KR20160036490A

KR20160036490A - 중쇄 지방산을 포함하는 암치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR20160036490A
Application number: KR1020150131141A
Authority: KR
Inventors: 박진병; 양경미
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단
Priority date: 2014-09-25
Filing date: 2015-09-16
Publication date: 2016-04-04

Abstract

본 발명은 중쇄 지방산을 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 사용하여 암질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 암치료용 약학 조성물은 암세포의 세포자멸을 유도할 수 있는 중쇄 지방산을 유효성분으로 포함하여 다양한 종류의 암세포를 사멸시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

중쇄 지방산을 포함하는 암치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for treating cancer comprising medium chain fatty acids as active ingredient}

본 발명은 중쇄 지방산을 포함하는 암치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 중쇄 지방산을 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물 및 상기 약학 조성물을 사용하여 암질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

지방산(脂肪酸, fatty acid)은 식물·동물·미생물에 있는 지질(살아 있는 세포의 구성성분)의 중요한 성분이다. 일반적으로 지방산은 짝수 개의 탄소원자와, 사슬의 길이를 따라 각 탄소원자에 결합된 수소원자, 그리고 사슬의 한쪽 끝은 사슬과 결합되어 있으며, 나머지 끝은 지방산이 산성(카르복시산)을 띠게 하는 카르복시기(－COOH)로 이루어진 곧은 사슬 화합물이다. 탄소-탄소 결합이 모두 단일결합인 화합물은 포화지방산, 이중결합 또는 삼중결합을 가진 화합물은 불포화지방산으로 포화지방산보다 반응성이 크다. 특히, 식품으로 섭취하여야 하는 지방산으로는 리놀레산과 리놀렌산 등을 들 수 있는데, 이중 리놀레산은 항암, 항비만, 항당뇨 등의 다양한 약리활성을 나타낸다고 보고되었다.

이같은 지방산 성분의 약학 조성물은 손상된 세포에 대한 세포막 투과성이 우수하여, 수용성 치료제 보다 높은 약리활성을 나타낸다는 장점이 있어, 지방산 유래 치료제를 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, WO 1995-024199에는 지방산 사슬(hydroxyundec)을 포함하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 암세포 전이억제용 약학 조성물이 개시되어 있고, 한국특허공개 제2009-0004173호에는 불포화 고급지방산 유도체를 포함하는 암 치료용 약학조성물이 개시되어 있으며, 일본특허공개 제2011-006346호에는 하이드록시 운데칸 산을 포함하는 세균 감염성 질환 예방용 약학 조성물이 개시되어 있다. 특히, 세포수준의 치료가 필요한 암질환에 대한 치료효과가 우수한 것으로 알려져 있어, 다양한 연구가 수행되고 있으나, 이러한 지방산 유래 항암제는 체내에서 지질분해 효소에 의하여 쉽게 분해될 수 있고, 체내에서 분해되지 않도록 제조된 유도체는 정상적인 생리활성을 교란시킬 수 있다는 문제점이 있어, 제형화가 용이하지 않다는 단점이 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 지방산 유래 화합물을 포함하는 항암제를 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 중쇄 지방산을 사용할 경우, 체내에서 지질분해 효소에 의하여 쉽게 분해되지 않으면서도, 생리활성을 교란시킬 가능성이 없으며, 암세포의 세포자멸을 유도할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 중쇄 지방산을 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 약학 조성물을 이용하여 암질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 지방산 유래 화합물을 포함하는 항암제를 개발하고자 다양한 연구를 수행하던 중, 중쇄 지방산에 주목하게 되었다. 약 6 내지 14개의 탄소수를 가지는 중쇄 디카르복실산을 의미하는 중쇄지방산의 일부는 체내에서 지질분해 효소에 의하여 쉽게 분해되지 않으면서도, 생리활성을 교란시킬 가능성이 없으며, 암에 대한 치료가능성이 알려져 있으므로, 상기 중쇄 지방산이 암세포에서 어떠한 역할을 수행함으로써, 암을 치료할 수 있는지를 확인하고자 하였다.

이에, 중쇄 지방산의 일종으로 알려진 ω-HUA(ω-Hydroxyundec-9-enoic acid)를 이용하여 비소세포성 폐암 세포주에 대한 세포독성을 평가한 결과, 상기 ω-HUA가 비소세포성 폐암 세포주의 세포자멸을 유도하여 항암활성을 나타냄을 확인하고, 이의 작용기작을 규명하였다. 그 결과, 상기 ω-HUA는 세포내에서 ROS의 생성을 촉진시켜서, 세포내 ROS의 생성수준이 증가하고, 증가된 ROS에 의하여 ER 스트레스가 유발되며, 상기 유발된 ER 스트레스를 통해 세포자멸이 발생되어, 결과적으로는 비소세포성 폐암 세포의 세포자멸을 통해 상기 질환을 치료하는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, 간암, 대장암, 폐암, 위암, 유방암 등의 세포에서도 세포자멸 현상이 나타남을 확인하였는데, 이들 암세포에서는 비소세포성 폐암에서 확인된 세포자멸성 신호전달과정과는 달리, MAP 인산화효소의 활성화를 통해 세포 자멸효과가 나타남을 확인하였다. 따라서, ω-HUA는 범용적인 암치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있고, 다른 종류의 중쇄 지방산 역시, 동일 또는 유사한 작용기작에 의하여 암세포의 세포자멸을 유도할 수 있으므로, 상기 중쇄 지방산은 암치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 중쇄 지방산을 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어 "중쇄 지방산"이란, 6 내지 14개의 탄소수, 바람직하게는 9 내지 13개의 탄소수를 가지고, 벤젠고리 없는 직쇄 형태의 중쇄 지방산을 의미하는데, 예를 들어, 세바식산(sebacic acid), 아젤레산(azelaic acid), 리놀레인산(Linoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid), (R)-9-히드록시스테아린산((R)-9-Hydroxystearic acid), α,ω-언덱-2-에네디오인산(α,ω-undec-2-enedioic acid), α,ω-트리덱-2-에네디오인산(α,ω-tridec-2-enedioic acid), ω-HUA(ω-Hydroxyundec-9-enoic acid) 등이 될 수 있다. 상기 중쇄 지방산은 통상적으로 16 내지 20개의 탄소수를 가지는 장쇄 지방산을 화학적 촉매반응 또는 효소반응 등의 당업계에서 공지된 방법으로 절단하여 제조될 수 있고, 이러한 제조방법은 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 중쇄 지방산의 일종인 ω-HUA(ω-Hydroxyundec-9-enoic acid)는 비소세포성 폐암에서 ROS의 생성을 촉진시켜서, 세포내 ROS의 생성수준이 증가하고, 증가된 ROS에 의하여 ER 스트레스가 유발되며, 상기 유발된 ER 스트레스를 통해 세포자멸이 발생되어, 결과적으로는 비소세포성 폐암 세포의 세포자멸을 통해 상기 질환을 치료하는 효과를 나타낼 수 있다. 뿐만 아니라, 간암, 대장암, 폐암, 위암, 유방암 등의 세포에서 동일한 기작을 통해 세포사멸을 유도할 수 있으므로, 범용적인 암치료용 약학 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 따라서, 항암활성의 차이는 있으나, 다른 종류의 중쇄 지방산 역시, 동일 또는 유사한 작용기작에 의하여 암세포의 세포자멸을 유도할 수 있으므로, 상기 중쇄 지방산은 암치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있다.

