JPWO2005023287A1 - ヒト組換えｈｇｆを含有する皮膚潰瘍予防治癒剤 - Google Patents

Abstract

第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有する血管新生促進用組成物、肉芽増生促進用組成物および皮膚潰瘍予防治癒用組成物を提供する。本発明の組成物は、肉芽増生および血管新生を促進し組織修復に有効な医薬品、なかでも皮膚潰瘍予防治癒剤として有用である。

Description

本発明は、ヒト組換えＨＧＦまたはヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有する皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤および肉芽増生促進剤に関する。

種々の細胞増殖因子は皮膚において細胞の増殖や表皮細胞の遊走、またはアポトーシス（細胞死）あるいは細胞外マトリックス産生などを制御することによって皮膚の創傷治癒に関与している。またある種の増殖因子の投与によって正常動物における皮膚の創傷治癒が促進されること、あるいは皮膚の創傷治癒能が低下している糖尿病患者や、ステロイド投与あるいは栄養失調のモデル動物において増殖因子が皮膚の創傷治癒能の低下を代償することが報告されている（非特許文献１、非特許文献２）。例えば糖尿病マウスにおいては正常のマウスに比べ皮膚創傷治癒は遅延するが、塩基性線維芽細胞増殖因子（basic fibroblast growth factor；ｂＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（platelet-derived growth factor）、インスリン様増殖因子−Ｉ（insulin-like growth factor-I）またはトランスフォーミング増殖因子−α（transforming growth factor-α）の局所投与が前記皮膚創傷治癒の遅延を抑制することが報告されている（非特許文献４〜６）。さらに、組換えｂＦＧＦは皮膚潰瘍の治療薬として利用されている。

一方、成熟肝細胞に対する増殖促進因子として発見されたＨＧＦ（hepatocyte
growth factor；肝細胞増殖因子）は各種傷害に対して組織の再生ならびに保護を担う生理機能を有している（非特許文献７〜１０）。皮膚においてもＨＧＦが表皮ケラチノサイト（角化細胞）またはメラノサイトの増殖や遊走を促進することが明らかにされ、ＨＧＦが皮膚の生理機能や創傷治癒に関与することが示唆された（非特許文献１１〜１３）。本発明者らは、さらに皮膚の生理機能や創傷治癒に対するＨＧＦの役割について検討を重ね、組換えＨＧＦを有効成分とする創傷治療または皮膚潰瘍治療剤を開発し、特許を得ている（特許文献１）。その後の研究でも、実験動物においてＨＧＦが皮膚創傷治癒に関与することが支持されている。例えば、ＨＧＦならびにｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦレセプターの発現は皮膚創傷に応じて増加する（非特許文献１４、非特許文献１５）。ＨＧＦを過剰発現するトランスジェニックマウスにおいて皮膚創傷後の血管新生や肉芽組織の形成の加速が見られる（非特許文献１６）。一方、皮膚創傷治癒モデルにおいて抗ＨＧＦ抗体の投与によって内因性ＨＧＦの作用をブロックすると表皮の再生や血管新生が抑制され治癒が遅延する（非特許文献１５）。
しかし、上記文献には、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦについては記載も示唆もされていない。

第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦは公知のタンパク質であるが（非特許文献１７）、非特許文献１７には肉芽増生および血管新生の促進作用について記載されていないし、示唆さえされていない。
また、内因性ＨＧＦが肉芽増生および血管新生に関与することは記載されているが（非特許文献１５、１６）、ＨＧＦを投与した場合かかる外因性ＨＧＦが同一の現象を引き起こすか否かについては全く検討されていないうえに、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦについて記載も示唆もされていない。
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本発明は、優れた肉芽増生および血管新生促進作用を有し組織修復に有効な医薬品、なかでも皮膚潰瘍予防治癒剤として有用な医薬品を提供することを目的とする。

本発明者らは、前記特許文献１に記載の発明についてさらに鋭意研究を重ねた結果、ＨＧＦのなかでも第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦが外因的補充によって肉芽増生および血管新生を促進させる作用に優れていることを知見した。前記ヒト組換えＨＧＦのかかる作用を利用すれば、広く組織修復に優れた医薬品を提供することができる。なかでも、前記ヒト組換えＨＧＦは、糖尿病、静脈うっ滞、膠原病または熱傷などに起因する皮膚潰瘍の予防または治療に特に優れた効果を奏することを知見した。
さらに、本発明者らは検討を重ねて、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、
（１） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物、
（２） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有することを特徴とする血管新生促進用組成物、
（３） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物、
（４） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦが次のいずれかである前記（１）〜（３）のいずれかに記載の組成物；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
（ｂ）配列表の配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質、
に関する。

また、本発明は
（５） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物、
（６） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有することを特徴とする血管新生促進用組成物、
（７） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物、
（８） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、前記（５）〜（７）のいずれかに記載の組成物；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２において、１乃至数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；または
（ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
に関する。

また、本発明は、
（９） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法、
（１０） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法、
（１１） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法、
（１２） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦが次のいずれかである前記（９）〜１０のいずれかに記載の方法；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
（ｂ）配列表の配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質、
（１３） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法、
（１４） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法、
（１５） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法、
（１６） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、前記（１３）〜（１５）のいずれかに記載の方法；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２において、１乃至数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；または
（ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
に関する。

また、本発明は、
（１７） 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦの使用、
（１８） 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦの使用、
（１９） 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦの使用、
（２０） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦが次のいずれかである前記（１７）〜（１９）のいずれかに記載の使用；
（ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
（ｂ）配列表の配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質、
（２１） 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子の使用、
（２２） 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子の使用、
（２３） 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子の使用、
（２４） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、前記（２１）〜（２３）のいずれかに記載の使用；
（ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
（ｂ）配列表の配列番号２において、１乃至数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
（ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；または
（ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ、
に関する。

