WO2002084296A2 - Verfahren zur selektion von immunologischen bindungsmolekülen - Google Patents

Verfahren zur selektion von immunologischen bindungsmolekülen Download PDF

Info

Publication number
WO2002084296A2
WO2002084296A2 PCT/EP2002/004048 EP0204048W WO02084296A2 WO 2002084296 A2 WO2002084296 A2 WO 2002084296A2 EP 0204048 W EP0204048 W EP 0204048W WO 02084296 A2 WO02084296 A2 WO 02084296A2
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
binding molecules
immunological binding
dimensionally arranged
library
epitopes
Prior art date
Application number
PCT/EP2002/004048
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2002084296A3 (de
Inventor
Hans-Georg Frank
Peter Kaufmann
Original Assignee
Aplagen Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from EP01109232A external-priority patent/EP1249704A1/de
Application filed by Aplagen Gmbh filed Critical Aplagen Gmbh
Priority to AU2002312811A priority Critical patent/AU2002312811A1/en
Publication of WO2002084296A2 publication Critical patent/WO2002084296A2/de
Publication of WO2002084296A3 publication Critical patent/WO2002084296A3/de

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6845—Methods of identifying protein-protein interactions in protein mixtures

Definitions

  • the present invention relates to a method for the selection of immunological binding molecules.
  • WO99 / 39210 describes a method in which, in a first step, epitopes are arranged in a two-dimensional array in order to bind antibodies which bind to one or more of these epitopes. The so In a second step, the defined entirety of the binding antibodies is again transferred to an array in order to analyze the presence and amount of epitopes in biological samples from a different biological-functional context.
  • the amount of epitope used in the first step limits all further steps, because only those antibodies can be used that have bound to epitopes of the first array.
  • epitopes that were newly expressed compared to the original epitoparray cannot be analyzed, because binding antibodies are at best contained in the antibody array at random.
  • epitopes of this type is the expression of products of oncogenes during tumorigenesis.
  • a hitherto unknown oncogene can only be discovered accidentally in a two-stage array as in WO99 / 39210, but not by systematic search.
  • the object of the present invention is therefore to provide a method with which immunological binding molecules, in particular antibodies, against substances can be obtained in a simple manner without the disadvantages mentioned occurring.
  • the method is intended to enable the targeted selection of immunological binding molecules.
  • the method according to the invention should make it possible to identify and isolate immunological binding molecules against highly conserved mammalian epitopes.
  • the object is achieved by a method having the features of patent claim 1.
  • the method according to the invention for the selection of immunological binding molecules from a library of immunological binding molecules comprises the following steps:
  • Immunological binding molecules are molecules that are obtained directly or indirectly by immunization and can bind other molecules.
  • the term includes in particular antibodies and antibody fragments, as well as single chain antibodies.
  • Library of immunological binding molecules means a large number of different immunological binding molecules, which are still linked to their DNA information in such a way that monoclonal immunological binding molecules can be obtained by separating members.
  • the term particularly encompasses libraries of single chain antibodies in phage libraries.
  • the libraries are made from recombinant techniques from birds, particularly chickens.
  • Epitope is a structure that can be recognized by an immunological binding molecule.
  • “Purified” means that epitopes from mixtures of epitopes are completely or partially enriched by technical processes, in particular chromatography and electrophoresis, or that the mixtures are completely or be partially separated. Furthermore, “purified” means that epitopes can be produced chemically or recombinantly and used with a defined degree of purity.
  • Selection of immunological binding molecules means a method in which the binding ability of the binding molecules to substances is tested and the molecules which have particularly high binding affinities are isolated.
  • the method according to the invention is based on an existing library of immunological binding molecules.
  • libraries can be obtained by methods such as those described in Barbas CF 3 rd , Furton DR, Scott JK, Silverman GJ (2001) Phage Display: A laboratory manual, l st edn. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York.
  • Non-mammals used according to the invention are preferably birds, in particular chickens, “highly conserved” in this context means that the target epitopes in at least two mammalian species have an amino acid sequence identity of more than 60%, preferably 70%.
  • sequence homology must comprise at least one sequence segment of 9 amino acids "In the preferred case, the homology is present in more than two mammalian species, the amino acid identity being greater than 80%, preferably 90%, and the homologous sequence region comprising 15-30 amino acids.”
  • High conservation "Within the meaning of the invention is also present if the sequence homology described above does not exist, but one and the same antibody binds domains / epitopes of phylogenetically homologous gene products in at least two mammalian species, the domains / epitopes preferably being functionally analogous.
  • a 2D matrix of defined natural product epitopes or blots of natural product electrophoresis are particularly suitable as two-dimensionally arranged purified samples. Arrangements of cleaned, highly conserved mammalian epitopes in the manner of an “array” are also particularly suitable, with unique x and y coordinates being assigned to the epitopes in a two-dimensional pattern.
  • the two-dimensionally arranged sample can be the blot of a natural product electrophoresis.
  • the electrophoresis is carried out as two-dimensionally as possible. Suitable substances for such electrophoresis include nucleic acids and proteins that have been isolated from mammalian tissues and contain highly conserved proteins.
  • the two-dimensionally separated proteins for example by molecular weight and isoelectric points, are transferred to a so-called blot membrane by conventional methods. Methods for this are described, for example, in Harlow E., Lane D (1988) Antibodies: A laboratory manual. l s edn. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York.
  • two-dimensionally prepared arrangements of purified or recombinantly expressed epitopes of natural product epitopes can be treated and used analogously to the blots of natural product electrophoresis.
  • the two-dimensionally arranged sample for example the blot membrane or the two-dimensional epitope array, is brought into contact with the library in such a way that the immunological binding molecules can form bonds with the epitopes.
  • washing steps are carried out which are intended to differentiate between non-specifically and specifically bound binding molecules, i.e. the only weakly unspecifically bound molecules are removed.
  • the epitopes or zones in the blot membrane which are defined by their X and Y coordinates and to which the immunological binding molecules which are to be obtained are bound, are then removed from the two-dimensionally arranged sample using suitable means.
  • suitable means for this purpose microdissection devices can be used, whereby both glass capillaries and mechanical processing as well as laser techniques can be used.
  • Such devices are commercially available, for example, from the companies eppendorf (Hamburg) and SL Microtest (Jena).
  • the immonulogic binding molecules bound to these areas are now used to be amplified in a manner adapted to the library.
  • the specificity of the binding molecules is defined by their ability to bind certain regions in two-dimensional samples, ie the molecules show a topographically defined primary specificity.
