WO2002090371A2 - Verfahren zur präparativen herstellung von langen nukleinsäuren mittels pcr - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for the preparative production of long nucleic acids by means of PCR and various possible uses for such a method.
  • the preparative scale refers to nucleic acid quantities obtained which are suitable for direct use in cell-free protein biosynthesis systems and / or in vitro transcription systems.
  • Long nucleic acids are those nucleic acids which, in addition to a nucleic acid base sequence (of any length) coding for a protein, contain further sequences, in particular regulatory sequences, each with more than 50, even more than 70, nucleotides.
  • Nucleic acids can be DNA or RNA, but also PNA.
  • Proteins are used in high purity for biotechnological and medical applications, but especially in large quantities, i.e. on a mg and g scale. In the case of larger proteins, classic synthesis is hardly possible and at least uneconomical.
  • RNA, mRNA can also be used directly. In this way, not only those proteins can be produced in a short time and with a comparatively moderate effort, which can also be genetically engineered, but even proteins can be produced which are, for example, cell toxic and consequently cannot be expressed at all with the usual genetic engineering cell systems.
  • nucleic acid itself, which in turn is expensive using genetic engineering methods.
  • regulatory sequences that are not naturally linked to a protein sequence, as well as other sequences, such as spacers, in order to improve the efficiency of protein synthesis.
  • Expression PCR is an alternative to the genetic engineering of complete nucleic acids that can be used in cell-free protein biosynthesis.
  • the efficient introduction of regulatory sequences (as well as other sequences that promote translation efficiency) into a nucleic acid to be produced plays a role in the context of
  • Amplification plays a special role. Very long PCR primers are necessary for the introduction of such further sequences into a target nucleic acid. On the one hand, long primers are complex to manufacture and on the other hand increase the likelihood of generating inhomogeneous PCR products.
  • nucleic acid From US-A-5, 571, 690 it is known to prepare a nucleic acid on a preparative scale by means of PCR, the nucleic acid to be amplified already containing all the required regulatory sequences. With the measures known in this respect, there is therefore no introduction of other, better regulatory sequences or replacement of the existing regulatory sequences by such other better ones Sequences possible.
  • nucleic acid obtained from the amplification cannot be used directly in protein synthesis.
  • a specific nucleic acid from a nucleic acid mixture cannot be specifically amplified, with simultaneous conversion of the target gene encoded by the specific nucleic acid for protein biosynthesis.
  • the third stage is the overlap and extension response.
  • the products from the first two stages are hybridized, filled into a double strand and finally amplified with further primers.
  • an additional sequence is inserted via a primer in front of the promoter, which is supposed to bring about an improved transcription.
  • transcription and translation take place in one cell-free system.
  • the disadvantage here is that a total of four steps are necessary to obtain the desired RNA.
  • 3 'sequences are missing, which are important for protein biosynthesis in prokaryotic systems.
  • no Affmitatstagsequenzen or the like by means of which a purification of the protein obtained is facilitated. Due to the complexity of the method and the lack of 3 'sequences for prokaryotic systems, the method known in this respect could not be useful for prokaryotic systems or for an application to nuclear acid mixtures (cDNA or genome libraries).
  • the invention is based on the technical problem of specifying a process for the production of long nucleic acids, in particular with protein sequences and with selected regulatory sequences, which works with little effort, gives high amounts of product nucleic acids, is suitable for prokayontic systems without additional effort and by means of whose amplification of defined nucleic acids from nucleic acid libraries is possible.
  • the invention teaches a method for the preparative production of long nucleic acids by means of PCR and with the following hybridization steps: a) a nucleic acid base sequence is hybridized at the 3 'and 5' end with an adapter primer, b) the product from step a) is hybridized at the 3 'and 5' end with one extension primer each, which contains an extension sequence, with one from the nucleic acid base sequence at the 3 'and the 5' end of the Nucleic acid base sequence around the extended and amplified nucleic acid sequence is formed.
  • a nucleic acid base sequence is a sequence which codes for a protein. In particular, this can be a gene, but also sequences from mtronless genomes.
  • the extension sequences can in particular be sequences which comprise a regulatory sequence and / or sequences which contain a ⁇ bosomal binding sequence.
  • the adapter primers are comparatively short. Part of an adapter sequence is specific for the nucleic acid base sequence, another part is constant and hybridizes to an extension sequence.
  • extension sequences do not have to be used for different nucleic acid base sequences. Rather, only the comparatively short adapter primers have to be matched to a defined nucleic base sequence, while the extension sequences can be, so to speak, universal, ie the same or a few selected extension sequences can always be used for different nucleic acid base sequences.
  • the extension sequences which are relatively complex to produce, can thus be used for a wide range of uses, and only the adapter sequences have to be produced for a specific nucleic acid base sequence. However, this is not very expensive since the adapter sequences can be comparatively short.
  • a particular advantage of the method according to the invention is that it is a generally applicable method for any coding sequences.
  • the hybridization with a primer at the 3 'and 5' end relates in particular to double-stranded nucleic acids, the hybridization of the pri ers taking place at the 5 end of the sense and antisense strand. In relation to the single strand, the hybridization with the various primers described above and below takes place at the respective 5 'end.
  • a further development of the invention is of independent importance, wherein the product from stage b) in stage c) can be hybridized with an amplification primer at the 3 'end and at the 5' end, an amplified nuclear acid end sequence being formed.
  • the amplification primers are comparatively short and can be used universally and are therefore readily available.
  • the Amplification primers can also have further (shorter) sequences added at the ends, which further increase the translation efficiency.
  • variations and modifications at the ends of the nucleic acids can also be introduced with little effort. This is particularly advantageous because it does not require different extension primers to be produced for variations and modifications, which in turn would be troublesome to an extent.
  • An example of a variation or modification is the incorporation of a biotin residue, coupled at the 5 'end of the amplification primer.
  • a nucleic acid end sequence stabilized against exonuclease degradation is obtained, which increases the half-life in an in vitro protein biosynthesis system by a multiple, typically more than 5 times, for example, compared to an unstabilized nucleic acid sequence of approx. 15 min. to about 2 h.
  • Stabilities are achieved which are comparable to those of circular plasmids and can therefore replace them to the same extent.
  • An alternative is stabilization using digoxygenin, which binds anti-digoxygenin antibodies.
  • the stabilizing group can in particular be set up at both ends of the nucleic acid end sequence.
  • Another example is a modification with an affinity tag or a sequence coding therefor or an anchor group or a sequence coding therefor.
  • An anchor group allows immobilization by binding the Anchor group on a solid surface with matched binding sites.
  • the anchor group can be attached to the nucleic acid itself, but a sequence coding therefor can also be provided.
  • the adapter primers typically contain ⁇ 70, in particular 20-60, nucleotides.
  • the extension primers typically contain> 70, also 90 and more, nucleotides.
  • the amplification primers in turn typically contain ⁇ 70, mostly ⁇ 30, nucleotides, typically> 9 nucleotides. Only the adapter primers have to be specifically adapted to a defined nucleic acid base sequence, which is associated with little effort in the light of the relatively short sequences.
  • Steps a), b) and optionally step c) are advantageously carried out in a PCR solution containing the nucleic acid base sequence, the adapter primers, the extension primers and optionally the amplification primers. It is then a one-step PCR with a total of 6 primers, two adapter sequences, two extension sequences and two amplification sequences. It is sufficient to use the adapter primer and extension primer in low concentrations and, in this respect, only to produce a small amount of intermediate product. The intermediate product also does not need to be homogeneous, which means that complex optimizations can be dispensed with. Because of the shortness of the amplification primers, no optimizations are necessary even for the amplification to the high amount of nucleic acid end sequence.
  • Steps a) and b) are carried out in a process step A) in a pre-PCR solution containing the nucleic acid base sequence, the adapter primer and the extension primer for a defined first number of cycles, and step c) is carried out in a process step B) in a main PCR solution containing the PCR product from stage A) and the amplification primers carried out for a defined second number of cycles.
