WO2002089854A1 - Transfert de genes et facteur angiogenique pour maladie de la peau - Google Patents

Transfert de genes et facteur angiogenique pour maladie de la peau Download PDF

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WO2002089854A1
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hgf
skin
therapeutic
wound
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Ryuichi Morishita
Kuniaki Nakanishi
Yasufumi Kaneda
Hitoshi Kotani
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Anges Mg, Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to the use of an angiogenic factor gene for skin diseases. More specifically, the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent containing an angiogenesis factor gene as an active ingredient, and a method characterized by administering an angiogenesis factor gene to a target site.
  • Angiogenic factors include hepatocyte growth factor (HGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), fibroblast growth factor (FGF) and hypoxia inducible factor (HIF).
  • HGF hepatocyte growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • FGF fibroblast growth factor
  • HIF hypoxia inducible factor
  • Skin disorders include wounds, baldness, skin ulcers, pressure sores (bedsores), scars (keloids), atopic dermatitis, skin damage after skin transplantation, including autotransplantation and allogeneic transplantation. Background art
  • Angiogenesis factor refers to not only stimulating in vivo the development of new blood vessels and angiogenesis initiated with the activation of parental endothelial cells, but also mitojek of endothelial cells in vitro. Are the growth factors indicated. Examples of angiogenic factors include HGF, VEGF, FGF and HIF. The therapeutic application of angiogenic factors was first published in Folkman et al. (N. Engl. J. Med. 285, 1182-1186 (1971)).
  • angiogenic factors such as the FGF family (Science 257, 1401-1403 (1992), Nature 362, 844-846 (1993)) and VEGF, can be used to produce myocardial and lower limb ischemia. It has been identified that it can promote and / or enhance collateral circulation development in animal models of disease (Circulation 90, II-228-II-234 (1994)). Furthermore, the present inventors have found that HGF acts as an endothelial-specific growth factor similarly to VEGF (J. Hypertens. 14, 1067-1072 (1996)). HGF is a cytokine that was discovered as a potent growth-promoting factor for mature stem cells, and its gene has been cloned [Biochem. Biophys. Res. Commun.
  • HGF is a plasminogen-related and mesenchymal-derived pleiotropic growth factor, and is known to regulate cell growth and cell motility in various types of cells [Nature 342: 440-443 (1989); Biochem. Biophys. Res. Comniun. 239: 639-644 (1997); J. Biochem. Tokyo 119: 591-600 (1996)].
  • HGF is an important factor regulating the morphogenetic process during embryogenesis and regeneration of some organs.
  • HGF is a potent mitogen of hepatocytes and other epidermal cells, including keratinocytes [Exp. Cell Res. 196: 114-120 (1991)].
  • HGF As the name implies, it is a substance found in the liver, but actually present in the body. This HGF has the effect of proliferating cells. When injured, cell division occurs rapidly around the wound and the wound is repaired, which is also due to the action of HGF.
  • the dermatology team at Juntendo University has identified this substance as one of the hair growth factors. HGF promotes hair cell division and promotes hair growth Have. The administration of HGF to hair matrix cells of the scalp, which has undergone softening by male hormones, is thought to regenerate thick hair.
  • HGF has various functions including the function of an angiogenic factor, and various attempts have been made to utilize it as a pharmaceutical.
  • the issue here has been the half-life of HGF in the blood.
  • the half-life of HGF was as short as about 10 minutes, it was difficult to maintain the blood concentration, and the transfer of an effective amount of HGF to the affected area became a problem.
  • VEGF is a dimeric glycoprotein that is mitogenic to endothelial cells and has the ability to increase vascular permeability. VEGF is a directly on endothelial cells, have specific My Tojienikku effects (Biochem. Biophys. Res. Commun ., 161, 851-858 (1989)) 0
  • HIF promotes erythrocyte production, increases erythropoietin to increase systemic oxygen supply, VEGF and its receptor to promote angiogenesis and increase local oxygen supply, and synthesizes ATP in anoxic condition It is a transcription factor that plays a central role in the transcriptional activation of genes for glycolytic enzymes that confer resistance to cells.
  • HIF-1 is a heterodimer consisting of HIF-1 and HIF-liS, and HIF-lj3 (also called Arnt) is involved in the metabolism of foreign foreign substances such as dioxin, and both Ah receptor and heterodimer. It has already been found that it functions to regulate the transcription of drug metabolizing enzyme genes.
  • gene therapy can be used in the treatment of a variety of ambulation disorders [ence 256: 808-813 (1992); Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987)].
  • vectors for gene transfer are viruses such as adenovirus One.
  • virus / sbetater is potentially dangerous.
  • Alternatives include HVJ-liposome-mediated gene transfer, which uses ribosomes, which have been reported as an effective in vivo gene transfer method, with the viral outer membrane and has little toxicity [Science 243: 375-378]. (1989); Anal.
  • Wound healing consists of a series of events, including inflammation, angiogenesis, matrix synthesis and collagen deposition, leading to reendothelialization, angiogenesis and the formation of granular tissue [Clark RAF Ed.] Overview and general cons ideration of wound repair. Moleular and Cellular Biology of Wound Repair. "Plenum Press. New York (1996) 3-50; An nu. Rev. Med. 46: 467-481 (1995); J. Pathol. 178: 5-10 (1996) ].
  • the healing process involves fibroblasts (FGF), transforming growth factor (TGF-a), transforming growth factor- ⁇ (TGF- ⁇ ), epidermal growth factor (EGF), platelet-derived growth factor (PDGF) It is regulated by a number of mitodins and chemotactic factors, including growth factors such as vascular endothelial cell growth factor (VEGF).
  • FGF fibroblasts
  • TGF-a transforming growth factor
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • HGF promotes wound sealing by epithelium in the T84 intestinal monolayer by enhancing cell turnover [J. Clin. Invest. 93: 2056-2065 (1994). ] 0
  • in vivo administration of recombinant HGF promotes the regeneration of epithelial cells in rat kidney damaged by antitumor agents [Gene Therapy 7: 417-427 (2000)] 0
  • Subcutaneous administration of recombinant HGF to gastric ulcers caused by rat frostbite increased serum HGF concentration, but had no effect on the rate of gastric ulcer healing. 8 to 15 days after frostbite induction
  • Epithelial cell proliferation increased in [Gastroenterology 113: 1858-1872 (1997)] 0
  • TGF- ⁇ expression is a key event in wound healing.
  • TGF- stimulates fibroblasts to produce matrix proteins, matrix protease inhibitors, and integrin receptors, thereby modulating matritosis formation and cell-cell interactions at the wound site
  • Rokerts AB, Aporn MB ". Transform ing growth factor- j3 the Molecular and Cellular Biology of Wound Repair” second edition, Clark RAF ed. (. Plenum Press New York, 1996 years, pp. 275-308).
  • TGF-j81 dysregulation and sustained overexpression have been reported to increase TGF-mRNA expression in tissues of patients with dermal fibrosis (eg, hypertrophic scars and keloids) [Am. J. Pathol.
  • TGF - / 3 neutralizing antibodies not only to reduce the cells in the wound granulation tissue in adults wounds were improved structure of new dermis [Lancet 339: 213-214 (199 2 )] 0
  • intravenous administration is a common sense for proteinaceous preparations, and examples of administration of HGF to ischemic disease models include intravenous and intraarterial administration [Circulation 97: 381-390 (1998)].
  • Intravenous or arterial administration in such animal models demonstrates the efficacy of HGF against ischemic or arterial disease
  • no specific conclusion has been made yet regarding the specific effective administration method and dosage of HGF.
  • HGF protein there is a problem of half-life as described above, and there is also a problem of transferability to the affected area, and no conclusion has yet been reached as to an effective administration method or dosage. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention relates to a therapeutic or prophylactic agent for a skin disease using an angiogenic factor gene, and to use of the agent.
  • HGF one of the angiogenic factors, may promote epithelial repair and angiogenesis during wound healing.i) After gene transfer, human HGF mRNA and Ii) whether the genetically transferred protein is biologically active, and iii) whether the transferred protein is pathological (eg, complete). Mitogenic activity, including some cells in wounds of various thicknesses, and whether they have any biological effects on re-epithelialization, angiogenesis and extracellular matrix deposition in granular tissue.
  • the present inventors have clarified that extremely effective results can be obtained by directly administering an angiogenic factor gene to an affected area for skin diseases. Specifically, by administering an angiogenic factor gene to skin wounds, effective effects can be obtained. Fruit was obtained.
  • the treatment with such an angiogenic factor gene is a non-invasive treatment, it has a feature that the gene can be administered any number of times depending on the disease state. That is, the gist of the present invention is as follows.
  • a therapeutic or preventive agent for skin diseases comprising an angiogenic factor gene as an active ingredient.
  • angiogenesis factor gene is an HGF gene, VEGF gene, FGF gene or HIF gene.
  • the skin disease is a wound, bald, skin ulcer, decubitus (bedsore), scar (keloid), or skin damage after skin transplantation including autograft and allograft.
  • the therapeutic or prophylactic agent is in the form of a tablet, pill, dragee, capsule, liquid, gel, ointment, syrup, slurry, suspension.
  • a therapeutic or prophylactic agent is in the form of a tablet, pill, dragee, capsule, liquid, gel, ointment, syrup, slurry, suspension.
  • Genes are encapsulated ribosome method, electrostatic ribosome method, HVJ-ribosome method, improved HVJ-ribosome method, virus envelope vector method, receptor-mediated gene transfer method, particle gun (gene gun) and DNA with carrier Transfer of molecules into cells, direct transfer of nake d-DNA, transfer of DNA molecules to cells with ultrasonic irradiation, electoral poration, or transfer with positively charged polymer An agent according to any one of the above (1) to (3).
  • a method for treating or preventing a skin disease which comprises introducing an angiogenic factor gene into a mammal.
  • an angiogenic factor gene for production of a therapeutic or prophylactic agent for a skin disease.
  • the “angiogenic factor gene” used in the present invention refers to a gene capable of expressing an angiogenic growth factor.
  • the term “angiogenesis factor” is used not only to stimulate the generation of new blood vessels and angiogenesis that are initiated with the activation of endothelial cells in the parent blood vessel, but also to stimulate in vivo
  • it refers to a growth factor that has been shown to be mitogenic to endothelial cells in vitro, and includes HGF, VEGF, FGF, HIF, and the like described below.
  • the “HGF gene” used in the present invention refers to a gene capable of expressing HGF (HGF protein). Specifically, ature 342, 440 (1989), Patent No. 2777678, Koyuki Uchimo, Biochem. Biophys. Res.Commun. 163: 967 (1989), Biochem. Biophys. Res.Co.Thigh un. 172: 321 (1990) And the like, in which the cDNA of HGF described in the above is incorporated into an appropriate expression vector (non-viral vector, viral vector) as described below.
  • an appropriate expression vector non-viral vector, viral vector
  • the nucleotide sequence of cDNA encoding HGF is described in the above-mentioned literature, and is also registered in databases such as Genbank.
  • HGF cDNA can be cloned by using an appropriate DNA portion as a primer for PCR based on these sequence information, for example, by performing an RT-PCR reaction on mRNA derived from liver or leukocytes. Can be. These clonings are described, for example, in Molecular Cloning Second Edition (Cold
  • VEGF gene used in the present invention refers to a gene capable of expressing VEGF (VEGF protein). That is, a vector in which VEGF cDNA is incorporated into an appropriate expression vector (a non-viral vector or a viral vector) as described below is exemplified. In humans, the presence of four subtypes (VEGF121, VEGF165, VEGF189, VEGF206) has been reported in humans due to selective splinting during transcription.
  • VEGF genes any of these VEGF genes can be used, but the biologically most active VEGF165 gene is more preferable.
  • the VEGF gene can be easily cloned by a person skilled in the art based on the sequence described in the literature (Science, 246, 1306 (1989)) and the sequence information registered in the database. It can be done easily.
  • FGF gene and “HIF gene” used in the present invention each refer to FGF And a gene capable of expressing HIF.
  • HGF and VEGF those which are incorporated into an appropriate expression vector (non-viral vector, viral vector) as described later are exemplified.
  • Those skilled in the art can easily clone the gene based on the sequence described in a known document and the sequence information registered in a database, and can also easily perform the modification and the like.
  • the angiogenesis factor gene of the present invention is not limited to those described above, and can be used as the angiogenesis factor gene of the present invention as long as the expressed protein has a function as an angiogenic factor. That is, 1) a DNA that hybridizes with the cDNA under stringent conditions, and 2) one or more (preferably several) amino acids with respect to the amino acid sequence of the protein encoded by the cDNA.
  • the angiogenesis of the present invention Included in the category of factor genes.
  • the DNAs of the above 1) and 2) can be obtained by, for example, site-directed mutagenesis, PCR [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a ⁇ . (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.1- 6.4] or the usual hybridization method [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a ⁇ . (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6.3.6.4] Can be.
  • DNA can be isolated.
  • the stringent conditions for hybridization to isolate DNA that encodes a protein that is functionally equivalent to an angiogenic factor are typically more stringent, typically around 1X SSC, 37 ° (:). The condition is about 0.5 X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C, and the more severe condition is about 0.1 X SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.
