration may be, for example, oral administration of tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, or oral solutions, or injections such as intravenous, intramuscular, or joint injections, suppositories.
  • parenteral administration such as intravenous injection is preferred for peptides digested in the stomach.
  • one or more active substances and at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, polyvinyl It can be mixed with pyrrolidone or magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition may contain additives other than an inert diluent, for example, a lubricant, a disintegrant, a stabilizer, or a solubilizing or solubilizing agent, according to a conventional method.
  • the tablets or pills can be coated with a sugar coating or a film of a gastric or enteric substance, if necessary.
  • Liquid compositions for oral use can include, for example, emulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs; commonly used inert diluents, such as purified water Or it may include ethanol.
  • the composition can contain additives other than inert diluents, for example, wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
  • Parenteral injections may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
  • the aqueous solution or suspension may contain, for example, distilled water for injection or physiological saline as a diluent.
  • examples of the diluent of the water-insoluble solution or suspension include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil (eg, olive oil), alcohols (eg, ethanol), and polysorbate 80. it can.
  • the composition may further include a wetting agent, an emulsifying agent, a dispersing agent, a stabilizer, a solubilizing or solubilizing agent, a preservative, and the like.
  • the composition can be sterilized by, for example, filtration through a bacteria retaining filter, blending of a fungicide, or irradiation.
  • a sterile solid composition can be produced and dissolved in sterile water or another sterile injectable medium before use.
  • the dose depends on the active ingredient, that is, the substance which inhibits the activation of LTRPG2 protein, or the strength, symptom, age, sex, etc. of the substance obtained by the screening method of the present invention. It can be determined as appropriate in consideration of the above.
  • the dose in the case of oral administration, is usually about 0. ⁇ ! ⁇ 100mg, preferably 0. ⁇ ! ⁇ 50 mg.
  • the dosage in the case of parenteral administration, is 0.01 to 50 mg, preferably 0.01 to 10 mg per day in the form of injection.
  • prokineticin 1 was used for human small intestine
  • prokineticin 2 was used for human testis-derived cDNA (Marathon Ready cDNA; Clontech) as type I cDNA.
  • prokineticin 1 an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 was used as the primer
  • an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 was used as the reverse primer.
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 was used as the forward primer for prokineticin 2
  • an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 was used as the reverse primer.
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 4 and 6 include the FLAG sequence. Therefore, prokineticin is expressed by in-frame fusion of the marker sequence FLAG epitope on the G-terminal side. This simplifies the purification of prokineticin.
  • An Xbal recognition sequence and a Notl recognition sequence were added to the 5 'end of each of the above primers, respectively.
  • DMA polymerase (Pyrobest DNA polymerase; Takara Shuzo) was used94. After G (2 minutes), 96 ° G (5 seconds) / 72. 5 cycles of G (1.5 minutes), 5 cycles of 96 ° 0 (5 seconds) / 70 ° G (1.5 minutes), cycles of 96 ° 0 (5 seconds) / 68 ° G (1.5 minutes) Repeated 20 times. As a result, a DNA fragment of about 0.3 kbp was amplified for both prokineticins 1 and 2. This fragment was cloned using pGR2.1 pi asm id (Invitrogen).
  • the nucleotide sequence of the obtained clone was analyzed with the ABI3700 DNA Sequencer (Applied Biosystems) using the dideoxy terminator method, and clones that matched the known prokineticin 1-2 sequence (GenBank No. AF333024, AF333025) were Selected. These clones were digested with XbaI Notl and inserted into a PCEP4 plasmid for animal cell expression (Invitrogen).
  • the constructed prokineticin expression plasmid is obtained by seeding HEK293 cells in a 6-well plate (Collagen-Type I-Coated 6-well plate; manufactured by Asahi Technograss) at 1 ⁇ 10 5 cells / well and culturing for 24 hours.
  • prokineticin 1 or prokineticin 2 expression plasmid was transduced using a transfection reagent (FuGENE6; Boehringer Mannheim). From 72 hours after transfection, transfected cells were selected in a hygromycin B-containing medium, and The obtained drug-resistant cells were used as prokineticin-expressing cells. Prokineticin-expressing cells are cultured in a 10 cm Petri dish (Go I lagen-Type Coated; Asahi Techno Glass Co., Ltd.) until confluent, the medium is discarded, and the cells are cultured in a DMEM medium containing 0.5% fetal bovine serum for 4 days. The prokineticin-containing medium was recovered.
  • Example 2 Gene cloning of G protein-coupled receptor, GPRg2 and acquisition of GPRg2-expressing CH0 cells
  • human spleen-derived cDNA (GVIarathon Ready cDNA; Clontech) was used as type I GDNA, and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 as the forward primer.
  • an oligonucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 was used as the reverse primer.
  • An Xbal recognition sequence was added to the 5 'end of each primer.
  • PGR was performed using DNA polymerase (Pyrobest DMA polymerase; Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • This sequence has an open reading frame of 1155 bases (SEQ ID NO: 1).
  • the amino acid sequence (384 amino acids) predicted from the open reading frame is shown in Torii Column No. 2.
  • the constructed GPRg2 expression plasmid was prepared by seeding GHO / dhfr-cells on a 6-well plate at 1 x 10 5 cells / well and culturing for 24 hours, then transfecting GPRg2 expression plasmid / well into transfection reagent (FuGENE6 The gene was transferred using Boehringer Mannheim. From 72 hours after gene transfer, transfected cells were selected in a medium containing methotrexate, and the obtained drug-resistant cells were used as GPRg2-expressing cells. (Example 3) Analysis of GPRg2 expression distribution in human tissues
  • PGR was performed using Taq polymerase (Ex Taq; Takara Shuzo) using cDNA derived from each human tissue as type III.
  • the PGR conditions are the same as in the first embodiment.
  • a DNA fragment of about 1.2 kbp was amplified by cDNA derived from the amygdala, hippocampus, corpus callosum, substantia nigra, thalamus, frontal lobe, and fetal brain. No amplification was confirmed for cDNAs from the stomach, small intestine, and testes.
  • Example 4 Change in intracellular Ga 2+ concentration by prokineticin in GPRg2-expressing GH0 cells
  • GPRg2-expressing GHO cells or pEF-BOS-dhfr were incorporated into a 96-well plate (96 well Black / clear bottom plate; BECTON DICKINSON).
  • GH0 cells vacant vector-treated cells
  • GH0 cells were plated with 1 ⁇ 10 4 cells and cultured for 24 hours. After that, the medium was discarded, and 4 ⁇ M Fluo-3, AM (Molecular Probe), 0.004% pluronic acid and Hunk's Balanced Solt Solution (Hanks BSS; Gibco) containing 1% FBS and 20m HEPES was added at 100 l / well and incubated at 37 ° C for 1 hour. After the incubation, the cells were washed four times with Hanks BSS containing 20 mM HEPES, and 100 ⁇ l / well of Hanks BSS containing 20 mM HEPES was added.
  • prokineticin 1 was inserted in-frame with the FactorXa sequence to prepare the same as the native form.
  • prokineticin 2 does not have a Tyr residue used for radioisotope labeling in the molecule, the FLAG sequence at the G-terminus is retained, and the Tyr residue in the sequence is radioisotoped.
  • purified prokineticin was obtained by the following procedure.
  • the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 9 was used as the forward primer, and the oligonucleotide represented by SEQ ID NO: 10 was used as the reverse primer.
  • a SpeI recognition sequence is added at the 5 'end of each of the above primers.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 includes a signal sequence sequence of influenza A virus' hemagglutinin, a FLAG sequence, and a Factor Xa recognition sequence. Therefore, after extracellular secretion, prokineticin 1 is expressed by fusing the marker sequence FLAG epitope and the Factor Xa recognition sequence in frame at the N-terminus.
  • prokineticin 1 purification of prokineticin 1 can be simplified.
  • PGR Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo) 94. After G (2 minutes), 94. The cycle of G (30 seconds) / 55 ° C (30 seconds) / 72 ° G (1.5 minutes) was repeated 20 times. As a result, a DNA fragment of about 1.4 kbp was amplified. This fragment was digested with Spel and inserted into pGEP4 plasmid. The nucleotide sequence of the obtained clone was analyzed using an ABI 3700 DNA Sequencer. The constructed prokineticin 1 expression plasmid was transfected into HEK293 cells in the same manner as in Example 1 to obtain a prokineticin 1 stable expression cell line.
  • prokineticin 2 expressed in animal cells the cDNA encoding prokineticin 2 expressed in frame with the marker sequence FLAG epitope fused to the G-terminal end prepared in Example 1 was pEF- Enter BOS- dhfr pl asm id Used. Therefore, after extracellular secretion, prokineticin 2 is expressed by in-frame fusion of the marker sequence FLAG epitope at the G-terminal side.
  • the constructed prokineticin 2 expression plasmid was transfected into GHO / dhfr cells in the same manner as in Example 2, to obtain a prokineticin 2 stable expression cell line.
  • prokineticin 1 or prokineticin 2 collected in the same manner as in Example 1 was applied to an M2-agarose column (Sigma), and the column was washed with 0.5% NaCl-containing PBS. After reacting overnight with PBS containing Factor Xa (Amersham), prokineticin 2 was eluted from the M2-7 galose column with the FLAG-peptide-containing PBS. The eluted product containing the target prokineticin was purified by gel filtration using a Superdex Peptide FPLC column (Amersham).
  • prokineticin 2 was slightly higher than prokineticin 1 and both were a single band of about 10 kDa.
  • the estimated molecular weights of prokineticins 1 and 2 were 9666.88 Da and 10039.31 Da, respectively, which matched the predicted molecular weights, confirming that prokineticins 1 and 2 were purified.
  • HEK293-EBNA cells (Invitrogen) will be 7 x 10 4 cells / well in a collagen type I-coated 24-well plate (Goll agen-Type Coated 24 wellpiate; Asahi Techno Glass).
  • 125 1-labeled prokineticin 2 ([ 125 1] -PK2) was obtained by purifying 5j (g of prokineticin 2 in Example 5 using lodaine-125 (PerkinElmer) using the I0D0-GEN lodination tube method ( Pierce).
