WO2002094286A1

WO2002094286A1 - Inhibiteurs de metastases cancereuses contenant des derives d'acide phosphatidique carbacycliques

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Publication number: WO2002094286A1
Application number: PCT/JP2002/004839
Authority: WO
Inventors: Mutsuko Mukai; Susumu Kobayashi; Hiromu Murofushi; Kimiko Murofushi
Original assignee: Gencom Corporation
Priority date: 2001-05-21
Filing date: 2002-05-20
Publication date: 2002-11-28
Also published as: JP4163007B2; DE60224276T2; DE60224276D1; JPWO2002094286A1; US20040214799A1; EP1402894A4; EP1402894B1; ATE381934T1; EP1402894A1

Description

力ルバ環状ホスファチジン酸誘導体を含む癌転移抑制剤技術分野

本発明は、力ルバ環状ホスファチジン酸誘導体を有効成分として含む、癌転移抑制剤に関する。背景技術

リゾホスファチジン酸（LPA、 lysophosphatidic acid) は、生体膜を構成するリン脂質の中で最も単純な構造を持っており、ホスファチジン酸（PA) からダリセ口ールの _sn - 1位あるいは 2位の脂肪酸のどちらか一方が脱ァシル化されたものである（図 1 )。通常の細胞において、全リン脂質中にしめる LPAの割合は 0. 5% 以下ときわめて少なく、 1980年代までは単に、リン脂質生合成の中間体や分解産物としてし力認識されていなかった。しかし最近、 LPA の様々な生理活性が示され (Moolenaar, W. H. ： Exp. Cell Res. 253， 230 - 238 (1999) )、さらに、細胞膜上の複数の受容体の存在も明らかになって（Guo，Z. ,他， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14367-14372 (1996) ； Hecht, J. H.，他, J. Cell Biol. 135, 1071 - 1083 (1996) ； An, S. ,他， J. Biol. Chem. 273, 7906-7910 (1998)； Bandoh, K.，他， J. Biol. Chem. 274, 27776-27785 (1999) ；及ぴ Im, D- S.，他， Mol. Pharmacol. 57, 753-759 (2000) )、機能リン脂質として注目されるようになった。

LPA は、細胞種によって様々な作用を引き起こす事が知られる。細胞の増殖促進 (van Corven, E. J. ,他， Cell 59, 45-54 (1989) )や細胞死の抑制 (Umansky, S. R. , 他， Cell Death Diff. 4, 608-616 (1997) ) に加え、低分子量 Gタンパク質の一つである Rhoを介したシグナル伝達系の活性化によって、細胞骨格の変化を導き、繊維芽細胞におけるストレスファイバーの形成（Gohla, A.，他， J. Biol. Chem. 273, 4653-4659 (1998) ) や、神経細胞における神経突起の退縮 (Tigyi, G.，他, J. Biol. Chem. 267, 21360 - 21367 (1992) ； Jalink, K. ,他, Cell Growth & Differ. 4, 247-255 (1993) ； Jalink, K.，他， J. Cell Biol. 126, 801-810 (1994) ；及ぴ Tigyi, G.，他， J. Neurochem. 66, 537 - 548 (1996) )、癌細胞の浸潤（Imamura, F. ,他， Biochem. Biophym. Res. Commun. 193， 497 - 503 (1993)； 0' Connor, K. L. ,他， J. Cell Biol. 143, 1749-1760 (1998) ; Stam, J. C. ,他， EMBO J. 17, 4066-4074 (1998) )などを誘導する。

一方、 1992年には、真性粘菌 Physarum polycephalumの単相体ミクソアメーバから、真核細胞の DNA複製酵素である DMポリメラーゼの活性を抑え、動物培養細胞の増殖を抑制する脂溶性物質が見いだされ、単離 ·精製された

(Murakami-Murofushi, K. ,他， J. Biol. Chem. 267, 21512-21517 (1992) )。この物質はグリセロール骨格の sn- 1位にシクロプロパンを含むへキサデカン酸が結合し、 2位と 3位にリン酸が環状エステル結合した物質であることがわかり（図 1 )、 Physarum由来の LPA様物質であること力ゝら、 PHYLPAと命名された。

PHYLPAが sn - 1位に特徴的な脂肪酸を有することから、一般的な脂肪酸に置換した誘導体を化学合成し、その活性を検討した。その結果、程度に強弱こそあつたが、いずれも細胞増殖を抑制することが示され、 PHYLPA の増殖抑制作用が、 2 位と 3位の環状リン酸基によることが明らかになった。現在では、このような環状リン酸基を持つ LPA類似体を総称して、環状ホスファチジン酸（cPA、 cyclic phosphatidic acid) と呼んでいる（図 1 )。この cPAは最近、ヒト血清中にアルブミンに結合した形で検出され (Kobayashi, T. ,他， Life Sciences 65, 2185-2191 (1999) )、広く生物界に存在することが明らかになった。また、このとき分離された脂質画分中の cPAは、パルミチン酸を脂肪酸として持つ Pal- cPAが主要成分であった。血清の他、ラットゃブタの脳でも cPAの存在が確認され、 Tigyi らはまた、ゥサギの角膜損傷モデルにおいて、房水や涙腺液中に、 cPAを含む一群の LPA 類縁体を検出している（Liliom, K.，他， Am. J. Physiol. 274, C1065- C1074 (1998) )。 cPAは、 LPAと同様な、または相反する様々な生理活性を示すことが明らかになつている。 LPA が培養細胞の増殖を促進するのに対し、 cPA は抑制作用を示す

(Murakami— Murofushi, K. ,他， Cell Struct. Funct. 18, 363-370 (1993) )。この作用は可逆的であり、培地から cPAを除くと、'細胞は再ぴ増殖を始める。増殖抑制作用の機構として、ふたつの可能性が示唆されている。

マウス繊維芽細胞（NIH3T3) において、 cPAが細胞内 cAMP濃度を数分以内に上昇させることが見いだされている。細胞内の Ca²⁺濃度の上昇を妨げることによつてこの現象は見られなくなり（Murakami-Murofushi, K.，他， Cell Struct. Funct. 18, 363-370 (1993) )、 cPAは細胞膜上の受容体を介して Ca²⁺依存的なァデュル酸シクラーゼを活性化している可能性が考えられる。細胞内 cAMP濃度の上昇が MAP キナーゼの活性化を抑制することが示されており（Hordijk, P. L. ,他， J. Biol. Chem. 269, 3534-3538 (1994) ；及ぴ Howe， L. R.，他， J. Biol. Chem. 268, 20717-20720 (1993) )、このこと力 S、増殖阻害につながる可能性が示唆された。一方、 cPA はその構造上、容易に細胞内に取り込まれると考えられる。この点に関し、 sn-1位を蛍光標識した cPAを合成し、細胞に添加した後にその挙動を観察することで、 cPAが迅速に細胞内に移行し、細胞質中、核の周辺部に局在することが判明している。また、 cPAが in vitroで、細胞周期を制御する cdc25ホスファターゼの活性を阻害することが見いだされており（小林哲幸 ·室伏きみ子：蛋白質核酸酵素 44, 1118-1125 (1999) )、このことから、 cPAが、細胞膜上の受容体を介さずに、細胞質内で cdk2キナーゼ複合体の活性化を直接抑制することで、細胞の増殖を阻害している可能性も考えられる。

また、血清を制限した培地で培養した繊維芽細胞では、 LPA、 cPA共に、細胞内のァクチン分子によるストレスファイバーの形成を誘導する（小林哲幸 ·室伏きみ子：蛋白質核酸酵素 44, 1118-1125 (1999) )。この場合は、 cPA も LPAと同様に、細胞膜受容体への結合を介して Rhoを活性化することで、その作用を引き起こすと考えられる。

さらに、癌細胞の浸潤については、 LPAの促進作用に対し、 cPAは強い抑制活性を示す (Mukai, M.，他， Int. J. Cancer 81, 918-922 (1999) )₀

癌の転移は、腫瘍の悪性化を示す最も顕著な現象であり、複雑な過程を経て成立する。中でも浸潤は特徴的なステップであり、生体内で原発巣から遊離した癌細胞は、間質、血管内に浸潤して血流にのって運ばれ、血管外、さらに遠隔臓器へと浸潤し、そこで増殖して転移巣を作る。 In vitroでこの現象を解析するために、明渡らは、ラット腹水肝癌細胞（AH-130) をラット腹腔に移植した際におこる腹膜浸潤をモデル化し、宿主正常細胞層を越えた癌細胞の移動を定量的に評価できる実験系を開発した（Akedo，H. ,他, Cancer Res. 46, 2416-2422 (1986) ) ₀ 通常、浸潤の研究には細胞外基質をコーティングした膜を通り抜けた癌細胞を観察する実験系が用いられるが、その方法に対してこの系は、 in vivo をよく反映すると考えられている。この実験系に用いられるいくつかの癌細胞には、その浸潤に血清を必要とするものとしないものとがある。 AH - 130細胞の高浸潤性クローン

