ES2554077B1 - Microsensor químico polimérico con sonda molecular fluorogénica, proceso de fabricación y uso para la liberación controlada de sustancias bioactivas y otras aplicaciones - Google Patents

Abstract

Microsensor químico polimérico con sonda molecular fluorogénica, proceso de fabricación y uso para la liberación controlada de sustancias bioactivas y otras aplicaciones.#La presente invención se refiere a microsensores químicos poliméricos de bajo coste, así como a su método de obtención, que son dispositivos sensibles a las variaciones de la concentración oxígeno en muestras y que comprenden una o más sondas moleculares fluorogénicas que son derivados de metaloftalocianina y/o metaloporfirina ancladas en una matriz polimérica inerte y estable de un xerogel y depositada en forma de película homogénea sobre una placa de ensayo del tipo microplaca o placa microtituladora. Los microsensores son aptos para aquellas operaciones del laboratorio bioquímico que requieren el manejo de múltiples muestras de pequeño volumen, por ejemplo, técnicas inmunológicas o ensayos basados en células, como es la monitorización de estudios metabólicos relacionados con la proliferación celular de eucariotas y procariotas, la citotoxicidad y senescencia celular y la cadena de respiración mitocondrial, entre otras aplicaciones, y pueden además contener y liberar de forma controlada sustancias bioactivas.

Description

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DESCRIPCION

Microsensor qulmico polimerico con sonda molecular fluorogenica, proceso de fabricacion y uso para la liberacion controlada de sustancias bioactivas y otras aplicaciones

Sector tecnico de la invencion

Esta invencion se engloba en el campo de la Qulmica, y concretamente en el campo de las tecnologlas biomedicas, y se refiere al revestimiento de microplacas con una pellcula sensible al oxlgeno, pudiendo estar precargada con una variedad de sustancias bioactivas simultaneamente, o mas concretamente, una pellcula biofuncional y bioactiva, de un material biocompatible, qulmicamente inerte y estable, la cual contiene sustancias capaces de responder a senales provenientes del medio flsico y/o fisiologico que la rodea, induciendo respuestas biologicas y flsicas, tal como serla la variacion en la concentracion de oxlgeno disuelta en dicho medio y de tal forma que no requiere la adicion de reactivos adicionales, complejas manipulaciones o largos period os de incubacion como los requeridos en otras tecnicas de preparation de este tipo de dispositivos, por lo que son de aplicacion, de forma sencilla, eficaz, reproducible y economica, para estudios de laboratorio in vitro y ex vivo, de la variacion de la concentracion de oxlgeno producida en los procesos biologicos, tanto en cineticas ultrarrapidas como rapidas o lentas.

Antecedentes de la invencion

En los procesos de respiration aerobica tanto de organulos subcelulares como de celulas vivas, tejidos y organismos completos, el oxlgeno actua como aceptor final de electrones, por lo que se consume continuamente y, consecuentemente, puede proporcionar information sobre su actividad, estado metabolico, viabilidad y/o respuesta fisiologica ante estlmulos como la action de un farmaco, el estres ambiental, toxicos o efectores. Por tanto, la medida de las variaciones en la concentracion del oxlgeno disuelto en un medio resulta de importancia capital en el seguimiento de multitud de procesos qulmicos y bioqulmicos.

Existen varios metodos para la medicion de oxlgeno disuelto; entre ellos podrlamos destacar metodos electroqulmicos, metodos polarograficos (Celda Clark) y metodos qulmicos (determination de oxlgeno por Winckler). Sin embargo, la mayorla de estos procedimientos tienen serios problemas para la medida del consumo de oxlgeno en procesos bioqulmicos, ya que, a la complejidad tecnica de muchos de ellos, se une su escasa o nula capacidad de miniaturization y de seguimiento continuo del proceso, sin mencionar la obligation, por parte del usuario, de realizar operaciones permanentes de mantenimiento (limpieza, calibration, cambio de membrana y electrolito, pulido del anodo, etc.).

Por ello, cada dla aumenta el interes en el uso de nuevos sensores opticos para la medida de la concentracion de oxlgeno, empleando sustancias que son capaces de absorber luz en la region visible y desactivarse por emision fluorescente (sondas moleculares fluorogenicas), a traves del conocido efecto del “quenching’ o atenuacion fluorescente provocada por el oxlgeno sobre una gran cantidad de sondas moleculares fluorogenicas (Mills, A.; Platinum Metals Rev., 1997,41, (3), 115-126; LingLing X. y col., Chinese Science Bulletin, 2007, 52 (2), 188-193). Por tanto, este tipo de compuestos son utiles para reconocer cuantitativamente la presencia de un determinado analito, mediante cambios en sus propiedades opticas.

La fluorescencia se limita a un numero relativamente pequeno de sistemas que incorporan caracterlsticas estructurales determinadas (grupos con capacidad coordinante

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de cationes, tales como los macrociclos de distintos tamanos conteniendo atom os dadores como nitrogeno, oxlgeno y azufre, en los que la intensidad de fluorescencia depende del numero de anillos y del grado de condensacion) y en entornos qulmicos capaces de soportar y favorecer el proceso. Segun diversos trabajos, parece demostrada la mejor sensibilidad para la deteccion de oxlgeno molecular de las sondas fluorescentes derivadas de metaloporfirinas de platino, las cuales absorben y emiten en el espectro visible (tlpicamente a 540 y 655 nanometros, respectivamente), con largos tiempos de estado excitado (>10 pseg) y, muchas de ellas, son accesibles comercialmente.

Resumiendo todo lo anterior, la tecnologla conocida consiste en el uso de una sonda molecular fluorogenica capaz de ser excitada con un foton hacia niveles altos (e inestables) de energla electronica y vibracional, de forma que la molecula tiende a retornar a su estado fundamental de energla, liberando el exceso energetico en forma de un foton. Sin embargo, durante el proceso, parte de la energla se disipa, por lo que el foton emitido por la sonda molecular fluorogenica es de menor energla, o lo que es lo mismo, de mayor longitud de onda que la absorbida inicialmente, segun la ley de Stokes. Ademas, la intensidad y longitud de onda de la luz emitida depende tanto de la estructura qulmica de la sonda molecular fluorogenica como del medio qulmico en el que se encuentra, pudiendo ser desactivada por un gran numero de factores, siempre teniendo en cuenta que los procesos de “quenching’ requieren contacto flsico entre sonda molecular fluorogenica y “quencher’ (< 2 A).

En consecuencia, no todas las sondas moleculares fluorogenicas conocidas son ideales para las aplicaciones pretendidas, ya que no permiten un contacto Intimo entre su centro de coordinacion y la molecula de oxlgeno que actua como “quencher’, lo que se creyo podrla resolverse mediante el uso de sondas moleculares fluorogenicas capaces de disolverse en el medio de cultivo en el que se desarrolla el experimento. Sin embargo, ante esta posibilidad algunos autores ya han puesto de relieve los riesgos de la presencia de algunos iones metalicos a la hora de afectar directamente a las celulas sujeto del ensayo, dada la conocida citotoxicidad de algunos de los cationes metalicos presentes en la estructura de los complejos que se usan habitualmente como sondas moleculares fluorogenicas (rutenio, paladio, platino, etc.); este aspecto es muy relevante para el empleo de dichas sondas en estudios de larga duracion, como son los estudios de linfoproliferacion y los de citotoxicidad, independientemente de la demostracion de su inocuidad a tiempos muy cortos (Papkovsky, D. B. y Fernandes, R., EP1601955B1). Ademas, diversas porfirinas se han usado para el tratamiento de tumores mediante la llamada terapia fotodinamica, que permite la destruccion selectiva de celulas tumorales con luz visible, combinando un fotosensibilizador (porfirina soluble en agua) y oxlgeno, mediante la generacion de especies de oxlgeno reactivas (ROS) (Ko Y.-J. y cols., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2007,17 2789-2794; Z Hu y cols., Biomedicine & Pharmacotherapy 2009, 63, 155-164). Del mismo modo, la hematoporfirina IX y sus derivados se han analizado frecuentemente como foto-insecticidas, es decir como moleculas fotoactivables para su uso como plaguicidas en el control de insectos (Pujol -Lereis, L.M. y cols., Revista QufmicaViva 2011, 10, 139-153), dada su capacidad, como consecuencia de la fotoactivacion, para producir intermedios de oxlgeno reactivos (ROI).

Consecuentemente, a la vista de la creciente bibliografla cientlfica sobre el tema en cuestion se deduce el extremado interes por el desarrollo de nuevos sensores qulmicamente inertes, como son los dispositivos miniaturizados de alto rendimiento basados en materiales polimericos con una estructura basada en silicio, obtenidos con tecnologla sol-gel (Young, S.K., Material Matters 2006, 1.3, 8), que usan metodos de deteccion no destructivos, sobre una minima cantidad de muestra, con medidas in situ y en tiempo real, usando una instrumentacion simple y asequible en cualquier laboratorio.

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El metodo conocido mas simple de fijacion de la sonda molecular fluorogenica a la matriz aprovecha el fenomeno de adsorcion (Wodnicka M. y cols., J Biomol Screen 2000, 5, 141), basado en la atraccion intermolecular mediante fuerzas ionicas, hidrofobicas o de Van der Waal, segun la naturaleza de las moleculas involucradas. Aunque es un metodo muy simple, carece de especificidad y es de esperar la perdida paulatina de la sonda molecular fluorogenica por desorcion, la cual influye en la sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de la medida (por la posible perdida de emision fluorescente) y en su fiabilidad (por la posible interaccion entre la sonda y el material biologico usado). Esto nos indica que no se conoce aun un metodo de fijacion permanente, economicamente rentable y sin residuos potencialmente toxicos, de la sonda fluorogenica a la matriz de silicio, lo que serla altamente recomendable para lograr sensores qulmicamente inertes, para la medida de variaciones en la concentracion de oxlgeno presente en los medios biologicos.

El metodo de fijacion mas seguro descrito hasta ahora consiste en la formacion previa de uno (o varios) enlaces fuertes, como son los enlaces covalentes, entre una sonda molecular fluorogenica, convenientemente sustituida y la matriz sillcea (Figueira, F. y cols., J. Porphyrins Phthalocyanines 2011; 15: 517-533). Como fruto de esta necesidad se pueden citar varios trabajos en los que se crea un enlace amida entre la tetracarboxifenilporfirina y la 3-aminopropil silica gel (Benedito, F.L. y cols., Applied Catalysis A: General 2003, 250, 1-11; Rahimi, R y cols,, ECSOC 14, 2010), la creacion de un enlace covalente entre tetracacarboxifenil- y tetrapropil- metaloporfirinas de platino y biomoleculas (Sagner, G. y cols., 1999, US006004530A), la formacion de un enlace amida entre diversas tetracacarboxifenil metaloporfirinas y un alcoxido funcionalizado (3- aminopropiltrietoxisilano) (Cohauila, M.I., Tesis Doctoral, 2011) y tetrasulfoftalocianinas (Coahuila M. I., J. Sol-Gel Science and Technology, 2006, 37, 117-120) que, posteriormente, se incluyen en la red de sllice.

Evidentemente, aunque con buenos resultados, desde un punto de vista qulmico y tecnico, los procedimientos anteriores presentan algunas dificultades, tales como el empleo de reactivos, subproductos y disolventes diflciles de retirar del medio de reaccion, el uso de derivados de silicio funcionalizados de alto precio, altas temperaturas de reaccion y disolventes que no resultan compatibles con los pollmeros con los que se fabrican las microplacas (poliestireno, policarbonato, polipropileno, polivinil-cloruro, politetrafluoretileno, polietileno, pollmeros de ciclo-olefina, etc.).

Una de las principales dificultades a las que se enfrenta el personal de laboratorio en el campo de los ensayos biologicos consiste en la creciente sofisticacion de las tecnicas experimentales y de screening llevadas a cabo en microplacas. Entre las posibles aplicaciones del empleo de las sondas moleculares fluorogenicas, para la medida de variaciones en la concentracion de oxlgeno, debidas al metabolismo celular, se puede citar, por ejemplo, la proliferacion de los linfocitos T (responsables de coordinar la
respuesta inmune celular y de facilitar la
cooperacion necesaria para desarrollar la produccion de
anticuerpos por los
linfocitos B y todas las formas de inmunidad mediada por celulas) es uno de los primeros eventos que tiene lugar en una respuesta inmune. La tecnica de linfo proliferacion permite evaluar dicha capacidad funcional y consiste en el cultivo de sangre periferica, con y sin estlmulo proliferativo. La proliferacion de las celulas se expresa como Indice de Estimulacion, o, lo que es lo mismo, el cociente entre los valores obtenidos en los cultivos estimulados y no estimulados. Por tanto, la tecnica de la linfoproliferacion o de transformacion linfoblastica permite detectar inmunodeficiencias de tipo celular, mediante la medicion del impacto inmunologico y, en consecuencia, la evaluacion del impacto inmunologico sobre el sistema inmune adaptativo o adquirido de los vertebrados. Dicho sistema inmune se puede ver influido por numerosas

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circunstancias como son: sustancias qulmicas, farmacos, aditivos de alimentos, caracterlsticas del medio ambiente, condiciones de manejo, seleccion y genetica, etc.

Es por ello que la investigacion dentro del campo de la inmunologla y en estudios de laboratorio de la estimulacion del crecimiento in vitro de linfocitos, tanto en primates como en otras especies animales (bovinos, equinos, porcinos, ovinos, etc.), nos da idea de la proporcion de linfocitos presentes en el individuo, la cual se asocia directamente con su capacidad de respuesta inmunologica. Segun el estado de la tecnica actual, para llevarlo a cabo, se necesitan 2 ml de sangre entera con heparina, conservada en la misma jeringa de extraccion. Debe asegurarse la rapida y correcta mezcla de la sangre con el anticoagulante mediante suaves inversiones de la jeringa, y se deben mantener condiciones de esterilidad en la extraccion y conservacion de la muestra, sin refrigerar, para mantener a temperatura ambiente.

Requiere ademas analizar lo antes posible la muestra despues de extralda y no mas alla de las 12 horas, teniendo en cuenta que, para la toma de dicha muestra, el sujeto debe estar en ayunas. El metodo actual, mas comunmente usado es aquel en el que los linfocitos sensibilizados se ponen en contacto frente al antlgeno, para que proliferen y se dividan, midiendo el grado de proliferacion con timidina tritiada (previamente anadida al medio de cultivo) unida a los nucleotidos que se van a usar para la slntesis de DNA. El protocolo estandar consistirla en:

- Aislamiento de linfocitos, a partir de sangre total, previa separacion en gradiente de Ficoll-isopaque.

- Lavado varias veces con medio de cultivo celular y ajuste de la concentracion a 5 millones de celulas/ml.

- Distribucion en placas de microtitulacion de 96 pocillos, a las que se le anade la disolucion del antlgeno problem a a la concentracion adecuada. A algunos pocillos no se les anade antlgeno y se usan como controles negativos.

- Incubacion durante 72 horas a 37°C y en atmosfera del 5% de CO2.

- Recoleccion de las celulas sobre filtros de fibra de vidrio y trasvase a viales, conteniendo un llquido de centelleo. Posteriormente se determina la radiacion beta emitida, la cual sera directamente proporcional al numero de celulas en mitosis.

- La tasa de proliferacion se establece por comparacion entre la radiactividad de los pocillos problema y los controles.

Consecuentemente, serla muy util una invencion tecnicamente factible que permitiese la aplicacion de un procedimiento alternativo para la investigacion in vitro, dentro del campo de la inmunologla y estudios bioqulmicos relacionados, que sea capaz de dar informacion no solo de punto final, como los actuales, sino de tiempo real y que ademas sea rapido, sencillo, eficaz, reproducible, economico, medible con aparatos estandar en cualquier laboratorio, dentro de unos llmites de deteccion y cuantificacion adecuados, sin residuos toxicos o peligrosos, y, consecuentemente, que supere todos los inconvenientes antes mencionados y evite las limitaciones tecnicas de las que adolecen los actuales metodos bioqulmicos (mantenimiento permanente de equipos costosos e instalaciones sofisticadas, que necesitan de personal autorizado y altamente preparado, aislamiento previo de celulas, a partir de sangre total, varios procesos intermedios de lavado entre las diferentes reacciones y tratamientos, posibilidad de contaminaciones residuales entre lavados, lentitud en la velocidad de procesado, uso de reactivos radiactivos caros, peligrosos y de diflcil destruccion, etc.). Ademas, en este campo serla de extremada utilidad tecnica un dispositivo capaz de medir la transformacion linfoblastica, inducida por

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mitogenos y/o por antlgenos especlficos, directamente en sangre completa sin necesidad del aislamiento previo de las celulas mononucleares de sangre periferica (PBMC), lo que resulta imposible con los actuales metodos colorimetricos.

Ademas de su mayor simplicidad de procesamiento y de evitar la perdida de poblaciones linfocitarias y de celulas no linfoides, debidas al gradiente de centrifugacion, el uso de sangre entera permitirla reproducir de modo ventajoso las condiciones que se dan in vivo (Shifrine M y cols., Am. J. Vet. Res., 1978, 39 (4), 687-690), pudiendose estudiar la potencial influencia sobre la proliferacion linfocitaria de otras celulas sangulneas presentes en la sangre, como los eritrocitos, a traves de mecanismos como la produccion de citoquinas que acelerarlan la proliferacion celular.

Es por ello que se puede afirmar que ninguno de los metodos actuales, manuales o automaticos, en tubos o microplacas, patentados o no, son capaces de dar respuesta al conjunto de problemas tecnicos que se han planteado mas arriba: mantenimiento costoso y permanente de equipos e instalaciones altamente sofisticadas, experimentos llevados a cabo exclusivamente por personal preparado especlficamente y oficialmente autorizado, necesidad de aislamiento previo de celulas (a partir de sangre completa), lentitud en la velocidad de procesado por la exigencia en los actuales protocolos de diversos procesos intermedios de lavados y adiciones de reactivos especlficos entre las diferentes etapas de test, el uso de un elevado numero de pipetas y accesorios, o sistemas robotizados, con el consiguiente gasto economico y de tiempo, perlodos muy largos de incubacion y medida (entre 5 y 7 dlas), obtencion exclusiva de informacion de punto final, sin datos intermedios de seguimiento de las distintas variables que intervienen en el proceso, alta probabilidad de contaminaciones residuales entre lavados, con el empleo de reactivos radiactivos caros, peligrosos y de diflcil destruccion, etc.