이처럼 암치료용 약학 조성물의 유효성분으로서 사용될 수 있는 중쇄 지방산은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 세바식산(sebacic acid), 아젤레산(azelaic acid), 리놀레인산(Linoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid), (R)-9-히드록시스테아린산((R)-9-Hydroxystearic acid), α,ω-언덱-2-에네디오인산(α,ω-undec-2-enedioic acid), α,ω-트리덱-2-에네디오인산(α,ω-tridec-2-enedioic acid), ω-HUA(ω-Hydroxyundec-9-enoic acid) 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 중쇄 지방산의 일종인 ω-HUA의 비소세포성 폐암 세포에 대한 세포독성을 시험한 결과, 3종의 세포에서 모두 세포독성을 나타냄을 확인하고(도 1a), 상기 세포독성은 각 폐암세포의 세포자멸에 의하여 유도된 것이며(도 1b 및 1c), 상기 세포자멸이 유도된 폐암세포는 세포막이 손상되어 사멸하게 됨을 확인하였다(도 1d). 이어, 상기 세포자멸이 ER 스트레스와 연관되는지를 확인하기 위하여, ER 스트레스 관련 단백질을 분석한 결과, ω-HUA의 처리시간이 증가할 수록 ER 스트레스 관련 단백질의 수준이 증가하고(도 2a), ER 스트레스 매개성 세포자멸 경로에 관여하는 CHOP의 발현을 억제하거나(도 2b) 또는 ER 스트레스의 발생을 억제(도 2c)할 경우, ω-HUA의 처리에 의한 세포자멸이 억제되므로, ω-HUA 유도성 세포자멸은 ER 스트레스에 의하여 매개됨을 알 수 있었다. ER 스트레스에 관여되는 ROS가 상기 ω-HUA 유도성 세포자멸에 관여하는지를 확인한 결과, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 용량의존적으로 ROS의 수준이 증가하고(도 3a 및 3b), ω-HUA를 처리하더라도 항산화제가 처리되면 ROS의 활성이 나타나지 않으며(도 3c), 세포의 형태손상율이 감소하고, 세포생존율이 증가하며(도 4a), ω-HUA의 처리에 의한 세포자멸을 억제할 수 있음을(도 4b 및 4c) 알 수 있었다. 한편, ω-HUA가 비소세포성 폐암 세포 이외의 다른 암세포에서도 동일하게 세포자멸을 유도할 수 있는지를 확인하기 위하여, 간암, 대장암, 폐암, 위암 및 유방암 세포주에 ω-HUA를 처리하고 세포생존율을 측정한 결과, ω-HUA는 다양한 암세포에 대하여 대부분 항암활성을 나타내었으나, 각 암종 별로 서로 다른 수준의 항암활성을 나타내었고, 동일한 암종 내에서도 세포주별로 서로 다른 수준의 항암활성을 나타냄을 확인하였다(도 5a 내지 5e).

특히, 특이적인 항암활성을 나타내는 유방암 세포주를 대상으로 단백질 마커 분석을 수행한 결과, 모든 유방암 세포에서 스트레스 관련 단백질 마커가 활성화되었고(도 6a 내지 6d), 세포자멸 관련 단백질 마커의 수준이 증가함을 확인하였으며(도 7a 내지 7c), 유방암 세포주에서 ROS의 생성량이 ω-HUA의 농도의존적으로 증가하였고(도 8a 내지 8c), 유방암 세포주의 MAP kinase 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준이 증가함을 확인하였다(도 9a 내지 9c).

그러나, ROS 생성 억제제로 알려진 NAC를 ω-HUA와 같이 처리할 경우에는, ω-HUA의 처리에 의해 증가된 MAP kinase 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준이 감소되고(도 10a 내지 10c), ω-HUA의 처리에 의해 감소된 세포생존율이 증가하였으므로(도 11), 상기 ω-HUA에 의한 항암활성은 ROS의 생성촉진으로 인하여 나타나는 효과임을 알 수 있었다.

끝으로, 유방암 세포주를 이식하여 제작한 유방암 이식 모델 마우스에 ω-HUA를 경구투여하면, 경구투여 기간이 경과함에 따라, 종양의 크기가 감소되면서도 생체내 독성을 나타내지는 않았으므로(도 12a 및 12b), 안전하면서도 효과적인 항암제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 암치료용 약학 조성물은, 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 암치료용 약학 조성물에 포함된 상기 중쇄 지방산의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 내지 20 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.

상기 본 발명의 암치료용 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 암치료용 약학 조성물은 단독으로로 투여하거나 공지된 항암제와 병용하여 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.

본 발명의 중쇄 지방산을 포함하는 암치료용 약학 조성물의 투여량은 사용목적, 질환의 중독도, 환자의 연령, 체중, 성별, 기왕력, 또는 유효성분으로서 사용되는 물질의 종류 등을 고려하여 당업자가 결정할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물은 성인 1인당 약 0.1 ng 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 1 ng 내지 약 10 mg/kg로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 상기 암치료용 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암질환이 발병된 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암질환의 치료방법을 제공한다.

상술한 바와 같이, 본 발명에서 제공하는 상기 중쇄 지방산은 암세포의 세포자멸을 유도할 수 있으므로, 보다 효과적으로 암질환을 예방 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 용어 "개체"란 암질환이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축 등을 포함하는 포유동물을 제한 없이 포함할 수 있으나, 암질환이 발명된 개체 중에서 인간을 제외한다.

본 발명의 암질환을 치료하는 방법에 있어서, 치료대상이 되는 암질환은 특별히 이에 제한되지 않으나, 간암, 대장암, 폐암, 위암, 유방암 등이 될 수 있다.

