SAUERSTOFFSENSOREN AUF MIKROTITERP ATTE
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf einen neuen Sensortyp, der benutzt werden kann, um Sauerstoff in Mikrotiterplatten oder ähnlichen Systemen zu messen. Mit einem neuen Sensorprinzip kann schneller gemessen werden und es ist weniger von dem umgebenden Medium beeinflusst.
Die Produktion von Feinchemikalien ist normalerweise mit einem Verbrauch an Rohmaterial verbunden, der signifikant über der stöchiometrisch notwendigen Menge liegt. Biokatalytische Prozesse stellen Wege zur Verfügung, weniger Substrat zu verbrauchen und weniger Nebenprodukte zu bilden. Diese ressourcenschonenede Vorgehensweise schützt unsere Umwelt.
Um dieses Potential vollständig auszunutzen und somit einen ökonomisch und ökologisch wettbewerbsfähigen Prozess darzustellen, muss die Prozessentwicklung nachhaltig beschleunigt werden. Der Kernpunkt dieser Prozesse ist die Biokatalyse. Während moderne genetische Verfahren {Genetic Engineering) , wie error-phone PCR die schnelle Erzeugung von Enzymvariationen in Größenordnungen von 104 bis 106 Varianten erlauben, stellen die Screening-Verfahren die Engstelle im Entwicklungsprozess dar.
Das Verlangen nach chemischen Verbindungen, die spezifisch an biologische Zellen binden, hat die Entwicklung von Hochdurchsatzverfahren (high-throughput screening, HTS) bewirkt. Mikrotiterplatten in verschiedenen Formaten sind dabei in vielfältigem Einsatz. Die zugehörigen Mikrotiterplatten-Auslesegeräte basieren auf der Messung von Absorption, F l u o resze n zi nte n s ität, F l u o reszen za b kl i n g zeit o d er/u n d Fluoreszenzpolarisation.
Diese Methoden neigen dazu, sehr spezifisch zu sein, was ihre Anwendung auf ausgewählte Systeme beschränkt. Aus diesem Grund müssen Alternativen entwickelt werden, die auf der Sensorik breit anwendbarer Parameter wie dem Sauerstoff basieren.
Die Messung der Sauerstoff konzentration als biologischer Parameter ist seit vielen Jahren bekannt. Seine Bedeutung liegt dabei nicht nur im Bereich der Screeningprozesse, sondern auch in der medizinischen Diagnostik, der Umweltanalytik und der analytischen Chemie. So ist Überwachung des Verbrauchs von gelöstem Sauerstoff durch Mikroorganismen als ein Kennwert für deren Stoffwechsel seit vielen Jahren untersucht worden. Zum Beispiel überwachte C.E. Cliffcon 1937 den Sauerstoffverbrauch von Mikroorganismen während eines Zeitraums von mehreren Tagen unter Verwendung einer Warburg-Flasche. Dieses Verfahren maß die Veränderung der Sauerstoff konzentration in einer langsamen und schwerfälligen Weise.
Die "Clark-Elektrode", ein neueres elektrochemisches Gerät, wird ebenfalls gewöhnlich zur Messung von gelöstem Sauerstoff verwendet. Unglücklicherweise verbraucht die Clark-Elektrode während des Gebrauchs Sauerstoff (wodurch sie den den Mikroorganismen zur Verfügung stehenden Sauerstoff vermindert). Daher wird die Elektrode typischerweise lediglich zur Messung von Volumina von 100 ml oder mehr verwendet, um zu verhindern, dass die Elektrode die Messungen beeinflusst.
Eine "Miniatur"-Clark-Elektrode wurde beschrieben, aber diese Elektrode ist ein kompliziertes Mehrkomponententeil, das ebenfalls mit der zu messenden Lösung in Berührung stehen muss. Während eine sauerstoffdurchlässige Membran verwendet werden kann, um die Wechselwirkung der Elektrodenkomponenten des Geräts mit den Bestandteilen der Prüflösung zu verhindern, muss der Sauerstoff noch
zwischen der Prüflösung und dem Messsystem ins Gleichgewicht kommen und wird verbraucht, sobald er die Membran passiert.