  • [ 125 I] -PK2 was added to each of the CH0 membrane fraction and the GPRg2 membrane fraction at a final concentration of 500 ⁇ to 30 g each, and 50 mM Tris-HGI (pH 7.5) JO mM MgGI 2 , 0.1% BSA The mixture was incubated for 1 hour at room temperature in a 50 ⁇ I solution consisting of, and collected in a glass filter using a cell harvester. A micro scintillator was added to the glass filter, and the total amount bound to the membrane fraction was measured using a liquid scintillation counter.
  • the amount of non-specific binding to the membrane fraction was determined by adding unlabeled prokineticin 1 or 2 (ie, prokineticin purified in Example 5) at a final concentration of 0.5 / ⁇ to the aforementioned test.
  • prokineticin 1 or 2 ie, prokineticin purified in Example 5
  • [ 125 1] -PK2 was found to specifically bind to the membrane fraction of CH0 cells stably expressing GPRg2.
  • no specific binding was observed in the membrane fraction of the CH0 cells transfected with the empty vector.
  • the GPRg2 receptor of the present invention has a binding affinity for prokineticin 2. It was confirmed that the receptor had By conducting a binding experiment using cells expressing this GPRg2 receptor in the presence of the test drug, it became possible to screen for substances having affinity for the GPRg2 receptor.
  • a substance may be a substance having an activity to enhance the activity of prokineticin 1 or 2 (ie, a neuronal cell death inhibitor) or a substance having an antagonist activity to inhibit the response of prokineticin II or 2 to GPRg2 (ie, a therapeutic agent for hyperalgesia). It is.
  • the dorsal root ganglion is the nerve tissue that receives the primary sensory nerve projections and is responsible for transmitting pain stimuli sensed by nociceptors to the brain.
  • drugs that reduce the excitability of spinal nerve cells can suppress the transmission of noxious stimuli.
  • Such drugs are useful as pain remedies to reduce pathological pain such as pain in rheumatoid arthritis and osteoarthritis.
  • Some types of pain do not involve noxious stimuli, such as neuropathic pain, but neuropathic pain is induced by the increased excitability of the nerve cells involved in pain transmission. Therefore, drugs that reduce spinal cord neuronal excitability are also effective against neuropathic pain (Sotgiu et al., Somatosens. Mot.
  • mRNA purified kit (0 igotex-dT30; Takara Shuzo Co., Ltd.) was purchased from commercially available total RNA from the dorsal root ganglion (Clontech). After purification of mRNA using), a reverse transcription reaction was performed using a reagent for reverse transcription reaction (Super Script; Gibco) to prepare human spinal dorsal root ganglion cDNA. Using the synthesized cDNA as type III, PGR was performed under the conditions described in Example 2.
  • a DNA fragment of about 1.2 kbp was amplified, and it was confirmed that GPRg2 was expressed in human dorsal root ganglia. Based on these results, a therapeutic agent for pain, particularly a hyperalgesia therapeutic agent can be developed by obtaining a compound that regulates the activation mechanism of GPRg2 by screening.
  • a substance that modulates the activity of the receptor which can be obtained by the screening tool of the present invention or the screening method of the present invention, is used as an active ingredient, and a carrier, an excipient, and / or other additives are used.
  • a pharmaceutical composition for suppressing neuronal cell death and for treating Z or hyperalgesia can be produced. Sequence listing free text

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Description

明 細 書 プロキネティシン受容体を用いた新規スクリーニング方法
技術分野
本発明は、 プロキネティシン受容体を使用した神経細胞死及び 又は痛覚過敏 を制御する物質のスクリーニング方法に関する。 背景技術
プロキネティシン （Prokineticin)は、 ヒ卜でプロキネティシン 1 とプロキネ ティシン 2 の 2 種類のサブタイプが存在する生理活性ペプチドである（Mol Pharmacol. 2001 59:692 - 8)。 もともとプロキネティシンは、 1990 年にフランス のグループによリ、 マンバ (南ァフリ力産のコブラ科の大型毒へビ）の蛇毒成分と して同定され、 ΓΜΙΤυ と命名されたが（Tox icon. 1990 28:847- 56)、 後にォー ストリアのグループにより、 力エル皮膚より該当分子が精製され、 「Bv8j と命 名された（Eur J Pharmacol. 1999 374：189-96) 0 哺乳類のプロキネ亍イシンは、 1999 年にマウスプロキネティシン 2 遺伝子配列が報告され（FEBS Lett. 1999 26:177-81)、 さらに同遺伝子がマウスでは第 6染色体、 ヒ卜では第 3染色体 p21 に存在している事が確認された（Gene. 2000 3： 189-95) 0 2001 年には、 ヒ卜ゲノ ム配列データベース検索により、 初めてヒトプロキネティシン 1 の存在が確認さ れた（Mol Pharmacol. 2001 59:692-8)。
プロキネティシン 1、 2は、 それぞれアミノ酸 105個、 108個で構成される前駆 体として細胞内で合成され、 成熟分子ではシグナルペプチドの除去により、 プロ キネティシン 1が 86個、 プロキネティシン 2が 81個になると考えられている。 プロキネティシン 1、 2は、 互いに約 55%の相同性を有しており、 マンバ、 力エル の該当分子に対しても 50%以上の相同性がある。 分子内には 5本の S-S結合が存 在しており、 これら Gysの位置は MIT1、 Bv8でも保存されている。 プロキネティ シンは立体構造が非常に安定でプロテアーゼ処理に対しても耐性を示す。
プロキネティシン 1 は、 組織発現解析から脳、 卵巣、 腎臓、 子宮、 心臓、 精巣 等、 中枢および抹消組織で広範な発現パターンを示している。 一方、 プロキネテ ィシン 2も同様に広い組織発現が観察されるが、 mRNA転写量はプロキネティシン 1に比べ低い（FEBS Lett. 1999 462:177-81、 Mol Pharmacol. 2001 59:692-8)。 プロキネティシンの生理機能に関しては、 ①中枢作用として神経細胞死抑制活 性（Eur J Neurosci. 2001 13:1694- 702)や痛覚過敏惹起活性（Eur J Pharmacol. 1999 374:189-96)、 ②消化器収縮作用（Mo I Pharmacol. 2001 59:692-8、 FEBS Lett. 1999461 :183-8)そして③精子形成作用 (FEBS Lett. 1999 462 :177-81)が 報告されている。 プロキネティシンの神経細胞死抑制活性は、 ラット小脳性顆粒 初代培養細胞を用いて、 増殖培地中の力リゥム濃度を上昇させる事によるアポ卜 一シス誘導実験系により、 確認された。 また同活性がマップキナーゼ (mitogen - activated kinase, MAPK)ゃホスファチジルイノシ! ^一ル 3キナーゼ
(phosphatidi I inositol-3-kinases P卜 3-K)阻害剤である PD98059や LY294002によ リ消失した事から、 プロキネティシンは ΜΑΡΚ/Ρ卜 3-Κを介して細胞内情報伝達を 行う、 と考察されている。 痛覚過敏惹起活性については、 プロキネティシンがォ ピオイド系を介する痛覚過敏や、 オビオイド■ リガンドの脳内受容体結合には影 響しない事から、 オビオイド系とは、 独立のシステムにより痛覚過敏が惹起され ると考えられている。
しかしながら、 上記のようにプロキネティシンの生理機能については報告があ るものの、 その受容体については最近になるまで同定されておらず、 プロキネテ ィシンの中枢作用を制御する,化合物の簡便なスクリーニング系の構築はなされて いなかった。 TO01/163609にプロキネティシン受容体の開示はあるが、 該受容体 は主に精巣に発現すると記載されている。 従って、 消化器収縮作用や精子形成作 用には働かず、 中枢作用、 特に、 神経細胞死抑制作用及び Ζ又は痛覚過敏を制御 する物質に働くヒ卜プロキネティシン 1、 2に対する内在性受容体分子を同定し、 さらに該受容体を使用した神経細胞死抑制剤及び/又は痛覚過敏治療剤のスクリ 一二ング方法が待望されている。 発明の開示
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 ヒトプロキネ亍イシン 1、 2に対する内 在性受容体 GPRg2をコードする遺伝子を同定することに成功した。 GPRg2遺伝子は ヒ ト扁桃核、 海馬、 脳梁、 黒質、 視床、 前頭葉、 及び胎児脳で発現しており、 胃. 小腸、 精巣では発現していないこと、 及び GPRg2遺伝子が一次知覚神経の投射を 受けており侵害受容器により感受された痛みの刺激を脳に伝達する役割を担って いる神経組織である脊髄後根神経節で発現していることより、 GPRg2が消化器収 縮作用や精子形成作用には働かず、 中枢作用に働くヒトプロキネティシン 1、 2に 対する内在性受容体分子であることを見出した。 また、 GPRg2の発現及び精製、 並びに GPRg2を発現する形質転換細胞の生産を可能にした。 加えて、 GPRg2を発現 させた細胞がプロキネティシンにより細胞内カルシウム濃度変化すること、 プロ キネティシンが GPRg2を安定発現する CH0細胞の膜画分に特異的に結合することを 見出し、 GPRg2及び GPRg2を発現する細胞が神経細胞死抑制を制御する物質、 及び 又は痛覚過敏を制御する物質をスクリーニングするためのスクリーニングツー ルとなることを見出した。 これらにより、 プロキネティシン受容体の活性を修飾 する物質を選択することによってプロキネティシンの神経細胞死抑制作用及び 又は痛覚過敏を制御することができる物質を同定することができ、 弓 Iいては神経 細胞死によつて引き起こされる疾患治療薬、 例えば、 痴呆症治療剤、 脳卒中治療 剤、 及び Z又は痛覚過敏症治療剤として有用な物質を見出すことができる。 本発 明はこのような知見に基づくスクリーニングツール及びスクリーニング方法を提 供するものである。
すなわち本発明は、
(1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドあるいは配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1〜10個のァミノ酸が欠失、 置換及ぴ 又は付加され たアミノ酸配列を含み、
