WO2005023287A1 - ヒト組換えｈｇｆを含有する皮膚潰瘍予防治癒剤 - Google Patents

ヒト組換えｈｇｆを含有する皮膚潰瘍予防治癒剤 Download PDF

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WO2005023287A1
WO2005023287A1 PCT/JP2004/012361 JP2004012361W WO2005023287A1 WO 2005023287 A1 WO2005023287 A1 WO 2005023287A1 JP 2004012361 W JP2004012361 W JP 2004012361W WO 2005023287 A1 WO2005023287 A1 WO 2005023287A1
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amino acid
hgf
acid residues
human recombinant
dna
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PCT/JP2004/012361
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Toshikazu Nakamura
Saho Yoshida
Kunio Matsumoto
Satoshi Itami
Kunihiko Yoshikawa
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Kringle Pharma Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to an agent for preventing and healing skin ulcers, an agent for promoting angiogenesis, and an agent for promoting granulation proliferation, which contain human recombinant HGF or a gene encoding human recombinant HGF.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Various cell growth factors are involved in skin wound healing by controlling cell proliferation, epidermal cell migration, apoptosis (cell death) or extracellular matrix production in the skin.
  • the administration of certain growth factors promotes skin wound healing in normal animals, and in some cases, decreases the ability of the skin to heal wounds, and is effective in diabetic patients and steroid administration or malnutrition model animals. It has been reported that growth factors compensate for a decrease in the ability of the skin to heal wounds (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Non-Patent Document 4 1 6 recombinant bFGF has been used as a therapeutic agent for skin ulcers.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • keratinocytes epidermal keratinocytes
  • melanocytes melanocytes
  • the present inventors have further studied the role of HGF on skin physiology and wound healing, and have developed a wound treatment or skin ulcer treatment agent containing recombinant HGF as an active ingredient, and have obtained a patent (Patent Reference 1).
  • HGF HGF was It is supported to be involved in skin wound healing.
  • the expression of HGF and cMetZHGF receptor increases in response to skin wounds (Non-Patent Document 14, Non-Patent Document 15).
  • Transgenic mice overexpressing HGF show accelerated angiogenesis and granulation tissue formation after skin wounds (Non-Patent Document 16).
  • the skin wound healing model when the action of endogenous HGF is blocked by administration of an anti-HGF antibody, regeneration of the epidermis and angiogenesis are suppressed and healing is delayed (Non-Patent Document 15).
  • Non-Patent Document 17 Human recombinant HGF lacking five amino acid residues is a known protein (Non-Patent Document 17).
  • Non-Patent Document 17 describes the effect of promoting granulation hyperplasia and angiogenesis. Listed,,, and even suggested,,,.
  • Non-Patent Documents 15 and 16 Non-Patent Documents 15 and 16 .However, when HGF is administered, exogenous HGF exerts a strong force to cause the same phenomenon. In addition, it has been completely studied, and furthermore, it has been described and suggested that human recombinant HGF lacking 5 amino acid residues in the first kringle domain has V and V. Not.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No. 3200609
  • Non-Patent Document l Suh, DY, Hunt, TK and Spencer, EM, "insulin-like growth factor—I reverses the impairment of wound healing induced by corticosteroids in rats.”, Endocrinology, 131, p.2399—2403 (1992 ).
  • Non-Patent Document 2 Albertson, S., Hummel, R.P., 3rd, Breeden, M. and Greenhalgh, D.G.
  • Non-Patent Document 3 Greenhalgh, D.G., Sprugel, K.H., Murray, M.J. and Ross, R., "PDGF and FGF stimulate wound healing in the genetically diabetic mouse., The
  • Non-Patent Document 4 Tsuboi, R. and Ritkin, DB, "Recombinant basic fibroblast growth factor stimulates wound healing in healing-impaired db / db mice., Journal of Experimental Medicine, 172, p.245-251 (1990).
  • Non-Patent Document 5 Brown, R ⁇ ., Breeden, MP and Greenhalgh, DG, "PDGF and TGF—alpha act synergistically to improve wound healing in the genetically diabetic mouse.”, Journal of Surgical Research, 56, p.562- 570 (1994).
  • Non-Patent Document 6 Tsuboi, R "Shi, CM., Sato, C” Cox, G.N. and Ogawa, H ""
  • IGF insulin-like growth factor
  • Non-Patent Document 7 Nakamura, ⁇ , Nishizawa, ⁇ , Hagiya, M., Seki, ⁇ , Shimonishi, M., Sugimura, A., Tashiro, K. and Shimizu, S., "Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor. ", Nature, 342, p.440-443 (1989).
  • Patent Document 8 Boros, P. and Miller, CM., "Hepatocyte growth factor: a multifunctional cytokine.”, Lancet, 345, p.293-295 (1995).
  • Non-Patent Document 9 Zarnegar, R. and Michalopoulos, G.K., "The many faces of hepatocyte growth factor: from hepatopoiesis to hematopoiesis. ,, Journal of Cell Biology, 129, p.1177-1180 (1995).
  • Non-Patent Document 10 Matsumoto, K. and Nakamura, ⁇ ⁇ , “Hepatocyte growth factor:
  • Kidney International 59, p.2023-2038 (2001).
  • Non-patent literature ll Matsumoto, ⁇ ⁇ , Hashimoto, ⁇ ⁇ , Yoshikawa, ⁇ ⁇ and Nakamura, ⁇ ⁇ , “Marked stimulation of growth and motility of human keratinocytes by hepatocyte growth factor.”, Experimental Cell Research, 196 , P.114-120 (1991).
  • Hepatocyte growth factor is a potent stimulator of human melanocyte DNA synthesis and growth.”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 176, p. .45-51 (1991).
  • Non-Patent Document 13 Halaban, R "Rubin, JS, Funasaka, Y” Cobb, M., Boulton, T “Faletto, D., Rosen, ⁇ , Chan, A., Yoko, ⁇ , White, W. and et al., "Met and hepatocyte growth factor / scatter factor signal transduction in normal melanocytes and melanoma cells. ", Oncogene, 7, p.2195-2206 (1992).
  • Non-Patent Document 14 Cowin, AJ, Kallincos, ⁇ , Hatzirodos, ⁇ , Robertson, JG, Pickering, KJ, Couper, J. and Belford, DA, "Hepatocyte growth factor and macrophage— stimulating protein are upregulated during excisional wound repair in rats. ", Cell and Tissue Research, 306, p.239-250 (2001).
  • Non-special reference literature 16 Toyoda, M., Takayama, ⁇ ⁇ , Horiguchi, ⁇ ⁇ , Otsuka, ⁇ ⁇ , Fukusato, ⁇ ⁇ , Merlino, G., Takagi, H. and Mori, M., “Overexpression or hepatocyte growth factor / scatter factor promotes vascularization and granulation tissue formation in vivo. ", FEBS Letters, 509, ⁇ 95-100 (2001).
  • the present invention solves the problem of providing a drug having an excellent granulation hyperplasia and angiogenesis promoting action and effective for tissue repair, and in particular, a drug useful as an agent for preventing and healing skin ulcer.
  • human recombinant HGF is excellent in promoting granulogenesis and angiogenesis by exogenous supplementation.
  • a drug excellent in tissue repair can be provided.
  • the above-mentioned human recombinant HGF has a particularly excellent effect in preventing or treating skin ulcers caused by diabetes, venous stasis, collagen disease or burns.
  • the present invention provides
  • composition for preventing and healing skin ulcers comprising a human recombinant HGF in which five amino acid residues are deleted in the first kringle domain,
  • composition for promoting angiogenesis characterized in that the first kringle domain has a human amino acid residue lacking at least 5 amino acid residues and contains human recombinant HGF.
  • composition for promoting granulation hyperplasia characterized in that the first kringle domain has human amino acid residues that are deficient in five amino acids, and contains human recombinant HGF.
  • composition for preventing and healing skin ulcers characterized in that the first kringle domain has a gene encoding human recombinant HGF in which five amino acid residues have been deleted,
  • composition for promoting angiogenesis characterized in that the first kringle domain has a gene encoding human recombinant HGF in which five amino acid residues have been deleted,
  • composition for promoting granulation proliferation characterized in that the first kringle domain has a gene encoding human recombinant HGF in which five amino acid residues have been deleted, and
  • the wound surface is covered with a sealed wound dressing capable of absorbing exudate from the skin ulcer, keeping the skin ulcer in a moist environment, and five amino acid residues in the first kringle domain.
  • a method for treating skin ulcer which comprises placing human recombinant HGF deficient in a sealed wound dressing or between a sealed wound dressing and a wound surface. About.
  • the present invention encodes a human recombinant HGF in which five amino acid residues are deleted in the first kringle domain (hereinafter, simply referred to as "human recombinant HGF" t), or encodes the human recombinant HGF.
  • a granulation proliferation promoter and an angiogenesis promoter containing a gene Such pharmaceuticals can be widely used for tissue repair, including prevention or treatment of skin ulcers.
  • the human recombinant HGF is derived from a living body or originates from a living body-derived HGF, it is safe to administer to a living body and has few side effects.
  • FIG. 1A shows a histological image of blood vessels stained in Example (3).
  • FIG. 1B shows the blood vessel density of the human recombinant HGF administration group and the physiological saline administration group.
  • saline indicates a group administered with saline
  • HGF (10 ⁇ g) indicates a group administered with human recombinant HGF. The same applies to the following drawings.
  • FIG. 2 shows the degree of granulation tissue proliferation in a group administered with human recombinant HGF and a group administered with physiological saline.
  • FIG. 2B shows the granulation area of the human recombinant HGF administration group and the physiological saline administration group.
  • FIG. 3 shows the ulcer closure rate (healing rate) between the group administered with human recombinant HGF and the group administered with physiological saline.
  • the human recombinant HGF used in the present invention is an HGF having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, in which five amino acid residues of the first kringle domain located at positions 128 to 206 from the N-terminus are present. Lost. The five amino acid residues that have been deleted may be present continuously or may be present in two to five places, but are preferably present consecutively.
  • the human recombinant HGF used in the present invention may be an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence. preferable.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is more preferably the amino acid sequence having one or several amino acids substituted in the amino acid sequence.
  • the protein consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has HGF activity, that is, a function substantially equivalent to HGF, such as mature liver. It preferably has a growth promoting activity on cells.
  • the human recombinant HGF used in the present invention is not limited to one produced using a genetic recombination technique or the like, and may be one that exists in a living body as one of various families of HGF. .
  • Methods for isolating and purifying the human recombinant HGF of the present invention from the body include, for example, thrombin treatment of mature hepatocytes and platelets containing HGF at a relatively high concentration to obtain HGF secreted out of the platelets.
  • Examples of the method include purification using ion exchange chromatography, affinity chromatography using heparin sepharose, or reversed-phase high-performance liquid chromatography, and the like.
  • the human recombinant HGF of the present invention is isolated and purified using human tissues or cells, but as long as the isolated HGF satisfies the above conditions of the present invention, non-human mammals such as rats and guinea pigs Tissues or cells such as mice, mice, birds, egrets, pigs, sheep, horses, monkeys, etc. may be used for the isolation and purification of HGF.
  • non-human mammals such as rats and guinea pigs Tissues or cells
  • the human recombinant HGF used in the present invention may have undergone various modifications known in the art.
  • the carboxyl group at the C-terminus of the human recombinant HGF used in the present invention may be amidated, esterified or ionized. Specifically, the carboxyl group at the C-terminus (—COOH) is replaced with a carboxylate (—COO—), amide (one CONH) or ester (—COOH) is replaced with a carboxylate (—COO—), amide (one CONH) or ester (
  • the substituent R in the ester is, for example, a C alkyl such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl.