En vista de los problemas detectados en el campo tecnico y aqul comentados, la presente invencion ofrece un nuevo dispositivo de medicion de variaciones en la concentracion de oxlgeno disuelto de una muestra y de deteccion y seguimiento de los procesos biologicos que las producen, que es una microplaca con sensor optico de bajo coste para ensayos biologicos, constituida de modo que resuelva el problema expuesto y apropiada para todo tipo de estudios de quimiosensibilidad relacionados con la proliferacion celular de eucariotas (por ejemplo, el test de transformacion linfoblastica) y procariotas (por ejemplo, antibiogramas para la seleccion de antimicrobianos en estudios de susceptibilidad in vitro), la citotoxicidad y la cadena de respiracion mitocondrial, tanto en fracciones subcelulares, en celulas aisladas, en tejidos y en fluidos biologicos completos, preferentemente sangre y orina, mediante el uso de un lector de placas capaz de medir la fluorescencia o fluorescencia en tiempo resuelto, tanto en modo de lectura inferior como superior. El microsensor qulmico polimerico aquf descrito consta de una matriz en forma de xerogel dopada con una o varias sondas moleculares fluorogenicas (fluorescentes) portadoras de grupos con una reactividad adecuada a los fines que se buscan, de procedencia comercial o no, en una cantidad adecuada para que, por una parte, sean utiles en la medida de variaciones en la concentracion de oxlgeno disuelto, durante la deteccion y seguimiento de procesos biologicos y, por otra, de unirse de forma permanente a la matriz gracias a las caracterlsticas qulmicas especlficas que presentan las diversas fases del proceso de sol-gel con el que se prepara el xerogel, evitando posibles efectos indeseados, inherentes a la sonda libre. La presente invencion, en una de las realizaciones mas preferidas, puede incorporar una o varias sustancias bioactivas con distinta afinidad especlfica para establecer una interaccion fisico-qulmica con la superficie de la matriz solida, capaces de ser adsobidas en la superficie de dicha matriz y, por tanto, liberarse gradualmente al medio de reaccion en una cantidad efectiva para producir los efectos pretendidos.

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Definiciones

Salvo que el contexto indique claramente lo contrario, en la presente memoria, se usan los siguientes terminos, con los significados que se proporcionan a continuacion:

- El termino “adsorcion” se refiere a la acumulacion de sustancias sobre una superficie o interfase, por ejemplo gas-solido. La matriz sobre la que se produce dicha adsorcion se llama adsorbente mientras que el material que se acumula sobre la superficie se llama adsorbato.

- El termino "adecuado" se refiere a una sustancia, sustituyente, proceso o cantidad apropiados y compatibles con los compuestos, productos, composiciones y dispositivos utiles en el campo de aplicacion de la presente invencion, segun puede ser determinado por un experto en la materia usando unicamente metodos rutinarios de experimentacion, y sin necesidad de una destreza inventiva encubierta.

- El termino “afinidad” se refiere a la capacidad de un adsorbato para fijarse a la superficie de un adsorbente determinado y formar una union mediante interacciones ionicas, atraccion de van der Waals o enlaces de tipo qulmico, lo que determina la capacidad de retencion del adsorbato por el adsorbente.

- El termino “alcoxilo” se refiere a cualquier radical organico derivado de un alcohol por perdida del hidrogeno hidroxflico, de formula RO-, siendo R un grupo alquilo, tal como se define mas abajo.

- El termino "alquilo" se usa para referirse a radicales de cadenas hidrocarbonadas, lineales, ramificadas o clclicas, que tienen de 1 a 20 atomos de carbono y que se unen al resto de la molecula mediante un enlace sencillo, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n- butilo, terc-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos independientemente por 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de entre halogeno, hidroxilo, amino, aminoalquil C1-C6, nitro, ciano, isocianato, isotiocianato, alquilo C1-C20, perfluoroalquilo C1-C20, -O-perfluoroalquilo C1-C20, -S-perfluoroalquilo C1-C20, alcoxi C1-C6, -OCHF2, - C(O)CH3, -C(O)OAlquilo C1-C3, -C(O) NH2, -S(O)2CH3, cicloalquilo C3-C6, -CH2- cicloalquilo C3-C6, piridinilo, -CH2-piridinilo, tienilo, CH2-tienilo, furanilo, CH2-furanilo, oxazolilo, CH2-oxazolilo, fenilo, bencilo, fenoxi, en el que el grupo alquilo y los anillos de los grupos cicloalquilo, piridinilo, tienilo, furanilo, oxazolilo, fenilo, bencilo, fenetilo y fenoxi pueden estar opcionalmente sustituidos por 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de entre entre halogeno, hidroxilo, amino, aminoalquil Ci-C6, nitro, ciano, isocianato, isotiocianato, alquilo Ci-C6, cicloalquilo C3-C6, perfluoroalquilo Ci-C3, - O-perfluoroalquilo C-tC3, -S-perfluoroalquilo CtC3, alcoxi C-,C3, -OCHF2, -CN, -COOH, - CH2CO2H, -C(O)CH3, -C(O)Oalquilo, -C(O)NH2, -S(O)2CH3.

- El termino "alquenilo" se refiere a radicales de cadenas hidrocarbonadas que contienen uno o mas enlaces carbono-carbono dobles, por ejemplo, vinilo, 1-propenilo, alilo, isoprenilo, 2-butenilo, 1,3-butadienilo, etc. Los radicales alquenilos pueden estar opcionalmente sustituidos independientemente por 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de entre halogeno, hidroxilo, amino, aminoalquil CtC6, nitro, ciano, isocianato, isotiocianato, alquilo CrC20, perfluoroalquilo C-,-C20, -O-perfluoroalquilo CrC20, -S-perfluoroalquilo C1-C20, alcoxi C1-C6, -OCHF2, -C(O)CH3, -C(O)OAlquilo C1-C3, -C(O) NH2, -S(O)2CH3, cicloalquilo C3-C6, -CH2-cicloalquilo C3-C6, piridinilo, -CH2-piridinilo, tienilo, CH2-tienilo, furanilo, CH2-furanilo, oxazolilo, CH2-oxazolilo, fenilo, bencilo, fenoxi, en el que el grupo alquilo y los anillos de los grupos cicloalquilo, piridinilo, tienilo, furanilo, oxazolilo, fenilo, bencilo, fenetilo y fenoxi pueden estar opcionalmente sustituidos por 1 a 3 grupos seleccionados independientemente de entre entre halogeno, hidroxilo, amino,

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aminoalquil C1-C6, nitro, ciano, isocianato, isotiocianato, alquilo C1-C6, cicloalquilo C3-C6, perfluoroalquilo C1-C3, -O-perfluoroalquilo C1-C3, -S-perfluoroalquilo C1-C3, alcoxi C1C3, - OCHF2, -CN, -COOH, -CH2CO2H, -C(O)CH3, -C(O)Oalquilo, -C(O)NH2, -S(O)2CH3.

- El termino “analito” se refiere a una especie qulmica de naturaleza inorganica, organica o bioqufmica y que se determina en una muestra, mediante un conjunto de operaciones y tecnicas aplicadas al analisis de dicha muestra.

- El termino “antibiograma” se refiere a un metodo de estudio fenotfpico de sensibilidad a los antimicrobianos, que consiste en enfrentar un inoculo bacteriano estandarizado a una unica o a diferentes concentraciones de antibiotico, permitiendo clasificar a los microorganismos en varias categorlas cllnicas, como sensibles, intermedios o resistentes y permite determinar la concentracion minima inhibitoria (CMI) y la concentracion minima bactericida (CMB).

- Los terminos “antibiotico” y “antimicrobiano” se refieren a substancias de origen

biologico o sintetico y se pueden categorizar como bactericidas, si matan a las bacterias susceptibles, o bacteriostaticos, si solo inhiben reversiblemente el crecimiento de las bacterias. Entre ellos podemos seleccionar, a tltulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invencion, a los siguientes: fosfomicina, vancomicina, penicilina, ampicilina, amoxicilina, amoxicilina/acido clavulanico, ampicilina/sulbactam, ticarcilina, piperacilina, piperacilina/tazobactam, ceftolozana, tazobactam, avibactam, cefazolina, cefuroxima, cefoxitina, cefpodoxima, cefditoren, cefotetan, ceftazidima, ceftazidima/acido clavulanico, cefotaxima, cefotaxima/acido clavulanico, cefepima cefepima/acido clavulanico, ceftarolina fosamil, aztreonam, imipenem, meropenem, faropenem medoxomil, tebipenem pivoxil, ertapenem, nitrofurantolna, polimixina, estreptomicina, kanamicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, neomicina, acido nalidlxico, ciprofloxacino,

levofloxacino, nemonoxacino, moxfloxacino, ozenoxacino, finafloxacino, prulifloxacino, ulifloxacino, zabtoxacino, delafloxacino, quinupristina, dalfopristina, linopristina,

flopristina, pristinamicina, colistina, acido oxollnico, isoniazida, rifamicina, rifampicina, tetraciclina, minociclina, tigeciclina, amadaciclina, dalbavancina, teicoplanina,

daptomicina, pleuromutilina, acido pipemldico, cotrimoxazol, linezolid, radezolid, tedizolid, fosfomicina, mupirocina, cloranfenicol, acido fusldico, doxiciclina, lincomicina,

clindamicina, eritromicina, oleandomicina, espiromicina, josamicina, diritromicina, fluritromicina, claritromicina, midecamicina, telitromicina, azitromicina, cetromicina, oritavancina, moditromicina, solitromicina, trimetoprim, metotrexato, sulfacetamida, sulfisoxasol, sulfadiazina, sulfametoxasol, sulfamoxol, sulfadimetoxina, sulfametoxipiridazina, sulfametoxidiazina, ftalilsulfatiazol, succinilsulfatiazol, mafenida, sulfadoxina, sulfaguanidina, sulfacetamida y futuros miembros de cualquiera de estas familias.

- El termino “antifungico” se refiere a substancias de origen biologico o sintetico que actuan frente a hongos patogenos, entre las que podemos seleccionar, a tltulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invencion, a los siguientes: anfotericina B, nistatina, natamicina, griseofulvina, miconazol, ketoconazol, itraconazol, fluconazol, voriconazol, posaconazol, bifonazol, butoconazol, clotrimazol, econazol, fenticonazol, flutrimazol, omoconazol, sulconazol, tioconazol, terconazol, flucitosina, caspofungina, micafungina, anidulafungina, terbinafina, naftifina, ciclopirox, tolnaftato o futuros miembros de cualquiera de estas familias.

- El termino “antineoplasico” se refiere a substancias citostaticas y citotoxicas de origen biologico o sintetico que son sustancias que actuan sobre una o varias fases del ciclo celular o sobre los mecanismos de control de la proliferacion de las celulas tumorales de forma caracterlstica, inhibiendo su crecimiento celular, entre las que

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podemos seleccionar, a tltuio ilustrativo y sin que limite el alcance de la invencion, a los siguientes: ciclofosfamida, clorambucilo, ifosfamida, melfalan, trofosfamida, carmustina, estramustina, fotemustina, dacarbacina, temozolomida, bleomicina, mitomicina, doxorubicina, daunorubicina, 4-epirubicina, citarabina, gemcitabina, 5-fluorouracilo, fludarabina, pentostatina, metotrexato, cisplatino, carboplatino. oxaliplatino, topotecan, irinotecan, trastuzumab, rituximab, mitoxantrona, etoposido, teniposido, vinblastina, vincristina, vinorelbina, paclitaxel, docetaxel, tamoxifeno, ciproterona, flutamida, leuprolida o futuros miembros de cualquiera de estas familias.

- El termino “antlgeno” se refiere a substancias capaces de inducir una repuesta inmune especlfica que desencadenan eventos que se pueden manifestar como reacciones alergicas, inmunologicas y pirogenas.

- El termino “antiprotozoario” se refiere a substancias de origen biologico o sintetico que actuan frente a parasitos protozoarios, entre las que podemos seleccionar, a tltulo ilustrativo y sin que limite el alcance de la invencion, a los siguientes: metronidazol, tinidazol, ornidazol, secnidazol,
benzinidazol, nifurtimox, furoato de diloxanida, iodoquinol, sulfametoxazol, trimetoprim, paromomicina, dehidroemetina, pirimetamina, quinina, quinidina, etofamida, teclozan, clefamida, antimoniato de meglumina, estibogluconato sodico, isetionato de pentamidina, isetionato de propamidina, hexamidina, clorhexidina, suramina sodica, cloroquina, amodiaquina, mefloquina, artemisina, artemeter, artesunato, sulfadoxina, pirimetamina, lumefantrina, doxicilina, proguanil, polihexametilenbiguanida, furazolidona, albendazol, nimorazol, melarsoprol, salinomicina, lasalocida o futuros miembros de cualquiera de estas familias.

- El termino “arilo” se rfiere a un grupo fenilo, furilo, tienilo o piridilo, sustituido o no sustituido, o un sistema de anillo condensado de cualquiera de estos grupos, tal como naftilo.

- Los terminos sinonimos “atenuacion de la fluorescencia” o “quenching’ se refieren a un proceso capaz de disminuir la intensidad de fluorescencia de una determinada sonda molecular fluorogenica, sin cambiar el espectro de emision.

- El termino “calibracion” se refiere al conjunto de operaciones que determinan, bajo condiciones especlficas, la relacion entre los valores indicados por un instrumento o sistema de medicion y los valores conocidos correspondientes a un patron de referencia;

- El termino “cantidad efectiva” de un compuesto, producto o composicion se refiere a una cantidad suficiente del compuesto, producto o composicion para generar los resultados deseados, ya que, aunque la cantidad exacta requerida podrfa variar ligeramente de lote a lote, del modo en que sera administrada posteriormente, de los resultados especlficos buscados, etc., siempre puede ser determinada por un experto en la materia usando unicamente metodos rutinarios de experimentacion.

- El termino “coloide” se refiere a partlculas solidas con diametro de 1-100 nanometros donde la fuerza gravitacional es despreciable y la interaccion es dominada por fuerzas de corto rango, tales como, atraccion de van der Waals y carga superficial.

- El termino “concentracion minima inhibitoria” se refiere a la concentracion mas baja del antibiotico que da como resultado la inhibicion de crecimiento visible bajo condiciones estandar. y el termino “concentracion minima bactericida” se refiere a la concentracion mas baja del antibiotico que es capaz de matar el 99.9% del inoculo original en un periodo de tiempo determinado.

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- El termino “crosstalk’ se refiere a la interferencia entre pocillos, debida a una contaminacion cruzada lumlnica entre dichos pocillos durante los ensayos de fluorescencia.

- El termino “curva de calibracion” se refiere al conjunto de concentraciones que describen el rango en el cual se cuantifica el compuesto por analizar.

- El termino “especificidad” se refiere a la capacidad del metodo para identificar los pocillos donde no hay una variacion significativa del analito y se calcula como la proporcion de pocillos sin carga biologica que dan negativo en el test: Especificidad=Falsos Positivos/[Falsos Positivos+Verdaderos Negativos].

- El termino “estable” se refiere a que no
reacciona, no
modifica sus
caracterlsticas o no sufre cambios en su estructura, por la
accion de
agentes externos, bien ffsicos (temperatura, radiacion, etc.), bien
qulmicos (disolventes, acidos, etc.), o bien biologicos (fluldos, enzimas, etc.), manteniendo invariables o inalterables su posicion, distribucion, forma, composicion, estado o situacion, al menos, durante el tiempo requerido para llevar a cabo los estudios deseados.

- El termino “fiabilidad” se refiere a la probabilidad de que el dispositivo realice las funciones para las que ha sido disenado bajo unas especificaciones dadas y durante un perlodo de tiempo determinado.

- El termino “gel” se usa para referirse a una red rlgida interconectada con poros de dimensiones menores a un micrometro y con cadenas polim ericas las cuales tienen longitud mucho mayor que un micrometro. Un gel puede ser formado por el crecimiento de una red debido a un arreglo discreto de partlculas coloidales o por una red tridimensional interconectada por hidrolisis y policondensacion simultanea de un precursor organometalico.

- Los terminos sinonimos “inmunodepresion” y “trastorno por inmunodeficiencia” se refieren a la disminucion o ausencia de la respuesta inmunitaria de un organismo, al no producirse anticuerpos suficientes o por una disfuncion de cualquier parte del sistema inmunitario, tal como los linfocitos T o B y derivados de inmunodeficiencias hereditarias, adquiridas, inmunosenescencia, o como efecto secundario de algunos tratamientos.

- El termino “lector de placas” se refiere a cualquier aparato capaz de realizar los analisis pretendidos de muestras contenidas en “placas de microtitulacion”, tambien llamadas “placa de pocillos”, “placa microtituladora” o “microplaca”, desde 6 a 3456 pocillos, mediante la deteccion de senales producidas como consecuencia de eventos biologicos, ffsicos y qulmicos, bien pocillo a pocillo, bien de manera conjunta, tal como los lectores de fluorescencia basados en la deteccion de placas mediante un primer sistema optico capaz de iluminar la muestra con una longitud de onda especlfica y un segundo sistema encargado de recoger la luz emitida y separarla (constituidos basicamente por monocromadores, tubos fotomultiplicadores, filtros y un software analltico adecuado).

- El termino “liberation controlada” se refiere a un sistema de administration de sustancias bioactivas de una forma lenta y continua durante perlodos dilatados de tiempo, en el cual, la sustancia bioactiva se incorpora a un soporte que generalmente es un material polimerico o una combination de varios, de modo que la velocidad de liberacion de la sustancia bioactiva desde dicho sistema al medio que la rodea, viene determinada por las propiedades del propio pollmero y, en menor medida, depende de los factores ambientales, como pueden ser el pH, la temperatura, etc.

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- El termino “ilmite de cuantificacion” se refiere a la concentracion mas baja del compuesto que puede cuantificarse cumpliendo con la precision y exactitud establecidas en el metodo.

- El termino “limite de deteccion” se refiere a la minima concentracion de un compuesto en una muestra el cual puede ser detectado, pero no necesariamente cuantificado, bajo las condiciones de operacion establecidas.

- El termino “lixiviacion” se refiere al proceso en el cual se extrae uno o varios solutos de un solido, mediante la utilizacion de un disolvente llquido, cuando ambas fases entran en contacto Intimo, permitiendo que el soluto o los solutos puedan difundirse desde el solido a la fase llquida.

- El termino “matriz biologica” se refiere al conjunto del medio y muestra biologica, de origen procariota o eucariota (p. ej., bacterias, protozoos, plantas, insectos, aves, peces, reptiles, mamfferos, etc), en el cual se genera y/o se encuentra la sustancia de interes, para su estudio in vitro o ex vivo.