(丽1) は、その浸潤に血清を必要とし、血清中の浸潤促進物質の検索の結果、少なくともそのうちの一つが LPA であることが明らかになった（Imamura, F. ,他， Biochem. Biophym. Res. Coramun. 193, 497-503 (1993) ) ₀ このことから、 LPA構造類似体である cPAの浸潤に対する影響を調べたところ、 LPAとは全く逆に、浸潤を抑制することが見いだされた。いくつかの、 sn - 1位に異なる脂肪酸が結合した誘導体を合成し、その浸潤抑制活性を調べたところ、 Pal-cPAが最も強い浸潤抑制を示した。また、同じアツセィ系において、その浸潤に血清や LPAを必要としなぃヒト繊維肉腫細胞（HT - ΙΟδΟ) の浸潤も、 Pal - cPA によって顕著に抑制された

(Mukai, M.，他， Int. J. Cancer 81, 918-922 (1999) )。

MM1細胞においても、 Pal- cPAの添加によって細胞内 cAMP濃度は数分のうちに上昇し、 LPA 共存下においてもこの効果は失われなかった（Mukai, M.，他， Int. J. Cancer 81， 918 - 922 (1999) )。そこで細胞内 cAMP濃度を上昇させる試薬を添加したところ、 LPA誘導性の浸潤は抑制された。さらに、これらの試薬や Pal - cPA の添加によって、 LPAによる Rhoの活性が阻害されることが示された（Mukai, M. , 他， FEBS Letters 484, 69- 73 (2000) )。これらのことから、この癌細胞 (MM1) においても、 cPA は細胞内 cAMP濃度を上昇させることによって、 cAMP- dependent Protein Kinase A (Aキナーゼ）の活性化を介して Rhoの活性を阻害し、浸潤を抑制する可能性が示唆された。しかしながら、力ルバ環状ホスファチジン酸誘導体が癌細胞の浸潤抑制作用を有するかどうかについてはこれまで報告されていなかった。発明の開示

本発明は、力ルバ環状ホスファチジン酸誘導体について癌細胞の浸潤抑制作用を検討することにより、新規な癌転移抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。

本発明者らは、小林らにより確立された方法 (Kobayashi, S. ,他， Tetrahedron Letters 34, 4047-4050 (1993) ) によって化学合成された 11種類の cPA誘導体について、 in vitro浸潤アツセィ系における血清 · LPA依存性の浸潤に対する影響を検討した（以下の実施例 1 )。その結果、 Pal- cPAよりも 10〜： 100倍強い浸潤抑制活性を示す cPA誘導体を見いだし、これらについて、 LPA非依存性の浸潤に対する影響を調べた（以下の実施例 2 )。最後に、 cPA誘導体による浸潤抑制活性の作用機作について、検討を行った（以下の実施例 3 )。その結果、力ルバ環状ホスファチジン酸誘導体が癌細胞浸潤抑制活性を有することを実証し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明によれば、一般式（I )：

〇

CH₂ -〇一 C— R 。

CH₂-CH₂ 〇M

(式中、 Rは、炭素数 1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数 2〜30 の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基、又は炭素数 2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これらの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。 Mは、水素原子又は対カチオンである。）

で示される化合物を有効成分として含む、癌転移抑制剤が提供される。本発明の特に好ましい態様では、一般式（I) において Rは、 _C₁₅H₃₁、一 (CH₂) ₇CH=CHC₆H₁₃、又は一（CH₂) ₇ CH= CHC ₇である。本発明の特に好ましい態様では、癌細胞の浸潤を抑制することにより癌の転移を抑制する癌転移抑制剤が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、治療的有効量の上記一般式（I) で示される化合物をヒトを含む哺乳動物に投与することを含む、癌の転移を抑制する方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、上記一般式（I ) で示される化合物の、癌転移抑制剤の製造における使用が提供される。図面の簡単な説明

図 1は、 LPA、 PHYLPA、及び cPAの構造を示す図である。

図 2は、化学合成された cPA誘導体の構造を示す図である。

図 3は、 In vitro浸潤アツセィ系を示す図である。

(a ) In vitro浸潤ァッセィの方法。コンフルェントな状態まで培養した単層正常細胞層に、癌細胞を重層培養し、一定時間後に細胞を固定し、位相差顕微鏡下で観察した。

(b) 浸潤した細胞の、位相差顕微鏡による観察像。矢印で示したものが浸潤した癌細胞（謹 1)。

図 4は、 FBSで誘導した浸潤に対する cPA誘導体の効果を示す図である。

10%FBS存在下で 1 X 10⁵cells/mlの MM1細胞に 25 M の cPA誘導体を添加し、 in vitro浸潤ァッセィを行つた。 cPAによる浸潤抑制作用を、コント口ールに対する割合（％) で示した。

図 5は、 LPAで誘導した浸潤に対する cPA誘導体の効果を示す図である。

25 μΜ LPA存在下で 1.5X10⁵cells/mlの MM1細胞に 25μΜ の cPA誘導体を添加し、 in vitro浸潤ァッセィを行つた。 cPAによる浸潤抑制作用を、コント口ールに対する割合（％) で示した。図 6は、 Carba- cPA の化学合成の経路を示す図である。図中の番号は、実施例

1の（1-2)に記載した合成の説明中の数字に一致する。

図 7は、 LPAで誘導した浸潤に対する carba-cPAの効果を示す図である。

25 /i M LPA存在下で 1. 5 X 10⁵cells/mlの MM1細胞に、 0. 5 μ M、 1 M、 10 μ Mの carba-cPAを添カ卩し、 in vitro浸潤アツセィを行った。 carba- cPAによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％) で示した。

図 8は、匿 1細胞の増殖に対する cPAの効果を示す図である。

10%FBS存在下で 1 X 10 cells/mlの丽 1細胞に 12. 5 μ M、 25 μ Μの cPA を添カ卩して培養し、 24時間後、 72時間後の細胞数を力ゥントした。

図 9は、 HT- 1080細胞の浸潤に対する cPAの効果を示す図である。

血清 . LPA非存在下で 2 X 10⁵cells/mlの HT- 1080細胞に、 10 μ Μ の cPA を添加し、 in vitro浸潤ァッセィを行つた。 cPAによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％) で示した。

図 1 0は、 LPAで誘導した浸潤に対する cAMP上昇試薬の効果を示す図である。 25 μ Μ LPA存在下で 1. 5 X 10⁵cells/mlの腿 1細胞に、細胞内 cAMP濃度を上昇させる試薬を図中に示した濃度で添加し、 in vi ro浸潤アツセィを行った。それらによる浸潤抑制作用を、コントロールに対する割合（％) で示した。

図 1 1は、細胞内サイクリック AMPに対する cPAの効果を示す図である。

25 /z M cPAを匿 1細胞に添加して一定時間後に反応を止め、細胞内 cAMP濃度を測定した。

図 1 2は、 B16 melanoma血行性肺転移モデルを用いた B16 melanomaの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体 cPA- 19及び cPA- 20の抑制作用を調べた実験における各試験群における体重の推移を示す。

図 1 3は、 B16 melanoma血行性肺転移モデルを用いた B16 melanomaの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体 cPA- 19及び cPA- 20の抑制作用を調べた実験において肺における転移結節数の結果を示す。図 1 4は、 B16 melanoma血行性肺転移モデルを用いた B16 melanomaの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体 cPA- 19及ぴ cPA-20の抑制作用を調べた実験において病理組織学的検査の結果を示す。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお、本明細書で使用する略号の説明を以下に記載する。

Ara- ァラキン酸， 20: 0

BSA ゥシ血胄ァ /レブミン

Bt₂cAMP ジブチリルサイクリック AMP

cAMP アデノシン 3' , 5， -サイクリックホスフェート

CBM カノレバモイル

cPA サイタリックホスファチジン酸

CTX コレラ毒素

DHA ドコサへキサェン酸

EPA エイコサヘンタエノン酸 (eicosapentaenoic acid)

FBS 胎児ゥシ血清

IBMX 3 -ィソブチル -1 -メチルキサンチン

Lau - ラウリン酸， 12 : 0

LPA リソホスファチジン酸

MEM 最小必須培地

Ole- ォレイン酸， 18： 1

Pal- パルミチン酸， 16: 0

厶 Pal- パルミトレイン酸， 16: 1

PBS リン酸緩衝生理食塩水

TCA 卜リクロロ酢酸

本発明の癌転移抑制剤は、一般式（I ) ：〇

CH₂-〇一 C一 R

CH₂-CH₂ 〇M

(式中、 Rは、炭素数 1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基、炭素数 2〜30 の直鎖状若しくは分岐状アル 01ケニル基、又は炭素数 2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基であり、これら Hの基はシクロアルカン環又は芳香環を含んでいてもよい。 Mは、水素原子又は対カチオ〇ンである。）