  • a C cycloalkyl group such as cyclopentyl, cyclohexyl, etc .;
  • C-aryl groups such as phenyl and ⁇ -naphthyl; for example, phenyl such as benzyl and phenethyl
  • the carboxyl group may be amidated, esterified or ionized as described above.
  • the amino group of the N-terminal methionine residue has a protecting group (for example, a C acyl group such as a C alkanoyl group such as formyl group and acetyl).
  • a protecting group for example, a C acyl group such as a C alkanoyl group such as formyl group and acetyl.
  • a daltamyl group formed by cleavage of the N-terminal side in vivo a pyroglutamic acid derivative, a substituent on the amino acid side chain (e.g., -OH, -SH, amino group, imidazole group, indole group, guadino group, etc.) are protected with appropriate protecting groups (for example, C acyl group such as C alkanoyl group such as formyl group and acetyl).
  • HGF human recombinant HGF to be used in the present invention, to which a sugar chain is bound, desirably bound sugars include fucose, galactose, mannose, N-acetyldarcosamine and the like.
  • the human recombinant HGF used in the present invention may form a pharmacologically acceptable salt.
  • the pharmacologically acceptable salt include a salt with an inorganic acid (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or a salt thereof.
  • salts with mechanical acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid).
  • the pharmacologically acceptable salt includes an inorganic base (eg, an alkali metal salt such as a sodium salt or a potassium salt, an alkaline earth salt such as a calcium salt or a magnesium salt). Salts with metal salts, aluminum salts or ammonium salts, or organic bases (eg, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine) Or ⁇ , ⁇ dibenzylethylenediamine, etc.) And the like.
  • an inorganic base eg, an alkali metal salt such as a sodium salt or a potassium salt, an alkaline earth salt such as a calcium salt or a magnesium salt.
  • Salts with metal salts, aluminum salts or ammonium salts, or organic bases eg, trimethylamine, triethylamine, pyridine, picoline, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dicyclohexylamine
  • the gene encoding human recombinant HGF used in the present invention is not particularly limited as long as it encodes the above-described human thread and recombinant HGF.
  • A It is represented by SEQ ID NO: 2.
  • B a DNA that hybridizes under stringent conditions with the DNA capable of sequence sequencing represented by SEQ ID NO: 2 and has HGF activity, that is, a function substantially equivalent to HGF
  • a DNA encoding a protein having a growth promoting activity on mature hepatocytes and the like are preferable examples.
  • the DNA that hybridizes with the DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 can be obtained, for example, by using the above-mentioned DNA as a probe, by the method of hybridization and plaque by the hybridization method. Alternatively, it means DNA obtained by using the Southern blot hybridization method or the like. Specifically, hybridization was carried out at about 65 ° C in the presence of about 0.7-1. OM sodium chloride using a filter on which colonies or plaque-derived DNA was immobilized.
  • an SSC solution with a concentration of about 0.1 to 2 times (a composition of the SSC solution with a concentration of 1% consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) at about 65 ° C DNA that can be identified by washing the filter below can be mentioned.
  • the DNA that hybridizes with the DNA having the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 is at least about 70%, preferably at least about 80%, more preferably at least about 80% with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Examples include DNA having a base sequence having a homology of 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Hybridization can be performed by a known method, for example, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001: hereinafter, Molecular Cloning). Cloning 3rd edition), etc. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the genes encoding the human recombinant HGF used in the present invention include genomic DNA and genomic DNA. Any of an NA library, a cDNA derived from the above-described cells and tissues, a cDNA library derived from the above-described cells and tissues, and a synthetic DNA may be used.
  • the vector used for the library may be any of, for example, a nocteriophage, a plasmid, a cosmid, and a phagemid.
  • a DNA encoding human recombinant HGF can also be obtained by directly amplifying by the RT-PCR method using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • RNA can be used as long as it can express the human recombinant HGF of the present invention by reverse transcriptase.
  • the RNA can also be obtained by known means.
  • the gene encoding the human recombinant HGF used in the present invention can be obtained by a known method (see “Biochemical Biophysical Research Communications, 172, 321-327 (1990)"). It is preferable to use the method described in Non-Patent Document 17.
  • the obtained gene may be subjected to a known treatment, for example, by substituting the base sequence of DNA by PCR or known method. Kits, for example, Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), etc., according to known methods such as ODA-LA PCR method, gapped duplex method, Kunkel method and the like, or a method analogous thereto.
  • ATG translation initiation codons
  • TAA translation termination codons
  • the gene encoding the human recombinant HGF of the present invention may be modified to enhance its stability in cells and, if toxic, to reduce its toxicity. .
  • modifications include, for example, J. Kawakami et al, Pharm Tech Japan, Vol. 8, p247 (1992); Vol. 8, p395 (1992); ST Crooke et al. Ed., Antisense Research and Applications, CRC. Modification by the method described in Press (1993) and the like.
  • modification with other substances other than lysanine, thymidine, guanine and cytosine can be mentioned.
  • the other substance examples include hydrophobic substances such as sugars; acids or bases; polycations such as polylysine which functions to neutralize the charge of the phosphate group skeleton; and lipids.
  • Preferred lipids to be added are those that contribute to enhancing the interaction with the cell membrane or increasing the uptake of nucleic acids.
  • cholesterol and its derivatives for example, Cholesteryl chromate or cholic acid
  • phospholipid for example, cholesterol and its derivatives (for example, Cholesteryl chromate or cholic acid) or phospholipid.
  • the other substance can be attached to the 3 ′ end or 5 ′ end of the nucleic acid, or can be attached via a base, sugar, or intramolecular nucleoside bond.
  • the modification of the gene encoding the recombinant human HGF of the present invention also includes chemical modification of the end of the gene.
  • terminal modifying group examples include a capping group specifically arranged at the 3′-end or the 5′-end of a nucleic acid, for preventing degradation by a nuclease such as exonuclease or RNase.
  • capping group examples include, but are not limited to, hydroxyl-protecting groups known in the art, including glycols such as polyethylene glycol or tetraethylene dalicol.
  • the gene encoding the human recombinant HGF of the present invention may be used as it is at the time of formulation, or may be used in a form inserted into an expression vector.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it can express the human recombinant HGF of the present invention.
  • examples include a vector in which a DNA fragment encoding the human recombinant HGF of the present invention is linked downstream of an appropriate promoter. .
  • Examples of the expression vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pCR4, pCR2.1, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (Eg, pSH19, pSH15), bacteriophage such as phage lambda, retrovirus, adeno-associated virus (AAV), adenovirus, lentivirus, vaccinia vinoles, noculo innoles, box vinores, henoreinsuinores, simple herpes Virus, lentivirus (HIV), Sendai virus, Epstein-Barr virus (EBV), vaccinia virus, poliovirus, Cymbis dinores, SV40 and other viruses, as well as pAl-11, pXTl, pRc / CMV
  • adeno-associated virus which is preferred by the virus, adenovirus, retrowinores, boxwinores, henoreinoinoresu, simple henoreinsuinooresu, lentinowinores (HIV), Sendai virus, Epstein-Barr virus (EBV), It is preferable to use vaccinia virus, poliovirus, synvis virus, SV40 and the like. Further, it is more preferable to use an adeno-associated virus (AAV) or an adenovirus. Although there are various serotypes of adenovirus, in the present invention, human adenovirus type 2 or 5 is used. It is preferred to use luz.
  • pCAGGS Gene, 108, P193-200 (1991)
  • pBK- Plasmids such as CMV, pcDNA3.1, and pZeoSV (Invitrogen, Stragene) are preferred.
  • the promoter may be any promoter as long as it is an appropriate promoter according to the host used for gene expression.
  • examples include the SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV- ⁇ promoter and the like. Among them, it is preferable to use CMV promoter, SRa promoter and the like. If the host is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ promoter or lpp promoter
  • the host is a Bacillus genus, SPOL promoter, SP02 promoter or pen p promoter is preferable, and if the host is yeast, PH
  • PGK promoter When the host is an insect cell, a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferred.
  • the expression vector has, in addition to the gene and the promoter encoding the human recombinant HGF of the present invention, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, an SV40 replication origin, and the like, if desired. Is also good.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene (methotrexe HMTX) resistance, an ampicillin resistance gene, a neomycin resistance gene (G418 resistance), and the like.
  • the target gene can be selected using a thymidine-free medium.
  • a PhoA 'signal sequence or a ⁇ signal sequence is used.
  • a host such as an amylase signal sequence or a subtilisin signal sequence is used.
  • the host is an animal cell, MF o; if the host is an animal cell, the signal sequence or SUC2 'signal sequence.
  • Interferon 'signal sequence or antibody molecule ⁇ signal sequence can be used.
  • the thus constructed expression vector containing the gene encoding the human recombinant HGF of the present invention can be further introduced into a host and used in the form of a transformant when formulating a preparation.
  • the human recombinant HGF of the present invention is produced in the cells of the transformant, in the cell membrane or extracellularly in the administered organism, and the human recombinant HGF of the present invention is effectively used in the living body. Can be administered.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, Bifidobacteria, lactic acid bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like are used.
  • Escherichia coli include Escherichia coli K12-DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)).
  • Bacillus genus examples include Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983), Journal of
  • Examples of the bifidobacteria include Bindobactenum longum, Bifidobacterium bifidum, Bindobactenum breve and the like.
  • Examples of the lactic acid bacterium include Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc, and Heidiococcus rot.
  • Examples of yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris and the like.
  • insect cells for example, when the virus is AcNPV, a cell line derived from a larva of night roth moth (Spodoptera frugiperda cell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, High derived from egg of Trichoplusia ni Five TM cells, cells derived from Mamestrabrassicae or cells derived from Estigmena acrea.
  • Sf cells Bombyx mori N (BmN cells) and the like can be mentioned.
  • Sf cells include For example, Sf9 cells (ATCC CRL1711), Sf21 cells (above, Vaughn, J ⁇ . Et. Al, In Vivo, 13, p213-217 (1977)) and the like are used.
  • insects include silkworm larvae (Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)).
  • animal cells examples include monkey cell COS-7, Vero, Chinese nomster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO cell), and dhfr gene-deficient Chinese hamster cell CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr—) cell).
  • CHO cell Chinese nomster cell CHO
  • dhfr— Chinese hamster cell CHO
  • Mouse L cells mouse AtT-20, mouse myeoma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Transformation of a bacterium belonging to the genus Escherichia can be performed, for example, according to the method described in "Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69, p2110 (1972)", “Gene, 17, pl07 (1982)” or the like. it can. Transformation of a bacterium of the genus Batinoles can be performed, for example, according to the method described in "Molecular & General Genetics, 168, pill (1979)”. Transformation of yeast is performed according to the method described in, for example, “Methods in Enzymology, Vol. 194, pl82-187 (1991)", “Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pl929 (1978)” and the like.
  • Insect cells or insects can be transformed according to the method described in, for example, "Bio / Technology, 6, p47_55 (1988)". Transformation of animal cells is described, for example, in “Cell Science Separate Volume 8, New Cell Engineering Experimental Protocol, p263-267 (1995) (published by Shujunsha)”, ⁇ Virology, Vol. 52, p456 (1973). Can be performed according to the method described in
  • a large amount of a raw material for the drug of the present invention can be obtained.
  • a liquid medium is suitable as a medium to be used for cultivation.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch and sucrose
  • examples of the nitrogen source include ammom-pharm salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, and soybean meal.
  • inorganic or organic substances such as potato extract may be mentioned, and examples of inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate and magnesium chloride. Furthermore, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • a medium for culturing the genus Escherichia for example, glucose and casamino acid are used. (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, p431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)).
  • a drug such as 3
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 324 hours, and if necessary, aeration and stirring can be performed.