  • a protein encoded by a gene isolated by such a hybridization method or a PCR method usually has a higher homology in its amino acid sequence than conventionally known angiogenic factors.
  • High homology refers to sequence homology of at least 50% or more, more preferably 70% or more, and even more preferably 90% or more (eg, 95% or more).
  • the identity of amino acid sequences and nucleotide sequences can be determined by the algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Pro Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877, 1993). Based on this algorithm, programs such as BLASTN and BLA STX have been developed (Altschul et al. J. Mol. Biol. 215: 403-410, 1990).
  • non-viral vectors When a gene therapy agent containing the HGF gene as an active ingredient is administered to a patient, there are two major modes of administration: non-viral vectors and viral vectors.
  • the preparation method and administration method are described in detail in [Separate volume experimental medicine, basic technology of gene therapy, Yodosha (1996); Separate volume experimental medicine, gene transfer & expression analysis experiment method, Yodosha (1997) ; Japanese Society of Gene Therapy, Gene Therapy Development Institute Ultimate Handbook, N'T'S (1999)].
  • a specific description will be given.
  • the target gene can be introduced into cells and tissues by the following method using a recombinant expression vector in which the target gene is incorporated into a conventional gene expression vector.
  • Examples of a method for introducing a gene into cells include a lipofection method, a monocalcium phosphate coprecipitation method, a DAE-dextran method, a direct injection method of DNA using a micro glass tube, an electoral port poration method, and the like.
  • Examples of the method of gene transfer into tissues include gene transfer using internal type liposomes, gene transfer method using electrostatic liposomes, HVJ-ribosome method, and improved HVJ-ribosome method.
  • HVJ-AVE ribosome method virus envelope vector method
  • receptor-mediated gene transfer method method of transferring DNA molecules into cells with a carrier (metal particles) using a particle gun (gene gun), naked—direct DNA
  • the recombinant expression vector can be incorporated into cells by subjecting it to any of the following methods: introduction, introduction with a positively charged polymer, and transfer of DNA molecules into cells along with ultrasonic irradiation. You.
  • HVJ-liposome encapsulates DNA in ribosomes made of lipid bilayer membrane, and fuses the ribosomes with inactivated Sendai virus (Hemaggulutinanting virus of Japan: HVJ).
  • the HVJ-ribosome method is characterized by having a very high fusion activity with the cell membrane as compared with the conventional liposome method, and is a preferable introduction form.
  • the method of preparing HVJ-ribosomes refer to Separate Volume Experimental Medicine, Basic Technology of Gene Therapy, Yodosha (1996); Separate Volume Experimental Medicine, Gene Transfer & Expression Analysis Experimental Method, Yodosha (1997); J Clin. Invest. 93: 1458-1464 (1994); Am. J. Physiol.
  • HVJ ribosome method is described in, for example, Molecular Medicine 30: 1440-1448 (1993); Experimental Medicine 12: 1822-1826 (1994); protein, nucleic acid, enzyme 42, 1806- 1813 (1997), etc., preferably Circulation 92 (Suppl. II): 479-482 (1995) The method described above can be used.
  • the HVJ is preferably a Z strain (available from ATCC), but basically other HVJ strains (eg, ATCC VR-907 and ATCC VR-105) can also be used.
  • the “virus envelope vector” in the present specification is a vector in which a foreign gene is encapsulated in a virus envelope.
  • the virus envelope vector is a gene transfer vector in which the virus genome is inactivated, and is safe, has low cytotoxicity, and has low antigenicity because there is no replication of viral proteins.
  • a virus envelope vector can be prepared, for example, according to the method described in PCT / JP01Z0782.
  • Viruses used for the preparation of the gene transfer vector include both wild-type viruses and recombinant viruses, such as retroviridae, togaviridae, coronawinores, flaviwinores, paramyxoviridae, and orthomyxovirus.
  • Family Bunyaviridae family, Rabdowinoreaceae family, Boxwinores family, Henoles pinolaceae family, Nokurouinoresu family, and Hepadnaviridae family.
  • a virus envelope vector using HVJ is preferable.
  • Hasa ⁇ , ⁇ . ⁇ . Et al. Journal of General Virology, 78, 2813-2820 (1997)), or Yonemitsusu, Y. et al.
  • a gene transfer vector can also be prepared using the recombinant Sendai virus.
  • the direct introduction method of naked-DNA is the simplest method among the above methods, and is also a preferable introduction method from this viewpoint.
  • the expression vector used here may be any expression vector as long as it can express the target gene in vivo.
  • Expression vectors such as CAGGS [Gene 108: 193-200 (1991)], pBK-CMV ⁇ pcDNA3.1, pZeoSV (Invitrogen, Stratagene) and the like.
  • CAGGS Gene 108: 193-200 (1991)
  • pBK-CMV ⁇ pcDNA3.1 pZeoSV (Invitrogen, Stratagene) and the like.
  • pZeoSV Invitrogen, Stratagene
  • virus vector a method using a virus vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus is typical. More specifically, for example, detoxified retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, box virus / less, polio virus, symbis virus, Sendai virus, SV40, immunodeficiency It is possible to introduce a gene into a cell by introducing the gene of interest into a DNA virus or RNA virus such as a virus (HIV) and infecting the cell with the recombinant virus.
  • a virus vector such as a recombinant adenovirus or a retrovirus
  • the efficiency of adenovirus infection is much higher than when other virus vectors are used. From this viewpoint, it is preferable to use an adenovirus vector system.
  • the gene therapy agent of the present invention can be introduced into a patient by an in vivo method in which the gene therapy agent is directly introduced into the body, or by extracting certain cells from humans and introducing the gene therapy agent into the cells outside the body.
  • an ex vivo method to return the cells to the body There is an ex vivo method to return the cells to the body [Nikkei Science, April 1994, pp. 20-45; Monthly Pharmaceutical Affairs 36 (1): 23-48 (1994); ): (1994); Japan Society of Genetics Therapy, Gene Therapy Development Research Handbook, N.T.S. (1999)].
  • the in vivo method is preferred.
  • various preparation forms for example, liquid preparations suitable for each of the above-mentioned administration forms can be taken.
  • the injection in the case of an injection containing a gene as an active ingredient, the injection can be prepared by a conventional method, for example, dissolved in an appropriate solvent (buffer such as PBS, physiological saline, sterilized water, etc.). Thereafter, if necessary, it can be prepared by sterilizing by filtration with a filter or the like, and then filling in a sterile container. A conventional carrier or the like may be added to the injection as required.
  • ribosome preparations such as suspensions, cryogens, and centrifugal concentrated cryogens are used. It can be in the form.
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention can be preferably administered topically to an affected part of the skin in the form of an ointment.
  • This ointment is a semi-solid external preparation of appropriate consistency that can be easily applied to the skin, and is usually a fat, fatty oil, lanolin, vaseline, noraffin, ⁇ , plaster, resin, plastic, darcols , Higher alcohols, glycerin, water or emulsifiers, and suspending agents, in which the decoy compound is evenly mixed based on these.
  • it may be in the form of an oily ointment, an emulsion ointment, or a water-soluble ointment.
  • Oil-based ointments are based on animal and vegetable oils and fats, or cellulose, liquid paraffin, etc. Emulsion-based ointments emulsify oil-based substances and water with an emulsifier, oil-in-water (0 / W) Or water-in-oil (W / 0).
  • the oil-in-water type (oZw) can be a hydrophilic ointment, the water-in-oil type (w / o) lacks an aqueous phase from the beginning, and can contain hydrophilic vaseline, purified lanolin or a water-absorbing ointment containing an aqueous phase , Hydrated lanolin.
  • a water-soluble ointment may contain a McGall base that is completely soluble in water as a major component.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is Vaseline containing 5% stearyl alcohol or Vaseline alone or Vaseline containing liquid paraffin.
  • Such carriers allow the pharmaceutical composition to be formulated into tablets, pills, dragees, capsules, solutions, gels, ointments, syrups, slurries, suspensions, etc., suitable for ingestion by the patient. .
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention may contain a synthetic or natural hydrophilic polymer as a carrier.
  • hydrophilic polymers include hydroxypropyl cellulose, polyethylene glycol, and the compound of the present invention is mixed with such a hydrophilic polymer in a suitable solvent. Thereafter, the solvent can be removed by a method such as air-drying or the like, molded into a desired form, for example, a sheet, and then applied to a target site.
  • Formulations containing such hydrophilic polymers have a low water content and are therefore preserved. It excels in preservation, and absorbs moisture when used to form a gel, and has excellent storage properties.
  • a hydrophilic sheet formed by adjusting the hardness by mixing a polyhydric alcohol with cellulose, starch and derivatives thereof, or a synthetic high molecular compound as a similar substance can also be used.
  • a known factor having an angiogenic action other than these angiogenic factors alone or in combination with a plurality of genes selected from angiogenic factor genes such as HGF, VEGF, FGF and HIF used in the present invention. Can be used in combination or alone. For example, it has been reported that factors such as EGF have an angiogenic effect, and these genes can be used. It has been reported that growth factors such as EGF repair various cellular disorders of tissues, and these genes can also be used.
  • the skin diseases referred to in the present invention include wounds, baldness, skin ulcers, pressure ulcers (bedsores), scars (keroids), atopic dermatitis, and skin damage after skin transplantation including autologous transplantation and allogeneic transplantation. Is included.
  • a prophylactic agent refers to
  • Affected refers to a drug that has the effect of preventing the disease in advance, or a drug that has the effect of reducing symptoms when the above-mentioned disease has developed, or a drug that has the effect of accelerating the recovery of symptoms.
  • a prophylactic agent is also included in the present invention.
  • the baldness here refers to the phenomenon of fluffiness, in which the hair cycle becomes extremely short and the hair grows out to the thick hairs during the growing period, resulting in only thin and short hairs.
  • Skin ulcers are deep tissue defects that reach the dermis or subcutaneous tissue, and are classified into ischemic ulcers, congestive ulcers, diabetic ulcers, pressure ulcers, radiation ulcers, and drip leaks.
  • Pressure ulcer refers to a condition in which peripheral blood vessels in a tissue block and cause necrosis due to continuous pressure received from the contact surface of the body. It is a refractory ulcer with a well-defined, dry, necrotic mass attached to the site where it is present.
  • Scars are hypertrophic hyperplasias of the connective tissue that appear after skin damage, with a flattened wound surface, sometimes resulting in crabfoot processes, proliferative, original wounds Some continue to expand beyond the site.
  • Factors that cause the formation of keloids by trauma include genetic, age-related, systemic factors such as hormones, and local factors such as scarring due to body parts. It is classified into hypertrophic scars, scar keloids and intrinsic keloids.
  • an appropriate administration method / administration site is selected according to the disease, symptom, and the like to be treated.
  • Parenteral administration is preferred as an administration method.
  • the “skin disease site” refers to a site including the skin disease site and its surroundings.
  • administration to the site of skin disease can be performed intravascularly or intramuscularly, and can be applied to the surface of the skin with an ointment or the like.
  • an ointment or the like apply to the affected area after skin transplantation including wounds, baldness, pressure ulcers (bed sores), keloids, atopic dermatitis, autologous transplantation and allogeneic transplantation.
  • the angiogenesis of the diseased part can be promoted, blood flow can be improved, and the function of the diseased part can be restored to normal.
  • wounds, baldness, skin ulcers, decubitus (bed sores), scars (keloids), atopic dermatitis, and skin damage after skin transplantation including autologous transplantation and allogeneic transplantation can be treated by aggressive gene transfer for patients, and the function can be restored in patients who have not been able to use appropriate treatment.
  • the therapeutic or prophylactic agent of the present invention comprises an amount of an angiogenic gene in an amount sufficient to achieve the intended purpose of the agent, ie, a “therapeutically effective amount” or a “pharmacologically effective amount”.
  • “Therapeutically effective amount” or “pharmacologically effective amount” is an amount of a drug effective to produce the intended pharmacological result, which reduces the symptoms of the patient to be treated. That is enough.
  • Useful assays to determine the effective amount for a given application include those that measure the extent of recovery of the target disease.
  • the actual amount to be administered depends on the individual to be treated, and is preferably the desired effect Is an amount optimized to be achieved without significant side effects.
  • a therapeutically effective amount, a pharmacologically effective amount, and toxicity can be determined by cell culture assays or any appropriate animal model. Also, such animal models can be used to achieve a desired concentration range and route of administration, from which a skilled artisan can determine an effective amount in humans.
  • the dose ratio between therapeutic and toxic effects is the therapeutic index and it can be expressed as the ratio ED50 / LD50. Large therapeutic index pharmaceutical compositions are preferred.
  • the determined dose is appropriately selected depending on the dosage form to be used, the sensitivity of the patient, the age and other conditions of the patient, the type of the disease, the severity of the disease, and the like.
  • the therapeutic agent of the present invention is preferably administered once every several days to several weeks, and the frequency of administration is appropriately selected according to the patient's condition. Since the therapeutic agent of the present invention is used for non-invasive administration, it has the characteristic that it can be administered any number of times depending on the disease state.