- El termino “matriz polimerica” se refiere a un material polimerico solido que contiene multiples unidades enlazadas qulmicamente y que estan unidas entre si para formar un solido, mediante un proceso de polimerizacion, de modo que moleculas pequenas se unen para crear otras moleculas y agregados mucho mayores, bien de naturaleza inorganica, con macromoleculas formadas a partir de enlaces covalentes, sin la intervencion de moleculas de hidrocarburos en su composicion, bien de naturaleza organica, formados a partir de hidrocarburos o sus derivados, o bien mixtos.

- El termino “medio biologico” se refiere a sistemas y mezclas, como pueden ser agua (incluyendo aguas potables, residuales, de torre de enfriamiento y de procesamiento), disoluciones salinas, medios de cultivo (entendido como una mezcla de componentes que puede incluir, aunque no esta limitado a, sales inorganicas, vitaminas, aminoacidos, carbohidratos y otros nutrientes disueltos en agua), fluldos biologicos y cualquier otro compatible con la vida de diversos agentes biologicos como son organismos superiores (animales y vegetales), microorganism os (virus, bacterias, levaduras, microalgas, etc.), celulas vegetales, celulas de animales, geneticamente modificados, o no, y partes derivadas de cualquiera de ellos.

- Los terminos “metaloftalocianina” y “metaloporfirina” se usan para referirse a dos grupos de compuestos que son sondas fluorogenicas, capaces de detectar un analito de forma selectiva, reversible y en tiempo real e informar de su reconocimiento mediante la emision de una senal optica, constituidas por un macrociclo central formado por un sistema cerrado de 16 atomos de carbono y nitrogeno, enlazados a traves de un ciclo o de una cadena hidrocarbonada mediante enlaces sencillos y dobles, formando un sistema resonante, capaz de albergar un atomo o ion metalico, elegido entre cobalto, cobre, hierro, magnesio, manganeso, zinc, antimonio, nlquel, vanadio, europio, terbio, gadolinio, samario y mas preferiblemente, paladio, platino y rutenio, que, generalmente, forma cuatro enlaces metal-nitrogeno, covalentes y covalentes coordinados. En el caso de la presente invencion, la metaloftalocianina y la metaloporfirina siempre portan de dos a cuatro grupos polares carboxilato, sulfonato, fosfato o fenol y que se hallan unidos a traves de un ciclo o de una cadena hidrocarbonada.

- Los terminos sinonimos “microplaca, placa de microtitulacion. placa de pocillos o placa microtituladora” se refiere a una placa de ensayo que presenta una pluralidad de pocillos en forma de receptaculos abiertos por su cara superior, fabricados de un material rlgido seleccionado entre vidrio, poliestireno, policarbonato, polipropileno, polivinil-cloruro, polietileno, politetrafluoretileno, pollmeros de ciclo-olefina, o similares, en colores

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adecuados a cada estudio (normalmente, transparente, blanco y negro) y con distinta geometrla (fondo en forma de C, F, U o V), capacidad del pocillo (desde 1 microlitro a 16 mililitros) y con un formato estandar de 6, 12, 24, 48, 96, 384,1536 y 3456 pocillos, en funcion del experimento a realizar con la placa, la cantidad de material biologico, los medios usados en el experimento (manuales, semiautomaticos o automaticos), etc.

- El termino “mitogeno” se refiere a substancias que estimulan la mitosis y la proliferacion celular y, de forma mas especlfica, la transform acion de los linfocitos en linfoblastos indiferenciados con capacidad para dividirse. Hay mitogenos inespeclficos, como el mitogeno de fitolaca (PWM), que es mitogeno tanto de linfocitos T como de B y mitogenos especlficos, de linfocitos T como la concanavalina A (conA) y la fitohemaglutinina (PHA) y otros de linfocitos B como el lipopolisacarido (LPS) de bacterias Gram negativas.

- El termino “muestra biologica" se refiere a cualquier muestra fisiologica o patologica obtenida de un sujeto biologico, incluidos llquidos, secreciones, etc. que forman parte o son producidos a partir de un organismo vivo: fluidos biologicos (incluyendo, pero no limitados a, suero, plasma, sangre, orina, saliva, sudor, leche, exudado vaginal, semen, jugos gastricos, llquido duodenal, llquido clstico, llquido ascltico, llquido intraocular, llquido pericardico, llquido sinovial, llquido amniotico, llquido cefalorraquldeo, llquido pleural, llquido peritoneal, exudados provenientes de lesiones, extractos de heces o estiercol, o alguno de sus componentes aislados), organos, tejidos, incluyendo muestras de tejido de biopsias o porciones en secciones de un organo o tejido, fracciones subcelulares, celulas aisladas, incluidas las de seres humanos y extractos de una muestra biologica, incluyendo, pero no limitados a antlgenos, anticuerpos, metabolitos, etc. aislados de un fluido biologico. La muestra puede, por tanto, comprender una muestra fleido, un fluido de una muestra, una muestra fluidizada o una preparacion a partir de una muestra que fesda. La muestra puede comprender asimismo organismos acuaticos completos, como algas (por ej. las del genero Tetraselmis), invertebrados (por ej. los del genero Artemia o los del genero
Caenorhabditis), o peces (por ej. los del genero Danio).

- Los terminos sinonimos “muestras control” y “controles” se refieren a las muestras de concentracion conocida que se cuantifican durante el analisis para corroborar la validez del metodo.

- El termino “oligomero” se refiere a especies moleculares constituidas por unidades repetitivas que tienen un tamano intermedio entre la unidad basica del monomero que las forma y un pollmero, es decir, contiene monomeros en un numero finito (denominado grado de oligomerizacion) y, por tanto, su masa molecular no ha logrado alcanzar un valor tan alto como para ser considerado un pollmero.

- El termino “one-pot” se refiere a una estrategia para incrementar la eficiencia de procesos qulmicos, tanto desde el punto de vista economico, como desde el tecnico, segun el cual dicho proceso se lleva a cabo en un unico reactor, mediante adiciones sucesivas de los reactivos, sin etapas intermedias de aislamiento, ni de purificacion.

- El termino “paciente” se refiere a cualquier ser vivo que padece o puede padecer una enfermedad, caracterizada por una alteracion perjudicial, real o potencial, de su estado de salud.

- El termino “porfirina” se usa para referirse a un macrociclo heteroclclico formado por cuatro subunidades de pirrol unidas por las caras opuestas (posicionD) mediante cuatro puentes metino (=CH-), pudiendo estar mono- o polisustituidas con diversos grupos funcionales (alquilo, alquenilo, carboxilato, sulfonato, fosfato, amino, etc.). A veces

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se usan, de modo intercambiable, los terminos porfin y porfina, con el mismo significado que el especificado anteriormente.

- El termino "protocolo” se refiere al documento que establece los objetivos, procedimientos y metodos que se utilizan para realizar un estudio y analizar los datos obtenidos.

- El termino "rango” se refiere al intervalo de validez del metodo analltico, definido por las concentraciones comprendidas entre los niveles superior e inferior del analito, en el cual se ha demostrado que el metodo es preciso, exacto y lineal.

- El termino "reproducibilidad” se refiere a la precision de un metodo analltico y expresa la variacion obtenida entre determinaciones independientes realizadas con el mismo sistema analltico de medida, pero en diferentes condiciones de analisis, tales como dlas, equipo, o analistas.

- El termino "sensibilidad” se refiere a la capacidad del metodo para identificar los pocillos donde hay una variacion significativa del analito, calculada como la proporcion de pocillos con carga biologica que dan positivo en el test: Sensibilidad=Verdaderos Positivos/[Verdaderos Positivos+Falsos Negativos].

- El termino "significativo” se refiere a una expresion estadlstica que depende del tamano de la muestra y nos indica la probabilidad de que una serie de resultados obtenidos se hayan debido al
azar.

- El termino "sol” se refiere a una suspension coloidal de partlculas dispersas en un llquido.

- El termino "sol-gel” se refiere a un proceso de slntesis y fabricacion, generalmente en disolucion y a una temperatura por debajo de los 100°C, de un material solido polimerico, preparado mediante la hidrolisis de monomeros de alcoxidos de metales o de metaloides, seleccionados dentro del grupo compuesto por silicio, aluminio, zirconio, titanio, estano, vanadio, hierro y cualquiera de sus combinaciones, que forman una red porosa con enlaces metal/metaloide y oxlgeno, a la que se pueden anadir otros derivados, como el polidimetilsiloxano hidroxi terminado (PDMS), que tambien contiene una cadena principal de atomos alternos de silicio y de oxlgeno, pero con radicales de naturaleza organica, con lo que se obtiene una matriz polimerica de naturaleza hlbrida (organica-inorganica); de esta forma, en ambos casos, cuando el llquido del poro es removido a presion y temperatura cercana a la ambiental, se produce una contraccion de la red y el producto resultante se denomina xerogel.

- Los terminos sinonimos "sonda molecular fluorogenica”, "sonda fluorogenica” y "sensor fluorogenico” se refieren a sistemas que contienen un centro de coordinacion unido a una unidad indicadora, que transforma la informacion qulmica en una senal medible y se caracterizan por su alta sensibilidad y por su elevada especificidad, al reconocer especlficamente al analito de interes mediante la seleccion adecuada de las longitudes de onda de excitacion y de emision.

- El termino "sustancia bioactiva" se refiere a un compuesto qulmico o biologico que puede ejercer "una interaccion con” o "producir efectos sobre” cualquier ser vivo (animal o vegetal) o alguna de sus partes, produciendo, generalmente, una mejora en su salud y bienestar, o reduciendo un riesgo de enfermedad por inhibicion del crecimiento y supervivencia de agentes biologicos patogenos, e incluye terminos como antibioticos, antifungicos, antiprotozoarios, antineoplasicos, mitogenos o antlgenos especlficos.

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- El termino "sustituido” se usa para referirse, generalmente, a un atomo de carbono o a un heteroatom o adecuado en el que un atomo de hidrogeno se reem plaza por otro atomo o un grupo qulmico tal como arilo, ciano, carboxilato, sulfonato, fosfato, amino, (C1-10)alquil, nitro, mercapto, (C1-10)alquiltio, halo, (C1-6)alquilamino, (C1- 6)dialquilamino, (C1-6)alcoxi, tri(C1-4)alcoxisilil, amino(C1-4)alquiltrialquiloxisilano, etc., y sus posibles combinaciones dentro de la molecula, que le confieren nuevas propiedades ffsico-qufmicas, las cuales mejoran las utilidades fundamentales y de novedad de los compuestos, productos o composiciones de la presente invencion.

- Los terminos sinonimos "tensioactivo no ionico” y "surfactante” se refieren a una serie de compuestos qulmicos con una estructura polar-no polar, pero con grupos no disociables, que son capaces de disminuir el valor de la tension superficial de una interfase, como son Triton X-100, Brij 30, Brij 35, Brij 56, Brij 58, Brij 700 y Tween 20.

- El termino "validacion” se refiere a la evidencia experimental documentada de que un metodo cumple con el proposito para el que fue disenado, por comparacion o no, con otros metodos establecidos y conocidos en el estado de la tecnica.

-El termino "xerogel” se refiere al material rlgido formado por una red tridimensional interconectada de un oxido inorganico, habitualmente conteniendo silicio y opcionalmente de un material hlbrido que puede ser sintetizado a traves de la formacion in situ de la matriz polimerica con especies organicas o inorganicas, consistente en poros submicrometricos y cadenas polimericas, que generalmente, usan como monomeros adecuados uno o varios alcoxidos, los cuales mezclados con agua y otros disolventes, son capaces de hidrolizarse para formar grupos intermedios silanol (Si—OH), que se condensan para producir enlaces siloxano (Si—O—Si). Tras un proceso de secado a presion atmosferica, se eliminan los disolventes y subproductos volatiles llquidos, lo que conduce a una contraccion del volumen final del material polimerico.

Descripcion general de la invencion

Es objeto de la presente invencion un dispositivo de detection (optica) de oxlgeno y m edition de sus variaciones de concentration en una muestra, siendo dicho dispositivo un microsensor qulmico polimerico (homopollmerico y/o copollmerico), de bajo coste, que comprende:

- un soporte que es una placa de ensayo, tambien denominada microplaca o placa microtituladora, que presenta una pluralidad de pocillos en forma de receptaculos abiertos por su cara superior y cuyo numero varla comunmente entre 6, 12, 24, 48, 96, 384,1536 o 3456 pocillos, y de geometrla y capacidad de pocillo variables; recubierto de

- una matriz polimerica inerte y estable que comprende un xerogel de estructura porosa, formado por pollmeros inorganicos constituidos por una cadena principal de atom os alternos de silicio y de oxlgeno, seleccionados entre una red tridimensional de sllice, desarrollada a partir de monomeros con grupos alcoxilo hidrolizables, y/o un polisiloxano, dicha matriz estando depositada en forma de pellcula homogenea sobre la pared interior de los pocillos del soporte, y siendo sensible al oxlgeno, segun se define en el apartado anterior, gracias a

- una o varias sondas fluorogenicas ancladas a la matriz, solubles en agua y seleccionadas entre derivados de metaloftalocianina y/o metaloporfirina.

Las placas de ensayo son tambien denominadas en el ambito de la presente invencion "placa de pocillos”, "placa microtituladora”, "placa de microtitulacion” o "microplaca”, refiriendose todos estos terminos a una placa que puede estar fabricada a partir de diversos materiales rlgidos, tlpicamente vidrio o plastico (poliestireno, policarbonato,

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polipropileno, polivinilcloruro, politetrafluoretileno, polietileno, polimeros de ciclo-olefina, o similares) y que presenta multiples pocillos, normalmente 6, 12, 24, 96, 384,1536 o incluso 3456, dispuestos en una matriz rectangular de formato 2:3, que se utilizan rutinariamente en el laboratorio para aplicaciones de investigacion, descubrimiento de farmacos, validacion de ensayos, controles de calidad y monitorizacion de diversos procesos biologicos, entre otras. En estas microplacas tienen lugar reacciones biologicas y qu(micas entre los agentes biologicos que se encuentran inmovilizados sobre el sustrato de la placa, o dispersos en el medio biologico, y los analitos producidos o consumidos en la matriz biologica que contiene dicha placa. Los pocillos pueden presentar distinta geometrla en su base, y estan dispuestos en un patron geometrico que simplifica la organizacion y realizacion de operaciones. Por ello, es importante destacar que el dispositivo objeto de la presente invencion puede presentar diversas formas, geometrlas, capacidades, materiales de fabricacion, espesores de la pellcula sensora depositada, etc., para poder adaptarse a las especificaciones tecnicas necesarias en cada estudio bioquimico, en el que sean usadas y para el que sean especlficamente disenadas.

Al seleccionar la microplaca, el experto debe adecuar por una parte los materiales de los que esta fabricada (poliestireno, policarbonato, polipropileno, polivinil-cloruro, polietileno, politetrafluoretileno, polimeros de ciclo-olefina, o similares y en colores adecuados a cada estudio transparente, blanco y, preferentemente, negro), por otra la geometrla y capacidad del pocillo (fondo en forma de C, F, U o V y capacidad desde 10 microlitos a 16 mililitros) y finalmente el formato idoneo, en funcion del experimento, cantidad de material biologico, medios manuales, semiautomaticos o automaticos, con 6, 12, 24, 48, 96, 384,1536 y 3456 pocillos todo ello sin necesidad de la adicion de reactivos suplementarios, complejas manipulaciones o largos perlodos de incubacion requeridos en otras metodologlas, lo que supone una clara ventaja tecnica frente a los actuales sistemas comercializados.

Por su parte, la sonda molecular fluorogenica, tambien conocida como “fluoroforo” o “generador de senal fluorescente” es el termino que denomina comunmente una molecula que, en base a sus propiedades fluorescentes, es capaz de convertir una determinada senal o estlmulo qulmico exterior, en otra senal o respuesta macroscopica especlfica medible y puede presentar estructuras qulmicas diversas, tales como productos naturales (triptofano), compuestos monoclclicos (piridoxal fosfato), biclcliclos (cloruro de dansilo), triclclicos (fluorescelna, rodamina B. BODIPY) y policlclicos (fenantrolinas, porfirinas y ftalocianinas). Algunas de estas sondas conocidas son solubles en agua, pero logicamente dicha solubilidad varla y depende en mayor o menor medida del grupo funcional, su numero y su distribucion en la periferia de la molecula.

Los (micro)sensores descritos en su forma esencial actuan como dispositivos miniaturizados de alto rendimiento basados en procesos de transduccion optica, para lo que se utilizan materiales polimericos en forma de xerogel para configurar la pellcula que recubre la placa de ensayo que contiene una cadena principal de atom os alternos de silicio y de oxigeno, pudiendo contener otros grupos organicos funcionales, que preferentemente es obtenido mediante tecnologia sol-gel, al cual se le anade un aditivo sensible al oxigeno como es la sonda molecular fluorogenica. De este modo, el conjunto matriz polimerica/aditivo sensible al oxigeno (sonda) es capaz de medir cineticas, ultrarrapidas, rapidas o lentas, de la concentracion de oxigeno presente en una matriz biologica, como puede ser agua, disoluciones salinas, medios de cultivo, suero, sangre, orina y otros definidos en el apartado anterior. La sonda fluorogenica permite medir variaciones en la concentracion del analito, al convertir una determinada senal o estimulo quimico exterior, mas concretamente la concentracion de oxigeno disuelto, en otra senal

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o respuesta macroscopica especlfica medible, mas concretamente una senal fluorescente.

La pellcula homogenea qulmicamente inerte y estable que recubre la placa es convenientemente una matriz polim erica de un material biocompatible, concretamente con una estructura basada en silicio, ya que las microestructuras de dicho material pueden ser facilmente desarrolladas utilizando diferentes tecnicas de fabricacion tal como se describen en la presente memoria. De esta forma, se produce una situacion ideal en cuanto a la fijacion de las sondas a la pellcula o matriz polimerica que recubre la placa: se forman enlaces fuertes entre la sonda y la matriz derivada de silicio. Asl, teniendo en cuenta que la sensibilidad del microsensor optico de oxlgeno depende de la capacidad para que el oxlgeno alcance a la molecula que actua como transductor, lo que viene determinado por la permeabilidad de la matriz encapsuladora hacia el oxlgeno, el dispositivo propuesto permite la difusion y contacto flsico adecuado para que se produzca el “quenching’ de la sonda.