  • immunological binding molecules which are specific for the features distinguishing the two samples "to remove a part of the" immunological binding molecules by bringing a first two-dimensionally arranged sample into contact with the library of immunological binding molecules and then by removing it in Bring contact with a second two-dimensionally arranged sample to select immunological binding molecules for those epitopes that distinguish the first two-dimensionally arranged sample and the two-dimensionally arranged sample.
  • the present invention enables a targeted subtractive selection of antibodies from suitable libraries on two-dimensional epitope preparations from a different biological context.
  • Antibodies can be isolated against qualitatively new epitopes in biological samples.
  • the following statements represent an example of the use of the method according to the invention.
  • the example comprises the steps of immunizing a non-mammal with various antigen preparations, the creation of a phage library and the selection of specific immunological binding molecules in the sense of the method. Immunization of the animals
  • the spleen was cut into 8-10 small pieces under sterile conditions. These pieces were carefully suspended by hand in an Elvehjem glass tube using the appropriate pestle in 3 ml of sterile isotonic saline. This suspension was filtered through a stainless steel sieve (150 mesh), the spleen cells contained in the filtrate were pelleted (400 g, 5 min. Room temperature) and then in lysis buffer (0.15 M NH 4 CI; 1 mM KHCO 3 ; 0.1 mM Na 2 EDTA; pH 7.2) the erythrocytes are selectively lysed. The total RNA was prepared from the remaining splenocytes and cDNA was produced after reverse transcription with oligo-dT primers.
  • the primers introduce an overlap area that is required for the splice overlap extension PCR when creating the sections coding for scFv.
  • the PCR leads to products of approximately 350 bp in size. After thorough cleaning of the products, they were used for the splice overlap extension PCR.
  • Aquimolar amounts (100 ng each) of the amplificates of Vk and Vh were used in the splice overlap extension PCR.
  • the reaction mixtures also contained a pair of specially defined primers (see Table 1; Andris-Widhopf, J., Rader, C, Steinberger, PI, Greer, R., Barbas, CF, III (2000) Methods for the generation of chicken monodonal antibody fragments by phage display, J. Immunol. Methods 242, 159-181J, which, inter alia, introduce the restriction sites required for the restriction and ligation into the product After initial denaturation at 94 ° C. for 1 min, 35 cycles followed with 15 s denaturation (94 ° C), 15 s annealing (56 ° C) and 120 s elongation (74 ° C) The desired product has a size of about 750 bp.
  • the vector was linearized by digestion with Sfi I. Since the vector contains two asymmetric interfaces of this restriction enzyme, directional cloning is possible without further digestion after digestion and purification of the vector. At the same time, the product of the splice overlap extension PCR was digested with the enzyme and the restricted product was purified.
  • the band patterns of 9 randomly drawn clones were analyzed after restriction of the insert (see FIG. 1).
  • 9 clones were picked arbitrarily, the plasmids were isolated and the inserts were amplified in a PCR.
  • the PCR products were purified, restricted with Mspl, separated in a 2% agarose gel and stained with ethidium bromide.
  • the series of samples are arranged from left to right in ascending order as follows. Row 1: 100 bp size ladder; Row 2: ⁇ X174 / Hae III; Row 3-11: clones 1-9. This shows that the library is not dominated by a few clones.
  • the cells of each confluent large bottle are detached with a cell scraper and pelleted at 1500 rpm, 5 4 ° C.
  • the cells are then washed twice with 10 ml PBS each.
  • the cells are taken up in 1.5 ml PBS, transferred into a 1.5 ml reaction vessel and pelleted at 3000 rpm, 5 RT.
  • After adding 200 ⁇ l lysis buffer the cells are homogenized with a pellet mixer for V at full speed. Subsequently, cell debris are pelleted at 17500xg, 45 ⁇ , 4 ° C. The supernatant is transferred to a new reaction vessel and placed on ice.
  • the protein is determined nephelometrically.
  • the calibration line is set up with BSA, i.e. the measured values correspond to protein in BSA
  • the samples are diluted 1: 5 with lysis buffer and then 2 ⁇ l each are used in a triple determination.
  • the samples are incubated on ice for one hour, transferred to semi-micro cuvettes and measured in a Behring laser nephelometer. After the protein determination, the samples are frozen in portions of 150 ⁇ g protein at -70 ° C.
  • Each gel strip is in a total of 360 ⁇ l solution in the reswelling tray
  • the solution consists of the sample in lysis buffer (Urea 7M, Thiourea
  • Rehydration solution (Urea 8M, CHAPS 2% (w / v), Pharmalyte 3-10 0.5% (v / v), DTT 0.2% (w / v), Orange G 0.2mg; solution in c0mplete TM Protease Inhibitior Cocktail; sterile filter before use) together. 15 ⁇ l of the carbanhydrase from the Carbamylyte Calibration Kit (Amersham Pharmacia Biotech) are used as markers for the first dimension. Rehydration is usually done overnight, but at least ten hours at 4 ° C.
  • the isoelectric focusing is carried out in the IPG strip kit of the Multiphor II electrophoresis chamber (AmershamPharmacia Biotech).
  • the ImmobilineDryStrips (Amersham Pharmacia Biotech) with a length of 18cm and a linear pH range of 3-10 or 4- 7 (for proteins with an acidic isoelectric point (IEP)).
  • the gel strips are covered with silicone oil during the run.
  • the focusing conditions are determined by the EPS 3500 XL power supply from
  • the power supply is set to automatically carry out the following focusing phases in the
  • Phase 1 150V j lmA
  • Phase 2 150V i lmA J 5W 150Vh
  • Phase 1 150V j lmA J 5W IVh
  • Phase 7 3500V j lmA
  • Phase 8 3500V j lmA
  • the gel strips can be stored at -70 ° C for some time.
  • the second dimension is a horizontal SDS-PAGE.
  • the gels have a size of 22x24.5cm and are cast on a plastic film. This has the advantage that they do not shrink when drying. Gradient gels with a gradient of 12% to 14% acrylamide are cast. Before pouring the gels, the plastic films are distilled six times for ten minutes. Washed water.
  • the gels for the second dimension were composed as follows:
  • the equilibration required before the gel run is carried out in two steps in the equilibration buffer (urea (6M), Tris-HCl (50mM pH 8.5), SDS (2% (w / v)), glycerol (30% (w / v)) ).
  • the proteins are reduced with the help of 1% (w / v) DTT (dithiothreitol) in the buffer.
  • the excess reducing agent is then removed by 4% (w / v) 2-iodoacetamide in the buffer. Both buffers also contain bromophenol blue to mark the running front.
  • Each step lasts 15 and is done on a shaker. Both solutions must be filtered before use.
  • the gel strips are distilled for a second. Rinse off water and then let the excess buffer run off the gel strips for about three minutes.
  • the gel strips are placed on the gels for the second dimension with the pH 3 or pH 4 side to the left.
  • the ExcelGel SDS buffer strips are used for the running buffer.
  • the buffer strips contain tricine as the secondary ion.
  • the Markll TM Wide Range Protein Standard from Novex, San Diego, USA is used as a marker for the second dimension.
  • 4 ⁇ l are applied undiluted. sketch
  • the conditions of the gel run are controlled by the EPS 3500 XL power supply from Amersham Pharmacia Biotech.
  • the power supply is set to automatically carry out the following phases:
  • Phase 1 100V 20mA J 50W j Ih20 ⁇
  • the run is briefly interrupted and the gel strips are removed from the gel in order to move the cathode buffer strip to the position where the gel strip previously lay.
  • the money is detached from the plastic carrier, inserted and opened in electrolyte-containing filter paper strips using standard methods (Hariow E, Lane D (1988) Antibodies: A laboratory manual. L st edn. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York) blotted a polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • Table 2 Name, antigen and size (number of transformants) per library
  • Placenta PDL 9 Primary invasive trophoblast, 3.8 10 7 freshly isolated from the membranes of a mature placenta PDL 10 living cells; Trophoblast- 3.1 10 7
  • Rat PDL (cumulative mixture of all phage total: 4 10 9

