WO2002089831A1 - Medicaments preventifs et curatifs contre la nephrite - Google Patents

Medicaments preventifs et curatifs contre la nephrite Download PDF

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WO2002089831A1
WO2002089831A1 PCT/JP2001/009574 JP0109574W WO02089831A1 WO 2002089831 A1 WO2002089831 A1 WO 2002089831A1 JP 0109574 W JP0109574 W JP 0109574W WO 02089831 A1 WO02089831 A1 WO 02089831A1
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PCT/JP2001/009574
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Jun Wada
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Protegene Inc.
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    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a prophylactic / therapeutic agent for nephritis, a prophylactic / therapeutic agent for glomerular disease, an inhibitor of infiltration of leukocytes or CD8-positive cells into the glomerulus, and an apoptosis inducer for CD8-positive cells .
  • Landscape technology a prophylactic / therapeutic agent for nephritis, a prophylactic / therapeutic agent for glomerular disease, an inhibitor of infiltration of leukocytes or CD8-positive cells into the glomerulus, and an apoptosis inducer for CD8-positive cells .
  • the kidney is an organ that plays an important role in removing waste products in the living body and controlling water.
  • Various nephritis caused by bacteria, viruses, chemical substances and the like are known as diseases related to the kidney. Nephritis is, for example, depending on the type of glomerular lesion, membranous nephritis, membranous proliferative nephritis, endoproliferative nephritis, mesangial proliferative nephritis, crescentic nephritis, IgA nephritis, purpura nephritis, lupus nephritis Etc., and are classified into acute nephritis syndrome, rapidly progressive nephritis syndrome, chronic nephritis syndrome, nephrotic syndrome, etc. according to clinical characteristics. Many of these nephritis show symptoms such as proteinuria and hematuria
  • crescent-forming nephritis progresses rapidly and eventually leads to renal failure unless strong immunosuppressive therapy is started (Yang R-Y et al., Biochemistry 37: 4086-). 4092, 1998; Bolton WK, Semin. Nephrol. 16: 517-526, 1996).
  • Lesions similar to human crescentic nephritis are induced by a single administration of anti-glomerular basement membrane serum (anti-GBM antibody) to WKY rats.
  • anti-GBM antibody anti-glomerular basement membrane serum
  • crescent formation infiltration of CD8-positive cells and macrophages into the glomeruli is observed (Kawasaki K et al., Kidney Int.
  • mammalian animal lectins are sugar chain binding proteins and recognize specific sugar chain structures. Animal lectins are classified into four groups: C-type lectins, P-type lectins, pentraxins, and galectins. Sugar chains are important as components of many cell membrane proteins and extracellular matrix, and the interaction between lectins and their ligands is involved in various biological functions.
  • Galectin a type of animal lectin, specifically recognizes and binds specifically to iS-galactoside. To date, at least 10 galectins (galectins 1 to 10) have been identified and cloned (Perilo NL et al., J. Mol. Med. 76: 402-412, 1998; Wada I et al., J Biol. Chem. 272: 6078-6086, 1997; Wada J et al., J. CI in. Inves t. 99: 2452461, 1997). These galectins share structural homology and common recognition of ligands, but are involved in different physiological or pathological functions.
  • galectin-1 ameliorates experimental autoimmune diseases (Levi G et al., Eur. J. Immunol. 13: 500-507, 1983; Offner H et al., Neuroim bandaging 28: 177-184, 1990).
  • the present invention relates to a novel prophylactic / therapeutic agent for nephritis, a prophylactic / therapeutic agent for glomerular diseases, an inhibitor of leukocyte infiltration into glomeruli, an inhibitor of infiltration of CD8 + cells into glomeruli, and induction of apoptosis of CD8 + cells
  • the purpose is to provide an agent.
  • the preventive / therapeutic agent for nephritis the preventive / therapeutic agent for glomerular diseases, and the agent for inhibiting infiltration of leukocytes into the glomerulus provided by the present invention are provided by the following (a) or (b). It is characterized by containing the polypeptide shown as an active ingredient.
  • the agent for suppressing infiltration of CD8-positive cells into the glomerulus and the agent for inducing apoptosis of CD8-positive cells contain the polypeptide shown in the following (c) or (d) as an active ingredient: It is characterized. (c) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing one type of galectin gene family.
  • FIG. 2 is a diagram showing urinary protein excretion in NTS nephritis rats.
  • FIG. 3 shows the results of examination of a kidney specimen of an NTS nephritis rat by an optical microscope and an immunofluorescence microscope.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of quantification of cells infiltrating into the glomerulus.
  • FIG. 5 shows the results of an immunofluorescence microscopic examination of a kidney specimen of NTS nephritis rat (A) and the results of quantification of proliferating cells in the glomerulus (B).
  • FIG. 6 is a view showing the results of measurement of the level of peripheral blood anti-heron IgG antibody by ELISA.
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of in situ TUNEL assay of kidney tissue.
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of apoptotic assay of T cells isolated from spleen.
  • FIG. 9 is a diagram showing the distribution of the administered exogenous G9 in renal tissue.
  • the agent for inhibiting glomerular infiltration of blood cells contains a polypeptide represented by the following (a) or (b) as an active ingredient, and the agent for inhibiting glomerular infiltration of CD8-positive cells of the present invention and the inhibitor of CD8-positive cells:
  • the apoptosis-inducing agent contains the following polypeptide (c) or (d) as an active ingredient.
  • polypeptide (a) a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 3 (hereinafter sometimes referred to as “polypeptide (a)”)
  • polypeptide (b) an amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 3, wherein one or more amino acids are deleted, substituted or added, and the binding activity is specific to galactoside. (Hereinafter sometimes referred to as “polypeptide (b)”)
  • polypeptide (c) a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 (hereinafter sometimes referred to as “polypeptide (c)”)
  • polypeptide (d) a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, and) having a specific binding activity to 3-galactoside (Hereinafter, it may be referred to as “polypeptide (d)”.
  • the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is galectin-1 derived from mouse, and the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is galectin-13 derived from mouse; and SEQ ID NO: 3
  • the polypeptide having the above amino acid sequence is galectin-19 derived from mouse.
  • Galectin is a general term for proteins and glycoproteins having specific binding activity to] 3-galactoside.
  • galectin-11 exists as a homodimer (prototype) of a sugar chain binding domain (subunit of about 14 kD) consisting of one polypeptide chain (see Fig. 1), and other members belonging to this type.
  • Galectin-3 exists as a chimeric type having one sugar chain binding domain at the C-terminus and an hnRNP-like domain at the N-terminus (see FIG. 1).
  • Galectin-19 also exists as a tandem repeat type (tandem repeat type) having two sugar chain binding domains in the same peptide chain (see Fig. 1), and other galectins belonging to this type are And galectin-14, galectin-16, galectin-18, galectin-19 and the like.
  • the two glycan-binding domains in the galectins of the tandem repeat type, such as galectin-19, are not identical and have about 38% homology at the amino acid level.
  • the sugar chain binding domain includes, for example, a portion consisting of amino acid residues 1 to 135 in the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 (that is, the entire amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1); (2) a portion consisting of amino acid residues 130 to 262 in the polypeptide consisting of the amino acid sequence described in (2); and (15) to 146 or 192 in the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3. It is thought to be a portion consisting of the -322nd amino acid residue.
  • the portion consisting of the 30th to 90th amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is considered to be involved in the binding activity to j3-galactoside, and this portion is considered to be a part of each galectin. Well preserved in.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted or added in the polypeptide (a) or (c) is not particularly limited as long as the polypeptide has a specific binding activity to 3-galactoside.
  • One or more, preferably one or several, and the specific range is preferably The number is preferably 1 to 25, and more preferably 1 to 10.
  • the amino acid sequence of the polypeptide (b) has at least 25% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more homology with the amino acid sequence of the polypeptide (a).
  • the amino acid sequence of (d) has homology of at least 25% or more, preferably 50% or more, more preferably 80% or more with the amino acid sequence of polypeptide (c).
  • the position of the amino acid to be deleted, substituted or added in the polypeptide (a) or (c) is not particularly limited as long as the polypeptide has a specific binding activity to 3-galactoside.
  • the position of the amino acid to be deleted, substituted or added in the polypeptide (a) or (c) may be, for example, a portion other than the sugar chain binding domain.
  • “having a specific binding activity to / 3-galactoside” means that it has a binding activity to ⁇ -galactoside (for example, lactose (glucose-1) 3-D-galactoside). It means that it has no binding activity to sugar chain structures other than // 3-galactoside. Examples of the sugar chain structure other than / 3-galactoside include glucose- 1,4-dalcose, darcos- ⁇ 1,2,1-fructose, and the like.
  • galactosid is a generic term for those in which the hemiacetal hydroxyl group of galactose is ether-bonded to other compounds.
  • Examples of the true substance include oligosaccharides such as lactose-melibiose and galactose. Examples include glycosides and glycolipids containing toose. Galactoside is divided into ⁇ ; and] 3 types depending on the bond coordination, and
  • Polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Tide has specific binding activity to iS-galactoside and can have the same structure as galectin-11. That is, it forms a homodimer of a sugar chain binding domain consisting of one polypeptide chain. Preferably, it has the same biological function as galectin-11.
  • the biological functions of galectin-11 include, for example, cell adhesion, cell proliferation, regulation of apoptosis of thymocytes and peripherally activated T cells, and the like.
  • a polypeptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 has specific binding activity to] 3_galactoside, It preferably has a structure similar to that of galectin-13, that is, it preferably has one sugar chain binding domain at the C-terminus and an hnRNP-like domain at the N-terminus, and has a biological function similar to that of galectin-13. It is more preferable to have one.
  • galectin_3 The biological functions of galectin_3 include, for example, cell adhesion, inflammation (promotes IL-11 production in monocytes and active oxygen from neutrophils), mRNA splicing, human T-cell leukemia Apoptosis inhibitory effect of cell line Uurkat E6-1).
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 has specific binding activity to] 3-galactoside and Can have the same structure as galectin-19, that is, it preferably has two sugar chain binding domains in the same peptide chain, and has the same biological function as galectin-19 Is more preferable.
  • the biological functions of galectin-19 include, for example, eosinophil chemotaxis, differentiation of thymic cells and induction of apoptosis of thymocytes, induction of apoptosis of peripherally activated T cells, and the like.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 2 or 3, and which has a specific binding activity to 0-galactoside.
  • polypeptides in which mutations such as deletion, substitution, or addition have been introduced into mouse-derived galectin-11, galectin-13, or galectin-9, as well as deletions, substitutions, or additions.
  • galectin-11, galectin-13 or galectin-19 derived from mammals such as humans and rats, and artificial deletions, substitutions, and additions to these galectins.
  • Polypeptides into which a mutation has been introduced are also included.
  • the amino acid sequences of human galectins 11, 3, and 9 are shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the amino acid sequences of galectin-1, 3, and 9 derived from the rat are shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, and SEQ ID NO: 9, respectively.
  • the “polypeptide” includes both polypeptides having a sugar chain added and polypeptides having no sugar chain added.
  • the type, position, etc. of the sugar chains added to the polypeptide vary depending on the type of host cell used in the production of the polypeptide. Polypeptides obtained using cells are also included.
  • the “polypeptide” also includes a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • polypeptides (a), (b), (c) and (d) can be produced by a conventional method using DNA encoding each polypeptide.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 can be obtained by using a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12, respectively. Manufacture it can.
  • DNA encoding the polypeptide (a) or (c) can be obtained, for example, according to the following (1) to (3).
  • Mouse-derived mRNA is prepared according to a conventional method. For example, a mouse embryonic kidney tissue or cell is treated with a guanidine reagent, a phenol reagent, or the like to obtain total RNA, and then poly-U-sepharose using oligo dT-cellulose / sepharose 2B as a carrier. Poly (A +) RNA (mRNA) is obtained by affinity ram method, batch method, etc. Using the obtained mRNA as type III, a single-stranded cDNA is synthesized using an oligo dT primer and a reverse transcriptase, and then a double-stranded cDNA is synthesized from the single-stranded cDNA.
  • the double-stranded cDNA thus obtained is inserted into an appropriate cloning vector to prepare a recombinant vector.
  • a host cell such as Escherichia coli is transformed with the obtained recombinant vector, and a transformant is selected by using tetracycline resistance and ampicillin resistance as indices to obtain a cDNA library.
  • the cloning vector for preparing the cDNA library may be any one capable of autonomous replication in a host cell, and for example, a phage vector, a plasmid vector, and the like can be used.
  • a host cell for example, Escherichia coli or the like can be used.
  • Transformation of host cells such as Escherichia coli is performed by the method of Hanahan (Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166: 557-580 (1983)), that is, prepared by coexisting calcium chloride, magnesium chloride or rubidium chloride. It can be carried out by a method such as adding a recombinant vector to the obtained recombinant cells.
  • a drug resistance gene such as tetracycline or ampicillin should be contained.
  • the cDNA library is prepared using a commercially available kit, for example, SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Gibco BRL), ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene), etc. Can do it.
  • a primer is synthesized based on the amino acid sequence of a known galectin, and is used to perform a polymerase chain reaction (PCR) to obtain a PCR amplified fragment.
  • the PCR amplified fragment may be subcloned using an appropriate plasmid vector.
  • Primers used for PCR include, for example, 5'-gcttcaatcatggcctgt-3 '(sense primer-1) and 5--ggc tggc t tcac t caaaggc- for DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11 includes, for example, b-gcacagagagc t acccagg-3 (sense framer-), 3 ⁇ 4-c ttctggcttagatcatg-3 '(antisense Primers 1) and 5'-gcaitggUcccc tgagatag-3 (sense primer 1), 5 -cgt tccagagaccggatcc-3 'antisense primer ") for DNA consisting of the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 12. Can be used.
  • the desired DNA can be obtained by performing colony hybridization or plaque hybridization on the cDNA library using the PCR amplified fragment as a probe.
  • the PCR amplified fragment isotope e.g. 32 P, 3 5 S
  • bi Ochin those labeled with digoxigenin or the like can be used.
  • a clone containing the desired DNA can also be obtained by expression screening such as immunoscreening using an antibody.
  • the nucleotide sequence of the obtained DNA can be obtained by digesting the DNA fragment as it is or after cutting it with an appropriate restriction enzyme or the like, and incorporating the DNA fragment into a vector by a conventional method. Although it can be determined using a modification method or dideoxynucleotide chain termination method, it is usually determined using a base sequence analyzer such as 373A DNA Sequencer (manufactured by Perkin Elmer).
  • the DNA encoding the polypeptide (a) (specifically, the DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, or SEQ ID NO: 12), and the polypeptide ( c) can be obtained (specifically, a DNA comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12).
  • the DNA encoding the polypeptide (a) is not limited to the DNA consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO: 12, but the DNA encoding the polypeptide (a) As long as it encodes, DNA consisting of other nucleotide sequences is also included. The same applies to the DNA encoding the polypeptide (c). Such DNA can be obtained by chemical synthesis according to its base sequence.
  • DNA synthesizers For chemical synthesis of DNA, commercially available DNA synthesizers, such as a DNA synthesizer using the thiophosphite method (manufactured by Shimadzu Corporation) and a DNA synthesizer using the phosphoramidite method (manufactured by Perkin Elmer Inc.) ) Can be used.
  • the DNA encoding the polypeptide (b) or (d) may be, for example, a DNA encoding the polypeptide (a) or (c) from a cDNA library derived from a mammal such as mouse, rat, or human. It can be obtained by screening for DNA that hybridizes under stringent conditions. “A DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA encoding the polypeptide (a) or (c)” is defined as a colony using the DNA encoding the polypeptide (a) or (c) as a probe.