Optische Systeme, die Werte für die Sauerstoffkonzentration liefern können, wurden entwickelt, um die Unzulänglichkeiten der Clark- Elektrodensysteme zu überwinden. Der Hauptvorteil derartiger optischer Verfahren besteht darin, dass das zur Bestimmung des quantitativen Wertes erforderliche Instrumentarium selbst keine physikalische Berührung mit der Prüflösung hat. Optische Verfahren, die sowohl kolorimetrische als auch fluorometrische Sauerstoffanalysen erlauben, die schnell und reproduzierbar auszuführen sind, sind bekannt und die Kosten für derartige Analysen sind oft ziemlich niedrig. Zum Beispiel wurden verschiedene Lumineszenzverfahren zur Bestimmung von Sauerstoff beschrieben, die auf der Fähigkeit von Sauerstoff beruhen, die Fluoreszenz- oder Phosphoreszenzemission einer Vielzahl von Verbindungen zu löschen. Jedoch wurden derartige Verfahren bisher nicht auf die speziellen Bedürfnisses des Screenings angepasst.
DE 3 346 810 C2 beschreibt eine Sensorapparatur zur Bestimmung der Anwesenheit von Sauerstoff in einer Umgebung, die lumineszierendes Material umfasst, dessen Lumineszenzintensität und -dauer durch Sauerstoff gelöscht werden kann, wobei das lumineszierende Material in ein Trägermaterial eingebaut ist, das relativ durchlässig für Sauerstoff und relativ undurchlässig für störende Löscher ist. Zusätzlich bedarf die Apparatur eines Vergleichsindikators, der hermetisch gegen den zu bestimmenden Sauerstoff abgeschlossen ist.
Aus EP 0 509 791 B1 ist ein Verfahren und eine Apparatur zum Nachweis der Anwesenheit von atmenden aeroben Bakterien in einer Flüssigkeit bekannt. Dabei tritt unter Einwirkung von Sauerstoff eine Verminderung der Fluoreszenzintensität auf. Der Fluoreszenzsensor liegt in einer Matrix vor, die für Wasser und nichtgasförmige gelöste Stoffe undurchlässig ist, aber
eine große Durchlässigkeit für Sauerstoff aufweist. Das Vorhandensein einer nichtwasserdurchlässigen Matrix ist notwendig, um die Beeinflussung des Sensors durch Bestandteile der Probe zu verringern. Dieser Aufbau führt jedoch zu großen Nachteilen. Einmal bildet die wasserundurchlässige Matrix ein Sauerstoffreservoir, welches das Messergebnis verfälschen kann. Ein weiterer Nachteil ist die geringe Sensitivität der Methode. Zwar ist die Sensitivität für die in EP 0 509 791 B1 beschriebene Anwendung zum Nachweis der Anwesenheit von atmenden aeroben Bakterien in einer Flüssigkeit ausreichend, da zu Beginn eine mit Sauerstoff gesättigte Lösung vorliegt, deren Sauerstoffkonzentration dann stark abnimmt, um ein Plateau bei geringerem Wert zu erreichen, so dass große Unterschiede in den Sauerstoff konzentrationen detektierbar sind. Beispielsweise Säugerzellen verbrauchen jedoch viel weniger Sauerstoff, so dass dort die zu erzielenden kleinen Änderungen der Sauerstoffkonzentration eine Methode verlangen, die eine signifikant höhere Sensitivität hat. Zum anderen muss sich die wasserundurchlässige Matrix des Fluoreszenzsensors mit der sie umgebenden Flüssigkeit im Gleichgewicht befinden, bevor sie eine Änderung des Signals aufgrund der Änderung des Sauerstoffgehalts der Flüssigkeit zeigen kann. An der Grenzfläche der wasserundurchlässigen Matrix zur sie umgebenden Flüssigkeit besteht aber ein zusätzliches Gleichgewicht, welches sich erst zeitverzögert einstellt. Dadurch erhält man eine lange Ansprechzeit. Die in EP 0 509 791 B1 beschriebene Anwendung zum Nachweis der Anwesenheit von atmenden aeroben Bakterien in einer Flüssigkeit beobachtet verhältnismäßig langsame Prozesse, wobei die zu erzielende Ansprechzeit ausreichend ist. Beispielsweise enzymatische Umsetzungen führen jedoch zu einer sehr schnellen Änderung der Sauerstoffmenge in der den Sensor umgebenden Flüssigkeit. Dabei kann sich die Sauerstoffkonzentration von 100 % Luftsättigung auf 0 % Luftsättigung innerhalb von unter einer Minute ändern. Solche schnellen Prozesse können mit dem in EP 0 509 791 B1 beschriebenen Sensor nicht detektiert werden.