かつ、
プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確 認できるポリべプチドである、 神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、
(2) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配 列からなり、
かつ、 プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確 認できるポリべプチドである、 神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、
(3) (1 ) 又は （2) に記載のポリペプチドであり、 神経細胞死抑制剤である痴 呆症治療剤、 脳卒中治療剤、 及び 又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール
(以下、 （1 ) 〜 （3) 記載の神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、 痴呆症治 療剤、 脳卒中治療剤、 及び痛覚過敏症治療剤スクリーニングツールを総称してポ リぺプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールと称する） 、
(4) (1 ) 又は （2) に記載のポリペプチドを発現している細胞である、 神経細 胞死抑制剤スクリ一ニングツール、
(5) (4) に記載の細胞であり、 神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、 脳卒中 治療剤、 及び 又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール （以下、 （4) ~ (5
) 記載の神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、 痴呆症治療剤、 脳卒中治療剤、 及び痛覚過敏症治療剤スクリーニングツールを総称して形質転換細胞型神経細胞 死抑制剤スクリーニングツールと称する） 、
(6) (4) 又は （5) に記載の細胞、 又は、 その細胞膜と、 試験化合物とをプロ キネティシン存在下で接触させる工程、 および前記ポリべプチドの活性変化を分 析する工程を含むことを特徴とする、 試験化合物がプロキネティシン受容体アン タゴニス卜又はアンタゴニストであるか否かを検出する方法、
(7) (4) 又は （5) に記載の細胞、 又は、 その細胞膜と、 試験化合物とをプロ キネティシン存在下で接触させる工程、 および前記ポリべプチドの活性変化を分 析する工程を含むことを特徴とする、 神経細胞死抑制剤をスクリーニングする方 法、
(8) (4) 又は （5) に記載の細胞、 又は、 その細胞膜と、 試験化合物とをプロ キネティシン存在下で接触させる工程、 および前記ポリべプチドの活性変化を分 析する工程を含むことを特徴とする、 神経細胞'死抑制剤である痴呆症治療剤、 脳 卒中治療剤及び 又は痛覚過敏症治療剤をスクリーニングする方法、
(9) (7) 又は （8) に記載のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする 工程、 及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程 を含むことを特徴とする、 神経細胞死抑制用である痴呆症治療用、 脳卒中治療用 及び 又は痛覚過敏症治療用医薬組成物の製造方法
に関する。
本明細書において、 「スクリーニングツール」 とは、 スクリーニングの為に用 いる物 （具体的には、 スクリーニングの為に用いるポリペプチド又はポリべプチ ドを発現している細胞） をいう。 「神経細胞死抑制剤スクリーニングツール」 と は、 神経細胞死抑制剤、 及び 又は痛覚過敏治療剤をスクリーニングするために, 本発明の神経細胞死抑制剤、 及び Z又は痛覚過敏治療剤をスクリーニングする方 法において、 試験化合物を接触させる対象となる細胞又はポリべプチドである。
(1 ) 〜 （5) に記載のポリペプチド又は細胞の、 神経細胞死抑制剤、 及び Z又は 痛覚過敏治療剤スクリーニングのための使用も本発明に含まれる。
前記 W00V163609に主に精巣に発現するプロキネティシン受容体として開示さ れた受容体は、 本発明で用いることのできるプロキネティシン受容体 GPRg2と 87 %のホモロジ一を有している。 一方、 本発明で用いることのできるプロキネティ シン受容体 GPRg2と同一のァミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチド、 及び該ポリヌクレオチドがコ一ドする推定アミノ酸配列について は、 種々の報告 (W098/46620. W001/3647U 麵/53308、 W001/68699,
W001/68700) があるが、 いずれもリガンド及ぴ用途が解明されていない。 なお、 本願優先日後に出版された論文 (JBC 277, 22, pp19276-19280, 2002) において、 本発明で用いることのできるプロキネティシン受容体と同一の配列の蛋白質がプ 口キネティシンの受容体であることが開示されているが、 同論文中では前記受容 体は小腸の収縮や血管形成に関与すると記載されている。 また本願優先日後に公 開された W002/6483において、 I 5Eと称されるプロキネティシン受容体 GPRg2と同 —の受容体と、 ヒト ZAQリガンドと称されるプロキネティシン 1との結合が示され ているが、 これらの結合が中枢作用に関与するとの記載はなく、 前記受容体とプ 口キネティシン 2とが結合するとの記載もない。
前記のとおり、 本願記載の神経細胞死抑制剤スクリーニングツール、 神経細胞 死抑制剤、 及び 又は痛覚過敏治療剤スクリーニング方法、 神経細胞死抑制用で ある痴呆症治療用、 脳卒中治療用及び 又は痛覚過敏症治療用医薬組成物の製造 方法は本願発明者らが初めて行った発明である。 図面の簡単な説明
図 1は、 プロキネティシン受容体 GPRg2を発現させた GH0細胞を用い、 プロキネテ イシン 1 (PK1 ) 又はプロキネティシン 2 (PK2) を含む HEK293培養上清を添加した ときのカルシウム濃度の経時変化を示すグラフである。
図 2は、 空ベクターを発現させた GH0細胞を用い、 プロキネティシン 1 (PK1 ) 又は プロキネティシン 2 (PK2) を含む HEK293培養上清を添加したときのカルシウム濃 度の経時変化を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
本明細書中で使用される 「プロキネティシン受容体」 は 「プロキネティシン受 容体蛋白質」 を表す。 「プロキネティシン」 は 「プロキネティシン 1」 、 「プロ キネティシン 2」 を含む。 Γァゴニスト」 はプロキネティシン存在下、 非存在下で プロキネティシン受容体の活性を促進する物質を表す。
[ 1 ] 神経細胞死抑制剤スクリーニングツール
本発明の神経細胞死抑制剤スクリーニングツールには、 ポリべプチド型神経細 胞死抑制剤スクリーニングツールと形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリー二 ングツールとが含まれる。 また、 神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして. 痴呆症治療剤、 脳卒中治療剤又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツールが含ま れる。
υポリべプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツール
本発明のポリべプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いる ことのできるポリペプチドとしては、 例えば、
(1)配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド；
(2)配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1〜10個、 好ましくは 1〜7個、 より好ま しくは 〜 5個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は付加されたアミノ酸配列を含 み、 しかも、 プロキネティシン （好ましくはプロキネティシン 2) 存在下で細胞 内カルシウム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（以下、 機能的等価改変体と称する） ；及び
(3)配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 90%以上であるアミノ酸配列 からなリ、 しかも、 プロキネティシン （好ましくはプロキネティシン 2) 存在下 で細胞内カルシゥム濃度が変動することにより活性が確認できるポリペプチド（ 以下、 相同ポリペプチドと称する） ；
が含まれる。 以下、 本発明のポリペプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングッ ールとして用いることができるこれらの各種ポリべプチドを総称.して、 スクリー ニング用ポリべプチドと称する。
本発明の相同ポリべプチドは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同 性が 90O/O以上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 プロキネティシン存在下で 細胞内カルシゥム濃度が変動することにより活性が確認できるポリべプチドであ る限り、 特に限定されるものではないが、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列に 関して、 好ましくは 90O/O以上、 より好ましくは 95%以上、 更に好ましくは 98%以 上の相同性を有するアミノ酸配列からなることができる。 なお、 本明細書におけ る前記 「相同性 J とは、 BLAST (Basic local a I i ngment search tool ；
Altschul, S.F.ら, J.Mol.Biol. , 215, 403-410, 1990)検索により得られた値 を意味する。 BLAST検索は、 BLASTパッケージ [sgi32bit版， バージョン 2. 0. 12 ； ational Center for Biotechnology Information (NCBI) より入手] の bl2seqプログラム (Tat i ana A. Tatusova, Thomas し. Madden, FEMS
Microbiol. Lett. , 174， 247—250, 1999) を用いて行うことができる。 なお、 パラメータ一では、 ペアワイズアラインメントパラメ一ターとして、 「プロダラ ム名」 として 「blastpj を、 「Gap挿入 Cost値」 を 「0」 で、 「Gap伸長 Cost値」 を 「0」 で、 「Matrix」 として 「BL0SUM62j をそれぞれ使用する。
以上、 スクリーニング用ポリペプチドについて説明したが、 該ポリペプチドと しては、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」 、 あるい は、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列の 1〜10個、 好ましくは 1〜7個、 より好 ましくは 1〜5個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列か らなり、 しかも、 プロキネ亍イシン存在下で細胞内カルシウム濃度が変動するこ とにより活性が確認できるポリぺプチド J が好ましく、 「配列番号 2で表される アミノ酸配列からなるポリペプチド」 がより好ましい。 スクリーニング用ポリべ プチドは前記ポリべプチドである限り特に限定されるものではなく、 その起源も ヒ卜に限定されない。
例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにお ける変異体が含まれるだけでなく、 ヒト以外の生物 （例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 又はィヌ） 由来の機能的等価改変体が含まれる。 更には、 それらの 天然ポリペプチド （すなわち、 ヒト由来の変異体、 あるいは、 ヒト以外の生物由 来の機能的等価改変体） 、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からな るポリベプチドのァミノ酸配列を、 遺伝子工学的に人為的に改変したポリぺプチ ドなどが含まれる。 なお、 本明細書において 「変異体」 （var i at i on)とは、 同一 種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、 あるいは、 数種間の相同ポリべプチ ドにみられる差異を意味する。
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒ卜における変異 体、 あるいは、 ヒ卜以外の生物由来の機能的等価改変体は、 当業者であれば、 配 列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドをコードするポリヌクレ ォチドの塩基配列 （例えば、 配列表の配列番号 1で表される塩基配列） の情報を 基にして取得することができる。 なお、 遺伝子組換え技術については、 特に断り がない場合、 公知の方法 （例えば、 Man i at i s, T.ら，" Mo l ecu l ar C l on i ng-A Labor atory Manua l ", Co l d Spr i ng Harbor Laboratory, NY, 1982) に従って実施するこ とが可能である。
本発明のポリべプチド型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いる ことのできるスクリーニングツール用ポリぺプチドは、 種々の公知の方法によつ て得ることができ、 例えば、 目的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いて 公知の遺伝子工学的手法により調製することができる。 より具体的には、 後述す るスクリーニングツール用形質転換細胞 （すなわち、 スクリーニングツール用ポ リぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、 前記ポリペプチドを発現している形質転換細胞） を、 スクリーニングツール用ポ リぺプチドの発現が可能な条件下で培養し、 受容体タンパク質の分離及び精製に 一般的に用いられる方法により、 その培養物から目的タンパク質を分離及び精製 することにより調製することができる。