본 발명의 암질환을 치료하는 방법에 있어서, 상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 다만, 경구 투여 시에는 위산에 의하여 상기 중쇄 지방산이 변성될 수 있기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 암치료용 약학 조성물은 암세포의 세포자멸을 유도할 수 있는 중쇄 지방산을 유효성분으로 포함하여 다양한 종류의 암세포를 사멸시킬 수 있으므로, 보다 효과적인 암치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1a는 다양한 비소세포성 폐암(NSCLC) 세포주에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (■)는 H1299 세포를 나타내고, (●)는 HCC827 세포를 나타내며, (▲)는 A549 세포를 나타낸다.
도 1b는 ω-HUA를 처리한 H1299 세포의 세포자멸의 수준을 비교한 유세포 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 1c는 ω-HUA를 처리한 H1299 세포를 대상으로, ω-HUA의 처리시간에 따른 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 1d는 다양한 비소세포성 폐암(NSCLC) 세포주에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 LDH 방출수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (■)는 H1299 세포를 나타내고, (●)는 HCC827 세포를 나타내며, (▲)는 A549 세포를 나타낸다.
도 2a는 ω-HUA를 처리한 H1299 세포를 대상으로, ω-HUA의 처리시간에 따른 ER 스트레스 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 2b는 CHOP의 발현여부 및 ω-HUA의 처리여부에 따른 세포생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진(우측)이다.
도 2c는 ER 스트레스 억제제(4-PBA)의 처리여부 및 ω-HUA의 처리여부에 따른 세포생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진(우측)이다.
도 3a는 ω-HUA의 처리농도에 따른 ROS의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 3b는 ω-HUA의 처리농도에 따른 ROS의 수준변화를 나타내는 형광현미경 사진 및 그래프이다.
도 3c는 항산화제의 처리에 따른 ROS의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 4a는 ω-HUA와 NAC의 조합처리에 따른 세포형태의 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진(상단) 및 세포생존율 변화를 나타내는 그래프(하단)이다.
도 4b는 ω-HUA와 NAC의 조합처리에 따른 H1299 세포의 세포자멸의 수준을 비교한 유세포 분석결과를 나타내는 그래프이다.
도 4c는 ω-HUA와 NAC의 조합처리에 따라, H1299 세포에서 검출되는 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다.
도 5a는 다양한 간암 세포주(PLC-PRF5 또는 Huh7)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 PLC-PRF5 세포를 나타내고, (■)는 Huh7 세포를 나타낸다.
도 5b는 다양한 대장암 세포주(DLD-1, SW620, HCT116 또는 HT29)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 DLD-1 세포를 나타내고, (■)는 SW620 세포를 나타내며, (▲)는 HCT116 세포를 나타내고, (×)는 HT29 세포를 나타낸다.
도 5c는 다양한 폐암 세포주(H1299, SW48, H460, SK-LU-1 또는 A549)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 H1299 세포를 나타내고, (■)는 SW48 세포를 나타내며, (▲)는 H460 세포를 나타내고, (×)는 SK-LU-1 세포를 나타내며, (※)는 A549 세포를 나타낸다.
도 5d는 다양한 위암 세포주(MKN-45, SNU-1, SNU-16 또는 AGS)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 MKN-45 세포를 나타내고, (■)는 SNU-1 세포를 나타내며, (▲)는 SNU-16 세포를 나타내고, (×)는 AGS 세포를 나타낸다.
도 5e는 다양한 유방암 세포주(T47D, MDA-MB-435, MDA-MB-231 또는 MCF-7)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 T47D 세포를 나타내고, (■)는 MDA-MB-435 세포를 나타내며, (▲)는 MDA-MB-231 세포를 나타내고, (×)는 MCF-7 세포를 나타낸다.
도 6a는 ω-HUA이 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 6b는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 6c는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 6d는 ω-HUA이 처리된 T47D 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 7a는 ω-HUA이 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포자멸 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 7b는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포자멸 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진 및 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7c는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포자멸 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진 및 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8a는 MCF-7 세포에 처리된 ω-HUA의 처리양의 변화에 따른 ROS의 생성수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8b는 MDA-MB-231 세포에 처리된 ω-HUA의 처리양의 변화에 따른 ROS의 생성수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8c는 MDA-MB-435 세포에 처리된 ω-HUA의 처리양의 변화에 따른 ROS의 생성수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9a는 ω-HUA이 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 9b는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 9c는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 10a는 ω-HUA와 NAC가 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 10b는 ω-HUA와 NAC가 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 10c는 ω-HUA와 NAC가 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.
도 11은 ω-HUA와 NAC가 처리에 따른, 유방암 세포주의 생존율 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12a는 ω-HUA를 경구투여한 유방암 이식 모델 마우스의 투여시간 경과에 따른 종양의 크기변화를 나타내는 사진이다.
도 12b는 ω-HUA를 경구투여한 유방암 이식 모델 마우스의 투여시간 경과에 따른 체중변화를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 비소세포성 폐암( NSCLC ) 세포주에 대한 ω- HUA 의 세포독성 평가

실시예 1-1: 세포생존율 평가

먼저, 공지된 방법에 따라 90% 이상의 순도를 갖는 ω-HUA(ω-Hydroxyundec-9-enoic acid)를 제조하고(J.-W. Song, et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 52: 2534-2537, 2013), 제조된 ω-HUA를 에탄올에 용해시킨 농축액(400 mM)을 이하의 실험에서 사용하였다.

다음으로, 인간의 NSCLC 세포주인 H1299, A549 또는 HCC827 세포에 10% FBS와 150㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 배지를 가하고, 37℃ 및 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 상기 배양된 각 세포에 상기 제조된 ω-HUA를 62.5, 125, 250 또는 500μM의 농도로 가하여 30시간 동안 배양한 다음, 배양된 각 세포의 생존율을 측정하였다(도 1a). 이때, 각 세포의 생존율은 각 세포에 WST-8(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt)를 2시간 동안 처리하고, 살아있는 세포의 미토콘드리아에서 생성되는 탈수소효소에 의하여 상기 WST-8로부터 생성되는 적색의 수용성 포르마잔 염료의 흡광도를 450nm에서 측정하는 방식으로 측정하였다.

도 1a는 다양한 비소세포성 폐암(NSCLC) 세포주에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (■)는 H1299 세포를 나타내고, (●)는 HCC827 세포를 나타내며, (▲)는 A549 세포를 나타낸다. 도 1a에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 용량의존적으로 비소세포성 폐암 세포주의 생존율이 저하되었고, 특히, H1299 세포는 HCC827 및 A549 세포에 비하여 ω-HUA에 대하여 높은 민감성을 나타냄을 확인하였다.

실시예 1-2: 유세포분석

상기 실시예 1-1의 결과로부터, 인간의 NSCLC 세포주에 ω-HUA를 처리할 경우, 세포생존율이 감소함을 확인하였으므로, 이러한 세포생존율의 감소가 세포자멸(apoptosis)에 의한 것인지를 확인하고자 하였다.

구체적으로, H1299 세포에 에탄올(vehicle) 또는 500μM ω-HUA를 30시간 동안 처리하면서 배양하고, 배양된 세포를 Annexin V와 propidium iodide (PI) reagent kit(BD Biosciences, USA)를 이용하여 염색하였으며, 염색된 세포를 유세포분석하여, Annexin V-양성 및 PI-음성을 나타내는 초기 자멸세포와 Annexin V-양성 및 PI-양성을 나타내는 후기 자멸세포를 분석하였다(도 1b). 이때, 데이터 분석은 Cell Quest 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용하여 수행하였다.

도 1b는 ω-HUA를 처리한 H1299 세포의 세포자멸의 수준을 비교한 유세포 분석결과를 나타내는 그래프이다. 도 1b에서 보듯이, 대조군 세포에서는 Annexin V-음성 및 PI-음성을 나타내는 정상세포가 대부분을 차지하고 Annexin V 양성 세포는 약 8.57% (4.91 + 3.66%)에 불과하였으나, ω-HUA를 처리한 H1299 세포에서는 Annexin V-양성 및 PI-음성을 나타내는 초기 자멸세포와 Annexin V-양성 및 PI-양성을 나타내는 후기 자멸세포가 대부분을 차지하고 그의 비율 또한 약 78.36% (12.27 + 66.09%)를 차지함을 확인하였다.