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zum Nachweis von Sauerstoff, insbesondere als Mikrotiterplatte oder Kulturplatte mit integrierter Sensorik, bereitzustellen. Es ist weiterhin eine Aufgabe dieser Erfindung, die Messung der Sauerstoffkonzentration in dieser Vorrichtung zu ermöglichen, ohne dass der eingesetzte Sensor ein störendes Sauerstoffreservoir darstellt. Ebenfalls ist es Aufgabe dieser Erfindung, den Sauerstoffgehalt mit geringer Zeitverzögerung (kleine Ansprechzeit), nominell 5 Minuten oder weniger, zu bestimmen. Darüber hinaus ist es Aufgabe der Erfindung, die Detektion schneller Änderungen der Sauerstoffkonzentration zu bestimmen.
Die vorstehend erwähnten und verwandten Aufgaben werden durch das Verfahren und die Vorrichtung der Erfindung verwirklicht. Diese Verfahren und Vorrichtungen verwenden ein Fluoreszenznachweissystem, in dem die fluoreszierende Sensor-Verbindung einen quantifizierbaren Grad der Löschung zeigt, wenn sie Sauerstoff ausgesetzt wird. Spezielle Vorteile werden durch den Einsatz einer hydrophilen Matrix erreicht. Dadurch kann der flüssige Anteil einer Probe zum größten Teil die Sensormatrix durchdringen. Somit stellt die Sensormatrix kein störendes Sauerstoffreservoir dar. Der Sensor steht dadurch in engerem Kontakt zur Probe und kann somit eine Messung mit geringer Ansprechzeit gewährleisten.
Ein Gegenstand der vorliegenden Anmeldung ist eine Vorrichtung zum Nachweis von Sauerstoff gemäß Anspruch 1 . Bevorzugte Ausführungsformen dieser Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche 2 bis 13.
Die Vorrichtung kann zum Nachweis von Sauerstoff in einer Probe, insbesondere in einer biologischen Probe, verwendet werden, beispielsweise in einer Kultur von Mikroorganismen oder höheren Zellen oder bei enzymatischen Umsetzungen.
Eine bevorzugte Ausführungsform des optischen Sauerstoffsensors in der erfindungsgemäßen Vorrichtung besteht aus folgenden Komponenten: einem lumineszierenden Farbstoff, dessen Phosphoreszenz durch in der Probe befindlichen Sauerstoff gelöscht wird. Dieser Farbstoff ist eingeschlossen in kleinen Polymerpartikeln (mit Durchmessern von wenigen nm bis zu einigen μm). Das Material dieser Partikel ist dadurch gekennzeichnet, dass es wasserabweisende Eigenschaften besitzt. Damit wird sichergestellt, dass der eingebaute wasserunlösliche Farbstoff durch Proteine nicht ausgewaschen wird. Im Gegensatz zu anderen Vorrichtungen (z.B. EP 0 509 791 B1 ), in welchen der sauerstoffempfindliche Farbstoff sich innerhalb einer hydrophoben Matrix befindet, ist das einzelne sauerstoffempfindliche Nano- oder Mikropartikel bereits ein vollständig abgeschirmter Sensor. Querempfindlichkeiten durch Wasser oder andere im Wasser gelöste Stoffe sind damit im Wesentlichen ausgeschlossen. Damit ist es nicht notwendig, die Partikel in eine hydrophobe Matrix einzuschließen, die für die Abschirmung des Lumineszenzsensors sorgt. Damit können die Partikel in jede beliebige, und damit auch wasserdurchlässige, Schicht eingebaut werden.