La introduccion en la matriz polimerica de sondas moleculares fluorogenicas, portadoras de grupos polares mediante los cuales se anclan a los grupos funcionales existentes en el pollmero de la matriz, creados por hidrolisis de cada grupo alcoxilo (entendido como cualquier radical organ ico derivado de un alcohol por perdida del hidrogeno hidroxllico, segun se define en el apartado anterior) presente en los monomeros usados, mostraron una alta resistencia frente a los fenomenos de lixiviacion por el medio llquido sujeto a estudio, adecuada para evitar su disolucion en dicho medio y, por consiguiente, minimizar los posibles efectos nocivos de la sonda que se comentan en el apartado relativo al estado de la tecnica. De este modo, los enlaces fuertes que se forman entre los grupos polares de la sonda y los grupos funcionales de la matriz mantienen dicha sonda unida a la pellcula de tal forma que se reduce su citotoxicidad (ya que esta probado que estas sondas son citotoxicas cuando se adicionan sin anclaje, por ejemplo en disolucion al medio biologico dentro de una placa), y lo que no es menos importante: mantiene constante la concentracion de sonda fluorogenica en el tiempo. Esta inmovilizacion de las sondas de interes aqul descritas, que como se vera mas adelante se incrementa cuando la matriz polimerica se obtiene mediante un proceso sol-gel, no disminuyen su fluorescencia, lo que se explicarla postulando la posible reaccion de los grupos perifericos (Trytek M. y cols., Biomimetic Based Applications, 2011, Prof. Marko Cavrak (Ed.); Trytek M. y cols., J. Catalysis, 2012, 286, 193-205), como en el presente caso serlan los grupos polares presentes en la sonda, tal como los carboxilatos, con los restos silanol de la matriz, formando enlaces covalentes.

Los poros de la matriz polimerica depositada sobre la placa en forma de pellcula juegan un papel esencial en el proceso de medida e interaccion entre la sonda molecular fluorogenica y el medio en el que se producen los fenomenos biologicos sujetos del estudio (Garcla-Sanchez, M.A. y cols., J. Non-Crystalline Solids 2009, 355(2), 120-125) y por ende, resulta esencial el control de muchas de las variables que intervienen en la hidrolisis y la condensacion durante el proceso de sol-gel, para lograr un equilibrio adecuado entre la no lixiviacion de la sonda adsorbida en la matriz y su accesibilidad a los reactivos. La configuracion de la matriz polimerica permite las siguientes ventajas a) que el oxlgeno que contiene el disolvente o disolventes se difunda a traves de los poros, ya que estos son lo suficientemente amplios para permitir su paso, o el de la disolucion que lo contiene; b) retener la sonda por anclaje y evitar su liberacion al medio; c) que la pellcula formada sea homogenea a nivel macroscopico, estando ademas los poros interconectados entre si y con el exterior; y d) dejar salir los disolventes en la etapa de secado (y las sustancias bioactivas durante el ensayo cuando el microsensor las comprenda, como se vera mas adelante).

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Dichos sensores opticos de atenuacion de la fluorescencia muestran una serie de ventajas tecnicas sobre otros metodos conocidos de medida de la concentracion de oxlgeno disuelto, entre las que se pueden destacar aquellas que se refieren a la minima cantidad de trabajo de mantenimiento necesario y a la calidad de los valores medidos; en este sentido, hay que subrayar que la sensibilidad del efecto de la medicion (cambio de la duracion de la luminiscencia/cambio de la concentracion de oxlgeno) aumenta a medida que la concentracion de oxlgeno disminuye; de ahl que el principio de medicion ofrezca una resolucion sumamente buena incluso en el rango bajo de medida, con amplios llmites de deteccion y de cuantificacion.

Tambien es objeto de la presente invencion el procedimiento de fabricacion del microsensor aqul descrito que, aunque apoyado en las tecnicas genericas de sol-gel para la preparation de la pellcula o matriz polimerica que recubre la placa, incluye ciertas modificaciones esenciales que permiten conseguir mejoras tanto en las propiedades genericas (resistencia qulmica y mecanica, prevention de su degradation ambiental, tamano adecuado de poro, etc.) como en las propiedades especlficas para su uso como microsensores en este tipo de dispositivos (formation de enlaces fuertes con la sonda, capacidad de adsorcion y de liberation selectiva y controlada de las sustancias bioactivas anadidas, biocompatibilidad con las matrices biologicas sujetas a estudio, etc.), dicho proceso estando caracterizado por obtener una matriz polimerica de estructura porosa formada por cadenas de atomos alternos de silicio y de oxlgeno seleccionadas entre sllice y polisiloxanos a partir de un proceso sol-gel, que comprende las siguientes etapas:

(a) formar un sol precursor de compuestos de silicio seleccionados entre un polisiloxano y/o sllice, a partir de la mezcla de al menos un monomero consistente en al menos un alcoxido de silicio de formula

Si(OR)n(R’)4-n,

donde n varla entre 2 y 4; R es un alquilo, tal como se define en el apartado anterior, y cada R’ es seleccionado independientemente entre alquilo o alquenilo, tal como se definen en el apartado anterior, junto a una proportion comprendida entre 2 y 30 moles de agua por mol de alcoxido; dicha agua siendo usada como reactivo de hidrolisis, junto a un catalizador promotor de la reaction que es un acido organico, un acido inorganico o una base en una razon molar catalizador:alcoxido comprendida entre 0,000001:99,999999 y 0,0001:99,9999;

(b) adicionar al sol precursor resultante de la etapa (a) al menos un aditivo sensible al oxigeno que consiste en la sonda molecular fluorogenica antes descrita, en una razon molar sonda:alcoxido entre 0,00001:99,99999 y 0,001:99,999;

(c) depositar una pelicula del sol precursor obtenido en la etapa (b) sobre la superficie interior de los pocillos de la microplaca que hace de soporte de forma homogenea, en un volumen comprendido entre el 0,25% y el 25% del volumen total del pocillo a recubrir;

(d) gelificar el sol precursor resultante de la etapa (c) mediante policondensacion del alcoxido a una temperatura comprendida entre 15°C y 70°C durante un tiempo comprendido entre 1 y 72 horas, dando lugar a una matriz porosa de xerogel, la cual se somete a

(e) sineresis o envejecimiento para evaporar el medio de disolucion del sol precursor, mediante procesos conocidos en el estado de la tecnica como de curado y secado, durante un periodo de 2 a 5 dias.

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El termino “xerogel” se refiere al material rlgido formado por una red tridimensional interconectada formada por cadenas de atomos alternos de silicio y de oxlgeno, y, opcionalmente, de un material hlbrido que puede ser sintetizado a traves de la formacion in situ de la matriz polimerica con especies organicas o inorganicas, consistente en poros submicrometricos y cadenas polimericas, que generalmente, usan como monomeros adecuados uno o varios alcoxidos, los cuales mezclados con agua y otros disolventes, establecidos y conocidos en el estado de la tecnica, son capaces de hidrolizarse para formar grupos intermedios silanol (Si—OH), que se condensan para producir enlaces siloxano (Si—O—Si). Tras un proceso de secado a presion atmosferica, se eliminan los disolventes y subproductos volatiles llquidos, lo que conduce a una contraccion del volumen final del material polimerico, resultando una humedad tlpicamente de menos de un 1% en peso de la composicion total de pollmero y preferiblemente menos de un 0,1% en peso.

La tecnica de sol-gel se utiliza comunmente para la fabricacion de oxidos de metales y metaloides a partir de una suspension estable en un medio llquido (normalmente acuoso o hidroalcoholico), de partlculas solidas coloidales entre 2 y 200 nanometros, con unos 103-109 atomos por partlcula, la cual, a traves de una serie de reacciones qulmicas, actua como precursora de un gel tridimensional formado por interconexion de partlculas solidas en el medio llquido; dicho gel tiene la propiedad de crear una pellcula con la forma deseada al depositarse sobre la superficie a recubrir, formandose una red porosa de partlculas o pollmeros discretos, todo ello dependiendo de las condiciones de reaccion (pH, proporcion de agua, temperatura, etc.). Dicha red esta formada por micro-, meso- y macroporos, con tamanos que van desde los 17 hasta los 3000 angstroms. Por lo tanto, no solo es posible el alojamiento flsico de las metaloftalocianinas y metaloporfirinas empleadas como sondas moleculares fluorogenicas (incluso de sus agregados H y J), lo que favorece la interaccion entre el analito y la sonda, sino tambien su posible lixiviacion desde la matriz sillcea hacia la disolucion en la que se lleva a cabo el experimento.

El empleo de una estrategia de slntesis “one-pot’ se mostro aqul tecnica y economicamente mas factible que los demas procesos secuenciales ya conocidos de formacion de enlaces fuertes, como son los enlaces covalentes, haciendo uso de las propiedades que presentan algunas porfirinas sustituidas con grupos cargados en la periferia del anillo de porfirina, tales como acidos carboxllicos y sulfonicos, los cuales les otorgan, por una parte, una solubilidad en agua que permita obtener disoluciones acuosas con una concentration de, al menos, 10 micromolar (evitando el empleo de disolventes organicos como, el cloroformo o la N,N-dimetilformamida, incompatibles con la mayorla de plasticos) y, por otra, les confieren una reactividad y caracterlsticas electrostaticas capaces de anclarse de forma mas potente en la matriz porosa del xerogel, evitando de ese modo la desorcion de la sonda molecular fluorescente a lo largo del proceso biologico estudiado.

En definitiva, el proceso de fabricacion de dispositivos objeto de la presente invention se aprovecha de las propiedades de la sllice amorfa, la cual conjuga una excelente estabilidad qulmica con unas buenas propiedades mecanicas y de resistencia al desgaste, conjuntamente con una gran capacidad de adsorcion sobre su superficie porosa de numerosas moleculas, mediante atracciones electrostaticas, fuerzas de Van der Waals, enlaces de hidrogeno o enlaces covalentes con algunos de los grupos reactivos que presenta en su superficie, lo que la convierte en el material de election para el recubrimiento de diferentes tipos de componentes, tanto plasticos como metalicos.

Ademas, a diferencia de otras sustancias de naturaleza ceramica, en las que resulta muy diflcil su deposition utilizando procesos flsicos y sin emplear temperaturas que superen el

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punto de fusion de los sustratos a recubrir, se pueden usar procesos sol-gel que consisten en el uso de una via qmmica para la deposicion del recubrimiento de modo homogeneo y usando en todo momento temperaturas de procesado inferiores a los puntos de fusion de la mayoria de los plasticos de interes estructural y de las temperaturas de descomposicion de un gran numero de moleculas organicas. A ello, habria que unir la ventaja de los procesos sol-gel, para tener bajo control, en funcion de los materiales y condiciones del proceso de fabricacion, posibles modificaciones de las propiedades estructurales, texturales, electronicas y morfologicas en la microestructura de la capa depositada, modificando, en funcion de nuestras necesidades tecnicas, su inercia o su reactividad, su resistencia al choque termico o su capacidad para la retencion por adsorcion sobre su superficie de moleculas de interes, etc.

La presente invencion se dirige tambien a los multiples usos de los microsensores descritos, que ademas permiten la adicion de sustancias bioactivas tales como antibioticos, antifungicos, antiprotozoarios, antineoplasicos, mitogenos, antigenos espedficos, etc., ofreciendo multiples usos en aplicaciones opticas utiles en ensayos relacionados con la proliferacion celular de eucariotas (tal como el test de transformacion linfoblastica) y procariotas (tal como antibiogramas para la seleccion de antimicrobianos en estudios de susceptibilidad in vitro), en la citotoxicidad y senescencia celular y en procesos ligados a la cadena de respiracion mitocondrial. Los microsensores son aptos en general para aquellas operaciones del laboratorio bioqmmico que requieren el manejo de multiples muestras de pequeno volumen, por ejemplo, tecnicas inmunologicas o ensayos basados en celulas, como los mencionados aqu entre otras aplicaciones, y puede ademas contener y liberar de forma controlada sustancias bioactivas.

Breve descripcion de las Fiquras

Figura 1. Deteccion y medida en el tiempo del crecimiento de celulas E. coli en los pocillos del microsensor preparado segun el Ejemplo 1, con 0,002 ml/pocillo, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 5, con diferentes

diluciones: (sin celulas), _ (dilucion 1/1024), A (dilucion 1/254), ▼ (dilucion 1/64), ♦

(dilucion 1/16), • (dilucion 1/4), ■ (sin dilucion). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 2. Deteccion y medida en el tiempo del crecimiento de celulas E. coli en los pocillos del microsensor preparado segun el Ejemplo 1, con 0,005 ml/pocillo, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 6, con diferentes

diluciones: (sin celulas), _ (dilucion 1/1024), A (dilucion 1/254), ▼ (dilucion 1/64), ♦

(dilucion 1/16), • (dilucion 1/4), ■ (sin dilucion). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 3. Deteccion y medida en el tiempo del crecimiento de celulas E. coli en los pocillos del microsensor preparado segun el Ejemplo 1, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 7, con diferentes diluciones: • (sin celulas), ■ (dilucion 1/1024), _ (dilucion 1/254), _ (dilucion 1/64), _ (dilucion 1/16), • (dilucion 1/4), ■ (sin dilucion). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 4. Deteccion y medida en el tiempo del crecimiento de celulas E. coli en los pocillos del microsensor preparado segun el Ejemplo 2 con antibioticos como sustancias bioactivas, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 8: • (sin celulas), ■ (sin celulas+antibioticos), A (con celulas a dilucion 1/16), _ (con celulas adilucion 1/16+antibioticos). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

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Figura 5. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 9: (dilucion 1:4 con vehlculo), ■ (dilucion 1:4 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 6. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 10: (dilucion 1:5 con vehlculo), ■ (dilucion 1:5 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 7. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 11: (dilucion 1:8 con vehlculo), ■ (dilucion 1:8 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 8. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 12: (dilucion 1:10 con vehlculo), ■ (dilucion 1:10 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 9. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 13: (dilucion 1:20 con vehlculo), ■ (dilucion 1:20 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 10. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 14: (dilucion 1:30 con vehlculo), ■ (dilucion 1:30 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 11. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 15: (dilucion 1:40 con vehlculo), ■ (dilucion 1:40 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 12. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxigeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 16: (dilucion 1:50 con vehlculo), ■ (dilucion 1:50 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

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Figura 13. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 17: (dilucion 1:100 con vehlculo), ■ (dilucion 1:100 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 14. Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 18: (dilucion 1:200 con vehlculo), ■ (dilucion 1:200 con

vehlculo+fitohemaglutinina). La grafica muestra el valor medio de medida de cuatro pocillos de la misma placa.

Figura 15. Deteccion y medida en el tiempo de la citotoxicidad en una muestra in vitro de celulas hum anas THLE-2 extraldas de tejidos y depositadas en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 19. La grafica muestra el valor medio de medida y su desviacion tlpica de seis pocillos de la misma placa.

Figura 16: Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 20. La grafica muestra el valor medio de medida y su desviacion tlpica de cuatro pocillos de la misma placa, con vehlculo y con fitohemaglutinina (PHA), medidos con su tapa, sin adicion de aceite mineral.

Figura 17: Deteccion y medida en el tiempo de la linfoproliferacion en una muestra in vitro de sangre humana depositada en los pocillos del microsensor preparado segun la presente invencion, en funcion del consumo de oxlgeno medido, tal como se describe en el Ejemplo 20. La grafica muestra el valor medio de medida y su desviacion tlpica de cuatro pocillos de la misma placa, con vehlculo y con fitohemaglutinina (PHA), medidos con su tapa y con adicion de 0,1 ml de aceite mineral.

Descripcion detallada de la invencion

El dispositivo descrito anteriormente puede presentar diversas formas, geometrlas, capacidades, materiales de fabricacion, espesores de la pellcula sensora depositada, numero de capas de pellculas sensoras y reflectantes, etc., para poder adaptarse a las especificaciones tecnicas necesarias en cada estudio bioqulmico, en el que sean usadas y para el que puedan ser especlficamente disenadas.

Cada pocillo en el que se deposita la pellcula sensora (que es la matriz polimerica con las sondas fluorogenicas ancladas, tal como se describe mas arriba) esta constituido por un receptaculo cuyas paredes y fondo son aptos y adecuados para el experimento in vitro de laboratorio a realizar. Son especialmente y preferentemente adecuados los pocillos en los que las paredes son opacas, de color negro y el fondo es plano y transparente y dentro de estos, mas preferentemente, los denominados con forma de F, que son utiles para mediciones opticas precisas, tales como las determinaciones fluorimetricas y colorimetricas y para cultivos celulares. Otro objeto particular de la invencion lo constituye el uso de pocillos con fondo plano con la pellcula sensora depositada, que permiten que sobre los mismos puedan inmovilizarse o adherirse sustratos biologicos, permitiendo su uso en ensayos en los que se use material biologico anclado o adherido al fondo plano o base del pocillo, as! como para ensayos en los que el material biologico y/o los analitos se encuentran en disolucion y/o en suspension.

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Se debe observar que sin apartarse de la invencion, la placa sobre la que se deposita la pellcula de xerogel puede ser elegida entre materiales inorganicos que incluyen, sin limitarlos, vidrio y cuarzo, o entre materiales organicos tales como por ejemplo pollmeros que pueden incluir, pero no limitarse a, poliestireno, policarbonato, polipropileno, polivinilcloruro, politetrafluoretileno, polietileno, pollmeros de ciclo-olefina, o similares.

Aparte del silicio, la matriz polimerica puede incluir en su estructura otros atomos diferentes como son preferentemente metales o metaloides seleccionados del grupo compuesto por aluminio, zirconio, titanio, estano, vanadio, hierro y cualquiera de sus combinaciones. Normalmente, en estos casos el pollmero se forma a partir de alcoxidos de estos metales y/o metaloides, que se encuentran rodeados por varios ligandos reactivos que presentan una alta reactividad hacia el agua, seleccionados preferiblemente entre los alcoxidos metalicos, tales como los de aluminio y de titanio, y los alcoxidos no metalicos como son los alcoxisilanos, con grupos alcoxilo elegidos preferiblemente entre metoxi, etoxi, propoxi, butoxi u otros grupos alcoxilo de cadena larga, mas preferiblemente el tetrametoxisilano y el tetraetoxisilano.

Entre los polisiloxanos mas preferidos para formar parte de la estructura del pollmero de la matriz, se encuentra el polidimetilsiloxano hidroxi terminado de formula I

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que es un compuesto tambien formado por cadenas de atomos alternos de silicio y de oxlgeno pero con radicales de naturaleza organica, donde n describe el grado de oligomerizacion, el cual indica el numero de unidades de silicio por molecula de oligomero; de esta forma, se obtienen matrices inertes estables de un xerogel que es de naturaleza hlbrida (organica-inorganica) en cuanto a sus radicales.