  • the organism into which the angiogenic factor gene is introduced is not particularly limited, but is preferably a mammal. Examples of mammals include, but are not limited to, non-human mammals such as human monkeys, mice, rats, pigs, horses, and hidge. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Figure 2 is a photograph showing the distribution of HGF gene mR NA of human HGF metastasis in rats (to d) and protein (e to h).
  • the bar scale in the figure is 1 for a and e 00 im and 200 ⁇ for bd, g and h.
  • FIG. 3 is a diagram showing the size of the wound area after gene transfer to the original wound area by percentage.
  • FIG. 4 is a diagram ( ⁇ ) and a photograph ( ⁇ ) showing PCNA expression in the epidermis at the edge of a rat wound after gene transfer.
  • ⁇ is a photograph showing the ratio of PCNA-positive cells in the epidermis after gene transfer
  • B is a photograph showing PCNA expression.
  • a ⁇ f The scale of the bar is 200 m.
  • FIG. 5 is a diagram (A) and a photograph (B) showing the results of detecting the expression of PCNA in the granulation tissue of a rat after gene transfer.
  • A shows the percentage of PCNA-positive cells in the granulation tissue after gene transfer
  • B shows the expression of PCNA.
  • a to c are photographs of HGF gene-transferred rats on days 3, 7, and 14, respectively
  • d to f are photographs of control rats on days 3, 7, and 14, respectively.
  • the scale of the bars in a to f is 200 m.
  • FIG. 6 is a diagram (A) and a photograph (B) showing the results of counting the number of microvessels using immunohistochemistry for factor VIII in granulation tissue of rats after gene transfer.
  • A shows the number of microvessels in granulation tissue
  • B shows the results of immunohistochemistry for factor VIII.
  • a to c are photographs of HGF gene-transferred rats on days 3, 7, and 14, respectively
  • d to f are photographs of control rats on days 3, 7, and 14, respectively.
  • the scale of the bars in a to f is 200 ⁇ .
  • FIG. 7 is a diagram showing the result of 1 ⁇ -? 0 ⁇ on 1111 ⁇ of ⁇ 01 ⁇ 2 (1).
  • ⁇ is an immediate amplification plot of Col ⁇ 2 (I) selected using the semi-quantitative RT-PCR method
  • B is a standard curve of RT-PCR threshold cycle.
  • FIG. 8 is a diagram and a photograph showing the results of RT-PCR for mRNA of TGF-j81, Col2 (1), ⁇ -actin, desmin and Col ⁇ 1 (III).
  • A shows the detection of PCR products
  • B shows the results of semi-quantitative RT-PCR.
  • Figure 9 shows the detection of hydroxyproline concentration in rat wounds after gene transfer. It is a figure showing a result.
  • HGF expression vector Human HGF cDNA (2.2 kb) was inserted into the EcoRI / Notl site of pUC-SRa expression vector plasmid. In the plasmid, transcription of the HGF cDNA is under the control of the SRa promoter (Nature 342: 440-443 (1989)).
  • HVJ - was purified from the ribosome calf thymus (HMG) - 1 (50 ⁇ 1) and in plasmid D ⁇ (200 g) to 20 ° C, 200 1 become as isotonic solution the total amount (137 mM NaCl, 5 After mixing for 1 hour with 4 mM KC1, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6), add 10 mg of dried lipid (1: 4.8: 2 mixture of phosphatidylserine, phosphatidinorecolin, and cholesterol) to the mixture.
  • the ribosome-DNA-HMG-1 complex suspension was stirred, sonicated for 3 seconds, and shaken for 30 minutes to form liposomes.
  • purified Sendai virus (HVJ) Z strain
  • Liposome suspension 0.5 ml,
  • HVJ hemagglutination units
  • 10 mg of lipid) and HVJ (30000 hemagglutination units) were mixed in a total volume of 3 ml of isotonic solution. After mixing, the mixture was incubated at 4 ° C for 10 minutes, and then heated at 37 ° C for 30 minutes with gentle shaking. Free HVJ was removed by sucrose density centrifugation. The HVJ liposome-DNA complex was recovered from the top layer and used immediately. 4. Wound Tissue and Blood Samples Forty-one rats were divided into two groups (HGF gene transfer group and control vector group) for wound biochemistry and histology studies.
  • Rats were anesthetized with a peritoneal injection of bentobarbital sodium (0.5 ml / kg), the back was shaved, the skin was washed, and a 14 mm thick wound was made on the back of each animal.
  • the same rats under pentoparbital anesthesia
  • HVJ-ribosome 500 / ⁇ 1 containing HGF cDNA or a control vector. It was introduced into the wound edge using a 27G needle.
  • the animals were decapitated under anesthesia 3, 7 and 14 days after injection and blood samples were taken for HGF measurement.
  • Blood samples were placed in cryotubes containing EDTA (2 mg / ml) and then centrifuged. The plasma was immediately frozen and stored at 180 ° C until analysis. At the time of dissection, the skin was removed, and the tissue of 5 rats from each group was quantified and then bisected. One was frozen in liquid nitrogen and stored at 180 ° C until use.
  • ELISA test Five tissue samples from each group were treated with 4 volumes of 20 mM Tris-HC 1 buffer containing 0.1% 2M NaCl, 0.1% Tween-80, ImM PMSF and ImM EDTA (pH 7. In 5), homogenization was performed for 1 minute using a polytron homogenizer (24000 rpm; Kinematics AG, Lucerne, Switzerland). The homogenate was centrifuged at 15000 ⁇ g for 30 minutes at 4 ° C., and the supernatant and the pellet were stored at 180 ° C. until enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for HGF protein.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Human HGF protein concentration was measured by ELISA using an anti-human-HGF monoclonal antibody, and rat HGF was also measured by ELISA using an anti-rat-HGF monoclonal antibody (Institute of Immunology, Tokyo, Japan). ).
  • the human HGF ELISA system specifically detected human HGF but not rat HGF.
  • the plasma concentration of HGF protein in 501 rat plasma was measured using the ELISA described above.
  • wounds were created in rats, HVJ-ribosomes or control vector were administered, and wound tissues obtained by decapitation of the animals under anesthesia 3, 7 and 14 days after injection were used. It was fixed in a periodic acid-lysine-paraformaldehyde (PLP) solution.
  • PLP acid-lysine-paraformaldehyde
  • the full-length human HGF cDNA inserted into the EcoRI and Notl sites of the pUC-SR expression vector plasmid was digested with a restriction enzyme that cleaves EcoRI, and the resulting HGF cDNA (848 bp) fragment was digested with pGEM-7Zf ( +) Ligation between EcoRI cloning sites of (Promega, Madison, WI).
  • the antisense probe and the corresponding sense probe were labeled with digoxigenin using an RNA labeling kit (Boehringer Mannheim, Postfach, Germany) using SP6 and T7 polymerase, respectively.
  • HGF mRNA was expressed in squamous epithelial cells in the epithelium at the edge of the wound, endothelial cells and smooth muscle cells in blood vessels, and fibrils in granulocytes and tissues 3 days after the gene transfection. It was detected in blast cells (FIGS. 2a, 2b, 2e and 2f). In contrast, it was not detected in all control rats.
  • human HGF protein is detected in the same cell type of SGF transfected rats (squamous epithelial cells in epithelium, endothelial cells in blood vessels and smooth muscle cells, and fibroblasts in granulation tissue) was not performed ( Figures 2c and 2g). Thereafter, this expression was maintained until 14 days after gene transfer (the last day of the test) (FIGS. 2d and 2h).
  • wounds were created in rats, HVJ-ribosomes or control vectors were administered, and wound tissues obtained by decapitation of the animals under anesthesia 3, 7, and 14 days after injection were used. Fixed during PLP.
  • PCNA proliferating cell nuclear antigen
  • angiogenesis The number of microvessels in the wound was evaluated by light microscopy on the area containing the largest number of blood vessels. was measured by; the number of blood vessels continuous 200 X field (ad hoc 0.0925 ⁇ 2 20 X objective lens and 1 0 X eyepiece). Angiogenesis was carried out in the same manner as in the method described in 1. above, by using a polyclonal antibody against factor VIII (1: 100, Dako Inc., Glostrup, Denmark) to detect factor VIII in the epithelial cells of granulation tissue. It was measured by examining it.
  • RNA in skin tissue was isolated using guanidium isothiocyanate-phenol mouth-oral form extraction and ethanol precipitation (Anal. Biochem. 162: 156-159 (1987) )).
  • RT-PCR was performed using an amplification reagent kit (TaqMan EZRT-PCR kit; Applied Biosystems, Alameda, CA) and a plurality of primers.
  • the following primers were prepared on an automatic DNA synthesizer: TGF- ⁇ 1, Cola2 (I), Cola1 (III), desmin, ⁇ -sm-actin and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ( GAPDH).
  • Table 1 Hepatology 24: 636-642 (1996).
  • the 5 'end of the TaqMan probe was linked to the reporter dye molecule FAM (6-carboxyfuran). Resin) and the 3 ′ end were labeled with a quencher monodye TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine).
  • IX reaction buffer 300 iM dATP, 300 ⁇ M dCTP, 300 dGTP, 600 dUTP, 3 mM Mg (0Ac) 2 , 0.1 U / ⁇ 1 rTth DNA polymerase, O. OlU / ⁇ AmpErase UNG, 900 nM primer And a final concentration of 200 nM TaqMan probe to prepare a raw mixture for the reaction according to the manufacturer's protocol.
  • the RT reaction was incubated at 60 ° C for 30 minutes, then at 95 ° C for 5 minutes to inactivate AmpErase UNG.
  • PCR was performed using ABI PRISM 7700 Sequence detector (Applied Biosystems).
  • the TaqMan probe was cleaved by the 5 ′ ⁇ 3 ′ exonuclease activity of rTth DNA polymerase, and the fluorescence of the reporter dye at an appropriate wavelength was amplified.
  • the increase in fluorescence was proportional to the concentration of template during PCR (FIG. 7A).
  • the threshold fluorescence level was 6.965 times the standard deviation of the mean obtained with the no template control (following the protocol of the TaqMan RT-PCR kit). 4 pills for each amount of RNA A standard curve was obtained using the threshold cycle established for this (Figure 7B).
  • the PCR products were separated by electrophoresis on a 3% agarose gel and stained with ethidium bromide ( Figure 8).
  • GAPD rat glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase TGF- ⁇ , rat transforming growth factor-1; Col Qf 2 (I), rat-21 type: gen, t segment 2: Coi Of l (ni), Rat collagen ST type-1; desmin, rat desmin;-sm-actin, rat vascular smooth muscle-actin.
  • wounds were created in rats, HVJ-ribosomes or control vector were administered, and animals were decapitated under anesthesia 3, 7, and 14 days after injection.
  • a tissue sample was prepared. .
  • ELISA test Polytron homogenate in 20 mM Tris-HC1 buffer (pH 7.5) containing 4 volumes of 0.1% 2M NaCl, 0.1% Tween-80, IraM PMSF and 1 mM EDTA It was homogenized for 1 minute using a Nizer (24000 rpm; Kinematica AG, Lucerne, Switzerland). The homogenate was centrifuged at 15000 ⁇ g for 30 minutes at 4 ° C., and the pellet was hydrolyzed in 6N HCl at 110 ° C. for 16 hours. Hydroxyproline content was measured using an amino acid analyzer (Model 835; HitacM Ltd. Tokyo, Japan).
  • the macroscopic and histological facts obtained by the present invention indicate that the HGF transgenic rats showed a more rapid reduction of the wound lesion area than the control rats, and that the basal cells in the epithelium at the edge of the wound Hyperproliferation was observed.
  • this model showed that increased expression of HGF mRNA and protein could amplify epithelial cell division and proliferation in and across the wound by paracrine and / or autocrine activity .
  • an increase in the number of blood vessels and a PCNA-positive staining of endothelial cells in granulation tissue are also observed in the HGF gene-transferred rats, confirming that HGF has a strong angiogenic activity.
  • angiogenesis factor gene transfer has a beneficial effect in the early stages of wound healing, and that angiogenesis factors may play a role in regulating skin diseases.
  • the manipulation of re-epithelialization and angiogenesis by overexpression of factors provides a new therapeutic option in the area of wound healing.