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Verfahren zur Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen aus einer Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle aus Vögeln, insbesondere Hühnern, mit folgenden Schritten:- In Kontaktbringen der Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle mit einer zweidimensional angeordneten Probe enthaltend mindestens ein aufgereinigtes Epitop; - Isolierung der an das mindestens eine Epitop gebundenen immunologischen Bindungsmoleküle.

Description

Verfahren zur Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen.
Es ist in der Biochemie üblich zur Charakterisierung einer unbekannten, in einem Organismus vorkommenden Substanz, beispielsweise eines Proteins, geringe Mengen der Substanz möglichst weitgehend aufzureinigen, um anschließend gegen die Substanz Antikörper zu erzeugen. Die so erhaltenen poly- oder monoklonalen Antikörper können dann zur weiteren Aufreinigung der Substanz eingesetzt werden. Der erhaltene Antikörper kann insbesondere auch dazu benutzt werden, das approximative Molekulargewicht der Substanz in Blots von gelelektrophoretischen Trennungen oder ihre Konzentration im Gewebe oder Blut zu untersuchen.
Hier tritt jedoch das Problem auf, dass die Substanzen, beispielsweise während einer elektrophoretischen Trennung, in ihrer Struktur so verändert werden, dass Antikörper, die gegen die aufgereinigten, strukturell nicht veränderten Substanzen gewonnen werden, die teilweise oder vollständig denaturierten Substanzen in Blots nicht mehr erkennen.
Bei der durch histologische Einbettungsverfahren bedingten Denaturierung kann dieses Problem gelöst werden, indem immunologische Bindungsmoleküle an histologischen Schnitten selektiert werden. Ein solches Verfahren wird beispielsweise in „Antibodies to Human Placental Endothelium Can Be Selected from Chicken-Derived Phage Display Antibody Libraries by Panning on Parrafin Sections", Versmold, A. et al., Placenta, 21, Nr. 7, 2000-09, Seite A25 XP001042358, verwendet.
In der WO99/39210 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem in einem ersten Schritt Epitope in einem zweidimensionalen Array angeordnet werden, um Antikörper zu binden, die an eines oder mehrere dieser Epitope binden. Die so definierte Gesamtheit der bindenden Antikörper wird in einem zweiten Schritt erneut in ein Array überführt, um die Gegenwart und Menge von Epitopen in biologischen Proben aus unterschiedlichem biologisch-funktionellem Kontext zu analysieren. Die im ersten Schritt benutzte Epitopmenge limitiert jedoch alle weiteren Schritte, weil nur noch solche Antikörper zum Einsatz kommen können, die an Epitope des ersten Arrays gebunden haben. Beim Vergleich von Proben aus unterschiedlichem biologischem Kontext können dagegen Epitope, die im Vergleich zum ursprünglichen Epitoparray neu exprimiert wurden, nicht analysiert werden, weil bindende Antikörper im besten Falle zufällig im Antikörperarray enthalten sind. Ein Beispiel für bekannte Epitope dieser Art ist die Expression von Produkten von Onkogenen während der Tumorigenese. Ein bis dato unbekanntes Onkogen kann in einem zweistufigen Array wie in WO99/39210 nur zufällig, nicht aber durch systematische Suche entdeckt werden.
Des weiteren tritt auch das Problem auf, dass viele Proteine und Epitope sich innerhalb eng verwandter Spezies, z. B. innerhalb der Mammalia (Säugetiere), nur sehr wenig unterscheiden. Dies ist auf die phyiogenetische Konservierung zurückzuführen und wird als Homologie bezeichnet. Darum sind viele für Mammalia besonders geeignete Epitope in anderen Mammalia nur sehr eingeschränkt immunogen. Antikörper gegen solche hochkonservierten Epitope sind also nach den üblichen Verfahren der Antikörperproduktion in Mäusen oder anderen im Labor verwendeten Nagetieren nur sehr schwierig oder gar nicht herstellbar.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem in einfacher Weise immunologische Bindungsmoleküle, insbesondere Antikörper, gegen Substanzen erhalten werden können, ohne dass die erwähnten Nachteile auftreten. Das Verfahren soll die gezielte Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen ermöglichen. Insbesondere soll das erfindungsgemäße Verfahren ermöglichen, immunologische Bindungsmoleküle gegen hochkonservierte Säugetierepitope zu identifizieren und zu isolieren. Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruches 1.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen aus einer Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle umfasst folgende Schritte:
- In Kontakt bringen der Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle aus Nicht-Säugetieren mit einer zweidimensional angeordneten Probe enthaltend mindestens ein aufgereinigtes Epitop
- Isolierung der an das mindestens eine Epitop gebundenen immunologischen Bindungsmoleküle.
"Immunologische Bindungsmoleküle" sind Moleküle, die direkt oder indirekt durch Immunisierung erhalten werden und andere Moleküle binden können. Der Begriff umfasst insbesondere Antikörper und Antikörperfragmente, sowie Single chain Antikörper.
"Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle" bedeutet eine Vielzahl von verschiedenen immunologischen Bindungsmolekülen, die noch so mit ihrer DNA Information verbunden sind, dass durch Vereinzelung von Mitgliedern monoklonale immunologische Bindungsmoleküle erhalten werden können. Der Begriff umfasst insbesondere Bibliotheken von Single chain Antikörpern in Phagen-Bibliotheken. Die Bibliotheken werden durch rekombinante Techniken aus Vögeln, insbesondere Hühnern, hergestellt.
"Epitop" ist eine Struktur, die von einem immunologischen Bindungsmolekül erkannt werden kann.
„Aufgereinigt" bedeutet, dass Epitope aus Mischungen von Epitopen durch technische Prozesse, insbesondere Chromatographie und Elektrophorese, ganz oder teilweise angereichert werden, bzw. dass die Mischungen ganz oder teilweise getrennt werden. Des weiteren bedeutet „aufgereinigt", dass Epitope chemisch oder rekombinant hergestellt und mit einem definierten Reinheitsgrad eingesetzt werden können.
"Selektion immunologischer Bindungsmoleküle" bedeutet ein Verfahren, bei dem die Bindungsfähigkeit der Bindungsmoleküle an Substanzen getestet wird und die Moleküle isoliert werden, die besonders hohe Bindungsaffinitäten zeigen.
Das erfindungsgemäße Verfahren geht von einer bestehenden Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle aus. Solche Bibliotheken können durch Verfahren erhalten werden, wie sie zum Beispiel in Barbas CF 3rd, Furton DR, Scott JK, Silverman GJ (2001) Phage Display: A laboratory manual, lst edn. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York beschrieben sind.