  • culturing is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and aeration and stirring may be added as necessary.
  • a transformant in which the host is yeast
  • a medium for example, Burkholder minimum medium (Bostian, KL et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p4505 (1980)) or 0.5 % Casamino acid, SD medium (Bitter, GA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p5330 (1984)).
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 5-8.
  • Culture is usually performed at about 20 ° C-35 ° C for about 24-72 hours, adding aeration and / or agitation as necessary.
  • the medium used is Grace's
  • Insect Medium (Grace, T.C.C., Nature, 195, p788 (1962)) to which immobilized additive such as 10% serum or the like is appropriately added is used.
  • the ⁇ of the medium is adjusted to about 6.2-6.4.
  • Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the medium When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum (Science, 122, p501 (1952)) or a DMEM medium (Virology, 8 , p396 (1959)), RPMI 1640 medium (The Journal of the American Medical Association, 199, p519 (1967)), 199 medium (Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, pi (1950)) and the like are used. .
  • the pH is about 6-8.
  • the cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration and stirring are added.
  • a gene encoding the human recombinant HGF of the present invention or an expression vector having the gene at the time of formulation is prepared using ribosome, microcapsule, microsphere, cytofectin, DNA-protein It may be used in the form of being contained in an artificial vector such as a complex or a biopolymer. Especially, it is preferable to encapsulate in ribosome or microcapsule.
  • the ribosome is a closed vesicle made of a lipid bilayer membrane having an aqueous layer inside, and it is known that the structure of the lipid bilayer membrane is very similar to that of a biological membrane. You.
  • Examples of the phospholipid used for producing liposome include acidic phosphatides such as phosphatidylcholine such as lecithin and lysolecithin, phosphatidylserine and phosphatidylglycerol, and sphingophospholipids such as phosphatidylethanolamine and sphingomyelin. Can be Also, cholesterol and the like can be added. Ribosomes can be produced according to a method known per se. The ribosome includes membrane fusion ribosome, HVJ-membrane fusion ribosome (Kaneda. Y et al., Biol. Chem, 264, pl2126-12129 (1989), Kato.
  • Microcapsules are film-coated particles, such as particles coated with a film-forming polymer derivative, a hydrophobic plasticizer, a surfactant, or a coating material consisting of a mixture of Z and a lubricant nitrogen-containing polymer. Things.
  • the preventive / healing agent for skin ulcer of the present invention an angiogenesis promoting agent and a granulation hyperplasia promoting agent (hereinafter collectively referred to as "agent of the present invention") are the aforementioned human recombinant HGF of the present invention or The gene encoding the human recombinant HGF of the present invention is contained as an active ingredient.
  • the agent of the present invention includes (a) a preventive / healing agent for skin ulcer, an angiogenesis promoter or a granulation hyperplasia promoter containing an expression vector having a gene encoding the human recombinant HGF of the present invention;
  • the present invention also includes a skin ulcer prevention / healing agent, an angiogenesis promoter or a granulation proliferation promoter containing ribosomes or microcapsules containing an expression vector having a gene encoding the human recombinant HGF of the present invention or a gene encoding the human recombinant HGF of the present invention.
  • the medicament of the present invention comprises the above-mentioned active ingredient for a preparation usually used in the art. It is manufactured by formulating with an additive according to a conventional method.
  • the dosage form of the drug of the present invention is not particularly limited.
  • the tablets may be coated tablets, such as sugar-coated tablets, gelatin-coated tablets, enteric-coated tablets or film-coated tablets, or double tablets or multilayer tablets.
  • the above-mentioned pharmaceutical preparations can be produced according to a method known per se or commonly used in the field of pharmaceuticals.
  • excipients for the production of solid preparations such as tablets, pills, capsules, powders or granules
  • excipients include sugars such as lactose, sucrose and glucose, starches such as starch, crystalline cellulose and the like.
  • binder include saccharides or sugar alcohols such as ducose and maltitol, polysaccharides such as starch, natural polymers such as gelatin, cellulose derivatives such as methylcellulose and carboxymethylcellulose, and synthetic polymers such as polybutylpyrrolidone. And the like.
  • Disintegrators include, for example, starch, sodium alginate, corn starch, hydroxypropyl pill starch, polybutylpyrrolidone or croscarmellose sodium.
  • examples of the lubricant include stearate, talc, powdered boric acid, polyethylene dalicol and the like.
  • examples of the surfactant include a fatty acid ester and the like.
  • the lipophilic base, water-soluble base or emulsion base may contain the above-mentioned active ingredient and, if desired, for example, a local anesthetic, an antihistamine, Contains topical astringents, sulfa drugs, antibiotics, anti-acne agents, surfactants, vitamins, herbal extracts, bile acids, preservatives, excipients, absorption enhancers, or supplemental carohydrates such as amino acids Thereby, the drug of the present invention can be produced.
  • the medicament of the present invention has a dosage form of an injection
  • the above-mentioned active ingredient and, if desired, a solubilizing agent, a buffering agent or a soothing agent are dissolved in a solvent such as a water-soluble solvent or a water-insoluble solvent.
  • the drug of the present invention can be produced by adding a drug additive such as a drug additive.
  • the injection is preferably sterile and isotonic with blood and blood, and may contain salt, glucose or glycerin or the like to make it isotonic with blood.
  • coloring agents, preservatives, flavors, flavoring agents, sweetening agents and the like may be contained in the pharmaceutical preparation.
  • an oily base such as petrolatum, liquid paraffin, silicon or vegetable oil
  • an emulsion base such as hydrophilic petrolatum or purified lanolin
  • a base such as a water-soluble base such as an emulsifier such as an anionic or nonionic surfactant or a preservative such as a preservative such as paraoxybenzoic acid esters, if desired.
  • the agent of the present invention can be produced by incorporating the compound.
  • a gelling agent eg, carboxyvinyl polymer, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, methylcellulose, ethylcellulose, carboxymethylcellulose
  • a gelling agent eg, carboxyvinyl polymer, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, methylcellulose, ethylcellulose, carboxymethylcellulose
  • pharmaceutical additives such as lower alcohols, neutralizers, surfactants or absorption enhancers.
  • the drug of the present invention is in the form of a cream, for example, higher fatty acid esters (eg, myristic acid ester, palmitic acid ester, getyl sebacate, hexyl laurate, cetyl isooctanoate), lower alcohols ( For example, ethanol, isopropanol, etc.), carbohydrates (eg, liquid paraffin, squalane, etc.), polyhydric alcohols (eg, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, etc.) or higher alcohols (eg, 2-xyldecanol, cetanol, 2-ota)
  • the agent of the present invention can be prepared by adding a base containing tildodecanol and the like to the above-mentioned active ingredient and, if desired, a pharmaceutical additive such as an emulsifier, a preservative, an absorption enhancer or an antifoggant. Can be manufactured.
  • the above-mentioned cream may be mixed with a gelling agent and a neutralizing agent.
  • the solvent contains the above-mentioned active ingredient and, if desired, for example, a buffer, a stabilizer, a preservative, a pH adjuster, a solvent, a solubilizing agent.
  • the agent of the present invention can be produced by adding a pharmaceutical additive such as a flavoring agent, a gelling agent, a flavoring agent or a cooling agent.
  • the solvent examples include glycerin, propylene glycol, ethanol, isopropanol, butylene glycolone, water, sorbitol, mannitol, xylitol, glucose, epsilon aminocaproic acid, glycine, glutamate, sodium hyaluronate, and polyethylene.
  • liquid preparation for external use examples include liquid preparations for external use such as washing, pouring, compress, inhalation, spraying, enema, application, medicine bath, wiping, disinfection, eye drops, eye wash, ear drops or nose drops.
  • An aerosol can be produced by using the external preparation of the present invention together with a normal propellant.
  • the propellant include dimethyl ether, liquefaction oil oil gas, N gas, nitrous oxide gas, CO gas, CFC alternative gas, etc. which are usually used in aerosols.
  • Compressed air can also be used without using a propellant. Also, use a mixture of these.
  • the administration method may be appropriately selected from various administration methods such as oral administration, parenteral administration and topical administration according to the dosage form.
  • the drug of the present invention can be implanted subcutaneously or intramuscularly.
  • the gene encoding the human recombinant HGF of the present invention can be administered directly to a living body without being formulated as described above, or as it is or together with an auxiliary agent for promoting uptake.
  • a powerful administration method may be performed according to a known method.For example, an in vivo method in which DNA is directly introduced into the body, or a certain kind of cell of a human being to be administered is taken out of the body and human recombination is performed with the cell.
  • There is an ex vivo method that introduces the gene encoding HGF and returns the transformed cells to the body Nikkei Science, April, 20-45 (1994), Monthly Pharmaceutical Affairs, 36, 23-48 (1994), experiment Medical extra number, 12, 15 (1994)).
  • the human group of the present invention As a method for introducing a gene encoding a recombinant HGF into cells, as described above, an expression vector such as an adeno-associated virus, an adenovirus vector, or a retrovirus vector is used to contain a gene, and the expression vector or the like is transferred to a cell. Transfection, electoral poration, microinjection, transduction, cell fusion, DEAE dextran, calcium phosphate precipitation, method of introducing DNA into cells with carrier (metal particles, etc.) using a gene gun, etc. (Wu et al. J. Biol. Chem. 267, 963-967 (1992), Wu et al. J. Biol. Chem.
  • ribosome method When a ribosome or the like is used, the ribosome method, the HVJ-ribosome method, the cationic ribosome method, the ribofectin method, the ribofectamine method and the like can be mentioned. Among them, a gene transfer method using an adenovirus vector or a retrovirus vector is desirable from the viewpoint of transfer efficiency.
  • angiogenesis promoter and granulation hyperplasia promoter of the present invention are used as external preparations, they are preferably used together with a hermetically sealed wound dressing.
  • the sealed wound dressing is preferably a dressing that provides a moist environment at the wound site and allows oxygen and water vapor to pass through without permeating liquids and bacteria.
  • a sealed wound dressing material examples include a colloid dressing material for hides (eg, Duoactive (Convatec), Comfeel (Coloplast), Tegasoap (3M), Absocure (Nitto Medical)), kitchen dressing Wood, alginate dressing materials (eg, cultstat (Convatec), Sorbusan (Alkea), Argoderm (Medicone), Krapio AG (Kuraray)), hydrogel dressing materials (eg, Jerry Palm (Bamboo Tiger), New Jill (Johnson & Johnson) , Intrasite (Smith & Nephew), Dara-UGEL (Convatec), Clearsite (Nippon SIGMAX)), polyurethane dressing (eg, Tegaderm (3M), Opsitund (Smith & Nephew), IV3000 (Smith & Nepnew) ), Bioclusive (Johnson & Johnson)), noisy mouth polymer dressing [ .
  • a colloid dressing material for hides eg, Duoactive (Convatec), Com
  • Hyde port fiber dressings or polyurethane foams EXAMPLE may preferably be mentioned.
  • These dressings can be used alone or in combination of two or more.
  • the dressing material may be in the form of a pressure-sensitive adhesive sheet for sticking to the skin, a film shape, or the like.
  • the form for using the external preparation of the present invention together with the hermetically sealed wound dressing material may be such that the external preparation of the present invention may be contained in the hermetically sealed wound dressing material, or the external preparation of the present invention may be applied.
  • the wound site may be covered with a sealed wound dressing material later, or after the damaged site is covered with the sealed wound dressing material, the external preparation of the present invention may be injected with a syringe, for example. You can.
  • the external preparation of the present invention is contained in the hermetically sealed wound dressing, it is usually preferable to include the external preparation of the present invention in the absorbent layer (for example, a hydrogel layer) of the hermetically sealed wound dressing.