  • Step A) can be carried out in a reaction volume which is 1/2 to 1/10 of the reaction volume of step B). In step A), a higher concentration of intermediate product arises due to the lower volume or significantly less nucleic acid base sequence can be used.
  • the adapter primers and the extension primers are again greatly diluted, with the result that the probability of incorporating variations and / or modifications into the nucleic acid end sequences via the amplification primers is increased ,
  • the procedure can be such that the PCR in a reaction volume of 10 to 100 ⁇ l, preferably 20 to 40 ⁇ l, with 0.01 to 100 pg, preferably 1 to 50 pg, nucleic acid base sequence, 0.05 to 10 ⁇ M, preferably 0.1 to 5 ⁇ M, adapter primer and 0.005 to 0.5 ⁇ M, preferably 0.001 to 0.1 ⁇ M, extension primer is carried out, with 0.01 to 10 ⁇ M, preferably 0.1 to 10, after a defined number of initial cycles uM, Amplification primers are added, and the amplified nucleic acid end sequence is produced by means of a defined number of subsequent cycles.
  • Step A reaction volume ⁇ 10 ⁇ l; 0.001 to 5 pg, preferably 0.01 to 1 pg, nucleic acid base sequence; 0.05 to 10 uM, preferably 0.1 to 5 uM, adapter primer and 0.05 to 10 uM, preferably 0.1 to 5 uM, extension primer; first number of cycles 10 to 30, preferably 15 to 25,
  • the invention further teaches the use of a method according to the invention for the production of nucleic acids for cell-free in vitro protein biosynthesis, in particular in prokaryotic systems, preferably in a translation system from Escheria coli D10.
  • a method according to the invention can advantageously be used for the selective amplification of a defined nucleic acid base sequence from a nucleic acid library. This makes it possible to characterize gene sequences, the gene sequence being used as the nucleic acid base sequence and the protein obtained being analyzed with regard to structure and / or function.
  • the background to this aspect of the invention is that for many genes the sequences are known, but not the structure and function of the protein encoded thereby.
  • elements of a gene library, for which only the sequence as such is known can be examined for their function in an organism. The study of the structure and function of the protein obtained follows the usual working methods of biochemistry.
  • the method according to the invention can be used to obtain nucleic acids which contain a nucleic acid base sequence coding for a protein and a ⁇ bosomal binding sequence and optionally one or more sequences from the group consisting of "promoter sequence, transcription terminator sequence, expression enhancer sequence, stabilization sequence and affinity tag sequence" ,
  • An affinity tag sequence codes for a structure which has a high affinity for (usually immobilized) binding sites in separation systems for purification. This enables easy and high-affinity separation of proteins that do not contain the affinity tag.
  • An example of this is Strep-tag II, a peptide structure consisting of 8 amino acid residues with affinity for StrepTactm.
  • a stabilization sequence codes for a structure which, either by itself or after binding with an binding molecule specific for the structure, brings about stabilization against degradation, in particular by nucleases.
  • a nucleic acid (end) sequence can also be stabilized by incorporating a biotin group at one end, preferably at both ends, which can be reacted with streptavid. This installation can be carried out by using primers carrying biotin, in particular amplification primers.
  • An expression enhancer sequence increases the translation efficiency compared to a nucleic acid without an expression enhancer sequence. This can be, for example, (non-translated) spacers.
  • a transcription terminator sequence terminates RNA synthesis. An example of this is the T7 Phage Gen 10 transcription terminator. Transcription terminator sequences can also stabilize against degradation by 3 'exonucleases. Advantageous relative arrangements of the above sequence elements to one another can be generalized from the following exemplary embodiments.
  • PCR The PCR was performed in a quantified in Examples reaction volume with 10 mM Tris-HCl (pH 8.85 at 20 ° C), 25 mM KCl, 5 mM (NH 4) 2 S0 4, 2 mM MgS0 4, 0 25 mM of each dNTP, 3 U Pwo DNA polymerase (Röche) and the amount of nucleic acid base sequence given in the examples were carried out. The cycles were for 0.5 min. at 94 ° C, 1 min. at 55 ° C and 1 min. performed at 72 ° C.
  • the reactions were carried out at 37 ° C., the course being followed by taking 5 ⁇ l aliquots of the reaction mixture at subsequent times and estimating the incorporation of [ 14 C] Leu by means of TCA precipitation. A further 10 ⁇ l aliquots were removed for the analysis of the synthesized protein using SDS-PAGE, followed by autoradiography in a phosphoimager system (Molecular Dynamics).
  • Plasmid construction A high copy derivative of the plasmid pET BH-FABP
  • pHMFA bovine heart fatty acid binding protein
  • the plasmid pHMFA served as a template for the construction of nucleic acids with different sequence regions upstream of the promoter.
  • the constructs (see examples) FA1, FA2 and FA4 with 0, 5 and 249 base pairs upstream of the promoter were primed with P1, Cl and P2 and generated with the downstream primer P3.
  • the construct FA3 with a sequence region of 15 base pairs upstream of the promoter was obtained by digestion of FA4 with the endonuclease Bgl II.
  • the control plasmid pHMFA (EcoRV) with a sequence range of 3040 base pairs was obtained by digesting the plasmid with EcoRV. All products were purified by agarose gel electrophoresis, followed by gel extraction using the "High Pure PCR Product Purification Kit".
  • Radioactive labeled nucleic acids were synthesized according to the above conditions, but in the presence of 0.167 ⁇ Ci / ⁇ l [ ⁇ - 35 S] dCTP.
  • the labeled nucleic acids were used in a coupled transcription / translation, reaction volume 400 ⁇ l. 30 ul aliquots were taken at successive times. After the addition of 15 ⁇ g ribonuclease A (DNAse-free, Röche), these were kept for 15 min. incubated at 37 ° C. Another incubation for 30 min. at 37 ° C., 0.5% SDS, 20 mM EDTA and 500 ⁇ g / ml Proteinase K (Gibco BRL) were added in a total reaction volume of 60 ⁇ l.
  • Remaining PCR products were further purified using ethanol precipitation and then subjected to denaturing electrophoresis (5.3% polyacrylamide, 7 M urea, 0.1% SDS, TBE). The dried gel was run through a phosphoimager system (Molecular Dynamics) to quantify the radioactivity.
  • Example 1 PCR with four primers
  • FIG. 2 shows a schematic representation of a one-step PCR according to the invention with four primers.
  • the nucleic acid base sequence coding for a protein which contains the complete coding sequence for H-FABP (homogeneous and functionally active fatty acid binding protein from bovine heart), obtained as a 548 bp restriction fragment from pHMFA by digestion using the endonucleases Ncol and BamHI, (and a 150 bp sequence at the 3 'end, which is neither translated, nor is complementary to an adapter primer or extension primer).
  • the two adapter primers A and B are hybridized to them, which comprise ends homologous to the ends of the nucleic acid base sequence.
  • the adapter primer A also contains a ribosomal binding sequence.
  • the extension primers C and D are hybridized to the outer ends of the adapter primers A and B.
  • the extension primer C comprises the T7 gene 10 leader sequence including the T7 transcription promoter and optionally upstream a sequence of, for example, 5 nucleotides.
  • the extension primer D comprises the T7 gene 10 terminator sequence.
  • Example 2 Efficiency of H-FABP synthesis depending on the sequence region upstream of the promoter.
  • FIG. 3 shows that all sequence regions, except 0 (lower curve), increase the protein synthesis. 5 base pairs are sufficient.
  • Example 3 Improvement of H-FABP synthesis by phage T7 gene 10 transcription terminator / 5 'leader sequence phage T7 gene 10.
  • FIG. 4 shows that the phage T7 gene 10 transcription terminator can improve the synthesis by at least a factor of 2.8.
  • the triangles stand for FA ⁇ t and the squares for FAt (see also Fig. 2).
  • Example 4 Influence of the position of the transcription terminator sequence.
  • the products FAst and FAast were generated to investigate the influence of the position of the terminator sequence. Both are identical to FAt and FAat, except that there is a 22 bp spacer sequence between the Stop codon and the terminator was introduced using different primers. 5 that the spacer sequence causes an approximately 2-fold increase in expression.