Description

明細書 血管新生因子の皮膚疾患への遺伝子導入 技術分野
本発明は、 血管新生因子遺伝子を皮膚疾患に対し用いることに関する。 より詳 細には、 血管新生因子遺伝子を有効成分として含有する治療剤又は予防剤や、 血 管新生因子遺伝子を標的部位へ投与することを特徴とする方法に関する。 血管新 生因子には肝細胞増殖因子 (HGF)、 血管内皮増殖因子 (VEGF)、 繊維芽細胞増殖因 子（FGF)及び hypoxia inducible factor (HIF)が含まれる。 皮膚疾患には創傷、 ハゲ、 皮膚潰瘍、 褥瘡 (床ずれ)、 瘢痕 （ケロイド） 、 アトピー性皮膚炎、 自家移 植及び他家移植を含む皮膚移植後の皮膚の損傷等が含まれる。 背景技術
「血管新生因子」 とは、 親血管の内皮細胞の活性化と共に開始される新しい血 管の発生や血管新生をィンビボで刺激するだけでなく、 インビトロで内皮細胞に 対してマイトジェエックであることが示されている增殖因子のことである。 血管 新生因子としては HGF、 VEGF、 FGF及び HIF等が挙げられる。 血管新生因子の治 療的な適用は、 Folkmanらによって最初に文献発表された (N. Engl. J. Med. 285， 1182-1186 (1971) )。 またはその後の研究によって、 組換え血管新生因子、 例えば FGFファミリー（Science 257, 1401-1403 (1992) , Nature 362, 844-846 (1993) ) 及び VEGF等を使用して心筋、 及び、 下肢虚血症の動物モデルにおける側副血行 路の発達を促進及び/又は増進させ得ることが確認されている（Circulation 90， II- 228- II - 234 (1994) )。 さらに本発明者らは、 HGFが VEGFと同様に内皮特異的 増殖因子として作用することを見出している（J. Hypertens. 14, 1067 - 1072 (199 6) )。 HGFは、 成熟幹細胞に対する強力な増殖促進因子として発見されたサイトカイ ンであり、 その遺伝子クロー-ングもされている [Biochem. Biophys. Res. Commun.
122： 1450 (1984)； Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 83： 6489 (1986)； FEBS Lette rs 22： 231 (1987)； Nature 342： 440-443 (1989)； Proc. Natl. Acad, Sci. USA.
87： 3200 (1991) ] 0 HGFはプラスミノーゲン関連及び間充織由来多面的成長因 子であり、 種々の型の細胞において細胞成長と細胞運動性を調節することが知ら れている [Nature 342： 440-443 (1989)； Biochem. Biophys. Res. Comniun. 239： 63 9-644 (1997)； J. Biochem. Tokyo 119： 591 - 600 (1996) ]。 さらに、 胚新生、 及び、 幾つかの器官の再生の間の形態形成工程を調節する重要な因子である。 例えば、 HGFは肝細胞、 及び、 角化細胞を含む他の表皮細胞の強力なマイトジェンである [Exp. Cell Res. 196： 114-120 (1991) ] 0 HGFは血管新生を刺激し、 細胞の分離を 誘導し、 内皮細胞の運動を開始する [Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 90 : 1937-1941 (1993)； Gene Therapy 7： 417-427 (2000) ]Q その後の研究により HGFは in vi voにおいて肝再生因子として障害肝の修復再生に働くだけでなく、 血管新生作 用を有し、 虚血性疾患や動脈疾患の治療又は予防に大きな役割を果たしているこ とが明らかとなった [Symp. Soc. Exp. Biol. , 7cell behavior 227-234 (1993)； Pro c. Natl. Acad, Sci. USA. 90： 1937-1941 (1993)； Circulation 97： 381-390 (1998) ] 0 ゥサギの下肢虚血モデルにおいて HGFを投与すると、 顕著な血管新生が見られ血 流量の改善、 血圧減少の抑制、 虚血症状の改善が生じたとの報告がある。 これら の報告により、 今日では、 血管新生因子の一つとして HGFが発現、 機能している と考えられるようになった。
その名が示すように、 肝臓で発見された物質であるが、 実際には体中に存在し ている。 この H G Fには細胞を増殖させる作用がある。 怪我をすると、 その周辺 でさかんに細胞分裂が起きて傷口が修復されるが、 これも H G Fの働きによる。 順天堂大学の皮膚科チームは、 この物質が、 毛髪増殖因子の一つであるというこ とをつきとめた。 H G Fには毛母細胞の分裂を促して、 毛髪を成長させる働きを 有する。 男性ホルモンによって軟毛化の進んだ頭皮の毛母細胞にこの H G Fを投 与すれば、 太い毛が再生すると考えられる。
また、 ラットの非梗塞性及び梗塞性心筋の心臓 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90： 8474 - 8478 (1993) ]、 並びに、 ラット角膜 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1937-194 1 (1993) ]において HGFにより血管新生が誘導されるという in vivoの事実が発見 されている。
このように HGFは血管新生因子の機能を初めとして種々の機能を有し、 それを 医薬品として活用するための様々な試みがなされてきた。 し力 し、 ここで問題と なってきたのが HGFの血中での半減期である。 HGFの半減期は約 10分と短く、 血中濃度を維持することが困難であり、 また、 HGF有効量の患部への移行性が問 題となった。
VEGFは内皮細胞に対してマイトジエニックな 2量体糖タンパク質であり、 そ して血管透過性を高める能力を有している。 VEGF は内皮細胞に対して直接的で、 特異的なマイ トジエニックな効果を有している（Biochem. Biophys. Res. Commun. , 161， 851-858 (1989) ) 0
HIFは赤血球の産生を促進し、 全身に酸素の供給量を増加させるエリス口ポェ チン、 血管新生を促し、 局所的な酸素供給を増加させる VEGFとその受容体、 無 酸素状態で ATPを合成し細胞に耐性を与える、 解糖系の諸酵素の遺伝子の転写活 性化を中心となって行う転写因子である。 HIF - 1は HIF - 1ひ と HIF - l iS からなる ヘテロダイマーであり、 HIF- l j3 (Arntともよばれている）はダイォキシン等の 外来異物の代謝に関与している、 Ahリセプターともへテロダイマーを形成し、 薬物代謝酵素遺伝子群の転写調節に機能していることが、 既に判明している。 一般に遺伝子治療は多様な離床疾患の処置において使用することができる [ ence 256： 808-813 (1992) ; Anal. Biochem. 162： 156- 159 (1987) ]。 遺伝子治 療を成功させる上で特に重要なのは、 遺伝子導入のための適当なベクターの選択 である。 特にアデノウィルス等のウィルスが遺伝子導入において好ましいベクタ 一である。 しかしながら、 ウィルスの有する感染毒性、 免疫系の低下、 及ぴ、 突 然変異性または発ガン性効果を考慮するとウイ^/スベタターは潜在的に危険であ る。 その代替方法としては、 効果的な in vivo遺伝子導入方法として報告されて いるリボソームをウィルス外膜と共に利用し、 毒性のほとんどない HVJ—リポソ ーム媒介遺伝子導入が挙げられる [Science 243： 375-378 (1989) ; Anal. NY Ac ad. Sci. 772： 126-139 (1995)〕。 該方法は、 肝臓、 腎臓、 血管壁、 心臓及び脳を 含む種々の組織への in vivo遺伝子導入の方法として成功している [Gene Therap χ 7： 417-427 (2000)； Science 243： 375-378 (1989)； Biochem. Biophys. Res. Commun. 186： 129-134 (1992)； Proc. Natl. Acad, Sci. USA. 90： 8474-8478 (199 3)； Am. J. Physiol. 271 (Regulatory Integrat ive Comp. Physiol. 40)： R1212- R 1220 (1996) ] 0
創傷治癒は炎症、 血管新生、 マトリックス合成及びコラーゲン沈着を含む事象 の系列から成り、 再内皮形成、 血管新生及び顆粒組織の形成へとつながる [Clark RAF編" Overview and general cons ideration of wound repair. The Moleular a nd Cellular Biology of Wound Repair. "Plenum Press. New York (1996) 3-50； An nu. Rev. Med. 46： 467-481 (1995) ; J. Pathol. 178： 5-10 (1996) ]。 治癒工程は線 維芽細胞 (FGF)、 形質転換成長因子一ひ (TGF- a )、 形質転換成長因子— β (TGF— β )、 上皮細胞成長因子 (EGF)、 血小板由来成長因子 (PDGF)及び血管内皮細胞成長 因子 (VEGF)等の成長因子を含む多数のマイトジヱン及び走化性因子により調節さ れる。 しかしながら、 HGFの創傷治癒における効果に関する研究はあまり存在し ない [Gastroenterology 113： 1858-1872 (1997) ]。
IGF、 PDGF及び EGF等の遺伝子の創傷への転移についての報告が幾つか存在す る [Gene Therapy 6： 1015-1020 (1999) ; Lab. Invest. 80： 151-158 (2000) ; J. Inv est. Dermatol. 112： 297-302 (1999)； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91： 12188-12192 (1994) ]が、 そのどれもが HGF遺伝子転移後の創傷治癒に関わる、 または、 組織 病理学効果に含まれる因子の数の定量的、 及び質的変化には着目していない。 創傷の再上皮化は角化細胞の創傷の端から中央への移動により起こる。 In vit roでは、 HGFは増殖、 細胞成長、 及び、 生理的 Ca2+条件下で培養される角化細胞 での DNA合成を増幅する [Exp. Cell Res. 196： 114_120 (1"1) ]。 さらに、 HGFは 細胞ターンオーバーの増幅により T84腸内単層中の上皮による創傷密閉が促進さ れることが発見された [J. Clin. Invest. 93： 2056-2065 (1994) ]0 組換え HGFの i n vivo投与が抗腫瘍剤により損傷を受けたラット腎臓中の上皮細胞の再生を促 進することが発見された [Gene Therapy 7： 417-427 (2000) ]0 しかしながら、 ラ ットの凍傷により惹起された胃潰瘍への組換え HGFの皮下投与により、 血清中の ヒト HGF濃度は増加したが、 胃潰瘍治癒速度には効果を示さず、 凍傷惹起 8〜： 15 日後胃縁で上皮細胞増殖が増加した [Gastroenterology 113： 1858-1872 (1997) ] 0
TGF- β発現の一過性の上向き調節は、 創傷治癒における重要な事象である。 T GF- は繊維芽細胞を刺激してマトリックスタンパク、 マトリックスプロテア一 ゼ阻害剤、 及び、 インテグリン受容体を産生し、 それにより創傷部位のマトリツ タス形成、 及び、 細胞間相互作用を調節する [Rokerts AB, Aporn MB： "Transform ing growth factor- j3 . The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair "第二版， Clark RAF編（Plenum Press. New York, 1996年，第275〜 308頁）]。 TG F - j8 1の異常調節、 及び、 持続的過剰発現は皮膚繊維症 (例えば、 肥大瘢痕及ぴ ケロイド）の患者の組織中で TGF - mRNAの発現が増大していることが報告さ れており [Am. J. Pathol. 152： 485-493 (1998) ]、 組織繊維症の増加に寄与すると 考えられる。 さらに、 TGF - /3 中和抗体は成人創傷において創傷肉芽組織中の細 胞を減少するだけでなく、 新真皮の構造を改善した [Lancet 339： 213-214 (199 2) ] 0
一般的にタンパク性製剤の場合は静脈内への投与が常識となっており、 虚血性 疾患モデルに対する HGFの投与に関しては、 静脈や動脈内への投与の例が示され ている [Circulation 97 : 381-390 (1998) ]。 このような動物モデルでの静脈また は動脈内投与により、 虚血性疾患又は動脈疾患に対する HGFの有効性が明らかに されているものの、 具体的な HGFの有効な投与方法及び投与量等については未だ 結論が出ていない。 特に HGFタンパクの場合は、 前記のような半減期の問題、 患 部への移行性の問題もあり、 有効な投与法または投与量等については未だ結論が 出ていない。 発明の開示