/ノ

で示される力ルバ環状ホスファチジン酸誘 1、導体を有効成分として含む。

一般式（I ) において、置換基 Rが示す炭〇素数 1〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキル基の具体例としては、例えば、メチル基、ェチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、へキシル基、ヘプチル基、ォクチル基、ノニル基、デシル基、ゥンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、へキサデシル基、ヘプタデシル基、ォクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基などが挙げられる。

置換基 Rが示す炭素数 2〜 3 0の直鎖状若しくは分岐状アルケニル基の具体例としては、例えば、ァリル基、プテュル基、ォクテュル基、デセニル基、ドデカジェニル基、へキサデカトリェニル基などが挙げられ、より具体的には、 8—デセニル基、 8—ゥンデセニル基、 8 -ドデセニル基、 8—トリデセニル基、 8— テトラデセニル基、 8—ペンタデセニル基、 8—へキサデセニル基、 8—へプタデセニル基、 8—ォクタデセニル基、 8—ィコセニル基、 8—ドコセニル基、へプタデ力一 8， 1 1ージェニル基、ヘプタデ力一 8， 1 1， 1 4—トリェニル基、ノナデカー 4 , 7 , 1 0， 1 3—テトラェニル基、ノナデ力一 4， 7 , 1 0 , 1 3 , 1 6—ペンタエ二ノレ基、へニコサ一 3 , 6， 9， 1 2， 1 5 , 1 8—へキサ工ニル基などが挙げられる。

置換基 Rが示す炭素数 2〜30の直鎖状若しくは分岐状アルキニル基の具体例としては、例えば、 8—デシニル基、 8—ゥンデシニル基、 8—ドデシニル基、 8 一トリデシニル基、 8—テトラデシニル基、 8 ^ンタデシニル基、 8—へキサデシニル基、 8 —へプタデシニル基、 8—ォクタデシニル基、 8—^ f コシニル基、 8—ドコシ二ノレ基、ヘプタデ力一 8， 1 1ージィニル基などが挙げられる。

上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうるシクロアルカン環の具体例としては、例えば、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロへキサン環、シクロオクタン環などが挙げられる。シクロアルカン環は、 1個以上のへテロ原子を含んでいてもよく、そのような例としては、例えば、ォキシラン環、ォキセタン環、テトラヒドロフラン環、 N—メチノレプロリジン環などが挙げられる。

上記のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基に含有されうる芳香環の具体例としては、例えば、ベンゼン環、ナフタレン環、ピリジン環、フラン環、チォフェン環などが挙げられる。

従って、置換基 Rがシクロアルカン環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、例えば、シクロプロピルメチル基、シクロへキシルェチル基、 8， 9ーメタノペンタデシル基などが挙げられる。

置換基 Rが芳香環によって置換されたアルキル基である場合の具体例としては、ベンジル基、フエネチル基、 p—ペンチルフエエルォクチル基などが挙げられる。一般式 (I)で示される環状ホスファチジン酸（cPA) 誘導体中の Mは、水素原子又は対カチオンである。 Mが対カチオンである場合の例としては、例えば、アルカリ金属原子、アルカリ土類金属原子、置換若しくは無置換アンモユウム基が挙げられる。アルカリ金属原子としては、例えば、リチウム、ナトリウム、力リウムなどが挙げられ、アルカリ土類金属原子としては、例えば、マグネシウム、力ルシゥムなどが挙げられる。置換アンモニゥム基としては、例えば、ブチルアンモニゥム基、トリェチルアンモニゥム基、テトラメチルアンモニゥム基などが挙げられる。

本発明において有効成分として用いる一般式（I ) で示される化合物は文献記載の方法 (Kobayashi, S. ,他， Tetrahedron Letters 34, 4047-4050 (1993) ；並びに「日本薬学会第 2 3回反応と合成の進歩シンポジウム 1 9 9 7年 1 1月 1 7 , 1 8 0 (熊本市民会館）環状ホスファチジン酸および力ルバ体誘導体の合成と生理作用、要旨集ページ 1 0 1— 1 0 4」）に準じて合成することができる。具体的な合成経路の一例を図 6に示す。

図 6においては、先ず、市販の（R) -ベンジルグリシジルエーテル（1)を BF₃ . Et₂0 で活性化させ、メチルホスホン酸ジメチルエステルに n - BuLiを作用させて得られるリチォ体を反応させることでアルコール (2)を得る。

得られたアルコールを、トルエン中で過剰の p-トルエンスルホン酸のピリジニゥム塩を用いて 80°Cで反応させることにより、環化体 (3)を得る。この環化体を、水素雰囲気下で 20% Pd (0H) ₂-Cを用いて加水素分解し、脱ベンジル化を行う（4)。縮合剤として 1-ェチル -3 -（3-ジメチルァミノプロピル）カルポジィミド塩酸塩を用いて、脂肪酸と反応させてカツプリング体（5)を得る。次に、求核剤としてプロモトリメチルシランを用いて、メチル基だけを位置選択的に除去し、環状ホスホン酸（6)を得る。これをエーテルを用いて分液ロートに移しこみ、少量の 0. 02N の水酸化ナトリゥム水溶液を滴下して、分液操作を行い、ナトリゥム塩 (7)として目的化合物を抽出、精製する。

本発明は、新規な癌転移抑制剤に関する。

癌の転移は癌細胞の原発巣からの離脱に始まり、細胞外マトリッタスの破壌、血管内への侵入、血管内皮細胞層を越えての浸潤、遠隔臓器での接着、増殖という多段階の過程をとる。これらの過程には種々の因子が関与しており、それらの阻害物質が新しい癌転移抑制剤として注目されている。中でも、浸潤は転移という現象の最も特徴的なステップであり、癌細胞の浸潤抑制する物質の中から優れた制癌剤が開発される可能性は極めて高いと考えられる。本発明は、癌細胞の浸潤抑制剤として使用できる新規な癌転移抑制剤を提供するものである。

本発明における癌転移とは、癌細胞がある場所から他の臓器、器官等に移動，増殖すること、即ち、癌細胞が原発巣から離れた部位に移動して癌が形成されることを意味し、血行性及ぴリンパ行性の両方を含む。

本発明の癌転移抑制剤により転移を抑制するべき癌の種類は特には限定されず、良性腫瘍及び悪性腫瘍の全てを包含する。転移抑制される癌の具体例としては、悪性黒色腫、悪性リンパ腫、消化器癌、肺癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、結腸癌、尿管腫瘍、胆嚢癌、胆管癌、胆道癌、乳癌、肝臓癌、勝臓癌、睾丸腫瘍、上顎癌、舌癌、口唇癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、甲状腺癌、脳腫瘍、力ポジ肉腫、血管腫、白血病、真性多血症、神経芽腫、網膜芽腫、骨髄 J3重、膀胱腫、肉腫、骨肉腫、筋肉腫、皮膚癌、基底細胞癌、皮膚付属器癌、皮膚転移癌、皮膚黒色腫などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

癌はその種類により、転移しやすい臓器は少しずつ異なり、例えば、乳癌は肺、肝、骨、リンパ節に、胃癌では肝、肺、骨、副腎に、そして大腸癌では肝、肺、副腎などに高率に転移することが知られている。転移癌の例としては、転移性肝癌、転移性空腸癌、転移性骨腫瘍、転移性脳腫瘍、転移性肺腫瘍、皮膚転移癌、転移性肋骨 Jffi瘍、転移性卵巣癌等がある。従って、本発明の癌転移抑制剤は、このような癌転移を抑制するために使用することができ、特に、術後の転移抑制剤として有用な薬剤である。また、本発明の癌転移抑制剤は、臨床的には癌再発抑制剤でもあり、患者の生存期間を延長し、生存率を高めることが期待される。

本発明の癌転移抑制剤は、既知の化学療法、外科的治療法、放射線療法、温熱療法や免疫療法などと組み合わせて用いることができる。特に、本発明の癌転移抑制剤は、既知の抗腫瘍剤および Zまたは癌転移抑制物質との併用により、さらに癌転移抑制効果を高めることができる。本発明の癌転移抑制剤を併用することにより、投与すべき既知の抗腫瘍剤およびまたは癌転移抑制物質の量を減量することができ、これにより、これらの薬物により引き起こされる副作用（白血球減少、血小板減少、出血、貧血、食欲不振、悪心、嘔吐、口内炎、下痢、発疹、脱毛、皮膚の色素沈着、発熱、倦怠感、頭痛、肝機能障害、蛋白尿、浮腫、過敏症等）を低減することができる場合がある。本発明の癌転移抑制剤は、 1又は 2以上の製剤学的に許容される製剤用添加物と有効成分である一般式（I ) で示される化合物とを含む医薬組成物の形態で提供することが好ましい。