  • DNA obtained by the hybridization method, the plaque hybridization method, the Southern hybridization method, etc. for example, hybridization using a filter immobilized with DNA derived from colonies or plaques After that, the conditions of 2 XSSC, 0.1% SDS, 42 ° C, preferably 1 XSS (: 0.1% SDS, 4 C, more preferably 0.1 XSSC, 0.1% SDS, 42 Includes DNA obtained by washing the filter under conditions.
  • DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA encoding the polypeptide (a) or (c) include at least the DNA encoding the polypeptide (a) or (c), respectively.
  • the DNA encoding the polypeptide (b) or (d) can be artificially added to the DNA encoding the polypeptide (a) or (c), for example, by site-directed mutagenesis. It can be obtained by introducing a mutation. Mutations can be introduced using, for example, a mutagenesis kit such as Mutant-K (TAKARA), Mutant-G (TAKARA), or TAKARA's LA PCR in vitro Mutagenesis series kit. Can do it.
  • DNA whose base sequence has already been determined can also be obtained by chemical synthesis as described above.
  • polypeptides (a), (b), (c) and (d) encode the respective polypeptides according to, for example, the following (1) to (3) It can be produced by expressing DNA in a host cell.
  • DNA fragment of an appropriate length containing the coding region of the polypeptide of interest is prepared.
  • DNA is prepared by substituting a base so that the base sequence of the coding region of the target polypeptide becomes an optimal codon for expression in a host cell.
  • a recombinant vector is prepared by inserting the above-mentioned DNA fragment downstream of the promoter of an appropriate expression vector, and the desired polypeptide can be produced by introducing the recombinant vector into an appropriate host cell.
  • a transformant can be obtained.
  • any of prokaryotic cells, yeast, animal cells, insect cells, plant cells, etc. may be used as long as the target gene can be expressed.
  • an animal individual or a plant individual can also be used.
  • the expression vector is not particularly limited as long as it is capable of autonomous replication in a host cell.
  • a plasmid vector, a phage vector, and the like can be used.
  • Specific examples of expression vectors include pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (Boehringer-Mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), PSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE -8 (QIAGEN), pBluescript II SK + (Stratagene), pBluescript II SK (-) (Stratagene), pGEX (Pharmacia), pET system (Novagen), pSupex, pUBHO, pTP5, ⁇ C194, pTrxFus (product of Invitrogen), pMAL-c2 (product of New England Biolabs), PSTV28 (product of Takara Shuzo), PUC118 (product of Takara Shuzo) and the like
  • genus Escherichia such as Escherichia coli or Bacillus' Bacill Bacteria belonging to the genus Bacillus, such as P. us subtilis, Pseudomonas' putida, and Rhizobium meliloti, such as Rhizobium meliloti.
  • Promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in bacteria such as Escherichia coli, for example, trp promoter evening one, lac promoter one, P L promoter, the P R promoter evening one such Escherichia coli or phage, etc.
  • Derived promoters can be used.
  • artificially designed and modified promoters such as the tac promoter, the lacT7 promoter, and the let I promoter can also be used.
  • the method for introducing the recombinant vector into bacteria is not particularly limited as long as it can introduce DNA into bacteria.
  • a method using calcium ions when yeast capable of using the electroporation method is used as a host cell, Saccha romyces cerevisiae, Schizosaccharomyces' Honbe (Scizosaccar omyces pombe), Pichia pastoris and the like can be used as host cells.
  • the promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in yeast.
  • gall promoter gall 0 promoter, heat shock protein promoter, MFal promoter, PH05 promoter, PGK Promoters, GAP promoters, ADH promoters, A0X1 promoters and the like can be used.
  • the method for introducing a recombinant vector into yeast is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing DNA into yeast.
  • the method of electroporation Becker, DM et al. Methods. Enzymol., 194: 182-187 (1990)
  • the spheroplast method Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 75: 1929-1933 (1978)
  • the lithium acetate method Itoh, ⁇ ⁇ , J. Bacteriol., 153: 163-168 (1983)).
  • monkey cells such as COS-7, Vero, chick hamster ovary cells (CH0 cells), mouse L cells, rat GH3, and human FL cells can be used as host cells.
  • the promoter in this case is not particularly limited as long as it can be expressed in animal cells.For example, SRa promoter overnight, SV40 promoter, LTR (Long Terminal Repeat) motor, CMV promoter, human cytomegalo An early gene promoter of the virus can be used.
  • the method for introducing the recombinant vector into animal cells is not particularly limited, as long as it is a method capable of introducing DNA into animal cells.
  • an electroporation method, a calcium phosphate method, a Lipofection method and the like can be used.
  • an insect cell is used as a host, an ovarian cell of Spodoptera frugiperda, an ovarian cell of Trichoplusia ni, a cultured cell derived from a silkworm ovary, or the like can be used as a host cell.
  • Spodoptera f rugiperda ovary cells such as Sf9 and Sf21, Trichoplusia ni ovary cells such as High 5, BTI-TN-5B1-4 (manufactured by Invitrogen), etc., Bombyx mori N4 etc. as cultured cells derived from silkworm ovaries Is mentioned.
  • the method for introducing the recombinant vector into insect cells is not particularly limited as long as DNA can be introduced into the insect cells.
  • a calcium phosphate method, a riboflex method, an electoporation method and the like can be used.
  • a transformant into which the recombinant vector into which the DNA encoding the polypeptide of interest has been incorporated is introduced is cultured according to a conventional culture method.
  • the transformant can be cultured according to the usual method used for culturing host cells.
  • a culture medium for culturing a transformant obtained by using a microorganism such as Escherichia coli or yeast as a host cell contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be used by the microorganism to efficiently culture the transformant.
  • a natural medium or a synthetic medium may be used as long as the medium can be used.
  • the carbon source carbohydrates such as glucose, fructose, sucrose and starch, organic acids such as acetic acid and propionic acid, and alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • the nitrogen source use ammonium salts of inorganic or organic acids such as ammonium, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium phosphate, peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casein hydrolyzate, etc. it can.
  • potassium (II) phosphate potassium (II) phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, calcium carbonate and the like can be used.
  • Culture of the transformant is performed under aerobic conditions such as shaking culture or aeration and stirring culture.
  • the culture temperature is usually 37 to 39:
  • the culture time is usually 8 to 12 hours, and the pH is maintained at 7.2 to 7.4 during the culture period.
  • the pH can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • an antibiotic such as ampicillin or tetracycline may be added to the medium as needed.
  • Sir may be added to the medium.
  • culturing a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter culturing a microorganism transformed with isopropyl 1 / 3-D-thiogalactopyranoside or the like using an expression vector using the trp promoter.
  • indole acrylic acid or the like may be added to the medium.
  • Culture media for transformants obtained using animal cells as host cells include commonly used RPMI 1640 medium, Eagle's MEM medium, DMEM medium, or a medium obtained by adding fetal bovine serum or the like to such a medium. Can be used. Cultivation of transformants, 5% C 0 2 presence usually performed 2-4 days at 37 to 42 ° C. At the time of culturing, an antibiotic such as kanamycin, benicillin, streptomycin or the like may be added to the medium as needed.
  • TNM-FH medium Pulsen
  • Sf-900 II SFM medium Gibco BRL
  • Culture of a transformant that can use ExCelU00, ExCell405 (manufactured by JR Biosciences) or the like is usually performed at 27 ° C. for 12 to 24 hours.
  • an antibiotic such as genomicin may be added to the medium as needed.
  • the polypeptide of interest can also be expressed as a secreted protein or a fusion protein.
  • the proteins to be fused include, for example, ⁇ -galactosidase, protein ⁇ , the IgG-binding region of protein ⁇ , chloramphenicol acetyltransferase, poly (Arg), poly (Glu), protein G, Examples include maltose binding protein, daltathione S-transferase, polyhistidine chain (His-tag), S peptide, DNA binding protein domain, Tac antigen, thioredoxin, green 'fluorescent protein', and the like.
  • the target polypeptide is obtained by collecting the target polypeptide from the culture of the transformant.
  • the term “culture” includes any of culture supernatant, cultured cells, cultured cells, and disrupted cells or cells.
  • the cells in the culture are collected by centrifuging the culture, and the cells are washed, and then the cells are disrupted. Extract the desired polypeptide.
  • the culture supernatant is used as it is, or cells or cells are removed from the culture supernatant by centrifugation or the like.
  • the polypeptide (a), (b), (c) or (d) thus obtained can be obtained by a solvent extraction method, a salting-out method using ammonium sulfate, a desalting method, a precipitation method using an organic solvent, getylaminoethyl (DEAE) — It can be purified by Sepharose, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, affinity chromatography, etc.
  • polypeptide (a), (b), (c) or (d) may be prepared based on its amino acid sequence by the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), the tBoc method (t-butylo method) It can also be produced by a chemical synthesis method such as the (xoxycarbonyl method). In this case, a commercially available peptide synthesizer can be used.
  • the polypeptide (a) or (b) can be administered alone as a prophylactic / therapeutic agent for nephritis, a prophylactic / therapeutic agent for glomerular diseases, or an inhibitor of leukocyte infiltration into the glomerulus, but usually it is a pharmaceutical.
  • the polypeptide (c) or (d) can also be administered alone as an inhibitor of glomerular infiltration of CD8-positive cells or as an inducer of apoptosis of CD8-positive cells, It is formulated and used according to a conventional method together with one or more pharmaceutically acceptable carriers and / or additives.
  • the amount of the active ingredient in the formulation is usually about 0.1 to 5% by weight, preferably about 1 to 5% by weight.
  • Pharmaceutically acceptable carriers include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone, potassium oxyvinyl polymer, sodium alginate, water-soluble dextran, sodium carboxymethyl starch, Cutin, xanthan gum, gum arabic, casein, gelatin, agar, glycerin, propylene glycol, polyethylene glycol, petrolatum, paraffin, stearyl alcohol, stearic acid, human serum albumin, mannitol, sorbitol, lactose, etc. .
  • additives used in formulation include fillers, extenders, binders, humectants, disintegrants, surfactants, lubricants, excipients, stabilizers, bactericides, and buffers.
  • These additives are appropriately selected according to the dosage unit form of the preparation and the like.
  • components used in ordinary protein preparations for example, stabilizers, bactericides, buffers, tonicity agents, chelating agents, pH regulators, surfactants, and the like are preferably selected. .
  • Stabilizers human serum albumin; L-amino acids such as glycine, cysteine and glutamic acid; monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose; sugar alcohols such as mannitol, inositol and xylitol; Sugar, maltose, disaccharides such as lactose, dextran, Saccharides such as polysaccharides such as droxypropyl starch, chondroitin sulfate, and hyaluronic acid and derivatives thereof; celluloses such as methylcellulose, ethylcellulose, hydroxyethylcellulose, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, and carboxymethylcellulose sodium Derivatives and the like.
  • L-amino acids such as glycine, cysteine and glutamic acid
  • monosaccharides such as glucose, mannose, galactose and fructose
  • sugar alcohols such as
  • Surfactants such as polyoxyethylene dalicol sorbitan alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether type, sorbitan monoethyl ester type and fatty acid dariceride type.
  • Buffer boric acid, phosphoric acid, acetic acid, citric acid, ⁇ -aminocaproic acid, glutamic acid and salts thereof (eg, alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and alkaline earth metal salts) .
  • alkali metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt and alkaline earth metal salts
  • Tonicity agents sodium chloride, potassium chloride, sugars, glycerin, etc.
  • Chelating agents sodium edetate, citric acid, etc.
  • the preventive / therapeutic agent for nephritis, the preventive / therapeutic agent for glomerular disease, or the agent for inhibiting leukocyte infiltration into the glomerulus of the present invention contains either the polypeptide (a) or (b) as an active ingredient. Or both may be contained as active ingredients.
  • the agent for inhibiting glomerular infiltration of CD8-positive cells or the agent for inducing apoptosis of CD8-positive cells of the present invention also contains either polypeptide (c) or (d) as an active ingredient. May be contained, or both may be contained as active ingredients.
  • the polypeptide (a), (b), (c) or (d) may be a pharmaceutically acceptable salt thereof, and specific examples thereof include sodium, potassium, lithium, calcium, magnesium, and barium. And non-toxic alkali metal salts such as ammonium, alkaline earth metal salts, ammonium salts and the like.
  • the above salts include a polypeptide and a suitable organic Non-toxic acid addition salts formed by reaction with acids or inorganic acids are also included.
  • non-toxic acid addition salts include, for example, hydrochloride, hydrochloride, hydrobromide, sulfate, bisulfate, acetate, oxalate, valerate, oleate, laurate , Borate, benzoate, lactate, phosphate, P-toluenesulfonate (tosylate), citrate, maleate, fumarate, succinate, tartrate, sulfonate, glycolic acid
  • the administration route and dosage form including salts, maleate, ascorbate, benzenesulfonate and the like are desirably used in the most effective manner for treatment.
  • Administration routes include, for example, oral administration, buccal, parenteral administration such as respiratory tract, rectum, subcutaneous, intramuscular and intravenous administration.
  • Dosage forms include, for example, sprays and capsules.
  • Suitable formulations for oral administration include, for example, emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules Agents and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include water, sugars such as sucrose, sorbitol and fructose, dalicols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p — It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters, flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • sugars such as sucrose, sorbitol and fructose
  • dalicols such as polyethylene glycol and propylene glycol
  • oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil
  • p p
  • preservatives such as hydroxybenzoic acid esters, flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate, talc, polyvinyl alcohol It can be produced by using a binder such as hydroxypropylcellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Formulations suitable for parenteral administration include, for example, injections, suppositories, sprays and the like.
  • injections can be prepared using a salt solution, a glucose solution, or a mixture thereof as a carrier.
  • Suppositories can be prepared using cocoa butter, hydrogenated fat, carboxylic acid or the like as a carrier.
  • Propellants can be manufactured using lactose, glycerin, etc. as carriers that do not irritate the recipient's oral and respiratory tract mucous membranes and facilitate the absorption by dispersing the active ingredient as fine particles. It can be made into dry powders.
  • the dosage and frequency of administration vary depending on the desired therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but the dosage can be appropriately selected from the usual range of 0.01 to lmg / kg per adult per day.
  • the frequency of administration can be appropriately selected from the range of once to several times a day.
  • the agent for preventing or treating nephritis according to the present invention can prevent and / or treat nephritis.
  • the types of nephritis that are targeted for prevention and treatment are not particularly limited.Symptoms such as proteinuria, glomerular hypertrophy, excessive cells in the glomerulus, crescent formation, infiltration of leukocytes into the glomerulus, It can be suitably used for nephritis associated with glomerular lesions such as infiltration of CD8-positive cells into the glomerulus and deposition of fiprinogen in the glomerulus.
  • nephritis examples include glomerulonephritis, for example, crescent-forming nephritis, lupus nephritis, IgA nephropathy, and membranous proliferative glomerulonephritis.
  • the preventive / therapeutic agent for glomerular diseases of the present invention can prevent and / or treat glomerular diseases.
  • the types of glomerular diseases targeted for prevention and treatment are not particularly limited, but include glomerular hypertrophy, hypertrophy of glomeruli, crescent formation, infiltration of leukocytes into glomeruli, and thread of CD8-positive cells. It can be suitably used for glomerular diseases showing lesions such as glomerular infiltration and fibrinogen deposition in glomeruli.
  • Such glomerular diseases include glomerulonephritis, for example Examples include crescent-forming nephritis, lupus nephritis, IgA nephropathy, and membranous proliferative glomerulonephritis.