  • Example 5 PCR from a complex DNA mixture.
  • a PCR for FAst was carried out in accordance with the above descriptions with the following exceptions: the nucleic acid base sequence was carried out in concentrations of 0.16 to 20 pg / 50 ⁇ l reactor volume and the reactions were carried out with 0.83 ⁇ g chromosomal DNA from Escherichia coli, sonicated for 5 min., supplemented. It was found that neither the quality nor the quantity of the PCR product was affected by the presence of a 5 million fold excess of competitive DNA.
  • a reaction mixture with 10 ⁇ g of the radiolabelled FAast was subjected to affinity purification. About 81% of the applied material was obtained from the column and 67% could be used as a pure product m are obtained from the elution fractions (calculated from TCA precipitation of the fractions of the affection column).
  • Example 7 Activity of the PCR product.
  • Example 8 Stability of the PCR product.
  • the decrease in the PCR product FAast was measured.
  • the radio-labeled product was used for this.
  • aliquots of the reaction mixture were removed and examined using denaturing polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the amount of the remaining PCR product was quantified by scanning the radioactivity of the gel and compared with the time course of the protein synthesis, measured by scanning the radioactivity of H-FABP in the gel after separation of the reaction mixtures using SDS-PAGE.
  • the results are in the Figure 6 shown. It can be seen that the half-life of the PCR product is approx. 100 min. is what corresponds to the entry of the H-FABP synthesis into a plateau.
  • Example 9 Optimized conditions for a PCR with four primers.
  • Table I summarizes optimized conditions for a PCR with four primers in a reaction volume of 25 ⁇ l.
  • Example 10 PCR with six primers.
  • BIOF is a biotin-labeled forward primer and BIOR is a biotin-labeled reverse primer.
  • FIG. 7 The structure is shown in FIG. 7.
  • Amplification primers were run.
  • the concentration of extension primer could be reduced to 0.025 ⁇ M by using the amplification primer, a factor of approx. 1/20, but with improved homogeneity and yield of PCR product.
  • Example 11 PCR with six primers in two stages.
  • the materials are used as stated above.
  • a pre-PCR is carried out in a reaction volume of 5 ⁇ l with 0.1 pg nucleic acid base sequence, namely with 0.3 ⁇ M adapter primer and 0.5 ⁇ M extension primer over 20 Cycles.
  • the reaction solution thus obtained is diluted to 25 ⁇ l with a PCR batch volume.
  • amplification primer is added to a final concentration of 0.5 ⁇ M.
  • amplification is carried out for a further 30 cycles.
  • Example 12 Stabilization of a nucleic acid with biotin.
  • a nucleic acid was produced using the primers BIOF and BIOR by means of PCR with 6 primers, as described above, and its degradation as a function of time and the improvement in protein synthesis were investigated. This is shown in Figures 7 and 8. It can be seen that with biotin, especially after conversion with streptavidin, stability is considerably improved. This also leads to an up to 20% higher protein synthesis.

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Abstract

Die Erfindung lehrt ein Verfahren zur präparativen Herstellung von langen Nukleinsäuren mittels PCR und mit den folgenden Hybridisierungsschritten: a) eine Nukleinsäurenbasissequenz wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Adapterprimer hybridisiert, b) das Produkt aus Stufe a) wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Verlängerungsprimer, welcher eine Verlängerungssequenz enthält, hybridisiert, wobei aus der Nukleinsäurebasissequenz eine an dem 3' und dem 5' Ende der Nukleinsäurebasissequenz um die Verlängerungssequenzen verlängerte und amplifizierte Nukleinsäuresequenz gebildet wird, sowie verschiedene Verwendungen eines solchen Verfahrens.

Description

Verfahren zur präparativen Herstellung von langen Nukleinsäuren mittels PCR
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur präparativen Herstellung von langen Nukleinsäuren mittels PCR sowie verschiedene Verwendungsmöglichkeiten für ein solches Verfahren. Als präparativer Maßstab werden erhaltene Nukleinsäurerαengen bezeichnet, die zum unmittelbaren Einsatz in zellfreien Proteinbiosynthesesystemen und/oder in vitro Transskriptionssystemen geeignet sind. Als lange Nukleinsäuren werden solche Nukleinsäuren bezeichnet, die neben einer für ein Protein codierenden Nukleinsaurebasissequenz (beliebiger Länge) weitere Sequenzen, insbesondere regulatorische Sequenzen mit jeweils mehr als 50, sogar mehr als 70, Nucleoti- den enthalten. Nukleinsäuren können DNA oder RNA, aber auch PNA sein.
Hintergrund der Erfindung.
Proteine werden für biotechnologische und medizinische Anwendungen in hoher Reinheit, insbesondere aber auch in hoher Menge, i.e. im mg- und g- Maßstab benötigt. Im Falle von größeren Proteinen ist eine klassische Synthese kaum möglich und jedenfalls unwirtschaftlich.
Eine Möglichkeit der Herstellung von Proteinen in größerem Maßstab ist die gentechnische Herstellung. Hierzu wird klonierte DNA, welche für das gewünschte Protein codiert, als Fremd DNA in Form von Vektoren bzw. Plasmiden in Zellen, insbesondere prokaryontische Zellen eingeschleust. Diese Zellen werden dann kultiviert, wobei die durch die Fremd DNA codierten Protei- ne exprimiert und gewonnen werden. Zwar lassen sich auf diesem Wege bereits beachtliche Mengen an Protein gewinnen, die insofern bekannten Maßnahmen, insbesondere die Klonierung, sind jedoch aufwendig. Zudem sind die Zellen meist nur transient transfiziert und zudem nur in Ausnahmefällen stabil immortalisiert. Eine kontinuierliche Produktion von Protein erfordert daher einen stetigen Nachschub an frischen Zellen, welche wiederum mittels der vorstehend beschriebenen aufwendigen Maßnahmen hergestellt werden müssen.
Ein weiterer Ansatz ist die sogenannte zellfreie in vitro Proteinbiosynthese. Hierbei werden biologisch aktive Zellextrakte eingesetzt, welche von natürlicherweise vorliegenden zellulären Nukleinsäuren weit- gehend befreit sind und welche mit Aminosäuren, energieliefernden Substanzen und zumindest einer Nuklein- säure versetzt werden. Die zugesetzte Nukleinsäure codiert dabei für das herzustellende Protein. Wenn als Nukleinsäure DNA eingesetzt wird, ist die Anwesenheit einer DNA-abhängigen RNA-Poly erase erforderlich. Es kann natürlich auch direkt RNA, mRNA, eingesetzt werden. Auf diesem Wege lassen sich nicht nur solche Proteine in kurzer Zeit und mit vergleichsweise moderatem Aufwand herstellen, die auch gentechnisch herstellbar sind, vielmehr können sogar Proteine hergestellt werden, die beispielsweise zelltoxisch sind und folglich mit den üblichen gentechnischen Zellsystemen überhaupt nicht nennenswert exprimierbar sind. Allerdings ist es notwendig die zugesetzte Nukleinsäure selbst herzustellen, was mittels gentechnischer Methoden wiederum aufwendig ist. Hinzu kommt, daß es oft ünschenwert ist, nicht natürlicherweise mit einer Proteinsequenz verknüpfte regulatorische Sequenzen sowie sonstige Sequenzen, wie Spacer, einzuführen, um die Effizient der Proteinsynthese zu verbessern.
Eine Alternative zur gentechnischen Herstellung von vollständigen, in der zellfreien Proteinbiosynthese einsetzbaren Nukleinsäuren ist die sogenannte Expressions PCR. In diesen Zusammenhängen spielt die effiziente Einführung regulatorischer Sequenzen (sowie anderer, die Translationseffizienz fördernder Sequenzen) in eine herzustellende Nukleinsäure im Rahmen der
Amplifikation eine besondere Rolle. Für die Einführung solcher weiterer Sequenzen in eine Ziel-Nukleinsäure sind sehr lange PCR Primer notwendig. Lange Primer sind einerseits in der Herstellung wiederum aufwendig und erhöhen andererseits die Wahrscheinlichkeit der Generierung inhomogener PCR-Produkte .