따라서, ω-HUA를 처리한 H1299 세포는 세포자멸로 인하여 세포생존율이 감소함을 알 수 있었다.

실시예 1-3: 세포자멸 관련 단백질 마커 분석

상기 실시예 1-2의 결과로부터, ω-HUA를 처리한 H1299 세포는 세포자멸로 인하여 세포생존율이 감소함을 확인하였으므로, 이를 세포자멸 관련 단백질 마커를 분석하여 검증하고자 하였다.

즉, H1299 세포에 500μM ω-HUA를 0, 4, 8, 12 또는 24시간 동안 처리하면서 배양하고, 상기 배양된 세포에 RIPA 완충액(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM Na₂EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM beta-glycerophosphate, 1 mM Na₃VO₄, and 1 ㎍/㎖ leupeptin)을 가한 다음, 얼음온도에서 30분동안 반응시켜 용해시켜서, 각각의 세포용해물을 수득하였다. 상기 수득한 세포용해물과, 세포자멸 관련 단백질인 절단된 caspase-9, 절단된 caspase-6 및 절단된 PARP(poly (ADP-ribose) polymerase)에 대한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 1c). 이때, 대조군으로는 H1299 세포에 에탄올(vehicle)을 처리하고 24시간 동안 배양한 세포를 사용하였고, 내부대조군으로는 튜불린을 사용하였다.

도 1c는 ω-HUA를 처리한 H1299 세포를 대상으로, ω-HUA의 처리시간에 따른 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 1c에서 보듯이, ω-HUA의 처리시간이 증가할 수록 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-9, 절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)의 수준이 증가함을 확인하였다.

실시예 1-4: LDH ( Lactate dehydrogenase ) 방출수준 분석

상기 실시예 1-2 및 1-3의 결과로부터 ω-HUA를 처리한 H1299 세포는 세포자멸이 진행됨을 확인하였으므로, 상기 세포자멸이 진행된 H1299 세포의 세포막이 손상되었는지의 여부를 확인하고자 LDH(Lactate dehydrogenase) 방출수준 분석을 수행하였다.

대략적으로, 상기 실시예 1-1에서 배양된 3종의 NSCLC 세포주의 세포 및 배양상층액을 LDH cytotoxicity assay kit(Cayman, USA)에 적용하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하여, 전체 LDH 활성에 대한 배양상층액에 포함된 LDH 활성을 산출하여 LDH 방출수준(%)을 수득하고, 이를 비교함으로써, 세포막의 손상수준을 비교하였다(도 1d).

도 1d는 다양한 비소세포성 폐암(NSCLC) 세포주에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 LDH 방출수준을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, (■)는 H1299 세포를 나타내고, (●)는 HCC827 세포를 나타내며, (▲)는 A549 세포를 나타낸다. 도 1d에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 LDH 방출수준이 용량의존적으로 증가되었고, 특히, H1299 세포는 HCC827 및 A549 세포에 비하여 상대적으로 높은 수준의 LDH 방출수준을 나타냄을 확인하였다.

따라서, H1299 세포는 ω-HUA의 처리에 의하여 가장 높은 손상수준을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 2: ER 스트레스와 ω- HUA 의 연관성 규명

리놀레인산, 팔미트산 등의 일부 지방산이 ER 스트레스를 유도할 수 있다고 알려져 있으므로, ω-HUA가 ER 스트레스를 유도할 수 있는지 확인하고자 하였다.

실시예 2-1: ER 스트레스 관련 단백질 분석

상기 실시예 1-3의 방법으로 얻어진 각각의 세포용해물과 ER 스트레스 관련 단백질(인산화된 eIF2a (Ser51) 및 인산화된 CHOP(C/EBP homologous protein))에 대한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 2a). 이때, 대조군으로는 H1299 세포에 에탄올(vehicle)을 처리하고 24시간 동안 배양한 세포를 사용하였고, 내부대조군으로는 튜불린을 사용하였다.

도 2a는 ω-HUA를 처리한 H1299 세포를 대상으로, ω-HUA의 처리시간에 따른 ER 스트레스 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 2a에서 보듯이, ω-HUA의 처리시간이 증가할 수록 ER 스트레스 관련 단백질(인산화된 eIF2a 및 인산화된 CHOP)의 수준이 증가함을 확인하였다.

따라서, ω-HUA-처리된 H1299 세포에서 ER 스트레스가 나타남을 알 수 있었다.

실시예 2-2: ω- HUA 유도성 세포자멸에 대한 ER 스트레스 연관 단백질의 역할분석

ER 스트레스에 의하여 활성화되는 C/EBP 패밀리 전사인자인 CHOP은 ER 스트레스 매개성 세포자멸 경로에 관여하는 것으로 알려져 있으므로, ω-HUA가 처리된 세포에서 CHOP와 세포자멸의 관련성을 분석하고자 하였다.

먼저, 하기 서열의 CHOP siRNA를 합성하고, Lipofectamine 2000 reagent(Invitrogen, USA)를 사용하여 H1299 세포에 상기 합성된 CHOP에 대한 siRNA 또는 대조군 siRNA를 도입한 다음, 30시간 동안 1차 배양하고, 상기 배양된 세포에 500μM ω-HUA를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2차 배양하였다.

CHOP siRNA: 5'-GTCCTGTCTTCAGATGAATT-3'(서열번호 1)

상기 2차 배양된 H1299 세포를 사용하는 것을 제외하고는 상기 1-1의 방법을 사용하여, 세포생존율을 측정하여 비교함과 동시에, 상기 수득한 각 세포를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1-3의 방법을 사용하여, 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교하였다(도 2b).

도 2b는 CHOP의 발현여부 및 ω-HUA의 처리여부에 따른 세포생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진(우측)이다.

먼저, 도 2b의 좌측 그래프에서 보듯이, CHOP의 발현을 억제하면 ω-HUA의 처리에 의하여 유도되는 세포생존율 저하가 억제됨을 확인하였다. 구체적으로, 정상세포에서는 CHOP siRNA의 처리에 의하여 CHOP의 발현이 억제되면 세포생존율이 다소 감소하는 경향을 나타내었으나, ω-HUA가 처리되어 세포생존율이 저하되는 조건에서는 CHOP siRNA의 처리에 의하여 CHOP의 발현이 억제되면 세포생존율이 증가함을 확인하였다.

또한, 도 2b의 우측 사진에서 보듯이, ω-HUA가 처리된 세포에서는 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-9, 절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)의 수준이 증가하였으나, 상기 ω-HUA가 처리된 세포에서 CHOP siRNA의 처리에 의하여 CHOP의 발현이 억제되면 상기 세포자멸 관련 단백질의 수준이 저하됨을 확인하였다.

실시예 2-3: ω- HUA 유도성 세포자멸과 ER 스트레스의 연관성 분석

상기 실시예 2-2의 결과로부터, ER 스트레스 연관 단백질인 CHOP의 발현여부가 ω-HUA 유도성 세포자멸의 수준을 조절할 수 있음을 확인하였으므로, ER 스트레스와 ω-HUA 유도성 세포자멸의 연관성을 분석하고자 하였다.