スクリ一ニングツール用ポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする ポリヌクレオチド、 機能的改変体をコードするポリヌクレオチド、 及び相同ポリ ぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを挙げることができる。 本明細書 (こおけ る用語 「ポリヌクレオチド」 には、 DMA及び RNAの両方が含まれる。 スクリ一ニングツール用ポリべプチドをコードするポリヌクレオチドの製造方 法は、 特に限定されるものではないが、 例えば、 （A) PCR を用いた方法、 （B)常 法の遺伝子工学的手法 （すなわち、 GDNAライブラリーで形質転換した形質転換株 から、 所望の cDNA を含む形質転換株を選択する方法） を用いる方法、 又は (C)化 学合成法などを挙げることができる。 以下、 各製造方法について、 順次、 説明す る。
(A) PGRを用いた方法
本発明のプロキネティシン受容体を産生する能力を有するヒト細胞あるいは 組織から mRNAを抽出する。 次いでこの mRNAを錶型として該受容体 mRNA又は一部の mRNA領域をはさんだ 2種類のプライマーを作製する。 逆転写酵素一ポリメラーゼ 連鎖反応 (以下 RT— PGRという）を行うことにより、 該プロキネテイシン受容体 cDNA又はその一部を得ることができる。 さらに、 得られたヒ卜のプロキネティシ ン受容体 cDNA又はその一部を適当な発現ベクターに組み込むことにより、 宿主細 胞で発現させ、 該受容体の蛋白質を製造することができる。
まず、 本発明のプロキネティシン受容体の産生能力を有する細胞あるいは組織, 例えばヒト脳から該蛋白質をコードするものを包含する mRNAを既知の方法によリ 抽出する。 抽出法としては、 グァニジン■チオシァネート 'ホット■フエノール 法、 グァニジン 'チオシァネート一グァニジン '塩酸法等が挙げられるが、 好ま しくはグァニジン■チオシァネート塩化セシウム法が挙げられる。 該蛋白質の産 生能力を有する細胞あるいは組織は、 該蛋白質をコードする塩基配列を有する遺 伝子あるいはその一部を用いたノーザンブロッテイング法、 該蛋白質に特異的な 抗体を用いたウェスタンプロッティング法などによリ特定することができる。
mRNAの精製は常法に従えばよく、 例えば mRNAをオリゴ (dT)セルロースカラムに 吸着つ'容出させ、 精製することができる。 さらに、 ショ糖密度勾配遠心法等によ リ mRNAをさらに分画することもできる。 また、 mRNAを抽出せずとも、 市販されて いる抽出済 mRNAを用いても良い。
次に、 精製された mRNAをランダムプライマー又はオリゴ dTプライマーの存在下 で、 逆転写酵素反応を行い第 1鎖 GDNAを合成する。 この合成は常法によって行う ことができる。 また、 GDNAは合成せずとも、 実施例 1、 実施例 2で用いているよう に、 市販されている cDNAを用いても良い。 得られた第 1鎖 cDMAを用い、 目的遺伝 子の一部の領域をはさんだ 2種類のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応 (Saiki, R. K. et al. (1988) Science 239, 487-491 ； 以下、 PGRという）に供し、 目的とするプロキネティシン受容体 DMAを増幅する。 得られた DNAをァガロースゲ ル電気泳動等により分画する。 所望により、 上記 DNAを制限酸素等で切断し、 接 続することによって目的とする DNA断片を得ることもできる。
(B)常法の遺伝子工学的手法
まず、 前記の PGRを用いた方法で調製した mRNAを錶型として、 逆転写酵素を用 いて〗本鎖 cDNAを合成した後、 この 1本鎖 GDNAから 2本鎖 GDNAを合成する。 その方 法としては、 例えば、 S1ヌクレア一ゼ法（Efstratiadis, ら, Cel l, 7, 279- 288, 1976)、 Land法（Land, H.ら， ucleic Acids Res. , 9, 2251—2266，
1981)、 O.Joon Yoo法（Yoo, 0. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983)、 又は Okayama— Berg法（Okayama, H.及び Berg, P. , Mol.Cel I.Biol., 2， 161-170, 1982)などを挙げることができる。
次に、 前記 2本鎖 cDNAを含む組換えプラスミドを作製した後、 大腸菌 (例えば、 DH5 株）に導入して形質転換させ、 例えば、 テトラサイクリン又はアンピシリン に対する薬剤耐性を指標として、 組換体を選択する。 宿主細胞の形質転換は、 例 えば、 宿主細胞が大腸菌の場合には、 Hanahanの方法（Hanahan, D. J. , Mol.Biol. , 166, 557-580, 1983)、 すなわち、 GaGI2、 MgCI2 又は RbGIを共存させて調製し たコンビテン卜細胞に、 前記組換え DNA体を加える方法により実施することがで きる。 なお、 ベクターとしては、 プラスミ ド以外にもラムダ系などのファージべ クタ一を用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、 目的の GDNAを有する形質転換株を選 択する方法としては、 例えば、 以下に示す (1 )合成オリゴヌクレオチドプローブ を用いるスクリーニング方法、 （2) PGRにより作製したプローブを用いるスクリー ニング方法、 （3)他の動物細胞で目的ポリべプチドを産生させてスクリーニング する方法を採用することができる。
合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるスクリーニング方法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の GDNAを有する形質転換株を選択することができる。 すなわち、 本発明のポリべプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチ ドを合成し、 これをプローブ (32P又は33 Pで標識する）として、 形質転換株の DNAを 変性固定したニトロセルロースフィルターとハイブリダィズさせ、 得られた陽性 株を検索して、 これを選択する。 なお、 プローブ用のオリゴヌクレオチドを合成 する場合には、 コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもで きるし、 あるいは、 考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個のヌクレオチ ド配列とすることもできる。 後者の場合には、 イノシンを含ませてその種類を減 らすことができる。
PCRにより作製したプローブを用いるスクリーニング方法では、 例えば、 以下 の手順により、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、 本発明のポリぺプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアン チセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、 これらを組合せて PGRを 行ない、 目的ポリペプチドの全部又は一部をコードする DNA断片を増幅する。 こ こで用いる錶型 DNAとしては、 本発明のポリべプチドを産生する細胞の mRNAよリ 逆転写反応にて合成した cDNA、 又はゲノム DNAを用いることができる。 このよ,う にして調製した DMA断片を、 例えば、 32P又は33 Pで標識し、 これをプローブとして 用いてコロニーハイブリダイゼーシヨン又はプラークハイプリダイゼーシヨンを 行なうことにより、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択する。
他の動物細胞で目的ポリべプチドを産生させてスクリーニングする方法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の GDNAを有する形質転換株を選択することがで きる。 すなわち、 形質転換株を培養し、 ポリヌクレオチドを増幅させ、 そのポリヌク レオチドを動物細胞にトランスフエク卜し、 ポリヌクレオチドにコ一ドされたポ リペプチドを細胞表面に産生させる。 なお、 この場合、 自己複製可能で転写プロ モーター領域を含むプラスミド、 あるいは、 動物細胞の染色体に組み込まれ得る ようなプラスミドのいずれを用いることもできる。 本発明のポリペプチドに対す る抗体を用いて、 本発明のポリペプチドを検出することにより、 元の形質転換株 の中から、 目的の cDNAを有する形質転換株を選択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、 公知の方法 (ί列えば、 Man i at is, T.ら， " Molecular Cloning— A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1982)に従って実施するこ とができる。 例えば、 細胞よりプラスミド DMAに相当する画分を分離し、 得られ たプラスミ ド DNAから cDNA領域を切リ出すことにより行なうことができる。
(0 化学合成法
化学合成法を用いた方法では、 例えば、 化学合成法によって製造した DNA断片 を結合することによって、 本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。 各 DMAは、 DNA合成機 [例えば、 Ol igo 1000 DNA Synthesizer (Beckman社製）、 又は 394 DNA/RNA Synthesizer (Appl ied Biosystems社製）など] を用いて合 成することができる。
また、 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリペプチドの情報に基づいて、 例えば、 ホスファイト■ トリエステル法（Hunkapi I ler， Μ·ら， Nature, 10, 105 -111, 1984)等の常法に従い、 核酸の化学合成により製造することもできる。 な お、 所望アミノ酸に対するコドンは、 それ自体公知であり、 その選択も任意でよ く、 例えば、 利用する宿主のコドン使用頻度を考慮して、 常法に従って決定する ことができる（Grantham, ら， Nucleic Acids Res.， 9， r43-r74, 1981)。 更に、 これら塩基配列のコドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコード する合成ォリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異 誘発法（site specific mutagenesis) (Mark, D. F.ら， Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 81, 5662-5666, 1984)等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られる DNAの配列決定は、 例えば、 マキサ ムーギルバートの化学修飾法（Maxam, A. M.及び G i I bert, W.， "Methods i n Enzymo l ogy" , 65, 499-559, 1980)ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法
(Mess i ng, J.及び V i e i ra, J.， Gene, 19, 269-276, 1982)等により行なうこと ができる。 本発明のスクリーニングツール用ポリべプチドは、 下記の方法によって得るこ とができる。 単離されたスクリーニングツール用ポリべプチドをコ一ドするポリ ヌクレオチドを、 適当なベクター DNA に再び組込むことにより、 宿主細胞 （好ま しくは真核生物、 特に好ましくは GH0細胞又は 293 - EBNA細胞） を形質転換させ ることができる。
前記形質転換細胞を培養することにより、 前記細胞の細胞表面に生産される スクリーニングツール用ポリべプチドは、 前記ポリべプチドの物理的性質や生化 学的性質等を利用した各種の公知の分離操作法によリ、 分離精製することができ る。 該方法としては、 具体的には例えば受容体蛋白質を含む膜分画を可溶化した 後、 通常の蛋白沈殿剤による処理、 限外濾過、 分子ふるいクロマトグラフィ一（ ゲル濾過）、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換体クロマトグラフィー、 ァフ ィニティクロマトグラフィー、 高速液体クロマトグラフィ一(HPLG)等の各種液体 クロマトグラフィー、 透析法、 これらの組合せ等を例示できる。 なお、 膜分画は 常法に従って得ることができる。 例えば本発明のプロキネティシン受容体を表面 に発現した細胞を培養し、 これらをバッファーに懸濁後、 ホモジナイズし遠心分 離することにより得られる。 また、 できるだけ緩和な可溶化剤 (GHAPS、 Tr i ton X- 100、 ジキトニン等）でプロキネティシン受容体を可溶化することにより、 可溶 化後も受容体の特性を保持することができる。
本発明のスクリーニングツール用ポリべプチドはマーカー配列とインフレーム で融合して発現させることで、 スクリーニングツール用ポリべプチドの発現の確 認、 細胞内局在の確認、 精製等が可能になる。 マーカー配列としては、 例えば、 FLAG ep i tope^ Hexa-H i st i d i ne tag. Hemagg l ut i n i n tag、 myc ep i topeなどがあ る。 また、 マーカー配列とプロキネティシン受容体の間にェンテロキナーゼ、 フ ァクタ一 Xa、 トロンビンなどのプロテアーゼが認識する特異的な配列を挿入する ことにより、 マーカー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去する事が 可能である。 例えば、 ムスカリンアセチルコリン受容体と Hexa - H i st i d i ne tagと をトロンビン認識配列で連結した報告がある（Hayash i , M.に and Haga, T.