Stand der Technik.
Aus der Literaturstelle US-A-5, 571, 690 ist es bekannt, eine Nukleinsäure in präparativem Maßstab mittels PCR herzustellen, wobei die zu amplifizierende Nukleinsäure bereits alle erforderlichen regulatorischen Sequen- zen enthält. Bei den insofern bekannten Maßnahmen ist somit keine Einführung anderer, besserer regulatorischer Sequenzen bzw. Ersatz der vorhandenen regulatorischen Sequenzen durch solche andere bessere Sequenzen möglich. Zudem ist die aus der Amplifikation erhaltene Nukleinsäure nicht unmittelbar in der Proteinsynthese einsetzbar. Schließlich kann nicht gezielt eine spezifische Nukleinsäure aus einem Nuklein- säuregemisch amplifiziert werden, bei gleichzeitiger Umwandlung des durch die spezifische Nukleinsäure codierten Zielgens für die Proteinbiosynthese.
Aus der Literaturstelle WO-A-9207949 ist es bekannt, eine Nukleinsäure mit einer für ein Protein codierenden Sequenz sowie einer regulatorischen Sequenz in mehreren Stufen herzustellen und zu amplifizieren. In einem ersten Schritt wird die für das Protein codierende Sequenz mit einer Standard-PCR amplifiziert. Dabei dient ein stromaufwärts hybridisierender Primer zur Einführung einer Adaptersequenz für eine sogenannte "Overlap-Extension-PCR" . In einer parallelen zweiten Stufe wird der Hybridisierungspartner für die Overlap-Extension-PCR hergestellt. Dazu werden zwei teilkomplementäre Primer hybridisiert und aufgefüllt. Das erhaltene Produkt trägt dabei am 3 '-Ende die zum 5 '-Ende des Amplifikats aus der ersten Stufe homologe Sequenz der Adaptersequenz sowie eine Promotersequenz und Regulationselemente für die zellfreie Proteinbio- synthese. Die dritte Stufe ist schließlich die Overlap und Extension Reaktion. Die Produkte aus den beiden ersten Stufen werden hybridisiert, zum Doppelstrang aufgefüllt und schließlich mit weiteren Primern amplifiziert. Bei dieser abschließenden Amplifikation wird über einen Primer eine zusätzliche Sequenz vor dem Promoter eingebaut, welche eine verbesserte Transskription bewirken soll. In zwei weiteren Stufen erfolgt die Transkription sowie die Translation in einem zellfreien System. Nachteilig ist hierbei, daß msge- amt vier Schritte bis zum Erhalt der gewünschten RNA notwendig sind. Weiterhin fehlen 3 ' -Sequenzen, welche für die Proteinbiosynthese in prokaryontischen Syste- men wichtig sind. Auch sind keine Affmitatstagsequen- zen oder dergleichen, mittels welcher eine Aufreini- gung des erhaltenen Proteins erleichtert wird, eingeführt. Aufgrund der Komplexität des Verfahrens sowie dem Fehlen von 3 '-Sequenzen für prokaryontische Syste- e durfte das insofern bekannte Verfahren weder für prokaryontische Systeme noch für eine Anwendung auf Nuklemsauregemische (cDNA oder Genom Bibliotheken) brauchbar sein.
In der Literaturstelle Martemyanov, K.A., et al . ; FEBS Lett. 414:268-270 (1997) ist ein Verfahren beschrieben, welches der Literaturstelle WO-A-9207949 ähnelt. Unterschiede bestehen darin, daß eine Sequenzhomologie zwischen dem 5 ' -Ende des stromaufwartigen und dem 3 '-Ende des stromabwartigen Primers vorliegt. Dadurch erfolgt eine Multimerisierung und letztendlich wird ein Polyprotein erzeugt, welches dann wiederum m Mo- nomere gespalten wird. Zusätzlich nachteilig bei dieser Variante ist, daß Polyproteme von nur sehr weni- gen Proteinen chemisch spaltbar sind. Zudem ist die Ausbeute recht gering.
Aus der Literaturstelle Nakano, H., et al . ; Biotech- nol. Bioeng. 64:194-199 (1999) ist ein spezieller Pro- tembioreaktor für die Expression von PCR-Produkten in Escherichia coli Lysat bekannt. Dabei werden Standard PCR-Produkte ohne spezielle Methodiken zu deren Generierung eingesetzt. Das PCR-Produkt wird dabei deutlich schlechter exprimiert als in einem Plasmid.
Alle vorstehenden Literaturstellen betreffen eukaryon- tische Systeme.
Technisches Problem der Erfindung.
Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von langen Nukleinsäuren, insbesondere mit Proteinsequenzen sowie mit ausgewählten regulatorischen Sequenzen, anzugeben, welches mit geringen Aufwand arbeitet, hohe Mengen an Produkt-Nuklemsauren ergibt, ohne Mehraufwand für prokayontische Systeme geeignet ist und mittels dessen eine Amplifikation von definierten Nukleinsäuren aus Nukleinsaurebibliotheken möglich ist.
Grundzuge der Erfindung.
Zur Losung dieses technischen Problems lehrt die Erfindung ein Verfahren zur präparativen Herstellung von langen Nukleinsäuren mittels PCR und mit den folgenden Hybridisierungsschritten: a) eine Nuklemsaurenba- sissequenz wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Adapterprimer hybridisiert, b) das Produkt aus Stufe a) wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Verlange- rungsprimer, welcher eine Verlangerungssequenz enthalt, hybridisiert, wobei aus der Nukleinsaurebasissequenz eine an dem 3' und dem 5' Ende der Nukleinsaurebasissequenz um die Verlangerungssequenzen verlängerte und ampliflzierte Nukle sauresequenz gebildet wird.
Als Nukleinsaurebasissequenz ist eine Sequenz bezeichnet, die für ein Protein codiert. Dabei kann es sich insbesondere um ein Gen handeln, aber auch um Sequenzen aus mtronlosen Genomen. Bei den Verlangerungssequenzen kann es sich insbesondere um Sequenzen han- dein, die eine regulatorische Sequenz umfassen und/oder um Sequenzen, welche eine πbosomale Bindungssequenz enthalten. Die Adapterprimer sind vergleichsweise kurz. Eine Teil einer Adaptersequenz ist spezifisch für die Nukleinsaurebasissequenz, ein weiterer Teil ist konstant und hybridisiert jeweils einer Verlangerungssequenz .
Hieraus folgt, daß für unterschiedliche Nuklemsaurebasissequenzen nicht jeweils "passende" lange Verlan- gerungssequenzen eingesetzt werden müssen. Vielmehr müssen lediglich die vergleichsweise kurzen Adapterprimer auf eine definierte Nukle basissequenz abgestimmt werden, wahrend die Verlangerungssequenzen gleichsam universell sein können, i.e. für verschiede- ne Nuklemsaurebasissequenzen sind stets die gleichen bzw. einige wenige ausgewählte Verlangerungsequenzen einsetzbar. Somit können die relativ aufwendig herzustellenden Verlangerungsequenzen einer breiten Nutzung zugeführt werden und für eine spezifische Nukleinsau- rebasissequenz müssen lediglich die Adaptersequenzen hergestellt werden. Dies ist jedoch wenig aufwendig, da die Adaptersequenzen vergleichsweise kurz sein können. Dies erlaubt es beispielsweise, sowohl eine regulatorischen Sequenz als auch eine ribosomalen Bindungssequenz, jeweils über einen der Verlangerungsprimer, an eine Nukleinsaurebasissequenz anzufügen, und zwar sogar m einem PCR Schritt. So kann eine Nukleinsäure erhalten werden, die eine besonders hohe Transskripti- ons- und/oder Translationsefflzienz einem pro- karyontischen System der zellfreien Proteinbiosynthese ergibt.
Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist, daß es sich um ein allgemein anwendbares Verfahren für beliebige codierende Sequenzen handelt.