이를 위하여, CHOP의 발현을 억제하는 CHOP siRNA 대신에, ER 스트레스 억제제(500 μM 4-phenylbutyrate, 4-PBA)를 H1299 세포에 2시간 동안 전처리하여 1차 배양하고, 상기 배양된 세포에 500μM ω-HUA를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2차 배양하였으며, 2차 배양된 세포를 대상으로 세포생존율과 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교하였다(도 2c).

도 2c는 ER 스트레스 억제제(4-PBA)의 처리여부 및 ω-HUA의 처리여부에 따른 세포생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프(좌측) 및 세포자멸 관련 단백질의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진(우측)이다.

먼저, 도 2c의 좌측 그래프에서 보듯이, ER 스트레스 억제제를 처리하면 ω-HUA의 처리에 의하여 유도되는 세포생존율 저하가 억제됨을 확인하였다. 구체적으로, 정상세포에서는 ER 스트레스 억제제의 처리에 의하여 세포생존율이 다소 증가하는 경향을 나타내었고, ω-HUA가 처리되어 세포생존율이 저하되는 조건에서는 ER 스트레스 억제제의 처리에 의하여 세포생존율이 증가함을 확인하였으며, 이러한 결과는 CHOP siRNA를 처리한 경우와 동일한 결과임을 확인하였다.

또한, 도 2c의 우측 사진에서 보듯이, ω-HUA가 처리된 세포에서는 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-9, 절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)의 수준 뿐만 아니라 CHOP의 수준이 증가하였으나, 상기 ω-HUA가 처리된 세포에서 ER 스트레스 억제제의 처리에 의하여 CHOP와 상기 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-9, 절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)의 수준이 저하됨을 확인하였으며, 이러한 결과는 CHOP siRNA를 처리한 경우와 동일한 결과임을 확인하였다.

상기 실시예 2-1 내지 2-3의 결과를 종합하면, ER 스트레스의 유발여부에 따라 ω-HUA 유도성 세포자멸의 수준이 조절됨을 확인할 수 있었으므로, ω-HUA 유도성 세포자멸은 ER 스트레스에 의하여 매개됨을 알 수 있었다.

실시예 3: ROS ( reactive oxygen species )와 ω- HUA 의 연관성 분석

실시예 3-1: ROS 의 세포내 생성에 미치는 ω- HUA 의 효과

일부 지방산의 처리는 세포에서 ROS의 생성을 촉진시킨다고 알려져 있으므로, ω-HUA가 ROS의 생성을 촉진할 수 있는지 확인하고자 하였다.

이를 위하여, H1299 세포에 0, 62.5, 125, 250 또는 500μM의 ω-HUA를 처리하고 30시간 동안 배양한 다음, 배양된 각 세포에서 생성된 ROS의 수준을 측정하고 비교하였다(도 3a). 이때, ROS의 수준은 H2DCF-DA(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate)를 37℃에서 45분 동안 처리하고, 상기 H2DCF-DA가 ROS에 의해 산화되어 생성되는 형광화합물인 DCF(2',7'-dichlorofluorescein)의 수준을 OxiSelect™ ROS assay kit(Cell Biolabs Inc., USA)를 사용하여 480 nm/530 nm(여기/방출) 에서 측정하고, 측정된 값을 과산화수소 표준곡선을 사용하여 산출하는 방식으로 측정하였다.

도 3a는 ω-HUA의 처리농도에 따른 ROS의 수준변화를 나타내는 그래프이다. 도 3a에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 용량의존적으로 ROS의 수준이 증가함을 확인하였다.

아울러, 0, 62.5 또는 500μM의 ω-HUA를 처리하고 30시간 동안 배양한 H1299 세포를 Zeiss LSM 510 공초점 현미경(Carl Zeiss, Germany)에 적용하여 각 세포에서 방출되는 DCF 형광의 수준을 촬영하고 측정된 형광값을 컴퓨터 프로그램(Axiovert 200 M fluorescence microscope software)에 적용하여 정량분석하였다(도 3b).

도 3b는 ω-HUA의 처리농도에 따른 ROS의 수준변화를 나타내는 형광현미경 사진 및 그래프이다. 도 3b에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 용량의존적으로 DCF의 형광값이 증가함을 확인하였다.

실시예 3-2: ω- HUA 의 처리에 의한 ROS 생성촉진에 대한 ROS 의 생성억제제의 효과

상기 실시예 3-1의 결과로부터 ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 용량의존적으로 ROS의 수준이 증가함을 확인하였으므로, ROS 제거제를 처리할 경우에 어떠한 효과를 나타내는지를 확인하고자 하였다.

ROS 제거제로서 항산화제(1 mM N-acetyl-L-cysteine, NAC)를 H1299 세포에 2시간 동안 전처리하여 1차 배양하고, 상기 배양된 세포에 500μM ω-HUA를 처리하거나 또는 처리하지 않고 2차 배양하였으며, 2차 배양된 세포를 대상으로 배양된 각 세포에서 생성된 ROS의 수준을 측정하고 비교하였다(도 3c). 이때, 대조군으로는 H1299 세포에 에탄올을 처리한 것을 사용하였다.

도 3c는 항산화제의 처리에 따른 ROS의 수준변화를 나타내는 그래프이다. 도 3c에서 보듯이, ω-HUA를 처리하더라도 항산화제가 처리되면 ROS의 활성이 나타나지 않음을 확인하였다.

실시예 3-3: 세포형태변화 분석

상기 실시예 3-2에서 수득한 각 세포를 위상차 현미경에 적용하여 세포형태를 촬영하고, 상기 각 세포를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1-1의 방법을 수행하여 이들 세포의 세포생존율을 평가하였다(도 4a).

도 4a는 ω-HUA와 NAC의 조합처리에 따른 세포형태의 변화를 나타내는 위상차 현미경 사진(상단) 및 세포생존율 변화를 나타내는 그래프(하단)이다. 도 4a에서 보듯이, H1299 세포에 ω-HUA를 처리하면 세포의 형태가 손상되고, 세포생존율이 감소하였으나, ω-HUA의 처리전에 항산화제인 NAC를 처리하면, ω-HUA를 단독으로 처리한 세포보다는 세포의 형태손상율이 감소하고, 세포생존율이 증가함을 확인하였다.

실시예 3-4: 유세포 분석

상기 실시예 3-2에서 수득한 각 세포를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-2의 방법을 사용하여 유세포 분석을 수행하였다(도 4b).