En definitiva, existen tres tipos de matriz polimerica que puede contener el dispositivo sensor y que son de especial interes: una matriz polimerica totalmente inorganica (de silanos “puros” como precursores), con lo que se forma una pellcula de dioxido de silicio “puro” (es decir, es una pellcula de matriz polimerica cuya estructura esta compuesta 100% de sllice); una segunda matriz polimerica, de naturaleza hlbrida organica- inorganica, cuya estructura, del tipo de las conocidas como materiales hlbridos, contiene de forma combinada sllice y polisiloxanos, como es preferiblemente el polidimetilsiloxano hidroxi-terminado de formula I y que puede aparecer muy preferiblemente entre un 10% y un 99% del total de matriz. Y dado que es posible que el polisiloxano, como es el polidimetilsiloxano hidroxi-terminado de formula I aparezca hasta en un 100% del total del peso de la matriz polimerica, entonces esta matriz tambien puede ser de polisiloxano “pura”, es decir, una matriz porosa formado por cadenas de atomos alternos de silicio y de oxlgeno pero con radicales de naturaleza organica, con grupos organicos, tambien unidos a los atomos de metal o metaloide, preferiblemente a los atomos de silicio que componen dicha cadena de atomos alternos de silicio y de oxlgeno.

Por su parte, cuando la sonda molecular fluorogenica es una porfirina metalada, esta puede seleccionarse dentro del grupo compuesto por hematoporfirina, coproporfirina, uroporfirina, clorofilina, sulfonatoporfirinas y todos sus isomeros posicionales; hidroxifenil porfirinas y todos sus isomeros posicionales; carboxifenil porfirinas y todos sus isomeros

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posicionales; sulfonatofenil porfirinas y todos sus isomeros posicionales; y fosfatofenil porfirinas y todos sus isomeros posicionales; y cualquier combinacion de los mismas. Cuando dicha sonda es una metaloftalocianina, esta puede seleccionarse dentro del grupo compuesto porsulfonatoftalocianinas, carboxiftalocianinas y cualquier combinacion de las mismas. En el caso mas preferido, la sonda fluorogenica es al menos una metaloporfirina que comprende un ciclo nitrogenado central conteniendo un atomo o ion metalico elegido preferentemente del grupo que consiste en paladio, platino y rutenio, sustituido en su periferia con uno, dos, tres o cuatro grupos del tipo carboxilato. Mas preferentemente todavia, la sonda es la 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(ll). En el caso mas preferido de todos, la sonda 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(ll) esta presente en la matriz polimerica en una proporcion comprendida entre el 10% y el 100% en peso del total de la mezcla de metaloporfirinas y/o metaloftalocianinas presentes en el dispositivo; es decir, la sonda 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(ll) puede estar presente en al menos un 10% en peso del total de sonda presente, combinada con otras sondas, o puede llegar a ser la unica presente.

Adicionalmente, en un caso muy preferido los polimeros que constituyen la matriz o pelicula del microsensor pueden contener una o varias sustancias bioactivas adsorbidas sobre la superficie porosa del xerogel que, mediante un proceso de desorcion paulatina y lixiviacion, se va liberando lentamente desde el xerogel que lo contiene hacia la matriz biologica sujeto del estudio. Estas sustancias bioactivas pueden ser antibioticos, antifungicos, antiprotozoarios, antineoplasicos, mitogenos o antigenos especificos, etc., o cualquiera de sus combinaciones de modo que las placas o microplacas pueden ser apropiadas para todo tipo de estudios in vitro y ex-vivo de quimiosensibilidad relacionados con la proliferacion celular de eucariotas (por ejemplo, el test de transform acion linfoblastica) y procariotas (por ejemplo, antibiogram as para la seleccion de antimicrobianos en estudios de susceptibilidad in vitro), la citotoxicidad y la cadena de respiracion mitocondrial, tanto de punto final, como de tiempo real, mediante el uso de un lector de placas/microplacas capaz de medir la fluorescencia o fluorescencia en tiempo resuelto, tanto en modo de lectura inferior como superior, adecuando, por una parte la geometna y capacidad del pocillo y, por otra, el formato en 6, 12, 24, 48 6 96 pocillos (utiles para analisis estandar de inmunologia y cultivos celulares), o en formato de 384, 1536 y 3456 pocillos (necesarias para estudios miniaturizados de alta capacidad), todo ello sin necesidad de la adicion de reactivos suplementarios, complejas manipulaciones o largos periodos de incubacion requeridos en otras metodologias, lo que supone una clara ventaja tecnica frente a los actuales sistemas comercializados.

Dado que una sustancia bioactiva, como es un farmaco disuelto, embebido o adsorbido sobre los poros de un polimero solido, tiende a difundirse hacia su superficie, liberandose de forma continua en el medio liquido que lo rodea, el dispositivo propuesto presenta diversas ventajas desde el punto de vista de la biodisponibilidad (Saez, V., Hernaez E. y Sanz-Angulo, L.; Revista Iberoamericana de Polimeros, 2004, 5(1), 55-70), como serian: la proteccion de sustancias bioactivas susceptibles de degracion en disolucion, una mayor eficacia en el aprovechamiento de la sustancia bioactiva y, por tanto, con un coste inferior, lo que resulta importante cuando se trata de un agente activo de alto precio, etc. La cinetica de liberacion de la sustancia bioactiva viene determinada por sus propiedades fisicas, particularmente por su peso molecular y su coeficiente de reparto entre la matriz polimerica y el medio biologico acuoso contenido en el pocillo, junto a otras caracteristicas particulars como las propiedades fisicas de la matriz y su geometna y, en ultimo termino, por la cantidad de farmaco incorporado. La cantidad de sustancia bioactiva liberada y la velocidad de liberacion desde el film polimerico es proporcional a la raiz cuadrada del tiempo (Roseman, T. y Higuchi, W.I., J. Pharm. Sci.,1970, 59, 353) y su velocidad de difusion depende de diversos factores como son el area superficial y de la

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densidad de la membrana, asl como de la solubilidad y del coeficiente de difusion de la sustancia bioactiva, aunque, si hay suficiente farmaco para mantener una concentracion interna mayor que la del medio externo, la velocidad de difusion del farmaco a traves de la membrana se mantiene constante (Saez, V., Hernaez E. y Sanz-Angulo, L.; Revista Iberoamericana de Pollmeros, 2002, 3(3),1-20).

Sus aplicaciones y ventajas frente a los sensores actualmente conocidos en el estado de la tecnica para la monitorizacion de estudios metabolicos relacionados con la proliferacion y quimiosensibilidad celular de eucariotas y procariotas, con la citotoxicidad y senescencia celular y con la cadena de respiracion mitocondrial, se basan en la distinta afinidad por la matriz, entre la sonda molecular fluorescente (una metaloftalocianina y/o una metaloporfirina sustituida con al menos un grupo polar del tipo fenol, carboxilato, sulfonato y/o fosfato, incluyendo todos sus isomeros posicionales) y la sustancia bioactiva a utilizar en el ensayo (preferentemente antibioticos, antifungicos, antiprotozoarios, antineoplasicos, mitogenos, antlgenos especlficos y sus posibles combinaciones).

Preferentemente, la cantidad de sustancia bioactiva en el microsensor esta comprendida entre el 0,001% y el 50% en peso respecto del peso total de la pellcula depositada de xerogel.

En una realizacion particular de la invention, el dispositivo comprende en su composition al menos una segunda pellcula o matriz polimerica que contiene un material inerte adecuado para reflejar y dispersar la luz emitida por la sonda. Este material inerte es preferiblemente un oxido metalico como dioxido de estano, oxido de zinc, dioxido de titanio o sus mezclas, mas preferiblemente el dioxido de titanio, para aprovechar las propiedades que presentan estos oxidos para reflejar y dispersar (“scattering’) la luz. Esta segunda pellcula, colocada por debajo de la pellcula sensora (es decir, depositada en primer lugar directamente sobre la placa de ensayo, y antes que la primera matriz que es depositada en forma de capa posteriormente), actua como una capa reflectora de la luz emitida por la sonda, de modo que, cuando actua dicha pellcula que contiene el oxido metalico elegido se incrementa la intensidad de la luminiscencia emitida por la pellcula principal sensora (que contiene la sonda fluorogenica), al proceder a la lectura superior de la emision fluorescente. Del mismo modo, en los dispositivos de lectura inferior, cuando la capa inerte de oxido metalico se coloca por encima del xerogel sensor, se puede conseguir que la capa oxido metalico refleje la emision de energia radiante, impidiendo la perdida de luz, dando lugar a un aumento de la sensibilidad del dispositivo.

En cuanto al proceso sol-gel de preparation de los dispositivos objeto de patente, dicho proceso es bien conocido por cualquier experto en la materia, que puede llevarlo a cabo usando unicamente metodos rutinarios de experimentation, usando al menos un alcoxido de silicio en presencia de agua como reactivo de hidrolisis y catalizadores adecuados, preferiblemente acidos. La cantidad de agua puede variar desde 1 hasta 30 moles por mol de alcoxido, siendo preferiblemente entre 2 y 4 moles de agua por mol de alcoxido, y la cantidad de catalizador tipicamente anadido a la mezcla de reaction varia desde 1 a 0,0000001 moles por mol de alcoxido, preferiblemente entre 0,000001 y 0,0001 moles de catalizador por mol de alcoxido, todo ello a una temperatura tipicamente comprendida entre los 15°C hasta los 70°C, preferentemente entre 20°C y 40°C, durante un periodo de reaccion que puede variar entre 1 hora y 4 dias, hasta que la reaccion se completa. En una realizacion preferida, la mezcla de alcoxido y agua se realiza en un medio de disolucion seleccionado entre un alcohol, un hexano y un eter ciclico para llevar a cabo la reaccion en un medio homogeneo; mas preferentemente todavia se emplean entre 2 y 20 moles adicionales de este medio, como cosolvente. Durante la etapa a) de mezcla de los componentes se puede anadir opcionalmente un agente de secado y retardo, preferiblemente n-butanol en una razon molar de alcoxido/medio de disolucion

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(preferiblemente agua)/butanol de 1/1-30/>4. Tras haber incorporado las sondas fluorogenicas, en la etapa b), la suspension (sol) se distribuye mediante deposicion en los pocillos de la microplaca en cantidades que pueden variar en funcion del volumen del pocillo y de la pellcula sensora que se quiere depositar, preferiblemente volumenes de la disolucion precursora (sol) que van desde, el 0,25% y el 25% del volumen total del pocillo a recubrir (mas preferiblemente entre 0,5% y 20%) y, mas preferiblemente, desde 0,001 mililitro, hasta 0,020 mililitros en cada pocillo de las placas de 96 pocillos (y manteniendose esta proporcion en funcion del numero de pocillos que integran la placa), tras lo cual se produce una evolucion de la red solida y el secado del disolvente hidroalcoholico, junto con todos los volatiles producidos en el proceso, con una velocidad apropiada para conseguir un gel, en forma de solido o semisolido con una porosidad idonea que permita la posterior liberacion de la sustancia bioactiva a los fines para los que se prepara, preferiblemente entre 1 y 20 dfas y mas preferiblemente entre 3 y 7 dfas.

El proceso sol-gel se inicia con la mezcla de precursores, catalizadores y medios de reaccion, en disolucion y en sus primeras etapas forman dispersiones coloidales (sol) que posteriormente gelifican. Este proceso depende de la velocidad de formacion de los componentes actuando como precursores del gel y se basa en la hidrolisis de los alcoxidos anteriormente definidos que contiene el monomero precursor y la policondensacion de los productos de dicha hidrolisis.

La hidrolisis del alcoxido o de la mezcla de varios alcoxidos, usualmente se lleva a cabo en una disolucion de agua con un segundo cosolvente, lo que permite generar una estructura polimerica, mediante un mecanismo simple de hidrolisis-policondensacion, preferentemente en presencia de acidos, tanto inorganicos (que son mas preferidos, como acido clorhfdrico, acido nftrico, acido sulfurico, etc.) como organicos (acido acetico, acido propionico, acido maleico, acido cftrico acido oxalico, etc.) o bases, actuando estos como catalizadores de dicha reaccion, y que, a tltulo ilustrativo y nunca limitativo del alcance de la presente invencion, se esquematiza a continuacion:

Si(OR)4 + H2O ___________^ HO-Si(OR)3 + HOR

HO-Si(OR)3 + H2O _______^ (HO)2-Si(OR)2 + HOR

(HO)2-Si(OR)2 + H2O ______ (HO)3-Si-OR + HOR

(HO)3-Si-OR + H2O ______> Si(OH)4 + HOR

Si(OH)4 + Si(OH)4 ______________> (HO)3-Si-O-Si-(OH)3 + H2O

En el caso de llevar a cabo la hidrolisis de la mezcla de dos o mas alcoxidos, se puede formar un alcoxido doble antes de producirse la hidrolisis, lo que, generalmente, da lugar a un compuesto mas estable que los alcoxidos por separado y, por tanto, se deben observar tiempos de hidrolisis mas largos. Del mismo modo, uno o varios de los radicales alcoxilo (entendido como cualquier radical organico derivado de un alcohol por perdida del hidrogeno hidroxflico), representados en el esquema anterior como -OR, donde R es un grupo alquilo segun se definio anteriormente, pueden ser sustituidos por otro tipo de radical, preferentemente un alcoxilo sustituido ramificado o no, un arilo sustituido o no, un alquilo sustituido o no, o un alquenilo sustituido o no.

La reaccion de hidrolisis-condensacion entre los alcoxidos en la etapa a) de mezcla conduce a una disolucion homogenea, lo que conlleva, a escala molecular, a una distribucion homogenea de varias partlculas y por tanto una distribucion estequiometrica homogenea final.

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Consecuentemente, para la obtencion de un oxido policristalino es necesaria una polimerizacion lenta de una solucion de alcoxido con trazas de agua disuelta en un cosolvente, como es un alcohol, lo que supone una hidrolisis lenta, para que el gel se forme por una reaccion de dos etapas: una de hidrolisis y una posterior de policondensacion, aprovechando que en general los alcoxidos usados son muy sensibles a la humedad, por lo que la hidrolisis para la formacion del gel se puede llevar a cabo usando un cosolvente, que es seleccionado entre un alcohol (preferentemente metanol, etanol, propanol), un hexano (preferentemente ciclohexano) o un eter clclico que es preferentemente tetrahidrofurano o dioxano, en una proporcion que varla entre 1 y 20 moles de disolvente por mol de alcoxido, que se sumarlan a los moles de agua.

En cuanto a la etapa concreta de aplicacion de la disolucion sol-gel sobre la placa de ensayo de la etapa (c), puede elegirse a voluntad entre recubrimiento por centrifugacion ("spin-coating"), recubrimiento por inmersion (“dip coating’), o cualquier otro adecuado a las caracterlsticas de los materiales usados y mas preferiblemente por centrifugacion, a una velocidad de rotacion de entre 300 y 2000 rpm, durante un tiempo que puede variar desde 1 minuto a 1 hora, pudiendo usarse otras velocidades y tiempos de centrifugacion para controlar la calidad y el espesor de capa deseado.

Las condiciones del proceso de gelacion o gelificacion del sol previamente formado influyen en la estructura, en el volumen y el tamano de poro de gel, por lo que estas propiedades dependen de factores como la razon agua/alcoxido, pH, concentracion y naturaleza qulmica de los alcoxidos, siendo las condiciones generales mas adecuadas las que se han indicado en el apartado anterior y tal como se ilustran mas concretamente en los ejemplos, a tltulo ilustrativo y nunca limitativo del alcance de la invencion.

El proceso de formacion de geles y su deposicion sobre la microplaca descrito de forma esencial en el anterior apartado de la presente memoria conlleva as! las siguientes etapas:

a) Etapa de mezclado: consiste en la incorporacion de los monomeros elegidos, cuya mezcla dara lugar a la estructura de la matriz polimerica, formada por cadenas de atomos alternos de silicio y de oxlgeno, sobre la mezcla de disolventes en la que se llevaran a cabo todas las etapas posteriores y que contiene, al menos, agua, que actua como reactivo y como disolvente, junto a un catalizador, acido o basico, y mas preferentemente otros cosolventes, tal como se han definido mas arriba, creandose un medio de reaccion homogeneo.

En una realizacion particular, ademas de los alcoxidos de silicio hasta aqul comentados, de formula Si(OR)nR’4-n, donde n varla entre 2 y 4; R es un alquilo, tal como se define en los apartados anteriores, y cada R’ es seleccionado independientemente entre alquilo o alquenilo, tal como se definen en los apartados anteriores, se pueden anadir a la mezcla otros alcoxidos de metales y/o metaloides, que son alcoxidos de formula

M(OR)n

y cualquiera de sus mezclas binarias y ternarias con estequiometrla en una razon molar comprendida entre 0,1 y 0,9 de cada uno de los alcoxidos de la mezcla; donde M es seleccionado del grupo que consiste en aluminio, zirconio, titanio, estano, vanadio y hierro; (RO-) representa un grupo alcoxilo, entendido como cualquier radical organico derivado de un alcohol por perdida del hidrogeno hidroxllico, segun se define en los apartados anteriores, donde R es mas preferiblemente un grupo alquilo y mas preferentemente aun metilo, etilo, propilo, butilo u otros alquilos de cadena larga; y n varla entre 2 y 4. En los casos mas preferidos, estos alcoxidos de metales y/o metaloides

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son seleccionados del grupo que consiste en alcoxidos de aluminio, de titanio y de silicio, siendo estos alcoxilos mas preferiblemente tetrametoxisilano o tetraetoxisilano.