Erfindungsgemäß wird ausgenutzt, dass Bibliotheken aus Nicht-Säugetieren gewonnen werden, da diese gegen hoch konservierte Epitope von Säugetieren bessere Antikörper bilden, als beispielsweise Mäuse, die üblicherweise für Immunisierung verwendet werden. Erfindungsgemäß verwendete NichtSäugetiere sind vorzugsweise Vögel, insbesondere Hühner, „hoch konserviert" bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die Zielepitope in mindestens zwei Säugetierspezies eine Aminiosäuresequenzidentität von mehr als 60%, vorzugsweise 70% aufweisen. Eine solche Sequenzhomologie muss mindestens einen Sequenzabschnitt von 9 Aminosäuren umfassen, kann sich aber auch auf das gesamte Molekül erstrecken. Im bevorzugten Fall liegt die Homologie in mehr als zwei Säugetierspezies vor, wobei die Aminosäureidentität größer als 80%, vorzugsweise 90% ist, und der homologe Sequenzbereich 15 -30 Aminosäuren umfasst. „Hohe Konservierung" im Sinne der Erfindung liegt auch vor, wenn die oben beschriebene Sequenzhomologie nicht gegeben ist, aber ein und derselbe Antikörper Domänen/Epitope phylogenetisch homologer Genprodukte in mindestens zwei Säugetierspezies bindet, wobei die Domänen/Epitope vorzugsweise funktionsanalog sind. Als zweidimensional angeordnete aufgereinigte Proben eignen sich insbesondere eine 2D-Matrix definierter Naturstoffepitope oder Blots von Naturstoffelektrophoresen. Geeignet sind insbesondere auch Anordnungen gereinigter hoch konservierter Säugetierepitope nach Art eines „Arrays", wobei in einem zweidimensionalen Muster den Epitopen eindeutige X- und Y- Koordinaten zugeordnet sind.
Es kann sich bei der zweidimensional angeordneten Probe um den Blot einer Naturstoffelektrophorese handeln. Um eine möglichst hohe Auflösung der Substanzen zu erzielen, wird die Elektrophorese möglichst zweidimensional durchgeführt. Geeignete Stoffe für solche Elektrophoresen sind u.a. Nukleinsäuren und Proteine, die aus Säugetiergeweben isoliert wurden und hochkonservierte Proteine enthalten. Die zweidimensional aufgetrennten Proteine, beispielsweise nach Molekulargewicht und isoelektrischen Punkten werden durch übliche Verfahren auf eine sog. Blotmembran übertragen. Verfahren hierzu sind beispielsweise beschrieben in Harlow E., Lane D (1988) Antibodies: A laboratory manual. ls edn. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York. Darüber hinaus können auch gezielt zweidimensional präparierte Anordnungen gereinigter oder rekombinant exprimierter Epitope Naturstoffepitope analog den Blots von Naturstoffelektrophoresen behandelt und benutzt werden.
Im Falle zweidimensionaler Gele ist es besonders bevorzugt, Gele aus verschiedenen biologischen Kontexten zu vergleichen, beispielsweise nicht- invasive gegen invasive Zellen, tumorigene gegen nicht-tumorigene Zellen, Stammzellen gegen differenzierte Zellen, primär isolierte Zellen gegen Zelllinien etc. Hierbei lässt sich aus den Blots zunächst nur entnehmen, dass unterschiedliche Substanzen vorhanden sind; die Struktur der Naturstoffe, beispielsweise Proteine, ist in der Regel nicht bekannt. - β -
Zur Selektion der Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle wird nun die zweidimensional angeordnete Probe, beispielsweise die Blotmembran oder der zweidimensionale Epitop-Array mit der Bibliothek so in Kontakt gebracht, dass die immunologischen Bindungsmolekülen Bindungen mit den Epitopen eingehen können.
In Abhängigkeit von der Probe ist es ggf. vorteilhaft, vorher die zweidimensional angeordnete Probe zu blockieren, um unspezifische Bindung der Bindungsmoleküle zu verhindern. Solche Blockierungsschritte, beispielsweise mit Albuminlösung sind dem Fachmann bekannt.
Nach der erfolgten Bindung der Bindungsmoleküle werden Waschschritte durchgeführt, die zwischen unspezifisch und spezifisch gebundenen Bindungsmolekülen differenzieren sollen, d.h. die nur schwach unspezifisch gebundenen Moleküle werden entfernt.
Aus der zweidimensional angeordneten Probe werden nun mit geeigneten Mitteln die durch ihre X- und Y-Koordinaten festgelegten Epitope oder Zonen in der Blotmembran entfernt, an die die immunologischen Bindungsmoleküle gebunden sind, die gewonnen werden sollen. Hierzu können Mikrodissektionseinrichtungen verwendet werden, wobei sowohl Glaskapillare und mechanische Bearbeitung als auch Lasertechniken zum Einsatz kommen können. Solche Einrichtungen sind beispielsweise kommerziell erhältlich von den Firmen eppendorf (Hamburg) bzw. SL Microtest (Jena).
Die an diese Areale gebundenen immonulogischen Bindungsmoleküle werden nun verwendet, um in einer an die Bibliothek angepassten Weise amplifiziert zu werden.
Je nach der bereits im ersten Selektionsschritt gefundenen Spezifität kann es sinnvoll sein, das Selektionsverfahren ein oder mehrmals zu wiederholen. Als Ergebnis dieses Verfahrens werden immunologische Bindungsmoleküle erhalten. Die Spezifität der Bindungsmoleküle ist durch ihre Fähigkeit definiert, bestimmte Regionen in zweidimensionalen Proben zu binden, d.h. die Moleküle zeigen eine topographisch definierte Primärspezifität.
Es kann auch sinnvoll sein, um solche immunologischen Bindungsmoleküle zu selektieren, die für die zwei Proben unterscheidenden Merkmale spezifisch sind "einen Teil der" immunologischen Bindungsmoleküle durch in Kontakt bringen einer ersten zweidimensional angeordneten Probe mit der Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle zu entfernen, um dann durch in Kontakt bringen mit einer zweiten zweidimensionalen angeordneten Proben immunologische Bindungsmoleküle für solche Epitope zu selektieren, die die erste zweidimensional angeordnete Probe und die zweidimensional angeordnete Probe unterscheiden.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine gezielte substraktive Selektion von Antikörpern aus geeigneten Bibliotheken an zweidimensionalen Epitoppräparationen aus unterschiedlichem biologischem Kontext. Antikörper können gegen qualitativ neue Epitope in biologischen Proben gezielt isoliert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben:
Beispiel 1 :
Die folgenden Ausführungen stellen ein Beispiel für die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Das Beispiel umfasst die Schritte der Immunisierung eines Nicht-Säugetieres mit verschiedenen Antigen- Präparationen, die Erstellung einer Phagen-Bibliothek sowie die Selektion spezifischer immunologischer Bindungsmoleküle im Sinne des Verfahrens. Immunisierung der Tiere
12 "white leghorn" Hühner im Alter von 6 bis 18 Monaten wurden immunisiert. Die Immunisierungsprotokolle wurden auf publizierten Standardschemata aufgebaut (Gassmann, M. et al. FASEB J (1990) 4:2528-2532) und umfassten eine erste Injektion einer Antigenpräparation (siehe Tabelle 2) in komplettem Freund 'schem Adjuvans, die von zwei Booster-injektionen im Abstand von jeweils 2 bis 4 Wochen gefolgt wurden. Booster-Injektion wurden mit inkomplettem Freund 'schem Adjuvans durchgeführt. Falls mit lebenden menschlichen Zellen immunisiert wurde, wurden pro Injektion eine Million Zellen ohne Adjuvans verabreicht (siehe auch Tabelle 2). 5 Tage nach der letzten Injektion wurden die immunisierten Tiere getötet, die Milzen entfernt und in steriler isotoner Lösung ins Labor verbracht.