本発明の目的は、 血管新生因子遺伝子を用いた皮膚疾患に対する治療剤若しく は予防剤、 及び、 該薬剤を用いることに関する。
本発明者らは、 血管新生因子の一つである H G Fは創傷治癒の間、 上皮修復及 ぴ血管新生を促進するかも知れないと考え、 i )遺伝子転移後、 ヒ ト HGFmRNA及 ぴタンパク質が完全な厚さの創傷内に分布し、 沈着するか、 ii) 遺伝的に転移さ れたタンパク質が生物学的に活性であるか、 及び、 iii)転移されたタンパク質が 病理学状態（例えば、 完全な厚さの創傷内のいくつかの細胞を含むマイトジェン 活性、 並びに、 顆粒組織内の再上皮化、 血管新生及び細胞外マトリックスの沈着 等）に生物学的な影響を及ぼすかを調べた。
さらに、 創傷組織におけるこれらの変化が TGF - β 1の分泌と関連しているか を調べた。 創傷領域、 並びに、 HGF遺伝子転移後の創傷組織中のヒト及びラット HGFタンパク質濃度、 並びに、 TGF - ]3 1、 及び、 コラーゲン型 I (Col α 2 (Ι) )、 コ ラーゲン型 III (Colひ Ι (ΙΠ) )、 デスミン及び血管平滑筋ひ-ァクチン（a - sm -ァ クチン）を含む創傷治癒に関わっていると考えられている他の構成因子の mRNA の発現を測定した。 このために半定量逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応 (RT- PCR)を 用い、 in situハイプリダイゼーション及び免疫組織化学的方法により創傷の形 態形成変化を調べた。
その結果、 本発明者らは、 皮膚疾患に対して、 直接患部に血管新生因子遺伝子 を投与することにより、 極めて有効な結果が得られることを明らかにした。 具体 的には皮膚創傷において、 血管新生因子遺伝子を投与することにより、 有効な効 果が得られることを見出した。
このような血管新生因子遺伝子による治療は非侵襲的な治療法であるため、 病 状に応じて何回でも当該遺伝子を投与することが可能であるという特徴を有する。 即ち、 本発明の要旨は以下の通りである。
(1) 血管新生因子遺伝子を有効成分として含有する、 皮膚疾患の治療剤又は予 防剤。
(2) 血管新生因子遺伝子が HGF遺伝子、 VEGF遺伝子、 FGF遺伝子または HIF遺 伝子である、 上記 （1) の治療剤又は予防剤。
(3) 該皮膚疾患が創傷、 ハゲ、 皮膚潰瘍、 褥瘡 (床ずれ)、 瘢痕 （ケロイド） 、 または、 自家移植及び他家移植を含む皮膚移植後の皮膚の損傷である、 上記
(1) の治療剤又は予防剤。
(4) 該治療剤又は予防剤が錠剤、 丸剤、 糖衣剤、 カプセル、 液剤、 ゲル剤、 軟 膏、 シロップ、 スラリー、 懸濁物の形態である、 上記 （1) 若しくは （2) の治 療剤又は予防剤。
(5) 遺伝子を内包型リボソーム法、 静電気型リボソーム法、 HVJ -リボソーム法、 改良型 HV J-リボソーム法、 ウィルスエンベロープベクター法、 レセプター介在 性遺伝子導入法、 パーティクルガン （遺伝子銃） で担体と共に DNA分子を細胞に 移入する方法、 n a k e d- DNAの直接導入法、 超音波の照射と共に DNA分子 を細胞に移入する方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 または、 正電荷ポリマーに よる導入法により細胞に移入するための、 上記 (1) 〜 （3) いずれかの剤。
(6) 血管新生因子遺伝子を哺乳動物に導入することを含む、 皮膚疾患の治療法 ,又は予防法。
( 7 ) 皮膚疾患の治療剤又は予防剤の製造のための血管新生因子遺伝子の使用。 本発明において使用する 「血管新生因子遺伝子」 とは、 血管新生増殖因子を発 現可能な遺伝子を指す。 ここで 「血管新生因子」 とは、 親血管の内皮細胞の活性 化と共に開始される新しい血管の発生や血管新生をインビポで刺激するだけでな く、 インビトロで内皮細胞に対してマイトジエニックであることが示されている 増殖因子を指し、 後述する HGF、 VEGF, FGF及び HIF等が含まれる。
本発明において使用する 「H G F遺伝子」 とは、 H G F (H G Fタンパク）を発 現可能な遺伝子を指す。 具体的には ature 342, 440 (1989)、 特許第 2777678号 公幸艮、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 163 : 967 (1989)、 Biochem. Biophys. Res. Co 腿 un. 172 : 321 (1990)等に記載の HGFの c DNAを後述のような適当な発現べクタ 一（非ウィルスベクター、 ウィルスベクター）に組み込んだものが挙げられる。 こ こで HGFをコードする c DNAの塩基配列は、 前記文献に記載されている他、 Genb ank等のデータベースにも登録されている。 従ってこれらの配列情報に基づき適 当な DNA部分を PCRのプライマーとして用い、 例えば肝臓や白血球由来の mRNA に対して RT— PCR反応を行うこと等により、 HGFの c DNAをクロ一二ングするこ とができる。 これらのクローニングは、 例えば Molecular Cloning第二版（Cold
Spring Harbor Laboratory Press (1989) )等の基本書に従い、 当業者ならば容易 に行うことができる。
本発明において使用される 「VEGF遺伝子」 とは、 VEGF (VEGFタンパク）を発現 可能な遺伝子を指す。 すなわち、 VEGFの c DNAを後述の如き適当な発現ベクター (非ウィルスベクタ一、 ウィルスベクター）に組み込んだものが例示される。 VEGF 遺伝子は、 ヒトにおいては転写に際しての選択的スプラインングにより、 4種類 のサブタイプ (VEGF121、 VEGF165、 VEGF189、 VEGF206)の存在が報告されている
(Science 219, 983 (1983)； J. Clin. Invest. 84, 1470 (1989)； Biochem. Biophys. Res. Commun. 161， 851 (1989) ) 。 本発明においてはこれらいずれの VEGF遺伝子 を使用することができるが、 生物学的に最も活性が強い VEGF165遺伝子がより好 ましい。 該 VEGF遺伝子は文献 （Science, 246, 1306 (1989) ) 記載の配列及ぴデ ータベースに登録されている配列情報に基づき、 当業者ならば容易にクローニン グすることができ、 またその改変等も容易に行うことができる。
本発明において使用される 「FGF遺伝子」 及び 「HIF遺伝子」 とは、 各々、 FGF 及び HIFを発現可能な遺伝子を指す。 HGFや VEGFと同様に、 後述の如き適当な 発現べクタ一（非ウィルスベクター、 ウィルスベクター）に組み込んだものが例示 される。 該遺伝子は公知の文献記載の配列及ぴデータベースに登録されている配 列情報に基づき、 当業者ならば容易にクロー-ングすることができ、 またその改 変等も容易に行うことができる。
さらに、 本発明の血管新生因子遺伝子は前述のものに限定されず、 発現される タンパク質が血管新生因子としての作用を有する遺伝子である限り、 本発明の血 管新生因子遺伝子として使用できる。 即ち、 1 ) 前記 c D N Aとストリンジェン トな条件下でハイブリダィズする D N Aや、 2 ) 前記 c D N Aによりコードされ るタンパク質のァミノ酸配列に対して 1若しくは複数 (好ましくは数個）のァミノ 酸が置換、 欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコード する D N A等のうち、 本発明の血管新生因子としての作用を有するタンパクをコ ードするものであれば、 本発明の血管新生因子遺伝子の範疇に含まれる。 ここで 前記 1 )及び 2 )の D N Aは例えば部位特異的突然変異誘発法、 P C R法 [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a丄. (1987) Publ ish. John Wiley & Sons Section 6. 1-6. 4]又は通常のハイブリダィゼーシヨン法 [Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et a丄. (1987) Publish. John Wiley & Sons Section 6. 3-6. 4]等により容易に得ることができる。
即ち、 当業者であれば、 上述の血管新生因子遺伝子をまたはその一部をプロ一 ブとして、 あるいは、 該血管新生因子と特異的にハイプリダイズするオリゴヌク レオチドをプライマーとして、 該 DNAとハイブリダイズする DNAを単離すること ができる。 機能的に血管新生因子と同等なタンパク質をコ一ドする DNAを単離す るためのハイプリダイゼーシヨンのストリンジェントな条件は、 通常 「1 X SSC、 37° (：」 程度であり、 より厳しい条件としては 「0. 5 X SSC、 0. 1% SDS、 42°C」 程 度であり、 さらに厳しい条件としては 「0. 1 X SSC、 0. 1% SDS、 65°C」 程度であ り、 ハイブリダィゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性 を有する DNAの単離を期待しうる。 但し、 上記 SS (：、 SDS及び温度条件の組合せ は例示であり、 当業者であれば、 ハイブリダイゼーシヨンのストリンジヱンシー を決定する上記、 若しくは他の条件（プローブ濃度、 プローブの長さ、 反応時間 等）を適宜組み合わせることにより、 上記と同様のストリンジエンシーを実現す ることが可能である。
このようなハイプリダイゼーシヨン法あるいは PCR法により単離される遺伝子 によりコードされるタンパク質は、 従来公知の血管新生因子と比較して、 通常、 そのアミノ酸配列において高い相同性を有する。 高い相同性とは少なくとも 5 0%以上、 さらに好ましくは 70%以上、 さらに好ましくは 90%以上 (例えば 95% 以上）の配列相同性を指す。 アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、 Karlin and Al tschulによるアルゴリズム BLAST (Pro Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877， 199 3)によって決定することができる。 このアルゴリズムに基づいて、 BLASTNや BLA STX等のプログラムが開発されている（Altschul et al. J. Mol. Biol. 215 : 403 - 4 10， 1990) o BLASTに基づき BLASTNによって塩基配列を解析する場合には、 パラ メーターは例えば score=100、 wordlength=12とする。 また、 BLASTに基づき BLA STXによってアミノ酸配列を解析する場合には、 ノ ラメーターは例えば scOre=50、 wordlength=3とする。 BLASTと Gapped BLASTプログラムを用いる場合には、 各 プログラムのデフオルトパラメーターを用いる。 これらの解析方法の具体的な手 法は公^。でめる (http ://www. ncbi. nlm. nih. gov) 0
次に、 本発明の遺伝子治療において用いられる遺伝子導入方法、 導入形態及び 導入量等について記述する。
HGF遺伝子を有効成分とする遺伝子治療剤を患者に投与する場合、 その投与形 態としては非ウィルスベクターを用いた場合と、 ウィルスベクターを用いた場合 の 2つに大別され、 実験手引書等にその調製法、 投与法が詳しく解説されている [別冊実験医学,遺伝子治療の基礎技術、 羊土社 (1996)；別冊実験医学,遺伝子導 入&発現解析実験法、 羊土社 (1997) ； 日本遺伝子治療学学会編遺伝子治療開発研 究ハンドブック、 ェヌ 'ティー 'エス（1999) ] 。 以下、 具体的に説明する。
A. 非ウィルスベクターを用いる場合
慣用の遺伝子発現べクターに目的とする遺伝子が組み込まれた組換え発現べク ターを用いて、 以下のような手法により目的遺伝子を細胞や組織に導入すること ができる。
細胞への遺伝子導入法としてはリポフエクション法、 リン酸一カルシウム共沈 法、 D E A E—デキストラン法、 微小ガラス管を用いた D N Aの直接注入法、 ェ レクト口ポレーション法等が挙げられる。
また、 組織への遺伝子導入法としては内包型リボソーム（internal type lipos ome)による遺伝子導入、法、 静電気型リボソーム （electrostatic type liposom e) による遺伝子導入法、 HVJ—リボソーム法、 改良型 HVJ—リボソーム法 (HVJ— AVE リボソーム法）、 ウィルスエンベロープベクター法、 レセプター介在性遺伝 子導入法、 パーティクルガン (遺伝子銃） で担体 (金属粒子）と共に DNA分子を細 胞に移入する方法、 n a k e d— D NAの直接導入法、 正電荷ポリマーによる導 入法、 超音波の照射と共に DNA分子を細胞に移入する方法等のいずれかの方法に 供することにより、 組換え発現ベクターを細胞内に取り込ませることが可能であ る。