도 4b는 ω-HUA와 NAC의 조합처리에 따른 H1299 세포의 세포자멸의 수준을 비교한 유세포 분석결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b에서 보듯이, 대조군 세포에서는 Annexin V-음성 및 PI-음성을 나타내는 정상세포가 대부분(80.01%)을 차지하고 Annexin V 양성 및 PI 양성 세포는 일부(16.30%)를 차지하였으나, ω-HUA를 처리한 H1299 세포에서는 Annexin V-양성 및 PI-음성을 나타내는 초기 자멸세포(7.93%)와 Annexin V-양성 및 PI-양성을 나타내는 후기 자멸세포(72.63%)가 대부분을 차지하였고, ω-HUA와 NAC를 조합처리한 H1299 세포에서는 대조군과 유사하게 Annexin V-음성 및 PI-음성을 나타내는 정상세포가 대부분(74.70%)을 차지하고 Annexin V 양성 및 PI 양성 세포는 일부(13.44%)를 차지함을 확인하였다. 따라서, ROS를 제거하는 항산화제의 처리는 ω-HUA의 처리에 의한 세포자멸을 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3-5: 세포자멸 관련 단백질 마커 분석

상기 실시예 3-4의 결과로부터, ROS를 제거하는 항산화제가 ω-HUA의 처리에 의한 세포자멸을 억제할 수 있음을 확인하였으므로, 세포자멸 관련 단백질 마커의 수준을 검출하여 이를 확인하고자 하였다.

상기 실시예 3-2에서 수득한 각 세포를 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 1-3의 방법을 사용하여 각 세포로부터 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)의 수준을 검출하고 비교하였다(도 4c).

도 4c는 ω-HUA와 NAC의 조합처리에 따라, H1299 세포에서 검출되는 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)의 수준을 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석사진이다. 도 4c에서 보듯이, 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-6 및 절단된 PARP)은 ω-HUA를 단독처리한 경우에만 증가하였고, ω-HUA와 NAC를 조합처리한 세포에서는 증가하지 않았다.

따라서, ROS를 제거하는 항산화제의 처리는 ω-HUA의 처리에 의해 유발되는 ER 스트레스를 억제할 수 있음을 알 수 있었다.

앞서 얻어진 결과를 종합하면, 비소세포성 폐암 세포주에 ω-HUA를 처리하면, 세포내 ROS의 생성수준이 증가하고, 증가된 ROS에 의하여 ER 스트레스가 유발되며, 상기 유발된 ER 스트레스를 통해 세포자멸이 발생되어, 폐암 세포주가 사멸됨을 알 수 있었다.

실시예 4: 다양한 암세포에 대한 ω- HUA 의 항암활성 평가

실시예 4-1: ω- HUA 민감성 암세포주 선발

상술한 바와 같이, ω-HUA는 비소세포성 폐암 세포에 대한 항암활성을 나타냄을 확인하였으므로, 상기 ω-HUA이 항암활성을 나타낼 수 있는 다른 암세포를 선발하고자 하였다.

이를 위하여, 간암 세포주(PLC-PRF5 또는 Huh7), 대장암 세포주(DLD-1, HCT116, SW620 또는 LoVo), 폐암 세포주(NCI-H1299, A549, H460 또는 SK-LU-1), 위암 세포주(MKN-45, SNU-1, SNU-16 또는 AGS) 및 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 또는 T47D)를 24웰 플레이트에 각 웰당 5만개의 세포밀도로 접종하여 24시간 동안 배양하고, ω-HUA를 62.5, 125, 250 또는 500μM의 농도로 가하여 30시간 동안 배양한 다음, 실시예 1-1의 방법을 수행하여 배양된 각 세포의 생존율을 측정하였다(도 5a 내지 5e).

도 5a는 다양한 간암 세포주(PLC-PRF5 또는 Huh7)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 PLC-PRF5 세포를 나타내고, (■)는 Huh7 세포를 나타낸다. 도 5a에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 다양한 간암 세포주(PLC-PRF5 또는 Huh7)의 세포 생존율이 감소하였고, 500μM의 ω-HUA를 가할 경우, 약 60%의 세포생존율을 나타냄을 확인하였다.

도 5b는 다양한 대장암 세포주(DLD-1, SW620, HCT116 또는 HT29)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 DLD-1 세포를 나타내고, (■)는 SW620 세포를 나타내며, (▲)는 HCT116 세포를 나타내고, (×)는 HT29 세포를 나타낸다. 도 5b에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할수록 다양한 대장암 세포주(DLD-1, SW620, HCT116 또는 HT29)의 세포 생존율이 감소하였고, 500μM의 ω-HUA를 가할 경우, 약 40 내지 80%의 세포생존율을 나타냄을 확인하였다.

도 5c는 다양한 비소세포성 폐암 세포주(H1299, SW48, H460, SK-LU-1 또는 A549)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 H1299 세포를 나타내고, (■)는 SW48 세포를 나타내며, (▲)는 H460 세포를 나타내고, (×)는 SK-LU-1 세포를 나타내며, (※)는 A549 세포를 나타낸다. 도 5c에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 다양한 폐암 세포주(H1299, SW48, H460, SK-LU-1 또는 A549)의 세포 생존율이 감소하였고, 500μM의 ω-HUA를 가할 경우, 약 30 내지 70%의 세포생존율을 나타냄을 확인하였다.

도 5d는 다양한 위암 세포주(MKN-45, SNU-1, SNU-16 또는 AGS)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 MKN-45 세포를 나타내고, (■)는 SNU-1 세포를 나타내며, (▲)는 SNU-16 세포를 나타내고, (×)는 AGS 세포를 나타낸다. 도 5d에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 다양한 위암 세포주(MKN-45, SNU-1, SNU-16 또는 AGS)의 세포 생존율이 감소하는 경향을 나타내었으나, 암세포 별로 편차가 크게 나타남을 확인하였고, 500μM의 ω-HUA를 가할 경우, 약 30 내지 85%의 세포생존율을 나타냄을 확인하였다.

도 5e는 다양한 유방암 세포주(T47D, MDA-MB-435, MDA-MB-231 또는 MCF-7)에 다양한 농도의 ω-HUA를 처리하고, 이에 의한 세포 생존율의 변화를 나타내는 그래프로서, (◆)는 T47D 세포를 나타내고, (■)는 MDA-MB-435 세포를 나타내며, (▲)는 MDA-MB-231 세포를 나타내고, (×)는 MCF-7 세포를 나타낸다. 도 5e에서 보듯이, ω-HUA의 처리농도가 증가할 수록 다양한 유방암 세포주(T47D, MDA-MB-435, MDA-MB-231 또는 MCF-7)의 세포 생존율이 감소하였고, 500μM의 ω-HUA를 가할 경우, 약 30 내지 50%의 세포생존율을 나타냄을 확인하였다.

상기 도 5a 내지 5e의 결과에서 보듯이, ω-HUA는 다양한 암세포에 대하여 대부분 항암활성을 나타내었으나, 각 암종 별로 서로 다른 수준의 항암활성을 나타내었고, 동일한 암종 내에서도 세포주별로 상이한 범위의 세포생존율 편차를 나타냄을 확인하였다. 실제로, 대장암의 경우에는 약 40 내지 80%의 세포생존율을 나타내었고, 비소세포성 폐암의 경우에는 약 30 내지 70%의 세포생존율을 나타내었으며, 위암의 경우에는 약 30 내지 85%의 세포생존율을 나타내어, 서로 유사한 수준의 세포생존율 편차를 나타냄을 확인한 반면, 유방암의 경우에는 약 30 내지 50%의 세포생존율을 나타내었고, 간암의 경우에는 약 60%의 세포생존율을 나타내어, 상기 3종의 암세포에 비하여 현저히 감소된 수준의 세포생존율 편차를 나타냄을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 ω-HUA는 모든 암세포에 대하여 항암활성을 나타내고, 특히 간암과 유방암 세포에 대하여 안정적인 항암활성을 나타냄을 알 수 있었다.