  • human recombinant HGF is preferably added in an amount of 0.01% by mass to 15% by mass, preferably 0.1% by mass to 3% by mass, based on the dry weight of the absorbent layer.
  • the release level of the human recombinant HGF can be increased, for example, as the exudate wets the absorbent layer.
  • the external preparation of the present invention does not leak outside.
  • the wound surface is exposed to the outside air by injecting the external preparation of the present invention into the wound surface or the absorbent layer of the wound dressing using, for example, a syringe. And the external preparation of the present invention can be administered.
  • the dose and frequency of administration of the drug of the present invention are not particularly limited, and are appropriately selected according to various conditions such as the type of the disease state to be treated, the age and weight of the patient, the symptoms and the severity of the disease. It is possible to do.
  • the dosage in the case of intravenous administration, is about 250-1000 ⁇ g / Kg /, preferably about 300-800 ⁇ g / Kg /, and particularly preferably about 300-550 gZKgZ as human recombinant HGF.
  • the dose of the active ingredient is about 0.001 to 30 mg, preferably about 0.01 to 3 mg.
  • the agent of the present invention can be used as an angiogenesis promoter or a granulation proliferation promoter.
  • angiogenesis promoter or a granulation proliferation promoter.
  • peptic ulcer treatment or granulation growth-promoting effects
  • anticancer postoperative suturing of skin, corneal surgery, etc.
  • cosmetics can also be used as cosmetics.
  • the enzyme-antibody reaction was detected in a substrate solution containing diaminobenzidine and hydrogen peroxide, and after the detection, cell nuclei were stained with matoxylin. Vascular density was quantified by microscopic observation of sections (100-fold visual field).
  • tissue sections When measuring granulation tissue, hematoxylin and eosin-stained tissue sections were used. An image of the tissue section prepared so as to be perpendicular to the surface of the ulcer was taken into a combi- ter, and the granulation tissue was traced. Then, the area of the granulation tissue was quantified by NIH image analysis software.
  • FIG. 1A shows a tissue image of the stained blood vessels.
  • control with respect to the blood vessel density in (saline administered group) is 33.
  • Density was enhanced to 59.6 ⁇ 4.5Zmm 2 (FIG. 1B). Therefore, it was revealed that human recombinant HGF promotes angiogenesis.
  • FIG. 2A The effect of human recombinant HGF on the proliferation of granulation tissue was examined.
  • Granulation tissue growth was measured by image analysis using tissue sections 7 days after the skin ulcer model was created .
  • examination of the tissue after preparation of the skin ulcer model showed that granulation tissue was increased by administration of human recombinant HGF (Fig. 2A).
  • the area of the granulation tissue was 1.30 ⁇ 0.15 mm 2 in the control (saline-administered saline group), whereas that of the recombinant human HGF was in a volume-dependent manner.
  • Administration of 10 ⁇ gZ ulcer on day ⁇ ⁇ administration of human recombinant HGF increased the area of granulation tissue to 2.3 times that of control, indicating that human recombinant HGF promoted granulation tissue proliferation (Figure 2B).
  • Human recombinant HGF (10 ⁇ gZ ulcer ⁇ day) was administered to the skin ulcer site for 5 consecutive days. As a result, a dose-dependent promotion of closure (healing) of the ulcer site by human recombinant HGF was observed 2 days later. Ten days after preparation of the ulcer model, the ulcer closure rate (healing rate) of the control skin to which saline was administered was 41.1 ⁇ 6.8%. In contrast, administration of human recombinant HGF on ⁇ / z gZ ulcer Z day promoted the ulcer closure rate (healing rate) to 85.0 ⁇ 4.0%.

Abstract

　第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有する血管新生促進用組成物、肉芽増生促進用組成物および皮膚潰瘍予防治癒用組成物を提供する。本発明の組成物は、肉芽増生および血管新生を促進し組織修復に有効な医薬品、なかでも皮膚潰瘍予防治癒剤として有用である。

Description

明 細 書
ヒト組換え HGFを含有する皮膚潰瘍予防治癒剤
技術分野
[0001] 本発明は、ヒト組換え HGFまたはヒト組換え HGFをコードする遺伝子を含有する皮 膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤および肉芽増生促進剤に関する。
背景技術
[0002] 種々の細胞増殖因子は皮膚において細胞の増殖や表皮細胞の遊走、またはアポ トーシス (細胞死)あるいは細胞外マトリックス産生などを制御することによって皮膚の 創傷治癒に関与している。またある種の増殖因子の投与によって正常動物における 皮膚の創傷治癒が促進されること、ある 、は皮膚の創傷治癒能が低下して 、る糖尿 病患者や、ステロイド投与あるいは栄養失調のモデル動物において増殖因子が皮膚 の創傷治癒能の低下を代償することが報告されている (非特許文献 1、非特許文献 2 )。例えば糖尿病マウスにおいては正常のマウスに比べ皮膚創傷治癒は遅延するが 、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor ;bFGF)、血小板由来 増殖因子（platelet- derived growth factor)、インスリン様増殖因子 I (insulin- like growth factor— I)またはトフンスフォ ~~ミング増殖因子 a (transforming growth factor- a )の局所投与が前記皮膚創傷治癒の遅延を抑制することが報告されて 、る (非特許文献 4一 6)。さらに、組換え bFGFは皮膚潰瘍の治療薬として利用されてい る。
[0003] 一方、成熟肝細胞に対する増殖促進因子として発見された HGF (hepatocyte growth factor ;肝細胞増殖因子）は各種傷害に対して組織の再生ならびに保護を担 う生理機能を有して 、る (非特許文献 7— 10)。皮膚にお!、ても HGFが表皮ケラチノ サイト (角化細胞)またはメラノサイトの増殖や遊走を促進することが明らかにされ、 H GFが皮膚の生理機能や創傷治癒に関与することが示唆された (非特許文献 11一 1 3)。本発明者らは、さらに皮膚の生理機能や創傷治癒に対する HGFの役割につい て検討を重ね、組換え HGFを有効成分とする創傷治療または皮膚潰瘍治療剤を開 発し、特許を得ている（特許文献 1)。その後の研究でも、実験動物において HGFが 皮膚創傷治癒に関与することが支持されている。例えば、 HGFならびに c MetZH GFレセプターの発現は皮膚創傷に応じて増加する (非特許文献 14、非特許文献 1 5)。 HGFを過剰発現するトランスジエニックマウスにぉ 、て皮膚創傷後の血管新生 や肉芽組織の形成の加速が見られる (非特許文献 16)。一方、皮膚創傷治癒モデル において抗 HGF抗体の投与によって内因性 HGFの作用をブロックすると表皮の再 生や血管新生が抑制され治癒が遅延する (非特許文献 15)。
しかし、上記文献には、第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損し て 、るヒト組換え HGFにつ ヽては記載も示唆もされて！/ヽな 、。
第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF は公知のタンパク質であるが (非特許文献 17)、非特許文献 17には肉芽増生および 血管新生の促進作用につ 、て記載されて 、な 、し、示唆さえされて 、な 、。
また、内因性 HGFが肉芽増生および血管新生に関与することは記載されているが (非特許文献 15、 16)、 HGFを投与した場合力かる外因性 HGFが同一の現象を引 き起こす力否かにっ 、ては全く検討されて 、な 、うえに、第一クリングルドメインにお V、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGFにつ 、て記載も示唆もされて いない。
特許文献 1：特許第 3200609号公報
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発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明は、優れた肉芽増生および血管新生促進作用を有し組織修復に有効な医 薬品、なかでも皮膚潰瘍予防治癒剤として有用な医薬品を提供することを目的とする 課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、前記特許文献 1に記載の発明につ ヽてさらに鋭意研究を重ねた結 果、 HGFのなかでも第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損してい るヒト組換え HGFが外因的補充によって肉芽増生および血管新生を促進させる作用 に優れていることを知見した。前記ヒト組換え HGFの力かる作用を利用すれば、広く 組織修復に優れた医薬品を提供することができる。なかでも、前記ヒト組換え HGFは 、糖尿病、静脈うっ滞、膠原病または熱傷などに起因する皮膚潰瘍の予防または治 療に特に優れた効果を奏することを知見した。
さらに、本発明者らは検討を重ねて、本発明を完成した。
[0009] すなわち、本発明は、
(1) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFを含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物、
(2) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFを含有することを特徴とする血管新生促進用組成物、
(3) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFを含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物、
(4) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFが次の 、ずれかである前記（1)一 (3)の 、ずれかに記載の組成物；
(a)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(b)配列表の配列番号 1において、 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたアミノ酸配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質、
に関する。
[0010] また、本発明は
(5) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFをコードする遺伝子を含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物、
(6) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFをコードする遺伝子を含有することを特徴とする血管新生促進用組成物、
(7) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFをコードする遺伝子を含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物、
(8) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFをコードする遺伝子力 次のいずれかの DNA力もなる遺伝子である、前記（5)— (7)の 、ずれかに記載の組成物；
(a)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNA； (b)配列表の配列番号 2において、 1乃至数個の塩基が欠失、置換または付加され た塩基配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列から なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF活性を有するタン パク質をコードする塩基配列力もなる DNA;または
(d)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと少なくとも 70%以上の 相同性を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる DN A、
に関する。
また、本発明は、
(9) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFを哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法、
(10) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFを哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法、