さらに、本発明は、
（２５） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有する密封型創傷被覆材、
（２６） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有する組成物と、皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆材とを有することを特徴とする皮膚潰瘍治療用キット、
（２７） 皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆材で創傷面を覆い、前記皮膚潰瘍部分を湿潤環境下に保ち、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを、密封型創傷被覆材中または、密封型創傷被覆材と創傷面の間に置くことを特徴とする皮膚潰瘍の治療方法、
に関する。

本発明は、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦ（以下、単に「ヒト組換えＨＧＦ」という）または前記ヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有する肉芽増生促進剤および血管新生促進剤を提供する。かかる医薬品は、皮膚潰瘍の予防または治療をはじめとして広く組織修復に利用することができる。さらに、前記ヒト組換えＨＧＦは生体由来のものまたは生体由来のＨＧＦを起源とするものであることから、生体に投与しても安全であり副作用が少ない。
また、上記医薬品は、密封型創傷被覆材と共に使用することにより、皮膚潰瘍部分を湿潤環境下に保つと共にヒト組換えＨＧＦが密封状態で皮膚潰瘍面で接触できるため、組織修復の促進をはかることができる。

図１Ａは実施例（３）において血管を染色した組織像を示す。図１Ｂはヒト組換えＨＧＦ投与群と生理食塩水投与群の血管密度を示す。図中、「生理食塩水」は生理食塩水投与群を示し、「ＨＧＦ（１０μｇ）」とはヒト組換えＨＧＦ投与群を示す。以下の図面も同様である。 図２Ａは、ヒト組換えＨＧＦ投与群と生理食塩水投与群における肉芽組織の増生の程度を示す。図２Ｂはヒト組換えＨＧＦ投与群と生理食塩水投与群の肉芽面積を示す。 ヒト組換えＨＧＦ投与群と生理食塩水投与群の潰瘍閉鎖率（治癒率）を示す。

本発明で用いるヒト組換えＨＧＦは、配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＨＧＦにおいて、Ｎ末端から１２８〜２０６番目に位置する第一クリングルドメインのうち５個のアミノ酸残基が欠損している。欠損している５個のアミノ酸残基は連続して存在していてもよいし、２〜５カ所に分かれて存在していてもよいが、連続して存在している方が好ましい。本発明で用いるヒト組換えＨＧＦとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなることが好ましい。なかでも、配列番号１で示されるアミノ酸配列、または当該アミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなることがより好ましく、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなることが特に好ましい。なお、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されているアミノ酸配列からなるタンパク質は、ＨＧＦ活性、すなわちＨＧＦと実質的に同質の機能、例えば成熟肝細胞に対する増殖促進活性を有することが好ましい。

本発明で用いるヒト組換えＨＧＦとしては、遺伝子組み換え技術等を用いて生産されたものに限定されず、ＨＧＦの多様なファミリーの一種として生体内に存在するものであってもよい。
遺伝子組み換え技術等を用いて本発明に用いるヒト組換えＨＧＦを生産する方法としては公知の方法を用いてよく、例えば「Biochemical Biophysical Research Communications, 172, 321-327 (1990)」（非特許文献１７）に記載されている方法が好適である。
生体内から本発明のヒト組換えＨＧＦを単離・精製する方法としては、例えば比較的高濃度にＨＧＦを含む成熟肝細胞や血小板をトロンビン処理し、血小板外へ分泌されるＨＧＦを取得後、イオン交換クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースによるアフィニティクロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィー等を用いて精製する方法等が挙げられる。通常はヒトの組織または細胞を用いて本発明のヒト組換えＨＧＦを単離・精製するが、単離されるＨＧＦが本発明の上記条件を満たす限り、ヒト以外の哺乳動物、例えばラット、モルモット、マウス、ニワトリ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、サル等の組織または細胞をＨＧＦの単離・精製のために用いてもよい。

本発明で用いられるヒト組換えＨＧＦは、当該技術分野で公知の種々の修飾を受けていてもよい。
例えば、本発明で用いられるヒト組換えＨＧＦのＣ末端のカルボキシル基は、アミド化、エステル化またはイオン化されていてもよい。具体的には、Ｃ末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）がカルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）に置換されていてもよい。ここでエステルにおける置換基Ｒとしては、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピルもしくはｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基；例えばシクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基；例えばフェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基もしくはα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが挙げられる。さらに、本発明で用いられるヒト組換えＨＧＦがＣ末端以外にカルボキシル基を有している場合、上記と同様にカルボキシル基がアミド化、エステル化またはイオン化されていてもよい。

本発明に用いられるヒト組換えＨＧＦとしては、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、Ｎ末端側が生体内で切断され生成したグルタミル基がピログルタミン酸化したもの、アミノ酸側鎖上の置換基（例えば、−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチルなどのＣ_２−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。なかでも、本発明に用いられるヒト組換えＨＧＦとしては糖鎖が結合しているものが望ましく、結合する糖としてはフコース、ガラクトース、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミンなどが挙げられる。

本発明に用いられるヒト組換えＨＧＦは薬理学的に許容される塩を形成していてもよい。本発明のヒト組換えＨＧＦが塩基性を示す場合、前記薬理学的に許容される塩としては、例えば無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、または有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。本発明のヒト組換えＨＧＦが酸性を示す場合、前記薬理学的に許容される塩としては、無機塩基（例えばナトリウム塩もしくはカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩もしくはマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩またはアンモニウム塩など）との塩、または有機塩基（例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミンもしくはＮ,Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンなど）との塩などが挙げられる。