このうち H V J—リポソームは脂質二重膜で作られたリボソーム中に D N Aを 封入し、 さらにこのリボソームと不活化したセンダイウィルス (Hemaggulutinati ng virus of Japan : HVJ)とを融合させたものである。 当該 H V J—リボソーム法 は従来のリポソーム法と比較して、 細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴 とするものであり、 好ましい導入形態である。 H V J—リボソームの調製法につ いては [別冊実験医学，遺伝子治療の基礎技術、 羊土社 (1996) ；別冊実験医学，遺 伝子導入 &発現解析実験法、 羊土社（1997) ； J. Clin. Invest. 93： 1458-1464 (199 4)； Am. J. Physiol. 271： R1212- 1220 (1996) ] 等に詳しく述べられている。 また H V Jリボソーム法とは、 例えば Molecular Medicine 30： 1440-1448 (1993)； 実験医学 12： 1822-1826 (1994)； 蛋白質 ·核酸 ·酵素 42, 1806- 1813 (1997)等に記 載の方法であり、 好ましくは Circulation 92 (Suppl. II)： 479-482 (1995)に記載 の方法が挙げられる。
なお、 HVJとしては Z株 (ATCCより入手可能）が好ましいが、 基本的には他の H VJ株（例えば ATCC VR-907や ATCC VR-105等）も用いることができる。
本明細書中の 「ウィルスエンベロープベクター」 とは、 ウィルスエンベロープ 中に外来遺伝子を封入したベクターである。 ウィルスエンベロープベクターは、 ウィルスのゲノムが不活性化た遺伝子導入べクタ一であり、 ウィルスタンパク質 の複製がないため安全で細胞毒性、 及び、 抗原性が低い。 不活性化ウィルスを用 いたウィルスエンベロープベクター中に遺伝子を封入することにより、 培養細胞 や生体組織に対して安全で、 高効率の遺伝子導入べクターを調製することができ る。 ウィルスエンベロープベクターは、 例えば P C T/ J P 0 1 Z 0 0 7 8 2等 に記載の方法に従って調製することができる。 遺伝子導入べクターの調製に使用 するウィルスとしては野生型ゥィルス及び組換え型ウィルスの両方が挙げられ、 例えばレトロウイルス科、 トガウィルス科、 コロナウイノレス科、 フラビウイノレス 科、 パラミクソウィルス科、 オルトミクソウィルス科、 ブニヤウィルス科、 ラブ ドウイノレス科、 ボックスウイノレス科、 へノレぺスゥイノレス科、 ノ キュロウイノレス科、 及び、 へパドナウィルス科等を挙げることができる。 特に HV Jを用いたウィル スエンベロープベクターが好ましい。 また、 H a s a η , Μ. Κ.ら （Journal of General Virology, 78, 2813 - 2820 (1997) ) 、 又は、 Y o n e m i t s u , Y.ら
(Nature Biotechnology 18, 970-973 (2000) ) に記載される組換え型センダイ ウィルスを用いて遺伝子導入ベクターを調製することもできる。
さらに、 n a k e d— D N Aの直接導入法は上記手法のうち最も簡便な手法で あり、 この観点からも好ましい導入法である。
ここで用いられる発現ベクターとしては、 生体内で目的遺伝子を発現されるこ とのできるベクターであれば如何なる発現ベクターであっても良いが、 例えば p C A G G S [Gene 108： 193-200 (1991) ]や、 p BK— CMVヽ p c DNA 3 . 1、 p Z e o S V (インビトロゲン社、 ストラタジーン社)等の発現ベクターが挙げられる。 B . ウィルスベクターを用いる場合
ウィルスベクターとしては、 組換えアデノウイルス、 レトロウィルス等のウイ ルスベクターを用いた方法が代表的なものである。 より具体的には、 例えば、 無 毒化したレトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス、 ヘルぺスウイ ノレス、 ワクシニアウィルス、 ボックスウイ/レス、 ポリオウイルス、 シンビスウイ ルス、 センダイウィルス、 S V 4 0、 免疫不全症ウィルス（H I V)等の D N Aゥ ィルスまたは R N Aウィルスに目的とする遺伝子を導入し、 細胞に組換えウィル スを感染させることによって細胞内に遺伝子を導入することが可能である。
前記ウィルスベクターのうち、 アデノウィルスの感染効率が他のウィルスべク ターを用いた場合よりもはるかに高いことが知られており、 この観点からはアデ ノウィルスベクター系を用いることが好ましい。
本宪明の遺伝子治療剤の患者への導入法としては、 遺伝子治療剤を直接体内に 導入する in vivo法及ぴヒ トからある種の細胞を取り出して体外で遺伝子治療剤 を該細胞に導入し、 その細胞を体内に戻す ex vivo法がある [日経サイエンス、 1 994年 4月号: 20- 45頁; 月刊薬事 36 ( 1 )： 23 - 48 (1994) ; 実験医学増刊 12 (1 5)： (1994)； 日本遺伝学治療学会編 遺伝子治療開発研究ハンドプック、 ェヌ ·テ ィー .エス（1999) ]。 本発明では、 in vivo法が好ましい。
製剤形態としては、 上記の各投与形態に合った種々の製剤形態 (例えば液剤等） をとり得る。 例えば有効成分である遺伝子を含有する注射剤とされた場合、 当該 注射剤は定法により調製することができ、 例えば適切な溶剤（ P B S等の緩衝液、 生理食塩水、 滅菌水等）に溶解した後、 必要に応じてフィルタ一等で濾過滅菌し、 次いで無菌的な容器に充填することにより調製することができる。 当該注射剤に は必要に応じて慣用の担体等を加えても良い。 また、 HV J—リボソーム等のリ ポソームにおいては懸濁剤、 凍結剤、 遠心分離濃縮凍結剤等のリボソーム製剤の 形態とすることができる。
皮膚疾患に対して、 本発明の治療剤又は予防剤は好ましくは軟膏の形態で皮膚 の患部に局所投与され得る。 この軟膏は皮膚に容易に塗布できる適当な稠度の全 質均等な半固形の外用剤であり、 通常、 脂肪、 脂肪油、 ラノリン、 ワセリン、 ノ ラフィン、 蠟、 硬膏剤、 樹脂、 プラスチック、 ダルコール類、 高級アルコール、 グリセリン、 水若しくは乳化剤、 懸濁剤を含み、 これらを基剤としてデコイ化合 物が均等に混和されたものである。 基剤に依存して、 油脂性軟膏、 乳剤性軟膏、 水溶性軟膏の形態であり得る。 油脂性軟膏は動植物性油脂及ぴ蠟、 またはヮセリ ン、 流動パラフィン等を基剤とし、 乳剤性軟膏は、 油脂性物質と水とを乳化剤で 乳化するもので、 水中油型 （0/W) または油中水型 (W/0)のいずれかであり得る。 水中油型 (oZw)は、 親水軟膏であり得、 油中水型 (w/o)は、 はじめから水相を欠 き、 親水ワセリン、 精製ラノリンを含み得る力 \ または水相を含む吸水軟膏、 加 水ラノリンを含み得る。 水溶性軟膏は完全に水に溶けるマク口ゴール基剤を主成 分として含み得る。
好ましくは、 薬学的に受容可能なキヤリァは 5 %ステアリルアルコールを含む ワセリンあるいはワセリンのみあるいは流動パラフィンを含むワセリンである。 このようなキヤリァは薬学的組成物が患者による摂取に適した錠剤、 丸剤、 糖衣 剤、 カプセル、 液剤、 ゲル剤、 軟膏、 シロップ、 スラリー、 懸濁物等に処方され ることを可能とする。
また、 患部の細胞または目的とする組織の細胞内に局所投与する場合、 本発明 の治療剤または予防剤には、 キャリアとして合成または天然の親水性ポリマーを 含有させ得る。 このような親水性ポリマーの例として、 ヒドロキシプロピルセル ロース、 ポリエチレングリコールが挙げられ、 本発明の化合物を、 適切な溶媒中 でこのような親水性ポリマーと混合する。 その後、 溶媒を風乾等の方法により除 去して、 所望の形態、 例えば、 シート状に成型した後、 標的部位に付与すること ができる。 このような親水性ポリマーを含む製剤は、 水分含量が少ないので、 保 存性に優れ、 使用の際には水分を吸収してゲル状となり貯留性にも優れる。 この ようなシートは、 類似の物としてセルロース、 デンプン及ぴその誘導体あるいは 合成高分子化合物等に多価アルコールを混合して硬度を調整して形成した親水性 シートも利用することができる。
本発明で用いられる H G F、 VEGF、 FGF及び HIF等の血管新生因子遺伝子から 選択される遺伝子を複数併用して、 若しくは、 単独で、 またはこれらの血管新生 因子以外の血管新生作用を有する公知の因子を併用して、 又は単独で用いること が可能である。 例えば、 E G F等の因子は血管新生作用を有することが報告され ており、 これらの遺伝子を使用することができる。 また E G F等の増殖因子は組 織の種々の細胞障害を修復することが報告されており、 これらの遺伝子を用いる ことも可能である。
本発明でいう皮膚疾患には創傷、 ハゲ、 皮膚潰瘍、 褥瘡 (床ずれ)、 瘢痕（ケロ イド）、 アトピー性皮膚炎、 並びに、 自家移植及ぴ他家移植を含む皮膚移植後の 皮膚の損傷等が含まれる。 なお、 本発明において予防剤とは、 上記疾患を発症
(罹患） するのを予め防ぐ効果を有する薬剤、 もしくは、 上記疾患を発症した際 に症状を軽減する効果を有する薬剤、 あるいは、 症状の回復を早める効果を有す る薬剤等を言い、 これらの予防剤も本発明に含まれる。
ここで、 ハゲとは毛周期が極端に短くなり、 成長期の最中の太い毛まで抜けて しまい、 その結果として細く短い軟毛ばかりが生えてくる、 軟毛化現象を指す。 皮膚潰瘍とは真皮ないし皮下組織に達する深い組織欠損であり、 虚血性潰瘍、 鬱 血性潰瘍、 糖尿病性潰瘍、 褥瘡、 放射線潰瘍及び点滴漏れ等に分類される。 褥瘡 とは、 体の接触面から受ける持続的圧迫により組織の末梢血管が閉塞し壊死を起 こす病態を指し、 長期臥症中に人の後頭部 ·背中 ·腰等のように、 長期間圧迫さ れている部位に生じる境界明瞭な、 乾燥性壊死塊の付着した難治性潰瘍である。 瘢痕（ケロイド）とは、 皮膚損傷後に見られる結合組織の肥大増殖症であり、 創面 が扁平に隆起し、 時に蟹足状突起を生じるものであり、 増殖性を有し、 元の創傷 部位を越えて周辺に拡大を続けるものもある。 外傷がケロイドを形成する因子と しては遺伝的、 年齢的、 ホルモン等の全身因子、 及び、 局所因子として体の部位 による瘢痕のなりやすさが挙げられる。 肥厚性瘢痕、 瘢痕ケロイド及び真性ケロ ィド等に分類される。
本発明の遺伝子治療剤は治療目的の疾患、 症状等に応じた適当な投与方法/投 与部位が選択される。 投与方法としては非経口的に投与することが好ましい。 ま た投与部位としては皮膚疾患部位内に投与することが好ましい。 ここで 「皮膚疾 患部位」 とは、 皮膚疾患患部及びその周辺を含む部位を指す。
皮膚疾患部位には具体的には血管内及び筋肉内等への投与、 並びに、 軟膏等に よるその表層への投与が可能である。 即ち創傷、 ハゲ、 褥瘡 (床ずれ）、 ケロイド、 ァトピー性皮膚炎、 自家移植及ぴ他家移植を含む皮膚移植後の患部にぉレ、ては、 注射器やカテーテルにより血管内及び筋内に投与することにより、 または、 軟膏 等の形態でその表面に塗布することにより患部の血管新生を促進させ血流量の改 善を図り、 患部の機能の回復正常化を行うことができる。
本発明の H G F遺伝子を適用することにより、 創傷、 ハゲ、 皮膚潰瘍、 褥瘡 (床ずれ)、 瘢痕（ケロイド）、 アトピー性皮膚炎、 並びに、 自家移植及び他家移植 を含む皮膚移植後の皮膚の損傷に対して積極的な遺伝子導入による治療を行うこ とができ、 従来、 適切な治療法の道のなかった患者において機能の回復が可能と なる。
本発明の治療剤または予防剤には、 該薬剤により意図される目的を達成するの に十分な量、 即ち 「治療的有効量」 または 「薬理学的に有効な量」 の血管新生因 子遺伝子が含まれる。 「治療的有効量」 または 「薬理学的に有効な量」 とは、 意 図される薬理学的結果を生じるために有効な薬剤の量であり、 処置されるべき患 者の徴候を軽減するのに十分な量である。 所定の適用における有効量を確認する 有用なアツセィ法としては、 標的疾患の回復の程度を測定する方法が挙げられる。 実際に投与されるべき量は、 処置される個体に依存し、 好ましくは、 所望の効果 が顕著な副作用を伴うことなく達成されるよう最適化された量である。
治療的有効量、 薬理学的に有効な量、 及び、 毒性は、 細胞培養アツセィまたは 任意の適切な動物モデルにより決定することができる。 また、 そのような動物モ デルは所望の濃度範囲おょぴ投与経路を達成するのに用い、 当業者であれば、 そ れに基づきヒトにおける有効量を決定することができる。 治療効果と毒性効果と の間の用量比は治療係数であり、 それは比率 ED50/LD50として表すことができ る。 大きな治療係数の薬学的組成物が好ましい。 決定された用量は、 使用される 投与形態、 患者の感受性、 年齢やその他の患者の条件、 疾患の種類、 重篤さ等に より適宜選択され、 本発明の治療剤の投与量としては、 患者の症状等によって異 なるが、 成人患者 1人当たり H G F遺伝子として約 1 μ g〜約 5 0 m gの範囲、 好ましくは約 1 0 μ g〜約 5 m g、 より好ましくは約 5 0 μ g〜約 5 m gの範囲 から投与量が選択される。
本発明の治療剤は数日ないし数週間に一回投与するのが好適であり、 投与回数 は適宜患者の症状に応じて選択される。 本発明の治療剤は非侵襲的な投与に供さ ' れるものであるため、 病状に応じて何回でも投与できるという特徴を有する。 ' 本発明におレ、て血管新生因子遺伝子を導入する生物としては特に制限はないが、 好ましくは哺乳動物である。 哺乳動物としては、 例えばヒトゃサル、 マウス、 ラ ット、 ブタ、 ゥシ、 ヒッジなどの非ヒト哺乳動物を例示することができるが、 こ れらに制限されない。 図面の簡単な説明