(11) 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え H GFを哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法、
(12) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFが次の!/、ずれかである前記（9)一 10の!、ずれかに記載の方法；
(a)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(b)配列表の配列番号 1において、 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたアミノ酸配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質、
(13) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFをコードする遺伝子を哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法、
(14) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFを哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法、
(15) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFを哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法、
(16) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFをコードする遺伝子力 次のいずれかの DNA力もなる遺伝子である、前記（13) 一（ 15)の 、ずれかに記載の方法；
(a)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNA；
(b)配列表の配列番号 2において、 1乃至数個の塩基が欠失、置換または付加され た塩基配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列から なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF活性を有するタン パク質をコードする塩基配列力もなる DNA;または
(d)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと少なくとも 70%以上の 相同性を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる DN A、
に関する。
また、本発明は、
(17) 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインに お 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト糸且換え HGFの使用、
(18) 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインに お 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト糸且換え HGFの使用、
(19) 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインに お 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト糸且換え HGFの使用、
(20) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFが次の 、ずれかである前記（ 17)—（ 19)の 、ずれかに記載の使用；
(a)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(b)配列表の配列番号 1において、 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたアミノ酸配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質、
(21) 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインに お 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGFをコードする遺伝子の使用
(22) 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインに お 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGFをコードする遺伝子の使用
(23) 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインに お 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGFをコードする遺伝子の使用
(24) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFをコードする遺伝子力 次のいずれかの DNA力もなる遺伝子である、前記（21) 一 (23)の 、ずれかに記載の使用；
(a)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNA；
(b)配列表の配列番号 2において、 1乃至数個の塩基が欠失、置換または付加され た塩基配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列から なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF活性を有するタン パク質をコードする塩基配列力もなる DNA;または
(d)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと少なくとも 70%以上の 相同性を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる DN A、
に関する。
さらに、本発明は、
(25) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFを含有する密封型創傷被覆材、
(26) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H GFを含有する組成物と、皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆 材とを有することを特徴とする皮膚潰瘍治療用キット、
(27) 皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆材で創傷面を覆 ヽ 、前記皮膚潰瘍部分を湿潤環境下に保ち、第一クリングルドメインにおいて 5個のァ ミノ酸残基が欠損しているヒト組換え HGFを、密封型創傷被覆材中または、密封型 創傷被覆材と創傷面の間に置くことを特徴とする皮膚潰瘍の治療方法、 に関する。
発明の効果
[0014] 本発明は、第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組 換え HGF (以下、単に「ヒト組換え HGF」 t 、う）または前記ヒト組換え HGFをコード する遺伝子を含有する肉芽増生促進剤および血管新生促進剤を提供する。かかる 医薬品は、皮膚潰瘍の予防または治療をはじめとして広く組織修復に利用すること ができる。さらに、前記ヒト組換え HGFは生体由来のものまたは生体由来の HGFを 起源とするものであることから、生体に投与しても安全であり副作用が少ない。
また、上記医薬品は、密封型創傷被覆材と共に使用することにより、皮膚潰瘍部分 を湿潤環境下に保つと共にヒト組換え HGFが密封状態で皮膚潰瘍面で接触できる ため、組織修復の促進をは力ることができる。
図面の簡単な説明
[0015] [図 1]図 1 Aは実施例（3)において血管を染色した組織像を示す。図 1Bはヒト組換え HGF投与群と生理食塩水投与群の血管密度を示す。図中、「生理食塩水」は生理 食塩水投与群を示し、「HGF (10 μ g)」とはヒト組換え HGF投与群を示す。以下の 図面も同様である。
[図 2]図 2Aは、ヒト組換え HGF投与群と生理食塩水投与群における肉芽組織の増 生の程度を示す。図 2Bはヒト組換え HGF投与群と生理食塩水投与群の肉芽面積を 示す。
[図 3]ヒト組換え HGF投与群と生理食塩水投与群の潰瘍閉鎖率 (治癒率)を示す。 発明を実施するための最良の形態
[0016] 本発明で用いるヒト組換え HGFは、配列番号 3で示されるアミノ酸配列を有する H GFにおいて、 N末端から 128— 206番目に位置する第一クリングルドメインのうち 5 個のアミノ酸残基が欠損して 、る。欠損して ヽる 5個のアミノ酸残基は連続して存在し ていてもよいし、 2— 5力所に分かれて存在していてもよいが、連続して存在している 方が好ましい。本発明で用いるヒト組換え HGFとしては、配列番号 1で示されるァミノ 酸配列、または当該アミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または 付加されているアミノ酸配列カゝらなることが好ましい。なかでも、配列番号 1で示される アミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において 1乃至数個のアミノ酸が置換されてい るアミノ酸配列力もなることがより好ましぐ配列番号 1で示されるアミノ酸配列力もなる ことが特に好ましい。なお、配列番号 1で示されるアミノ酸配列において 1乃至数個の アミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなるタンパク質は、 HGF 活性、すなわち HGFと実質的に同質の機能、例えば成熟肝細胞に対する増殖促進 活性を有することが好まし 、。
[0017] 本発明で用いるヒト組換え HGFとしては、遺伝子組み換え技術等を用いて生産さ れたものに限定されず、 HGFの多様なファミリーの一種として生体内に存在するもの であってもよい。
遺伝子組み換え技術等を用いて本発明に用いるヒト組換え HGFを生産する方法と しては公知の方法を用いてよく、例えば「Biochemical Biophysical Research
Communications, 172, 321-327 (1990)」（非特許文献 17)に記載されている方法が好 適である。
生体内から本発明のヒト組換え HGFを単離 ·精製する方法としては、例えば比較的 高濃度に HGFを含む成熟肝細胞や血小板をトロンビン処理し、血小板外へ分泌さ れる HGFを取得後、イオン交換クロマトグラフィー、へパリンセファロースによるァフィ 二ティクロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィー等を用いて精製する 方法等が挙げられる。通常はヒトの組織または細胞を用いて本発明のヒト組換え HG Fを単離'精製するが、単離される HGFが本発明の上記条件を満たす限り、ヒト以外 の哺乳動物、例えばラット、モルモット、マウス、 -ヮトリ、ゥサギ、ブタ、ヒッジ、ゥシ、 サル等の組織または細胞を HGFの単離 ·精製のために用いてもょ 、。
[0018] 本発明で用いられるヒト組換え HGFは、当該技術分野で公知の種々の修飾を受け ていてもよい。
例えば、本発明で用いられるヒト組換え HGFの C末端のカルボキシル基は、アミド ィ匕、エステルイ匕またはイオンィ匕されていてもよい。具体的には、 C末端のカルボキシ ル基 (― COOH)がカルボキシレート（― COO— )、アミド (一 CONH )またはエステル（
2
-COOR)に置換されていてもよい。ここでエステルにおける置換基 Rとしては、例え ばメチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピルもしくは n—ブチルなどの C アルキル
1-6 基；例えばシクロペンチル、シクロへキシルなどの C シクロアルキル基；例えばフエ
3-8
-ル、 α ナフチルなどの C ァリール基；例えば、ベンジル、フエネチルなどのフエ
6-12
-ルー C アルキル基もしくは a ナフチルメチルなどの a ナフチルー C アルキル
1-2 1-2 基などの C ァラルキル基；ビバロイルォキシメチル基などが挙げられる。さらに、本
7-14
発明で用いられるヒト組換え HGF力 末端以外にカルボキシル基を有して 、る場合 、上記と同様にカルボキシル基がアミド化、エステルイ匕またはイオンィ匕されていてもよ い。
[0019] 本発明に用いられるヒト組換え HGFとしては、 N末端のメチォニン残基のァミノ基が 保護基（例えば、ホルミル基、ァセチルなどの C アルカノィル基などの C ァシル
2-6 1-6 基など)で保護されて ヽるもの、 N末端側が生体内で切断され生成したダルタミル基 がピログルタミン酸ィ匕したもの、アミノ酸側鎖上の置換基 (例えば、 -OH、 -SH、アミ ノ基、イミダゾール基、インドール基、グァ -ジノ基など）が適当な保護基 (例えば、ホ ルミル基、ァセチルなどの C アルカノィル基などの C ァシル基など）で保護されて
2-6 1-6
V、るもの、あるいは糖鎖が結合した 、わゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども 含まれる。なかでも、本発明に用いられるヒト組換え HGFとしては糖鎖が結合してい るものが望ましぐ結合する糖としてはフコース、ガラクトース、マンノース、 N ァセチ ルダルコサミンなどが挙げられる。
[0020] 本発明に用いられるヒト組換え HGFは薬理学的に許容される塩を形成して ヽても よい。本発明のヒト組換え HGFが塩基性を示す場合、前記薬理学的に許容される塩 としては、例えば無機酸 (例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、または有 機酸 (例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、 クェン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩 などが挙げられる。本発明のヒト組換え HGFが酸性を示す場合、前記薬理学的に許 容される塩としては、無機塩基 (例えばナトリウム塩もしくはカリウム塩などのアルカリ 金属塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニゥ ム塩またはアンモ-ゥム塩など）との塩、または有機塩基 (例えばトリメチルァミン、トリ ェチルァミン、ピリジン、ピコリン、エタノールァミン、ジエタノールァミン、トリエタノール ァミン、ジシクロへキシルァミンもしくは Ν,Νしジベンジルエチレンジァミンなど）との 塩などが挙げられる。
[0021] 本発明で用いられるヒト組換え HGFをコードする遺伝子としては、上述してきたヒト 糸且換え HGFをコードする遺伝子であれば特に限定されな 、が、 (a)配列番号 2で表 わされる塩基配列力 なる DNA、または (b)配列番号 2で表わされる塩基配列力 な る DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAであって、 HGF活性、 すなわち HGFと実質的に同質の機能、例えば成熟肝細胞に対する増殖促進活性 等を有するタンパク質をコードする DNA等が好適な例として挙げられる。本発明では 、配列番号 2で表わされる塩基配列を含むまたは力 なる DNAを用いることが特に 好ましい。
[0022] 配列番号 2で表わされる塩基配列からなる DNAとハイブリダィズする DNAとは、例 えば上記 DNAをプローブとして、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイ ブリダィゼーシヨン法あるいはサザンブロットハイブリダィゼーシヨン法等を用いること により得られる DNAを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来の DN Aを固定化したフィルターを用いて、約 0. 7-1. OM程度の塩化ナトリウム存在下、 約 65°C程度でハイブリダィゼーシヨンを行った後、約 0. 1— 2倍程度の濃度の SSC 溶液（1倍濃度の SSC溶液の組成は、 150mM塩ィ匕ナトリウム、 15mMクェン酸ナト リウムよりなる）を用いて約 65°C程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定 できる DNAを挙げることができる。
上記の配列番号 2で表される塩基配列力 なる DNAとハイブリダィズする DNAとし て具体的には、配列番号 2で表わされる塩基配列と約 70%以上、好ましくは約 80% 以上、より好ましくは約 90%以上、最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩 基配列を有する DNA等が挙げられる。ハイブリダィゼーシヨンは、公知の方法、例え ばモレキュラー 'クロー-ング (Molecular Cloning, A laboratory Manual, Third Edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001 :以下、モレキュフ 一'クロー-ング第 3版と略す）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販 のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことが できる。