(1996) J. B i ochem. , 120, 1232-1238)
2)形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツール
本発明の形質転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いる ことのできる形質転換細胞 （以下、 スクリーニングツール用形質転換細胞と称す る） としては、 例えば、
(1 ) 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換され、 前記ポリべプチドを発現し ている形質転換細胞；
(2) 機能的等価改変体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形 質転換され、 前記ポリべプチドを発現している形質転換細胞；及び
(3) 相同ポリペプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形 質転換され、 前記ポリぺプチドを発現している形質転換細胞
を挙げることができる。
スクリーニングツール用形質転換細胞は、 例えば、 先に述べた方法により単離 されたスクリーニングツール用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを、 適当なベクター DNA に再び組込むことにより、 宿主細胞 （好ましくは真核生物、 特に好ましくは GH0細胞又は 293-EBNA細胞） を形質転換させることにより取得 することができる。 また、 これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現 にかかわる配列を導入することにより、 それぞれの宿主細胞においてポリヌクレ ォチドを発現させることが可能である。
前記発現ベクターは、 スクリーニングツール用ポリべプチドをコ一ドするポリ ヌクレオチドを含む限り、 特に限定されるものではなく、 例えば、 用いる宿主細 胞に応じて適宜選択した公知の発現ベクターに、 前記ポリヌクレオチドを揷入す ることにより得られる発現ベクターを挙げることができる。 また、 本発明の形質 転換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いることのできるス クリーニングツール用形質転換細胞は、 前記発現ベクターで形質転換され、 スク リーニングツール用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含み、 形質転 換細胞型神経細胞死抑制剤スクリーニングツールとして用いる際に前記ポリぺプ チドを発現している限り、 特に限定されるものではなく、 例えば、 スクリーニン グツール用ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドが、 宿主細胞の染色体に 組み込まれた細胞であることもできるし、 あるいは、 スクリーニングツール用ポ リベプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの形で含有する細 胞であることもできる。 スクリーニングツール用形質転換細胞は、 例えば、 スク リーニングツール用ポリべプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現べク ターにより、 所望の宿主細胞を形質転換することにより得ることができる。
例えば、 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 酵母等の細胞が含まれ、 脊椎動物細胞としては、 例えばサルの細胞である COS細胞 (Gluztnan, Y. (1981) Cel l, 23, 175-182)やチヤィニーズ■ /、ムスタ一卵巣細胞 (GH0)のジヒドロ葉酸 レダクターゼ欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220)、 ヒト胎児腎臓由来 HEK293細胞および同細胞に
Epstein Barr Virusの EBNA— 1遺伝子を導入した 293— EBNA細胞（Invは rogen社製） 等がよく用いられているが、 これらに限定されるわけではない。
脊椎動物細胞の発現べクタ一としては、 通常発現しょうとする遺伝子の上流に 位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、 ポリアデニル化部位および転写 終結配列等を有するものを使用でき、 これはさらに必要により複製起点を有して もよい。 該発現べクタ一の例としては、 SV40の初期プロモーターを有する pSV2dhfr (Subramani, S. et al. (1981) Moに Cel I. Biol., 1， 854-864)、 ヒ 卜の elongation factorプロモータ一を有する pEF - BOS ( izushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. , 18, 5322)、 cytomegalovirusプロモー ターを有する pGEP4 (Invi trogen社製）等を例示できるが、 これに限定されない。 宿主細胞として、 COS細胞を用いる場合を例に挙げると、 発現ベクターとして は、 SV40複製起点を有し、 G0S細胞において自律増殖が可能であり、 さらに転写 プ口モータ一、 転写終結シグナルおよび RNAスプライス部位を備えたものを用い ることができ、 例えば、 pME18S、 (Maruyama, K. and Takebe, Y. (1990) Med. Immunol. , 20, 27 - 32)、 pEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S. (1990) Nucleic Acids Res. , 18, 5322)、 pCDM8(Seed, B. (1987) Nature, 329, 840 - 842) 等が挙げられる。 該発現べクタ一は DEAE—デキストラン法 (Luthman, H. and Magnusson, G. (1983) Nucleic Acids Res. , 11, 1295-1308)、 リン酸カル シゥム一 DNA共沈殿法（Graham, F. L. and van der Ed, A. J. (1973) Virology, 52， 456-457)、 FuGENE6(Boer inger Mannheim社製）を用いた方法、 および電気パ ルス穿孔法（Neumann, E. et al. (1982) EMB0 J. , 1， 841 -845)等により COS細胞 に取り込ませることができ、 かくして所望の形質転換細胞を得ることができる。 また、 宿主細胞として CH0細胞を用いる場合には、 発現ベクターと共に、 G418 耐性マーカーとして機能する neo遺伝子を発現し得るベクター、 例えば
pRSVneo (Sambrook, J. et al. (1989)： " Molecular Cloning- A Laboratory Manual "Cold Spring Harbor Laboratory, NY)や pSV2 - neo (Southern, P. J. and Berg, P. (1982) J. Mol. Appl. Genet. , 1, 327- 341)等をコ■ 卜ランスフエクト し、 G418耐性のコロニーを選択することによリスクリーニング用ポリペプチドを 安定に産生する形質転換細胞を得ることができる。 また、 宿主細胞として 293— EBNA細胞を用いる場合には、 Epstein Barr Virusの複製起点を有し、 293-EBNA 細胞で自己増殖が可能な pGEP4 (Invi trogen社）などの発現べクタ一を用いて所望 の形質転換細胞を得ることができる。
上記で得られる所望の形質転換体は、 常法に従い培養することができ、 該培養 により細胞内又は細胞表面に本発明のスクリーニング用ポリべプチドが生産され る。 該培養に用いられる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各 種のものを適宜選択でき、 例えば上記 COS細胞であれば RPM I -1640培地やダルべッ コ修正ィ一ダル最小必須培地 (DMEM)等の培地に必要に応じ牛胎児血清 (FBS)等の 血清成分を添加したものを使用できる。 また、 上記 293— EBNA細胞であれば牛胎 児血清 (FBS)等の血清成分を添加したダルべッコ修正イーグル最小必須培地
(DME )等の培地に G418を加えたものを使用できる。
[2] 神経細胞死抑制剤及び 又は痛覚過敏治療剤スクリーニング方法
スクリーニングツール用ポリべプチド又はスクリーニングツール用形質転換 細胞を用いると、 スクリーニングツール用ポリべプチドの活性を修飾可能な物質 (化合物、 ペプチド及び抗体） を検出及びスクリーニングすることができる。 本発明の検出方法において、 スクリーニング用ポリべプチドの活性の変化は、 スクリーニングに用いる受容体蛋白質の生理学的な特性に応じた活性の指標を測 定することにより行われる。 指標とする活性とは、 たとえばリガンドとの結合活 性であり、 あるいはリガンドの結合によってもたらされる刺激に対する応答であ る。 具体的には、 以下に述べるような検出方法を示すことができる。 スクリ一二 ング用ポリペプチドとしては、 該ポリペプチドを発現させた細胞、 該細胞の膜分 画、 又は該ポリペプチドからなる蛋白質の精製標品などを用いることもできる。 また本発明によるスクリーニング方法のための被験化合物としては、 市販の化合 物、 ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物やペプチド、 コンビナ トリアル .ケミストリ一技術（Terrett，N. , et a l . (1995) Tetrahedron, 51 , 8135 - 8137)によつて得られた化合物群やファージ■ディスプレイ法（Fe I i G i， F. , et a l . (1991 ) J. Mo l . B i o l . , 222， 301 - 310)などを応用して作成されたランダム ■ペプチド群を用いることができる。 また、 微生物の培養上清や、 植物、 海洋生 物由来の天然成分、 動物組織抽出物などもスクリーニングの対象となる。 あるい は本発明のスクリーニング方法によリ選択された化合物又はべプチドを化学的又 は生物学的に修飾した化合物又はべプチドを用いうるが、 それらに限らない。 a)リガンド結合アツセィ法を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリべプチドに結合する物質（化合物、 ぺプチド、 及び抗体）はリガンド結合アツセィ法によリスクリーニングする事ができる。 該 スクリーニング用ポリべプチドを発現させた細胞膜、 あるいは該スクリーニング 用ポリペプチドからなる蛋白質精製標品を調製する。 緩衝液、 イオン、 pHのよう なアツセィ条件を最適化し、 最適化したバッファ一中で同スクリ一ニング用ポリ ぺプチドを発現させた細胞膜、 あるいは該スクリーニング用ポリべプチドからな る蛋白質精製標品を、 標識リガンド、 例えば 1251 標識プロキネティシン （好まし くは 1251 標識プロキネティシン 2) を被験薬と共に一定時間インキュベーション する。 反応後、 ガラスフィルタ一等で濾過し適量のバッファーで洗浄した後、 フ ィルターに残存する放射活性を r力ゥンター等で測定する。 得られた放射活性リ ガンドの結合阻害を指標に該スクリーニング用ポリべプチドのァゴニスト活性を 有する物質 (化合物、 ペプチド、 及び抗体）、 あるいはアンタゴニスト活性を有す る物質（化合物、 ペプチド、 及び抗体）をスクリーニングすることができる。 本発 明のスクリーニング方法によって選択される、 該スクリーニング用ポリべプチド のアンタゴニスト活性を有する物質は、 例えば、 痛覚過敏症の治療や予防に有用 である。 また、 本発明のスクリーニング方法によって選択される、 該スクリー二 ング用ポリペプチドのァゴニスト活性を有する物質は、 神経細胞死抑制、 例えば、 痴呆症や脳卒中の治療や予防に有用である。