  • the inhibitor of leukocyte infiltration into glomeruli of the present invention can suppress or inhibit leukocyte infiltration into glomeruli.
  • leukocytes targeted for suppression of glomerular infiltration include monocytes, macrophages, T cells, and natural killer cells.In particular, in order to suppress the infiltration of macrophages into the glomeruli, It can be suitably used.
  • Suppressing or inhibiting leukocyte infiltration into the glomerulus may prevent diseases caused by leukocyte infiltration into the glomerulus, such as glomerular nephritis (eg, crescentic nephritis). Can be prevented and / or treated.
  • the agent for inhibiting infiltration of CD8-positive cells into glomeruli of the present invention can suppress or inhibit infiltration of CD8-positive cells into glomeruli.
  • the type of CD8-positive cells targeted for suppression of glomerular infiltration is not particularly limited, but examples include CD8-positive cytotoxic T cells.
  • Diseases caused by infiltration of CD8-positive cells into the glomerulus by suppressing or inhibiting the infiltration of CD8-positive cells into the glomeruli, such as glomerulonephritis (eg, crescentic nephritis) Can prevent and Z or treat glomerular diseases.
  • the agent for inducing apoptosis of CD8-positive cells of the present invention can selectively induce apoptosis in CD8-positive cells without inducing apoptosis in CD4-positive cells.
  • the type of CD8-positive cells to be subjected to apoptosis induction is not particularly limited, and examples include CD8-positive cytotoxic T cells.
  • diseases caused by CD8-positive cells for example, glomerular diseases such as glomerulonephritis (eg, crescentic nephritis) can be prevented and / or treated.
  • NTS heron anti-glomerular basement membrane serum
  • the glomerular basement membrane (GBM s) was isolated from a 4-week-old female WKY rat (body weight: about 100 g) and used as an antigen for an anti-glomerular basement membrane antibody.
  • the WKY rat used was purchased from Charles River Japan (At sugi, Kanagawa, Japan).
  • Emulsion was prepared by mixing equal amounts of homogenate and Freund's complete adjuvant (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA), and the emulsion was subcutaneously injected twice a month into Japanese egrets for 2 months. Three weeks after the last administration, blood was collected from a heron to separate antiserum. The antiserum was immobilized at 56 ° C for 30 minutes, adsorbed with fresh erythrocytes, and then used to induce nephritis in WKY rats.
  • G1, G3, G9 mouse galectin-11,13,19 recombinant protein
  • Recombinant galectin-11,13,19 (hereinafter referred to as G1, G3, G9) can be prepared by a known method ( Based on Wada J. et al., J. Biol. Chem. 272: 6078-6086, 1997; Wada J. et al., J. CI in. Inves 99: 2452-2461, 1997), the pTrcHis2 vector (Invitrogen, San Diego, CA, USA). These recombinant proteins are produced as fusion proteins having c-myc epitope and (His) 6 at the C-terminus.
  • a vector containing the G1 gene (SEQ ID NO: 10), the G3 gene (SEQ ID NO: 11), and the G9 gene (SEQ ID NO: 12) (hereinafter referred to as “pTrcHis2 / G1J, "pTrcHis2 / G3", “pTrcHis2 / G9”. ) was transformed into a T0P10 vector host (Invitrogen). Transformed bacterial colonies were cultured in Luria-Bertani's medium and protein synthesis was induced by adding 1 imo 1 / LCD isopropy 1-j3-Dtiogalac topyranoside (IPTG).
  • IPTG 1 imo 1 / LCD isopropy 1-j3-Dtiogalac topyranoside
  • the bacterium was lysed with (20 thigh ol / L Tris (pH 7.4), 5 mmol / L ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 150 thigh ol / L sodium chloride, 1 thigh ol / L DTT). The lysate was centrifuged at 4 ° C for 30 minutes at 20 OOOXg.
  • the centrifuged supernatant was added to a 10 mL lactosy Sepharose column (Sigma, ST. Louis, MO, USA). After washing the unbound protein, the fusion protein was eluted with Tris-DTT buffer containing 200 IMIO1 / L Lactose. The eluted fraction was dialyzed against phosphate buffer (PBS) containing 1 mmol / L DTT and stored at -70 ° C. The sample was analyzed by 12.5% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfe-polyacrylamide gel electrophoresis). As a result, a single band was obtained for all galectins and their molecular weights were consistent. That is, the molecular weight of G1 was 17 kDa, that of G3 was 37 kDa, and that of G9 was 39 kDa, which corresponded to the molecular weights predicted from the number of constituent amino acids.
  • Urine was collected and 24-hour urine protein excretion was measured.
  • WKY rats were sacrificed on the 14th day, and their kidney tissues were used for observation by light microscopy, fluorescent antibody method, in situ TUNEL method for examining apoptosis (in situ terminal deoxy transf erase (TdT ) -mediated uridine triphosphate (dUTP) nick end labeling react ion).
  • TdT in situ terminal deoxy transf erase
  • dUTP uridine triphosphate
  • NTS nephritis 20
  • 1 bandol / L DTT, DEX, Gl, G3 or PBS containing G9 was administered.
  • CD8-positive cells in the glomeruli appeared on day 3 and then gradually decreased until day U, and were killed on day 8.
  • Tissues were fixed in 10% formaldehyde, embedded in paraffin, and sliced into 3 thickness sections. The sections were stained with PAS (periodic acid-Schif f). The diameter of 50 glomeruli was measured in each animal, and the total number of glomerular cells and the number of crescents with crescents were counted.
  • PAS periodic acid-Schif f
  • the infiltration of leukocytes into glomeruli was examined by enzyme-linked immunosorbent assay.
  • the enzyme antibody method was performed using an immunoperoxidase ABC kit (Vector laboratories, Burlingame, CA, USA).
  • cryostat sections were prepared using mouse monoclonal antibodies against rat leukocytes (OX1), mouse monoclonal antibodies against rat monocytes / macrophages (ED1), mouse monoclonal antibodies against rat CD4 or CD8 (Serotec). ) For 60 minutes. Next, the cells were reacted with bismuth-labeled anti-mouse IgG at 22 ° C. for 30 minutes, and then reacted with 3,3-diamino-benzidine and hydrogen peroxide. Brown By counting the number of cells having the above reaction product, the number of OX1, ED1, CD4, and CD8 positive cells in glomeruli was counted. Twenty glomeruli were observed per rat, and the average number of positive cells was determined.
  • OX1 mouse monoclonal antibodies against rat leukocytes
  • ED1 mouse monoclonal antibodies against rat monocytes / macrophages
  • CD4 or CD8 mouse monoclonal antibodies against rat CD4 or CD8 (S
  • FITC-dUPT In Situ Cell Death Detection kit
  • a 4 zm thick cryostat section was prepared and fixed at 22 ° C for 20 minutes using 4% paraformaldehyde. Sections were treated with 0.1% Triton X-100, 0.1% sodium citrate for 2 minutes on ice. Further, the TUNEL reaction mixture was treated in a dark place under humidified conditions for 60 minutes. Fifty glomeruli were examined for each WKY rat, and the number of apoptotic cells per glomerulus was counted.
  • the antibody titer of anti-Egret IgG antibody in the rat serum was examined by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay).
  • Mononuclear cells isolated from the spleen were subjected to CD4, CD8 staining, and TUNEL reaction.
  • the spleen was homogenized and suspended in RPMI-1640 (Gibco BRL, Grand Island, Y, USA). Then, it was overlaid on Fico 11-Paque containing no endotoxin (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) and centrifuged at 2000 rpm for 20 minutes. Mononuclear cells were collected, washed twice with PBS at 4 ° C., and adjusted to 2 ⁇ 10 7 eel ls / mL.
  • TUNEL reaction mixture containing fluoroscein-dUTP and TdT
  • FACS Caribur 3A Beeton Dickinson, Mountain View, CA, US
  • the secondary antibody is already adsorbed on serum proteins of other animals and has no cross-reactivity to other species IgG. Since only the administered exogenous fusion protein has myc at the C-terminus and no myc epitope in endogenous galectin-19, the two can be distinguished by anti-myc antibody.
  • Figure 2 shows the results of quantification of urinary protein excretion in NTS nephritis rats.
  • ( ⁇ ) in A, B, and CD shows the amount of urinary protein excreted when NTS-nephritis rats were administered PBS containing DTT
  • (A) in A, B, C, and D Shows urinary protein excretion when NTS nephritis rats were administered PBS containing G1, G3, G9, and DEX, respectively.
  • the amount of urinary protein excreted in 24 hours by the control rat to which normal squirrel serum was administered was as small as 1.9 ⁇ 0.4 mg / day.
  • urinary protein excretion was significantly reduced, and urinary protein excretion on day 14 was 5.6 ⁇ 1.8, 11.6 ⁇ 2.3, It was 9.5 ⁇ 4.5 mg / day.
  • Table 1 shows the test results of glomerular hypertrophy and hypercellularity in NTS nephritis rats.
  • Table 2 shows the test results of the deposition of rat IgG, C3, and fibrinogen on glomeruli of NTS nephritis rats.
  • Fig. 3 shows the results of examination of kidney specimens of NTS nephritis rats by light microscopy and immunofluorescence microscopy.
  • Gl, G3, and G9 suppress glomerular lesions such as glomerular hypertrophy caused by nephritis, hyperplasia and crescent formation in glomeruli, and deposition of fibrinogen in glomeruli. It was shown to have an effect.
  • Fig. 4 shows the results of quantification of cells infiltrating into the glomeruli of NTS nephritis rats and cell proliferation in the glomeruli.
  • the (mouth) of A indicates the number of CD8-positive cells (cells / glomerular) that infiltrated into the glomerulus on day 8
  • the (mouth) of A ) Indicates the number of CD4-positive cells that infiltrated into the glomerulus on day 8 (cells / glomerular)
  • the (open) of B indicates the number of white blood cells that infiltrated into the glomerular body on day 14 (cells).
  • ( ⁇ ) in B shows the number of monocyte Z macrophages invaded into the glomerulus on day 14 (cells / glomerular).
  • Inflammatory cells were detected in the glomeruli of the NTS nephritis rat by enzyme-linked immunosorbent assay (immunoperoxidase reaction).
  • Figure 4A infiltration into the glomeruli occurred on the eighth day.
  • the number of the obtained CD8 positive cells and CD4 positive cells was 3.5 ⁇ 0.8 Z glomeruli and 0.9 ⁇ 0.2 Z glomeruli, respectively.
  • FIG. 4B on day 14, the number of leukocytes infiltrating into the glomerulus increased remarkably, reaching 28.3 ⁇ 3.4 glomeruli, and most of the cells (25.0 ⁇ 2.6 Z glomeruli) were macrophages.
  • the number of CD8 positive cells infiltrating into the glomeruli was 0.6 ⁇ 0.2. Reduced to Z glomeruli. As shown in FIG. 4B, on the 14th day, the number of macrophages infiltrating into the glomeruli decreased to 2.3 ⁇ 0.1 / glomeruli.
  • Gl, G3, and G9 have an effect of suppressing infiltration of macrophages into glomeruli, which causes glomerular diseases such as glomerulonephritis. Furthermore, G9 was shown to have an effect of suppressing infiltration of CD8-positive cells into glomeruli, which causes glomerular diseases such as glomerulonephritis.
  • FIG. 6 shows the results of measurement of the level of peripheral blood anti-Peacock IgG antibody by ELISA. As shown in FIG. 6, the administration of dexamethasone completely inhibited the production of anti-Egret IgG antibody, but administration of Gl, G3 and G9 did not affect the antibody production.
  • dexamethasone a steroid hormone, inhibits and suppresses the functions involved in antibody production of immunocompetent cells such as antigen-presenting cells, helper T cells (CD4-positive T cells), and B cells.
  • l, G3, and G9 do not inhibit or suppress the functions of these immunocompetent cells involved in antibody production.
  • the side effect of immunosuppression is that Gl, G3, and G9 are steroid hormones. It was found to be less than dexamethasone.
  • FIG. 7 shows the results of in situ TUNE L attestation of kidney tissue.
  • Arrows in FIG. 7A indicate TUNEL-positive apoptotic cells observed in the NTS nephritis rat group to which PBS was administered.
  • the white line indicates a length of 50 m.
  • FIG. 7B shows the number of apoptotic cells ( ⁇ Z glomeruli) present in the glomeruli of the NTS nephritis rat.
  • FIG. 7A As shown in FIG. 7A, in the NTS nephritis rat group to which PBS was administered, almost no apoptotic cells were found in the glomeruli on day 14. As shown in FIG. 7B, no increase in apoptotic cells was observed in the renal tissues of the NTS nephritis rat group to which any of dexamethasone, Gl, G3, and G9 was administered.
  • (6) Apoptosis of T cells isolated from spleen Table 3 and FIG. 8 show the results of apoptotic assays (FACS analysis) of T cells isolated from spleens of the normal rat group. The numerical values in Table 3 and FIG. 8 represent the percentage (%) of apoptotic cells among CD4-positive cells and CD8-positive cells. '
  • FIG. 9 shows the distribution of the administered exogenous galectin in the kidney tissue.
  • exogenous G9 was detected by anti-C-myc antibody
  • exogenous G9 was distributed to glomerular endothelial cells and capillaries around tubules as shown in Fig. 9 (red part in Fig. 9).
  • the endothelial cells in the glomerular loops and in the capillaries around the tubules were not all positive but partially positive.
  • Endogenous G9 has been detected in glomerular cells as previously reported. It was distributed in both skin cells and mesangial cells (Wada J. et al., J. Clin. Invest. 99: 2452-2461, 1997).
  • Exogenous G9 administered by double staining was predominantly distributed in glomerular loops endothelial cells, and its distribution pattern was different from endogenous G9.
  • a novel preventive and therapeutic agent for nephritis a preventive agent for glomerular diseases-a therapeutic agent, an inhibitor of infiltration of leukocytes into the glomerulus, an inhibitor of infiltration of CD8-positive cells into the glomerulus, and induction of apoptosis of CD8-positive cells
  • An agent is provided.