本発明の癌転移抑制剤は、種々の形態で投与することができ、経口投与でも非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、皮下又は皮内等への注射、直腸内投与、経粘膜投与など）でもよい。経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、散剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤などを挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、経皮吸収剤などを挙げることができるが、本発明の薬剤の剤形はこれらに限定されることはなレ、。さらに、公知の技術によって持続性製剤とすることもできる。本発明の薬剤の製造に用いられる製剤用添加物の種類は特に限定されず、当業者が適宜選択可能である。例えば、賦形剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、基剤、溶解剤又は溶解補助剤、分散剤、懸濁剤、乳化剤、緩衝剤、抗酸化剤、防腐剤、等張化剤、 PH調節剤、溶解剤、安定化剤などを用いることができ、これらの目的で使用される個々の具体的成分は当業者に周知されている。

経口投与用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物として、例えば、プドウ糖、乳糖、 D-マンニトール、デンプン、又は結晶セルロース等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、デンプン、又はカルボキシメチルセルロースカルシゥム等の崩壊剤又は崩壌補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビュルピロリドン、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードフアット等の基剤を用いることができる。

注射あるいは点滴用の製剤の調製に用いることができる製剤用添加物としては、注射用蒸留水、生理食塩水、プロピレングリコール等の水性あるいは用時溶解型注射剤を構成しうる溶解剤又は溶解補助剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、 D- 二トール、グリセリン等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等の pH調節剤等の製剤用添加物を用いることができる。

本発明の薬剤はヒトを含む哺乳動物に投与することができる。

本発明の薬剤の投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、及ぴ投与経路などの条件に応じて適宜増減されるべきであるが、一般的には、成人一日あたりの有効成分の量として 1 / gZk gカゝら 1， 00 Omg/k g程度の範囲であり、好ましくは 10 /i g/k gから 10mg/k g程度の範囲である。上記投与量の薬剤は一日一回に投与してもよいし、数回（例えば、 2〜4回程度）に分けて投与してもよい。

本出願の優先権主張の基礎となる出願である特願 2001— 150685号の明細書に開示した内容は全て引用により本明細書に開示したものとする。

以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されることはない。実施例

実施例 1 ： cPA誘導体の合成とそれらによる癌細胞浸潤抑制

(1-1) 種々の cPA合成誘導体による癌細胞浸潤抑制

(A) 材料及び方法

cPA誘導体の化学合成

11 種類の cPA 合成誘導体は、 Kobayashi, S.，他， Tetrahedron Letters 34, 4047-4050 (1993)に記載された方法に従って合成された。現在、 20種類の cPA 誘導体が合成されている。そのうち、本研究で用いなかった cPA誘導体の浸潤抑制活性については、既に向井らによって調べられており、その結果、 Pal - cPA は約 85%、 01e-cPAは約 60。ん PHYLPA、 APal- cPA、 Lau- cPA、 Ara-cPAは 50%前後、 LPA 誘導性の浸潤を抑制していた（Mukai, M. ,他， Int. J. Cancer 81， 918-922 (1999))。今回用いた cPA誘導体の構造を、図 2に示した。細胞培養

300gのォスのドンリューラット（日本生物材料）を無菌的に開腹し、それから得た腸間膜を、 37°Cで 15分間、 0. 25%トリプシン処理し、 150 iz mのステンレスメッシュで濾過、遠心して中皮細胞を回収した。 2倍量のイーグル MEMアミノ酸ビタミン培地（ニッスィ）を添加したイーグル MEM1 (エツスィ）に、 10%FBSを加えたメディゥムで、 37°C、 5%C0₂の条件下で培養した。一週間培養してコンフルェントまで育った単層の中皮細胞を、浸潤アツセィに用いた。

ラット腹水肝癌細胞（AH- 130) の高浸潤性クローンである丽1細胞は、向井らによって確立され (Int. J. Cancer： 81, 918-922 (1999) ) , 中皮細胞と同様の条件下で培養した。

In vitro浸潤アツセィ

in vitro浸潤ァッセィは、明渡らにより開発された (Akedo, H. ,他， Cancer Res. 46, 2416-2422 (1986) )。コンフルェントになるまで育てた中皮細胞層に、 10%FBS、または 25 M LPA (SIGMA) 存在下で、丽 1細胞を重層培養し、 25 // M cPAを添加した。 37°C、5%C0₂の条件下で 20時間培養したのち、 10%ホルマリンで固定して、位相差顕微鏡下で、浸潤した應1細胞のコロニーをカウントした（図 3 )。

cPA及ぴ LPAは、 0. 1% fatty-acid free BSA (SIGMA) を含む PBS中で氷冷して超音波処理し、ェマルジョン化して、一 20°Cに保存したものを使用した。

(B ) 結果及び考察

11種類の cPA誘導体による癌細胞浸潤抑制

いくつかの cPA誘導体のうち、 Pal- cPAが FBS誘導性、 LPA誘導性のいずれの浸潤をも強く抑制することが明らかになつている（Mukai, M.，他， Int. J. Cancer 81, 918 - 922 (1999) )。 cPA の構造と、浸潤抑制の強さの関連を調べるために、 Pal-cPAを含む化学合成した 11種類の cPA誘導体の癌細胞浸潤への影響を調べた。

10%FBS存在下で浸潤ァッセィを開始して 20時間後に細胞を固定し、浸潤したコロニーをカウントしたところ、 Pal - _CPA以外に 5種類の 25 μ Μ cPA誘導体について、 50%を越える浸潤抑制が見られた（図 4 )。この 5種類について、さらに LPA 誘導性の浸潤に対する影響を調べた（図 5 )。その結果、グリセロール骨格 1位に結合する脂肪酸種の違いによる浸潤抑制活性の差が見いだされた。 sn - 1位に EPA を持つ cPA- 12によって、 FBS誘導の浸潤は約 70%抑制されたが、 LPA誘導の浸潤は抑制されなかった。このことから、 FBS中には、 LPA以外の浸潤促進因子が含まれ、 cPA-12はその因子に誘導される浸潤を抑制している可能性が考えられる。このことは、 10%FBSあるいは 25 / M LPAにより、丽 1細胞の浸潤が同程度に誘導されるが、 10%FBSを含む培地中の LPA濃度はその 1/10程度である事とも一致する。さらには、 cPA による浸潤抑制作用が、その脂肪酸種によって特異性を付与されていることが示され、この構造一活性相関についてはさらに検討する必要があろう。また、環状リン酸基の開環を防ぐためにデザインされた、 sn- 3位の Oを Cに置き換えた carba- cPAによって、強い浸潤抑制活性が観察された。

また、丽1細胞のみ cPAで前処理し、メディゥムで洗ってから LPA存在下で中皮細胞に重層した場合にも、浸潤抑制活性は失われなかったこと、また、中皮細胞のみを cPAで前処理し、洗浄後に LPA存在下で丽 1細胞を重層した場合に明らかな浸潤が見られたこと力、ら、 cPAは中皮細胞ではなく、 MM1細胞に影響していることが示された。

(1-2) Carba-cPAによる癌細胞浸潤抑制

(A) 材料及び方法

Carba-cPAの合成

Carba-cPA の合成法は、東京理科大学薬学部、小林進によって開発された。以下の文中の数字は、図 6の図中の番号と一致する。

市販の（R) -ベンジルグリシジルエーテル（1)を BF₃ · Et₂0で活性化させ、メチルホスホン酸ジメチルエステルに n - BuLi を作用させて得られるリチォ体を反応させることでアルコール（2)を得た。得られたアルコールを、トルエン中で過剰の P-トルエンスルホン酸のピリジニゥム塩を用いて 80°Cで反応させることにより、環化体 (3)を得た。この環化体を、水素雰囲気下で 20% Pd (0H) ₂- Cを用いて加水素分解し、脱べンジル化を行った（4)。縮合剤として 1 -ェチル- 3- (3-ジメチルァミノプロピル）カルポジィミド塩酸塩を用いて、脂肪酸と反応させてカツプリング体 (5)を得た。次に、求核剤としてブロモトリメチルシランを用いて、メチル基だけを位置選択的に除去し、環状ホスホン酸 (6)を得た。これをエーテルを用いて分液ロートに移しこみ、少量の 0. 02Nの水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、分液操作を行い、ナトリウム塩 (7)として抽出、精製した。

低濃度の carba- cPAを用いた in vitro浸潤ァッセィ

丽 1細胞に 0. 5 μ Μ、 1 μ Μ、 10 Μの carba- cPAを添加し、 25 /i M LPA存在下で 1-1と同様に in vitro浸潤ァッセィを行つた。

匿 1細胞の増殖に対する carba-cPAの影響

10%FBSを含むメディウムに、 12. 5 μ M、 25 μ Mの cPAを添加し、 37°C、 5%C0₂の条件下で 24時間、 72時間培養した匪 1細胞の細胞数を、血球計算盤を用いて力