Der Einbau in eine solche wasseraufnehmende, quellende Matrix hat im Vergleich zu den Vorrichtungen mit hydrophober Matrix folgende Vorteile:
1 . Die Ansprechzeit der Sensoren wird entscheidend verkürzt. Ansprechzeiten im Sekundenbereich sind möglich. Dies ist darauf zurückzuführen, dass zum einen die Sensorschicht kein entscheidendes Sauerstoffreservoir ist, und zum zweiten in der gequollenen Matrix die gleichen Reaktionen ablaufen könen wie in der überstehenden Probe.
2. Durch die hydrophilen Eigenschaften des Sensors eignet sich der Sensor gut zur Zellkultivierung. Im Gegensatz dazu eignet sich eine Vorrichtung gemäß EP 0 509 791 B1 durch ihre Hydrophophie nur
schlecht zur Zellkultivierung. Gründe dafür sind z.B., dass adhärent wachsende Zellen für ihr Wachstum hydrophile Oberflächen bevorzugen. Ausserdem werden für anspruchsvolle Zellen zusätzliche Beschichtungen aus Lösungen von beispielsweise Polylysin, Fibronectin oder Kollagen verwendet. Die Herstellung solcher Beschichtungen gelingt bevorzugt auf hydrophilen Oberflächen.
3. Es können lineare Ethanol-Iösliche Hydrogele als Einbaumatrix verwendet werden. Damit vereinfacht sich der Herstellungsprozess der Mikrotiterplatten erheblich. Es braucht keine Vernetzung der Matrix stattfinden, und Abspaltungsprodukte brauchen nicht durch aufwendige Waschprozeduren aus den Sensoren entfernt zu werden. Damit verkürzt sich der Herstellungsprozess beträchtlich und die Produktionskosten werden gesenkt.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfasst die Vorrichtung gemäß der Erfindung eine zusätzliche Beschichtung aus Lösungen von z.B. Polylysin, Fibronectin oder/und Kollagen, z.B. zur Verbesserung des Zellwachstums.
In noch einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Vo rrichtu ng zwei oder mehr spektral unterschied liche Lumineszenzfarbstoffe umfassen. Dabei kann ein Farbstoff als Indikator ausgeführt sein, während ein anderer als Referenzfarbstoff dient. Insbesondere werden zwei spektral unterschiedliche Farbstoffe verwendet, wobei der erste sauerstoffsensitiv und der zweite im Vergleich zum ersten im Wesentlichen sauerstoffinsensitiv ist. Die Sauerstoffsensitivitäten sollten sich messbar voneinander unterscheiden , wo bei unter Anwendungsbedingungen die Sensitivität des Indikator-Farbstoffes beispielsweise um den Faktor > 10, vorzugsweise > 100, noch mehr bevorzugt > 1000 höher ist als diejenige des Referenzfarbstoffs.
Vorzugsweise wird der zweite Farbstoff ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rhodaminen, Xanthenoiden, Styrylfarbstoffen und Merocyaninen. Der erste Farbstoff kann vorzugsweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Pt-(ll)-porphyrinen, Pd-(ll)-porphyrinen und Ru- (Il)-Komplexen mit Poly-N-Heterocyclus, z.B. Polypyridyl-Liganden. Zur Signalerfassung werden zwei Lumineszenzen ausgelesen. Das Signal ist dabei der Quotient aus beiden Lumineszenzintensitäten oder -abklingzeiten. Man erhält ein intern referenziertes Signal.