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Description

明 細 書 腎炎の予防 ·治療剤 技術分野
本発明は、 腎炎の予防 ·治療剤、 糸球体疾患の予防 ·治療剤、 白血 球または CD 8陽性細胞の糸球体内'浸潤抑制剤、 および CD 8陽性細 胞のアポ卜一シス誘導剤に関する。 景技術
腎臓は生体内の老廃物の除去、 水分調節等の重要な役割を担う臓器 である。 この腎鼯に関する疾患として、 細菌、 ウィルス、 化学物質等 が原因となって生じる種々の腎炎が知られている。 腎炎は、 例えば、 糸球体病変の種類によって、 膜性腎炎、 膜性増殖性腎炎、 管内増殖性 腎炎、 メサンギゥム増殖性腎炎、 半月体形成性腎炎、 I gA腎炎、 紫 斑病性腎炎、 ループス腎炎等に分類されており、 また、 臨床的特徴に よって、 急性腎炎症候群、 急速進行性腎炎症候群、 慢性腎炎症候群、 ネフローゼ症候群等に分類されている。 これらの腎炎の多くは蛋白尿 、 血尿等の症状を示す。 現在、 腎炎の治療には、 副腎皮質ステロイ ド 剤、 免疫抑制剤等が使用されている。
糸球体腎炎を含む糸球体疾患の中でも、 半月体形成性腎炎は急速に 進行し強い免疫抑制療法を開始しなければ結果的に腎不全に至る （Ya ng R - Yら， Biochemistry 37： 4086- 4092， 1998； Bolton WK, Semin. Nephrol. 16： 517-526, 1996) 。 ヒトの半月体形成性腎炎に類似した 病変が、 抗糸球体基底膜血清 （抗 GBM抗体） を WKYラッ トに単回 投与することにより惹起される。 糸球体病変としては、 半月体形成に 加えて、 C D 8陽性細胞やマクロファ一ジの糸球体内への浸潤が認め られる （Kawasaki Kら， Kidney Int. 41 ： 1517-1526, 1992) 。 さら に、 投与された異種 I g G抗体に対する抗体の産生、 糸球体における 免疫グロプリンおよび補体の沈着により糸球体病変は悪化する。 この 半月体形成性腎炎は、 デキサメタゾンの投与により抑制される。
一方、 哺乳類の動物レクチンは糖鎖結合蛋白であり、 特異的な糖鎖 構造を認識する。 動物レクチンは、 C型レクチン、 P型レクチン、 pe ntraxins、 ガレクチンの 4つのグループに分類されている。 糖鎖は多 くの細胞膜蛋白と細胞外基質の構成成分として重要であり、 レクチン とそのリガンドとの間の相互作用は様々な生物学的機能に関与して いる。
動物レクチンの一種であるガレクチンは、 iS—ガラクトシドを特異 的に認識し、 これに特異的に結合する。 現在までに少なくとも 10種類 のガレクチン (ガレクチン一 1〜10) が同定されクロ一ニングされて いる （Perilo NLら， J.Mol.Med. 76： 402-412, 1998 ; Wada Iら， J.B iol.Chem. 272： 6078-6086, 1997 ; Wada Jら， J. CI in. Inves t. 99 : 2 452-2461, 1997) 。 これらガレクチンには構造に相同性があり、 リガ ンドの認識にも共通性があるが、 生理学的または病理学的にはそれぞ れ異なった機能に関与している。 これら機能の多様性は、 細胞上のリ ガンドである糖鎖の多様性と、 様々な組織における糖鎖の分布に関係 している。 ガレクチンの様々な機能の中でも、 アポト一シスの誘導や 免疫反応における役割について多くの報告がある。 例えば、 ガレクチ ンー 1は実験的な自己免疫疾患を改善し （Levi Gら， Eur. J. Immunol. 13： 500-507, 1983； Of fner Hら， Neuroim匪 ology 28： 177 - 184， 19 90) 、 活性化されたヒト末梢 T細胞や単離されたヒト胸腺細胞のアポ トーシスを誘導する （Perillo NLら， Nature 378： 736-739, 1995； P erillo NLら， J.Exp. Med 185： 1851-1858, 1997) 。 胸腺で強く発現 しているガレクチン一 9も胸腺細胞のアポトーシスを誘導する （Wada Jら， J.Clin. Invest. 99： 2452-2461, 1997) 。 逆に、 ガレクチン— 3は T細胞を保護するように働き、 細胞質で be 1-2とへテロダイマー を形成することによりアポトーシスを阻止する （Yang R- Yら， Proc.N atl. Acad. Sci. USA 93： 6737-6742, 1996) 。 発明の開示
本発明は、 新規な腎炎の予防 ·治療剤、 糸球体疾患の予防 ·治療剤 、 白血球の糸球体内浸潤抑制剤、 CD 8陽性細胞の糸球体内浸潤抑制 剤および CD 8陽性細胞のアポトーシス誘導剤を提供することを目 的とする。
上記目的を達成するために、 本発明により提供される腎炎の予防 · 治療剤、 糸球体疾患の予防 ·治療剤および白血球の糸球体内浸潤抑制 剤は、 以下の （ a) または （b) に示すボリペプチドを有効成分とし て含有することを特徴とする。
( a) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリ ぺプチド
(b) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1ま たは複数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列か らなり、 かつ &一ガラク トシドに特異的な結合活性を有するポリぺプ チド
また、 本発明により提供される C D 8陽性細胞の糸球体内浸潤抑制 剤および C D 8陽性細胞のアポトーシス誘導剤は、 以下の （c ) また は （d) に示すポリペプチドを有効成分として含有することを特徴と する。 ( c ) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチド
(d) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数個のァ ミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ i3 一ガラク トシドに特異的な結合活性を有するポリベプチド 図面の簡単な説明
図 1は、 ガレクチン遺伝子ファミリ一のタイプを示す模式図である 図 2は、 NT S腎炎ラッ トにおける尿蛋白排出量を示す図である。 図 3は、 NT S腎炎ラッ トの腎臓標本の光学顕微鏡および免疫蛍光 顕微鏡による検査結果を示す図である。
図 4は、 糸球体内へ浸潤した細胞の定量結果を示す図である。
図 5は、 NT S腎炎ラッ 卜の腎臓標本の免疫蛍光顕微鏡による検査 結果 （A) および糸球体内における増殖細胞の定量結果 （B) を示す 図である。
図 6は、 E L I S Aによる末梢血抗ゥサギ I g G抗体レベルの測定 結果を示す図である。
図 7は、 腎臓組織の in situ TUNELアツセィの結果を示す図である 図 8は、 脾臓から単離した T細胞のアポト一シスアツセィの結果を 示す図である。
図 9は、 投与された外因性 G 9の腎組織における分布を示す図であ る。 発明を実施するための最良の形態
本発明の腎炎の予防 ·治療剤、 糸球体疾患の予防 ·治療剤および白 血球の糸球体内浸潤抑制剤は、 以下の （ a) または （b) に示すポリ ペプチドを有効成分として含有し、 本発明の CD 8陽性細胞の糸球体 内浸潤抑制剤および CD 8陽性細胞のアポトーシス誘導剤は、 以下の (c ) または （d) に示すポリペプチドを有効成分として含有する。
( a) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリ ペプチド （以下 「ポリペプチド （ a) 」 という場合がある。 ）
(b) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1ま たは複数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列か らなり、 かつ —ガラク トシドに特異的な結合活性を有するポリぺプ チド （以下 「ポリペプチド （b) 」 という場合がある。 ）
( c ) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチド （以下 「ポリペプチド （ c ) という場合がある。 」 ）
(d) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数個のァ ミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ）3 —ガラク トシドに特異的な結合活性を有するポリペプチド （以下 「ポ リペプチド （d) 」 という場合がある。 )
配列番号 1記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドは、 マウス由 来のガレクチン— 1であり、 配列番号 2記載のアミノ酸配列からなる ポリペプチドは、 マウス由来のガレクチン一 3であり、 配列番号 3記 載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、 マウス由来のガレクチン 一 9である。 '
ガレクチンは、 ]3—ガラク トシドに特異的な結合活性を有するタン パク質および糖タンパク質の総称である。 そのうち、 ガレクチン一 1 は、 1本のポリペプチド鎖からなる糖鎖結合ドメイン （約 14kDのサブ ユニッ ト） のホモダイマー （プロ トタイプ） として存在しており （図 1参照） 、 このタイプに属する他のガレクチンとしては、 ガレクチン 一 2、 ガレクチン— 5、 ガレクチン— 7、 ガレクチン一 1 0等が挙げ られる。 また、 ガレクチン— 3は、 C末端に 1つの糖鎖結合ドメイン 、 N末端に hnRNP様ドメインを有するキメラタイプとして存在してい る （図 1参照） 。 また、 ガレクチン一 9は、 同一のペプチド鎖に 2つ の糖鎖結合ドメインを有するタンデムリピートタイプ （直列反復型） として存在しており （図 1参照） 、 このタイプに属する他のガレクチ ンとしては、 ガレクチン一 4、 ガレクチン一 6、 ガレクチン一 8、 ガ レクチン一 9等が挙げられる。 ガレクチン一 9等のタンデムリピート タイプのガレクチンにおける 2つの糖鎖結合ドメインは同一ではな く、 アミノ酸レベルで約 38 %の相同性を有している。
また、 いずれのガレクチンも、 糖鎖結合ドメインのアミノ酸配列は 全長にわたって保存されている。 糖鎖結合ドメインは、 例えば、 配列 番号 1記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドにおいては 1〜1 35 番目のアミノ酸残基からなる部分 （すなわち配列番号 1記載のァミノ 酸配列の全体） 、 配列番号 2記載のアミノ酸配列からなるポリべプチ ドにおいては 1 30〜 262番目のアミノ酸残基からなる部分、 配列番号 3 記載のアミノ酸配列からなるポリべプチドにおいては 1 5〜146番目ま たは 1 92〜322番目のアミノ酸残基からなる部分と考えられている。 特 に、 配列番号 1記歳のアミノ酸配列のうち、 30〜90番目のアミノ酸残 基からなる部分が j3—ガラク トシドへの結合活性に関与していると 考えられており、 この部分は各ガレクチンにおいてよく保存されてい る。
ポリペプチド （ a ) または （c ) において欠失、 置換または付加さ れるアミノ酸の個数は、 ポリペプチドが 3—ガラク トシドに特異的な 結合活性を有する限り特に限定されるものではなく、 その個数は 1又 は複数個、 好ましくは 1又は数個であり、 その具体的な範囲は、 好ま しくは 1〜25個、 さらに好ましくは 1〜10個である。 このとき、 ポリ ペプチド （b) のアミノ酸配列は、 ポリペプチド （ a) のアミノ酸配 列と少なく とも 25%以上、 好ましくは 50%以上、 さらに好ましくは 80 %以上の相同性を有し、 ポリペプチド （d) のアミノ酸配列は、 ポリ ペプチド （ c ) のアミノ酸配列と少なくとも 25%以上、 好ましくは 50 %以上、 さらに好ましくは 80%以上の相同性を有する。
また、 ポリペプチド （ a) または （ c ) において欠失、 置換または 付加されるアミノ酸の位置は、 ポリベプチドが 3—ガラクトシドに特 異的な結合活性を有する限り特に限定されるものではない。 ポリぺプ チド （ a) または （c ) において欠失、 置換または付加されるァミノ 酸の位置としては、 例えば、 糖鎖結合ドメイン以外の部分が考えられ る。
ここで、 「/3—ガラク トシドに特異的な結合活性を有する」 とは、 β—ガラク 卜シド (例えばラク 卜一ス (グルコース一）3— D—ガラク トシド） ） に対する結合活性は有するが、 /3—ガラク トシド以外の糖 鎖構造に対する結合活性は有しないことを意味する。 /3—ガラク トシ ド以外の糖鎖構造としては、 例えば、 グルコース—ひ 1， 4一ダルコ ース、 ダルコ一ス一 α 1， 2一フルク 卜ース等が挙げられる。 なお、 「ガラク トシド」 は、 ガラク ト一スのへミアセタール水酸基が他の化 合物とエーテル結合したものの総称であり、 その真体例としては、 ラ ク トースゃメリビオースなどの少糖類の他、 ガラク トースを含む配糖 体や糖脂質などが挙げられる。 ガラク トシドは、 その結合配位によつ て ο;型と ]3型とに分けられ、 このうち 「|3 _ガラク トシド」 は /3型の ものである。
配列番号 1記載のアミノ酸配列において 1または複数個のアミノ 酸配列が欠失、 置換または付加されたァミノ酸配列からなるポリぺプ チドは、 iS —ガラク トシドに特異的な結合活性を有するとともに、 ガ レクチン一 1 と同様の構造をとり得ること、 すなわち、 1本のポリべ プチド鎖からなる糖鎖結合ドメインのホモダイマーを形成し得るこ とが好ましく、 ガレクチン一 1 と同様の生物学的機能を有しているこ とがさらに好ましい。 ガレクチン一 1の生物学的機能としては、 例え ば、 細胞接着、 細胞増殖、 胸腺細胞や末梢活性化 T細胞のアポトーシ スの制御等が挙げられる。
配列番号 2記載のアミノ酸配列において 1 または複数個のアミノ 酸配列が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなるポリぺプ チドは、 ]3 _ガラク トシドに特異的な結合活性を有するとともに、 ガ レクチン一 3と同様の構造をとり得ること、 すなわち、 C末端に 1つ の糖鎖結合ドメイン、 N末端に hnRNP様ドメインを有することが好ま しく、 ガレクチン一 3と同様の生物学的機能を有していることがさら に好ましい。 ガレクチン _ 3の生物学的機能としては、 例えば、 細胞 接着、 炎症 （単球での I L一 1産生や好中球からの活性酸素の産生を 促進する） 、 m R N Aのスプライシング、 ヒト T細胞白血病セルライ ン Uurka t E6-1 ) のアポトーシス抑制作用等が挙げられる。
配列番号 3記載のアミノ酸配列において 1または複数個のアミノ 酸配列が欠失、 置換または付加されたァミノ酸配列からなるポリぺプ チドは、 ]3—ガラク トシドに特異的な結合活性を有するとともに、 ガ レクチン一 9と同様の構造をとり得ること、 すなわち、 同一のぺプチ ド鎖に 2つの糖鎖結合ドメインを有することが好ましく、 ガレクチン 一 9と同様の生物学的機能を有していることがさらに好ましい。 ガレ クチン一 9の生物学的機能としては、 例えば、 好酸球走化能、 胸腺細 胞の分化と胸腺細胞のアポトーシスの誘導、 末梢活性化 T細胞のアポ トーシス誘導等が挙げられる。 配列番号 1、 2または 3に記載のアミノ酸配列において 1または複 数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり 、 かつ 0—ガラク トシドに特異的な結合活性を有するポリペプチドに は、 マウス由来のガレクチン一 1、 ガレクチン一 3またはガレクチン — 9に対して人為的に欠失、 置換、 付加等の変異を導入したポリぺプ チドの他、 欠失、 置換または付加された状態で天然に存在するポリべ プチド、 例えば、 ヒト、 ラッ ト等の哺乳動物由来のガレクチン一 1 、 ガレクチン一 3またはガレクチン一 9や、 これらのガレクチンに対し て人為的に欠失、 置換、 付加等の変異を導入したポリペプチドも含ま れる。
ヒト由来のガレクチン一 1、 3、 9のアミノ酸配列をそれぞれ配列 番号 4、 配列番号 5、 配列番号 6に示す。 また、 ラッ ト由来のガレク チン— 1、 3、 9のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号 7、 配列番号 8 、 配列番号 9に示す。