( B ) 結果及び考察

低濃度の carba - cPAによる癌細胞浸潤抑制

脂肪酸種による抑制活性の差を見るために、低濃度の carba- cPAを添カ卩して浸潤アツセィを行った（図 7 )。

天然体 cPAでは、 sn- 1位にパルミチン酸の結合したものが最も強く浸潤を抑制したが、 carba- cPAでは、パルミチン酸が結合した cPA-18よりも、ォレイン酸の結合した cPA- 19、パルミトォレイン酸の結合した cPA- 20の方が、強い浸潤抑制活性を示した。

丽 1細胞の増殖に対する carba- cPAの影響

図 8に示したように、 sn- 1位にパルミチン酸の結合した cPAは、天然体（cPA- 5) も carba体（cPA- 18) も丽1細胞の増殖には影響しなかった。一方、より強い浸潤抑制活性を示した carba- Ole- cPA (cPA- 19)、 carba- Δ Pal-cPA (cPA- 20) は、増殖抑制作用をも示した。天然体でも Ole- cPA、 A Pal- cPAがいずれも増殖抑制作用をもつ事が示されているが、これらの分子種の浸潤抑制作用は弱いことが、向井らにより報告されている (Mukai, M. ,他, Int. J. Cancer 81, 918-922 (1999) )₀ 従って、脂肪酸の種類による細胞増殖への影響と、浸潤抑制作用とは、おそらく独立した現象であると考えられる。 ² 実施例 2 ：血清 . LPAに依存しない癌細胞の浸潤に対する cPAの効果

(A) 材料及び方法

細胞培養

ヒト繊維肉腫細胞である HT - 1080 細胞は、向井らにより確立され (Int. J. Cancer： 81, 918-922 (1999) )、 1/100量の非必須ァミノ酸溶液 (GIBCO BRL) を添加したイーグル MEM1 (ニッスィ）に、 10%FBSを加えたメディゥムで、 37° (：、 5%C0₂の条件下で培養した。

In vitro浸潤：

HT-1080細胞を、 0. 05%トリプシン処理によって回収し、無血清培地で洗浄後、血清 · LPA非存在下で第 1章に示したのと同様なァッセィを行い、 4時間後に細胞を固定し、浸潤した細胞をカウントした。

HT-1Q80細胞の培養上清を用いた麗1細胞の in vitro浸潤ァッセィ

HT- 1080細胞のメディウムを無血清培地に換えて、 37°C、 5%C0₂の条件下で 20 時間培養した。このメディウムを回収し、遠心した上清を、培養上清として用いた。この上清を用いて、一度洗った丽 1細胞を懸濁し、段落 0 0 4 3と同様に浸潤アツセィを行った。

(B ) 結果及び考察

血清♦ LPA非依存的な癌細胞浸潤に対する carba-cPAの影響

HT-1080細胞は、 in vitro浸潤アツセィ系において、血清 · LPA非依存的に浸潤する。この現象もまた、 Pal-cPA によって抑制されることが見いだされている

(Mukai, M.，他， Int. J. Cancer 81， 918 - 922 (1999) )。この知見に基づいて、同じ脂肪酸を持つ cPA- 18 (carba- Pal-cPA)を用いて、この細胞の浸潤に対する carba-cPAの影響を調べた。図 9に示したように、 carba- cPAはこの細胞においても、天然体と同程度か、またはそれ以上の強さの浸潤抑制活性を示した。

HT-1080細胞の培養上清が麗1細胞の浸潤に与える影響

HT-1080細胞が自ら LPAを合成し、その LPAによって浸潤が誘導される可能性を考え、 LPA依存的に浸潤する匪 1細胞を HT-1080細胞の培養上清で懸濁し、中皮細胞に重層して、浸潤が起こるか否かを検討した。 HT- 1080 細胞の無血清培養上清で、 1. 5 X 10⁵cells/mlの匿 1細胞を懸濁し、 in vitro浸潤アツセィを行つた結果を表 1に示す。

その結果、 MM1細胞の浸潤は促進されず（表 1 )、また、 HT- 1080細胞を用いた in vi 0浸潤アツセィ系に、 25 μ Μの LPAを添加してみても、浸潤がより促進されることはなかった。これらのこと力、ら、 ΗΤ - 1080細胞の浸潤促進因子は LPAとは別のものであることが示唆された。表 1

添加した培地浸潤細胞の数 / c m

未処理培地 9 7 . 7 ± 3 8 . 4

コンディション培地 7 2 . 2 ± 1 8 . 4

実施例 3 ： cPAによる浸潤抑制のシグナル伝達系の解析

(A) 材料及ぴ方法

細胞内 cAMP濃度を上昇させる試薬の、浸潤に対する影響

cAMP合成酵素であるアデ二ル酸シクラゼを直接活性化する Forskolin(Wako)、アデ二ル酸シクラーゼを活性化する Gタンパク質（G_s) の不活性化を妨げるコレラ毒素（CTX、 Cholera Toxin) (GIBCO BRL)、膜透過性で、細胞内に入って cAMP と同様の働きをする Bt₂cAMP (nacalai tesque) _N cAMP分解酵素であるホスホジェステラーゼを阻害するイソブチルメチルキサンチン（ IBMX、 3-isobutyl-l-methylxanthine) (SIGMA)を、 in vitro浸潤ァッセィ系に添加し、 25 Μ LPA存在下で M1細胞の浸潤に対する影響を調べた。

細胞内 cAMPの測定

無血清培地中の MM1細胞を lmMの IBMXで 10分間前処理した後、 25 /x Mの LPA または cPA、ポジティブコントロールとして、浸潤を抑制することが確認された ΙΟ μ Μの Forskolinを添カ卩し、一定時間後、 10%永冷 TCAを加えて反応を止めた。遠心した上清を、 water- saturated diethyletherで 4回洗って TCAを除き、 60°C の窒素ガス流下で溶媒を全てとばし、得られたサンプル中の cAMPを、 Cyclic AMP

[³H] assay system (Amersham) を用いて測定した。

(B ) 結果と考察

細胞内 cAMP濃度の上昇が、癌細胞の浸潤に与える影響

細胞内 cAMP濃度の上昇が、 cAMP- dependent protein kinase Aの活性化を介して低分子量 Gタンパク質の一つである Rhoの活性を阻害することが知られている

(Laudanna, C.，他, J. Biol. Chem. 272, 24141-24144 (1997)；及び Dong, J- M.，他， J. Biol. Chem. 273, 22554 - 22562 (1998) )。また、 Pal-cPAが、 MM1細胞の細胞内 cAMP 濃度の上昇を導くことが報告されている（Mukai，M.，他， Int. J. Cancer 81, 918 - 922 (1999) )。このことから、 Rhoを介することが明らかになつている LPA 誘導性の浸潤に対する cAMPの影響を調べた。

図 1 0に示したように、どの試薬によっても、癌細胞の浸潤は抑制された。このこと力、ら、このうちの一つ、 Forskolinをポジティブコントロールとして用い、 carba-cPA添加による細胞内 cAMP濃度の変化を測定し、その浸潤抑制活性への関与を検討した。

Carba-cPAの、細胞内 cAMP濃度に対する影響

図 1 1に示したように、 Forskolinによる cAMP濃度の上昇が測定できているにも関わらず、以前に報告されているような、 Pal - cPAの添加による cAMP濃度の早い上昇を確認、することができなかった。また、 carba - Pal - cPA の添加によっても結果は同様だった。しかし、同じ細胞で、 LPAによって浸潤は誘導され、 Pal-cPA によってその浸潤は抑制されることから、 cAMPを介さなレ、、別の浸潤抑制機構の存在が示唆された。

(実施例 1〜3のまとめ）

実施例 1では、種々の cPA誘導体を用いて in vitro浸潤アツセィを行った。最初に、血清誘導性の浸潤に対する cPAの影響を調べたところ、図 4に示したように、構造の違いによる浸潤抑制活性の差が見られた。このうち、 25 μ Μ添加することによって 50%を越える浸潤抑制を示す、 Pal-cPA を含む 6種類の cPA誘導体について、 LPA誘導性の浸潤に対する影響を調べた（図 5 )。血清誘導性の浸潤を約 70%抑制した、 sn- 1位に EPAを有する cPA- 12は、 LPA誘導性の浸潤を抑制しなかった。このことから、血清中に LPA以外の浸潤促進物質が存在する可能性が示唆された。さらに、環状リン酸基の開環を防ぐためにデザインされた、 sn- 3位の 0を Cに置き換えた carba- cPAによる、浸潤抑制活性が見いだされた。この活性は非常に強く、天然体の 10〜： 100倍ほどであった（図 7 )。