本発明のスクリーニング方法は、 W0 01 /19986 に記載のリガンド結合アツセィ 法を利用したスクリーニング方法により実施できる。ただし、 リガンドは LTG4を プロキネティシンに、 受容体は LTG4受容体をプロキネティシン受容体 （すなわち スクリーニング用ポリペプチド） に置き換える。より具体的には実施例 7 に記載 の方法により実施できる。
b)GTP rS結合法を利用したスクリーニング方法
本発明のスクリーニング用ポリべプチドの活性を修飾する物質（化合物、 ぺプ チド、 及び抗体)は GTP rS結合法によリスクリーニングすることが可能である（L azareno, S. and B i rdsa l I , N. J. M. (1993) Br. J. Pharmaco l . 109, 1 120-1 127) 0 スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞膜を 20mM HEPES (pH7. 4) , 100m Μ NaG I , 翻 MgC I 2, 50mM GDP溶液中で、 35Sで標識された GTP S 400p と混合 する。 被験薬存在下と非存在下でインキュベーション後、 ガラスフィルタ一等で 濾過し、 結合した GTP rS の放射活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一等で測 定する。 被験薬存在下における特異的な GTP rS 結合の上昇を指標に、 該スクリ 一二ング用ポリペプチドのァゴニスト活性を有する物質（化合物、 ペプチド、 及 び抗体）をスクリーニングすることができる。 また、 被験薬存在下における、 プ 口キネティシン （好ましくはプロキネティシン 2) による GTP rS結合上昇の抑制 を指標に該スクリーニング用ポリぺプチドのアンタゴニスト活性を有する物質 (化合物、 ペプチド、 及び抗体）をスクリーニングすることができる。
G)細胞内 Ga2+濃度の変動を利用したスクリーニング方法 本発明のスクリーニング用ポリべプチドの活性を修飾する物質（化合物、 ぺプ チド、 及び抗体）は、 スクリーニング用ポリペプチドを発現させた細胞の細胞内 C a2+濃度の変動を利用してスクリーニングすることが可能である。 細胞内の Ca2+濃 度の測定は fura2や f l uo3等を用いて測定することができる。
あるいは、 Ga2+濃度に依存して転写量が調節される遺伝子の転写活性を検出す ることにより、 間接的に Ga2+濃度を測定することが可能である。 具体的には以下 の方法で、 Ga2+濃度を測定することができる。 まず、 セラムレスポンシブエレメ ン卜をつないだレポ一タ一遺伝子をスクリーニング用ポリべプチドを発現させた 細胞に導入し、 被験薬を該細胞の培養液中に加える。 レポーター遺伝子には、 検 出可能なシグナルを生成することができる任意の遺伝子を用いることができる。 例えばルシフェラ一ゼ遺伝子は、 レポーター遺伝子として望ましい。 37°Cで 4時 間インキュベート後、 培地を除去し、 細胞を溶解してルシフェラーゼ活性を測定 する。 そして被験薬添加時のルシフェラーゼ活性誘導を指標にスクリーニング用 ポリペプチドのァゴニスト活性を有する物質（化合物、 ペプチド、 及び抗体）をス クリーニングすることができる。 また、 被験薬を該細胞の培養液中に添加後、 最 終濃度 5 - 500nMのプロキネティシン （好ましくはプロキネティシン 2) を添加し 同様にルシフヱラーゼ活性を測定する。 そして、 被験薬添加時のプロキネ亍イシ ン （好ましくはプロキネティシン 2) によるルシフヱラーゼ活性誘導の阻害を指 標に、 スクリーニング用ポリべプチドのアンタゴニスト活性を有する物質（化合 物、 ぺプチド、 及び抗体）をスクリーニングすることができる。
本発明のスクリーニング方法においては、 該蛋白質を発現させた細胞と発現さ せていない宿主細胞（コントロール細胞）に物質（化合物、 ペプチド、 及び抗体)等 を一定時間作用させ、 Ga2+濃度を直接あるいは間接的に測定する。 コントロール 細胞と比較して、 該蛋白質を発現させた細胞特異的な Ga2+濃度の上昇又は低下を 指標にァゴニスト活性を有する物質 (化合物、 ペプチド、 及び抗体）をスクリー二 ングすることができる。 また、 被験薬存在下における、 プロキネティシン （好ま しくはプロキネティシン 2) による Ga2+濃度の上昇又は低下の阻害作用を指標に 該スクリーニング用ポリべプチドのアンタゴニス卜活性を有する物質（化合物、 ぺプチド、 及び抗体）をスクリーニングすることができる。 本発明のスクリーニング方法は、 実施例 4記載の条件で行うことが好ましい。 たとえば実施例 4に記載の条件で、 EG50=100 ;u M以下の物質を、 好ましくは EG 50=10 M 以下の物質を、 更に好ましくは EG50=1 j« M 以下の物質をァゴニスト活 性を有する物質として、 選択することができる。 また、 実施例 4 に記載のアツセ ィ条件に被験薬を追加することにより、 即ち、 実施例 4の条件で I G50 が 10 ju M 以下の物質を、 好ましくは I G50が 1 M以下の物質を、 更に好ましくは I G50が 0. 1 j« 以下の物質をアンタゴニスト活性を有する物質として選択することができる
[3]神経細胞死抑制用及ぴ 又は痛覚過敏治療用医薬組成物の製造方法
本発明には、 本発明のスクリーニング方法を用いてスクリーニングする工程、 及び前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程を含むこと を特徴とする、 神経細胞死抑制用、 及びノ又は痛覚過敏治療用医薬組成物の製造 方法が包含される。
本発明のスクリーニング方法により得られる物質を有効成分とする製剤は、 前 記有効成分のタイプに応じて、 それらの製剤化に通常用いられる担体、 賦形剤、 及ぴ 又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 又 は経口用液剤などによる経口投与、 あるいは、 静注、 筋注、 若しくは関節注など の注射剤、 坐剤、 経皮投与剤、 又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げる ことができる。 特に胃で消化されるペプチドにあっては、 静注等の非経口投与が 好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、 少な くとも一つの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 微結晶 セルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 デンプン、 ポリビニルピロリ ドン、 又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。 前記組成 物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加剤、 例えば、 滑沢剤、 崩壊剤、 安定化剤、 又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。 錠剤又は 丸剤は、 必要によリ糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆す ることができる。 経口のための液体組成物は、 例えば、 乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 又はエリキシル剤を含むことができ、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例え ば、 精製水又はエタノールを含むことができる。 前記組成物は、 不活性な希釈剤 以外の添加剤、 例えば、 湿潤剤、 懸濁剤、 甘味剤、 芳香剤、 又は防腐剤を含有す ることができる。
非経口のための注射剤としては、 無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、 懸濁剤、 又は乳濁剤を含むことができる。 水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、 希釈剤として、 例えば、 注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。 非水溶性の溶 液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、 例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール、 植物油 (例えば、 ォリーブ油）、 アルコール類 (例えば、 エタノー ル）、 又はポリソルベート 80等を含むことができる。 前記組成物は、 更に湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶解若しくは溶解補助剤、 又は防腐剤などを含むこ とができる。 前記組成物は、 例えば、 バクテリア保留フィルターを通す濾過、 殺 菌剤の配合、 又は照射によって無菌化することができる。 ま 、 無菌の固体組成 物を製造し、 使用の際に、 無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、 使用 することもできる。
投与量は、 有効成分、 すなわち、 LTRPG2蛋白質の活性化を阻害する物質、 ある いは、 本発明のスクリーニング方法により得られる物質の活性の強さ、 症状、 投 与対象の年齢、 又は性別等を考慮して、 適宜決定することができる。
例えば、 経口投与の場合、 その投与量は、 通常、 成人 (体重 60kgとして）におい て、 1日につき約 0. ·！〜 100mg、 好ましくは 0. ·！〜 50mgである。 非経口投与の場合、 注射剤の形では、 1日につき 0. 01〜50mg、 好ましくは 0. 01〜10mgである。 実施例
以下に実施例によリ本発明を詳述するが， 本発明は該実施例によって限定され るものではない。 なお、 特に断りがない場合は、 公知の方法（Man i at i s, T. at a l . (1982) ： "Mo l ecu l ar C l on i ng - A Laboratory Manua I " Go l d Spr i ng Harbor Laboratory, NY等）に従って実施可能である。 また、 市販の試薬ゃキッ卜 を用いる場合には市販品の指示書に従って実施可能である。 (実施例 1) 動物細胞でのプロキネティシン発現系の構築