本発明において、 「ポリペプチド」 には、 糖鎖が付加されたポリべ プチドおよび糖鎖が付加されていないポリぺプチドのいずれもが含 まれる。 ポリペプチドに付加される糖鎖の種類、 位置等は、 ポリぺプ チドの製造の際に使用される宿主細胞の種類によって異なるが、 糖鎖 が付加されたポリべプチドには、 いずれの宿主細胞を用いて得られる ポリペプチドも含まれる。 また、 「ポリペプチド」 には、 その医薬的 に許容される塩も含まれる。
ポリペプチド （ a ) 、 （b ) 、 （ c ) および （d ) は、 それぞれの ポリペプチドをコードする D N Aを用いて常法に従って製造できる。 例えば、 配列番号 1、 配列番号 2および配列番号 3に記載のアミノ酸 配列からなるポリペプチドは、 それぞれ配列番号 1 0、 配列番号 1 1 および配列番号 1 2に記載の塩基配列からなる D N Aを用いて製造 できる。
ポリペプチド （a) または （ c ) をコードする DNAは、 例えば、 以下の （ 1 ) 〜 （3) に従って取得できる。
( 1 ) c D N Aライブラリ一の作製
マウス由来 mRNAを常法に従って調製する。 例えば、 マウスの胎 児腎臓の組織または細胞を、 グァニジン試薬、 フエノール試薬等で処 理して全 RNAを得た後、 オリゴ d T—セルロースゃセファロ一ス 2 Bを担体とするポリ U—セファロース等を用いたァフィ二ティ一力 ラム法、 バッチ法等によりポリ （A + ) RNA (mRNA) を得る。 得られた mRNAを錶型として、 オリゴ d Tプライマー及び逆転写酵 素を用いて一本鎖 c DN Aを合成した後、 該一本鎖 c DNAからニ本 鎖 c DN Aを合成する。 このようにして得られた二本鎖 c DNAを適 当なクローニングベクターに組み込んで組換えベクターを作製する。 得られた組換えベクターを用いて大腸菌等の宿主細胞を形質転換し、 テトラサイクリン耐性、 アンピシリン耐性を指標として形質転換体を 選択することにより、 c DNAのライブラリ一が得られる。
ここで、 cDNAライブラリーを作製するためのクローニングべク ターは、 宿主細胞中で自立複製できるものであればよく、 例えば、 フ ァ一ジベクタ一、 プラスミ ドベクタ一等を使用できる。 宿主細胞とし ては、 例えば、 大腸菌 （Escherichia coli) 等を使用できる。
大腸菌等の宿主細胞の形質転換は、 Hanahanの方法 （Hanahan, D.， J . Mol. Biol. 166： 557-580 ( 1983) ) 、 すなわち、 塩化カルシウム 、 塩化マグネシウム又は塩化ルビジウムを共存させて調製したコンビ テン卜細胞に、 組換えベクターを加える方法等により行うことができ る。 なお、 ベクタ一としてプラスミ ドを用いる場合は、 テトラサイク リン、 アンピシリン等の薬剤耐性遺伝子を含有させておく。 c DN Aライブラリ一の作製は、 市販のキッ ト、 例えば、 SuperScr ipt Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Gib co BRL社製） 、 ZAP-cDNA Synthesis Kit (ストラタジーン社製） 等を 使用して行なうことができる。
( 2 ) 目的の D N Aを含むクロ一ンのスクリーニング
既知のガレクチンのアミノ酸配列に基づいてプライマ一を合成し、 これを用いてポリメラーゼ連鎖反応 （P C R) を行ない、 P C R増幅 断片を得る。 P C R増幅断片は、 適当なプラスミ ドベクターを用いて サブクロ一ニングしてもよい。
P C Rに使用するプライマーとしては、 配列番号 1 0記載の塩基配 列からなる DN Aに対しては、 例えば、 5' - gcttcaatcatggcctgt- 3' ( センスプライマ一) 、 5 -ggc tggc t tcac t caaaggc-3 (アンチセンスフ ライマー） 、 配列番号 1 1記載の塩基配列からなる DNAに対しては 、 例えば、 b -gcacagagagc t acccagg-3 (センスフライマー-) 、 ¾ -c ttctggcttagatcatg-3' (アンチセンスプライマ一) 、 配列番号 1 2記 載の塩基配列からなる DNAに対しては、 例えば、 5'-gcaitggUcccc tgagatag-3 (センスフラ マ一) 、 5 -cgt tccagagaccggatcc-3' ァ ンチセンスプライマ"） を使用できる。
c D NAライブラリーに対して、 P C R増幅断片をプローブとして コロニーハイブリダイゼ一ションまたはプラークハイブリダイゼー シヨンを行なうことにより、 目的の D N Aを取得できる。 プローブと しては、 P C R増幅断片をアイソトープ （例えば32 P、 3 5 S) 、 ビ ォチン、 ジゴキシゲニン等で標識したものを使用できる。
目的の DN Aを含むクローンは、 抗体を用いたィムノスクリ一ニン グ等の発現スクリーニングによっても得ることができる。
( 3 ) 塩基配列の決定 取得された DNAの塩基配列は、 該 DNA断片をそのまま、 または 適当な制限酵素等で切断した後、 常法によりベクターに組み込み、 通 常用いられる塩基配列解析方法、 例えば、 マキサム一ギルパートの化 学修飾法、 ジデォキシヌクレオチド鎖終結法を使用して決定できるが 、 通常は、 373A DNAシークェンサ一 （Perkin Elmer社製） 等の塩基配 列分析装置を使用して配列決定される。
以上のようにして、 ポリペプチド （ a) をコードする DNA (具体 的には、 配列番号 1 0、 配列番号 1 1または配列番号 1 2に記載の塩 基配列からなる DNA) 、 およびポリペプチド （ c ) をコードする D N A (具体的には、 配列番号 1 2に記載の塩基配列からなる DNA) を取得できる。
ポリべプチド （ a) をコードする DNAは、 配列番号 1 0、 配列番 号 1 1および配列番号 1 2に記載の塩基配列からなる DN Aに限定 されるものではなく、 ポリペプチド （ a) をコードする限り、 その他 の塩基配列からなる DN Aも含まれる。 ポリペプチド （c ) をコード する DNAについても同様である。 そのような DNAは、 その塩基配 列に従って化学合成により取得することができる。 D N Aの化学合成 は、 市販の DNA合成機、 例えば、 チォホスファイ ト法を利用した D NA合成機 （島津製作所社製） 、 フォスフォアミダイ ト法を利用した DNA合成機 （パーキン ·エルマ一社製） を使用して行なうことがで きる。
ポリペプチド （b) または （d) をコードする DNAは、 例えば、 マウス、 ラッ ト、 ヒト等の哺乳動物由来の c D N Aライブラリーから 、 それぞれポリペプチド （ a) または （ c ) をコードする DNAとス トリンジェン卜な条件下でハイブリダィズする DN Aをスクリー二 ングすることにより取得できる。 「ポリペプチド （a) または （ c ) をコードする DNAとストリン ジェン卜な条件下でハイブリダィズする D NA」 とは、 ポリペプチド ( a) または （ c ) をコードする DN Aをプローブとしたコロニー - ハイブリダィゼーシヨン法、 プラーク ·ハイブリダィゼ一シヨン法、 サザンハイプリダイゼーション法等により得られる D NAを意味し、 例えば、 コロニーまたはプラーク由来の D N Aを固定化したフィル夕 一を用いてハイブリダイゼ一ションを行った後、 2 XSSC、 0.1%SDS 、 42°Cの条件下、 好ましくは 1 XSS (：、 0.1%SDS、 4 Cの条件下、 さ らに好ましくは 0.1 XSSC、 0.1%SDS、 42 の条件下でフィルターを洗 浄することにより取得できる DN Aが含まれる。
ポリペプチド （ a) または （c ) をコードする D NAとストリンジ ェントな条件下でハイプリダイズする D N Aの具体例としては、 それ ぞれポリペプチド （ a) または （c ) をコードする DNAと少なくと も 40%以上の相同性を有する DNA、 好ましくは 60%以上の相同性を 有する DN A、 さらに好ましくは 80%以上の相同性を有する DN Aが 挙げられる。
また、 ポリペプチド （b) または （d) をコードする D NAは、 そ れぞれポリペプチド （ a) または （ c ) をコードする DN Aに、 例え ば部位特異的変異誘発法によって人為的に変異を導入することによ り取得できる。 変異の導入は、 例えば、 変異導入用キッ ト、 例えば、 Mutant - K (TAKARA社製） 、 Mutant-G (TAKARA社製) 、 TAKARA社の LA P CR in vitro Mutagenesis シリ一ズキッ トを使用して行なうことが できる。 また、 塩基配列が既に決定されている DNAについては、 上 記のように化学合成により取得することもできる。
ポリペプチド （a) 、 (b) 、 ( c ) および （d) は、 例えば、 以 下の （ 1 ) 〜 （ 3 ) に従って、 それぞれのポリペプチドをコードする DN Aを宿主細胞中で発現させることにより製造できる。
( 1 ) 組換えべクタ一および形質転換体の作製
目的とするポリペプチドのコード領域を含む適当な長さの D N A 断片を調製する。 また、 目的とするポリペプチドのコード領域の塩基 配列を、 宿主細胞における発現に最適なコドンとなるように、 塩基を 置換した DNAを調製する。
上記 DN A断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に揷 入することにより組換えベクターを作製し、 該組換えベクターを適当 な宿主細胞に導入することにより、 目的とするポリペプチドを生産し 得る形質転換体を取得できる。
宿主細胞としては、 目的とする遺伝子を発現し得る限り、 原核細胞 、 酵母、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細胞等のいずれを使用してもよい 。 また、 動物個体や植物個体を使用することもできる。
発現ベクターとしては、 宿主細胞において自立複製が可能なもので あれば特に限定されず、 例えば、 プラスミ ドベクタ一、 ファージべク 夕一等を使用できる。 発現ベクターの具体例としては、 pBTrp2、 pBTa cl、 pBTac2 (ベーリンガ一マンハイム社製) 、 pKK233-2 (フアルマシ ァ社製） 、 PSE280 (Invitrogen社製） 、 pGEMEX- 1 (Promega社製） 、 p QE-8 (QIAGEN社製） 、 pBluescript II SK+ (ストラタジーン社製） 、 pBluescript II SK (-) (ストラタジーン社製） 、 pGEX (フアルマシア 社製） 、 pETシステム （ノバジェン社製） 、 pSupex、 pUBHO, pTP5、 ρ C194、 pTrxFus ( Invi t r ogen社製） 、 pMAL-c2 (New England Biolabs 社製） 、 PSTV28 (宝酒造社製） 、 PUC118 (宝酒造社製） 等が挙げられ る。
細菌を宿主細胞とする場合、 例えば、 エッシェリヒァ · コリ' （Esch erichia coli) 等のェシエリヒア属、 バチルス 'ズブチリス （Bacill us subtilis) 等のバチルス属、 シュ一ドモナス ' プチダ （Pseudomon as put ida) 等のシユードモナス属、 リゾビゥム . メリロティ （Rhizo bium meliloti) 等のリゾピウム属に属する細菌を宿主細胞として使 用できる。 具体的には、 Escherichia coli XLl-Blue, Escherichia c oli XL2-Blue> Escherichia coli DH1、 Escherichia col i K12、 Esch erichia coli JM109, Escherichia col i HB101等の大腸菌や、 Bacill us subtilis MI 114、 Bacillus subtilis 207- 21等の枯草菌を宿主細 胞として使用できる。 この場合のプロモーターは、 大腸菌等の細菌中 で発現できるものであれば特に限定されず、 例えば、 trpプロモー夕 一、 lacプロモータ一、 PLプロモーター、 PRプロモー夕一等の大腸菌 やファージ等に由来するプロモーターを使用できる。 また、 tacプロ モ一ター、 lacT7プロモーター、 let Iプロモーターのように人為的に 設計改変されたプロモーターを使用することもできる。
細菌への組換えべクタ一の導入方法としては、 細菌に DNAを導入 し得る方法であれば特に限定されず、 例えば、 カルシウムイオンを用 いる方法 （Cohen, S.N. et al. , Pro Natl. Acad. Sci. , USA, 69 ： 2110-2114 ( 1972) ) 、 エレク ト口ポレーション法等を使用できる 酵母を宿主細胞とする場合、 サッカロミセス ·セレピシェ （Saccha romycescerevi s i ae) 、 シゾサッカロミセス 'ホンべ (Sc izosacc ar omyces pombe) 、 ピヒア 'パストリス （Pichia pastoris) 等を宿主 細胞として使用できる。 この場合のプロモ一夕一は、 酵母中で発現で きるものであれば特に限定されず、 例えば、 gallプロモーター、 gall 0プロモーター、 ヒートショックタンパク質プロモーター、 MFa lプロ モ一夕一、 PH05プロモーター、 PGKプロモーター、 GAPプロモ一ター、 ADHプロモーター、 A0X1プロモータ一等を使用できる。 酵母への組換えベクターの導入方法は、 酵母に DN Aを導入し得る 方法であれば特に限定されず、 例えば、 エレク トロボレ一シヨン法 （ Becker, D.M. et al..Methods. Enzymol. , 194： 182-187 (1990) ) 、 スフエロプラスト法 （Hinnen, A. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA, 75 : 1929-1933 ( 1978) ) 、 酢酸リチウム法 （Itoh, Η· , J. Bacteriol. , 153： 163-168 ( 1983) ) 等を使用できる。
動物細胞を宿主細胞とする場合、 サル細胞 COS- 7、 Vero、 チヤィニ —ズハムスター卵巣細胞 （CH0細胞） 、 マウス L細胞、 ラッ 卜 GH3、 ヒ ト FL細胞等を宿主細胞として使用できる。 この場合のプロモーターは 、 動物細胞中で発現できるものであれば特に限定されず、 例えば、 SR aプロモ一夕一、 SV40プロモーター、 LTR(Long Terminal Repeat)プ 口モーター、 CMVプロモータ一、 ヒトサイ トメガロウィルスの初期遺 伝子プロモーター等を使用できる。
動物細胞への組換えベクターの導入方法は、 動物細胞に DN Aを導 入し得る方法であれば特に限定されず、 例えば、 エレク ト口ポレーシ ヨン法、 リン酸カルシウム法、 リポフエクシヨン法等を使用できる。 昆虫細胞を宿主とする場合には、 Spodoptera f rugiperdaの卵巣細 胞、 Trichoplusia niの卵巣細胞、 カイコ卵巣由来の培養細胞等を宿 主細胞として使用できる。 Spodoptera f rugiperdaの卵巣細胞として は Sf9、 Sf21等、 Trichoplusia niの卵巣細胞としては High 5、 BTI-TN -5B1-4 (インビトロジェン社製） 等、 カイコ卵巣由来の培養細胞とし ては Bombyx mori N4等が挙げられる。
昆虫細胞への組換えベクターの導入方法は、 昆虫細胞に D N Aを導 入し得る限り特に限定されず、 例えば、 リン酸カルシウム法、 リボフ ェクシヨン法、 エレクト口ポレーション法等を使用できる。
( 2 ) 形質転換体の培養 目的とするポリペプチドをコードする D N Aを組み込んだ組換え ベクタ一を導入した形質転換体を通常の培養方法に従って培養する。 形質転換体の培養は、 宿主細胞の培養に用いられる通常の方法に従 つて行うことができる。
大腸菌や酵母等の微生物を宿主細胞として得られた形質転換体を 培養する培地としては、 該微生物が資化し得る炭素源、 窒素源、 無機 塩類等を含有し、 形質転換体の培養を効率的に行なえる培地であれば 天然培地、 合成培地のいずれを使用してもよい。
炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 スクロース、 デンプ ン等の炭水化物、 酢酸、 プロピオン酸等の有機酸、 エタノール、 プロ パノール等のアルコール類を使用できる。 窒素源としては、 アンモニ ァ、 塩化アンモニゥム、 硫酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 リン 酸アンモニゥム等の無機酸または有機酸のアンモニゥム塩、 ペプトン 、 肉エキス、 酵母エキス、 コーンスチープリカー、 カゼイン加水分解 物等を使用できる。 無機塩としては、 リン酸第一カリウム、 リン酸第 二カリウム、 リン酸マグネシウム、 硫酸マグネシウム、 塩化ナトリウ ム、 硫酸第一鉄、 硫酸マンガン、 硫酸銅、 炭酸カルシウム等を使用で さる。
形質転換体の培養は、 振盪培養または通気攪拌培養等の好気的条件 下で行なう。 培養温度は通常 37〜39 ：、 培養時間は通常 8〜1 2時間で あり、 培養期間中は P Hを 7. 2〜7. 4に保持する。 p Hの調整は、 無機 酸、 有機酸、 アルカリ溶液、 尿素、 炭酸カルシウム、 アンモニア等を 使用して行なうことができる。 また、 培養の際、 必要に応じてアンピ シリン、 テトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 プロモーターとして誘導性のプロモータ一を用いた発現べクタ一 で形質転換した微生物を培養するときには、 必要に応じてィンデュー サーを培地に添加してもよい。 例えば、 lacプロモーターを用いた発 現べクタ一で形質転換した微生物を培養するときにはィソプロピル 一 /3—D—チォガラクトピラノシド等を、 trpプロモーターを用いた 発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはィンドール ァクリル酸等を培地に添加してもよい。
動物細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地と しては、 一般に使用されている RPMI 1640培地、 Eagleの MEM培地、 DMEM 培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を使用でき る。 形質転換体の培養は、 通常 5 % C 02存在下、 37〜42°Cで 2〜4 日間行なう。 また、 培養の際、 必要に応じてカナマイシン、 ベニシリ ン、 ストレプトマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
昆虫細胞を宿主細胞として得られた形質転換体を培養する培地と しては、 一般に使用されている TNM-FH培地 （ファーミンジェン社製） 、 Sf-900 II SFM培地 （Gibco BRL社製） 、 ExCelU00、 ExCell405 (JR Hバイォサイエンシーズ社製） 等を使用できる形質転換体の培養は、 通常 27°Cで 12〜24時間行なう。 また、 培養の際、 必要に応じてゲン夕 マイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
目的とするポリペプチドは、 分泌タンパク質または融合夕ンパク質 として発現させることもできる。 融合させるタンパク質としては、 例 えば、 β —ガラク トシダーゼ、 プロテイン Α、 プロテイン Αの I g G 結合領域、 クロラムフエニコ一ル · ァセチルトランスフェラーゼ、 ポ リ （A r g) 、 ポリ （G l u) 、 プロテイン G、 マルトース結合夕ン パク質、 ダルタチオン S-トランスフェラ一ゼ、 ポリヒスチジン鎖 (H is- tag) 、 Sペプチド、 D N A結合タンパク質ドメイン、 T a c抗原 、 チォレドキシン、 グリーン ' フルォレツセント · プロテイン等が挙 げられる。 ( 3 ) ポリペプチドの単離 ·精製
形質転換体の培養物より目的とするポリべプチドを採取すること により、 目的とするポリペプチドが得られる。 ここで、 「培養物」 に は、 培養上清、 培養細胞、 培養菌体、 細胞または菌体の破砕物のいず れもが含まれる。
目的とするポリべプチドが形質転換体の細胞内に蓄積される場合 には、 培養物を遠心分離することにより、 培養物中の細胞を集め、 該 細胞を洗浄した後に細胞を破碎して、 目的とするポリペプチドを抽出 する。
また、 目的とするポリペプチドが形質転換体の細胞外に分泌される 場合には、 培養上清をそのまま使用するか、 遠心分離等により培養上 清から細胞または菌体を除去する。
こうして得られるポリペプチド （ a ) 、 ( b ) 、 ( c ) または （d ) は、 溶媒抽出法、 硫安等による塩析法脱塩法、 有機溶媒による沈殿 法、 ジェチルアミノエチル （D E A E ) —セファロース、 イオン交換 クロマトグラフィー法、 疎水性クロマトグラフィ一法、 ゲルろ過法、 ァフィ二ティ一クロマトグラフィ一法等により精製できる。
また、 ポリペプチド （a ) 、 （b ) 、 （c ) または （d ) は、 その アミノ酸配列に基づいて、 Fmoc法 （フルォレニルメチルォキシカルボ ニル法) 、 tBoc法 ( t 一ブチルォキシカルボニル法) 等の化学合成法 によって製造することもできる。 この際、 市販のペプチド合成機を利 用できる。
ポリペプチド （ a ) または （b ) は、 腎炎の予防 ·治療剤、 糸球体 疾患の予防 ·治療剤または白血球の糸球体内浸潤抑制剤として単独で 投与することも可能ではあるが、 通常は医薬的に許容され得る 1種以 上の担体および Zまたは添加剤とともに常法に従って製剤化して使 用する。 また、 ポリペプチド （c ) または （d ) も同様に、 C D 8陽 性細胞の糸球体内浸潤抑制剤または C D 8陽性細胞のアポトーシス 誘導剤として単独で投与することも可能ではあるが、 通常は医薬的に 許容され得る 1種以上の担体および/または添加剤とともに常法に 従って製剤化して使用する。 製剤化する場合、 製剤中の有効成分の量 は、 通常 0. 1〜 5重量％、 好ましくは 1〜 5重量％程度である。
医薬的に許容される担体としては、 水、 医薬的に許容される有機溶 剤、 コラーゲン、 ポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリ ドン、 力 ルポキシビ二ルポリマー、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラ ン、 カルボキシメチルスターチナトリウム、 ぺクチン、 キサンタンガ ム、 アラビアゴム、 カゼイン、 ゼラチン、 寒天、 グリセリン、 プロピ レンダリコール、 ポリエチレングリコール、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒト血清アルブミン、 マンニ トール、 ソルビトール、 ラク ト一ス等が挙げられる。
製剤化に際して使用される添加剤としては、 例えば、 充填剤、 増量 剤、 結合剤、 付湿剤、 崩壌剤、 表面活性剤、 滑沢剤、 賦形剤、 安定化 剤、 殺菌剤、 緩衝剤、 等張化剤、 キレート剤、 P H調整剤、 界面活性 剤等が挙げられ、 これらの添加剤は製剤の投与単位形態等に応じて適 宜選択される。 これらのうち、 通常の蛋白製剤等に使用される成分、 例えば、 安定化剤、 殺菌剤、 緩衝剤、 等張化剤、 キレート剤、 p H調 整剤、 界面活性剤等が好ましく選択される。
添加剤の具体例を以下に例示する。
安定化剤： ヒト血清アルブミン ； グリシン、 システィン、 グルタミ ン酸等の L一アミノ酸； グルコース、 マンノース、 ガラク ト一ス、 果 糖等の単糖類、 マンニトール、 イノシトール、 キシリ トール等の糖ァ ルコール、 ショ糖、 マルト一ス、 乳糖等の二糖類、 デキストラン、 ヒ ドロキシプロピルスターチ、 コンドロイチン硫酸、 ヒアルロン酸等の 多糖類及びそれらの誘導体等の糖類； メチルセルロース、 ェチルセル ロース、 ヒドロキシェチルセルロース、 ヒドロキシプロピルセルロー ス、 ヒドロキシプロピルメチルセルロース、 カルポキシメチルセル口 ースナトリゥム等のセルロース誘導体等。
界面活性剤：ポリォキシエチレンダリコールソルビタンアルキルェ ステル、 ポリォキシエチレンアルキルエーテル系、 ソルビタンモノァ シルエステル系、 脂肪酸ダリセリ ド系等の界面活性剤。
緩衝剤： ホウ酸、 リン酸、 酢酸、 クェン酸、 ε —アミノカプロン酸 、 グルタミン酸およびそれらの塩 （例えば、 ナトリウム塩、 カリウム 塩、 カルシウム塩、 マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土 類金属塩） 。
等張化剤：塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 糖類、 グリセリン等。 キレート剤： ェデト酸ナトリウム、 クェン酸等。
本発明の腎炎の予防 ·治療剤、 糸球体疾患の予防 ·治療剤または白 血球の糸球体内浸潤抑制剤は、 ポリペプチド （ a ) または （b ) のい ずれか一方を有効成分として含有していてもよいし、 両方を有効成分 として含有していてもよい。 また、 本発明の C D 8陽性細胞の糸球体 内浸潤抑制剤または C D 8陽性細胞のアポト一シス誘導剤も同様に、 ポリペプチド （ c ) または （d ) のいずれか一方を有効成分として含 有していてもよいし、 両方を有効成分として含有していてもよい。 ポリペプチド （ a ) 、 （b ) 、 ( c ) または （d ) は、 その医薬的 に許容される塩であってもよく、 その具体例としては、 ナトリウム、 カリウム、 リチウム、 カルシウム、 マグネシウム、 バリウム、 アンモ ニゥム等の無毒性アルカリ金属塩、 アルカリ土類金属塩、 アンモニゥ ム塩等が挙げられる。 また、 上記塩には、 ポリペプチドと適当な有機 酸または無機酸との反応による無毒性酸付加塩も含まれる。 代表的無 毒性酸付加塩としては、 例えば、 塩酸塩、 塩化水素酸塩、 臭化水素酸 塩、 硫酸塩、 重硫酸塩、 酢酸塩、 蓚酸塩、 吉草酸塩、 ォレイン酸塩、 ラウリン酸塩、 硼酸塩、 安息香酸塩、 乳酸塩、 リン酸塩、 P -トルェ ンスルホン酸塩 （トシレート） 、 クェン酸塩、 マレイン酸塩、 フマル 酸塩、 コハク酸塩、 酒石酸塩、 スルホン酸塩、 グリコール酸塩、 マレ イン酸塩、 ァスコルビン酸塩、 ベンゼンスルホン酸塩等が挙げられる 投与経路および投与剤形は、 治療に際して最も効果的なものを使用 するのが望ましい。 投与経路としては、 例えば、 経口投与、 口腔内、. 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与が挙げら れ、 投与剤形としては、 例えば、 噴霧剤、 カプセル剤、 錠剤、 顆粒剤 、 シロップ剤、 乳剤、 座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等が挙げられる 経口投与に適当な製剤としては、 例えば、 乳剤、 シロップ剤、 カブ セル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等が挙げられる。 乳剤やシロップ剤のよ うな液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソルビトール、 果糖等の糖類、 ポリ エチレングリコール、 プロピレングリコール等のダリコール類、 ごま 油、 ォリーブ油、 大豆油等の油類、 p —ヒドロキシ安息香酸エステル 類等の防腐剤、 ストロベリーフレ一バ一、 ペパーミント等のフレーバ 一類等を添加剤として使用して製造できる。 カプセル剤、 錠剤、 散剤 、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニトール等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシ ゥム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピ ルセルロース、 ゼラチン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤 、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として使用して製造できる。 非経口投与に適当な製剤としては、 例えば、 注射剤、 座剤、 噴霧剤 等が挙げられる。 例えば、 注射剤は、 塩溶液、 ブドウ糖溶液またはこ れらの混合物を担体として使用して製造できる。 座剤は、 カカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等を担体として使用して製造できる。 噴 霧剤は、 受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつを有効成分を 微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体として、 乳糖、 グ リセリン等を使用して製造でき、 エアロゾル、 ドライパウダー等に製 剤化できる。
投与量および投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期 間、 年齢、 体重等により異なるが、 投与量は、 成人 1 日当たり通常 0. 01〜 l mg/kgの範囲から適宜選択でき、 投与回数は、 1 日 1回から数 回の範囲から適宜選択できる。
本発明の腎炎の予防 ·治療剤は、 腎炎を予防および Zまたは治療で きる。 予防 ·治療の対象となる腎炎の種類は特に限定されるものでな いが、 蛋白尿等の症状や、 糸球体肥大、 糸球体内の細胞過多、 半月体 形成、 白血球の糸球体内浸潤、 C D 8陽性細胞の糸球体内浸潤および フィプリノーゲンの糸球体内沈着等の糸球体病変を伴う腎炎に好適 に使用できる。 このような腎炎としては、 糸球体腎炎、 例えば、 半月 体形成性腎炎、 ループス腎炎、 I gA腎症、 膜性増殖性糸球体腎炎等が 挙げられる。
本発明の糸球体疾患の予防 ·治療剤は、 糸球体疾患を予防および Z または治療できる。 予防 ·治療の対象となる糸球体疾患の種類は特に 限定されるものではないが、 糸球体肥大、 糸球体内の細胞過多、 半月 体形成、 白血球の糸球体内浸潤、 C D 8陽性細胞の糸球体内浸潤およ びフィプリノーゲンの糸球体内沈着等の病変を示す糸球体疾患に好 適に使用できる。 このような糸球体疾患としては、 糸球体腎炎、 例え ば、 半月体形成性腎炎、 ループス腎炎、 I gA腎症、 膜性増殖性糸球体 腎炎等が挙げられる。
本発明の白血球の糸球体内浸潤抑制剤は、 白血球の糸球体内への浸 潤を抑制または阻害できる。 糸球体内浸潤抑制の対象となる白血球と しては、 例えば、 単球、 マクロファージ、 T細胞、 ナチュラルキラ一 細胞等が挙げられるが、 特にマクロファージの糸球体内への浸潤を抑 制するために好適に使用できる。 白血球の糸球体内への浸潤を抑制ま たは阻害することにより、 白血球の糸球体内浸潤が原因となる疾患、 例えば、 糸球体腎炎 （例えば半月体形成性腎炎） 等の糸球体疾患を予 防および/または治療できる。
本発明の C D 8陽性細胞の糸球体内浸潤抑制剤は、 C D 8陽性細胞 の糸球体内への浸潤を抑制または阻害できる。 糸球体内浸潤抑制の対 象となる C D 8陽性細胞の種類は特に限定されるものではないが、 例 えば、 C D 8陽性細胞障害性 T細胞等が挙げられる。 C D 8陽性細胞 の糸球体内への浸潤を抑制または阻害することにより、 C D 8陽性細 胞の糸球体内浸潤が原因となる疾患、 例えば、 糸球体腎炎 （例えば半 月体形成性腎炎） 等の糸球体疾患を予防および Zまたは治療できる。 本発明の C D 8陽性細胞のアポトーシス誘導剤は、 C D 4陽性細胞 にアポト一シスを誘導することなく、 C D 8陽性細胞に選択的にアポ トーシスを誘導できる。 アポト一シス誘導の対象となる C D 8陽性細 胞の種類は特に限定されるものではないが、 例えば、 C D 8陽性細胞 障害性 T細胞等が挙げられる。 C D 8陽性細胞のアポトーシスを誘導 することにより、 C D 8陽性細胞が原因となる疾患、 例えば、 糸球体 腎炎 （例えば半月体形成性腎炎） 等の糸球体疾患を予防および Zまた は治療できる。 〔実施例〕
1. 方 法
( 1 ) ゥサギ抗糸球体基底膜血清 （nephrotoxic serum： NT S) の 作製
4週齢の雌 WKYラット （体重約 100g) より糸球体基底膜 （GBM s ) を分離して、 抗糸球体基底膜抗体の抗原として使用した。 なお、 使用した WKYラッ 卜は、 Charles River Japan (At sugi , Kanagawa, Japan) から購入した。