[0023] 本発明で用いられるヒト組換え HGFをコードする遺伝子は、ゲノム DNA、ゲノム D NAライブラリー、上記した細胞'組織由来の cDNA、上記した細胞'組織由来の cD NAライブラリー、合成 DNAのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、 ノ クテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また 、上記した細胞 ·組織より totalRNAまたは mRNA画分を調製したものを用 、て直接 RT— PCR法によって増幅することによりヒト組換え HGFをコードする DNAを得ること もできる。また、 RNAも、逆転写酵素により本発明のヒト組換え HGFを発現すること ができるものであれば用いることができる。該 RNAも公知の手段により得ることができ る。
[0024] 本発明で用いられるヒト組換え HGFをコードする遺伝子は公知の方法により得るこ と力 （？さ、 f列 ば目 ij じ「Biochemical Biophysical Research Communications, 172, 321-327 (1990)」 (非特許文献 17)に記載されている方法を用いることが好ましい。さら に、得られた遺伝子に対して公知の処理を施してもよい。例えば、 DNAの塩基配列 の置換は、 PCRや公知のキット、例えば、 Mutan™— super Express Km (宝酒造）、 Mutan™— K (宝酒造）等を用いて、 ODA— LA PCR法、 gapped duplex法、 Kunkel法等 の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。また、制限酵 素で消化したり、リンカ一を付加したりすることもできる。さらに、翻訳開始コドン (AT G)や翻訳終止コドン (TAA、 TGAまたは TAG)を適当な合成 DNAアダプターを用 いて付加することもできる。
[0025] 本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子は、細胞内でのその安定性を高める ため、また、もし毒性があるならその毒性をより小さなものにするために修飾されてい てもよい。このような修飾には、例えば J. Kawakami et al, Pharm Tech Japan, Vol.8, p247 (1992)； Vol.8, p395 (1992)； S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press (1993)等に記載された方法による修飾が挙げられる。さらに 、了ザニン、チミジン、グァニンおよびシトシン以外の他の物質の付カ卩による修飾も挙 げられる。前記他の物質としては、糖;酸または塩基;リン酸基骨格の電荷を中和する ように働くポリリジンのようなポリカチオン体;脂質などの疎水性のものが挙げられる。 付加するに好ましい脂質としては、細胞膜との相互作用の向上または核酸の取込み の増大に寄与するものが好ましぐ具体的にはコレステロールやその誘導体 (例えば コレステリルクロ口ホルメートまたはコール酸等）またはホスホリピドなどが挙げられる。 前記他の物質は、核酸の 3'末端あるいは 5'末端に付着させることもできるし、塩基、 糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることもできる。また、本発明のヒト組換 え HGFをコードする遺伝子の修飾として、遺伝子の末端の化学修飾も挙げられる。 末端の修飾基としては、核酸の 3 '末端あるいは 5 '末端に特異的に配置されたキヤッ プ用の基で、ェキソヌクレアーゼまたは RNaseなどのヌクレアーゼによる分解を阻止 するためのものが挙げられる。前記キャップ用の基としては、ポリエチレングリコール またはテトラエチレンダリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた 水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。
[0026] 本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子は製剤化する際にそのまま用いてもよ いが、発現ベクターに挿入した形態で用いてもよい。前記発現ベクターは本発明のヒ ト組換え HGFを発現することができればよぐ例えば本発明のヒト組換え HGFをコー ドする DNA断片が適当なプロモーターの下流に連結されているベクターなどが挙げ られる。
[0027] 前記発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、 pCR4、 pCR2. 1、 pBR3 22、 pBR325、 pUC12、 pUC13)、枯草菌由来のプラスミド（例、 pUB110、 pTP5 、 pC194)、酵母由来プラスミド（例、 pSH19、 pSH15)、 λファージなどのバクテリオ ファージ、レトロウイルス、アデノ随伴ウィルス（AAV)、アデノウイルス、レンチウィル ス、ワクシニアウイノレス、ノキュロウイノレス、ボックスウイノレス、へノレぺスゥイノレス、単純 ヘルぺスウィルス、レンチウィルス (HIV)、センダイウィルス、ェプスタイン バーウイ ルス（EBV)、ワクシニアウィルス、ポリオウイルス、シンビスゥイノレス、 SV40等のウイ ルスなどの他、 pAl— 11、 pXTl、 pRc/CMV、 pRc/RSV、 pcDNAl/Neoなど が用いられる。中でも、ウィルスが好ましぐアデノ随伴ウィルス (AAV)、アデノウィル ス、 レトロウイノレス、ボックスウイノレス、へノレぺスゥイノレス、単純へノレぺスゥイノレス、レン チウイノレス (HIV)、センダイウィルス、ェプスタイン バーウィルス (EBV)、ワクシニア ウィルス、ポリオウイルス、シンビスウィルス、 SV40等を用いることが好ましい。さらに アデノ随伴ウィルス (AAV)またはアデノウイルス等を用いることがより好まし 、。アデ ノウィルスには種々の血清型が存在するが、本発明では 2型または 5型ヒトアデノウィ ルスを使用することが好ましい。
また、発現ベクターを後述するように宿主細胞に導入せず裸のベクターとして生体 に in vivo導入する場合、使用される発現ベクターとしては pCAGGS[Gene, 108, P193-200 (1991)]、 pBK— CMV、 pcDNA3. 1、 pZeoSV (インビトロゲン社、ストラジ ーン社)等のプラスミドが好ま 、。
[0028] 前記プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に応じた適切なプロモータ 一であればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、 SR αプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプロモーター、 CMVプロモーター、 HS V— ΤΚプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、 CMVプロモーター、 SR aプロ モーターなどを用いるのが好ましい。宿主がェシエリヒア属菌である場合は trpプロモ 一ター、 lacプロモーター、 recAプロモーター、 λ Ρプロモーターまたは lppプロモー
L
ターなどが好ましぐ宿主がバチルス属菌である場合は SPOlプロモーター、 SP02 プロモーターまたは penpプロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合は PH
05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモーターまたは ADHプロモーター などが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、 P10プロ モーターなどが好まし 、。
[0029] 前記発現ベクターは、本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子およびプロモー ターの他に、所望によりェンハンサー、スプライシングシグナル、ポリ A付加シグナル 、選択マーカーまたは SV40複製オリジンなどを有していてもよい。選択マーカーとし ては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（以下 dhfrと略称する場合がある）遺伝子 (メソトレ キセー HMTX)耐性）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子 (G418 耐性)等が挙げられる。特に dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 CHOを用 いて dhfr遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含ま ない培地によっても選択できる。また、シグナル配列としては、宿主がェシエリヒア属 菌である場合は PhoA'シグナル配列もしくは ΟπιρΑ·シグナル配列など力 宿主が バチルス属菌である場合は a アミラーゼ ·シグナル配列もしくはサブチリシン ·シグ ナル配列など力 宿主が酵母である場合は MF o; ·シグナル配列もしくは SUC2 'シ グナル配列など力 宿主が動物細胞である場合にはインシュリン 'シグナル配列、 α インターフェロン'シグナル配列もしくは抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利 用できる。
[0030] このようにして構築された本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子を含有する 発現ベクターは、さらに宿主に導入し形質転換体の形態で製剤化の際に用いること ができる。形質転換体を投与することにより、投与された生体内において本発明のヒト 組換え HGFが形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に生成され、本発明のヒ ト組換え HGFを生体に有効に投与することができる。
上記発現ベクターを導入する宿主としては、例えば、ェシエリヒア属菌、バチルス属 菌、ビフィズス菌、乳酸菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。ェシ エリヒア属菌の具体例としては、 Escherichia coli K12 - DH1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60卷, 160 (1968))、JM103 (Nucleic Acids Research, 9卷, 309(1981)) , JA22 1 (Journal of Molecular Biology, 120卷, 517 (1978))、 HB101 [Journal of Molecular Biology, 41卷, 459 (1969)〕、 C600 (Genetics, 39卷, 440 (1954))、 DH5 a ( Inoue,H.,Nojima,H.and Okayama'H., Gene, 96, 23—28 (1990))、 DH10B (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87卷， 4645— 4649 (1990))等が挙げられる。バチルス属菌とし ては、例えば Bacillus subtilis MI114(Gene, 24卷， 255 (1983)、 Journal of
Biochemistry, 95卷， 87 (1984))等が挙げられる。ビフィズス菌としては、例えば Bindobactenum longum、 Bifidobacterium bifidum、 Bindobactenum breve等 »荦 ら れる。乳酸菌としては、例えばラタトバチラス属（Lactobacillus)、ストレプトコッカス属（ Streptoccoccus)、ロイコノストック厲（Leuconostoc)、へアイオコッカス腐 (Pediococcus )等が挙げられる。酵母としては、例えば Saccharomyces cerevisiae AH22、 AH22R ―, NA87— 11A、 DKD— 5D、 20B— 12、 Schizosaccharomyces pombe NCYC1913 、 NCYC2036、 Pichia pastoris等が挙げられる。
[0031] 昆虫細胞としては、例えば、ウィルスが AcNPVの場合は夜盗蛾の幼虫由来株化 細胞（Spodoptera frugiperda cell ; Sf細胞）、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞 、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestrabrassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが挙げられる。ウィルスが BmNPVの場合は、蚕由 来株化細胞（Bombyx mori N ; BmN細胞）などが挙げられる。該 Sf細胞としては、例 えば、 Sf9細胞（ATCC CRL1711)、 Sf21細胞（以上、 Vaughn, J丄. et. al, In Vivo, 13, p213-217 (1977))などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫 等が挙げられる（前田ら、 Nature, 315, 592 (1985))。
動物細胞としては、例えば、サル細胞 COS— 7、 Vero、チャイニーズノヽムスター細 胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記）、 dhfr遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞 C HO (以下、 CHO (dhfr— )細胞と略記）、マウス L細胞、マウス AtT— 20、マウスミエ口 一マ細胞、ラット GH3、ヒト FL細胞などが挙げられる。
[0032] ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば「Pro Natl. Acad. Sci. USA, 69, p2110 (1972)」 「Gene, 17, pl07 (1982)」等に記載の方法に従って行うことができ る。バチノレス属菌を开質転換するには、例えば「Molecular & General Genetics, 168 , pi l l (1979)」等に記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには 、例えば「Methods in Enzymology, 194卷, pl82- 187 (1991)」、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, pl929 (1978)」等に記載の方法に従って行うことができる。昆虫細胞ま たは昆虫を形質転換するには、例えば「Bio/Technology, 6, p47_55 (1988)」等に記 載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば「細胞ェ 学別冊 8新細胞工学実験プロトコール， p263-267 (1995) (秀潤社発行）」、 Γ Virology , 52卷， p456 (1973)」等に記載の方法に従って行うことができる。
[0033] このようにして得られた形質転換体を培養することにより、本発明にかかる薬剤の原 料を多量に得ることができる。宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形 質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、そ の中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せし められる。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉またはショ糖 などが挙げられ、窒素源としては、例えばアンモ-ゥム塩類、硝酸塩類、コーンスチ ープ 'リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕またはバレイショ抽出液などの無 機または有機物質が挙げられ、無機物としては、例えば塩ィ匕カルシウム、リン酸二水 素ナトリウムまたは塩ィ匕マグネシウムなどが挙げられる。さらに、酵母エキス、ビタミン 類、生長促進因子などを添加してもよい。培地の pHは約 5— 8が望ましい。
[0034] ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコースおよびカザミノ酸 を含む M9培地（Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, p431— 433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972) )が好ましい。ここに必要によりプロ モーターを効率よく働かせるために、例えば 3 |8—インドリルアクリル酸のような薬剤を 加えることができる。宿主がェシエリヒア属菌の場合、培養は通常約 15— 43°Cで約 3 一 24時間行い、必要により通気や撹拌をカ卩えることもできる。宿主がバチルス属菌の 場合、培養は通常約 30— 40°Cで約 6— 24時間行い、必要により通気や撹拌を加え ることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えばバ ークホールダー (Burkholder)最小培地（Bostian, K. L.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, p4505 (1980))や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地（Bitter, G. A.ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, p5330 (1984) )等が挙げられる。培地の pHは約 5— 8に調整するのが好ましい。培養は通常約 20°C— 35°Cで約 24— 72時間行い、必 要に応じて通気や撹拌を加える。