실시예 4-2: ω- HUA 처리된 유방암 세포주의 스트레스 관련 단백질 마커 분석

상기 실시예 4-1의 결과로부터 ω-HUA가 유방암에 대하여 특이적인 치료효과를 나타낼 것으로 예상되었으므로, 이를 확인하기 위하여 ω-HUA 처리된 유방암 세포주의 스트레스 관련 단백질 마커 분석을 수행하였다.

상기 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 또는 T47D)를 24시간 동안 배양하고, 500μM의 ω-HUA를 가하여 0, 2, 4, 8 또는 12시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 배양된 세포에 RIPA 완충액을 가한 다음, 얼음온도에서 30분동안 반응시켜 용해시켜서, 각각의 세포용해물을 수득하였다. 상기 수득한 세포용해물과, 스트레스 관련 단백질 마커(인산화되거나 또는 인산화되지 않은 ERK, p38 또는 JNK)에 대한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 6a 내지 6d).

도 6a는 ω-HUA이 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이고, 도 6b는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이며, 도 6c는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이고, 도 6d는 ω-HUA이 처리된 T47D 세포의 배양시간의 경과에 따른 스트레스 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다. 도 6a 내지 6d에서 보듯이, 정도의 차이는 있으나, 모든 유방암 세포에서 스트레스 관련 단백질 마커(p-ERK, p-p38 또는 p-JNK)가 활성화됨을 확인하였다.

실시예 4-3: ω- HUA 처리된 유방암 세포주의 세포자멸 관련 단백질 마커 분석

상기 실시예 4-1의 결과로부터 ω-HUA가 유방암에 대하여 특이적인 치료효과를 나타낼 것으로 예상되었으므로, 이를 확인하기 위하여 ω-HUA 처리된 유방암 세포주의 세포자멸(apoptosis) 관련 단백질 마커 분석을 수행하였다.

상기 실시예 4-2에서 수득한 각각의 세포용해물(MCF-7, MDA-MB-231 및 MDA-MB-435)과, 세포자멸 관련 단백질 마커(절단된 caspase-3 및 절단된 PARP)에 대한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하고, MDA-MB-231 및 MDA-MB-435의 경우에는 20시간 동안 배양된 세포를 대상으로 PI/Annexin 염색을 수행한 후, 유세포 분석을 수행하였다(도 7a 내지 7c).

도 7a는 ω-HUA이 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포자멸 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이고, 도 7b는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포자멸 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진 및 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 7c는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 세포자멸 관련 단백질 마커의 발현수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진 및 유세포분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7a 내지 7c에서 보듯이, 웨스턴블럿 분석을 통하여 3종의 유방암 세포주에서 모두 세포자멸 관련 단백질(절단된 caspase-3 및 절단된 PARP)의 발현수준이 증가함을 확인하였고, 유세포분석을 통하여 early apoptosis(오른쪽 아래 부분) 구획에서 비교군(vehicle 처리군)에 비해 증가함을 확인하였다.

따라서, ω-HUA에 의해 유방암 세포주의 사멸이 유도될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4-4: ω- HUA 처리된 유방암 세포주의 ROS 생성수준 분석

유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231 또는 MDA-MB-435)를 24시간 동안 배양하고, 0, 250 또는 500μM의 ω-HUA를 가하여 1시간 동안 추가로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 실시예 3-1의 방법을 이용하여 배양된 각 세포에서 생성된 ROS의 수준을 측정하고 비교하였다(도 8a 내지 8c).

도 8a는 MCF-7 세포에 처리된 ω-HUA의 처리양의 변화에 따른 ROS의 생성수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이고, 도 8b는 MDA-MB-231 세포에 처리된 ω-HUA의 처리양의 변화에 따른 ROS의 생성수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이며, 도 8c는 MDA-MB-435 세포에 처리된 ω-HUA의 처리양의 변화에 따른 ROS의 생성수준 변화를 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 8a 내지 8c에서 보듯이, 3종의 유방암 세포주에서 모두 ROS의 생성량이 ω-HUA의 농도의존적으로 증가함을 확인하였으므로, 유방암 세포주 사멸의 원인이 ROS의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.

실시예 4-5: ω- HUA 처리된 유방암 세포주의 MAP kinase 및 ω- HUA 대사산물 의 인산화수준 분석

상기 실시예 4-4에서 보듯이, ROS의 생성량이 ω-HUA의 농도의존적으로 증가함을 확인하였으므로, ω-HUA의 처리가 ROS 하위 신호전달물질로 알려진 MAP kinase 의 발현수준에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 4-2에서 수득한 각각의 세포용해물(MCF-7, MDA-MB-231 및 MDA-MB-435)과, MAP kinase 관련 단백질 마커(ERK, 인산화된 ERK, P38, 인산화된 P38, JNK, 인산화된 JNK) 및 ω-HUA의 세포내 대사산물(AMPK(AMP-activated protein kinase), 인산화된 AMPK 또는 인산화된 ACC(Acetyl-CoA carboxylase))에 대한 항체를 사용한 웨스턴블럿 분석을 수행하였다(도 9a 내지 9c).

도 9a는 ω-HUA이 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이고, 도 9b는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이며, 도 9c는 ω-HUA이 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 9a 내지 9c에서 보듯이, 다양한 MAP kinase 관련 단백질 마커(ERK, P38, 또는 JNK)가 ω-HUA의 처리에 의하여 활성화(인산화)됨을 확인하였다. 다만, P38의 경우에는 ω-HUA의 처리 후 8시간이 경과된 시점부터 인산화가 감소됨을 확인하였다.

한편, AMPK는 세포의 주된 에너지 센서로서, 지방산 산화와 당소비 같은 대사경로의 음성 조절자(negative regulator)로서의 역할을 수행하고, α-catalytic subunit, 2개의 β- regulatory 및 γ-subunits로 구성된 이형삼합체(heterotrimeric complex)의 형태로 구성되며, LKB1(liver kinase B1) 세린/트레오닌 키나아제에 의해서 172번 타이로신이 인산화됨으로써 활성화된다고 알려져 있다. 상기 AMPK는 AMP분자의 축척 및 ATP 생산 저하에 의한 대사 스트레스를 통해 활성화 되고, 메트포르민(Metformin)을 포함하는 제2형 당뇨병 관련 약물에 의해서 활성화 된다고 알려져 있는 바, 도 9a 내지 9c의 결과로부터, 유방암 세포주에 ω-HUA를 처리하면 AMP가 증가하여 대사스트레스가 유발됨을 알 수 있었다.