WKYラッ 卜の腎臓を生理食塩水で灌流した後、 それらをホモゲナ ィズし、 糸球体基底膜を単離した。 ホモゲネートと Freund完全アジュ バント （Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) とを等量混和して ェマルジヨンを調製し、 このェマルジヨンを月に 2回ずつ 2ヶ月間ゥ サギに皮下注射により投与した。 最後の投与から 3週間後にゥサギよ り採血し、 抗血清を分離した。 この抗血清を 56°Cで 30分間非動化し、 新鮮な赤血球で吸着した後、 WKYラッ 卜に腎炎を誘導するのに使用 した。
(2) マウスガレクチン一 1， 一 3， 一 9組換えタンパク質の作製 組換えガレクチン一 1， 一 3， 一 9 (以下、 G l， G 3 , G 9とい う。 ） は、 公知の方法 （Wada J.ら， J.Biol. Chem. 272： 6078-6086, 1997； Wada J.ら， J. CI in. Inves t 99： 2452-2461, 1997) に基づいて 、 pTrcHis2ベクタ一 （Invitrogen, San Diego, CA, USA) を使用して 産生させた。 なお、 これらの組換えタンパク質は、 C末端に c-mycェ ピトープと（His)6をもつ融合夕ンパク質として産生される。
G 1遺伝子 （配列番号 1 0 ) 、 G 3遺伝子 （配列番号 1 1 ) 、 G 9 遺伝子 （配列番号 1 2 ) を含むベクター （以下、 それぞれ 「pTrcHis2 /G1J 、 「pTrcHis2/G3」 、 「pTrcHi s 2/G9」 という。 ） を、 T0P10パク テリア宿主 （Invitrogen) にトランスフォーメーションした。 トラン スフォーメーションした細菌コロニーを、 Luria- Bertani ' s 培地で 培養し、 1 imo 1/LCD i sop ropy 1- j3 -D-t i ogalac topyranos i de ( IPTG) を加えることによりタンパク質合成を誘導した。 1 % TritonX-100, 1 Ommo 1/L benzamidine、 10mmol/L ε - amino-n - caproic acid、 およひ 2 mmol/L phenylmethanesul f onyl fluorideを含む Tris-di thiothrei tol (Tris-DTT) 緩衝液 （20腿 ol/L Tris (pH 7.4) ， 5 mmol/L ethyl enediaminetetraacetic acid (EDTA) ， 150腿 ol/L sodium chror i de ， 1腿 ol/L DTT) で細菌を溶解した。 その溶解液を 4 °Cで 30分間、 20 OOOXgで遠心した。 遠心上清を 10mLの lactosy卜 Sepharoseカラム （Si gma, ST. Louis, MO, USA) に添加した。 非結合タンパク質を洗浄した 後、 融合タンパク質を 200IMIO1/L Lactoseを含む Tris-DTTバッファー で溶出した。 その溶出画分を 1 mmol/L DTTを含有するリン酸緩衝液 （ PBS) で透析し、 - 70°Cで保存した。 サンプルを 12.5%の SDS- PAGE (so d ium dodecyl sul f t e-polyacryl amide gel electrophoresis) で解 析したところ、 いずれのガレクチンでも単一のバンドが得られ、 分子 量も一致した。 すなわち、 分子量は G 1が 17kDa、 G 3が 37kDa、 G 9 が 39kDaであり、 それぞれ構成アミノ酸数から予測される分子量と一 致した。
( 3 ) N T S腎炎の誘導
抗糸球体基底膜血清を 40匹の WKYラットに第 1 日目に腹腔内投 与 （ 2mL/kg 体重） し、 NT S腎炎を誘導した後、 D TT ( 1 mmol/L ， n=8) 、 デキサメタゾン （D E X ； 0.17mg/kg 体重， n=8) 、 G 1 ( l mg/kg 体重， n=8) 、 G 3 ( 1 mg/kg 体重， n=8) 、 G 9 ( 1 mg/kg 体重， n=8) をそれぞれ含有する P B Sを隔日に 2週間投与した。 尿 を集めて、 24時間の尿蛋白排出量を測定した。
WKYラッ トを第 14日目に屠殺し、 それらの腎組織を用いて、 光学 顕微鏡による観察、 蛍光抗体法、 アポトーシスを検討するための in s i tu TUNEL法 (in situ terminal deoxy trans f erase (TdT) -mediated u r idine tr iphosphate (dUTP) nick end labeling react ion) を行なつ た。
また別の実験として、 20匹の NT S腎炎 （n=20) および 20匹の正常 腎 （n=20) を準備し、 それぞれに 1匪 ol/L DTT、 D EX、 G l、 G 3または G 9を含む P B Sを投与した。 この 10群 （それぞれ n=4) を第 8 日目に屠殺し、 それぞれの組織を用いて、 酵素抗体法 （免疫べ ルォキシダーゼ染色） による CD 4陽性細胞および CD 8陽性細胞の 検出、 FAC S (fluorescence-activated cell sorter) 解析を行な つた。
なお、 糸球体内の CD 8陽性細胞は、 第 3 日目から出現し、 その後 第 U日目まで次第に減少するため、 第 8 日目に屠殺した。
(4) 光学顕微鏡による観察
組織は、 10% ホルムアルデヒドで固定し、 パラフィンに包埋した 後、 3 厚の切片を作製した。 切片は P A S (periodic acid-Schif f) で染色した。 それぞれの動物で 50個の糸球体の直径を計測し、 糸 球体内総細胞数、 半月体をもつ糸球体数をカウントした。
( 5 ) 蛍光抗体法 （免疫蛍光顕微鏡による観察）
4 m厚のクリオスタツト切片を F I T Cでラベルしたャギ抗ゥサ ギ I g G、 ャギ抗ラッ ト I g G、 ャギ抗ラッ ト C 3抗体、 ャギ抗ラッ トフイブリノ一ゲン抗体 （Cappel, Costa Mesa, CA, USA) で染色し た。 蛍光強度を以下の指標によって評価した。
(一） =陰性； （+ ) =弱陽性； （ + +) =中等度陽性 ； （+ + +) =陽性； （ + + + +) 二強陽性
さらに、 2 厚の連続クリオス夕ッ ト切片を用意した。 増殖マ一 カーである K i - 6 7の染色に、 切片を氷上でアセトン固定し、 さら に 10分間煮沸した。 これらの切片を K i - 6 7に対するマウスモノク ローナル抗体 （Dako, Glostrup, Denmark) で 2時間染色した。 連続 切片をさらにラッ ト単球/マク口ファ一ジに対するマウスモノク口 ーナル抗体 （E D 1 ； Serotec, Oxford, UK) 、 および a—平滑筋ァ クチン （ひ一 S MA ； Sigma) に対するマウスモノクローナル抗体で 1時間染色した。 最後に FITCで標識した抗マウス I g G (Cappel) で 30分間染色した。 糸球体 1個あたりの K i 一 6 7， E D I , - S M A陽性細胞数をカウントした。 ラッ ト 1匹あたり 20個の糸球体を観察 し、 陽性細胞数の平均値を求めた。
( 6 ) 酵素抗体法 （免疫ペルォキシダ一ゼ染色）
糸球体への白血球の浸潤を酵素抗体法によって検討した。 酵素抗体 法は、 免疫ペルォキシダーゼ A B C kit (Vector laboratories, Bur lingame, CA, USA) を用いて行なった。
まず、 クリオスタツ ト切片を、 ラッ ト白血球に対するマウスモノク ローナル抗体 （O X 1 ) 、 ラッ ト単球/マクロファージに対するマウ スモノクローナル抗体 （E D 1 ) 、 ラッ ト C D 4または C D 8に対す るマウスモノクローナル抗体 （Serotec) と 60分間反応させた。 次い で、 ビスチンで標識したゥマ抗マウス I g Gと 22°Cで 30分間反応させ た後、 3, 3-diamino-benzidineおよび過酸化水素に反応させた。 茶色 の反応産物を有する細胞数をカウントすることにより、 糸球体におけ る O X l、 E D 1、 C D 4、 C D 8陽性細胞数をカウントした。 ラッ ト 1匹あたり 20個の糸球体を観察し、 陽性細胞数の平均値を求めた。
( 7 ) 腎組織における in situ TUN E L法
腎組織中のアポトーシス細胞を、 FITC-dUPTを用いた in si tu TUNEL 法 (In Situ Cell Death Detect ion ki t； Boehr inger Mannheim, Man nheim, Germany) により検討した。
4 zm厚のクリオスタツ ト切片を用意し、 4 % パラホルムアルデヒ ドを用いて 22°Cで 20分間固定した。 氷上で 2分間、 0.1% Triton X-1 00、 0.1% sodium citrateで切片を処理した。 さらに TUNEL反応混合 物を暗所にて加湿条件下で 60分間処理した。 それぞれの WKYラッ ト について 50個の糸球体を検討し、 糸球体 1個あたりのアポトーシス細 胞数をカウントした。
( 8 ) 抗ゥサギ I g G抗体の E L I S Aによる測定
ラッ ト血清中の抗ゥサギ I g G抗体の抗体価を E L I S A (enzyme -l inked immunosorbent assay) によって検討した。
96穴ゥエルの各ゥエルに正常ゥサギ I g Gを 50 L (lOmg/ml； Chem icon, Temecula, USA) 加えて 22°Cでー晚インキュベートした。 その 翌日、 第 14日目に採血した血清を 40倍に希釈し、 各ゥエルに 50/iLず つ添加して 2時間反応させた。 その後、 アルカリフォスファターゼで 標識したゥサギ抗ラッ ト I g G (Southern Biotechnology Associate s, Birmingham, AL， USA) を 2000倍に希釈して各ゥエルに添加し、 2 時間反応させた。 最後に、 p- nitrophenyl phosphate溶液 （Sigma) を 各ゥエルに添加し、 1時間反応させた。 405nmにおける吸光度をマイ クロプレートリーダ一 （Japan Bio_Rad， Tokyo, 〗apan) を用いて測 定した。
( 9) F A C S解析
脾臓より単離した単核球を CD 4、 CD 8染色、 TUNEL反応に供し た。
まず脾臓をホモゲナイズして RPMI- 1640 (Gibco BRL, Grand Island ， Y, USA) に懸濁した。 次いで、 エンドトキシンを含まない Fi co 11- Paque (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) に重層して 2000rpmで 20分間遠心した。 単核球を回収し、 4 °Cの P B Sで 2回洗浄し、 2 X 107 eel ls/mLに調整した。 細胞をフィコエリ トリン （phycoerythr in ) で標識した抗ラット C D 4抗体 （Serotec) 、 あるいはフィコエリ トリンで標識した抗ラット C D 8抗体 （Antigenix America, Frankl i n Square, NY, USA) で染色した後、 4 % パラホルムアルデヒドを含 む P B S IOO Lで固定した。 遠心後に固定液を除去し、 細胞を 0.1%
Triton X- 100および 0.1% sodium ci trateを用いて氷上で 2分間処 理した。 細胞を P B Sで 2回洗浄した後、 50^Lの TUNEL反応混合物 （ f luorescein-dUTPおよび TdTを含む） と反応させた （In Situ Cell De al Detection Kit) 。 反応後、 喑所にて加湿容器内において、 37°C で 60分間反応させ、 P B Sで 2回洗浄した後、 two-color flow cytom etry (FACS Caribur 3A； Bee ton Dickinson, Mountain View, CA, US A) を用いて、 T細胞のアポト一シスの割合を解析した。
( 1 0 ) 投与された外因性ガレクチン一 9の腎臓における分布 ガレクチン— 9 ( 1 mg/kg 体重） を正常 WKYラッ トに投与し、 投 与 4時間後に屠殺した。 腎臓のクリオスタツ ト切片を用意し、 抗 inyc 抗体 （Invitrogen) に反応させた。 さらに、 口一ダミン （rhodamine ) で標識したゥマ抗マウス I g G抗体 （Vector Laboratories) で染 色した。 さらに、 二重染色のため、 ゥサギ抗ガレクチン— 9抗体 （Wa da J.ら， J.Biol. Chem. 272： 6078-6086, 1997； Wada J .ら， J.Clin . Invest 99： 2452-2461, 1997) 、 続いて FITCで標識したラバ抗ゥサギ I g G (Cheniicon) で染色した。 二次抗体は既に他の動物の血清タン パク質で吸着してあり、 他種 I g Gに対する交差反応性はない。 投与 された外因性の融合夕ンパク質のみが C末端に mycを有し、 内因性の ガレクチン一 9に mycェピトープは存在しないため、 抗 myc抗体により 両者の区別が可能である。
( 1 1 ) 統計処理
データは平均土標準偏差で示した。 ANOVA検定を用いて、 p< 0.05を有意とした。 フイ ツシヤー解析も行なった。
2. 結 果
( 1 ) 尿蛋白排出量の定量結果
NT S腎炎ラッ トの尿蛋白排出量の定量結果を図 2に示す。 なお、 図 2中、 A、 B、 C Dの （酾） は、 N T S腎炎ラッ トに D T Tを含 有する P B Sを投与したときの尿蛋白排出量を示し、 A、 B、 C, D の （秦） は、 N T S腎炎ラッ トにそれぞれ G 1、 G 3、 G 9、 D E X を含有する P B Sを投与したときの尿蛋白排出量を示す。
正常ゥサギ血清を投与した対照ラッ トが 24時間で排出した尿蛋白 量は、 1.9±0.4mg/dayと少量であった。
一方、 NT S腎炎ラットにおいては、 図 2 A〜Dに示すように、 第 1週目では少量の蛋白尿であつたが、 第 2週目では進行性に尿蛋白排 出量が増加し、 14日目には 35.8±7. lmg/dayに達した。
これに対して、 デキサメタゾン、 G l、 G 3、 G 9を投与した NT S腎炎ラッ トにおいては、 図 2 A~Dに示すように、 1 日あたりの尿 蛋白排出量が有意に抑制された。 すなわち、 デキサメタゾンを投与し た NT S腎炎ラッ ト群では、 尿蛋白排出量が顕著に減少し、 14日目の 尿蛋白排出量は 2.3±0.4mg/dayであった。 また同様に、 G l、 G 3、 G 9を投与した NT S腎炎ラット群でも尿蛋白排出量が顕著に減少 し、 14日目の尿蛋白排出量は、 それぞれ 5.6±1.8、 11.6±2.3、 9.5±4 .5mg/dayであった。
以上の結果より、 G l、 G 3および G 9が、 腎炎によって生じる蛋白 尿を抑制する作用を有することが示された。
( 2 ) 光学顕微鏡および免疫蛍光顕微鏡による所見
NT S腎炎ラットにおける糸球体の肥大と細胞過多に関する検査 結果を表 1に示す。 また、 NT S腎炎ラッ トの糸球体へのラッ ト I g G、 C 3、 フイブリノ一ゲンの沈着に関する検査結果を表 2に示す。 また、 NT S腎炎ラッ トの腎臓標本の光学顕微鏡および免疫蛍光顕微 鏡による検査結果を図 3に示す。
[表 1 ]
糸球体の直径 糸球体内細胞の総数 細胞性半月体 一 ( m) _ 一（個/糸球体） ( )
PBS 206.3±40.2 167±32 56土 10 Gl 3.8±32.1 61±24 5±2 G3 150.0±34.8 72±18 8±3 G9 146.6±36.2 66±23 5±2 DE 131.3±20.4 52±15 3±8
[表 2]
I g G C 3 フイブリノ一ゲン
PBS ( + + + +) (+ +) (+ + + +)
Gl (+ + +) (+ +) (一）
G3 (+ + +) (+ +) (一）
G9 (+ + +) (+ +) (一）
DEX (-) (一） (一） なお、 表 1、 表 2および図 3中、 「P B SJ は、 NT S腎炎ラッ ト に DTTを含む P B Sを投与したときの結果を、 「G 1」 、 「G 3」 、 「G 9」 、 「D E X」 は、 N T S腎炎ラッ トにそれぞれ G 1、 G 3 、 G 9、 D EXを含む P B Sを投与したときの結果を示す （以下の他 の表および図においても同様） 。 また、 表 2中、 （―） は陰性を、 （ + ) は弱陽性を、 （++) は中等度陽性を、 （+ + +) は陽性を、 （ + + + +) は強陽性を示す。 また、 図 3中、 「LMj は光学顕微鏡に よる検査結果を示す。