本発明で用いられるヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子としては、上述してきたヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子であれば特に限定されないが、（ａ）配列番号２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ、または（ｂ）配列番号２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであって、ＨＧＦ活性、すなわちＨＧＦと実質的に同質の機能、例えば成熟肝細胞に対する増殖促進活性等を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等が好適な例として挙げられる。本発明では、配列番号２で表わされる塩基配列を含むまたはからなるＤＮＡを用いることが特に好ましい。

配列番号２で表わされる塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば上記ＤＮＡをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法等を用いることにより得られるＤＮＡを意味する。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、約０．７〜１．０Ｍ程度の塩化ナトリウム存在下、約６５℃程度でハイブリダイゼーションを行った後、約０．１〜２倍程度の濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムよりなる）を用いて約６５℃程度の条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡを挙げることができる。
上記の配列番号２で表される塩基配列からなるＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡとして具体的には、配列番号２で表わされる塩基配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、最も好ましくは約９５％以上の相同性を有する塩基配列を有するＤＮＡ等が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法、例えばモレキュラー・クローニング（Molecular Cloning, A laboratory Manual, Third Edition（J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001：以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）に記載の方法等に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。

本発明で用いられるヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子は、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡのいずれでもよい。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、上記した細胞・組織よりtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することによりヒト組換えＨＧＦをコードするＤＮＡを得ることもできる。また、ＲＮＡも、逆転写酵素により本発明のヒト組換えＨＧＦを発現することができるものであれば用いることができる。該ＲＮＡも公知の手段により得ることができる。

本発明で用いられるヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子は公知の方法により得ることができ、例えば前記「Biochemical Biophysical Research Communications, 172, 321-327 (1990)」(非特許文献１７)に記載されている方法を用いることが好ましい。さらに、得られた遺伝子に対して公知の処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡの塩基配列の置換は、ＰＣＲや公知のキット、例えば、Mutan^TM−super Express Km（宝酒造）、Mutan^TM−K（宝酒造）等を用いて、ODA−LA PCR法、gapped duplex法、Kunkel法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行うことができる。また、制限酵素で消化したり、リンカーを付加したりすることもできる。さらに、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）や翻訳終止コドン（ＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧ）を適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。

本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子は、細胞内でのその安定性を高めるため、また、もし毒性があるならその毒性をより小さなものにするために修飾されていてもよい。このような修飾には、例えば J. Kawakami et al., Pharm Tech Japan, Vol.8, p247（1992）; Vol.8, p395（1992）; S. T. Crooke et al. ed., Antisense Research and Applications, CRC Press (1993)等に記載された方法による修飾が挙げられる。さらに、アデニン、チミジン、グアニンおよびシトシン以外の他の物質の付加による修飾も挙げられる。前記他の物質としては、糖；酸または塩基；リン酸基骨格の電荷を中和するように働くポリリジンのようなポリカチオン体；脂質などの疎水性のものが挙げられる。付加するに好ましい脂質としては、細胞膜との相互作用の向上または核酸の取込みの増大に寄与するものが好ましく、具体的にはコレステロールやその誘導体（例えばコレステリルクロロホルメートまたはコール酸等）またはホスホリピドなどが挙げられる。前記他の物質は、核酸の３’末端あるいは５’末端に付着させることもできるし、塩基、糖、分子内ヌクレオシド結合を介して付着させることもできる。また、本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子の修飾として、遺伝子の末端の化学修飾も挙げられる。末端の修飾基としては、核酸の３’末端あるいは５’末端に特異的に配置されたキャップ用の基で、エキソヌクレアーゼまたはＲＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解を阻止するためのものが挙げられる。前記キャップ用の基としては、ポリエチレングリコールまたはテトラエチレングリコールなどのグリコールをはじめとした当該分野で知られた水酸基の保護基が挙げられるが、それに限定されるものではない。

本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子は製剤化する際にそのまま用いてもよいが、発現ベクターに挿入した形態で用いてもよい。前記発現ベクターは本発明のヒト組換えＨＧＦを発現することができればよく、例えば本発明のヒト組換えＨＧＦをコードするＤＮＡ断片が適当なプロモーターの下流に連結されているベクターなどが挙げられる。

前記発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＣＲ４、ｐＣＲ２．１、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５）、λファージなどのバクテリオファージ、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等のウイルスなどの他、ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。中でも、ウイルスが好ましく、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス（ＨＩＶ）、センダイウイルス、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、シンビスウイルス、ＳＶ４０等を用いることが好ましい。さらにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）またはアデノウイルス等を用いることがより好ましい。アデノウイルスには種々の血清型が存在するが、本発明では２型または５型ヒトアデノウイルスを使用することが好ましい。
また、発現ベクターを後述するように宿主細胞に導入せず裸のベクターとして生体にｉｎ ｖｉｖｏ導入する場合、使用される発現ベクターとしてはｐＣＡＧＧＳ[Gene, 108, p193-200 (1991)]、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）等のプラスミドが好ましい。

前記プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に応じた適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。例えば、動物細胞を宿主として用いる場合は、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが挙げられる。これらのうち、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどを用いるのが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーターまたはｌｐｐプロモーターなどが好ましく、宿主がバチルス属菌である場合はＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターまたはｐｅｎＰプロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合はＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーターまたはＡＤＨプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