또한, ACC는 지방산 생합성을 조절하는 바이오틴 의존성 효소로서, 아세틸-CoA의 비가역적 촉매에 의해 말로닐-CoA를 생산하며, 지방산 합성, 지방질 생합성 및 암세포의 성장에 필수적인 역할을 수행하는데, 이러한 활성은 비가역적 인산화에 의해 억제되는 것으로 알려져 있다. 도 9a 내지 9c의 결과로부터, 유방암 세포주에 ω-HUA를 처리하면 ACC가 인산화되어 세포성장에 필수적인 지방산 합성이 억제되고 이로 인하여 유방암 세포주의 세포자멸이 유도됨을 알 수 있었다.

실시예 4-6: 유방암 세포주의 MAP kinase 및 ω- HUA 대사산물의 인산화에 미치는 ROS의 역할 분석

상기 실시예 4-5에서 확인된 MAP kinase 및 ω-HUA 대사산물의 인산화에 ROS가 영향을 미치는지의 여부를 확인하고자, ω-HUA를 처리하기 2시간 전에 ROS 저해제로 알려진 NAC(N-acetyl-L-cysteine)를 처리하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 4-5와 동일한 실험을 수행하였다(도 10a 내지 10c).

도 10a는 ω-HUA와 NAC가 처리된 MCF-7 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이고, 도 10b는 ω-HUA와 NAC가 처리된 MDA-MB-231 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이며, 도 10c는 ω-HUA와 NAC가 처리된 MDA-MB-435 세포의 배양시간의 경과에 따른 MAP kinase 관련 단백질 마커 및 ω-HUA 대사산물의 인산화 수준의 변화를 비교한 결과를 나타내는 웨스턴블럿 분석결과를 나타내는 사진이다.

도 10a 내지 10c에서 보듯이, NAC 처리에 의해 ERK 및 JNK의 인산화 수준이 감소하고, p38의 인산화는 변화되지 않았으므로, ω-HUA를 처리하면 ROS에 의해서 빠른 시간 내에 하류신호 전달 물질인 ERK 및 JNK가 활성화되고, 이에 의하여 세포자멸이 유발되는 것으로 분석되었다. 또한, ω-HUA 대사산물인 AMPK 및 ACC는 NAC 처리에 의하여 인산화가 억제되므로, 정상적인 세포활동을 위한 지방산 합성이 수행될 것으로 분석되었다.

실시예 4-7: ω- HUA 처리에 의한 유방암 세포주의 생존율 감소에 미치는 ROS 의 역할 분석

24웰 플레이트의 각 웰에 2 X 10⁴개의 3종의 유방암 세포주(MCF-7, MDA-MB-231 및 MDA-MB-435)를 접종하고 24시간 동안 배양한 다음, NAC을 처리하고, 2시간 후에 ω-HUA를 처리하여 하룻밤동안 배양하였다. 배양이 종료된 후, 상기 각 웰에 CCK-8 용액 50㎕를 분주하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 450nm에서 흡광도를 측정하였고, 측정된 흡광도를 환산하여 생존율을 산출하였다(도 11). 이때, 대조군으로는 아무것도 처리하지 않은 유방암 세포주(control), ω-HUA를 단독으로 처리한 유방암 세포주(ω-HUA) 또는 NAC를 단독으로 처리한 유방암 세포주(NAC)를 사용하였다.

도 11은 ω-HUA와 NAC가 처리에 따른, 유방암 세포주의 생존율 변화를 나타내는 그래프이다. 도 11에서 보듯이, ω-HUA를 단독으로 처리할 경우(ω-HUA)에는 유방암 세포주의 생존율이 감소되었으나, NAC를 단독으로(NAC) 또는 ω-HUA와 함께 처리한 경우(ω-HUA+NAC)에는 유방암 세포주의 생존율이 크게 감소되지 않음을 확인하였다.

따라서, ω-HUA의 항암활성은 ROS 의존적인 경로를 통해 나타남을 알 수 있었다.

실시예 4-8: 유방암 동물모델을 이용한 ω- HUA의 항암효과 검증

유방암 세포주의 일종인 MDA-MB-231세포주(1 X 10⁷개)를 5주령 athymic nude mice의 좌측 등 부위에 주사하고, 사육하여 50㎤ 크기의 종양을 형성시켜서 유방암 이식 모델 마우스를 제작하였다. 상기 제작된 유방암 이식 모델 마우스에 ω-HUA를 30일 동안 10mg/kg의 투여량으로 메일 경구투여하면서, 투여시간의 경과에 따른 종양의 크기변화 및 체중변화를 측정하고 비교하였다(도 12a 및 12b). 이때, 대조군으로는 ω-HUA를 경구투여하지 않은 유방암 이식 모델 마우스(vehicle)를 사용하고, 종양의 크기 및 체중은 3일에 한번씩 측정하였다.

먼저, 도 12a는 ω-HUA를 경구투여한 유방암 이식 모델 마우스의 투여시간 경과에 따른 종양의 크기변화를 나타내는 사진이다. 도 12a에서 보듯이, ω-HUA의 투여기간이 경과할 수록, 유방암 이식 모델 마우스에 이식된 유방암 세포의 크기가 감소되어, ω-HUA가 유방암에 대한 항암효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 도 12b는 ω-HUA를 경구투여한 유방암 이식 모델 마우스의 투여시간 경과에 따른 체중변화를 나타내는 그래프이다. 도 12b에서 보듯이, 유방암 이식 모델 마우스의 체중은 별다른 변화가 없었으므로, 상기 ω-HUA는 별다른 생체내 독성을 나타내지 않음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 제공하는 ω-HUA는 효과적인 항암활성을 나타냄에도 불구하고, 별다른 생체내 독성을 나타내지 않으므로, 안전하면서도 효과적인 항암제로서 사용할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Pharmaceutical composition for treating cancer comprising medium chain fatty acids as active ingredient <130> KPA140855-KR-P1 <150> KR 10-2014-0128527 <151> 2014-09-25 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CHOP siRNA <400> 1 gtcctgtctt cagatgaatt 20

Claims

중쇄 지방산을 유효성분으로 포함하는 암치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중쇄 지방산은 6 내지 14개의 탄소수를 가지는 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중쇄 지방산은 세바식산(sebacic acid), 아젤레산(azelaic acid), 리놀레인산(Linoleic acid), 팔미트산(Palmitic acid), (R)-9-히드록시스테아린산((R)-9-Hydroxystearic acid), α,ω-언덱-2-에네디오인산(α,ω-undec-2-enedioic acid), α,ω-트리덱-2-에네디오인산(α,ω-tridec-2-enedioic acid), ω-HUA(ω-Hydroxyundec-9-enoic acid) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 중쇄 지방산인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
상기 중쇄 지방산은 ω-HUA(ω-Hydroxyundec-9-enoic acid)인 것인 조성물.
제1항에 있어서,
간암, 대장암, 폐암, 위암, 유방암 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 암종의 치료에 사용되는 것인 조성물.
제1항에 있어서,
비소세포성 폐암의 치료에 사용되는 것인 조성물.
제1항에 있어서,
유방암의 치료에 사용되는 것인 조성물.
제1항에 있어서,
약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 암치료용 약학 조성물을 약제학적으로 유효한 양으로 암질환이 발병된 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암질환의 치료방법.
제9항에 있어서,
상기 암질환은 간암, 대장암, 폐암, 위암, 유방암 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 암질환인 것인 방법.