表 1に示すように、 NT S腎炎を惹起したラッ ト腎臓においては、 光学顕微鏡による検査の結果、 糸球体の肥大と糸球体における細胞の 過多を認められた。 また、 NT S腎炎ラッ ト群では、 表 1および図 3 dに示すように、 約 56%の糸球体において細胞性半月体 （cellular c rescent) が認められるとともに、 強い壊死性病変が糸球体内に認め られた。 また、 NT S腎炎ラッ ト群では、 免疫蛍光顕微鏡による検査 の結果、 表 2および図 3 a _ cに示すように、 ラッ ト I g Gの線状お よび顆粒状の沈着と、 ラッ ト C 3およびフイブリノ一ゲンの顆粒状の 沈着とが、 糸球体の係蹄壁に認められた。
これに対して、 デキサメタゾンを投与した NT S腎炎ラッ ト群では 、 表 1および図 3 tに示すように、 半月体形成が認められた糸球体は 3 %以下であり、 有意な細胞増殖や糸球体肥大は認められなかった。 また、 表 2および図 3 q _ s に示すように、 ラッ ト I g G、 C 3およ びフィプリノーゲンの糸球体内への沈着は認められなかった。
一方、 G l、 G 3、 G 9を投与した NT S腎炎ラッ ト投与群では、 免疫蛍光顕微鏡および光学顕微鏡による検査の結果、 デキサメタゾン を投与した NT S腎炎ラッ ト群とほぼ同様な形態学的変化が認めら れた。 すなわち、 表 1および図 3 h、 1、 pに示すように、 半月体が 認められた糸球体は 5〜 8 %であり、 糸球体の細胞増加は認められな かった。 また、 表 2および図 3 e ~ g、 i〜k、 m〜oに示すように 、 フイブリノ一ゲンの糸球体内への沈着は認められなかったが、 ラッ ト I g Gと C 3の糸球体沈着は抑制されなかった。
なお、 全ての対照群および実験群において、 外因性に投与されたゥ サギ I g Gは線状に染色され変化は認められなかった。
以上の結果より、 G l、 G 3、 G 9が、 腎炎によって生じる糸球体 の肥大、 糸球体における細胞の過多および半月体形成、 糸球体内への フイブリノーゲンの沈着等の糸球体病変を抑制する作用を有するこ とが示された。
( 3) 糸球体内へ浸潤した細胞と糸球体内における細胞増殖の定量結 果
NT S腎炎ラットの糸球体内へ浸潤した細胞と糸球体内における 細胞増殖の定量結果を図 4に示す。 図 4中、 Aの （口） は第 8 日目に 糸球体内へ浸潤した CD 8陽性細胞の数 （個/糸球体） を、 Aの （醺 ) は第 8 日目に糸球体内へ浸潤した CD 4陽性細胞の数 （個/糸球体 ) を示し、 Bの （口） は第 14日目に糸球体内へ浸潤した白血球の数 （ 個ノ糸球体） を、 Bの （讕） は第 14日目に糸球体内へ浸潤した単球 Z マクロファージの数 （個/糸球体） を示す。
酵素抗体法 （免疫ペルォキシダ一ゼ反応） によって、 NT S腎炎ラ ッ トの糸球体内における炎症細胞を検出したところ、 図 4 Aに示すよ うに、 第 8 日目には、 糸球体内へ浸潤した C D 8陽性細胞と CD 4陽 性細胞の個数がそれぞれ 3.5±0.8個 Z糸球体、 0.9±0.2個 Z糸球体で あった。 また、 図 4 Bに示すように、 14日目には、 糸球体内へ浸潤し た白血球の個数は顕著に増加して、 28.3±3.4個 糸球体に達し、 そ の細胞のほとんど （25.0±2.6個 Z糸球体） はマクロファージであつ た。
これに対して、 デキサメタゾンを投与した NT S腎炎ラッ ト群では 、 図 4 Aに示すように、 第 8 日目には、 糸球体内へ浸潤した C D 8陽 性細胞の個数が 0.6±0.2個 Z糸球体に減少した。 また、 図 4 Bに示す ように、 第 14日目には、 糸球体内へ浸潤したマクロファージの個数が 2.3±0.1個/糸球体に減少した。
一方、 G l、 G 3を投与した NT S腎炎ラッ ト群では、 図 4 Aに示 すように、 CD 8陽性細胞の浸潤を抑制できなかったが、 これとは対 照的に、 G 9を投与した NT S腎炎ラッ ト群では、 図 4 Aに示すよう に、 CD 8陽性細胞の浸潤を有意に抑制し、 糸球体内へ浸潤した CD 8陽性細胞の個数は 1· 2±0.2個/糸球体に減少した。 また、 G l、 G 3、 G 9を投与した NT S腎炎ラッ ト群では、 図 4 Bに示すように、 糸球体内へのマクロファージの浸潤を有意に抑制した。
また、 NT S腎炎ラッ トにおける腎臓標本の免疫蛍光顕微鏡による 検査結果および糸球体内における増殖細胞の定量結果を、 それぞれ図 5 、 ]3に示す。 なぉ、 図 5八中、 （a) は ED I、 （b) は K i — 6 7、 ( c ) は c¾ _ S MAに関する結果を示し、 図中の白線は lOO m の長さを示す。 また、 図 5 B中、 （鼴） は ED 1陽性細胞数 （個/糸 球体） 、 （口） は K i 一 6 7陽性細胞数 （個/糸球体） を示す。
増殖マ一カーである K i - 6 7と単球/マクロファ一ジの細胞型 マーカーである ED— 1 とを腎組織連続切片上で検出した結果、 P B Sを投与した NT S腎炎ラッ ト群では、 図 5 A ( a) 、 （b) に示す ように、 K i 一 6 7の免疫反応性が糸球体の核で観察され、 それらの ほとんどで単球/マクロファージのマーカ一である ED— 1も陽性 であった。 また、 P B Sを投与した NT S腎炎ラッ ト群の糸球体では 、 ED— 1陽性細胞 （24±8個/糸球体） と K i _ 6 7陽性細胞 （22士 7個/糸球体） が多量に認められたが、 G l、 G 3、 G 9およびデキサ メ夕ゾンを投与した NT S腎炎ラット群においては、 E D— 1陽性細 胞と K i 一 6 7陽性細胞の発生が有意に抑制された。 これに対して、 a— S MAの分布は ED— 1 と K i — 6 7の分布と異なっており、 P B Sを投与した NT S腎炎ラッ ト群においては、 メサンギゥム細胞の 一部のみがひ— S MA陽性であった （図 5 A ( c ) ) 。 この結果によ り、 メサンギゥム細胞の増殖活性は低く、 NT S腎炎での糸球体細胞 の蓄積は糸球体へのマク口ファ一ジの流入と増殖によるものである ことが示された。
以上の結果より、 G l、 G 3、 G 9が、 糸球体腎炎等の糸球体疾患 の原因となるマクロファージの糸球体内浸潤を抑制する作用を有す ることが示された。 さらに、 G 9は、 糸球体腎炎等の糸球体疾患の原 因となる CD 8陽性細胞の糸球体内浸潤を抑制する作用を有するこ とが示された。 ( 4 ) E L I S Aによる末梢血抗ゥサギ I g G抗体 （circulating an ti - rabbit IgG) レベルの測定
E L I S Aによる末梢血抗ゥサギ I g G抗体レベルの測定結果を 図 6に示す。 図 6に示すように、 デキサメタゾンの投与により抗ゥ サギ I g G抗体の産生は完全に阻害されたが、 G l、 G 3、 G 9の投 与は抗体産生に影響を及ぼさなかった。
この結果より、 ステロイ ドホルモンであるデキサメタゾンは、 抗原 提示細胞、 ヘルパ一 T細胞 （CD 4陽性 T細胞） 、 B細胞などの免疫 担当細胞の抗体産生に関与する機能を阻害 ·抑制するが、 G l、 G 3 、 G 9はこれら免疫担当細胞の抗体産生に関与する機能を阻害 ·抑制 しないこと、 すなわち、 免疫抑制という副作用は、 G l、 G 3、 G 9 の方がステロイ ドホルモンであるデキサメタゾンよりも少ないこと が明らかとなった。
( 5 ) 腎組織の in situ TUNE Lアツセィ
腎組織の in situ TUNE Lアツセィの結果を図 7に示す。 図 7 A の矢印は、 P B Sを投与した NT S腎炎ラッ ト群において観察された TUNE L陽性アポトーシス細胞を示す。 なお、 図 7 A中、 白線は 5 0 mの長さを示す。 また、 図 7 Bは、 N T S腎炎ラッ トの糸球体内 に存在するアポトーシス細胞の数 （偭 Z糸球体） を示す。
図 7 Aに示すように、 P B Sを投与した NT S腎炎ラッ ト群におい て、 14日目の糸球体内にアポトーシス細胞はほとんど認められなかつ た。 また、 図 7 Bに示すように、 デキサメタゾン、 G l、 G 3、 G 9 のいずれかを投与した NT S腎炎ラッ ト群の腎組織においてはアポ トーシス細胞の増加は認められなかった。 ( 6 ) 脾臓より分離された T細胞のアポト一シスアツセィ 正常ラッ ト群の脾臓より分離された T細胞のアポトーシスアツセ ィ （FAC S解析） の結果を表 3および図 8に示す。 表 3および図 8 中の数値は、 C D 4陽性細胞および C D 8陽性細胞のうちアポト一シ ス細胞の割合 （％) を表す。 '
[表 3 ]
正常ラ V 卜 NT S腎炎ラッ ト
C D 4 + C D 8 + C D 4 + C D 8 +
PBS 6 .8±1. 8 . 7.0±2. , 1 5.7±1.8 4.8±2 .0
G1 9 .1±2. 0 8.9±2. .2 9.1±2.3 8.6±1 .8
G3 8 .1±1. 6 6.4±1. .8 5.9±2.1 7.0±1 • 6
G9 8 .6±1. 9 8.4±2. , 1 9.2±1.6 16.8±2 .2
DEX 24 • 9土 2. 8 28.3±2. .4 20.1±2.6 25.7±2 .9 表 3および図 8に示すように、 P B Sを投与した正常ラッ ト群の脾 臓より分離した C D 4陽性細胞と C D 8陽性細胞のうち約 7 %が自 発的にアポトーシスに至っていた。 デキサメタゾンを投与した正常ラ ッ トにおけるアポトーシスは、 C D 4陽性細胞の約 25%、 C D 8陽性 細胞の約 28%に認められたが、 G l、 G 3、 G 9を投与した正常ラッ ト群ではアポト一シスの有意な増加は見られなかった。
また、 表 3および図 8に示すように、 NT S腎炎ラッ ト群では、 脾 臓より分離した C D 4陽性細胞の約 6 %と C D 8細胞の約 5 %が自 発的にアポトーシスに至っており、 アポトーシス細胞の割合は P B S を投与した正常ラッ ト群と同様であった。
これに対して、 デキサメタゾンを投与した NT S腎炎ラッ ト群では 、 C D 4陽性細胞の約 20%、 C D 8陽性細胞の約 26%がアポトーシス に至っており、 P B Sを投与した正常ラッ ト群と同様、 デキサメタザ ンの投与によりアポト一シスが増加した。 一方、 G l、 G 3を投与し た NT S腎炎ラット群では、 C D 4陽性細胞および C D 8陽性細胞の 5〜 9 %がアポトーシスに至っており、 G 1、 G 3により誘導される アポト一シスは、 基礎レベルと同様であった。 しかし、 G 9を投与し た NT S腎炎ラッ ト群では、 CD 4陽性細胞の約 9 %、 CD 8陽性細 胞の約 17%がアポトーシスに至っており、 G 9の投与により誘導され る CD 4陽性細胞のアポトーシスは基礎レベルに留まるのに対して CD 8陽性細胞のアポト一シスは促進していた。
以上の結果により、 デキサメタゾンは休止 T細胞および活性化 T細 胞のいずれにおいてもアポト一シスが誘導するが、 G 9は NT S腎炎 ラッ ト群における活性化 C D 8陽性 T細胞に対して選択的にアポト 一シスを誘導することが示された。 すなわち、 G 9は、 糸球体腎炎等 の糸球体疾患の原因となる CD 8陽性細胞の糸球体内浸潤を選択的 に抑制する作用を有し、 デキサメタゾンと異なり、 CD 8陽性細胞に 非選択的なアポトーシスを誘導するという副作用を有しないことが 示された。
( 7 ) 投与された外因性ガレクチンの腎組織における分布
投与された外因性ガレクチンの腎組織における分布を図 9に示す。 投与された外因性 G 9を抗 C- myc抗体により検出したところ、 図 9 に示すように、 外因性 G 9は糸球体内皮細胞と尿細管周囲の毛細血管 に分布した （図 9の赤色部分） 。 また、 糸球体係蹄と尿細管周囲の毛 細血管の内皮細胞はすべてが陽性ではなく一部が陽性であった。 内因 性 G 9は既に報告されているように糸球体細胞に検出されており、 内 皮細胞とメサンギゥム細胞のいずれにも分布していた （Wada J. ら， J. Clin. Invest.99： 2452-2461, 1997) 。 二重染色法により投与された外 因性 G 9は糸球体係蹄内皮細胞に主に分布し、 その分布パターンが内 因性 G 9とは異なっていた。
G 1 と G 3のマクロファージの糸球体内浸潤抑制効果は、 投与され た外因性 G 1、 G 3が内皮細胞やマクロファ一ジ上に発現した糖鎖を 架橋して両者の接着を抑制することにより発揮されるものと考えら れる。 糸球体内皮細胞に外因性ガレクチンの免疫組織学的局在が確認 されたことはこの考えを支持する。 産業上の利用の可能性
本発明により、 新規な腎炎の予防，治療剤、 糸球体疾患の予防 -治 療剤、 白血球の糸球体内浸潤抑制剤、 CD 8陽性細胞の糸球体内浸潤 抑制剤および CD 8陽性細胞のアポトーシス誘導剤が提供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 以下の （ a) または （b) に示すポリペプチドを有効成分として含 有することを特徴とする腎炎の予防 · 治療剤。
( a ) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリぺ プチド
(b) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1また は複数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からな り、 かつ /3—ガラク トシドに特異的な結合活性を有するポリべプチド
2. 以下の （ a) または （b) に示すポリペプチドを有効成分として含 有することを特徴とする糸球体疾患の予防 · 治療剤。
( a) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリぺ プチド
(b) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1また は複数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からな り、 かつ /3—ガラクトシドに特異的な結合活性を有するポリペプチド
3. 前記糸球体疾患が、 糸球体肥大、 糸球体内の細胞過多、 半月体形成 、 白血球の糸球体内浸潤、 C D 8陽性細胞の糸球体内浸潤およびフイブ リノーゲンの糸球体内沈着からなる群より選択される 1種以上の病変を 示す糸球体疾患であることを特徴とする請求項 2記載の糸球体疾患の予 防 ·治療剤。
4. 前記糸球体疾患が、 糸球体腎炎であることを特徴とする請求項 2記 載の糸球体疾患の予防 · 治療剤。
5. 以下の （ a) または （b) に示すポリペプチドを有効成分として含 有することを特徴とする白血球の糸球体内浸潤抑制剤。
(a) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリぺ プチド
(b) 配列番号 1〜 3のいずれかに記載のアミノ酸配列において 1また は複数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からな り、 かつ ]3—ガラク トシドに特異的な結合活性を有するポリぺプチド
6. 前記白血球が、 単球またはマクロファージであることを特徴とする 請求項 5記載の白血球の糸球体内浸潤抑制剤。
7. 以下の （c ) または （d) に示すポリペプチドを有効成分として含 有することを特徴とする CD 8陽性細胞の糸球体内浸潤抑制剤。
( c ) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチド
(d) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ i3—ガ ラクトシドに特異的な結合活性を有するポリべプチド
8. 以下の （c) または （d) に示すポリペプチドを有効成分として含 有することを特徴とする C D 8陽性細胞のアポト一シス誘導剤。
( c ) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列からなるポリべプチド
(d) 配列番号 3に記載のアミノ酸配列において 1または複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列からなり、 かつ ) 3—ガ ラク トシドに特異的な結合活性を有するポリペプチド
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122 Ep: pct application non-entry in european phase