Präparation von Splenozyten, Gesamt-RNA und cDNA
Unter sterilen Bedingungen wurde die Milz in 8-10 kleine Stücke zerteilt. Diese Stücke wurden in einem Elvehjem Glasröhrchen mit Hilfe des passenden Pistills vorsichtig von Hand weiter in 3 ml steriler isotoner Salzlösung suspendiert. Diese Suspension wurde durch ein Edelstahlsieb (150 mesh) filtriert, die im Filtrat enthaltenen Milzzellen pelletiert (400g, 5 min. Raumtemperatur) und anschließend in Lyse-Puffer (0.15 M NH4CI; 1 mM KHCO3; 0.1 mM Na2EDTA; pH 7.2) die Erythrozyten selektiv lysiert. Aus den verbleibenden Splenozyten wurde die Gesamt-RNA präpariert sowie cDNA nach einer reversen Transkription mit oligo-dT Primern hergestellt.
Polymerase-Ketten Reaktionen (PCR) für die Bibliothekserstellung
Primer, die benutzt werden können, um die variablen Regionen von leichter (Vk) und schwerer Kette (Vh) der Immunglobulin-cDNAs zu amplifizieren, sind in Tabelle 1 zusammengefasst (Andris-Widhopf, J., Rader, C, Steinberger, Pl, Füller, R., Barbas, C.F., III (2000) Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display. J. Immunol. Methods 242, 159-181). Die PCR wurde mit folgenden Parametern durchgeführt: Die initiale Denaturierung wurde für 1 min bei 94°C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen mit 15 s Denaturierung (94°C), 15 s Annealing (56°C) und 90 s Elongation (74°C). Die Primer führen einen Überlappungsbereich ein, der für die splice overlap extension PCR bei der Erstellung der für scFv codierenden Abschnitte benötigt wird. Die PCR führt zu Produkten von ca. 350 bp Größe. Nach gründlicher Reinigung der Produkte wurden diese für die splice overlap extension PCR eingesetzt.
Splice overlap extension PCR
Aquimolare Mengen (je 100 ng) der Amplifikate von Vk und Vh wurden in der splice overlap extension PCR eingesetzt. Weiterhin enthielten die Reaktionsmischungen ein Paar speziell definierter Primer (Siehe Tabelle 1; Andris-Widhopf, J., Rader, C, Steinberger, PI, Füller, R., Barbas, C.F., III (2000) Methods for the generation of chicken monodonal antibody fragments by phage display. J. Immunol. Methods 242, 159-181J, zusammengefasst, die unter anderem die für die Restriktion und Ligation benötigten Restriktionsschnittstellen in das Produkt einführen. Nach initialer Denaturierung bei 94°C für 1 min. folgten 35 Zyklen mit 15 s Denaturierung (94°C), 15 s Annealing (56°C) und 120 s Elongation (74°C). Das gewünschte Produkt hat eine Größe von ca. 750 bp.
Vektor und Ligation
Verwendet wurde der Vektor pComb3H-SS (Barbas, CF 3rd. Curr. Opin. Biotechnol. (1993) 4:526-530, Biassoni, R. et al. Semin. Cancer Biol. (1999) 9: 13-18, Siegel, D.L et al. J Immunol. Methods (1997) 206:73-85, Andris- Widhopf, J., Rader, C, Steinberger, PI, Füller, R., Barbas, C.F., III (2000) Methods for the generation of chicken monodonal antibody fragments by phage display. J. Immunol. Methods 242, 159-181J. Dieser Vektor sowie die oben beschriebenen Primer wurden im Scripps Research Institut, La Jolla, Kalifornien, USA, speziell für das Phage Display von Antikörperbibliotheken hergestellt und entworfen.
Vor der Ligation wurde der Vektor durch Verdau mit Sfi I linearisiert. Da der Vektor zwei asymetrische Schnittstellen dieses Restriktionsenzyms enthält, ist nach Verdau und Reinigung des Vektors eine direktioneile Klonierung direkt ohne weiteren Verdauungsschritt möglich. Parallel dazu wurde auch das Produkt der splice overlap extension PCR mit dem Enzym verdaut und das restringierte Produkt gereinigt.
Erstellung der Phagen-Antikörper Bibliotheken
Präparierter Vektor (14 μg) und PCR-Produkt (10 μg) wurden zusammen in der Gegenwart von 20 U T4-Iigase über Nacht bei 4°C inkubiert, die Reaktionsprodukte mit Ethanol präzipitiert und in 50 μl Aqua Bidestillata resuspendiert. Mit dieser DNA Lösung wurden elektrokompetente E.coli (XL-1 Blue) transformiert. Die Anzahl der Transformanten wurde durch Titerung auf LB-Ampicillin Platten bestimmt (Sambrook,J., E.F.Fritsch, and T.Maniatis. Cold Spring Harbor Laboratory (1989), Cold Spring Harbor, N.Y.) und die Phagen- Bibliotheken nach Superinfektion der transformierten E.coli mit dem Helferphagen M13KO7 geerntet. Die in Phagenform vorliegenden Bibliotheken wurden sowohl einzeln als auch als gemischte Gesamtbibliothek (kumulative Bibliothek) gelagert.
Um einen Eindruck von der Diversität der Bibliothek zu bekommen und die Dominanz einiger weniger Klone auszuschließen, wurden die Bandenmuster von 9 zufällig gezogenen Klonen nach Restriktion des Inserts analysiert (s. Figur 1). Zur Überprüfung der Diversität der kumulativen Bibliothek wurden 9 Klone willkürlich gepickt, die Plasmide isoliert und die Inserts in einer PCR amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden gereinigt, mit Mspl restringiert, in einem 2% Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die Probenreihen sind von links nach rechts wie folgt in aufsteigender Nummerierung angeordnet. Reihe 1: 100 bp Größen-Leiter; Reihe 2: ΦX174/HaeIII; Reihe 3-11: Klone 1-9. Dies zeigt, dass die Bibliothek nicht von wenigen Klonen dominiert wird.
Beispiel 2:
Erstellung von zweidimensional angeordneten Proben (2-D PAGE)
1.1 Proben Vorbereitung
Die Zelllysate der Chorionkarzinomzelllinien JEG-3 und AC1-1 sowie die der Hybridzellinien AC-1M32, AC-1M46, AC-1M59, AC-1M81, AC-1M88 (s. Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ, Braunschweig) werden verwendet.
Die Zellen je einer konfluenten großen Flasche (75qcm Kulturfläche) werden mit einem Zellschaber abgelöst und bei 1500 rpm, 5 4°C pelletiert. Danach werden die Zellen zweimal mit je 10ml PBS gewaschen. Die Zellen werden in 1,5ml PBS aufgenommen, in ein 1,5ml Reaktionsgefäß überführt und bei 3000 rpm, 5 RT pelletiert. Nach der Zugabe von 200μl Lyse-Puffer werden die Zellen mit einem Pellet-Mischer für V bei voller Geschwindigkeit homogenisiert. Anschließend werden Zelltrümmer bei 17500xg, 45λ, 4°C pelletiert. Der Überstand wird in ein neues Reaktionsgefäß überführt und dieses auf Eis gestellt.
1.2 Proteingehaltsbestimmung
Die Proteinbestimmung erfolgt nephelometrisch. Die Eichgerade wird mit BSA aufgestellt, d.h. die gemessenen Werte entsprechen Protein in BSA-
Äquivalenten.
Die Proben werden für die Proteinbestimmung 1:5 mit Lyse-Puffer verdünnt und dann je 2μl in eine dreifache Bestimmung eingesetzt.
Ansatz für Proteinbestimmung: 190μl dest. Wasser 8μl Lyse-Puffer 2μl Probe 1:5 verdünnt vortexen, kurz zentrifugieren 200μl Trichloressigsäure 20% hinzufügen, vortexen.
Die Proben werden eine Stunde auf Eis inkubiert, in Halbmikroküvetten überführt und in einem Behring Laser-Nephelometer gemessen. Nach der Proteinbestimmung werden die Proben in Portionen zu 150μg Protein bei -70°C eingefroren.
1.3 Rehydratisierung der ImmobilineDryStrips
Jeder Gelstreifen wird in insgesamt 360μl Lösung im Reswelling Tray