図 1は、 遺伝子転移後の創傷中のヒト H G F濃度 （A) 及びラット H G F濃度 (B) を検出した結果を示す図である。 *コントロールラットにおける値に対し て p <0. 05。 各グループ共 n =5。 N D ;検出せず。
図 2は、 H G F遺伝子転移ラット中のヒ ト H G Fの mR NA ( a〜d )及びタン パク質（e〜h )の分布を示す写真である。 図中の棒のスケールは、 a及び eで 1 00 i mであり、 b〜d、 g及び hで 200 μ ηιである。
図 3は、 元の創傷領域に対する遺伝子転移後の創傷領域の大きさを割合で示す 図である。
図 4は、 遺伝子転移後のラットの創傷の端の表皮中での PCNAの発現を示す図 (Α)および写真 (Β)である。 Α は遺伝子転移後の表皮中の PCNA 陽性細胞の割合を、 Bは PCNAの発現を示す写真である。 図中 a〜cは各々、 H G F遺伝子転移ラッ トの 3、 7及び 14日目の写真、 （！〜 f はコントロールラットの 3、 7及ぴ 14日目 の写真である。 a〜 f 中の棒のスケールは 200〃 mである。
図 5は、 遺伝子転移後のラットの肉芽組織中での PCNAの発現を検出した結果 を示す図 (A)および写真 (B) である。 Aは遺伝子転移後の肉芽組織中の PCNA陽 性細胞の割合を、 Bは PCNAの発現を示す。 図中 a〜cは各々、 H G F遺伝子転 移ラットの 3、 7及び 14日目の写真、 d〜 f は各々コントロールラットの 3、 7 及び 14日目の写真である。 a〜 f 中の棒のスケールは 200 mである。
図 6は、 遺伝子転移後のラットの肉芽組織における第 VIII因子に対する免疫 組織化学を用いた微細血管数のカウントの結果を示す図 (A)および写真 (B)である。 Aは肉芽組織における微細血管数、 Bは第 VIII因子についての免疫組織化学の結 果を示す。 図中 a〜cは各々、 H G F遺伝子転移ラットの 3、 7及び 14日目の写 真、 d〜f は各々コントロールラットの 3、 7及ぴ 14 目の写真である。 a〜f 中の棒のスケーノレは 200 μ πιである。
図 7は、 < 01 « 2 (1)の1111¾^にっぃての1^-?0^の結果を示す図でぁる。 Αは半 定量的 RT - PCR法を用いて選られた Col α 2 (I)の即時増幅プロットであり、 Bは R T-PCRの閾値サイクルの標準曲線である。
図 8は、 TGF- j8 1、 Col 2 (1)、 α -ァクチン、 デスミン及び Col α 1 (III)の mR NAについての RT- PCRの結果を示す図および写真である。 Aでは PCR産物の検出 を行っており、 Bは半定量的 RT- PCRの結果である。
図 9は、 遺伝子転移後のラットの創傷中のヒ ドロキシプロリン濃度を検出した 結果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を具体的に説明するが、 本発明はこれらの実施例に よりなんら限定されるものではない。
( 1 ) 創傷組織及び血漿中の HGFタンパク濃度
およそ 1 1週齢で 310〜370 gの重さの 65匹の雄の Wistarラ ットを、 2つの実験のうちの 1つに割り当て、 2匹ずつ温度管理された、 12時間 の明暗サイクルの部屋に収容した。 全てのラットに市販の餌及ぴ水道氷を任意に 与 た。 この実験は Care and Use of Laboratory Animals of the National In stitute of Healthに従って行った。 該プロトコノレは National Defense Medical Collegeの動物実験の倫理について委員会により承認されたものである。
2 . HGF発現ベクター ヒ ト HGF cDNA (2. 2kb)を pUC - SR a発現べクタ一プラス ミ ドの EcoRI/Notl部位に挿入した。 該プラスミ ド中、 HGF cDNAの転写は SR a プロモーターのコントロールを受ける (Nature 342： 440-443 (1989) )。
3 . HVJ -リボソーム 子牛胸腺から精製した（ HMG) - 1 (50 μ 1)とプラスミ ド D ΝΑ (200 g)を 20°Cで、 総量 200 1となるよう等張液（137mM NaCl, 5. 4mM KC1, lOmM Tris-HCl, pH7. 6)で 1時間混合した後、 10mgの乾燥脂質（ホスファチジル セリン、 ホスファチジノレコリン、 コレステロールの 1 : 4. 8 : 2の混合物）に添カロし た。 リボソーム- DNA- HMG-1複合体懸濁液を攪拌し、 3秒間超音波処理し、 30分 間振盪しリポソームを形成した。 精製センダイウィルス（HVJ) (Z株）を使用直前、 3分間の UV照射（llOerg/mmV秒）により不活化した。 リポソーム懸濁液 (0. 5ml,
10mgの脂質を含む）と HVJ (30000血球凝集単位）を総量 3mlの等張液中で混合 した。 混合後 4°Cで 10分間インキュベートした後、 軽く振盪しながら 37°Cで 30 分間加温した。 遊離の HVJをショ糖密度遠心分離により除去した。 HVJリポソ一 ム -DNA複合体を最上層から回収し、 すぐに使用した。 4 . 創傷組織及び血液試料 41匹のラットを、 創傷の生化学、 及び、 組織学 研究のために 2つのグループ（HGF遺伝子転移グループ及ぴコント口ールべクタ 一グループ）に分けた。 ベントバルビタ一ルナトリウム（ 0 . 5 ml/kg)を腹膜注射 してラットを麻酔し、 背中の毛を剃り、 皮膚を洗浄し、 各動物の背中に 14mm 厚の創傷をつくった。 3日後、 同じラット（ペントパルビタール麻酔下）に 100 g の HGF cDNAを含む HV J -リボソーム（500 /^ 1)、 または、 コントロールベクターを 皮下注射した。 27G針を用いて創傷の端に導入した。 注射 3、 7及び 14日後に麻 酔下で動物を断頭し、 HGF測定のため血液試料を採取した。 血液試料を EDTA (2mg /ml)を含む凍結チューブに入れた後、 遠心した。 直に血漿を凍結し、 分析するま で一 80°Cで貯蔵した。 また、 解剖時、 皮膚を除き、 各グループから 5匹のラット の組織について定量した後二分した。 一方を液体窒素中で凍結し、 使用するまで 一 80°Cで貯蔵した。
5 . ELISA試験 各グループ毎 5匹の組織試料を 4倍量の 0. 1% 2M NaCl、 0. 1% Tween- 80、 ImM PMSF及び ImM EDTAを含む 20mM Tris-HC 1 ノくッファー（pH7. 5)中、 ポリ トロン式ホモジェナイザー（24000rpm; Kinematics AG, Lucerne, Swi tzerland)を用いて 1分間ホモジェナイズした。 ホモゲネートを 4°C、 15000 X g で 30分間遠心し、 上清及びべレットを HGFタンパクについての酵素免疫分析 (EL ISA)まで一 80°Cで貯蔵した。 ヒ ト HGFタンパク濃度を抗ヒ ト- HGFモノクローナ ル抗体を用いて ELISAで測定し、 ラット HGFについても抗ラット -HGFモノクロ ーナル抗体を用いて ELISAで測定した（Institute of Immunology, Tokyo, Japa n)。 ヒ ト HGF ELISA系ではラット HGFではなくヒ ト HGFを特異的に検出した。 50 1ラット血漿中の HGFタンパクの血漿濃度を上述の ELISAを用いて測定した。
6 . 結果 創傷組織への HGF遺伝子転移 3、 7及び 14日後、 HGF遺伝子転移ラ ット中のヒ ト HGFタンパク量は大いに増幅され、 コントロールラットでは HGFが 全く検出されないことが ELISAにより明らかになった（図 1A)。 しかしながら、 H GF遺伝子転移ラット由来の血漿試料からはヒ ト HGFタンパクは検出されなかつ た。 それに対し、 HGF遺伝子転移ラットの創傷組織中のラット HGF量は、 遺伝子 転移 3日後初めて有意に増加した（図 1B、 pく 0. 05)。
( 2 ) 創傷組織中のヒト HGFmRNA及ぴタンパク質の発現
( 1 ) に記載の方法と同様の方法により、 ラットにおいて創傷を作成し HVJ- リボソームまたはコントロールベクターを投与し、 注射 3、 7及び 14日後に麻酔 下で動物を断頭して得た創傷組織を過ョゥ素酸 -リジン-パラホルムアルデヒ ド (P LP)溶液中に固定した。
1 . In situハイブリダイゼーション HGFの in situハイブリダイゼーショ ンのため、 脱パラフィン化した 4%パラホルムアルデヒド固定セクションを 0. 2N
HC1で 20分間処置した後、 2 X SSC中、 10分間 37。Cでインキュベートし、 最終 的に S ^ g/ralプロティナーゼ K中、 37°Cで 10分間インキュベートした。 続いて 各セクションを 5分間 4%パラホルムアルデヒド中に固定ィ匕し、 組織の酸化によ る非特異的結合を防ぐために 0. 25% (容量/容量)無水酢酸を含む 0. lmol/1 トリ エタノールァミンバッファー（pH8. 0)中で 10分間インキュベートした。 pUC-SRひ 発現ベクタープラスミ ドの EcoRI及び Notl部位中に挿入した完全長ヒト HGF cD NAを、 EcoRIを切断する制限酵素で消化し、 得られた HGF cDNA (848bp)の断片を pGEM-7Zf (+) (Promega, Madison, WI)の EcoRIクローニング部位の間に連結した。 アンチセンスプローブ及び対応するセンスプローブを、 RNA標識キット（Boehrin ger Mannheim, Postfach, Germany)により、 各々 SP6及び T7ポリメラーゼを用 いてジゴキシゲニンで標識した。 50% (容量/容量)脱イオン化ホルムアミ ド、 5 Χ デンハート溶液、 5% (重量/容量)硫酸デキストラン、 2 X SS 0. 3mg/mlサケ精 子 DNA、 5mM EDTA及び 0. 01 μ g/ml ジゴキシゲニン標識プローブ中、 42。Cで一 晚ハイブリダイズさせた。 55°Cで 20分間、 最終ストリンジエンシーの洗浄を行 つた後、 ハイプリダイゼーションを免疫学的に検出した。
2 . 免疫組織化学 脱パラフィン化したセクションに対して直接免疫ペルォキ シダーゼ法を適用した。 該方法では HGFに対するマウスモノクローナル抗体（1： 2 0, Institute of Immunology, Tokyo, Japan)、 及び、 ゥサギ免疫グロブリンに 対する西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識二次抗体（Chemicon International Inc. , 希釈 1 : 250)を用いた。 ヒト HGFに対するマウスモノクローナル抗体によりラッ ト HGFではなくヒト HGFを特異的に検出した。
3 . 結果 HGF遺伝子転移ラットの創傷組織中、 HGF mRNAは遺伝子転移 3日 後の創傷の端の上皮中扁平上皮細胞、 血管の内皮細胞及び平滑筋細胞、 並びに、 肉芽糸且織中の,線維芽細胞で検出された（図 2 a，2 b，2 e及び 2 f )。 それに対し、 全てのコントロールラットでは検出されなかった。 同様に、 ヒト HGFタンパク力 S HGF遺伝子転移ラットの同じ細胞型 (上皮中の扁平上皮細胞、 血管の内皮細胞及 ぴ平滑筋細胞、 並びに、 肉芽組織中の線維芽細胞）で検出され、 コントロールラ ットではされなかった（図 2c及び 2g)。 その後、 遺伝子転移 14日後（試験最終 日）までこの発現は維持された（図 2d及び 2h)。
( 3 ) 創傷病変サイズ
( 1 ) に記載の方法と同様の方法により、 ラットにおいて創傷を作成し HVJ - リボソームまたはコント口一ルべクタ一を投与した 20匹のラットを遺伝子（又は ベクター）転移後の創傷範囲の測定に用いた。
1 . 創傷範囲の測定 遺伝子転移 0、 3、 7、 10及び 14日後にィメージ分析器 (T0SPIX-U, AS3260C,及びィメージ分析パッケージソフトゥェァ； Toshiba, Tokyo, J apan)を用いて取ったトレーシングで創傷範囲を測定した。 創傷範囲は初期範囲 (遺伝子転移 0日後のもの）に対するパーセンテージで表現した。 完全な厚さの創 傷が完全に上皮で覆われた時点を、 完治した日とした。
2 . 結果 創傷病変範囲 (遺伝子転移 0日後の元の創傷病変範囲に対するパー センテージとして表現）は、 遺伝子転移 3日後、 HGF遺伝子転移ラットで有意に 減少した（コントロールラットと比べて）（図 3， ρ < 0· 05)。 しかしながら、 HGF遺 伝子転移ラット及びコントロールラットの間で完全に治癒するまでに必要とされ る日数に差異はなかった。 ( 4 ) 創傷中の細胞増殖及び血管新生
( 1 ) に記載の方法と同様の方法により、 ラットにおいて創傷を作成し HVJ - リボソームまたはコントロールベクターを投与し、 注射 3、 7及び 14日後に麻酔 下で動物を断頭して得た創傷組織を PLP中に固定した。