Die Hybridisierung mit einem Primer am 3' und 5' Ende bezieht sich insbesondere auf doppelstrangige Nukleinsäuren, wobei die Hybridisierung des Pri ers jeweils am 5 -Ende des sense- und antisense-Stranges erfolgt. Auf den Einzelstrang bezogen findet die Hybridisierung mit den verschiedenen vorstehend und folgend beschriebenen Primern am jeweiligen 5 '-Ende statt.
Ausfuhrungsformen der Erfindung.
Von selbststandiger Bedeutung ist eine Weiterbildung der Erfindung, wobei das Produkt aus der Stufe b) in einer Stufe c) am 3 ' Ende und am 5' Ende mit jeweils einem Amplifikationsprimer hybridisiert werden kann, wobei eine amplifizierte Nuklemsaureendsequenz gebildet wird. Auch die Amplifikationsprimer sind einerseits vergleichsweise kurz und universell einsetzbar und folglich leicht verfugbar. Mittels der Amplifikationsprimer können zudem weitere (kürzere) Sequenzen an den Enden angefügt werden, welche die Translationseffizienz weiter erhöhen. Auch sind mittels der kurzen Amplifikationsprimer Variationen und Modifikationen an den Enden der Nukleinsäuren mit wenig Aufwand einführbar. Dies ist insbesondere deshalb von Vorteil, da damit für Variationen und Modifikationen keine unterschiedlichen Verlängerungsprimer hergestellt zu werden brauchen, was wiederum in störendem Maße aufwendig wäre.
Ein Beispiel für eine Variation bzw. Modifikation ist der Einbau eines Biotinrestes, am 5 '-Ende des Amplifi- kationsprimers gekoppelt. Hierdurch wird nach Inkuba- tion der Nukleinsäureendsequenz mit beispielsweise Biotin-bindendem Streptavidin eine gegen Exonuklease- Abbau stabilisierte Nukleinsäureendsequenz erhalten, welche eine Erhöhung der Halbwertszeit in einem in vitro Proteinbiosynthesesystem gegenüber einer nicht stabilisierten Nukleinsäureendsequenz um ein Vielfaches, typischerweise mehr als 5-fach, beispielsweise von ca. 15 min. auf ca. 2 h, aufweist. Es werden Stabilitäten erreicht, welche mit jenen von zirkulären Plasmiden vergleichbar sind und diese insofern gleich- wertig ersetzen können. Eine Alternative ist eine Stabilisierung mittels Digoxygenin, welches Anti-Digoxy- genin-Antikörper bindet. Die Stabilisierende Gruppe kann insbesondere an beiden Enden der Nukleinsäureendsequenz eingerichtet sein. Ein anderes beispiel ist eine Modifikation mit einem Affinitytag bzw. einer hierfür codierenden Sequenz oder eine Ankergruppe bzw. einer hierfür codierenden Sequenz. Eine Ankergruppe erlaubt eine Immobilisierung durch Bindung der Ankergruppe an eine Festkorperoberflache mit ge- matchten Bindungssites. Die Ankergruppe kann an der Nukleinsäure selbst angebracht sein, es kann aber auch eine hierfür codierende Sequenz vorgesehen sein.
Die Adapterprimer enthalten typischerweise < 70, insbesondere 20 - 60, Nucleotide. Die Verlangerungsprimer enthalten typischerweise > 70, auch 90 und mehr, Nucleotide. Die Amplifikationsprimer wiederum enthal- ten typischerweise < 70, meist < 30, Nukleotide, typischerweise > 9 Nukleotide. Lediglich die Adapterprimer müssen an eine definierte Nukleinsaurebasissequenz spezifisch angepaßt werden, was im Lichte der relativ kurzen Sequenzen mit wenig Aufwand verbunden ist.
Vorteilhafterweise werden die Schritte a) , b) und optional der Schritt c) in einer PCR Losung enthaltend die Nukleinsaurebasissequenz, die Adapterprimer, die Verlangerungsprimer und optional die Ampliflkati- onsprimer durchgeführt. Es handelt sich dann um e ne Einstufen PCR mit insgesamt 6 Primern, zwei Adap- tersquenzen, zwei Verlangerungssequenzen und zwei Amplifikationssequenzen. Dabei reicht es, die Adapterprimer und Verlangerungsprimer in geringen Konzentra- tionen einzusetzen und insofern auch nur eine geringe Menge an Zwischenprodukt zu erzeugen. Das Zwischenprodukt braucht zudem nicht homogen vorliegen, wodurch aufwendige Optimierungen entfallen können. Aufgrund der Kurze der Amplifikationsprimer sind auch bei der Amplifikation auf die hohe Menge an Nuklemsaureendsequenz keine Optimierungen erforderlich. Alternativ zu der vorstehenden Ausführungsform ist von selbstständiger Bedeutung eine Variante, die mit zwei PCR Stufen arbeitet. Dabei werden die Schritte a) und b) in einer Verfahrenstufe A) in einer Vor-PCR Lösung enthaltend die Nukleinsaurebasissequenz, die Adapterprimer und die Verlangerungsprimer für eine definierte erste Zyklenzahl durchgeführt und wird der Schritt c) in einer Verfahrenstufe B) in einer Haupt-PCR Lösung enthaltend das PCR Produkt aus der Stufe A) und die Amplifikationsprimer für eine definierte zweite Zyklenzahl durchgeführt. Dabei kann die Stufe A) in einem Reaktionsvolumen durchgeführt werden, welches 1/2 bis 1/10 des Reaktionsvolumens der Stufe B) beträgt. In der Stufe A) entsteht dann, bedingt durch das ge- ringere Volumen eine höhere Konzentration an Zwischenprodukt bzw. es kann deutlich weniger Nukleinsaurebasissequenz eingesetzt werden. Mit der Verdünnung mittels PCR-Ansatzvolumen beim Übergang von der Stufe A) zur Stufe B) werden wiederum die Adapterprimer sowie die Verlangerungsprimer stark verdünnt mit der Folge einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit des Einbaus von Variationen und/oder Modifikationen in die Nukleinsäu- reendsequenzen über die Amplifikationsprimer .
Im Einzelnen kann in der ersten vorstehenden Alternative so verfahren werden, daß die PCR in einem Reaktionsvolumen von 10 bis 100 μl, vorzugsweise 20 bis 40 μl, mit 0,01 bis 100 pg, vorzugsweise 1 bis 50 pg, Nukleinsaurebasissequenz, 0,05 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM, Adapterprimer und 0,005 bis 0,5 μM, vorzugsweise 0,001 bis 0,1 μM, Verlangerungsprimer durchgeführt wird, wobei nach einer definierten Anfangszyklenzahl 0,01 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 10 μM, Amplifikationsprimer zugegeben werden, und wobei mittels einer definierte Anzahl anschließender Zyklen die amplifizierte Nukleinsäureendsequenz hergestellt wird. In der zweiten vorstehenden Alternative empfehlen sich die folgenden Reaktionsbedingungen: Stufe A) : Reaktionsvolumen < 10 μl; 0,001 bis 5 pg, vorzugsweise 0,01 bis 1 pg, Nukleinsaurebasissequenz; 0,05 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 uM, Adapterprimer und 0,05 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM, Verlangerungsprimer; erste Zyklenzahl 10 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25,
Stufe B) : Reaktionsvolumen 10 bis 100 μl, vorzugsweise 15 bis 50 μl, erhalten durch Ergänzung der Lösung aus Stufe A) mit PCR-Ansatzlösung; 0,01 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM, Amplifikationsprimer; zweite Zyklenzahl 15 bis 50, vorzugsweise 20 bis 40.