実施例 2では、この carba - cPAに注目し、浸潤に血清 · LPAを必要としない癌細胞を用いて、その浸潤に対する carba- cPAの効果を調べた。図 9に示したように、 LPA非依存性の浸潤においても、 carba-cPAによる、天然体 cPAと同様な強い浸潤抑制活性がみられた。

さらに実施例 3では、 carba-cPA による浸潤抑制の作用機作の解析を行った。 LPAが低分子量タンパク質の一つである Rhoの活性化を介して浸潤を促進すること、また、 Pal - cPAの添加によつて細胞内 cAMP濃度が上昇し、さらに Rhoの活性が抑制されることから、 carba - cPAによっても細胞内 cAMP濃度が上昇し、その結果として浸潤が抑制される可能性を考え、細胞内 cAMP濃度の測定を行った（図 1 1 )。しかし、ポジティブコントロールである Forskolinによる cAMP濃度の上昇が測定されているにもかかわらず、 Pal- cPAによる cAMP濃度の上昇を確認することができなかった。さらに、 carba- Pal-cPAによっても cAMP濃度の変化は見られなかった。 Pal - cPAについて、再現性がみられないことについては、腹 1細胞が変化してしまった可能性が考えられる。しかし、この細胞においても血清 · LPA による浸潤誘導、さらに Pal-cPAによる浸潤抑制は見られることから、 cAMPを介さない、別の浸潤抑制の系の存在が示唆された。実施例 4 ： B16 melanoma血行性肺転移モデルを用いた B16 melanomaの肺転移に対する環状ホスファチジン酸誘導体 cPA- 19及ぴ cPA- 20の抑制作用

(試験材料及ぴ方法）

1 . 被験物質、媒体及び陽性対照物質

被験物質として cPA - 19 及び cPA- 20 を使用した。媒体として、 Albumin, Bovine Lessentially Fatty Acid Free] (BSA, Lot No. 89H7604, Sigma chemical company)を Ca²⁺及ぴ Mg²⁺を含まない PBS (pH 7. 2)により溶解して調製した 0. lw/v% BSA/PBS を使用した。調製後、フィルター（0. 22 )11， Millipore)により濾過滅菌した。用時調製した。陽性対照物質として cPA- 5を使用した。

2 . 混合物調製法及び頻度

被験物質又は陽性対照物質に対して必要量の媒体を加え、超音波処理により溶解し、 0. 16 mg/mL溶液を調製した。さらに被験物質では 0. 16 mg/mL溶液を媒体により希釈し、 0. 08及び 0. 02 mg/mL溶液を調製した。混合物質はいずれも用時調製した。

3 . 試験系及び試験系の環境条件

日本チヤ一ルス.リバ一株式会社よりマウスを購入した。系統は C57BL/6NCrj、性別は雌、入荷動物数は 6 0匹、入荷時週齢は 4週齢、体重範囲は 10. 2〜14. 0g であった。試験系の環境条件は以下の通りである

温度： 23〜26°C、湿度： 54〜60°C、換気回数： 13回時、照明： 12時間（午前 7 時〜午後 7時）、飼料：固型飼料 CRF-1 (オリエンタル酵母工業株式会社）を高圧蒸気滅菌して自由に摂取させた。飲水：次亜塩素酸ナトリウムを添カ卩した井戸水（残留塩素濃度約 2 ppm)を給水瓶で自由に摂取させた。床敷：ホワイトフレーク（日本チヤ一ルス ·リバ一株式会社）を高圧蒸気滅菌して使用した。飼育ケージ及び交換頻度：高圧蒸気滅菌したポリカーポネィト製ケージ (W215 XH140 XD320 mm)を使用し、床敷と同時に 1週間に 2回交換した。ケージ収容動物数：検疫馴化期間においては 1ケージ当たり 5匹、試験期間においては 1ケージ当たり 3匹収容した。洗浄及び消毒：飼育室の清掃を毎日行い、床を消毒液で清拭した。

4 . 試験方法

4 . 1 腫瘍細胞の名称

腫瘍細胞としてマウス悪性黒色腫 B16 - F0を使用した。大日本製薬株式会社より購入した。

4 . 2 培養

培養は 10% Feral bovine serum及びカナマイシン含有のダルベッコ変法ィーダル培地を使用した。 37°C、 5 %C0₂に設定した C0₂インキュベーター内で、 95% 湿度条件下で静置培養した。腫瘍細胞がセミコンフルェントの状態に達した後、 0. 25%トリプシン- 0. 02%EDTA混合液により細胞をハーべストした。培地を加えトリプシンの作用を停止させるとともにビベッティングを行い、細胞浮遊液を調製した。培養用培地により 1/10に希釈して、移植に十分な量となるまで継代した。 4 . 3 移植用腫瘍細胞浮遊液の調製

継代法と同じ手法により、細胞浮遊液を調製した。即ち、 Ca²⁺及び Mg²⁺を含まな V、リン酸緩衝液 [PBS (-) ]により細胞を洗浄した後、回収した細胞を 10mL PBS (-）に懸濁し、細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液の細胞数を計測し、全細胞数とした。 50 μ Lの細胞懸濁液、 100 μ Lの 0. 4%トリパンブルー液及ぴ 100 μ Lの PBS (-）を混合し、生細胞数を計測した。生細胞数及び全細胞数より細胞の生存率を算出した。これらの結果をもとに、生細胞数を 1 X 10⁷cells/mL に調整し、移植用の腫瘍細胞浮遊液を調製した。

4 . 4 投与被験物質投与日の体重を基に、層別連続無作為化法により下記の表 2に示す 8 試験群に群分けした。表 2

以前の試験の結果より、 .被験物質及ぴ陽性対照物質は B16マウス悪性黒色腫の増殖抑制作を示さないことが判明している。よって媒体、被験物質又は陽性対照物質を B16- F0細胞浮遊液と 1： 1の割合で混合し、この混合液を尾静脈内に投与した。移植細胞数は 5 X 10⁵cells/bodyであった。被験物質の用量は 0. 001, 0. 004 もしくは 0. 008 mg/bodyであり、陽性対照物質の用量は 0. 008 mg/bodyであった。 4 . 5 一般状態の観察及び体重測定

被験物質投与後 14日までを観察期間とした。この間に毎日生死の確認を行レ、、一般状態を観察した。週 2回体重測定を行った。

4 . 6 剖検

被験物質投与後 14日に、イソフルラン麻酔下にて腹大静脈後部より採血を行つた。放血致死後、胸腔内及び腹腔内の転移結節の有無を確認した。肺を摘出し、 10%中性緩衝ホルマリン溶液にて固定後、肺転移結節数を実体顕微鏡下 (倍率： 10 倍)にて計測した。

4 . 7 病理組織学的検查

肺転移結節数を計測後、標本をパラフィン包埋し、薄切切片を作製した。これらの切片よりへマトキシリン ·ェォジン染色標本を作製したのち、左葉及び後葉の一定部位において、転移巣の数を計測し、大きさにより分類した。大きさは転移巣の長径において 40倍の対物レンズ径 (0. 65腿）を基準として 0. 65腿未満のものを小型とし、 0. 65 mm以上 1. 30 腿未満のものを大型として分類した。また、転移巣に対するリンパ球の浸潤の程度を定性的に確認した。

5 . 統計学的解析処理方法

各試験群の代表値は、平均値土標準偏差 (mean土 S. D. )で表示した。平均値の差の検定は、転移結節数については媒体群と cPA - 19群との間、及ぴ媒体群と cPA- 20 群との間で Dunnett， s multiple comparison test (Dunnettの多重比較検定）により行い、媒体群と cPA - 5群との間で Studentの T一検定により検定を行った。転移巣数については媒体群を対照として、 Wilcoxon test により検定を行った。転移結節又は転移巣を有する個体数については媒体群を対照として Fisher' s extract probability test (Fisherの抽出可能性検定）により検定を行った。有意水準は 1及び 5 %とした。

(結果）

1 . 一般状態

全試験群において、観察期間中の死亡例はみられなかった。また、一般状態に異常は認められなかった。

2 . 体重の推移（図 1 2、表 3 )

各試験群における体重の推移を図 1 2およぴ表 3に示す。表 3 ： B16-F0メラノ一マ担持マゥスの体重に対する cPA - 19又は cPA-20の影響体重 (g)

N

(rag/body) 0曰目 4曰百 7曰目 1曰目 14曰百

6 16.0±0.5 15.7±0.8 16.1±1.1 16.9±1.2 17·3±1.2 cPA-19 0.001 6 15·9±0.6 15.5±0.5 15.8±0.7 16.5±1.0 17.1±1.2 0.004 6 15.9±0.6 16.0±0.5 16.1±0.6 16.7±0.6 17.6±0.9 0.008 6 15.9±0.6 15.4±0.5 15.9±0.5 16.8±0.5 17.0±0.4 t

cPA-20 0.001 6 15.9±0.6 15.5±0.3 16.1±0.6 16.8±0.4 17.4±0.6 0.004 6 16.0±0.6 16.0±0.7 16.2±0.6 16.9±0.7 17.5±0.8 0.008 6 15.9±0.5 16.1±0.8 16.3±0.8 17.0±0.9 17.7±0.8