Preferentemente, los alcoxidos son seleccionados del grupo que consiste en: tetrametoxisilano, tetraetoxisilano, octiltrietoxisilano,
etiltrimetoxisilano,
hexiltrietoxisilano,
hexiltrimetoxisilano,
ciclohexiltrimetoxisilano, feniltrietoxisilano, feniltrimetoxisilano,
benziltrietoxisilano, dimetildimetoxisilano,
clorometiltrietoxisilano,
tetra(1,1,1,3,3,3-
hexafluoroisopropoxi)silano, polifluorooctiltrietoxisilano, tetra-n-propoxisilano, tetra-n- butoxisilano, tetrakis(2-metoxietoxi)silano, metiltrietoxisilano,
dodeciltrietoxisilano,
dodeciltrimetoxisilano,
hexadeciltrimetoxisilano,
octadeciltrietoxisilano,

octadeciltrimetoxisilano, metiltrimetoxisilano, (3-aminopropil)trietoxisilano, (3- aminopropil)trimetoxisilano, aliltrimetoxisilano, aliltrietoxisilano, trietoxivinilsilano,
[3-(2-
aminoetilamino)propll]trimetoxisilano, (3-chloropropil)trimetoxisilano,
(3-

bromopropil)trimetoxisilano,
3-cloropropildimetoximetilsilano,
3-cloropropyiltrietoxisilano,
2-cianoetiltrietoxisilano,
(3-mercaptopropil)trietoxisilano, (3-mercaptopropil)trimetoxisilano,
ciclohexil(dimetoxi)metilsilano,
dietoxidimetilsilano, dietoxidifenilsilano, dietoxi(3- glicidiloxipropil)metilsilano,
dietoximetilvi nilsilano,
dimetoximetilfenilsilano,
trimetoxi(2-
feniletil)silano, N-[3-(trimetoxisilil)propil]anilina, tetraetiltitanato, tetraisopropiltitanato y
tetrabutiltitanato y sus posibles mezclas binarias y ternarias, con estequiometrla variable, en una razon molar desde 0,1 a 0,9 de cada uno de sus componentes y mas preferiblemente mezclas binarias con estequiometrla 1:1, que pueden estar disueltos en el medio de disolucion que es agua y un segundo cosolvente, de naturaleza organ ica, preferentemente seleccionado dentro del grupo compuesto por metanol, etanol, propanol, ciclohexano, tetrahidrofurano, dioxano o sus mezclas, para formar las disoluciones coloidales o soles precursores.

Los monomeros anteriores utiles en la presente invencion tienen uno o mas grupos alcoxilo de formula -OR, pudiendo sustituirse alguno de sus atomos de hidrogeno por otro tipo de radical, tal como se define en los apartados anteriores, preferiblemente cuando no esta sustituido el grupo -OR representa metoxilo y etoxilo. Se prefiere que los monomeros tengan dos o mas grupos alcoxilo, con el fin de proporcionar una reticulacion adecuada al xerogel resultante, aumentando de manera eficaz el control de la liberacion de las sustancias bioactivas usadas en la presente invencion; ademas las mezclas de monomeros de alcoxidos que contienen diferentes numeros de grupos alcoxilo son de utilidad en la presente invencion, ya que, de este modo, se pueden obtener tasas variables de liberacion de las sustancias bioactivas.

En un caso particular, el 100% de alcoxidos que se anaden a la mezcla de obtencion del pollmero son alcoxidos de formula Si(OR)n(R’)4-n, de tal forma que son todos precursores de pollmeros inorganicos constituidos por una cadena principal de atomos alternos de silicio y de oxlgeno, dando lugar a una red tridimensional de atomos alternos de silicio y de oxlgeno. En otro caso particular, como se ha explicado al definir la estructura y composicion del dispositivo, los polisiloxanos se anaden a la mezcla en una cantidad del 100% de la mezcla, preferiblemente el polidimetilsiloxano hidroxi terminado. Entre un caso particular y otro, se da aquel en el que la cadena de atomos alternos de silicio y de oxlgeno se obtiene por la mezcla de alcoxidos y de agregados de los segmentos de polisiloxanos, en una proporcion comprendida entre el 10% y el 99% de polisiloxanos, preferiblemente del polidimetilsiloxano hidroxi terminado de formula I, respecto al peso total de la pellcula de matriz polim erica depositada. La combinacion hlbrida mejora las propiedades flsicas, reologicas o de biocompatibilidad de los recubrimientos obtenidos. Un proceso mas preferente todavla de fabricacion del dispositivo en cuestion lo constituye aquel en el que en la etapa a) se anade a la disolucion como precursor un polisixolano que consiste en polidimetilsiloxano hidroxi terminado, en cuyo caso se anade adicionalmente al menos un tensioactivo no ionico,

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segun se definio anteriormente. Este proceso, y el dispositivo obtenido a partir de el, resulta de gran importancia y supone una ventaja en el campo de aplicacion del dispositivo, gracias a que se favorece la adherencia de la muestra biologica en estudio a la superficie del pocillo recubierta por la matriz polimerica, concretamente en el caso de medios formados por celulas, siendo esta cualidad del dispositivo muy ventajosa en estudios con celulas adherentes, que son adecuados para la mayorla de los tipos de celulas, incluyendo los cultivos primarios.

b) adicionar al sol precursor resultante de la etapa (a) al menos un aditivo sensible al oxlgeno que consiste en la sonda molecular fluorogenica antes descrita, en una razon molar sonda:alcoxido entre 0,00001:99,99999 y 0,001:99,999.

c) Etapa de distribucion mediante deposicion: consiste en la distribucion de allcuotas del sol obtenido en las etapa anterior en un molde adecuado, que es la placa de ensayo, aprovechando su textura llquida de baja viscosidad, una vez mezclado en la etapa (b) con la sonda fluorogenica elegida (y las sustancias bioactivas opcionales, en el caso mas preferido), en un volumen comprendido entre el 0,25% y el 25% del volumen total del pocillo a recubrir, solidificando el gel a partir de la disolucion coloidal (sol), resultante de las etapas a) y b). El molde en el que se deposita el sol es el fondo de cada uno de los pocillos de la microplaca elegida en funcion del ensayo al que se vaya a someter, permitiendo que, una vez seco, se adapte perfectamente a la forma del pocillo que lo contiene. El metodo de aplicacion de la disolucion puede elegirse a voluntad, entre recubrimiento por inmersion, por impresion a chorro o por centrifugacion a una velocidad de rotacion de entre 300 y 2000 rpm durante de 1 a 3 minutos, pudiendo usarse otras velocidades y tiempos de recubrimiento por centrifugacion para controlar la calidad y el espesor de capa deseado.

d) Etapa de gelificacion o de gelacion: consiste en la produccion de partlculas coloidales que se unen entre si para formar una estructura tridimensional, a medida que se va produciendo la policondensacion del alcoxido de silicio y/o los segmentos del polisixolano, preferiblemente del polidimetilsiloxano hidroxi terminado. En este proceso, el catalizador, incluyendo acidos tanto inorganicos (acido clorhfdico, acido nftrico, acido sulfurico, etc.) como organicos (acido acetico, acido propionico, acido maleico, acido cftrico acido oxalico, etc.) o bases juega un papel de extrema importancia, por su influencia directa en la velocidad de policondensacion y, por tanto, del tamano de la partlcula y del numero de enlaces.

e) Etapa de sineresis o envejecimiento: engloba el tiempo de evolucion de la red solida, aun inmersa en el disolvente, usado tanto para la solubilizacion de los alcoxidos, como de los aditivos utiles en la presente invencion (sonda fluorogenica, sustancias bioactivas o precursores organicos, en el caso de obtencion de geles hlbridos organicos- inorganicos), durante el cual, por un lado, prosigue la polimerizacion de los grupos hidroxilo libres, por lo que aumenta la conectividad de la red y, por otro, se observa una reduccion irreversible del volumen del gel (sineresis), debido a la expulsion progresiva del llquido almacenado en los poros. Finalmente, a nivel macroscopico, se observa un fortalecimiento del gel y un secado progresivo. En esta etapa existe un riesgo no menor de fractura del gel, debido a las tensiones provocadas por las fuerzas capilares asociadas a las interfaces llquido-vapor. Por ello, hay que llevar a cabo muy lentamente la evaporacion del disolvente, conjugando los buenos resultados obtenidos mediante esta practica, con los inconvenientes tecnicos que plantean los tiempos de secado excesivamente largos (desde semanas a meses, para formar un xerogel monolltico seco). Por ello, en el ambito de la presente invencion, se propone opcionalmente el uso de al menos un aditivo qulmico que modifica la tension superficial del disolvente englobado en los poros, permitiendo su mas rapida evaporacion; puede ser tanto acido, como el acido

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oxalico, o basico, como la formamida, que favorece la nucleacion y crecimiento de agregados, incrementando la microdureza del gel humedo y el correspondiente tamano de poro del gel seco, mientras que ayuda a mantener una distribucion homogenea de tamano de poro. Finalmente durante esta etapa se produce una estabilizacion que consiste en la reduccion de la concentracion de grupos silanol (-SiOH) en la superficie del xerogel mediante la formacion de enlaces fuertes con otros silanoles o grupos reactivos presentes en el medio, tales como los fenoles, acidos carboxilicos, sulfonicos y/o fosfonicos presentes en la estructura de ftalocianina y de porfirina anadida previamente.

En una realizacion preferida, el metodo comprende la deposicion de una segunda pellcula o matriz polimerica como la descrita al definir las realizaciones detalladas del microsensor. Preferentemente, esta segunda capa se deposita sobre la superficie interior de los pocillos que conforman la placa de ensayo que sirve de soporte, antes de depositar la primera capa de matriz polimerica en la etapa (c). Esta segunda pellcula, de composicion descrita anteriormente, se puede depositar bien por adicion del oxido metalico a la mezcla de alcoxidos, durante el proceso de sol-gel de la etapa (a), por formacion de un xerogel hibrido o mixto, preferiblemente a partir de alcoxidos de silicio, como el tetraetoxisilano y de titanio, como el tetrabutiltitanato o por dispersion del oxido metalico en una silicona, preferentemente de procedencia comercial tal como Loctite® 5091™ Nuva-Sil®.

Independientemente del numero de pellculas polimericas que se depositan en la microplaca en cuestion, una realizacion preferente y particular del metodo de fabricacion comprende adicionar, preferiblemente en la etapa (b), una o varias sustancias bioactivas tales como antibioticos, antifungicos, antiprotozoarios, antineoplasicos, mitogenos o antigenos especificos, etc., o en una combinacion de las mismas en la misma etapa b) en la que se adicionan las sondas fluorogenicas al sol precursor que va a formar la matriz polimerica. En el caso de usar una combinacion adecuada de mas de una sustancia bioactiva, dichas sustancias se mezclan en cualquier proporcion, como es en una razon en peso entre ambas que puede variar entre 0,1:99,9 a 99,9:0,1, de modo que las placas sensoras resultantes son apropiadas directamente para todo tipo de estudios de quimiosensibilidad relacionados con la proliferacion celular de eucariotas (por ejemplo, el test de transform acion linfoblastica) y procariotas (por ejemplo, antibiogramas para la seleccion de antimicrobianos en estudios de susceptibilidad in vitro), la citotoxicidad y la cadena de respiracion mitocondrial, mediante el uso de un lector de placas capaz de medir la fluorescencia o fluorescencia en tiempo resuelto, tanto en modo de lectura inferior como superior, todo ello sin necesidad de la adicion de reactivos suplementarios, complejas manipulaciones o largos perlodos de incubacion requeridos en otras metodologlas, lo que supone una clara ventaja tecnica frente a los actuales sistemas comercializados.

La cantidad de sustancia bioactiva util en la presente invencion se situa entre el 0,001% y el 50% en peso, basados en el peso total de la pellcula polimerica depositada sobre el pocillo, preferiblemente una cantidad de sustancia bioactiva entre el 0,01 y el 30% en peso.

Otro objeto particular de la invencion lo constituye el uso del dispositivo objeto de interes para la medida in vitro directa de cineticas, ultrarrapidas, rapidas o lentas, de la concentracion de oxigeno presente en cualquier medio biologico, tal como se define en apartados anteriores y de modo preferido en fluidos biologicos, incluyendo, pero no limitados a: suero, plasma, sangre, orina, saliva, sudor, leche, exudado vaginal, semen, liquido pericardico, liquido sinovial, liquido amniotico, liquido cefalorraquideo, liquido pleural y liquido peritoneal, preferiblemente orina y sangre, completas o, mas preferiblemente diluidas con agua, suero fisiologico, suero de ternera, suero bovino fetal,

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suero de caballo, suero humano, solucion salina equilibrada de Hank, RPMI 1640, medio basal de Eagle (BME), medio minimo esencial de Eagle (MEM), medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM), modificacion de Iscove del medio DMEM (IMDM), McCoy 5A, medio L-15 de Leibovitz, medio F-10 de Ham, medio F-12 de Ham, medio 199 y cualquiera de sus variantes, conocidas en el estado de la tecnica.

De forma particular y preferida, el uso en laboratorio del dispositivo resultante, tal como se recoge en la presente memoria de invencion, se dirige a la investigacion, deteccion y monitorizacion in vitro y ex vivo en ensayos con enzimas y sistemas enzimaticos dependientes de oxigeno; o cultivos de celulas adherentes o cultivos celulares en suspension de organulos celulares y de tejidos de animales, modificados geneticamente o no, o de organismos eucariotas formados por una sola celula, o por una colonia de celulas iguales entre si, sin diferenciacion de tejidos y que viven en medios acuosos o en Kquidos internos de organismos superiores, como los protozoos, que incluyen, pero no se limitan a los generos Giardia, Enteromonas, Nosema, Naegleria, Trichomonas, Trypanosoma, Leishmania, Toxoplasma, Sarcocystis, Plasmodium, Balantidium,

Acanthamoeba, Entamoeba, u otros generos de los mismos ordenes, y organismos acuaticos completos, como algas (por ej. las del genero Tetraselmis), invertebrados (por ej. los del genero Artemia o los del genero
Caenorhabditis), o peces (por ej. los del genero Danio). El uso del microsensor en investigacion incluye, pero no se circunscribe exclusivamente a campos de investigacion in vitro y ex vivo en estimulacion de la transformacion linfoblastica con mitogenos inespecficos; la respuesta inmune celular provocada, por tratamientos inmunologicos, farmacologicos, quirurgicos, nutricionales, hormonales, ambientales, etc., incluyendo la respuesta inmune celular a vacunas o inmunogenos, con o sin adyuvantes, en desarrollo o ya existentes en el mercado; el perfil inmunologico y el estado del sistema inmune del sujeto para el control de rutina de grupos de riesgo; la sospecha de enfermedades inmunomediadas, incluyendo la inmunosenescencia; las inmunodeficiencias que pueden sospecharse frente a cuadros infecciosos recurrentes o refractarios al tratamiento, incluyendo, pero no limitadas a enfermedades infecciosas, como las que presentan formas latentes con alto riesgo de progresar hacia la enfermedad; el deficit de la capacidad inmunologica en estados patologicos autoinmunes, como la mielopatia degenerativa, o geneticos, como la agammaglobulinemia; las consecuencias de terapias inmunosupresoras o terapia de realce inmunitaria, de reacciones de hipersensibilidad celular reaccionando contra los alergenos del medio ambiente o antigenos; la respuesta a mitogenos, incluyendo los desordenes que muestran una respuesta blastogenica variable hacia los mitogenos selectivos de celulas B; la candidiasis mucocutaneas y otras infecciones fungicas cronicas; la blastogenesis inducida por berilio, la deteccion de la exposicion previa a diversos agentes patogenos, por ejemplo malaria, hepatitis u otras infecciones incluyendo Mycoplasma pneumoniae,
Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis
o
Mycobacterium africanum; enfermedades periodontales y ciertas infecciones virales, por ejemplo dengue o enfermedades linfoproliferativas asociadas al virus de Epstein-Barr; la deteccion de exposicion previa al antigeno correspondiente en individuos sin respuesta a anticuerpos; la presencia de antigenos responsables de alergias que tambien estimulan in vitro reacciones especficas linfoproliferativas (reacciones alergicas inmediatas, reacciones por contacto y la hipersensibilidad por drogas); los estados alergicos; las reacciones inmunologicas hacia agentes patogenos, alergenos y autoantigenos; las condiciones autoinmunes en las que los antigenos estimulan espedficamente la transformacion linfoblastica solo en pacientes que padecen dicho estado; los estados de inmunodeficiencia genetica y adquirida, con una funcion linfocitaria deprimida (aun en ausencia de linfocitopenia); los efectos terapeuticos, incluyendo, pero no limitados, a los resultantes de terapias antibioticas, antiprotozoarias, antifungicas, antineoplasicas, inmunoestimulantes o inmunosupresoras, asi como los metodos para optimizar farmacos,

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para identificar dosis eficaces de la quimioterapia y metodos de caracterizacion fenotlpica; el seguimiento del grado de deterioro/mejorla de la reactividad linfocitaria en pacientes con cancer; el comportamiento celular en desordenes mitocondriales; el seguimiento del grado de deterioro y/o mejorla de la reactividad linfocitaria en pacientes con cancer; el comportamiento celular en desordenes mitocondriales; el estudio in vitro de reacciones enzimaticas de consumo o produccion de oxlgeno y de modelos de enfermedades asociadas al estres oxidativo; el vinculo funcional entre desordenes neurologicos (Alzheimer, esquizofrenia, autismo, ELA, etc.) y los mecanismos de regulacion bioenergetica de celulas perifericas; las complicaciones diabeticas e inflamacion; las tecnicas de manipulacion para la terapia celular reproductiva, regenerativa y terapeutica; el efecto de formulaciones conteniendo nanopartlculas y otros sistemas teranosticos sobre la funcion inmunologica basica de linfocitos animales y otras aplicaciones para la investigacion en la industria alimentaria, lactea y de microalgas, o usos in vitro y ex vivo en el campo toxicologico, diagnostico, pronostico y terapeutico de cualquiera de las aplicaciones mencionadas, teniendo en cuenta que aunque, por si mismo, el microsensor de la presente invencion no genera los resultados de un metodo de diagnostico in vitro, para la deteccion de enfermedades, condiciones o infecciones, puede ser util como un componente clave de un sistema para el diagnostico, al usarse en combinacion con otros procedimientos, que validen el dispositivo y determ inen su idoneidad, optimizacion y estandarizacion, con otros materiales y con otros sistemas que pueden ser disenados por un experto en la materia.

Debe tenerse en cuenta que la presente memoria, al contemplar estos usos del dispositivo, y que se realizan siempre in vitro y/o ex vivo, cubre asimismo los correspondientes metodos para llevar a cabo las tareas comentadas anteriormente (monitorizacion de la transformacion linfoblastica in vitro con mitogenos inespeclficos, de la posible optimizacion de sustancias con potencial terapeutico y la identificacion de dosis eficaces de la quimioterapia y metodos de caracterizacion fenotlpica, etc.) utilizando el dispositivo aqul descrito, mediante sistemas miniaturizados tipo microplaca, que pueden tener formatos de 6, 12, 24, 48, 96, 384,1536 o 3456 pocillos y geometrla y capacidad de los pocillos variable, lo cual permite reducir el volumen de reactivos y medio a emplear en los ensayos, asl como estudiar en un formato manejable el efecto de un compuesto sobre un gran numero de aislados o el de una serie de compuestos sobre un aislado determinado; dichos metodos consistiendo generalmente en depositar una muestra de una o mas matrices biologicas, que se refieren al conjunto formado por un medio y muestra biologica, de origen procariota o eucariota (p. ej., bacterias, protozoos, plantas, insectos, aves, peces, reptiles, mamlferos, geneticamente modificados o no, etc.) tal como se definieron anteriormente, en uno o varios pocillos del dispositivo, y asl medir mediante espectroscopla de fluorescencia y de fluorescencia en tiempo resuelto (TRF), las variaciones en tiempo real en la concentracion de oxlgeno producidas en dicha matriz biologica a lo largo del experimento.