ヒ 卜プロキネティシン 1、 2 をコードする遺伝子の増幅には、 プロキネティシ ン 1 はヒ卜小腸、 プロキネティシン 2 はヒ卜精巣由来の cDNA(Marathon Ready cDNA； クロンテック社）を錶型 cDNA に用いた。プロキネティシン 1 が、 フォヮ一 ドプライマ一として、 配列番号 3 で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ ドを使用し、 リバースプライマーとして、 配列番号 4で表される塩基配列からな るオリゴヌクレオチドを使用した。プロキネティシン 2 がフォワードプライマー として、 配列番号 5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、 リバースプライマーとして、 配列番号 6 で表される塩基配列からなるオリゴヌク レオチドを使用した。 配列番号 4、 配列番号 6で表される塩基配列には FLAG配列 が含まれる。 従って、 プロキネティシンは、 G 末端側にマーカー配列 FLAG ェピ 卜ープをインフレームで融合して発現される。 これにより、 プロキネティシンの 精製が簡便化できる。なお、 前記の各プライマーの 5' 末端には、 それぞれ、 Xbal 認識配列、 Notl 認識配列が付加してある。 PGR は DMA ポリメラーゼ（Pyrobest DNA polymerase；宝酒造社）を用い、 94。 G(2分）の後、 96° G(5秒)/ 72。 G(1.5分） のサイクルを 5 回、 96° 0(5 秒） /70° G(1.5 分）のサイクルを 5 回、 96° 0(5 秒) /68° G(1.5分)のサイクルを 20回繰り返した。 その結果、 プロキネティシン 1、 2共に約 0.3kbpの DNA断片が増幅された。 この断片を pGR2.1 pi asm id (イン ビトロジェン社）を用いてクローニングした。 得られたクローンの塩基配列はジ デォキシターミネータ一法により ABI3700 DNA Sequencer (アプライドバイオシス テムズ社）で解析し、 既知プロキネティシン 1、 2配列 （GenBank No. AF333024, AF333025)と合致したクローンをそれぞれ選択した。 これらクローンを Xba卜 Notl で消化し、 動物細胞発現用 PCEP4 plasmid (インビトロジェン社）に挿入した。 構築されたプロキネティシン発現プラスミドは、 6 ゥエルプレート（Col lagen - Type I -Coated 6 well plate ； アサヒテクノグラス社製）に HEK293細胞を 1 ゥェ ルあたり 1x105細胞で播種して 24時間培養後、 1 ゥヱルあたり 1 gのプロキネ ティシン 1 又はプロキネティシン 2発現プラスミドをトランスフエクシヨン試薬 (FuGENE6;ベーリンガーマンハイム社）を用いて遺伝子導入した。 遺伝子導入 72 時間後より、 ハイグロマイシン B含有培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、 得ら れた薬剤耐性細胞をプロキネティシン発現細胞として用いた。 プロキネティシン 発現細胞は、 10cmシャーレ（Go I lagen - Type卜 Coated ；アサヒテクノグラス社）に コンフルェン卜になるまで培養後、 培地を廃棄し、 0.5%牛胎児血清入り DMEM 培 地にて 4日間培養して、 プロキネティシン含有培地を回収した。
(実施例 2) G蛋白質共役型受容体、 GPRg2 の遺伝子クローニングと GPRg2発現 CH0細胞の取得
ヒ ト GPRg2 をコードする遺伝子の増幅には、 ヒ ト脾臓由来の cDNAGVIarathon Ready cDNA； クロンテック社）を錶型 GDNA に、 フォワードプライマ一として配列 番号 7 で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使用し、 リバースブラ イマ一として、 配列番号 8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを使 用した。なお、 前記の各プライマーの 5' 末端には、 それぞれ、 Xbal 認識配列が 付加してある。 PGR は DNAポリメラーゼ（Pyrobest DMA polymerase;宝酒造社）を 用い、 94° G(2分)の後、 96° G(5秒) /72° G(1.5分)のサイクルを 5回、 96° G(5 秒) /70° GC1.5分)のサイクルを 5 回、 96° C(5秒) /68° G(1.5 分）のサイクルを 20 回繰り返した。 その結果、 約 1.2kbp の DNA 断片が増幅された。 この断片を Xbal で消化 した後、 pEF-BOS-dhfr plasmid(Biochim Biophys Acta. 1997 1354:159-70)に挿入した。 得られたクローンの塩基配列はジデォキシターミネ一 ター法により ABI3700 DNA Sequencer (アプライドバイオシステムズ社）を用いて 解析した。 明らかになった配列を配列番号 1に示す。
同配列は 1155塩基のオープンリーディングフレーム (配列番号： 1)を持ってい る。 オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列 (384 アミノ酸） を酉己列番号 2に示す。
構築された GPRg2発現プラスミドは、 6ゥエルプレートに GHO/dhfr—細胞を 1 ゥ エルあたり 1x105細胞で播種して 24時間培養後、 1 ゥエルあたり の GPRg2 発現プラスミ ドをトランスフエクシヨン試薬（FuGENE6;ベーリンガーマンハイム 社）を用いて遺伝子導入した。 遺伝子導入 72 時間後より、 メ 卜トレキセート含有 培地で遺伝子導入細胞の選択を行い、 得られた薬剤耐性細胞を GPRg2発現細胞と して用いた。 (実施例 3) ヒト組織における GPRg2の発現分布解析
GPRg2 の組織発現分布を解析するために、 ヒト各組織由来 cDNA を錶型とし、 Taq ポリメラーゼ (Ex Taq；宝酒造社）を用いて PGR を行った。 PGR条件は、 実施 例 1 と同じである。 その結果、 約 1.2kbpの DNA断片が扁桃核、 海馬、 脳梁、 黒 質、 視床、 前頭葉、 胎児脳に由来する cDNA で増幅された。 胃、 小腸、 精巣由来 の cDNAでは増幅が確認されなかった。
(実施例 4) GPRg2発現 GH0細胞のプロキネティシンによる細胞内 Ga2+濃度の変化 96 ゥェルプレー卜（96well Black/clear bottom plate ； BECTON DICKINSON 社）に GPRg2発現 GHO細胞もしくは、 pEF- BOS-dhf rを組み込んだ GH0細胞 (空べク ター処理細胞）を 1 x104細胞でプレーティングして 24時間培養後、 培地を廃棄し、 4〃M Fluo-3,AM (Molecular Probe社）、 0.004% pluronic acidおよび 1% FBSと 20m HEPES を含む Hunk's Balanced Solt Solution (Hanks BSS；ギブコ社）を 1 ゥエルあたり 100〃 I 添加し、 37°Cで 1 時間インキュベートした。 インキュベー 卜後、 細胞を 20mM HEPESを含む Hanks BSSで 4回洗浄して、 1 ゥエルあたり 100 μ Iの 20mM HEPESを含む Hanks BSSを添加した。
細胞内 Ga2+濃度の変化は FLIPR (モレキュラーデバイス社）を用いて経時的に測 定した。 すなわち、 測定開始 10秒後に、 プロキネティシンを含む HEK293細胞培 養上清を添加し、 添加後、 50秒間は 1秒毎に、 さらに 4分間は 6秒毎に蛍光強度 を測定した。 得られた結果の蛍光値を Y軸に、 時間を X軸にプロットすると、 GPRg2 はプロキネティシンに反応して細胞内 Ga2+濃度の変化が観察されたが、 プ 口キネティシンを発現させない HEK293 細胞培養上清では観察されなかった。 さ らに、 同反応は、 空べクタ一を処理した GH0細胞では見られなかった。 以上の事 から、 GPRg2はプロキネティシン 1、 2に対する生体内受容体である事が確認でき た。
本プロキネティシン受容体で形質転換した細胞の細胞内 Ga2+濃度の変化を測定 する事でプロキネティシンァゴニス卜、 アンタゴニスト、 すなわち神経細胞死抑 制剤、 及び 又は痛覚過敏治療剤のスクリーニングが可能となった。 (実施例 5) 動物細胞発現プロキネティシン 1及び 2の発現並びに精製
動物細胞で発現させたプロキネティシンの精製サンプルを用いて、 放射性同位 元素標識を行い、 バインディングアツセィ等に用いることを考え、 まず、 以下の 実験により精製プロキネティシンを得た。 その際、 プロキネティシン 1 は、 精製 時に用いた FLAG配列を除去するために、 ィンフレームで FactorXa配列を入れて、 nat i ve form と同じものを作製した。 また、 プロキネティシン 2 は、 分子内に放 射性同位元素標識に用いる Tyr残基を有していないため、 G末端の FLAG配列を残 して、 同配列中の Tyr 残基に対して放射性同位元素標識することを考えた。 具体 的には以下の手順で精製プロキネティシンを取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン 1 を取得するために、 フォワードブラ イマ一として配列番号 9で表されるオリゴヌクレオチドを、 リバースプライマー として、 配列番号 10で表されるオリゴヌクレオチドを使用した。前記の各プライ マーの 5' 末端には、 それぞれ、 Spe l 認識配列が付加してある。 なお、 配列番号 9 で表される塩基配列には、 インフルエンザ A ウィルス 'へマグルチニンのシグ ナルシーケンス配列、 FLAG配列、 そして Factor Xa認識配列が含まれる。 従って、 プロキネティシン 1 は、 細胞外分泌後は、 N 末端側にマーカー配列 FLAG ェピト —プと Factor Xa認識配列をインフレームで融合して発現される。 これにより、 プロキネティシン 1の精製が簡便化できる。 PGRはパイロペス卜 DNAポリメラーゼ (Pyrobest DNA po l ymerase ;宝酒造社）を用い、 94。 G (2 分）の後、 94。 G (30 秒) /55° C (30 秒) /72° G (1 . 5 分）のサイクルを 20 回繰り返した。 その結果、 約 1 . 4kbpの DNA断片が増幅された。 この断片を Spe lで消化した後、 pGEP4 p l asm i d に揷入した。 得られたクローンの塩基配列は、 AB I 3700 DNA Sequencer を用いて 解析した。 構築されたプロキネティシン 1 発現プラスミドは、 （実施例 1 )で用い た方法と同様に、 HEK293細胞に遺伝子導入し、 プロキネティシン 1安定発現細胞 株を取得した。
動物細胞で発現させたプロキネティシン 2の取得のためには、 実施例 1 で作製 した、 G 末端側にマーカ一配列 FLAG ェピトープをインフレームで融合して発現 されるプロキネティシン 2をコードする cDNAを pEF-BOS- dhfr p l asm i dに揷入し て用いた。 従って、 プロキネティシン 2 は、 細胞外分泌後は、 G末端側にマーカ 一配列 FLAG ェピトープをインフレームで融合して発現される。 構築されたプロ キネティシン 2発現プラスミドは、 実施例 2で用いた方法と同様に、 GHO/dhfr細 胞に遺伝子導入し、 プロキネティシン 2安定発現細胞株を取得した。