[0035] 宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としては Grace's
Insect Medium (Grace, T.C.C., Nature, 195, p788 (1962) )に非動化した 10%ゥシ 血清等の添加物を適宜カ卩えたもの等が用いられる。培地の ρΗは約 6. 2-6. 4に調 整するのが好ましい。培養は通常約 27°Cで約 3— 5日間行い、必要に応じて通気や 撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては例え ば約 5— 20%の胎児牛血清を含む MEM培地（Science, 122, p501 (1952)) , DME M培地（Virology, 8, p396 (1959)) , RPMI 1640培地（The Journal of the American Medical Association, 199, p519 (1967)) , 199培地（Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, pi (1950))等が用いられる。 pHは約 6— 8であるのが好 ましい。培養は通常約 30°C— 40°Cで約 15— 60時間行い、必要に応じて通気ゃ撹 拌を加える。
[0036] 本発明においては、製剤化の際に本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子ま たは前記遺伝子を有する発現ベクターを、リボソーム、マイクロカプセル、ミクロスフエ ァ、サイトフエクチン、 DNA—タンパク質複合体またはバイオポリマー等の人工べクタ 一に内包させた形態で用いてもよい。中でも、リボソームまたはマイクロカプセルに内 包することが好ましい。 [0037] ここで、リボソームとは内部に水層を有する脂質二重膜でできた閉鎖小胞体であり、 その脂質二分子膜構造が生体膜に極めて近似して ヽることが知られて ヽる。リポソ一 ムを製造するに際し使用されるリン脂質としては、例えばレシチン、リゾレシチン等の ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の酸性リ ン脂質、ホスファチジルエタノールァミン、スフインゴミエリン等のスフインゴリン脂質等 が挙げられる。また、コレステロール等を添加することもできる。リボソームは、自体公 知の方法に従って製造することができる。リボソームには、膜融合リボソーム、 HVJ- 膜融合リボソーム（Kaneda. Y et al., Biol. Chem, 264, pl2126- 12129 (1989)、 Kato. K et al., Biol. Chem, 266, p3361— 3364 (1991)、 Tomita. N et al., Biochem. Biophys. Res., 186, pl29-134 (1992)、 Tomota. N et al., Cric. Res., 73, p898— 905 (1993))、 陽イオン性リボソーム（特表 2000— 510151号公報、特表 2000— 516630号公報）等が知 られて 、る。センダウィルス (HVJ)と融合させた HVJ—膜融合リボソームを用いること が本発明において好ましい。リボソームの表面に HVJの糖タンパクを組み込み、また は共有結合させてポリエチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導入効 率が上昇する。マイクロカプセルはフィルムコートされた粒子であり、膜形成ポリマー 誘導体、疎水性可塑剤、表面活性剤または Zおよび潤滑剤窒素含有ポリマーの混 合物からなるコーティング材料でコートされた粒子等で構成されるものが挙げられる。
[0038] 本発明の皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤および肉芽増生促進剤 (以下、 これらを総称して「本発明の薬剤」という）は、上述してきた本発明のヒト組換え HGF または本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子を有効成分として含む。本発明 の薬剤としては、（a)本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子を有する発現べク ターを含有する皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤、 (b )本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子を有する発現ベクターを含む形質転 換体を含有する皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤、 (c )本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子または本発明のヒト組換え HGFをコー ドする遺伝子を有する発現ベクターを含むリボソームまたはマイクロカプセル等を含 有する皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤も含まれる。
[0039] 本発明の薬剤は、上記有効成分を通常は当該技術分野で用いられている製剤用 添加剤とともに常法に従って製剤化することにより製造される。本発明の薬剤の剤形 は特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤、注射剤、 ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ゲル状クリーム剤、ローション剤、乳剤、懸 濁剤、湿布剤、硬膏剤、リニメント剤、エアゾール剤、シロップ剤、口腔剤、点眼剤ま たは点鼻剤などが挙げられる。前記錠剤は、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶 被錠もしくはフィルムコーティング錠などのコーティングを施した錠剤、または二重錠 や多層錠であってよい。
[0040] 上記のような医薬製剤は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従つ て製造することが可能である。
錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば 賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤または滑沢剤などを製剤用添加物として用い ることができる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖もしくはブドウ糖等の糖類、デン プン等のデンプン類、結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、例えばダル コースやマルチトールなどの糖類もしくは糖アルコール類、デンプンなどの多糖類、 ゼラチンなどの天然高分子類、メチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース などのセルロース誘導体、ポリビュルピロリドンなどの合成高分子化合物等が挙げら れる。崩壊剤としては、例えば澱粉、アルギン酸ソーダ、コーンスターチ、ヒドロキシプ 口ピルスターチ、ポリビュルピロリドンまたはクロスカルメロースナトリウム等が挙げられ る。滑沢剤としては、例えばステアリン酸塩、タルク、ホウ酸末またはポリエチレンダリ コール等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば脂肪酸エステル等が挙げられる
[0041] 本発明の薬剤が坐剤の剤形を有する場合は、親油性基剤、水溶性基剤または乳 剤性基剤に、上記有効成分、および所望により、例えば局所麻酔薬、抗ヒスタミン剤 、局所収れん剤、サルファ剤、抗生物質、瘡傷治療薬、界面活性剤、ビタミン類、生 薬エキス、胆汁酸類、防腐剤、賦形剤、吸収促進剤またはアミノ酸等の製剤用添カロ 物を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。
[0042] 本発明の薬剤が注射剤の剤形を有する場合は、水溶性溶剤または非水溶性溶剤 などの溶剤に、上記有効成分、および所望により溶解補助剤、緩衝剤または無痛化 剤等の製剤用添加剤等の製剤用添加物を含有させることにより本発明の薬剤を製造 することができる。前記注射剤は、殺菌され、かっ血液と等張であることが好ましぐ 血液と等張にするために食塩、ブドウ糖またはグリセリンなどを含有して 、てもよ 、。 さらに、所望により着色料、保存料、香料、風味剤、甘味剤等を医薬製剤中に含有し ていてもよい。
[0043] 本発明の薬剤が軟膏剤の剤形を有する場合、例えばワセリン、流動パラフィン、シリ コンもしくは植物油などの油脂性基剤;例えば親水ワセリンもしくは精製ラノリンなどの 乳剤性基剤;例えばマクロゴールなどの水溶性基剤などの基剤に、上記有効成分、 および所望により例えば陰イオン型もしくは非イオン型界面活性剤などの乳化剤また はパラォキシ安息香酸エステル類などの保存剤等の製剤用添加剤を含有させること により本発明の薬剤を製造することができる。
[0044] 本発明の薬剤がゲル剤の剤形を有する場合、水にゲル化剤（例えばカルボキシビ -ル重合体、ヒドロキシェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセル ロース、ェチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはアルギン酸プロピレン グリコールエステル等)などを加えて得られる基剤に、上記有効成分、および所望に より、例えば低級アルコール、中和剤、界面活性剤または吸収促進剤などの製剤用 添加剤を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。
[0045] 本発明の薬剤がクリーム剤の剤形を有する場合、例えば高級脂肪酸エステル類 ( 例えばミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、セバシン酸ジェチル、ラウリン酸 へキシル、イソオクタン酸セチル等）、低級アルコール（例えばエタノール、イソプロパ ノール等）、炭水化物（例えば流動パラフィン、スクヮラン等）、多価アルコール (例え ばプロピレングリコール、 1, 3—ブチレングリコール等）または高級アルコール（例えば 2 キシルデカノール、セタノール、 2—オタチルドデカノール等）等を含む基剤に、 上記有効成分、および所望により、例えば乳化剤、防腐剤、吸収促進剤またはかぶ れ防止剤などの製剤用添加剤を含有させることにより本発明の薬剤を製造することが できる。
また、クリーム剤とゲル剤の中間の性質を有するゲル状クリーム剤とするためには、 上記のクリーム剤にゲル化剤および中和剤をカ卩えればよい。 [0046] 本発明の薬剤が外用液剤の剤形を有する場合、溶剤に、上記有効成分、および所 望により、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤、 pH調製剤、溶剤、溶解補助剤、着香 剤、ゲル化剤、矯味剤または清涼化剤等などの製剤用添加剤を含有させることにより 本発明の薬剤を製造することができる。前記溶剤としては、例えばグリセリン、プロピ レングリコール、エタノール、イソプロパノール、ブチレングリコーノレ、水、ソルビトール 、マン-トール、キシリトール、ブドウ糖、ィプシロンアミノカプロン酸、グリシン、グルタ ミン酸塩、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール類、カルボキシビュルポリマ 一類ゃセタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類、中鎖脂肪酸エス テル類やミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸エステル類、ステアリン酸などの高級 脂肪酸、スクヮラン、流動パラフィン、白色ワセリンまたは精製ラノリンなどを挙げること ができる。
ここで、外用液剤としては、洗浄、注入、湿布、吸入、噴霧、浣腸、塗布、薬浴、清 拭、消毒、点眼、洗眼、点耳または点鼻など外用に供する液体製剤が挙げられる。
[0047] 本発明の外用液剤を通常噴射剤と共に用いることによりエアゾール剤を製造するこ とができる。噴射剤としては通常エアゾールに用いられるジメチルエーテル、液ィ匕石 油ガス、 Nガス、亜酸化窒素ガス、 COガス、代替フロンガス等を挙げることができる
2 2
。噴射剤を用いないで圧縮空気を用いることもできる。また、これらの混合物を用いて ちょい。
[0048] 本発明の薬剤については、経口投与、非経口投与または局所投与など種々の投 与方法の中から、その剤形に応じて投与方法を適宜選択すればよい。本発明の薬 剤は皮下または筋肉内等に埋め込むこともできる。
本発明のヒト組換え HGFをコードする遺伝子は、上述のように製剤化せずに、その ままでまたは摂取促進のための補助剤とともに直接生体に投与することもできる。力 力る投与方法は公知の方法に従って行ってよいが、例えば DNAを直接体内に導入 する in vivo法、または投与されるヒト等力 ある種の細胞を体外に取り出して当該細 胞にヒト組換え HGFをコードする遺伝子を導入し、その形質転換細胞を体内に戻す ex vivo法がある（日経サイエンス、 4月号、 20-45 (1994)、月間薬事、 36、 23-48 ( 1994)、実験医学増刊、 12、 15 (1994) )。それぞれの方法において、本発明のヒト組 換え HGFをコードする遺伝子を細胞に導入する方法としては、上述したようにアデノ 随伴ウィルス、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等の発現ベクターに遺 伝子を含有させて該発現べクタ一等を細胞に導入する遺伝子導入方法、トランスフ ェクシヨン、エレクト口ポレーシヨン、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、 D EAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃で担体 (金属粒子等）とともに D NAを細胞内に導入する方法等（Wu et al.J. Biol. Chem. 267, 963-967(1992)、 Wu et al.J. Biol. Chem. 263, 14621-14624, (1988)、 Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 2726-2730 (1991))が挙げられる。またリボソーム等を用いる場合には、リボソーム法、 HVJ—リボソーム法、陽イオン性リボソーム法、リボフヱクチン法、リボフヱクトァミン法 等が挙げられる。中でも、導入効率の観点から、アデノウイルスベクターまたはレトロ ウィルスベクターを用いる遺伝子導入方法が望まし ヽ。
また、本発明の皮膚潰瘍治療剤、血管新生促進剤および肉芽増生促進剤が外用 剤として使用される場合、密封型創傷被覆材と共に使用されることが好ましい。密封 型創傷被覆材は、創傷部での湿潤環境を提供し、かつ液体や細菌などを透過させ ずに酸素や水蒸気を透過できる被覆材が好ま ヽ。このような密封型創傷被覆材と しては、例えば、ハイド口コロイドドレッシング材〔例.デュオアクティブ（Convatec) , コムフィール（コロプラスト），テガソープ（3M) ,アブソキュア（日東メディカル）〕、キチ ンドレッシング材、アルギン酸塩ドレッシング材〔例.カルトスタツト（Convatec) ,ソー ブサン（アルケア），ァルゴダーム（メデイコン），クラピオ AG (クラレ）〕、ハイドロジェル ドレッシング材〔例.ジヱリパーム（竹虎），ニュージヱル (Johnson & Johnson) ,ィ ントラサイト（Smith & Nephew) ,ダラ-ュゲル（Convatec) ,クリアサイト（日本シ グマックス）〕、ポリウレタンドレッシング材〔例.テガダーム（3M) ,ォプサイトゥンド（S mith & Nephew) , IV3000 (Smith & Nepnew) ,バイオクルーシブ（Johnso n & Johnson)〕、ノヽイド口ポリマードレッシング材〔例.ティエーノレ (Johnson & J ohnson)〕、ハイド口ファイバードレッシング材またはポリウレタンフォーム〔例.ハイド 口サイト（Smith & Nephew)〕などのドレッシング材が好ましく挙げられる。これらド レッシング材は 1若しくは 2以上を組合わせて用いることもできる。また、ドレッシング 材は皮膚貼付用粘着シート状、フィルム状などの形態であってもよ 、。 [0050] 本発明の外用剤を密封型創傷被覆材と共に使用する形態としては、密封型創傷被 覆材に本発明の外用剤を含有させてもよぐまたは本発明の外用剤を塗布などした 後に密封型創傷被覆材で損傷部位を被覆する形態であってもよぐあるいは密封型 創傷被覆材で損傷部位を被覆した後に、例えば注射器などで、本発明の外用剤を 注入などする形態であってもよ 、。
[0051] 密封型創傷被覆材に本発明の外用剤を含有させる場合、通常は密封型創傷被覆 材の吸収材層（例えば、ヒドロゲル層など）に本発明の外用剤を含有させることが好ま しい。この場合、ヒト組換え HGFは、吸収材層の乾燥重量を基準として 0. 01質量％ 一 5質量％、好ましくは 0. 1質量％— 3質量％の量添加されるのがよい。吸収材層に ヒト組換え HGFを含有させることにより、例えば滲出液によって吸収材層が濡れるに つれてヒト組換え HGFの放出レベルを高めることができる。また、本発明の外用剤を 塗布などした後に密封型創傷被覆材で損傷部位を被覆する場合は、本発明の外用 剤が外部に漏出しないという利点がある。また、あるいは密封型創傷被覆材で損傷 部位を被覆した後に、例えば注射器などで、創傷面または創傷被覆材の吸収剤層 に本発明の外用剤を注入することにより、創傷面を外気にさらすことなく本発明の外 用剤を投与できる。