CPA— 5 0.008 6 15.9±0.6 15.8±0.9 16.2±1.0 17, 0±0.8 17.4±1.0 各値は平均土 S. D.を示す。

溶媒群からの有意差はない

被験物質投与日において、媒体群では 16.0±0.5 gであった。 cPA- 19の 0.001, 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 15.9±0.6， 15.9±0.6及び 15.9 ±0.6gであった。 cPA- 20の 0.001， 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 15.9±0.6， 16.0±0.6及ぴ 15.9±0.5gであった。 cPA - 5群では 15.9±0.6 gであった。被験物質投与後 4日において、媒体群では 15.7±0.8gであった。 cPA-19の 0.001, 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 15.5±0· 5， 16.0 ±0.5及び 15.4±0.5gであった。 cPA- 20の 0.001, 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 15.5±0.3， 16.0±0.7及ぴ16.1±0.8_§でぁった。 cPA - 5群では 15.8±0.9 gであった。被験物質投与後 7日において、媒体群では 16.1±1.1 gであった。 cPA- 19の 0.001, 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 15.8±0.7， 16.1±0.6及び 15.9±0.5gであった。 cPA- 20の 0.001， 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 16.1±0.6, 16.2±0.6及ぴ 16.3±0.8 gであった。 cPA- 5群では 16.2±1.0gであった。被験物質投与後 11日において、媒体群では 16.9±1.2 gであった。 cPA- 19の 0.001, 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 16.5±1.0， 16.7±0.6及び 16.8±0.5 でぁった。 cPA- 20の 0.001, 0.004及ぴ 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 16.8±0.4, 16.9±0.7 及ぴ 17.0±0.9gであった。 cPA- 5群では 17.0±0.8gであった。被験物質投与後 14日において、媒体群では 17.3 ±1.2 gであった。 cPA- 19の 0.001, 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 17.1±1.2, 17.6±0.9及ぴ 17.0±0.4 gであった。 cPA- 20の 0.001, 0.004及び 0.008 mg/body投与群では、それぞれ 17.4 ±0.6, 17.5±0.8及ぴ 17.7±0.8gであった。 cPA- 5群では 17.4±1.0gであった。各測定時点において、体重値を媒体群と比較したところ、 cPA - 19， cPA - 20 及び cPA-5 群では有意差は認められなかった。また、各測定時点の体重値を被験物質投与日の体重値と比較したところ、被験物質投与後 4日において媒体群、 cPA - 19 の 0.001及ぴ 0.008 mg/body投与群、 cPA-20の 0.001 mg/body投与群及び cPA - 5 では一過性の体重減少が認められた。肺転移結節（図 1 3、表 4 )

被験物質投与後 14日に摘出した、肺における転移結節数の結果を図 1 3および 4に示す。

表 4 ：マウスにおける B16- F0 メラノーマの肺転移に対する cPA - 19又は cPA - 20の影響

N 肺腫癌節を有する肺腫瘍節の数

、mg/body) マウスの数 (平均土 S. D. ) (最小ー最 70

6 6 49土 20 28-84 cPA-19 0. 001 6 6 54± 12 37-66

0. 004 6 6 4±2** 2-6 0. 008 6 0土 (Γ 0 cPA-20 0. 001 6 6 58 ±40 17-112

0. 004 6 2^& 1±2«« 0-4 0. 008 6 0-1

CPA - 5 0. 008 6 6 21±13^$ 5-38

&P<0. 05, &&P<0. 01対溶媒群 (Fisherの抽出可能性検定）

**P<0. 01対溶媒群 (Dunnettの多重比較検定）

##P<0. 01対溶媒群 (Dunnettの多重比較検定）

$P<0. 05対溶媒群（Studentの T検定).

転移結節を有する個体数は媒体群では 6例であった。 cPA- 19 の 0. 001， 0. 004 及ぴ 0. 008 mg/body投与群ではそれぞれ 6， 6及ぴ 0例であった。 cPA-20の 0. 001， 0. 004及び 0. 008 mg/body投与群ではそれぞれ 6， 2及び 1例であった。 cPA- 5群では 6例であった。転移結節を有する個体数は、媒体群と比較して cPA- 19の 0. 008 mg/body投与群、 cPA-20の 0. 00 及ぴ 0. 008 mg/body投与群では有意に減少した。転移結節数は、媒体群では 49±20 (最少一最大： 28-84、以下同じ）個であった。 cPA- 19群の 0. 001, 0. 004及ぴ 0. 008 mg/body投与群ではそれぞれ 54土 12 (37-66) , 4 ± 2 (2- 6)及ぴ 0 ± 0 (0)個であった。 cPA- 20群の 0. 001, 0. 004及び 0. 008 mg /body投与群ではそれぞれ 58±40 (17- 112)、 1 ± 2 (0-4)及び 0土 0 (0-1)個であつた。 cPA- 5群では 21 ± 13 (5-38)個であった。肺転移結節数は、媒体群と比較して cPA - 19の 0. 00 及び 0. 008 mg/body投与群 cPA- 20の 0. 004及び 0. 008 mg/body 投与群では有意に減少し、また cPA-5群においても有意に減少した。

4. 剖検 (表 5 )

剖検の結果を表 5に示す。

表 5 ：胸腔内及ぴ腹腔内の転移結節に対する cPA- 19又は cPA- 20の影響群投与量動物胸 S空

(mg/body) 番号脾臓副腎腎臓卵巣陰核腺傍

301

302

303

溶媒一 304

305 -

306 +

307

308

0 001 309

"· ¹ 310

311

312

313 一十

314 -

315 - cPA-19 0.004 _lc

320

0.·

323 +

324 -

325 - - - - -

326 - + - - ~

"} 7 + + 一一一一

0·⁰⁰¹ 328 - — — — — +

329 一 - - - - -

330 - - - - -

331

332

cPA-20 0.004

0.画

341

342

343 +

344 — +

345 一 +

cPA— 5 0.008 „.

346

347

348

—：なし

+：あり媒体群において胸腔内（1例）、腹腔内では脾臓（5例）、卵巣（2例)及び脂肪組織（ 2例）にて転移結節が認められた。 cPA- 19の 0. 001 mg/body投与群において胸腔内（1例）、腹腔内では脾臓（1例）、卵巣（2例）、副腎（1例）、腎臓（2例)及び脂肪組織（ 1例）において転移結節が認められた。 cPA- 19の 0. 004 mg/body投与群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（1例）、副腎（1例）及び脂肪組織（ 1例）において転移結節が認められた。 cPA- 19の 0. 008 mg/body投与群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（ 1例）において転移結節が認められた。 cPA- 20の 0. 001 mg/body投与群において、胸腔内（ 1例）、腹腔内では横隔膜（1例）、脾臓（1例）、卵巣（1例）、及び陰核腺傍（1例）において転移結節が認められた。 cPA- 20の 0. 004 mg/body投与群において胸腔內では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（ 1例）において転移結節が認められた。 cPA - 20の 0. 008 mg/body投与群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（1例）において転移結節が認められた。 cPA- 5群において胸腔内では転移結節は認められず、腹腔内では脾臓（ 3例）において転移結節が認められた。 cPA- 19群及び cPA- 20群において、用量の増加に伴い、胸腔内や腹腔内に転移結節を有する個体数が減少した。

5. 病理組織学的検查（図 1 4、表 6および表 7 )

病理組織学的検査の結果を図 1 4、表 6およぴ表 7に示す。

表 6 ：マウスの B16- F0ミエローマの肺転移巣の数に対する cPA- 19又は cPA- 20の影響転移巣を有する 1切片当たりの転移巣の数 "

N

(mg/body) マウスの数小さいサイズ 2) 大きいサイズ²)

6 6 1.3±1.5 1.3±1.0 2.7±2.4 cPA-19 0.001 6 6 3.0±1.3 0.7 ±0.8 3.7±1.8 0.004 6 0.3±0· 5 0±0" 0.3±0· 5^! 0.008 6 0土 ( 0±0" 0±0" cPA— 20 0.001 6 4 3.2±3.5 1.2±1.3 4.3 ±4.6

0.004 6 0.2±0.4 0±0" 0·2±0· 4^!l

0.008 6 0 0±(^ 0±0

CPA— 5 0.008 6 5 2±0.8 0.8±0.8 2.0±1.3

1) 左葉およ Ό¾葉の切片、 |直は平均土 S. D.を示す。

2) 大きさ； »巣の長い方の長さ，小さいサイズ：く 0.65應，大きいサイズ :0.65議≤力つく 1.3咖

& Pく 0.05, && Pく 0.01対溶媒群（Fisherの抽出可能性検定).