(Amersham Pharmacia Biotech) rehydratisiert.
Die Lösung setzt sich aus der Probe in Lyse-Puffer (Urea 7M, Thiourea
2M,CHAPS 4%(w/v), Tris40mM), dem Marker und der
Rehydratisierungslösung (Urea 8M, CHAPS 2%(w/v), Pharmalyte 3-10 0,5%(v/v), DTT 0,2%(w/v), Orange G 0,2mg; Lösung ansetzen in c0mplete ™ Protease Inhibitior Cocktail; vor Gebrauch steril filtrieren) zusammen. Als Marker für die erste Dimension werden 15μl der Carbanhydrase aus dem Carbamylyte Calibration Kit (Amersham Pharmacia Biotech) verwendet. Die Rehydratisierung erfolgt in der Regel über Nacht, mindestens aber zehn Stunden bei 4°C.
1.4 Isoelektrische Fokussierung
Die isoelektrische Fokussierung wird in dem IPG Strip Kit der Multiphor II- Elektrophorese-Kammer (AmershamPharmacia Biotech) durchgeführt Für die Zelllysate haben sich die ImmobilineDryStrips (Amersham Pharmacia Biotech)der Länge 18cm und dem linearen pH-Bereich von 3-10 bzw. 4-7 (für Proteine mit saurem isoelektrischem Punkt (IEP)) als geeignet erwiesen. Während des Laufes werden die Gelstreifen mit Silikonöl bedeckt.
Die Fokussierung im basischen Bereich wird durch fehlendes Reduktionsmittel beeinträchtigt. Da DTT (Dithiothreitol) bei der Elektrophorese zur Anode wandert, wird vor der Kathode ein DTT-Depot angelegt. Dazu wird ein IEF-
Filterpapierstreifen auf 11cm gekürzt und mit 500μl DTT-Lösung getränkt.
Überschüssige Flüssigkeit wird entfernt.
Die Fokussierungsbedingungen werden durch das Netzgerät EPS 3500 XL von
Amersham Pharmacia Biotech kontrolliert. Das Netzgerät wird auf automatische Durchführung der folgenden Fokussierungsphasen im
Gradientenmodus eingestellt:
Tabelle 1: Programm des Netzgerätes für die Focussierung im pH- Gradient 3-10
Spannung 1 Stromstärke 1 Leistung Dauer
Phase 1: 150V j lmA | 5W IVh
Phase 2: 150V i lmA J 5W 150Vh
Phase 3: 300V j lmA | 5W IVh
Phase 4: 300V I lmA | 5W 300Vh
Phase 5. 3500V I lmA | 5W lOOOOVh
Phase 6: 3500V i lmA ! 5W lOOOOVh
Tabelle 2: Programm des Netzgerätes für die Focussierung im pH- Gradient 4-7
Spannung I Stromstärke | Leistung Dauer
Phase 1 : 150V j lmA J 5W IVh
Phase 2: 150V I lmA | 5W 150h
Phase 3: 300V | lmA | 5W IVh
Phase 4: 300V j lmA | 5W 600Vh
Phase 5: 600V j lmA | 5W IVh
Phase 6: 600V j lmA Ϊ 5W 600Vh
Phase 7: 3500V j lmA | 5W 3000Vh
Phase 8: 3500V j lmA | 5W 30000Vh
Nach der Fokussierung können die Gelstreifen bei -70°C einige Zeit gelagert werden.
1.5 SDS-PAGE
Die zweite Dimension ist eine horizontale SDS-PAGE. Die Gele haben eine Größe von 22x24,5cm und werden auf einem Kunststofffilm gegossen. Das hat den Vorteil, daß sie beim Trocknen nicht schrumpfen. Gegossen werden Gradientengele mit einem Gradienten von 12% bis 14% Acrylamid. Vor dem Gießen der Gele werden die Kunststofffilme sechsmal zehn Minuten mit dest. Wasser gewaschen. Die Gele für die zweite Dimension waren wie folgt zusammengesetzt:
Sammelgel Trenngel Lsg. Trenngel
1 2
T=6%, T=12%, T=14%,
C=3% C=2% C=0,5%
Acrylamid 40% 1,82ml 4,365ml 5,1ml
N,N'-Methylenbisacrylamid 2% 1,125ml 2,7ml 0,525ml
Glycerin 87% 6,5ml 4,3ml -
Gelpuffer lOx 1,5ml 1,5ml 1,5ml
Dest. Wasser 4,05ml 2,125ml 7,875ml
TEMED lOμl lOμl lOμl
APS 40% 18μl 10,6μl 7,7μl
Endvolumen 15ml 15ml 15ml
Die vor dem Gellauf erforderliche Äquilibrierung erfolgt in zwei Schritten im Äquilibrierungspuffer (Urea (6M),Tris-HCI (50mM pH 8,5), SDS (2%(w/v)), Glycerin (30%(w/v))). Im ersten Schritt werden die Proteine mit Hilfe von l%(w/v) DTT (Dithiothreitol) im Puffer reduziert. Danach wird das überschüssige Reduktionsmittel durch 4%(w/v) 2-Iodacetamid im Puffer entfernt. Beide Puffer enthalten zusätzlich Bromphenolblau zur Markierung der Lauffront. Jeder Schritt dauert 15 und wird auf einem Schüttler durchgeführt. Vor dem Gebrauch müssen beide Lösungen filtriert werden. Nach dem zweiten Schritt werden die Gelstreifen eine Sekunde mit dest. Wasser abgespült und dann der überschüssige Puffer ca. drei Minuten von den Gelstreifen herunter laufen gelassen.
Zum Starten des Gellaufs werden die Gelstreifen mit der Seite pH 3 bzw. pH 4 nach links auf die Gele für die zweite Dimension aufgelegt. Für den Laufpuffer werden die ExcelGel SDS Buffer Strips verwendet. Die Pufferstreifen enthalten Tricin als Folge-Ion.
Als Marker für die zweite Dimension wird der Markll™ Wide Range Protein Standard von Novex, San Diego, USA verwendet. Neben den Gelstreifen werden jeweils 4μl unverdünnt aufgetragen. Skizze
M pH3 1D pHIO M
Figure imgf000018_0001
Laufbedingungen :
Die Bedingungen des Gellaufs werden durch das Netzgerät EPS 3500 XL von Amersham Pharmacia Biotech kontrolliert. Das Netzgerät wird auf automatische Durchführung der folgenden Phasen eingestellt:
Tabelle 3: Programm des Netzgerätes für die SDS-PAGE
Spannung Stromstärke | Leistung | Dauer
Phase 1: 100V 20mA J 50W j Ih20λ
Phase 2: 600V 30mA | 50W j 5h
Nach der ersten Phase wird der Lauf kurz unterbrochen und die Gelstreifen werden vom Gel entfernt, um den Kathoden-Pufferstreifen auf die Stelle zu verschieben, wo vorher der Gelstreifen lag. Nach dem Ende des Programmes wird das Geld von dem Kunststoffträger gelöst, nach Standardverfahren (Hariow E, Lane D (1988) Antibodies :A laboratory manual. lst edn. CSHL Press, Cold Spring Harbor, New York) in elektrolythaltige Filterpapierstreifen eingelegt und auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran geblottet. Die PVDF Membran wird anschliessend entnommen und getrocknet. Sie enthält die zweidiemensional getrennten und durch Blot übertragenen Proteine als Spotmuster. Tabellen
Tabelle 1: Sequenzen der Primer für die Amplifikation von Vh und Vk sowie die overlap extension PCR Acronym PCR: Vh und Vk a) Vk
CSCVK 5 ' GTGGCCCAGGCGGCCCTGACTCAGCCGTCCTCGGTGTC3 '
CKJo-B 5 ' CGAAGATCTAGAGGACTGACCTAGGACGGTCAGG3 ' b) Vh
CSVHo-F 5 ' GGTCAGTCCTCTAGATCTTCCGCCGTGACGTTGGACGAG3 '
CSCG-B 5 ' CTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGGAGGAGACGATGACTTCGGTCC3 '
Overlap-extension PCR
CSC-F 5 'GAGGAGGAGGAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCGTGACTCAG3 ' CSC-B 5 'GAGGAGGAGGAGGAGGAGGAGCTGGCCGGCCTGGCCACTAGTGG AGG3'
Tabelle 2: Bezeichnung, Antigen und Größe (Anzahl der Transformanten) pro Bibliothek
Phage Display Library Antigen Transformanten
(PDL)
PDL 1-4 Homogenat reifer menschlicher 1.2 109
Placenta PDL 5 Lebende Zellen, Trophoblast- 107
Zellinie AC1-1 PDL 6 Lebende Zellen; Trophoblast- 9.1 107
Zellinie Jeg-3 PDL 7 Lebende Zellen; Trophoblast- 8.6 107
Zellinie AC-1M88 PDL 8 Primärer Zottentrophoblast, 1.8 109 frisch isoliert aus einer reifen
Placenta PDL 9 Primärer invasiver Trophoblast, 3.8 107 frisch isoliert aus Eihäuten einer reifen Placenta PDL 10 Lebende Zellen; Trophoblast- 3.1 107
Zellinie AC-1M32 PDL 11 Lebende Zellen; Trophoblast- 2.1 107
Zellinie AC-1M59 PDL 12 gereinigtes humanes beta-2- 2 108
Glycoprotein I PDL 15 Homogenat von Placenta der 4.7 107
Ratte PDL (kumulative Mischung aller Phagen- Gesamt: 4 109
Bibliothek) Bibliotheken