前記発現ベクターは、本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子およびプロモーターの他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカーまたはＳＶ４０複製オリジンなどを有していてもよい。選択マーカーとしては、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（以下ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子（メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特にｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯを用いてｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選択できる。また、シグナル配列としては、宿主がエシェリヒア属菌である場合はＰｈｏＡ・シグナル配列もしくはＯｍｐＡ・シグナル配列などが、宿主がバチルス属菌である場合はα−アミラーゼ・シグナル配列もしくはサブチリシン・シグナル配列などが、宿主が酵母である場合はＭＦα・シグナル配列もしくはＳＵＣ２・シグナル配列などが、宿主が動物細胞である場合にはインシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列もしくは抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ利用できる。

このようにして構築された本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有する発現ベクターは、さらに宿主に導入し形質転換体の形態で製剤化の際に用いることができる。形質転換体を投与することにより、投与された生体内において本発明のヒト組換えＨＧＦが形質転換体の細胞内、細胞膜または細胞外に生成され、本発明のヒト組換えＨＧＦを生体に有効に投与することができる。
上記発現ベクターを導入する宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、ビフィズス菌、乳酸菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。エシェリヒア属菌の具体例としては、Escherichia coli Ｋ１２・ＤＨ１（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60巻，160 (1968)）、ＪＭ１０３（Nucleic Acids Research，9巻，309(1981)），ＪＡ２２１（Journal of Molecular Biology，120巻，517 (1978)）、ＨＢ１０１〔Journal of Molecular Biology，41巻，459 (1969)〕、Ｃ６００（Genetics，39巻，440 (1954)）、ＤＨ５α（Inoue,H.,Nojima,H.and Okayama,H., Gene, 96, 23-28 (1990)）、ＤＨ１０Ｂ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA，87巻，4645−4649 (1990)）等が挙げられる。バチルス属菌としては、例えばBacillus subtilis ＭＩ１１４(Gene，24巻，255 (1983)、Journal of Biochemistry，95巻，87 (1984)）等が挙げられる。ビフィズス菌としては、例えばBifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve等が挙げられる。乳酸菌としては、例えばラクトバチラス属（Lactobacillus）、ストレプトコッカス属（Streptoccoccus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）等が挙げられる。酵母としては、例えばSaccharomyces cerevisiae ＡＨ２２、ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−５Ｄ、２０Ｂ−１２、Schizosaccharomyces pombe ＮＣＹＣ１９１３、ＮＣＹＣ２０３６、Pichia pastoris等が挙げられる。

昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合は夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のＭＧ１細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh Five^TM 細胞、Mamestrabrassicae由来の細胞またはEstigmena acrea由来の細胞などが挙げられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N；ＢｍＮ細胞）などが挙げられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ATCC CRL1711）、Ｓｆ２１細胞（以上、Vaughn, J.L. et. al., In Vivo,13, p213-217 (1977)）などが用いられる。昆虫としては、例えば、カイコの幼虫等が挙げられる（前田ら、Nature，315，592 (1985)）。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記）、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記）、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ−２０、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３、ヒトＦＬ細胞などが挙げられる。

エシェリヒア属菌を形質転換するには、例えば「Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69，p2110 (1972) 」や「Gene，17，p107 (1982) 」等に記載の方法に従って行うことができる。バチルス属菌を形質転換するには、例えば「Molecular ＆ General Genetics，168，p111 (1979)」等に記載の方法に従って行うことができる。酵母を形質転換するには、例えば「Methods in Enzymology，194巻，p182-187 （1991）」、「Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75，p1929 (1978)」等に記載の方法に従って行うことができる。昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、例えば「Bio/Technology，6，p47-55（1988）」等に記載の方法に従って行うことができる。動物細胞を形質転換するには、例えば「細胞工学別冊８新細胞工学実験プロトコール，p263-267（1995）（秀潤社発行）」、「Virology，52巻，p456（1973）」等に記載の方法に従って行うことができる。

このようにして得られた形質転換体を培養することにより、本発明にかかる薬剤の原料を多量に得ることができる。宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。炭素源としては、例えばグルコース、デキストリン、可溶性澱粉またはショ糖などが挙げられ、窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕またはバレイショ抽出液などの無機または有機物質が挙げられ、無機物としては、例えば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウムまたは塩化マグネシウムなどが挙げられる。さらに、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは約５〜８が望ましい。

エシェリヒア属菌を培養する際の培地としては、例えばグルコースおよびカザミノ酸を含むＭ９培地（Miller， Journal of Experiments in Molecular Genetics，p431-433，Cold Spring Harbor Laboratory, New York（1972））が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率よく働かせるために、例えば３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地としては、例えばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Bostian, K. L. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77，p4505 (1980)）や０.５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Bitter, G. A. ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，p5330（1984））等が挙げられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、培地としてはGrace's Insect Medium（Grace, T.C.C., Nature，195，p788（1962））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地としては例えば約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science，122，p501 (1952)），ＤＭＥＭ培地（Virology，8，p396 (1959)），ＲＰＭＩ １６４０培地（The Journal of the American Medical Association, 199，p519 (1967)），１９９培地（Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，p1 (1950)）等が用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。

本発明においては、製剤化の際に本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子または前記遺伝子を有する発現ベクターを、リポソーム、マイクロカプセル、ミクロスフェア、サイトフェクチン、ＤＮＡ―タンパク質複合体またはバイオポリマー等の人工ベクターに内包させた形態で用いてもよい。中でも、リポソームまたはマイクロカプセルに内包することが好ましい。