[0052] 本発明の薬剤の投与量および投与頻度は特に限定されず、治療すべき病態の種 類、患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて 適宜選択することが可能である。例えば静脈投与の場合、その投与量はヒト組換え H GFとして約 250— 1000 μ g/Kg/曰、好ましくは約 300— 800 μ g/Kg/曰、特 に好ましくは、約 300— 550 gZKgZ日であり、ヒト組換え HGFをコードする遺伝 子として約 0. 2— 40, 000 μ g/Kg/曰、好ましくは約 2— 2, 000 μ g/Kg/曰で ある。外用薬などによる局所投与の場合、有効成分の投与量は約 0. 001— 30mg 程度、好ましくは約 0. 01— 3mg程度である。
[0053] 本発明の薬剤は、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤として使用することがで きる。さらに、血管新生促進作用または肉芽増生促進作用を利用して皮膚潰瘍予防 治療をはじめ、消化性潰瘍治療、抗ガン、手術後の皮膚縫合、角膜手術などにおけ る医薬品的用途はもちろん、育毛剤または化粧品として用いることもできる。 実施例
[0054] 以下に、実施例等を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定 されるものではな 、ことは言うまでもな 、。
(1)本発明のヒト組換え HGFの作製
「Seki, T., Ihara, I., bugimura, A., bhimonishi, M., ishizawa, T., As ami, O., Hagiya, M., Nakamura, T. and Shimizu, S., "Isolation and expression of cDNA for different forms of hepatocyte growth factor from human leukocyte. , Biochemical Biophysical Research Communications, 172, 321-327 (1990)」に記載の方法に従つ て、第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え HG Fを発現ベクターを導入した CHO細胞の培養上清力も精製した。ヒト組換え HGFの 精製度は SDSゲル電気泳動後のタンパク質染色から 98%以上であった。なお、前 記第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF のアミノ酸配列を配列番号 1に示す。
[0055] (2)皮膚潰瘍モデルの作成とヒト組換え HGFの局所投与
糖尿病を自然発症する変異マウス (C57BLZKsJ— dbZdb、 10週齢の雌)を実験 に使用した。各マウスの背部に 2力所、パンチバイオプシー (皮膚生検採取用器具） を用いて直径 6mmの皮膚全層欠損潰瘍モデルを作成した。その後透明の半透過 性被覆材（BIOCLUSIVE, Johnson & Johnson MEDICAL)にて潰瘍部を覆った。全層 欠損処置を行った日を 0日目として、 27ゲージの注射針を使用して被覆材の上から 潰瘍部に（1)において調整したヒト組換え HGFの溶液または比較例としての生理食 塩水（25 μ 1)を潰瘍モデル作成直後から連日投与した。ヒト組換え HGFの投与量は 10 μ gZ潰瘍 Ζ日である。マウスを潰瘍モデノレ作成後、 7日目、 14日目、 21日目な らびに 28日目に潰瘍部の解析を行った。
[0056] (3)組織学的解析ならびに血管新生の解析
血管の組織染色を行う場合、 70%エタノールにて固定パラフィン包埋した切片を 0 . 1%トリプシンにて室温で 10分間処理し、 PBS (リン酸緩衝生理食塩水）による洗浄 後、 3%過酸ィ匕水素を含む PBSにて 30分間処理した。次に切片を抗 CD31ZPEC AM— 1抗体（Phar Mingen社の抗体を 50倍に希釈したもの）にて室温にて 2時間ィ ンキュペートした後、ピオチン標識西洋ヮサビパーォキシダーゼ結合抗ラッ HgG抗 体 (DAKO社の抗体を 200倍に希釈したもの）にて 30分間インキュベートした。ジァ ミノベンチジンと過酸ィ匕水素を含む基質溶液中で酵素抗体反応を検出し、検出後へ マトキシリンにて細胞核を染色した。切片の顕微鏡観察（100倍の視野）によって血 管密度を定量した。
[0057] (4)肉芽組織の解析
肉芽組織を測定する場合、へマトキシリンならびにェォジン染色した組織切片を使 用した。潰瘍部表面に対して垂直になるように調製した組織切片の画像をコンビユー ターに取り込み、肉芽組織をトレースした後、 NIH画像解析ソフトウェア一にて肉芽 組織の面積を定量した。
[0058] (5)潰瘍部の閉鎖 (治癒)率の決定
潰瘍部の閉鎖 (治癒)を測定するため、潰瘍部片縁をスライドガラス上にトレースし た後、 CCDカメラにてコンピューターに取り込み、 NIH画像解析用ソフトウェアーを 用いる画像解析によって潰瘍部の面積を定量した。潰瘍部の閉鎖率が 0%は潰瘍部 の閉鎖が認められな 、状態に相当し、 100%は潰瘍部の閉鎖が完了したことに相当 している。
[0059] 上記実験の結果を以下に示す。
(結果 1)ヒト組換え HGFによる血管新生の促進
血管新生は皮膚潰瘍の治癒を含め組織修復にぉ 、て重要な役割を担って 、ること から、血管新生に対するヒト組換え HGFの効果を解析した。皮膚潰瘍モデル作成 7 日後の組織切片を用いて免疫染色によって血管を検出した（図 1Aに血管を染色し た組織像を示す)。その結果、対照 (生理食塩水投与群)での血管密度は 33. 4±6 . 0/mm2であったのに対して、 10 /z g/潰瘍/日のヒト組換え HGF投与によって血 管密度は 59. 6 ±4. 5Zmm2に促進された（図 1B)。したがって、ヒト組換え HGFは 血管新生を促進することが明らかとなった。
[0060] (結果 2)ヒト組換え HGFによる肉芽組織の増生促進
肉芽組織の増生に対するヒト組換え HGFの効果を調べた（図 2A)。肉芽組織の増 生は皮膚潰瘍モデル作成後 7日目の組織切片を用いた画像解析によって測定した 。その結果、皮膚潰瘍モデル作成後の組織を調べると、ヒト組換え HGFの投与によ つて肉芽組織の増生が認められた（図 2A)。画像解析の結果、対照 (生理食塩水投 与群）においては肉芽組織の面積が 1. 30±0. 15mm2であったのに対して、ヒト組 換え HGFは容量依存的に肉芽組織の面積を促進し、 10 μ gZ潰瘍 Ζ日のヒト組換 え HGF投与によって肉芽組織の面積は対照の 2. 3倍に増大し、ヒト組換え HGFは 肉芽組織の増生を促進することが認められた (図 2B)。
(結果 3)ヒト組換え HGFによる潰瘍部の閉鎖 (治癒）の促進
皮膚潰瘍部にヒト組換え HGF (10 μ gZ潰瘍 Ζ日）を連日 5日間投与した。その結 果、ヒト組換え HGFによる容量依存的な潰瘍部の閉鎖 (治癒)促進が 2日後から認め られた。潰瘍モデル作成 10日後、生理食塩水を投与した対照の皮膚においては、 潰瘍閉鎖率 (治癒率)が 41. 1 ±6. 8%であった。これに対して、 ΙΟ/z gZ潰瘍 Z日 のヒト組換え HGF投与によって潰瘍閉鎖率 (治癒率)が 85. 0±4. 0%に促進された 。また、対照 (生理食塩水投与群)では潰瘍部の閉鎖 (治癒)完了に 21日要したのに 対して、 10 gZ潰瘍 Z日のヒト組換え HGF投与によって 14日において潰瘍部の 閉鎖 (治癒)完了が認められた (図 3)。

Claims

請求の範囲
[1] 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物。
[2] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を含有することを特徴とする血管新生促進用組成物。
[3] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物。
[4] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF が次のいずれかである請求項 1一 3のいずれかに記載の組成物；
(a)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(b)配列表の配列番号 1において、 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたアミノ酸配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質。
[5] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF をコードする遺伝子を含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物。
[6] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF をコードする遺伝子を含有することを特徴とする血管新生促進用組成物。
[7] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF をコードする遺伝子を含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物。
[8] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF をコードする遺伝子力 次のいずれかの DNAからなる遺伝子である、請求項 5— 7の いずれか〖こ記載の組成物；
(a)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNA；
(b)配列表の配列番号 2において、 1乃至数個の塩基が欠失、置換または付加され た塩基配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列から なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF活性を有するタン パク質をコードする塩基配列力もなる DNA;または
(d)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと少なくとも 70%以上の 相同性を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる DN A。
[9] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法。
[10] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法。
[11] 第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法。
[12] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF が次の!/、ずれかである請求項 9一 11の!、ずれかに記載の方法；
(a)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(b)配列表の配列番号 1において、 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたアミノ酸配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質。
[13] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF をコードする遺伝子を哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法。
[14] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法。
[15] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法。
[16] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF をコードする遺伝子力 次のいずれかの DNAからなる遺伝子である、請求項 13— 1
5に記載の方法；
(a)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNA；
(b)配列表の配列番号 2において、 1乃至数個の塩基が欠失、置換または付加され た塩基配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列から なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF活性を有するタン パク質をコードする塩基配列力もなる DNA;または (d)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと少なくとも 70%以上の 相同性を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる DN A。
[17] 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおい て 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト糸且換え HGFの使用。
[18] 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおい て 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト糸且換え HGFの使用。
[19] 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおい て 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト糸且換え HGFの使用。
[20] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF が次の!/、ずれかである請求項 17— 19の!、ずれかに記載の使用；
(a)配列表の配列番号 1に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
(b)配列表の配列番号 1において、 1乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加さ れたアミノ酸配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質。
[21] 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおい て 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト糸且換え HGFをコードする遺伝子の使用。
[22] 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおい て 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト糸且換え HGFをコードする遺伝子の使用。
[23] 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおい て 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト糸且換え HGFをコードする遺伝子の使用。
[24] (24) 第一クリングルドメインにおいて 5個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換え H
GFをコードする遺伝子力 次のいずれかの DNA力もなる遺伝子である、請求項 21 一 23のいずれかに記載の使用；
(a)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列からなる DNA；
(b)配列表の配列番号 2において、 1乃至数個の塩基が欠失、置換または付加され た塩基配列を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする DNA;
(c)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと相補的な塩基配列から なる DNAとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、かつ HGF活性を有するタン パク質をコードする塩基配列力もなる DNA;または
(d)配列表の配列番号 2に記載の塩基配列を有する DNAと少なくとも 70%以上の 相同性を有し、かつ HGF活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなる DN A。
[25] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を含有する密封型創傷被覆材。
[26] 第一クリングルドメインにお！、て 5個のアミノ酸残基が欠損して 、るヒト組換え HGF を含有する組成物と、皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆材と を有することを特徴とする皮膚潰瘍治療用キット。
[27] 皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆材で創傷面を覆!ヽ、前記 皮膚潰瘍部分を湿潤環境下に保ち、第一クリングルドメインにぉ 、て 5個のアミノ酸 残基が欠損しているヒト組換え HGFを、密封型創傷被覆材中または、密封型創傷被 覆材と創傷面の間に置くことを特徴とする皮膚潰瘍の治療方法。
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