Der Referenzfarbstoff muss nicht in der ersten Matrix eingeschlossen sein, sondern kann auch ausserhalb vorliegen. In manchen Anwendungen kann eine solche Messung mit zwei Luminophoren von Vorteil sein, da eine höhere Genauigkeit erreicht werden kann, da zeitliche Schwankungen der Lichtintensität der verwendeten Lichtquelle sowie zeitliche Schwankungen der Sensitivität der verwendeten Ausleseeinheit zum großen Teil referenziert werden und nicht wellenlängenabhängige Überlagerungen des Sensorsignals mit Eigenlumineszenz der Probe zum großen Teil referenziert werden können.
Weiterhin können die beiden Farbstoffe bei der Herstellung in einem konstanten Verhältnis vermischt werden, so dass das resultierende Signal unabhängig von der eingesetzten Menge des Farbstoffgemisches ist, was größere Toleranzen bei der Beschichtung der eingesetzten absoluten Menge Sensor erlaubt. Durch die größere bei der Herstellung erlaubte Toleranz können geringere Substanzmengen für die Beschichtung verwendet werden.
In dieser Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann auch die Messung nur der Lumineszenzintensität oder -abklingzeit des Indikator- Farbstoffes erfolgen.
Herstellungsbeispiel für Mikrotiterplatten mit hydrophilen Sauerstoff optoden
A Herstellungsvorschrift sauerstoffsensitiver Partikel:
1 ml einer 10 % (w/w) Polystyrol-Suspension (Aldrich, 45,948-8) wird mit 3 ml Wasser und 1 ml Methanol versetzt und 1 h gerührt. Dazu werden 200 μl einer Lösung von 0, 1 mg Pt(ll)meso-tetra(pentafluorphenyl)porphin (Porphin Products, Pt T975) in Chloroform versetzt und 24 h gerührt. Die Partikel werden abzentrifugiert, mehrmals mit Ethanol gewaschen und in 1 ml Ethanol resuspendiert.
B Herstellungsvorschrift O2-Cocktails:
1 ) 500 mg Polyhydroxyethylmethacrylat (PolyHema, Polysciences, 09689) werden in 10 ml Ethanol und 100 μ\ Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml der unter A beschriebenen Suspension gegeben und 12 h gerührt.
2) 500 mg Polyhydroxyethylmethacrylat (PolyHema, Polysciences, 06989I und 0.1 mg Rhodamin-B-octadecylesterperchlorat (Fluka,
83685) werden in 10 ml Ethanol und 100 μ\ Wasser gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 ml der unter A beschriebenen Suspension gegeben und 12 h gerührt.
Der in B2) beschriebene Cocktail enthält zusätzlich zu dem hydrophob verkapselten Porphin-Farbstoff einen Rhodamin Referenzfarbstoff.
C Vorschrift zur Beschichtung von Mikrotiterplatten (MTP) mit Sauerstoff Sensoren:
96'Well Format:
ln jedes Well der MPT werden 1 ,5 μ\ des unter B1 ) bzw. B2) beschriebenen Cocktails dispergiert. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels kann die Platte y-sterilisiert werden.
Durch die Abbildungen wird die Erfindung näher erläutert.
Abbildung 1 zeigt ein Fluoreszenzspektrum eines erfindungsgemäßen Sensors, sauerstofffrei bzw. Luft-gesättigt. Aus Abb. 1 ist ersichtlich, dass die Intensität der Fluoreszenz durch eine Sättigung mit Luft beträchtlich abnimmt. (Anregung: 540 nm)
Abbildung 2 veranschaulicht die Ansprechzeit eines erfindungsgemäßen Sensors in Abhängigkeit von der Luftsättigung [%]. Auch bei geringen Luftgehalten zeigt der erfindungsgemäße Sensor eine vergleichsweise geringe Ansprechzeit.
In Abbildung 3 ist der Vergleich des Sauerstoffsignals bei einem erfindungsgemäßen Sensor (1 ) und einem Sensor gemäß EP 0 509 791 B1 (2) gezeigt. Es ist ersichtlich, dass der erfindungsgemäße Sensor eine wesentlich geringere Ansprechzeit aufweist.