ここで、リポソームとは内部に水層を有する脂質二重膜でできた閉鎖小胞体であり、その脂質二分子膜構造が生体膜に極めて近似していることが知られている。リポソームを製造するに際し使用されるリン脂質としては、例えばレシチン、リゾレシチン等のホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール等の酸性リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン等のスフィンゴリン脂質等が挙げられる。また、コレステロール等を添加することもできる。リポソームは、自体公知の方法に従って製造することができる。リポソームには、膜融合リポソーム、ＨＶＪ−膜融合リポソーム（Kaneda. Y et al., Biol. Chem, 264, p12126-12129 (1989)、Kato. K et al., Biol. Chem, 266, p3361-3364 (1991)、Tomita. N et al., Biochem. Biophys. Res., 186, p129-134 (1992)、Tomota. N et al., Cric. Res., 73, p898-905 (1993)）、陽イオン性リポソーム（特表2000−510151号公報、特表2000−516630号公報）等が知られている。センダウイルス（ＨＶＪ）と融合させたＨＶＪ−膜融合リポソームを用いることが本発明において好ましい。リポソームの表面にＨＶＪの糖タンパクを組み込み、または共有結合させてポリエチレングリコール等を添加すると、細胞への遺伝子導入効率が上昇する。マイクロカプセルはフィルムコートされた粒子であり、膜形成ポリマー誘導体、疎水性可塑剤、表面活性剤または／および潤滑剤窒素含有ポリマーの混合物からなるコーティング材料でコートされた粒子等で構成されるものが挙げられる。

本発明の皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤および肉芽増生促進剤（以下、これらを総称して「本発明の薬剤」という）は、上述してきた本発明のヒト組換えＨＧＦまたは本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を有効成分として含む。本発明の薬剤としては、（ａ）本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を有する発現ベクターを含有する皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤、（ｂ）本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を有する発現ベクターを含む形質転換体を含有する皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤、（ｃ）本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子または本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を有する発現ベクターを含むリポソームまたはマイクロカプセル等を含有する皮膚潰瘍予防治癒剤、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤も含まれる。

本発明の薬剤は、上記有効成分を通常は当該技術分野で用いられている製剤用添加剤とともに常法に従って製剤化することにより製造される。本発明の薬剤の剤形は特に限定されず、例えば錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、坐剤、注射剤、ペースト剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、ゲル状クリーム剤、ローション剤、乳剤、懸濁剤、湿布剤、硬膏剤、リニメント剤、エアゾール剤、シロップ剤、口腔剤、点眼剤または点鼻剤などが挙げられる。前記錠剤は、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠もしくはフィルムコーティング錠などのコーティングを施した錠剤、または二重錠や多層錠であってよい。

上記のような医薬製剤は、それ自体製剤学の分野で周知または慣用の方法に従って製造することが可能である。
錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤または顆粒剤などの固形製剤の製造には、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤または滑沢剤などを製剤用添加物として用いることができる。賦形剤としては、例えば乳糖、白糖もしくはブドウ糖等の糖類、デンプン等のデンプン類、結晶セルロース等が挙げられる。結合剤としては、例えばグルコースやマルチトールなどの糖類もしくは糖アルコール類、デンプンなどの多糖類、ゼラチンなどの天然高分子類、メチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリビニルピロリドンなどの合成高分子化合物等が挙げられる。崩壊剤としては、例えば澱粉、アルギン酸ソーダ、コーンスターチ、ヒドロキシプロピルスターチ、ポリビニルピロリドンまたはクロスカルメロースナトリウム等が挙げられる。滑沢剤としては、例えばステアリン酸塩、タルク、ホウ酸末またはポリエチレングリコール等が挙げられる。界面活性剤としては、例えば脂肪酸エステル等が挙げられる。

本発明の薬剤が坐剤の剤形を有する場合は、親油性基剤、水溶性基剤または乳剤性基剤に、上記有効成分、および所望により、例えば局所麻酔薬、抗ヒスタミン剤、局所収れん剤、サルファ剤、抗生物質、瘡傷治療薬、界面活性剤、ビタミン類、生薬エキス、胆汁酸類、防腐剤、賦形剤、吸収促進剤またはアミノ酸等の製剤用添加物を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。

本発明の薬剤が注射剤の剤形を有する場合は、水溶性溶剤または非水溶性溶剤などの溶剤に、上記有効成分、および所望により溶解補助剤、緩衝剤または無痛化剤等の製剤用添加剤等の製剤用添加物を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。前記注射剤は、殺菌され、かつ血液と等張であることが好ましく、血液と等張にするために食塩、ブドウ糖またはグリセリンなどを含有していてもよい。さらに、所望により着色料、保存料、香料、風味剤、甘味剤等を医薬製剤中に含有していてもよい。

本発明の薬剤が軟膏剤の剤形を有する場合、例えばワセリン、流動パラフィン、シリコンもしくは植物油などの油脂性基剤；例えば親水ワセリンもしくは精製ラノリンなどの乳剤性基剤；例えばマクロゴールなどの水溶性基剤などの基剤に、上記有効成分、および所望により例えば陰イオン型もしくは非イオン型界面活性剤などの乳化剤またはパラオキシ安息香酸エステル類などの保存剤等の製剤用添加剤を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。

本発明の薬剤がゲル剤の剤形を有する場合、水にゲル化剤（例えばカルボキシビニル重合体、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはアルギン酸プロピレングリコールエステル等）などを加えて得られる基剤に、上記有効成分、および所望により、例えば低級アルコール、中和剤、界面活性剤または吸収促進剤などの製剤用添加剤を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。