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen aus einer Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle aus Nicht-Säugetieren mit folgenden Schritten:
- In Kontakt bringen der Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle mit einer zweidimensional angeordneten Probe enthaltend mindestens ein aufgereinigtes Epitop
- Isolierung der an das mindestens eine Epitop gebundenen immunologischen Bindungsmoleküle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die immunologischen Bindungsmoleküle Antikörper oder Antikörperfragmente, insbesondere scFv- Fragmente sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Bibiothek eine Phagen- Bibliothek ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Bibliothek aus Vögeln, insbesondere Hühnern gewonnen wurde.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Epitop durch eine Anordnung in einer zweidimensional angeordneten Probe strukturell verändert wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die zweidimensional angeordnete Probe eine 2D-Matrix definierter Naturstoffepitope, ein geordnetes Array gereinigter Epitope oder ein Blot einer Naturstoff-Elektrophorese ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Naturstoff- Elektrophorese eine zweidimensionale Elektrophorese ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Naturstoff-Elektrophorese eine Protein-Elektrophorese ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zwei zweidimensional angeordnete Proben nacheinander eingesetzt werden.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass immunologische Bindungsmoleküle durch in Kontakt bringen mit einer ersten zweidimensional angeordneten Probe aus der Bibliothek immunologischer Bindungsmoleküle entfernt werden, um durch in Kontakt bringen mit einer zweiten zweidimensional angeordneten Probe immunologische Bindungsmoleküle für solche Epitope zu selektieren, die die erste zweidimensional angeordnete Probe und die zweite zweidimensional angeordnete Probe unterscheiden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass Bereiche der zweidimensional angeordneten Probe durch Mikrodissektionseinrichtungen ausgeschnitten werden, um selektierte Bibliotheken von immunologischen Bindungsmolekülen zu erhalten.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Selektionsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zwei oder mehrmals nacheinander durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 , dadurch gekennzeichnet, dass die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 erhaltenen immunologischen Bindungsmoleküle durch Vereinzelung monoklonalisiert werden.
PCT/EP2002/004048 2001-04-14 2002-04-11 Verfahren zur selektion von immunologischen bindungsmolekülen WO2002084296A2 (de)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2002312811A AU2002312811A1 (en) 2001-04-14 2002-04-11 Method for selecting immunological binding molecules