De forma general, el uso del dispositivo descrito en la presente memoria se lleva a cabo en cualquier plataforma estandar disponible comercialmente de fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF), de uso comun en analisis bioqulmicos, medicos, qulmicos o de investigacion y capaz de aceptar cualquier tipo de microplacas estandar (incluyendo formatos de 96, 384 pocillos o superiores),

De esta manera, la lectura de cada pocillo puede tomarse varias veces e implica excitar el marcador fluorescente con un pulso corto de luz, a continuacion, esperar un cierto tiempo (desde 50 a 200 microsegundos) despues de la excitacion y antes de medir la senal fluorescente restante de larga vida. De este modo, se eliminan las senales de fondo fluorescentes de vida corta y la dispersion de la radiacion.

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Para una mejor comprension de esta memoria descriptiva, a continuacion se dan, a tltuio ilustrativo y nunca iimitativo dei aicance de ia invencion, aigunos ejempios de ia esenciaiidad de ia misma.

Ejemplos

Ejempio 1: fabrication de una pelicula sensora y deposition sobre la microplaca para obtener el dispositivo de deteccion de oxigeno y de medicion de la variacion en sus concentraciones objeto de la presente invencion

Se mezcian 32 miiimoies (mmoies) de tetraetoxisiiano y 32 mmoies de octiitrietoxisiiano en 12,5 miiiiitros (mi) de etanoi absoiuto y sobre esa disoiucion se anaden 4 mi (0,0004 mmoies) de acido ciorhldrico 0,1 N.

La mezcia se agita vigorosamente durante 1 hora y se ie anaden 34 mi de etanoi, agitandose durante 30 minutos adicionaies. Tras ese tiempo, se ie adicionan gota a gota, 6 mi de una disoiucion 0,01 miiimoiar (mM) hidroaicohoiica (100 etanoi:10 agua v/v) de ia

5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenii)porfirina Pt(II) (0,06 mmoies).

La disoiucion resuitante se pipetea y se depositan 0,010 mi/pociiio sobre una piaca negra de poiiestireno, con 96 pociiios y fondo piano transparente, para permitir una buena visuaiizacion dei contenido dei pociiio, y, por tanto, ia posibiiidad de mediciones por transmision de iuz, junto a un “crosstaik” reducido entre pociiios.

Finaimente, ia piaca resuitante se deja geiificar, secar y estabiiizarse a temperatura ambiente de 5 a 7 dlas.

Ejempio 2: fabricacion de una pellcula sensora con antibioticos y deposicion sobre la microplaca de acuerdo con una realizacion particular de la presente invencion

Las piacas se fabrican siguiendo un procedimiento simiiar ai descrito en ei Ejempio 1, en ia cuai en aigunos pociiios se deposita ia disoiucion sensora como ia descrita en ei ejempio 1, ios cuaies se usan como bianco, junto a otros pociiios conteniendo una disoiucion en ia que ios 6 mi de disoiucion hidroaicohoiica 0,01 mM (100 etanoi:10 agua v/v) conteniendo 0,06 mmoies de ia 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenii)porfirina Pt(II), se forman a partir de 0,4 mi de sonda 10mM en dimetiisuifoxido, diiuida con ei voiumen correspondiente de agua en ia que se han disueito peniciiina y estreptomicina en cantidad adecuada para contener ias concentraciones finaies en ia peilcuia sensora de 100 U/mi y 0,1 mg/mi, respectivamente y compietada con etanoi para obtener 1/10 de ia disoiucion base de sonda. Finaimente, ia piaca generada con am bos tipos de pociiios (peilcuia sensora y peilcuia sensora con antibioticos) se deja geiificar, secar y estabiiizarse a temperatura ambiente de 5 a 7 dlas.

De este modo, es de esperar que cuando se siembran bacterias en un medio bioiogico adecuado para su crecimiento, en ios pociiios de una piaca sin antibiotico (fabricada segun ei ejempio 1) se producira un crecimiento bacteriano iogarltmico, que ira agotando ei oxigeno disueito en ei medio; a medida que disminuye adicionaimente ei nivei de oxigeno, ei crecimiento bacteriano podrla dificuitarse y ia presion parciai de oxigeno puede voiverse iimitante, hasta que ia presion parciai de oxigeno aicance casi cero, punto en ei cuai puede cesar ei crecimiento ceiuiar y dicho patron de crecimiento se refiejara en una curva sigmoidea. Por ei contrario, ai anadir un agente antibiotico ai xerogei que recubre ei pociiio resuitante dei proceso anterior se suprimira ei crecimiento bacteriano, no se consumira oxigeno y ias mediciones de emision de fiuorescencia daran una ilnea constante, proxima ai vaior de ios pociiios con un medio bioiogico sin bacterias.

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Ejemplo 3: fabrication de una pelicula sensora con un mitogeno y deposition sobre la microplaca

Las placas se fabrican siguiendo un procedimiento similar al descrito en el Ejemplo 1, en la cual en algunos pocillos se deposita la disolucion sensora como la descrita en el ejemplo 1, los cuales se usan como blanco, junto a otros pocillos conteniendo una disolucion en la que los 6 ml de disolucion hidroalcoholica 0,01 mM (100 etanol:10 agua v/v) conteniendo 0,06 mmoles de la 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(II), se forman a partir de 0,4 ml de sonda 10 mM en dimetilsulfoxido, diluida con el volumen correspondiente de agua en la que se ha disuelto fitohemaglutinina en cantidad adecuada para contener las concentraciones finales en la pelicula sensora de 0,02 mg/ml y completada con etanol para obtener 1/10 de la disolucion base de sonda. Finalmente, la placa generada con am bos tipos de pocillos (pelicula sensora y pelicula sensora con mitogeno) se deja gelificar, secar y estabilizarse a temperatura ambiente de 5 a 7 dlas.

De este modo, es de esperar que cuando se siembran celulas mononucleadas de sangre periferica o se anaden muestras biologicas que las contengan, en los pocillos de una placa sin mitogeno (fabricada segun el ejemplo 1), no se observara crecimiento celular, no se consumira oxlgeno y las mediciones de emision de fluorescencia daran una llnea constante, proxima al valor de los pocillos con un medio biologico sin celulas mononucleadas de sangre periferica. Por el contrario, al anadir un mitogeno adecuado al xerogel que recubre el pocillo resultante del proceso anterior se producira un crecimiento celular logarltmico, que ira agotando el oxlgeno disuelto en el medio; a medida que disminuye adicionalmente el nivel de oxlgeno, el crecimiento celular podrla dificultarse y la presion parcial de oxlgeno puede vol verse limitante, hasta que la presion parcial de oxlgeno alcance casi cero, punto en el cual puede cesar el crecimiento celular y dicho patron de crecimiento se reflejara en una curva sigmoidea.

Ejemplo 4: fabricacion de una pelicula sensora hlbrida y deposicion sobre la microplaca

Sobre una disolucion de 44 mmoles (10 ml) de tetraetoxisilano en 40 ml de etanol absoluto y 37 ml de agua, se anaden gota a gota 0,4 ml (0,38 g) de poli(dimetilsiloxano) hidroxil terminado y 0,02 ml de polioxietileno(23)lauril eter (Brij-35).

La mezcla se agita vigorosamente durante 1 hora y se le adicionan, gota a gota, 4 ml (0,06 mmoles) de una disolucion hidroalcoholica 0,01 mM (100 etanol:10 agua v/v) de

5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(II).

La disolucion resultante se sonica durante 30 minutos, en un bano de ultrasonidos, al cabo de los cuales se agita durante otros 30 minutos adicionales y se depositan con una pipeta 0,04ml/pocillo sobre una placa negra de poliestireno, con 96 pocillos y fondo plano transparente. Finalmente, la placa resultante se deja gelificar, secar y estabilizarse a temperatura ambiente durante un perlodo de 2 dlas.

Ejemplo 5: protocolo de deteccion E. Coli con 0,002 ml de pelicula sensora/pocillo

A cada pocillo de una microplaca obtenida segun el ejemplo 1, en la que se han depositado 0,002 ml de disolucion precursora de la pelicula sensora, se le anaden 0,1 ml de una suspension de medio de cultivo estandar (Difco Laboratories), al que se le ha transferido una colonia bacteriana de E. Coli. De este modo, la placa resultante, bien se congela a -20°C, para su posterior uso, bien se coloca, cubierta con 0,1 ml/pocillo de aceite mineral, en un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer), de forma que el lector captura dos senales: una primera senal de excitacion a 340 nanometros y una emision a 615 nanometros, tras un tiempo de demora de 70 microsegundos y una segunda senal a las mismas longitudes de excitacion y emision, pero con una demora de 30

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microsegundos. La relacion entre la primera y la segunda lectura, se considera la senal final que aparece en la grafica, lo cual establece una ventaja comparativa frente a las medidas de fluorescencia tradicionales, al eliminar algunos problemas metodologicos, como la autofluorescencia.

Tras la lectura continua (entre 40 y 80 lecturas cada 15 minutos) de la placa a 37°C y 5% de dioxido de carbono en el incubador de celulas, se obtiene un grafico del crecimiento bacteriano en cada pocillo, a traves de la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 1).

Ejemplo 6: protocolo de deteccion E. Coli con 0,005 ml de pelicula sensora/pocillo

A cada pocillo de una microplaca obtenida segun el ejemplo 1, en la que se han depositado 0,005 ml de disolucion precursora de la pelicula sensora, se le anaden 0,1 ml de una suspension de medio de cultivo estandar (Difco Laboratories), al que se le ha transferido una colonia bacteriana de E. Coli. De este modo, la placa resultante, bien se congela a -20°C, para su posterior uso, bien se coloca, cubierta con 0,1 ml/pocillo de aceite mineral, en un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer), de forma que el lector captura dos senales: una primera senal de excitacion a 340 nanometros y una emision a 615 nanometros, tras un tiempo de demora de 70 microsegundos y una segunda senal a las mismas longitudes de excitacion y emision, pero con una demora de 30 microsegundos. La relacion entre la primera y la segunda lectura, se considera la senal final que aparece en la grafica, lo cual establece una ventaja comparativa frente a las medidas de fluorescencia tradicionales, al eliminar algunos problemas metodologicos, como la autofluorescencia.

Tras la lectura continua (entre 40 y 80 lecturas cada 15 minutos) de la placa a 37°C y 5% de dioxido de carbono en el incubador de celulas, se obtiene un grafico del crecimiento bacteriano en cada pocillo, a traves de la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 2).

Ejemplo 7: protocolo de deteccion E. Coli con 0,01 ml de pelicula sensora/pocillo

A cada pocillo de una microplaca obtenida segun el ejemplo 1, en la que se han depositado 0,01 ml de disolucion precursora de la pelicula sensora, se le anaden 0,1 ml de una suspension de medio de cultivo estandar (Difco Laboratories), al que se le ha transferido una colonia bacteriana de E. Coli. De este modo, la placa resultante, bien se congela a -20°C, para su posterior uso, bien se coloca, cubierta con 0,1 ml/pocillo de aceite mineral, en un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer), de forma que el lector captura dos senales: una primera senal de excitacion a 340 nanometros y una emision a 615 nanometros, tras un tiempo de demora de 70 microsegundos y una segunda senal a las mismas longitudes de excitacion y emision, pero con una demora de 30 microsegundos. La relacion entre la primera y la segunda lectura, se considera la senal final que aparece en la grafica, lo cual establece una ventaja comparativa frente a las medidas de fluorescencia tradicionales, al eliminar algunos problemas metodologicos, como la autofluorescencia.

Tras la lectura continua (entre 40 y 80 lecturas cada 15 minutos) de la placa a 37°C y 5% de dioxido de carbono en el incubador de celulas, se obtiene un grafico del crecimiento bacteriano en cada pocillo, a traves de la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 3).

Ejemplo 8: Protocolo de deteccion E. coli a 0,01 ml de pelicula sensora+antibioticos/pocillo

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A cada pocillo de una microplaca obtenida segun el ejemplo 2, en la que se han depositado 0,01 ml de disolucion precursora de la pellcula sensora, se le anaden 0,1 ml de una suspension de medio de cultivo estandar (Difco Laboratories), al que se le ha transferido una colonia bacteriana de E. coli. De este modo, la placa resultante, bien se congela a -20°C, para su posterior uso, bien se coloca, cubierta con 0,1 ml/pocillo de aceite mineral, en un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer), de forma que el lector captura dos senales: una primera senal de excitacion a 340 nanometros y una emision a 615 nanometros, tras un tiempo de demora de 70 microsegundos y una segunda senal a las mismas longitudes de excitacion y emision, pero con una demora de 30 microsegundos. La relacion entre la primera y la segunda lectura, se considera la senal final que aparece en la grafica, lo cual establece una ventaja comparativa frente a las medidas de fluorescencia tradicionales, al eliminar algunos problemas metodologicos, como la autofluorescencia.

Tras la lectura continua (entre 40 y 80 lecturas cada 15 minutos) de la placa a 37°C y 5% de dioxido de carbono en el incubador de celulas, se obtiene un grafico del crecimiento bacteriano en cada pocillo, a traves de la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 4).

Ejemplo 9: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:4) en presencia de fitohemaglutinina

La sangre se recoge en tubos de 10 ml con heparina de sodio como anticoagulante y se diluye con medio de cultivo comercial RPMI 1604 suplementado, en una proporcion v/v de sangre a medio de 1:4 y se distribuye en allcuotas de 0,180 ml/pocillo de dicha disolucion de sangre en las placas multipocillo obtenidas segun el Ejemplo 3.

La placa se incuba a 37°C y un 5% de dioxido de carbono en el incubador de celulas durante 72 horas, cubierta con 0,1 ml/pocillo de aceite mineral, en un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer), de forma que el lector captura dos senales: una primera senal de excitacion a 340 nanometres y una emision a 615 nanometres, tras un tiempo de demora de 70 microsegundos y una segunda senal a las mismas longitudes de excitacion y emision, pero con una demora de 30 microsegundos. La relacion entre la primera y la segunda lectura, se considera la senal final que aparece en la graficas, lo cual establece una ventaja comparativa frente a las medidas de fluorescencia tradicionales, al eliminar algunos problemas metodologicos, como la autofluorescencia y permite hacer medidas en sangre completa, durante 40-80 veces, cada 15 minutos, de modo que se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, a traves de la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 5).

Ejemplo 10: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:5) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:5 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, a traves de la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 6).

Ejemplo 11: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:8) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:8 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 7).

Ejemplo 12: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:10) en presencia de fitohemaglutinina

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Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:10 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 8).

Ejemplo 13: protocolo de deteccion de proliferation en sangre humana completa diluida (1:20) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:20 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 9).

Ejemplo 14: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:30) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:30 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 10).

Ejemplo 15: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:40) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:40 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 11).

Ejemplo 16: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:50) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:50 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 12).

Ejemplo 17: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:100) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:100 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 13).

Ejemplo 18: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa diluida (1:200) en presencia de fitohemaglutinina

Segun un procedimiento similar al del Ejemplo 9, con una proporcion v/v de sangre a medio de 1:200 se obtiene un grafico de linfoproliferacion en cada pocillo, mediante la representacion del consumo de oxlgeno, de acuerdo a lo esperado (Figura 14).

Ejemplo 19: protocolo de citotoxicidad de la 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(II), frente a celulas THLE-2

A cada pocillo de una microplaca negra de 96 pocillos, para cultivo de tejidos, se le anaden 10.000 celulas THLE2/pocillo, suspendidas en el medio recomendado por el proveedor. De este modo, la placa resultante se guarda en el incubador de celulas a 37°C y 5% de dioxido de carbono, durante toda la noche, tras lo cual, se aspira el medio y se anaden 0,18 mililitros/pocillo de medio completo nuevo, seguidos de 0,02 mililitros/pocillo de concentraciones variables de la 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(II), previamente disuelta en dimetilsulfoxido, hasta una concentracion final, en cada pocillo, del 1% en dimetilsulfoxido.

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La placa se mantiene en el incubador de celulas a 37°C y 5% de dioxido de carbono, durante 72 horas, tras las cuales se aspira el medio y se reemplaza por 0,02 mililitros/pocillo del tampon de lisis (“Ready to use lysis buffer’ del Cambrex Vialight Plus kit, Cat#LT07-121). Tras 45 minutos adicionales de incubacion, se anaden 0,05 mililitros/pocillo del reactivo de deteccion de ATP (“ATP monitoring reagent-Plus” del Cambrex Vialight Plus kit, Cat#LT07-121) y se mantiene a temperatura ambiente durante 5 minutos, tras los que se hace una lectura de luminiscencia en un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer).

De ese modo, se obtiene el grafico de la Figura 15, que representa el contenido de ATP, cuyos datos son la media ± error de 6 pocillos diferentes para cada concentracion de la

5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(II), resultando una concentracion inhibitoria media (CI50) de 0,07 milimolar.

Ejemplo 20: protocolo de deteccion de proliferacion en sangre humana completa en presencia de fitohemaglutinina

La sangre se recoge en tubos de 10 ml con heparina de sodio como anticoagulante y se diluye con 100 ml de un medio de cultivo comercial RPMI 1604 modificado, en el que se ha disuelto fitohemaglutinina en cantidad adecuada para contener una concentracion final de 0,02 mg/ml. La mezcla resultante, se incuba a 37°C y un 5% de dioxido de carbono en el incubador de celulas durante 72 horas, tras lo cual se distribuye en allcuotas de 0,180 ml/pocillo de dicha disolucion de sangre en las placas multipocillo obtenidas segun el Ejemplo 1.

Dicha placa, conteniendo la sangre y cubierta con su correspondiente tapa, se introduce en el incubador de celulas a 37°C y un 5% de dioxido de carbono, tras agregar a la mitad de los pocillos 0,1 ml/pocillo de aceite mineral, para prevenir cualquier intercambio de oxlgeno con el interior, mientras que el resto de los pocillos se mantienen sin aceite. Al cabo de tres horas, la placa se introduce en un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer), de forma que el lector captura dos senales: una primera senal de excitacion a 340 nanometros y una emision a 615 nanometros, tras un tiempo de demora de 70 microsegundos y una segunda senal a las mismas longitudes de excitacion y emision, pero con una demora de 30 microsegundos. La relacion entre la primera y la segunda lectura, se considera la senal final con la que se crean la graficas, de modo que se obtiene la linfoproliferacion en cada pocillo, a traves de la representacion del consumo de oxlgeno y cuyos datos son la media ± error de 4 pocillos diferentes para la concentracion dada (Figuras 16 y 17).