Die Erfindung lehrt weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Nukleinsäuren für die zellfreie in vitro Proteinbiosyn- these, insbesondere in prokaryontischen Systemen, vorzugsweise in einem Translationsystem aus Escheria coli D10.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren ist vorteilhafterweise einsetzbar zur selektiven Amplifikation einer definierten Nukleinsaurebasissequenz aus einer Nukleinsäu- rebibliothek. Dies ermöglicht eine Charakterisierung von Gensequenzen, wobei die Gensequenz als Nukleinsäurenbasissequenz eingesetzt wird und wobei das erhalte- ne Protein hinsichtlich Struktur und/oder Funktion analysiert wird. Der Hintergund dieses Aspekts der Erfindung ist, daß für viele Gene zwar die Sequenzen bekannt sind, nicht jedoch die Struktur und Funktion des dadurch codierten Proteins. Somit können Elemente einer Genbibliothek, zu welchen lediglich die Sequenz als solche bekannt ist, auf ihre Funktion in einem Organismus untersucht werden. Die Untersuchung der Struktur und Funktion des erhaltenen Proteins folgt dabei üblichen Arbeitsmethoden der Biochemie.
Mittels des erf dungsgemaßen Verfahrens lassen sich Nukleinsäuren gewinnen, welche eine für ein Protein codierenden Nukleinsaurebasissequenz und eine πboso- male Bindungssequenz sowie optional eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus "Promotorsequenz, Transskriptionstermmatorsequenz, Expressions- enhancersequenz, Stabilisierungssequenz und Affini- tytagsequenz" enthalten. Eine Affmitytagsequenz codiert für eine Struktur, welche eine hohe Affinität für (meist immobilisierte) Bindungsstellen in Trennsystemen zur Aufreinigung aufweist. Dadurch ist eine leichte und hochaffine Abtrennung von Proteinen, wel- ehe das Affmitytag nicht enthalten, möglich. Ein Beispiel hierfür ist Strep-tag II, eine Peptidstruktur aus 8 Ammosaureresten mit Affinität zu StrepTactm. Eine Stabilisierungssequenz codiert für eine Struktur, welche entweder selbst, oder nach Bindung mit einem für die Struktur spezifischen Bmdungsmolekul, eine Stabilisierung gegen Degradation, insbesondere durch Nukleasen, bewirkt. Eine Stabilisierung einer Nukleinsäure (end) sequenz kann auch dadurch erfolgen, daß an einem Ende, vorzugsweise an beiden Enden, eine Biotin- gruppe eingebaut ist, welche mit Streptavid umgesetzt sein kann. Dieser Enbau kann durch Einsatz von Biotin tragenden Primern, insbesondere Amplifikati- onsprimern, erfolgen. Eine Expressionsenhancersequenz steigert die Translationseffizienz gegenüber einer Nukleinsäure ohne Expressionsenhancersequenz . Dabei kann es sich beispielsweise um (nicht translatierte) Spacer handeln. Eine Transkriptionsterminatorsequenz terminiert die RNA-Synthese. Ein Beispiel hierfür ist der T7 Phage Gen 10 Transskriptionsterminator . Transs- kriptionsterminatorsequenzen können auch gegen Degradation durch 3' Exonukleasen stabilisieren. Vorteilhafte relative Anordnungen der vorstehenden Sequenze- lemente zueinander lassen sich aus den folgenden Ausführungsbeispielen verallgemeinern.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von lediglich bevorzugte Ausführungsformen darstellenden Beispielen näher erläutert.
Methoden:
PCR: Die PCR wurde in einem in den Beispielen quantifizierten Reaktionsvolumen mit 10 mM Tris-HCl (pH 8,85 bei 20°C), 25 mM KCl, 5 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 0,25 mM jeder dNTP, 3 U Pwo DNA Polymerase (Röche) sowie der in den Beispielen angegebenen Menge Nukleinsäureba- sissequenz durchgeführt. Die Zyklen wurden für 0,5 min. bei 94°C, 1 min. bei 55°C und 1 min. bei 72°C durchgeführt .
In vitro Expression: In vitro Experimente wurden gemäß der Literaturstelle Zubay, G.; Annu. Rev. Genet. 7:267-287 (1973) mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. Das Escherichia coli S-30 Lysat wurde mit 750 U/ml T7 Phagen RNA Polymerase (Stratagene) und 300 μM [1C]Leu (15 dpm/p- mol, 7Λmersham) supplementiert . PCR Produkte und Kon- trollplasmide wurden in Konzentrationen von 1 nM bis 15 nM eingesetzt. Die Reaktionen wurden bei 37 °C durchgeführt, wobei der Verlauf dadurch verfolgt wurde, daß zu subsequenten Zeitpunkten 5 μl Aliquoten der Reaktionsmischung entnommen und der Einbau von [14C]Leu mittels TCA Präzipitation abgeschätzt wurde. Weitere 10 μl Aliquoten wurden zwecks Analyse des syntheti- sierten Proteins mittels SDS-PAGE, gefolgt von einer Autoradiographie in einem Phosphoimager-System (Mo- lecular Dynamics) entnommen.
Plasmid Konstruktion: Ein high copy Derivat des Plasmids pET BH-FABP
(Specht, B. et al . ; J. Biotechnol. 33:259-269 (1994)), welches für bovine heart fatty acid bindung protein codiert wurde konstruiert, pHMFA genannt. Ein Fragment von pET BH-FABP wurde durch Verdau mit den Endonuklea- sen SphI und EcoRI erzeugt und in den Vektor pUClδ insertiert. Bezüglich der Sequenzen, welche für die Synthese von H-FABP relevant sind, ist das Plasmid pHMFA identisch mit dem Originalplasmid. Es sei angemerkt, daß das linearisierte Plasmid sich nicht besser als das circuläre Plasmid verhält.
Konstruktion von Nukleinsäuren mit verschiedenen Sequenzbereichen upstream des Promotors:
Das Plasmid pHMFA diente als Matrize für die Konstruk- tion von Nukleinsäuren mit verschiedenen Sequenzbereichen upstream des Promotors. Die Konstrukte (siehe Beispiele) FA1, FA2 und FA4 mit 0, 5 und 249 Basenpaaren upstream des Promotors wurden mit den Primern Pl, Cl und P2 sowie mit dem downstream Primer P3 generiert. Das Konstrukt FA3 mit einem Sequenzbereich von 15 Basenpaaren upstream des Promotors wurde durch Verdau von FA4 mit der Endonuklease Bgl II erhalten. Das Kontrollplasmid pHMFA(EcoRV) mit einem Sequenzbereich von 3040 Basenpaaren wurde durch Verdau des Plasmids mit EcoRV erhalten. Alle Produkte wurden gereinigt durch Agarose Gel Elektrophorese, gefolgt von Gel Extraktion mittels des "High Pure PCR Product Purifica- tion Kit".
Affinitätsreinigung:
Die Reinigung des fatty acid binding protein enthaltend Strep-tag II (Voss, S. et al . ; Protein Eng. 10:975-982 (1997)) wurde mittels Affinitätschromatographie gemäß Herstellervorschrift (IBA Göttingen, Deutschland) durchgeführt mit der Abweichung eines reduzierten Volumens der Affinitätssäule (200 μl) . Die Reaktionsmischung der gekoppelten Transkription/Trans- lation wurde kurz zentrifugiert und dann auf der Säule aufgetragen. Isolierte Fraktionen wurden durch TCA Präzipitation und Autoradiographie nach SDS-PAGE (s.o.) analysiert.
H-FABP Aktivitätsassay:
Die vollständige Reaktionsmischung mit in vitro synthetisiertem H-FABP wurde auf die Aktivität der Bindung von Oleinsäure untersucht. Verschiedene Volumina (0 - 30 μl) wurden mit Reaktionsmischung ohne H-FABP auf 30 μl aufgefüllt und mit Translationpuffer (50 mM HEPES pH 7,6, 70 mM KOAc, 30 mM NH4C1, 10 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 0,002 % NaN3) auf ein Endvolumen von 120 μl verdünnt. Nach Zugabe von 2 μl 5 mM [9,10(n)-3H] Oleinsäure (Amersham) mit einer spezifischen Aktivität von 1000 dpm/pmol wurden die Proben für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. 50 μl der Proben wurden zur Entfernung ungebundener Oleinsäure mittels Gelfiltration (Micro Bio Spin Chromatographie Columns; Bio-Rad) eingesetzt. Die 3H Radioaktivität der eluierten Fraktionen wurde mittels eines Scintillationszählers gemessen.