本発明の薬剤がクリーム剤の剤形を有する場合、例えば高級脂肪酸エステル類（例えばミリスチン酸エステル、パルミチン酸エステル、セバシン酸ジエチル、ラウリン酸ヘキシル、イソオクタン酸セチル等）、低級アルコール（例えばエタノール、イソプロパノール等）、炭水化物（例えば流動パラフィン、スクワラン等）、多価アルコール（例えばプロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール等）または高級アルコール（例えば２−ヘキシルデカノール、セタノール、２−オクチルドデカノール等）等を含む基剤に、上記有効成分、および所望により、例えば乳化剤、防腐剤、吸収促進剤またはかぶれ防止剤などの製剤用添加剤を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。
また、クリーム剤とゲル剤の中間の性質を有するゲル状クリーム剤とするためには、上記のクリーム剤にゲル化剤および中和剤を加えればよい。

本発明の薬剤が外用液剤の剤形を有する場合、溶剤に、上記有効成分、および所望により、例えば緩衝剤、安定化剤、防腐剤、ｐＨ調製剤、溶剤、溶解補助剤、着香剤、ゲル化剤、矯味剤または清涼化剤等などの製剤用添加剤を含有させることにより本発明の薬剤を製造することができる。前記溶剤としては、例えばグリセリン、プロピレングリコール、エタノール、イソプロパノール、ブチレングリコール、水、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ブドウ糖、イプシロンアミノカプロン酸、グリシン、グルタミン酸塩、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール類、カルボキシビニルポリマー類やセタノール、ステアリルアルコールなどの高級アルコール類、中鎖脂肪酸エステル類やミリスチン酸イソプロピルなどの脂肪酸エステル類、ステアリン酸などの高級脂肪酸、スクワラン、流動パラフィン、白色ワセリンまたは精製ラノリンなどを挙げることができる。
ここで、外用液剤としては、洗浄、注入、湿布、吸入、噴霧、浣腸、塗布、薬浴、清拭、消毒、点眼、洗眼、点耳または点鼻など外用に供する液体製剤が挙げられる。

本発明の外用液剤を通常噴射剤と共に用いることによりエアゾール剤を製造することができる。噴射剤としては通常エアゾールに用いられるジメチルエーテル、液化石油ガス、Ｎ_２ガス、亜酸化窒素ガス、ＣＯ_２ガス、代替フロンガス等を挙げることができる。噴射剤を用いないで圧縮空気を用いることもできる。また、これらの混合物を用いてもよい。

本発明の薬剤については、経口投与、非経口投与または局所投与など種々の投与方法の中から、その剤形に応じて投与方法を適宜選択すればよい。本発明の薬剤は皮下または筋肉内等に埋め込むこともできる。
本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子は、上述のように製剤化せずに、そのままでまたは摂取促進のための補助剤とともに直接生体に投与することもできる。かかる投与方法は公知の方法に従って行ってよいが、例えばＤＮＡを直接体内に導入するｉｎ ｖｉｖｏ法、または投与されるヒト等からある種の細胞を体外に取り出して当該細胞にヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を導入し、その形質転換細胞を体内に戻すｅｘ ｖｉｖｏ法がある（日経サイエンス、4月号、20-45（1994）、月間薬事、36、23-48（1994）、実験医学増刊、12、15（1994））。それぞれの方法において、本発明のヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を細胞に導入する方法としては、上述したようにアデノ随伴ウイルス、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター等の発現ベクターに遺伝子を含有させて該発現ベクター等を細胞に導入する遺伝子導入方法、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子銃で担体（金属粒子等）とともにＤＮＡを細胞内に導入する方法等（Wu et al.,J. Blol. Chem. 267, 963-967(1992)、Wu et al.,J. Blol. Chem. 263, 14621-14624, (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, 2726-2730 (1991)）が挙げられる。またリポソーム等を用いる場合には、リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、陽イオン性リポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法等が挙げられる。中でも、導入効率の観点から、アデノウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターを用いる遺伝子導入方法が望ましい。

また、本発明の皮膚潰瘍治療剤、血管新生促進剤および肉芽増生促進剤が外用剤として使用される場合、密封型創傷被覆材と共に使用されることが好ましい。密封型創傷被覆材は、創傷部での湿潤環境を提供し、かつ液体や細菌などを透過させずに酸素や水蒸気を透過できる被覆材が好ましい。このような密封型創傷被覆材としては、例えば、ハイドロコロイドドレッシング材〔例．デュオアクティブ（Ｃｏｎｖａｔｅｃ），コムフィール（コロプラスト），テガソーブ（３Ｍ），アブソキュア（日東メディカル）〕、キチンドレッシング材、アルギン酸塩ドレッシング材〔例．カルトスタット（Ｃｏｎｖａｔｅｃ），ソーブサン（アルケア），アルゴダーム（メディコン），クラビオＡＧ（クラレ）〕、ハイドロジェルドレッシング材〔例．ジェリパーム（竹虎），ニュージェル（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ），イントラサイト（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｈｅｗ），グラニュゲル（Ｃｏｎｖａｔｅｃ），クリアサイト（日本シグマックス）〕、ポリウレタンドレッシング材〔例．テガダーム（３Ｍ），オプサイトウンド（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｈｅｗ），ＩＶ３０００（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｎｅｗ），バイオクルーシブ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）〕、ハイドロポリマードレッシング材〔例．ティエール（Ｊｏｈｎｓｏｎ ＆ Ｊｏｈｎｓｏｎ）〕、ハイドロファイバードレッシング材またはポリウレタンフォーム〔例．ハイドロサイト（Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｎｅｐｈｅｗ）〕などのドレッシング材が好ましく挙げられる。これらドレッシング材は１若しくは２以上を組合わせて用いることもできる。また、ドレッシング材は皮膚貼付用粘着シート状、フィルム状などの形態であってもよい。