Ejemplo 21: protocolo de lixiviacion de la 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(II), hacia el medio

Sobre 24 pocillos de una microplaca generada segun el Ejemplo 1 (filas A-H y columnas 7-9), se anaden 0,2 ml de medio de cultivo RPMI 1640. De este modo, el medio de tres de los pocillos (fila A) se retira de forma inmediata (denominado dla 0) o se mantiene en la placa a diferentes dlas hasta 8 dlas (denominado dfa 8, correspondientes a las filas F- H), tras los cuales, tambien se aspira el medio.

La placa, una vez que esta completamente vacla, se procesa anadiendo 0,1 ml de vehlculo (medio de cultivo RPMI 1640) sobre el pocillo de la fila A y columna 7 (n=1) y 0,1 ml de una disolucion patron de sulfito de sodio al 10% en agua sobre cada pocillo de la fila A y columnas 8 y 9 (n=2), correspondientes todos ellos al dfa 0. Del mismo modo se anaden 0,1 ml de vehlculo (medio de cultivo RPMI 1640) sobre cada pocillo de las filas F- H y columna 7 (n=3) y 0,1 ml de una disolucion de sulfito de sodio al 10% en agua sobre los pocillos de las filas F-H y columnas 8 y 9 (n=6), correspondientes todos ellos al dla 8.

Los pocillos conteniendo vehlcuio o disolucion de sulfito de sodio se cubren con 0,15 ml de aceite mineral, para evitar cualquier intercambio de oxlgeno con el exterior y se llevan a un lector de placas (Envision, Perkin-Elmer) y cada pocillo se lee 10 veces, con un intervalo de 1 una hora (10 horas de lectura), de modo similar a como se describe en los 5 ejemplos anteriores, suministra cada una de las senales finales recogidas en la Tabla 1, donde se incluyen los valores medios de cada grupo y la desviacion estandar (□).

Tabla 1

Media □ Media □

19,3 - 25,29 14,48

18,8 - 14,93 1,54

21,4 - 17,80 2,35

Vehlculo

Dfa 0 23,1 - Dfa 8 16,97 1,75

25,1 - 17,60 2,88

28,9 - 18,77 2,87

28,9 - 18,83 5,46

27,8 - 18,33 2,61

29,3 - 18,17 2,73

30,9 - 18,47 3,17

29,1 - 18,90 2,43

28,2 - 19,73 2,24

44,85 25,53 71,57 35,52

182,30 111,16 222,88 73,57

Patron Positivo

212,10 51,34 244,85 110,11

Dfa 0

242,65 36,70 Dfa 8 259,25 122,31

262,30 33,80 260,43 118,87

275,90 37,90 247,30 111,65

284,10 39,74 254,08 128,49

284,05 36,42 242,75 117,29

286,50 31,25 249,87 112,58

290,95 35,43 238,97 106,50

289,90 33,66 241,85 102,44

296,50 38,75 238,62 91,32

Claims (21)

1. 5

   10

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   25

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   REIVINDICACIONES

   1. Microsensor qulmico polimerico de deteccion de oxlgeno caracterizado por que comprende:

   - un soporte que es una placa de ensayo que presenta una pluralidad de pocillos en forma de receptaculos abiertos por su cara superior y cuyo numero varla entre 6, 12, 24, 48, 96, 384,1536 o 3456 pocillos, siendo de geometrla y capacidad variables; recubierto de

   - una pellcula sensible al oxlgeno depositada homogeneamente sobre la superficie interior de los pocillos del soporte, que comprende:

   • una matriz polimerica inerte y estable que comprende un xerogel de estructura porosa, formado por pollmeros inorganicos constituidos por una cadena principal de atomos alternos de silicio y de oxlgeno seleccionados entre una red tridimensional de dioxido de silicio, desarrollada a partir de monomeros con grupos alcoxilo hidrolizables, y/o un polisiloxano, dicha matriz siendo sensible al oxlgeno gracias a

   • al menos una sonda molecular fluorogenica anclada a la matriz polimerica, que es soluble en agua y seleccionada entre derivados de metaloftalocianina y/o metaloporfirina.
2. 2. Microsensor de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la sonda molecular fluorogenica es al menos una metaloporfirina que comprende un ciclo nitrogenado central conteniendo un atomo o ion metalico seleccionado del grupo que consiste en paladio, platino y rutenio, sustituido en su periferia con uno, dos, tres o cuatro grupos del tipo carboxilato.
3. 3. Microsensor de acuerdo con la reivindicacion 2, donde una de las sondas moleculares es 5,10,15,20-tetrakis(4-carboxifenil)porfirina Pt(II), y esta presente en la matriz polimerica en una proporcion comprendida entre el 10% y el 100% en peso del total de metaloporfirinas y/o metaloftalocianinas del microsensor.
4. 4. Microsensor de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el xerogel de la matriz polimerica incluye en su estructura al menos un segundo atomo metal o metaloide diferente al silicio seleccionado del grupo que consiste en aluminio, circonio, titanio, estano, vanadio, hierro y cualquiera de sus combinaciones.
5. 5. Microsensor de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la matriz polimerica es seleccionada del grupo que consiste en:

   - una matriz inorganica de estructura compuesta en un 100% de dioxido de silicio;

   - una matriz hlbrida organica-inorganica que contiene de forma combinada dioxido de silicio y polisiloxanos, estando contenidos dichos polisiloxanos en un intervalo comprendido entre 10% y 99% del total del peso de la matriz; y

   - una matriz organica de estructura compuesta en un 100% de polisiloxano.
6. 6. Microsensor de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el polisiloxano es polidimetilsiloxano hidroxi terminado de formula I

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   imagen1

   donde n corresponde al numero de unidades de silicio por molecula de oligomero, y representa el grado de oligomerizacion.
7. 7. Microsensor de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una segunda pellcula de una matriz polimerica que contiene un material inerte adecuado para reflejar y dispersar la luz emitida por la sonda que consiste en un oxido metalico seleccionado dentro del grupo compuesto por dioxido de estano, oxido de zinc, dioxido de titanio y cualquiera de sus combinaciones, estando dicha capa depositada directamente sobre la superficie interior de los pocillos de la microplaca y entre dicha superficie interior y la primera capa de matriz polimerica.
8. 8. Microsensor de acuerdo a una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende adicionalmente al menos una sustancia bioactiva adsorbida sobre la superficie de la matriz polimerica porosa del xerogel.
9. 9. Microsensor de acuerdo a la reivindicacion 8, donde dicha sustancia bioactiva es seleccionada del grupo que consiste en antibioticos, antifungicos, antiprotozoarios, antineoplasicos, mitogenos y antlgenos especlficos, as! como cualquiera de sus combinaciones, y se encuentra presente en la matriz polimerica en una cantidad comprendida entre un 0,001% y un 50% en peso respecto al peso total de la matriz polimerica depositada.
10. 10. Proceso para la fabricacion del microsensor definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, mediante preparacion de una matriz de estructura porosa formada por cadenas de atomos alternos de silicio y de oxlgeno seleccionadas entre sllice y polisiloxanos a partir de un proceso sol-gel, que comprende las etapas de:

    (a) formar un sol precursor de compuestos de silicio seleccionados entre dioxido de silicio y/o polisiloxano, a partir de la mezcla de al menos un monomero portador de al menos un alcoxido de silicio de formula

    Si(OR)n(R’)4-n,

    donde n varla entre 2 y 4; R es un alquilo, y cada R’ es seleccionado independientemente entre alquilo o alquenilo, en una proporcion comprendida entre 2 y 30 moles de agua por mol de alcoxido, usada como reactivo de hidrolisis, y un catalizador precursor de reaccion que es un acido organico, un acido inorganico o una base en una razon molar catalizador:alcoxido comprendida entre 0,000001:99,999999 y 0,0001:99,9999;

    (b) adicionar al sol precursor resultante de la etapa (a) al menos un aditivo sensible al oxlgeno que consiste en la sonda molecular fluorogenica antes descrita, en una razon molar sonda:alcoxido entre 0,00001:99,99999 y 0,001:99,999;

    (c) depositar una pellcula del sol precursor obtenido en la etapa (b) sobre la superficie interior de los pocillos de la microplaca que hace de soporte de forma

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    homogenea, en un volumen comprendido entre 1% y 25% del volumen total del pocillo a recubrir

    (d) gelificar el sol precursor resultante de la etapa (c) mediante policondensacion del alcoxido a una temperatura comprendida entre 15°C y 70°C durante un tiempo comprendido entre 1 y 72 horas, dando lugar a una matriz porosa de xerogel, la cual se somete a

    (e) sineresis o envejecimiento para evaporar el medio de disolucion del sol precursor, durante un perlodo de 2 a 5 dfas.
11. 11. Proceso segun la reivindicacion anterior, donde se anade al menos un segundo alcoxido de metal y/o metaloide a la mezcla de la etapa a), que es un alcoxido de formula

    M(OR)n

    y cualquiera de sus mezclas binarias y ternarias con estequiometrla en una razon molar comprendida entre 0,1 y 0,9 de cada uno de los alcoxidos de la mezcla; donde M es seleccionado del grupo que consiste en aluminio, zirconio, titanio, estano, vanadio y hierro; (RO-) representa un grupo alcoxilo que es un radical organico derivado de un alcohol por perdida del hidrogeno hidroxllico, donde R es un grupo alquilo; y n varla entre 2 y 4.
12. 12. Proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11, donde los alcoxidos

    son seleccionados del grupo que consiste en: tetrametoxisilano, tetraetoxisilano, octiltrietoxisilano,
    etiltrimetoxisilano,
    hexiltrietoxisilano, hexiltrimetoxisilano,
    ciclohexiltrimetoxisilano, feniltrietoxisilano, feniltrimetoxisilano,
    benziltrietoxisilano, dimetildimetoxisilano,
    clorometiltrietoxisilano,
    tetra(1,1,1,3,3,3-

    
    hexafluoroisopropoxi)silano, polifluorooctil trietoxisilano, tetra-n-propoxisilano, tetra-n- butoxisilano, tetrakis(2-metoxietoxi)silano, metiltrietoxisilano,
    dodeciltrietoxisilano,
    dodeciltrimetoxisilano,
    hexadeciltrimetoxisilano,
    octadeciltrietoxisilano,

    
    octadeciltrimetoxisilano, metiltrimetoxisilano, (3-aminopropil)trietoxisilano, (3- aminopropil)trimetoxisilano, aliltrimetoxisilano, aliltrietoxisilano, trietoxivinilsilano,
    [3-(2-
    aminoetilamino)propll]trimetoxisilano, (3-chloropropil)trimetoxisilano,
    (3-

    
    bromopropil)trimetoxisilano,
    3-cloropropildimetoximetilsilano,
    3-

    
    cloropropyiltrietoxisilano,
    2-cianoetiltrietoxisilano,
    (3-mercaptopropil)trietoxisilano, (3-
    mercaptopropil)trimetoxisilano,
    ciclohexil(dimetoxi)metilsilano,
    dietoxidimetilsilano,

    
    dietoxidifenilsilano, dietoxi(3-glicidiloxipropil)metilsilano,
    dietoximetilvinilsilano,
    dimetoximetilfenilsilano,
    trimetoxi(2-feniletil)silano, N-[3-(trimetoxisilil)propil]anilina,
    tetraetiltitanato, tetraisopropiltitanato y tetrabutiltitanato y sus posibles mezclas binarias y ternarias, con estequiometrla variable, en una razon molar desde 0,1 a 0,9 de cada uno de sus componentes.
13. 13. Proceso segun una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde la mezcla de alcoxido y agua se realiza en un medio de disolucion seleccionado entre un alcohol, un hexano y un eter clclico; dicho medio de disolucion estando presente en una cantidad comprendida entre 2 y 20 moles.
14. 14. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde:

    - el 100% de los alcoxidos que se anaden en la mezcla de la etapa a) son alcoxidos de formula Si(OR)n(R’)4-n, dando lugar a una red tridimensional de atomos alternos de silicio y de oxlgeno;

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    - el 100% de los alcoxidos que se anaden en la mezcla de la etapa a) son polisiloxanos, en cuyo caso se anade adicionalmente al menos un tensioactivo no ionico; o

    - entre el 10% y el 99% del total de precursores que se anaden en la mezcla de la etapa a) son polisiloxanos, en cuyo caso se anade adicionalmente al menos un tensioactivo no ionico.
15. 15. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, donde el polisiloxano es polidimetilsiloxano hidroxi terminado de formula I

    ,0.

    H'

    CH,

    ‘Si'

    I

    CH,

    ,0.

    CH,

    fnSi

    CH,

    ,0,

    ch3

    ~sK

    CH,

    ,0,

    donde n corresponds dl I lull ICI U UC Ul NUdUCS UC SIIIOIU [JUI representa el grado de oligomerizacion.

    H

    mulecula de oligomero, y
16. 16. Proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, donde la deposicion de la etapa (c) se lleva a cabo mediante recubrimiento por centrifugacion a una velocidad de rotacion de entre 300 y 2000 rpm durante un tiempo comprendido entre 1 y 60 minutos, o por inmersion.
17. 17. Proceso para la fabricacion de un microsensor como el definido en la reivindicacion 7, caracterZado por que comprende adicionar una segunda capa de una matriz polimerica, que contiene al menos un material inerte adecuado para reflejar y dispersar la luz emitida por la sonda consistente en un oxido metalico seleccionado del grupo compuesto por dioxido de estano, oxido de zinc, dioxido de titanio y cualquiera de sus combinaciones, antes de la deposicion de la capa de matriz polimerica que contiene la sonda fluorogenica, donde dicho oxido metalico es adicionado en el proceso sol-gel de la etapa (a) dando lugar a un xerogel mixto, o bien es adicionado mediante dispersion en al menos una silicona
18. 18. Proceso para la fabricacion de un microsensor como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, caracterizado por que comprende adicionar al menos una sustancia bioactiva en la etapa (b) en una cantidad comprendida entre 0,001% y 50% en peso del total de la pellcula polimerica depositada sobre el pocillo.
19. 19. Uso de un microsensor como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la monitorizacion de muestras in vitro y ex vivo mediante un estudio seleccionado del grupo que consiste en: estudio de proliferacion celular de eucariotas o procariotas, estudio de citotoxicidad y quimiosensibilidad, estudio de senescencia celular, estudio de la cadena de respiracion mitocondrial; estudio de transformacion linfoblastica con mitogenos inespeclficos; estudio de respuesta inmune celular provocada por tratamientos inmunologicos, farmacologicos, quirurgicos, nutricionales, hormonales o ambientales; estudio de perfil inmunologico y estado del sistema inmune de un sujeto para el control de rutina de grupos de riesgo; estudio de enfermedades inmunomediadas; estudio de inmunodeficiencias que pueden sospecharse frente a cuadros infecciosos recurrentes o refractarios al tratamiento; estudio del deficit de la capacidad inmunologica en estados patologicos autoinmunes; estudio de consecuencias de terapias inmunosupresoras, terapias de realce inmunitaria, de

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    reacciones de hipersensibilidad celular reaccionando contra los alergenos del medio ambiente o antigenos; estudio de la respuesta a mitogenos; estudio de la candidiasis mucocutaneas y otras infecciones fungicas cronicas; estudio de la blastogenesis inducida por berilio; estudio de la deteccion de la exposicion previa a diversos agentes patogenos; estudio de enfermedades periodontales y ciertas infecciones virales; estudio de la deteccion de exposicion previa al antigeno correspondiente en sujetos sin respuesta a anticuerpos; estudio de la presencia de antigenos responsables de alergias que tambien estimulan reacciones espedficas linfoproliferativas; estudio de estados alergicos; estudio de reacciones inmunologicas hacia agentes patogenos, alergenos y autoantigenos; estudio de las condiciones autoinmunes en las que los antigenos estimulan espedficamente la transformacion linfoblastica solo en sujetos que padecen dicho estado; estudio de los estados de inmunodeficiencia genetica y adquirida, con una funcion linfocitaria deprimida; estudio de efectos terapeuticos; estudio de seguimiento del grado de deterioro/mejona de la reactividad linfocitaria en sujetos con cancer; estudio del comportamiento celular en desordenes mitocondriales; estudio del seguimiento del grado de deterioro y/o mejoria de la reactividad linfocitaria en pacientes con cancer; estudio del comportamiento celular en desordenes mitocondriales; estudio de reacciones enzimaticas de consumo o produccion de oxigeno y de modelos de enfermedades asociadas al estres oxidativo; estudio del vinculo funcional entre desordenes neurologicos y mecanismos de regulacion bioenergetica de celulas perifericas; estudio de las complicaciones diabeticas e inflamacion; estudio de las tecnicas de manipulacion para la terapia celular reproductiva, regenerativa y terapeutica; estudio del efecto de formulaciones conteniendo nanopartfculas y otros sistemas teranosticos sobre la funcion inmunologica basica de linfocitos animales; que se llevan a cabo en un cultivo seleccionado del grupo que consiste en cultivos con enzimas o sistemas enzimaticos dependientes de oxigeno, cultivos de celulas adherentes y cultivos celulares en suspension de: organulos celulares, tejidos de animales modificados geneticamente o no; organismos eucariotas formados por una sola celula o por una colonia de celulas iguales entre si sin diferenciacion de tejidos y que viven en medios acuosos o en liquidos internos de organismos superiores, y organismos acuaticos completos.
20. 20. Uso de un microsensor como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para la medida directa in vitro de cineticas de la concentracion de oxigeno presente en Kquidos organicos, en liquidos inorganicos, en sus mezclas o en al menos una matriz biologica seleccionada de un grupo que consiste en suero, plasma, saliva, sudor, leche, exudado vaginal, semen, liquido pericardico, liquido sinovial, liquido amniotico, liquido cefalorraqmdeo, liquido pleural y liquido peritoneal, orina completa, sangre completa, orina o sangre diluidas en un medio seleccionado del grupo que consiste en: agua, suero fisiologico, suero de ternera, suero bovino fetal, suero de caballo, suero humano, solucion salina equilibrada de Hank, RPMI 1640, medio basal de Eagle, medio minimo esencial de Eagle, medio MEM modificado por Dulbeco, modificacion de Iscove del medio DMEM, McCoy 5A, medio L-15 de Leibovitz, medio F-10 de Ham, medio F-12 de Ham, medio 199 y cualquiera de sus variantes.
21. 21. Uso de un microsensor como el definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9, para la liberacion controlada de sustancias bioactivas.