！ Pく 0.05，！! Pく 0.01対溶媒群 (Wilcoxon検定).

表 7 ： B16-F0メラノ一マ担持マウスの肺の病理組織学的所見

所見

•投与量動物番号

、mg/bodyノメラノーマ転移巣に対する

リンパ球の浸潤

301

302

303

溶媒 304 +

305

306

307

308 +

309

0. 001

310

311

312

313

314 *

315

cPA-19 0. 004

316

320 *

321

0. 008

322 *

323

324

325

326

327

0. 001

328 ++

329

330

331

332 *

333

cPA-20 0. 004 *

334 *

338 *

339

0. 008

340 *

341 *

342 *

343

344 ++

345

cPA-5 0. 008

346 +

347 *

348

等級；〜，なし； +,少量； ++，中程度; +++，多量； *:未試験（転移巣なし）層転移巣を有する個体数は媒体群では 6例であった。 cPA- 19の 0. 001， 0. 004及び 0. 008 mg/body投与群ではそれぞれ 6 , 2及ぴ 0例であつた。 cPA- 20の 0. 001, 0. 004及ぴ 0. 008 mg/body投与群ではそれぞれ 4 , 1及び 0例であった。 cPA- 5群では 5例であった。転移巣を有する個体数は、媒体群と比較して cPA-19の 0. 004 及び 0. 008 mg/body投与群、 cPA- 20の 0. 004及び 0. 008 mg/body投与群では有意に減少した。

肺の転移巣数は、媒体群において小型の転移巣が 1. 3± 1. 5個、大型の転移巣が 1. 3± 1. 0個でありその合計は 2. 7±2. 4個であった。 cPA- 19の 0. 001 mg/body投与群において小型の転移巣が 3. 0± 1. 3個、大型の転移巣が 0. 7±0. 8個でありその合計は 3. 7± 1. 8個であった。 cPA- 19の 0. 004 mg/body投与群において小型の転移巣が 0. 3±0. 5個であり大型の転移巣は認められなかった。 cPA - 19の 0. 008 mg /body投与群においては転移巣は認められなかった。 cPA- 20の 0. 001 mg/body投与群において小型の転移巣が 3. 2±3. 5個、大型の転移巣が 1. 2± 1. 3個でありその合計は 4. 3±4. 6個であった。 cPA- 20の 0. 004 mg/body投与群において小型の転移巣が 0. 2±0. 4個であり大型の転移巣は認められなかった。 cPA - 20の 0. 008 mg /body投与群においては転移巣は認められなかった。 cPA- 5群において小型の転移巣が 1. 2±0. 8個、大型の転移巣が 0. 8±0. 8個でありその合計は 2. 0± 1. 3個であつた。媒体群と比較して、小型の転移巣は cPA- 19の 0. 008 mg/body投与群及び cPA-20の 0. 008 mg/body投与群において、大型の転移巣では cPA- 19の 0. 004及び 0. 008 mg/body投与群、 cPA- 20の 0. 00 及び 0. 008 mg/body投与群において、またそれらの合計では cPA- 19の 0. 00 及ぴ 0. 008 mg/body投与群、 cPA- 20の 0. 004 及び 0. 008 mg/body投与群において、それぞれ有意に減少した。

転移巣に対するリンパ球の浸潤は媒体群では 6例中 1例に認められた。 cPA- 19 の 0. 001 mg/body投与群では 6例中 1例に転移巣に対するリンパ球の浸潤が認められ、 0. 004 mg/body投与群の 2例では認められなかった。 cPA- 20の 0. 001 mg/body 投与群では 4例中 1例に転移巣に対するリンパ球の浸潤が認められ、 0. 004 mg /body投与群の 1例では認められなかった。 cPA- 5群では 5例中 2例に転移巣に対するリンパ球の浸潤が認められた。各試験群において、転移巣に対するリンパ球の浸潤の程度に差は認められなかった。

癌転移の主要経路の 1つである血行性転移は、癌細胞の原発巣からの離脱と周辺組織への浸潤から始まり、リンパ管や血管へ侵入し、色々な器官の毛細血管床での接着を経て、遠隔部位での増殖による転移巣の形成に至るまで複雑な反応力スケードカら成り立っている。本実験で用いた B16 melanoma血行性肺転移モデルは、原発巣を遊離した癌細胞が脈管内に侵入した以降の過程を調べることが可能なモアノレである (Poste G. and Fidler I. J.： The pathogenesis of cancer metastasis. Nature 283 : 139-146 (1980) ；及び、がん転移研究会編 [責任編集]入村達郎：がんの浸潤'転移研究マニュアル，株式会社金芳堂, . 7- 11、京都（1994) )。リゾホスファチジン酸 (LPA)はリゾリン脂質メディエーターの 1つであり（小林哲幸，室伏きみ子：リゾリン脂質メディエーターとしてのリゾホスファチジン酸と環状ホスファチジン酸の存在，代謝及び生理機能，蛋白質核酸酵素 44 : 1118 - 1126 (1999) )、 in vitro浸潤実験系において浸潤を強く誘導することが知られている（向井睦子，明渡均：リゾホスファチジン酸によるがん細胞浸潤の誘導と環状ホスファチジン酸による浸潤の抑制，蛋白質核酸酵素 44 :

1126-1131 (1999) ； Mukai M. , Imamura F. , Ayaki Μ. , Shinkai Κ. , Iwasaki

Τ. , Murakami - Murofushi Κ. , Murofushi Η. , Kobayashi S. , Yamamoto Τ.， Nakamura Η. and Akedo Η.■' Inhibition of tumor invasion and metastasis by a novel lysophospharidie acid (cyclic LPA) . Int. , J. Cancer 81： 918-922 (1999) ) ₀ この LPAの構造類似体である環状ホスファチジン酸（cPA)は、 in vitro浸潤実験系において LPAとは反対に浸潤を強く抑制することが知られている（小林哲幸，室伏きみ子：リゾリン脂質メディエーターとしてのリゾホスファチジン酸と環状ホスファチジン酸の存在,代謝及び生理機能，蛋白質核酸酵素 44 : 1118- 1126 (1999)。そこで今回、 B16 melanoma血行性肺転移モデルを用いて、 cPA誘導体である cPA - 19 及ぴ cPA-20のマウス悪性黒色腫 B16- F0の肺転移に対する抑制作用を検討した。体重の経時的推移において、 cPA- 1'9の 0. 001及ぴ 0. 008 mg/body投与群、 cPA - 20 の 0. 001 mg/body投与群では一過性の体重減少が認められた。これは媒体群や cPA-5群においても認められており、 cPA- 19の 0. 004 mg/body投与群及ぴ cPA - 20 の 0. 004及び 0. 008 mg/body投与群では認められないことから、被験物質の作用によるものではないと考えられる。またその後順調な体重増加が認められたことから、 cPA- 19及ぴ cPA-20は体重の変化に対して影響を与えないと考えられる。また、肺における B16- F0の転移結節数において、媒体群では十分な結節数が認められたことから、今回の試験系に問題はなかったと考えられる。 cPA - 19 及び cPA-20の両試験群において 0. 004 mg/body投与群は転移結節数を有意に減少させ、 0. 008 mg/body投与群ではほぼ完全に転移を抑制した。また肺組織内部の転移巣や肺以外の転移においても同様の結果が得られた。これは cPA-19及ぴ cPA- 20 が B16- F0の転移を抑制したためと考えられる。一方、 cPA- 5群では有意な転移結節数の減少は認められたが、転移巣数を減少させる作用は認められなかった。

以上のことから、本実験モデルにおいて cPA - 19及び cPA-20は 0. 004及ぴ 0. 008 mg/bodyの用量において B16-F0の肺転移を抑制する作用を示し、その作用は cPA-5 より強いことが明らかとなつた。産業上の利用の可能性

癌の転移は、 Jffi瘍の悪性化を示す最も顕著な現象であり、複雑な過程を経て成立する。なかでも癌細胞の浸潤は特徴的な段階である。本発明により carba-cPA が強い浸潤抑制活性を有することが判明し、新規な癌転移抑制剤を提供することが可能になった。本発明の癌転移抑制剤の利用は、癌治療へ大きく貢献するものである。

Claims

請求の範囲

1. 一般式（ I )：

で示される化合物を有効成分として含む、癌転移抑制剤。

2. 一般式（I) においてが、一 C₁₅H₃い - (CH₂) ₇CH = CHC₆ H₁₃、又は一（CH₂) ₇CH = CHC₈H₁₇であることを特徴とする、請求項 1 に記載の癌転移抑制剤。

3. 癌細胞の浸潤を抑制することにより癌の転移を抑制する、請求項 1又は 2に記載の癌転移抑制剤。