本発明の外用剤を密封型創傷被覆材と共に使用する形態としては、密封型創傷被覆材に本発明の外用剤を含有させてもよく、または本発明の外用剤を塗布などした後に密封型創傷被覆材で損傷部位を被覆する形態であってもよく、あるいは密封型創傷被覆材で損傷部位を被覆した後に、例えば注射器などで、本発明の外用剤を注入などする形態であってもよい。

密封型創傷被覆材に本発明の外用剤を含有させる場合、通常は密封型創傷被覆材の吸収材層（例えば、ヒドロゲル層など）に本発明の外用剤を含有させることが好ましい。この場合、ヒト組換えＨＧＦは、吸収材層の乾燥重量を基準として０．０１質量％〜５質量％、好ましくは０．１質量％〜３質量％の量添加されるのがよい。吸収材層にヒト組換えＨＧＦを含有させることにより、例えば滲出液によって吸収材層が濡れるにつれてヒト組換えＨＧＦの放出レベルを高めることができる。また、本発明の外用剤を塗布などした後に密封型創傷被覆材で損傷部位を被覆する場合は、本発明の外用剤が外部に漏出しないという利点がある。また、あるいは密封型創傷被覆材で損傷部位を被覆した後に、例えば注射器などで、創傷面または創傷被覆材の吸収剤層に本発明の外用剤を注入することにより、創傷面を外気にさらすことなく本発明の外用剤を投与できる。

本発明の薬剤の投与量および投与頻度は特に限定されず、治療すべき病態の種類、患者の年齢および体重、症状および疾患の重篤度などの種々の条件に応じて適宜選択することが可能である。例えば静脈投与の場合、その投与量はヒト組換えＨＧＦとして約２５０〜１０００μｇ／Ｋｇ／日、好ましくは約３００〜８００μｇ／Ｋｇ／日、特に好ましくは、約３００〜５５０μｇ／Ｋｇ／日であり、ヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子として約０．２〜４０，０００μｇ／Ｋｇ／日、好ましくは約２〜２，０００μｇ／Ｋｇ／日である。外用薬などによる局所投与の場合、有効成分の投与量は約０．００１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．０１〜３ｍｇ程度である。

本発明の薬剤は、血管新生促進剤または肉芽増生促進剤として使用することができる。さらに、血管新生促進作用または肉芽増生促進作用を利用して皮膚潰瘍予防治療をはじめ、消化性潰瘍治療、抗ガン、手術後の皮膚縫合、角膜手術などにおける医薬品的用途はもちろん、育毛剤または化粧品として用いることもできる。

以下に、実施例等を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではないことは言うまでもない。
（１）本発明のヒト組換えＨＧＦの作製
「Seki, T., Ihara, I., Sugimura, A., Shimonishi, M., Nishizawa, T., Asami, O., Hagiya, M., Nakamura, T. and Shimizu, S., “Isolation and expression of cDNA for different forms of hepatocyte growth factor from human leukocyte.”, Biochemical Biophysical Research Communications, 172, 321-327 (1990)」に記載の方法に従って、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを発現ベクターを導入したＣＨＯ細胞の培養上清から精製した。ヒト組換えＨＧＦの精製度はＳＤＳゲル電気泳動後のタンパク質染色から９８％以上であった。なお、前記第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦのアミノ酸配列を配列番号１に示す。

（２）皮膚潰瘍モデルの作成とヒト組換えＨＧＦの局所投与
糖尿病を自然発症する変異マウス（Ｃ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂ、１０週齢の雌）を実験に使用した。各マウスの背部に２カ所、パンチバイオプシー（皮膚生検採取用器具）を用いて直径６ｍｍの皮膚全層欠損潰瘍モデルを作成した。その後透明の半透過性被覆材（BIOCLUSIVE, Johnson & Johnson MEDICAL）にて潰瘍部を覆った。全層欠損処置を行った日を０日目として、２７ゲージの注射針を使用して被覆材の上から潰瘍部に（１）において調整したヒト組換えＨＧＦの溶液または比較例としての生理食塩水（２５μｌ）を潰瘍モデル作成直後から連日投与した。ヒト組換えＨＧＦの投与量は１０μｇ／潰瘍／日である。マウスを潰瘍モデル作成後、７日目、１４日目、２１日目ならびに２８日目に潰瘍部の解析を行った。

（３）組織学的解析ならびに血管新生の解析
血管の組織染色を行う場合、７０％エタノールにて固定パラフィン包埋した切片を０．１％トリプシンにて室温で１０分間処理し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）による洗浄後、３％過酸化水素を含むＰＢＳにて３０分間処理した。次に切片を抗ＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１抗体（Ｐｈａｒ Ｍｉｎｇｅｎ社の抗体を５０倍に希釈したもの）にて室温にて２時間インキュベートした後、ビオチン標識西洋ワサビパーオキシダーゼ結合抗ラットＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社の抗体を２００倍に希釈したもの）にて３０分間インキュベートした。ジアミノベンチジンと過酸化水素を含む基質溶液中で酵素抗体反応を検出し、検出後ヘマトキシリンにて細胞核を染色した。切片の顕微鏡観察（１００倍の視野）によって血管密度を定量した。

（４）肉芽組織の解析
肉芽組織を測定する場合、ヘマトキシリンならびにエオジン染色した組織切片を使用した。潰瘍部表面に対して垂直になるように調製した組織切片の画像をコンピューターに取り込み、肉芽組織をトレースした後、ＮＩＨ画像解析ソフトウエアーにて肉芽組織の面積を定量した。