1 . 増殖細胞核抗原 (PCNA)の測定 細胞増殖の指標として各組識中での PCNA の発現を検出した。 脱パラフィン化した上皮、 及び、 肉芽組織に対して直接免疫 ペルォキシダーゼ法を適用した。 PCNAに対するマウスモノクローナル抗体（PC- 1 0， 1 : 100， Dako Inc. , Glostrup, Denmark) , 及び、 ゥサギ免疫グロブリンに対 する西洋ヮサビペルォキシダーゼ標識二次抗体（Chemicon International Inc. , 希釈 1 : 250)を用いた。 PC - 10に対する免疫組織ィ匕学の前に、 0. 01Mクェン酸緩衝 液 (pH6. 0)中、 120°Cで 15分のォートクレープ前処理を行った。 ネガティブコン トロールとして、 一次抗体とのインキュベーション工程を省いた。 PC - 10の分析 のため、 少なくとも 1000個の腫瘍細胞での免疫反応に基づいて、 免疫反応が陽 性であった核の割合を測定した (PCNA指数)。
2 . 血管新生の測定 創傷中の微細血管数を、 最も多数の血管を含む領域につ いて光学顕微鏡で評価した。 血管数を連続的な 200 Xの場 (20 X対物レンズ及び 1 0 X接眼レンズ； 場当たり 0. 0925膽2)で測定した。 また、 血管新生は上述の 1 . における方法と同様にして、 第 VIII因子に対するポリクローナル抗体（1 : 100， Da ko Inc. , Glostrup, Denmark)を用いて肉芽組織の上皮細胞中の第 VIII因子を調べ ることにより測定した。
3 . 結果 遺伝子転移 3及び 7日後の HGF遺伝子転移ラット中で創傷の端の上 皮、 及ぴ、 肉芽組織の両方で PCNA指数はどちらも有意に増加した（コント口ール ラットと比べて）（図 4及び 5, p<0. 05)。 肉芽組織中の微小血管数 (第 VIII因子 の免疫組織化学により検出）は、 遺伝子転移 3日後の HGF遺伝子転移ラットで有 意に増加していた（図 6, pぐ 0. 05)。
( 5 ) 創傷中の皮膚成分の発現 ( 1 ) に記載の方法と同様の方法により、 ラットにおいて創傷を作成し HVJ - リボソームまたはコントロールベクターを投与し、 注射 3、 7及ぴ 14日後に麻酔 下で動物を断頭して得た創傷組織から RNA抽出を行つた。
1 . 総 RNA抽出、 及ぴ、 半定量的 RT- PCR 各グループから 5匹のラットの皮 膚組織中の種々の mRNAの発現を、 半定量的 RT- PCRにより調べた (Lab. Invest 7 9： 679-688 (1999) ) 0 皮膚組織中の総 RNAをイソチオシァネート酸グァニジゥム - フヱノールク口口ホルム抽出及びエタノール沈殿を用いて単離した (Anal. Bioche nk. 162： 156-159 (1987) )。 増幅試薬キット（TaqMan EZRT- PCRキット； Appl ied Bi osystems, Alameda, CA)及び複数のプライマーを用いて RT- PCRを行った。 以下 のプライマーを自動 DNA合成装置で作成した： TGF - β 1， Col a 2 (I) , Col a 1 (III)， デスミン， α - sm -ァクチン及ぴグリセルアルデヒド- 3 -リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDH)。 用いた全ての PCRプライマー及び TaqManプローブの配列情報、 並びに、 温度条件を表 1に示す（Hepatology 24： 636-642 (1996) ) 0 TaqManプローブの 5' 末端をリポーター色素分子 FAM (6-カルボキシフルォレジン）、 及び、 3'末端をク ェンチヤ一色素 TAMRA (6-カルボキシテトラメチルローダミン）で標識した。 I X 反応バッファー、 300 i M dATP、 300 ^ M dCTP、 300 dGTP, 600 dUTP, 3 mM Mg (0Ac) 2、 0. 1U/ μ 1 rTth DNAポリメラーゼ、 O. OlU/ μ Ι AmpErase UNG、 900 nM プライマー及び 200nM TaqManプローブの最終濃度を、 製造者のプロトコルに 従って反応のための原混合物を調製した。 RT反応液を 60°Cで 30分間、 続いて A mpErase UNGを不活化するため 95°Cで 5分間ィンキュベートした。 ABI PRISM 77 00 Sequence detector (Applied Biosystems)を用いて PCRを行った。 PCRの各サ ィクルで、 rTth DNAポリメラーゼの 5'→3 'ェキソヌクレアーゼ活性により TaqM an プローブを切断し、 適当な波長におけるリポーター色素の蛍光を増幅させた。 蛍光の増加は、 PCR中のテンプレートの濃度に比例した（図 7A)。 閾値蛍光レベル は、 テンプレート無しのコントロールで得られた平均値の標準偏差に 6. 965かけ た（TaqMan RT-PCRキットのプロトコルに従つた）。 各 RNA量毎に 4個のゥヱルに ついて確立した閾値サイクルを用いて標準曲線を得た（図 7B)。 PCR産物を 3%ァ ガロースゲルでの電気泳動により分離し、 ェチジゥムプロミドで染色した（図 8
A)。
(表 1 )
¾ブp ¾cR RT θ HFGi.
CO
アニーリング 産物の大きさ mRNA センスプライマ一 (5'-3') アンチセンスプライマ一（5'-3') TaqMan プローブ（5'-3') (Q サイク レ (bp)
GAPDI I CTTCACCACCATGGAGAAGGC GGCATGGACTGTGGTCATGAG CCTGGCCAAGGTCATCCATGACAACTTT 60 40 238
TGF-BI TGAGTGGCTGTCTTTTGACGTC GCAGTTCTTCTCTGTGGAGCTG CAGTGGCTGAACCAAGGAGACGGAAT 64 50 301
CoIa2(I) GGCTGCTCCAAAAAGACAAAT CCAGAGGTGCAATGTCAAGGA ATACAAAACGAATAAGCCATCTCGCCTGC 60 40 97
G A C
CoiaKIII) GTGAAAGAGGATCTGAGGGCT GAGTTCAGGGTGGCAGAATTT TGCTGCCATTGCTGGAGTTGGA 64 50 302
C
asm- CGATAGAACACGGCATCATCA GCATAGCCCTCATAGATAGGC AACTGGGACGACATGGAAAAGATCTGG 60 50 301
ァクチン C A
デスミン AGCGCAOAATTGAGTCACTCA TGTCGGTATTCCATCA丁 CTCCT CTCAGGGACATCCGTGCTCAGTATGAGA 60 50 301
A
GAPD ラットグリセルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ; TGF- Ι，ラット形質転換成長因子- 1; Col Qf 2(I)，ラット - 2 1型: ゲン, t セグメント 2: Coi Of l(ni),ラットコラ一ゲン ST型び- 1;デスミン，ラットデスミン； - sm-ァクチン，ラット血管平滑筋 -ァクチン.
スミン mRNAの発現は、 遺伝子転移 3日後コントローノレラットと比べて有意に上 昇しており、 TGF - β 1及ぴ Col a 2 (I) mRNAの発現は、 遺伝子転移 7及び 14日後 に各々、 有意に減少していた（図 8B, pく 0. 05)。
( 6 ) 創傷中のヒドロキシプロリン濃度
( 1 ) に記載の方法と同様の方法により、 ラットにおいて創傷を作成し HVJ - リボソームまたはコントロールベクターを投与し、 注射 3、 7及び 14日後に麻酔 下で動物を断頭して得た創傷組織から組織試料を調製した。 .
1 . ELISA試験 4倍量の 0· 1% 2M NaCl、 0. 1 % Tween - 80、 IraM PMSF及ぴ 1 mM EDTAを含む 20mM Tri s- HC 1バッファー（pH7. 5)中、 ポリ トロン式ホモジェ ナイザー（24000rpm; Kinematica AG, Lucerne, Switzerland)を用いて 1分間ホ モジェナイズした。 ホモゲネートを 4°C、 15000 X gで 30分間遠心し、 ペレット を 6N HC1中に 110°Cで 16時間加水分解した。 ヒドロキシプロリン含量をァミノ 酸分析器（モデル 835 ; HitacM Ltd. Tokyo, Japan)を用いて測定した。
2 . 結果 創傷中のヒドロキシプロリン濃度は、 遺伝子転移 3、 7及び 14日後 の HGF遺伝子転移ラット中、 コントロールラットに比べて明らかに低かった（図 9, p < 0. 05)。
上記実施例で得られた結果は各々、 平均土平均の標準偏差として表した（SEM)。 分散分析 (AN0VA)により有意の F値が得られた場合、 フイツシヤーの保護最小-有 , 相連検定 (F isher s protected least-signii icant-dir'f erence test)を; i 用 した。 pく 0. 05で有意な相違とした。 産業上の利用の可能性
今回、 コント口ールラットと比べて HGF遺伝子転移ラットの創傷組織中のヒ ト 及びラット HGFタンパクの量の増加が、 ELISA及び免疫組織化学を用いて観察さ れ、 同様により早い再上皮化、 強力な複数の型の細胞の増殖、 及び、 強力な血管 新生が創傷内で免疫組織化学により観察された。 それに対し、 創傷治癒の間、 創 傷中の TGF- j3 1mRNA及ぴ Col o; 2 (I) mRNAの下向き調節、 並びに、 ヒドロキシプ 口リン量の減少を観察した。 これらの結果より、 皮膚創傷への HGF遺伝子転移は、 創傷治癒工程の一部である再上皮化、 及び、 血管新生を助ける。 また、 瘢痕の形 成も抑制される力も知れなレ、。
遺伝子転移 14日後 (試験終了日）、 創傷中のヒト HGF産生が維持されることを 確認した。 さらに、 創傷中のラット HGF濃度は、 遺伝子転移 3日後、 コントロー ルラットよりも有意に高かった。 従って、 ヒト HGF遺伝子はラット HGFの産生の 正の調節因子として働くのかも知れない。 さらに、 この結果は HGF自身が局所 H GFの産生を自己完結的な陽性フィ一ドバックで調節し、 自己分泌-傍分泌方式で 調節するという仮説 [Kid. Int. 53： 50-58 (1998)； Biochem. Biophys. Res. Commun. 220： 539 - 545 (1996) ]が裏付けられ、 H G F遺伝子を投与することにより、 投与 を受けた個体における本来の H G Fの産生が促進されると考えられる。
本発明により得られた巨視的、 及ぴ、 組織学的事実は、 HGF遺伝子導入ラット ではコントロールラットと比べ、 創傷病変範囲のより迅速な減少が見られ、 創傷 の端の上皮中の基底細胞の超増殖が観察された。 そのため、 このモデルで HGF mR A及びタンパク発現の増加が、 創傷内及び創傷を横断しての上皮細胞の分裂、 及び、 増殖を傍分泌及び/または自己分泌活性により増幅し得ることが示された。 本発明では、 HGF遺伝子転移ラットで血管数の増加、 及び、 肉芽組織中の内皮細 胞の PCNA-陽性染色も観察され、 HGFが強力な血管新生活性を有することを裏付 ける。
本発明では、 半定量的 RT- PCRを用いて TGF- β 1 mRNA発現が HGF遺伝子転移 ラットでは遺伝子転移 7日後に、 コント口ールラットと比べて減少していること が観察された。 さらに、 Colひ 2 (1) mRNA発現は遺伝子転移 14日後に、 ヒドロキ シプロリンは遺伝子転移 3、 7及び 14日後に減少した。 この結果、 HGF遺伝子転 移ラットでの瘢痕形成が TGF - ]3 1合成の下向き調節により抑制されるかもしれな いことが示唆された。 従って、 皮膚への HGF遺伝子転移は、 皮膚繊維症の患者の 処置に有用であるかもしれない。
以上の結果により血管新生因子遺伝子転移が創傷治癒の初期段階で有利な効果 を有し、 血管新生因子が皮膚疾患を調節する役割を果たすかもしれないことが示 され、 遺伝子転移で誘導した血管新生因子の過剰発現により再上皮化、 及び、 血 管新生の操作は、 創傷治癒の分野において新しい治療法の選択を提供する。

Claims

請求の範囲
1 . 血管新生因子遺伝子を有効成分として含有する皮膚疾患の治療剤又は予防 剤。
2 . 血管新生因子遺伝子が HGF遺伝子、 VEGF遺伝子、 FGF遺伝子または HIF遺 伝子である、 請求項 1記載の治療剤又は予防剤。
3 . 皮膚疾患が創傷、 ハゲ、 皮膚潰瘍、 褥瘡 (床ずれ)、 瘢痕 （ケロイド） 、 ァ トビー性皮膚炎、 または、 自家移植及び他家移植を含む皮膚移植後の皮膚の損傷 である、 請求項 1記載の治療剤又は予防剤。
4 . 該治療剤又は予防剤が錠剤、 丸剤、 糖衣剤、 カプセル、 液剤、 ゲル剤、 軟 膏、 シロップ、 スラリー、 懸濁物の形態である、 請求項 1又は 2記載の治療剤又 は予防剤。
5 . 遺伝子を内包型リボソーム法、 静電気型リボソーム法、 HVJ -リボソーム法、 改良型 HVJ -リボソーム法、 ウィルスエンベロープベクター法、 レセプター介在 性遺伝子導入法、 パーティクルガン (遺伝子銃）で担体と共に DNA分子を細胞に移 入する方法、 n a k e d - D NAの直接導入法、 超音波の照射と共に DNA分子を 細胞に移入する方法、 エレクト口ポレーシヨン法、 または、 正電荷ポリマーによ る導入法のいずれかにより細胞に移入するための、 請求項 1〜 3いずれかに記載 の薬剤。
6 . 血管新生因子遺伝子を哺乳動物に導入することを含む、 皮膚疾患の治療又 は予防法。
7 . 皮膚疾患の治療剤又は予防剤の製造のための血管新生因子遺伝子の使用。
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