実施例 1 と同じ方法で回収したプロキネティシン 1 もしくは、 プロキネティシ ン 2を含有する培地を、 それぞれ M2—ァガロースカラム（シグマ社）にかけ、 0. 5% NaC I 含有 PBSでカラムを洗浄後、 プロキネティシン 1 は、 Factor Xa (アマシャ ム社)含有 PBSで一晩反応して、 プロキネティシン 2は、 FLAG-pept i de含有 PBS にて、 それぞれ M2— 7ガロースカラムよリ溶出した。 目的プロキネティシンを含 む溶出産物は、 最終的に Superdex Pept i de FPLC カラム（アマシャム社）でゲルろ 過を行い精製を行った。 精製産物を SDS電気泳動後、 銀染色 (第一化学社）を行つ たところ、 プロキネティシン 2の方がプロキネティシン 1 よりわずかに高分子側 に、 共に約 10 kDaの単一バンドとして確認された。 プロキネティシン 1 と 2の 推定分子量は、 それぞれ 9666. 88 Da、 10039. 31 Da である事から、 予測分子量に 合致しており、 プロキネティシン 1及び 2が精製されていることが確認できた。
(実施例 6) GPRg2発現 HEK293細胞のプロキネティシンによるルシフェラーゼレ ポーターアツセィ系の構築
コラーゲンタイプ I をコーティングした 24 ゥエルプレート（Go l l agen-Type卜 Coated 24 we l l p i ate ;アサヒテクノグラス社）に、 HEK293- EBNA細胞（インビトロ ジェン社）を 1 ゥエル当たり 7 x 104細胞となるように播種し、 24時間培養した後、 実施例 1で構築した GPRg2動物細胞発現プラスミド、 又はプラスミド pEF-BOS (コ ントロールとしての空べクタ一）（1 ゥエル当たり 100ng)と、 プラスミ ド pSRE - I UG (ストラタジーン社）（1 ゥヱル当たり 20ng)とを、 遺伝子導入試薬 (FuGENE6 ;ベ —リンガーマンハイム社）を用いて、 2者同時に遺伝子導入した。 遺伝子導入から 24時間経過した後、 培地を廃棄し、 10 nMの精製プロキネティシン 1 もしくは精 製プロキネティシン 2を添加して、 5時間 37°Cで反応させ、 ルシフェラーゼ■ァ ッセィシステム（和光純薬社）の方法に従い、 細胞内ルシフ: Eラ一ゼ活性を測定し た。 その結果、 GPRg2を遺伝子導入した HEK293細胞では、 空ベクターを遺伝子導 入した HEK293 細胞に比べて、 細胞内ルシフヱラーゼ活性が特異的に上昇してい た。
プロキネティシンの代わりに、 又はプロキネティシンと同時に被験薬を添加し てこの反応系を用いる事で、 プロキネティシン 1 又は 2と同様の活性を有するァ ゴニスト活性を有する物質 （すなわち神経細胞死抑制剤） 、 並びに GPRg2 に対す るプロキネティシン 1 又は 2の反応を阻害するアンタゴニスト活性を有する物質 (すなわち痛覚過敏治療剤） のスクリーニングが可能になった。
(実施例 7) 1251標識プロキネティシン 2を用いた GPRg2受容体結合アツセィ系の
150國培養シャーレに GH0細胞及び GPRg2を安定発現する GH0細胞をコンフル ェントになるまでそれぞれ培養後、 50 mM Tris-HCl (pH7.5) , 10 mM MgCI2にそれ ぞれ懸濁してホモジナイザー （ポリ トロン；キネマティ力社） にてホモジェナイ ズした。 超遠心後、 各沈殿物を 50 tn Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgGI2に懸濁し、 これを GH0 膜画分、 GPRg2 膜画分とした。 1251 標識したプロキネティシン 2([1251] - PK2)は、 実施例 5で精製した 5j( g のプロキネティシン 2 を lodaine - 125 (パーキンエルマ一社）を用いて、 I0D0-GEN lodi nation Tube 法（ピアス社）に 従って作製した。
前記 CH0膜画分、 GPRg2膜画分各 30 gに [125I]-PK2を最終濃度 500 ρΜになる ようにそれぞれ加え、 50 mM Tris-HGI (pH7.5) JO mM MgGI2,0.1% BSA からなる溶 液 50〃 I 中で室温 1 時間インキュベーションし、 セルハーべスターにてグラスフ ィルターに回収した。 グラスフィルターにマイクロシンチレーターを加え、 液体 シンチレーシヨンカウンターで膜画分への総結合量を測定した。 さらに、 前述の 試験に最終濃度 0.5 /^の非標識プロキネティシン 1 もしくは 2 (すなわち実施 例 5で精製したプロキネティシン） を加えることで、 膜画分への非特異的結合量 を測定した。 その結果、 [1251]- PK2は GPRg2 を安定発現する CH0細胞の膜画分に 特異的に結合することが分かった。 一方、 空ベクターを遺伝子導入した CH0細胞 の膜画分では、 特異的結合は観察されなかった。
以上のように、 本発明の GPRg2受容体は、 プロキネティシン 2に結合親和性を 持つ受容体であることが確認された。 本 GPRg2受容体を発現する細胞を用いて被 験薬存在下で結合実験を行うことで、 GPRg2 受容体に対して親和性を有する物質 のスクリーニングが可能となった。 こうした物質は、 プロキネティシン 1 又は 2 の活性を増強する活性を有する物質 （すなわち神経細胞死抑制剤） 、 もしくは GPRg2に対するプロキネティシン〗 又は 2の反応を阻害するアンタゴニズト活性 を有する物質 （すなわち痛覚過敏治療剤） である。
(実施例 8) GPRg2のヒト脊髄後根神経節での遺伝子発現の確認
脊髄後根神経節は、 一次知覚神経の投射を受けており、 侵害受容器により感受 された痛みの刺激を脳に伝達する役割を担っている神経組織である。 そのため、 脊髄神経細胞の興奮性を低下させる薬剤は、 侵害刺激の伝達を抑制することがで きる。 このような薬剤は、 慢性関節リウマチや変形性関節炎における痛みのよう な病的な痛みを抑える疼痛治療薬として有用である。 疼痛には、 神経因性疼痛の ように侵害刺激を伴わないものも存在するが、 神経因性疼痛は、 痛みの伝達に関 わる神経細胞自体の興奮性が高まっているために誘発される疼痛と考えられてい るため、 神経因性疼痛に対しても脊髄神経細胞の興奮性を低下させる薬剤は有効 で あ る （Sotgiu et a I . , Somatosens. Mot. Res. , 9, 227, 1992； Zhang et al. , J. Physiol. ,84, 798, 2000; Ma and Woo If, Pain, 61, 383, 1995； Sot iu and Biel la, Neurosc i . Let. , 283, 153, 2000)。
ヒト GPRg2遺伝子のヒト脊髄後根神経節での組織発現を解析するために、 市販 のヒト脊髄後根神経節由来の total RNA (クロンテック社）から、 mRNA精製キッ卜 (0l igotex-dT30 ;宝酒造社） を用いて mRNA を精製後、 逆転写反応用試薬 (Super Script;ギブコ社）を用いて逆転写反応を行なうことにより、 ヒ卜脊髄後根神経節 cDNAを調製した。 合成された cDNAを錶型とし、実施例 2に記載した条件を用いて PGRを行なった。その結果、約 1.2kbpの DNA断片が増幅され、 GPRg2がヒ卜脊髄後 根神経節で発現している事が確認された。 こうした結果より、 GPRg2 の活性化機 構を調節するような化合物をスクリーニングにより取得することで、 疼痛治療薬 特には痛覚過敏治療剤を開発できる。 産業上の利用可能性
プロキネティシンの中枢作用として、 神経細胞死抑制活性 (Eur J Neurosc i . 2001 13 : 1694- 702)や痛覚過敏惹起活性 (Eur J Pharmaco l . 1999 374 : 189-96)が 知られており、 従って、 前記受容体おょぴ 又は前記受容体で形質転換した細胞 を用いる本発明のスクリーニング方法によって、 中枢作用をコントロールできる 有用な物質、 例えば、 神経細胞死を伴うことが知られている痴呆症、 脳卒中、 及 び 又は痛覚過敏症の治療剤として有用な物質を簡便にスクリーニングすること ができる。本発明のスクリーニングツールによれば、 神経細胞死抑制剤、 及びノ 又は痛覚過敏治療剤として有用な物質をスクリーニング及び評価することができ る。
また、 本発明のスクリーニングツール又は本発明のスクリーニング方法によリ 得ることができる、 前記受容体の活性を修飾する物質を有効成分とし、 担体、 賦 形剤、 及び 又はその他の添加剤を用いて製剤化することにより、 神経細胞死抑 制用、 及び Z又は痛覚過敏治療用医薬組成物を製造することができる。 配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出しく 223>には、 「Artげ i c i a l Sequenceの説明を記載す る。具体的には、 配列表の配列番号 3〜10の配列で表される各塩基配列は、 人工 的に合成したプライマ一配列である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリペプチドあるいは配列番号 2 で表されるアミノ酸配列の 1〜10個のァミノ酸が欠失、 置換及びノ又は付加され たアミノ酸配列を含み、
かつ、
プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確 認できるポリべプチドである、 神経細胞死抑制剤スクリーニングツール。
2. 配列番号 2で表されるアミノ酸配列との相同性が 90O/O以上であるアミノ酸配 列からなり、
かつ、
プロキネティシン存在下で細胞内カルシウム濃度が上昇することにより活性が確 認できるポリべプチドである、 神経細胞死抑制剤スクリーニングツール。
3. 請求の範囲 1又は 2に記載のポリべプチドであり、 神経細胞死抑制剤である痴 呆症治療剤、 脳卒中治療剤、 及びノ又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール
4. 請求の範囲 1又は 2に記載のポリペプチドを発現している細胞である、 神経細 胞死抑制剤スクリーニングツール。
5. 請求の範囲 4に記載の細胞であり、 神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤、 脳卒中治療剤、 及び 又は痛覚過敏症治療剤スクリーニングツール。
6. 請求の範囲 4又は 5に記載の細胞、 又は、 その細胞膜と、 試験化合物とをプロ キネティシン存在下で接触させる工程、 および前記ポリべプチドの活性変化を分 析する工程を含むことを特徴とする、 試験化合物がプロキネティシン受容体アン タゴニスト又はアンタゴニス卜であるか否かを検出する方法。
7. 請求の範囲 4又は 5に記載の細胞、 又は、 その細胞膜と、 試験化合物とをプ 口キネティシン存在下で接触させる工程、 および前記ポリべプチドの活性変化を 分析する工程を含むことを特徴とする、 神経細胞死抑制剤をスクリーニングする 方法。
8. 請求の範囲 4又は 5 に記載の細胞、 又は、 その細胞膜と、 試験化合物とを プロキネティシン存在下で接触させる工程、 および前記ポリべプチドの活性変化 を分析する工程を含むことを特徴とする、 神経細胞死抑制剤である痴呆症治療剤 脳卒中治療剤及び 又は痛覚過敏症治療剤をスクリーニングする方法。
9. 請求の範囲 7又は請求の範囲 8に記載のスクリーニング方法を用いてスクリ 一二ングする工程、 及び
前記スクリーニングにより得られた物質を用いて製剤化する工程
を含むことを特徴とする、 神経細胞死抑制用あるいは痴呆症治療用、 脳卒中治療 用及び Z又は痛覚過敏症治療用医薬組成物の製造方法。
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