（５）潰瘍部の閉鎖（治癒）率の決定
潰瘍部の閉鎖（治癒）を測定するため、潰瘍部片縁をスライドガラス上にトレースした後、ＣＣＤカメラにてコンピューターに取り込み、ＮＩＨ画像解析用ソフトウエアーを用いる画像解析によって潰瘍部の面積を定量した。潰瘍部の閉鎖率が０％は潰瘍部の閉鎖が認められない状態に相当し、１００％は潰瘍部の閉鎖が完了したことに相当している。

上記実験の結果を以下に示す。
（結果−１）ヒト組換えＨＧＦによる血管新生の促進
血管新生は皮膚潰瘍の治癒を含め組織修復において重要な役割を担っていることから、血管新生に対するヒト組換えＨＧＦの効果を解析した。皮膚潰瘍モデル作成７日後の組織切片を用いて免疫染色によって血管を検出した（図１Ａに血管を染色した組織像を示す）。その結果、対照（生理食塩水投与群）での血管密度は３３．４±６．０／ｍｍ^２であったのに対して、１０μｇ／潰瘍／日のヒト組換えＨＧＦ投与によって血管密度は５９．６±４．５／ｍｍ^２に促進された（図１Ｂ）。したがって、ヒト組換えＨＧＦは血管新生を促進することが明らかとなった。

（結果−２）ヒト組換えＨＧＦによる肉芽組織の増生促進
肉芽組織の増生に対するヒト組換えＨＧＦの効果を調べた（図２Ａ）。肉芽組織の増生は皮膚潰瘍モデル作成後７日目の組織切片を用いた画像解析によって測定した。その結果、皮膚潰瘍モデル作成後の組織を調べると、ヒト組換えＨＧＦの投与によって肉芽組織の増生が認められた（図２Ａ）。画像解析の結果、対照（生理食塩水投与群）においては肉芽組織の面積が１．３０±０．１５ｍｍ^２であったのに対して、ヒト組換えＨＧＦは容量依存的に肉芽組織の面積を促進し、１０μｇ／潰瘍／日のヒト組換えＨＧＦ投与によって肉芽組織の面積は対照の２．３倍に増大し、ヒト組換えＨＧＦは肉芽組織の増生を促進することが認められた（図２Ｂ）。

（結果−３）ヒト組換えＨＧＦによる潰瘍部の閉鎖（治癒）の促進
皮膚潰瘍部にヒト組換えＨＧＦ（１０μｇ／潰瘍／日）を連日５日間投与した。その結果、ヒト組換えＨＧＦによる容量依存的な潰瘍部の閉鎖（治癒）促進が２日後から認められた。潰瘍モデル作成１０日後、生理食塩水を投与した対照の皮膚においては、潰瘍閉鎖率（治癒率）が４１．１±６．８％であった。これに対して、１０μｇ／潰瘍／日のヒト組換えＨＧＦ投与によって潰瘍閉鎖率（治癒率）が８５．０±４．０％に促進された。また、対照（生理食塩水投与群）では潰瘍部の閉鎖（治癒）完了に２１日要したのに対して、１０μｇ／潰瘍／日のヒト組換えＨＧＦ投与によって１４日において潰瘍部の閉鎖（治癒）完了が認められた（図３）。

Claims (27)

1. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物。
2. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有することを特徴とする血管新生促進用組成物。
3. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物。
4. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦが次のいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載の組成物；
   （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
   （ｂ）配列表の配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質。
5. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有することを特徴とする皮膚潰瘍予防治癒用組成物。
6. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有することを特徴とする血管新生促進用組成物。
7. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を含有することを特徴とする肉芽増生促進用組成物。
8. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項５〜７のいずれかに記載の組成物；
   （ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
   （ｂ）配列表の配列番号２において、１乃至数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
   （ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；または
   （ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
9. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法。
10. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法。
11. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法。
12. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦが次のいずれかである請求項９〜１１のいずれかに記載の方法；
    （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
    （ｂ）配列表の配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質。
13. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子を哺乳動物に投与し、皮膚潰瘍を治療する方法。
14. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、血管新生を促進する方法。
15. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを哺乳動物に投与し、肉芽増生を促進する方法。
16. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項１３〜１５に記載の方法；
    （ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列表の配列番号２において、１乃至数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；または
    （ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
17. 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦの使用。
18. 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦの使用。
19. 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦの使用。
20. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦが次のいずれかである請求項１７〜１９のいずれかに記載の使用；
    （ａ）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質；または
    （ｂ）配列表の配列番号１において、１乃至数個のアミノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質。
21. 皮膚潰瘍を治療するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子の使用。
22. 血管新生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子の使用。
23. 肉芽増生を促進するための医薬を製造するための、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子の使用。
24. （２４） 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦをコードする遺伝子が、次のいずれかのＤＮＡからなる遺伝子である、請求項２１〜２３のいずれかに記載の使用；
    （ａ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列からなるＤＮＡ；
    （ｂ）配列表の配列番号２において、１乃至数個の塩基が欠失、置換または付加された塩基配列を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ；
    （ｃ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ；または
    （ｄ）配列表の配列番号２に記載の塩基配列を有するＤＮＡと少なくとも７０％以上の相同性を有し、かつＨＧＦ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列からなるＤＮＡ。
25. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有する密封型創傷被覆材。
26. 第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを含有する組成物と、皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆材とを有することを特徴とする皮膚潰瘍治療用キット。
27. 皮膚潰瘍部分からの滲出液を吸収しうる密封型創傷被覆材で創傷面を覆い、前記皮膚潰瘍部分を湿潤環境下に保ち、第一クリングルドメインにおいて５個のアミノ酸残基が欠損しているヒト組換えＨＧＦを、密封型創傷被覆材中または、密封型創傷被覆材と創傷面の間に置くことを特徴とする皮膚潰瘍の治療方法。