Analyse der Stabilität der Nukleinsäuren:
Radioaktiv markierte Nukleinsäuren wurden gemäß den vorstehenden Bedingungen synthetisiert, jedoch in Gegenwart von 0,167 μCi/μl [α-35S] dCTP. Die markierten Nukleinsäuren wurden in einer gekoppelten Transskrip- tion/Translation, Reaktionsvolumen 400 μl, eingesetzt. 30 μl Aliquoten wurden an aufeinanderfolgenden Zeitpunkten entnommen. Nach der Zugabe von 15 μg Ribonu- klease A (DNAse-frei, Röche) wurden diese für 15 min. bei 37°C inkubiert. Eine weitere Inkubation für 30 min. bei 37°C wurde nach Zugabe von 0, 5 % SDS, 20 mM EDTA und 500 μg/ml Proteinase K (Gibco BRL) in einem Gesamtreaktionsvolumen von 60 μl durchgeführt. Verbleibende PCR Produkte wurden weiter gereinigt mittels Ethanolfällung und wurden danach einer denaturierenden Elektrophorese (5,3% Polyacrylamid, 7 M Harnstoff, o,l % SDS, TBE) unterzogen. Das getrocknete Gel wurde zur Quantifizierung der Radioaktivität durch ein Phosphoi- mager System (Molecular Dynamics) laufen gelassen.
Sequenzen:
Eingesetzte Pri ersequenzen sind in der Figur 1 dargestellt. Beispiel 1: PCR mit vier Primern
In der Figur 2 ist eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Einstufen-PCR mit vier Primern dargestellt. Mittig erkennt man zunächst die für ein Protein codierende Nukleinsaurebasissequenz, welche die vollständige Codierungssequenz für H-FABP (homogeneous and functionally active fatty acid binding protein from bovine heart) , erhalten als ein 548 bp Restriktionsfragment aus pHMFA durch Verdau mittels der Endonu- kleasen Ncol und BamHI, umfaßt (sowie eine 150 bp Sequenz am 3 '-Ende, welche weder translatiert wird, noch zu einem Adapterprimer oder Verlangerungsprimer com- plementär ist) . Hieran werden die beiden Adapterprimer A und B hybridisiert, welche mit den Enden der Nukleinsaurebasissequenz homologe Enden umfassen. Der Adapterprimer A enthält weiterhin eine ribosomale Bindungssequenz. An die außenliegenden Enden der Adapter- primer A und B werden die Verlangerungsprimer C und D hybridisiert. Der Verlängerungprimer C umfaßt die T7 Gen 10 Leadersequenz einschließlich des T7 Transskrip- tionspromotors sowie optional upstream eine Sequenz von beispielsweise 5 Nukleotiden. Der Verlänge- rungsprimer D umfaßt die T7 Gen 10 Terminatorsequenz.
Beispiel 2: Effizienz der H-FABP Synthese in Abhängigkeit des Sequenzbereiches upstream des Promotors.
Vier PCR Produkte (FA1 bis FA4) mit verschiedenen Sequenzbereichen upstream des Promotors (0, 5, 15, 250 Basenpaare) und das linearisierte Kontrollplasmid pHMFA(EcoRV) mit 3040 bp upstream des Promotors wurden in verschiedenen Konzentrationen (1, 5, 10 und 15 mM) auf in vitro Transskription/Translation untersucht. Die Figur 3 zeigt, daß alle Sequenzbereiche, außer 0 (untere Kurve) , eine Erhöhung der Proteinsynthese bewirken. Bereits 5 Basenpaare reichen aus.
Beispiel 3: Verbesserung der H-FABP Synthese durch Phage T7 Gen 10 Transskriptionsterminator/5 ' leader Sequenz Phage T7 Gen 10.
In der Figur 4 erkennt man, daß durch den Phage T7 Gen 10 Transskriptionsterminator die Synthese um zumindest einen Faktor 2,8 verbessert werden kann. Die Dreiecke stehen für FAΔt und die Quadrate für FAt (siehe auch Fig. 2) .
Weiterhin erkennt man in der Figur 4, daß eine Deleti- on von 34 bp zwischen dem Transskriptionsanfang und der epsilon-Sequenz (Olins, P.O. et al . ; Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264:16973-16976 (1989) zu einer Unterdrückung einer Produktbildung führt. Die Kreise stehen für diese Variante FAΔ34 (siehe auch Fig. 2) .
Beispiel 4: Einfluß der Lage der Transskriptionster- minatorsequenz .
Zur Untersuchung des Einflusses der Lage der Terminatorsequenz wurden die Produkte FAst und FAast (siehe Fig. 2) erzeugt. Beide sind identisch mit FAt und FAat, außer daß eine 22 bp Spacersequenz zwischen dem Stopcodon und dem Terminator mittels unterschiedlicher Primer eingeführt wurde. In der Fig. 5 erkennt man, daß die Spacersequenz eine etwa 2-fache Erhöhung der Expression bewirkt.
In der Figur 5 ist aber auch aus einem Vergleich von FAt und FAat weiterhin zu erkennen, daß ein Affmitytag kaum Einfluß auf die Expression hat.
Beispiel 5: PCR aus einer komplexen DNA Mischung.
Die Effektivität und Spezifität des erfindungsgemäßen Verfahrens wurde in Gegenwart einer hohen Menge an kompetitiver DNA untersucht. Eine PCR für FAst wurde entsprechend der vorstehenden Beschreibungen ausgeführt mit den folgenden Ausnahmen: die Nukleins urebasissequenz wurde in Konzentrationen von 0,16 bis 20 pg/50 μl Reaktorvolumen durchgeführt und die Reaktio- nen wurden mit 0,83 μg chromosomaler DNA aus Escheri- chia coli, ultraschallbehandelt für 5 min., supplemen- tiert. Es wurde gefunden, daß weder die Qualität noch die Quantität des PCR Produkts durch die Anwesenheit eines 5-millionenfachen Überschusses an kompetitiver DNA beeinflußt wurde.
Beispiel 6: Affinitätsreinigung mit Strep-tag II.
Eine Reaktionsmischung mit 10 μg des radioaktiv markierten FAast wurde der Affinitätsreinigung unterworfen. Etwa 81 % des aufgetragenen Materials wurde von der Säule erhalten und 67 % konnten als reines Produkt m den Elutionsfraktionen gewonnen werden (berechnet aus TCA Prazitipation der Fraktionen der Affmitatssaule) .
Beispiel 7: Aktivität des PCR Produkts.
Proben von H-FABP, synthetisiert entweder mittels des Plasmids oder als PCR Produkt FAast, wurden miteman- der hinsichtlich der Bmdungsaktivitat für Oleinsäure untersucht. Nach der Transskription/Translation wurden verschiedene Volumina mit 0 bis 330 pmol nicht-mar- kierten H-FABP in einem B dungsassay gemäß der vorstehenden Beschreibung zu Methoden untersucht. Die Aktivitäten wurden als identisch gefunden, unabhängig von dem Herstellungsweg.
Beispiel 8: Stabilität des PCR Produkts.
Zur Untersuchung, ob die Stabilität des PCR Produkts möglicherweise die Effektivität der Expression begrenzen konnte, wurde die Abnahme des PCR Produktes FAast gemessen. Es wurde hierfür das radioaktiv markierte Produkt eingesetzt. In bestimmten Zeitabstanden wurden Aliquoten des Reaktionsgemisches entnommen und mittels denaturierender Polyacrylamid Gelelektrophorese untersucht. Die Menge am verbleibendem PCR Produkt wurde durch Scannen der Radioaktivität des Gels quantifi- ziert und mit dem Zeitverlauf der Protemsynthese, gemessen durch Scannen der Radioaktivität von H-FABP im Gel nach Auftrennung der Reaktionsmischungen mittels SDS-PAGE, verglichen. Die Ergebnisse sind in der Figur 6 dargestellt. Man erkennt, daß die Halbwertzeit des PCR Produkts ca. 100 min. beträgt, was dem Einlauf der H-FABP Synthese in ein Plateau entspricht.
Beispiel 9: Optimierte Bedingungen für eine PCR mit vier Primern.