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP01109232A EP1249704A1 (de) 2001-04-14 2001-04-14 Verfahren zur Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen
EP01109232.7 2001-04-14
DE10123030.3 2001-05-11
DE10123030 2001-05-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2002084296A2 true WO2002084296A2 (de) 2002-10-24
WO2002084296A3 WO2002084296A3 (de) 2003-11-06

Family

ID=26009274

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2002/004048 WO2002084296A2 (de) 2001-04-14 2002-04-11 Verfahren zur selektion von immunologischen bindungsmolekülen

Country Status (2)

Country Link
AU (1) AU2002312811A1 (de)
WO (1) WO2002084296A2 (de)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999039210A1 (en) * 1998-01-29 1999-08-05 Miller, Samuel High density arrays for proteome analysis and methods and compositions therefor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999039210A1 (en) * 1998-01-29 1999-08-05 Miller, Samuel High density arrays for proteome analysis and methods and compositions therefor

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DE WILDT RUUD M T ET AL: "Antibody arrays for high-throughput screening of antibody-antigen interactions" NATURE BIOTECHNOLOGY, NATURE PUBLISHING, US, Bd. 18, Nr. 9, September 2000 (2000-09), Seiten 989-994, XP002162316 ISSN: 1087-0156 *
SCHMITZ, U. ET AL.: "Phage display: A molecular tool for the generation of antibodies - A review." PLACENTA, Bd. 21, Nr. Suppl.A, 2000, Seiten S106-S112, XP001042371 *
VERSMOLD ET AL.: "Antibodies to human placental endothelium can be selected from chicken-derived phage display antibody libraries by panning on paraffin sections." PLACENTA, Bd. 21, Nr. 7, September 2000 (2000-09), Seite A25 XP001042358 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2002312811A1 (en) 2002-10-28
WO2002084296A3 (de) 2003-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3586536T2 (de) Monoklonaler antikoerper gegen ein cytotoxin, denselben erzeugendes hybridoma und verfahren fuer die herstellung des gereinigten cytotoxin.
DE69028671T3 (de) Löslisches extrazellulares Fragment des menschlischen IFN-beta 2/IL-6-Rezeptors, seine Herstellung und diesen Fragment enthaltende pharmazeutische Mischung
Adachi et al. Identification of nuclear pre-replication centers poised for DNA synthesis in Xenopus egg extracts: immunolocalization study of replication protein A.
DE69017753T2 (de) Tumor-Nekrosefaktor-Bindungsprotein II, seine Reinigung und spezifische Antikörper.
DE3586853T2 (de) Immunologisch aktive Peptide, geeignet zur Einführung von Immunisierung gegen Malaria und deren Kodierung von Genen.
DE69220042T3 (de) Mycobakterium polypeptide und dafür kodierende nukleinsäuren zur diagnose und kontrolle von tuberkulose
DE19630390A1 (de) Proteine, insbesondere Membranproteine von Helicobacter pylori, ihre Herstellung und Verwendung
DE68925199T2 (de) Peptide und polypeptide stammend von den submaxillaren drüsen der ratte, deren entsprechende monoklonale und polyklonale antikörper entsprechende hybridomen und verwendung dieser verbindungen in der diagnose bei bestimmungen und für pharmazeutische zwecke
DE102005023011A1 (de) Quantitative Proteinbestimmung von Formalin fixiertem Gewebe
DE69111880T2 (de) Immunogenes Protein und cDNA-Klon.
DE60123819T2 (de) Methode zur in vivo identifizierung von intrazellularen epitopen
DE3525722A1 (de) Verfahren zur herstellung von reinem hefechromatin
Kusama et al. Expression of hard α-keratins in pilomatrixoma, craniopharyngioma, and calcifying odontogenic cyst
WO2002084296A2 (de) Verfahren zur selektion von immunologischen bindungsmolekülen
EP1588172A2 (de) Verfahren zur identifizierung bhs-spezifischer proteine und fragmente davon
DE3645095C2 (de) Antikörper
DE69926606T2 (de) Plazentaprotein 13
EP1277837A2 (de) Epididymis-spezifische DNA-Sequenzen und deren Verwendung
DE19617940A1 (de) Nebenhoden-spezifisches Rezeptorprotein und dessen Verwendung
DE3933850A1 (de) Zytolyse-inhibitor (zli), eine diese blutplasmaprotein kodierende dna-sequenz, sowie ein plasmid, ein wirtsorganismus und ein verfahren zur gewinnung dieses proteins
EP1249704A1 (de) Verfahren zur Selektion von immunologischen Bindungsmolekülen
WO2001081423A1 (de) Antikörper gegen natives gp96, deren herstellung und verwendung
Leone et al. Micropurification of two human cerebrospinal fluid proteins by high performance electrophoresis chromatography
DE3686466T2 (de) Polypeptide, deren kodierende peptide und methode zur herstellung dieser peptide und dnas.
DE69127743T2 (de) Für ein Protein, das sich mit dem Enhancer des Alpha-Fetoprotein verbindet, kodierende DNS

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

122 Ep: pct application non-entry in european phase
NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: JP