In der Tabelle I sind optimierte Bedingungen für eine PCR mit vier Primern in einem Reaktionsvolumen von 25 μl zusammengefaßt.
Tabelle I
a) Reaktionskomponenten
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b) Temperaturpro ramm
Figure imgf000023_0002
Beispiel 10: PCR mit sechs Primern.
Mit den Materialien aus Beispiel 9, jedoch mit zusätzlich zwei Amplifikationsprimern e (26 Nucleotide) und f (33 Nucleotide) sowie einer erhöhten Adapterprimer- Konzentration von 0,2 μM wurden variierende Verlangerungsprimer Konzentrationen eingestellt. Bezüglich der Amplifikationsprimer wird auf die Figur 1 verwiesen, dort BIOR und BIOF. BIOF ist ein biotinmarkierter For- wardprimer und BIOR ein biotinmarkierter Reversepri- mer. Die Struktur ist in der Fig. 7 dargestellt.
Ein minimaler Bedarf an teurem Verlangerungsprimer ergab sich, wenn zunächst 25 Zyklen ohne Amplifikati- onsprimer und anschließend weitere 25 Zyklen mit
Amplifikationsprimer gefahren wurden. Die Konzentration an Verlangerungsprimer konnte durch den Einsatz der Amplifikationsprimer bis auf 0,025 uM gesenkt werden, ein Faktor von ca. 1/20, bei dennoch verbesserter Ho- mogenität und Ausbeute an PCR Produkt.
Diese Vorteile beruhen darauf, daß die Wahrscheinlichkeit der Bildung von Zwischenprodukten in hohen Konzentrationen mit dem Einsatz der sechs Primer stark reduziert ist, da die Primer, die zur Entstehung der Zwischenprodukte erforderlich sind, in geringen Konzentrationen eingesetzt werden. Zwischenprodukte kön¬ nen folglich nicht mit den Amplifikationsprimern expo- nentiell angereichert werden.
Beispiel 11: PCR mit sechs Primern in zwei Stufen.
Grundsätzlich wird mit den Materialien, wie vorstehend angegeben, gearbeitet. Zunächst wird eine Vor-PCR in einem Reaktionsvolumen von 5 μl mit 0,1 pg Nukleinsaurebasissequenz durchgeführt, und zwar mit 0,3 uM Adapterprimer und 0,5 μM Verlangerungsprimer über 20 Zyklen. Dann wird die so erhaltene Reaktionslösung mit PCR Ansatzvolumen auf 25 μl verdünnt. Dann wird Amplifikationsprimer auf eine Endkonzentration von 0,5 μM zugegeben. Schließlich wird für weitere 30 Zyklen amplifiziert.
Beispiel 12: Stabilisierung einer Nukleinsäure mit Biotin.
Es wurde unter Einsatz der Primer BIOF und BIOR im Wege der PCR mit 6 Primern, wie vorstehend beschrieben, eine Nukleinsäure hergestellt und deren Abbau als Funktion der Zeit sowie die Verbesserung der Protein- synthese untersucht. Dies ist in den Figuren 7 und 8 dargestellt. Man erkennt, daß sich mit Biotin, insbesondere nach Umsatz mit Streptavidin eine erheblich verbesserte Stabilität ergibt. Dies führt auch zu einer bis zu 20% höheren Proteinsynthese.
Unabhängig von den vorstehenden Beispielen ist anzumerken, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch sehr leicht Variationen der Sequenzen durch Mutationen möglich sind, beispielsweise durch Einsetzen von Taq- Polymerase und/oder veränderten Reaktionsbedingungen. Wenn dies nicht gewünscht ist, so kann vorzugsweise mit Pwo oder Pfu gearbeitet werden, welche genauer funktionieren und proofreading Aktivität haben.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur präparativen Herstellung von langen Nukleinsäuren mittels PCR und mit den folgenden Hybridisierungsschritten:
a) eine Nukleinsäurenbasissequenz wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Adapterprimer hybridisiert,
b) das Produkt aus Stufe a) wird am 3' und 5' Ende mit jeweils einem Verlangerungsprimer, welcher eine Verlängerungssequenz enthält, hybridisiert,
wobei aus der Nukleinsaurebasissequenz eine an dem 3' und dem 5' Ende der Nukleinsaurebasissequenz um die Verlängerungssequenzen verlängerte und amplifi- zierte Nukleinsäuresequenz gebildet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Produkt aus der Stufe b) in einer Stufe c) am 3 ' und 5' Ende mit jeweils einem Amplifikationsprimer hybridisiert wird, wobei eine amplifizierte Nukleinsäureendse- quenz gebildet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Adapterprimer < 70 Nucleotide enthalten, wobei die Ver- längerungsprimer > 70 Nucleotide enthalten, und/oder wobei die Amplifikationsprimer < 70 Nukleotide enthalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Schritte a) , b) und optional der Schritt c) in einer PCR Lösung enthaltend die Nukleinsaurebasissequenz, die Adapterprimer, die Verlangerungsprimer und optional die Amplifikationsprimer durchgeführt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Schritte a) und b) in einer Verfahrenstufe A) in einer Vor-PCR Lösung enthaltend die Nukleinsaurebasissequenz, die Adapterprimer und die Verlangerungsprimer für eine definierte erste Zyklenzahl durchgeführt werden und wobei der Schritt c) in einer Verfahrenstufe B) in einer Haupt-PCR Lösung enthaltend das PCR Produkt aus der Stufe A) und die Amplifikationsprimer für eine definierte zweite Zyklenzahl durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die PCR in einem Reaktionsvolumen von 10 bis 100 μl, vorzugsweise 20 bis 40 μl, mit 0,01 bis 100 pg, vorzugsweise 1 bis 50 pg, Nukleinsaurebasissequenz, 0,05 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM, Adapterprimer und 0,005 bis 0,5 μM, vorzugsweise 0,001 bis 0,1 uM, Verlangerungsprimer durchgeführt wird, wobei nach einer definierten Anfangszyklenzahl 0,01 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM Amplifikationsprimer zugegeben werden, und wobei mittels einer definierte Anzahl anschließender Zyklen die ampli- fizierte Nukleinsäureendsequenz hergestellt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 5, mit den folgenden Reaktionsbedingungen :
Stufe A) : Reaktionsvolumen < 10 μl; 0,001 bis 5 pg, vorzugsweise 0,01 bis 1 pg, Nukleinsaurebasissequenz; 0,05 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM, Adapterprimer und 0,05 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM, Verlangerungsprimer; erste Zyklenzahl 10 bis 30, vorzugsweise 15 bis 25,
Stufe B) : Reaktionsvolumen 10 bis 100 μl, vorzugsweise 15 bis 50 μl, erhalten durch Ergänzung der Losung aus Stufe A) mit PCR-Ansatzlosung; 0,01 bis 10 μM, vorzugsweise 0,1 bis 5 μM, Amplifikationsprimer; zweite Zyklenzahl 15 bis 50, vorzugsweise 20 bis 40.
8. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung von Nukleinsäuren für die zellfreie m vitro Proteinbiosynthese, insbesondere m prokaryontischen Systemen, oder für in vitro Transkriptionssysteme.
9. Verwendung nach Anspruch 8 in einem Translationsy- stem aus Escheria coli D10.
10. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprü¬ che 1 bis 7 zur selektiven Amplifikation einer definierten Nukleinsaurebasissequenz aus einer Nukleinsäurebibliothek.
11. Verwendung eines Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Charakterisierung von Gensequenzen, wobei die Gensequenz als Nukleinsäurenbasissequenz eingesetzt wird und wobei das erhaltene Protein hinsichtlich Struktur und/oder Funktion analysiert wird.
12. Nukleinsäure für zellfreie Proteinbiosynthesesysteme enthaltend eine für ein Protein codierenden Basisequenz und eine ribosomale Bindungssequenz sowie optional eine oder mehrere Sequenzen aus der Gruppe bestehend aus "Promotorsequenz, Transskriptionsterminatorsequenz, Expressionsenhancersequenz, Stabilisierungssequenz und Affinitytagsequenz" .
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