WO2002077240A1

WO2002077240A1 - Synthase d'acide desoxymugineique et gene de cette synthase

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Publication number: WO2002077240A1
Application number: PCT/JP2002/001940
Authority: WO
Inventors: Naoko Nishizawa; Satoshi Mori; Takashi Negishi
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation
Priority date: 2001-03-23
Filing date: 2002-03-04
Publication date: 2002-10-03
Also published as: US20040093634A1; CN1213147C; CN1484704A; KR20030084892A; EP1380647A4; JPWO2002077240A1; EP1380647A1

Description

明細書デォキシムギネ酸合成酵素及びその遺伝子技術分野

本発明は、植物の鉄獲得機構に関与するムギネ酸類を生合成する過程における, ニコチアナミンのケト体を 2 ' —デォキシムギネ酸に還元する還元酵素、それをコードする遺伝子、及び当該遺伝子が導入されることによる鉄欠乏耐性が強化された植物に関する。また、本発明は植物の鉄獲得機構に閧与するムギネ酸類を生合成するための酵素群、又はそれらをコードする遺伝子群からなる、鉄欠乏耐性が強化された植物を創生するための酵素キット、及び遺伝子キッ卜に関する。背景技術

鉄は地殻上で第 4番目に存在量の多い元素であり、植物に必須の元素である。鉄は酸素が存在する通常の好気条件下では 3価鉄の不溶態として存在しており、不溶態として存在している鉄をこのまま植物は吸収することができない。特に、石灰岩が多い場合には土壌はアル力リ性となって多くの植物は不溶態の鉄を吸収し、利用することができずに鉄欠乏によって枯死することになる。

植物は、植物に必須の元素である鉄を吸収し、利用するために、不溶態の三価鉄を可溶化してこれを吸収するための機構を獲得してきている。植物が、不溶態の三価鉄を可溶化してこれを吸収するために獲得してきた機構としては、「ストラテジ一 I」と「ストラテジー I I」と呼ばれている 2種類の方法が知られている,

「ストラテジー I」と呼ばれている機構は、根からプロトンを放出し根圏の p Hを低下させることにより不溶態の F e ^{3 +}を可溶化し、さらに根の表層に存在する鉄還元酵素によって F e ^{2 +}に還元した後、二価鉄のトランスポーターによって細胞内に鉄を取り込む。この鉄獲得機構は、双子葉植物やイネ科以外の単子葉植物に採用されている。一方、イネ科植物はファイトシデロフォアと総称される天然の鉄キレー夕一であるムギネ酸類を根から分泌し、土壌中の不溶熊の 3価の鉄を「鉄 -ムギネ酸」キレートとして可溶化し、キレートの形で根から吸収するという高度に巧妙なメカニズムにより鉄を吸収している。イネ科植物のこの鉄獲得機構は、「ストラテジー II」と呼ばれている。

ムギネ酸（MA) は、窒素原子を含む 4員環を有する次式、

で示される化合物であり、 3価の鉄とキレ一トを形成するフアイトシデロフォアと総称される天然の鉄キレ一夕一としては、このムギネ酸とその誘導体である 5 種類のものが知られている。これらの 5種類の誘導体とは、ムギネ酸の前駆体である水酸基が欠落したデォキシムギネ酸（DMA) 、デォキシムギネ酸（DM A) の開環体であるアベニン酸（AVA) 、ムギネ酸のァゼチジン環に水酸基が結合した 3—ヒドロキシムギネ酸（HMA) 及び 3—ェピ—ヒドロキシムギネ酸 ( ( e p i ) - HMA) 、並びに 3—ヒドロキシムギネ酸の開環体であるディスティンコン酸である。 '

これらのムギネ酸及びムギネ酸誘導体の化学構造式、並びにその生合成経路の概要を第 1図に示す。まず、 S—アデノシルメチォニン合成酵素によりメチォ二ンから S—アデノシルメチォニン (S AM) が作られる。次いで、ニコチアナミン合成酵素により 3分子の S—アデノシルメチォニンが結合して 1分子のニコチアナミン (Ν Α) が生成される。生成したニコチアナミンは、ニコチアナミンァミノ基転移酵素により 3 " —ケト体になり、続いて何らかの還元酵素により 2 ' ーデォキシムギネ酸（DMA) になる。これがさらに水酸化されてムギネ酸（M A) をはじめとする他のムギネ酸誘導体になる（Mori and Nishizawa, 1987, PI ant Cell Physiol, 28. 1081-1092； Shoj iina et al. , 1989， Biol. Metals, 2, 142-145； S oj ima et al. , 1990, Plant Physiol. , 93, 1497-1503) 。ムギネ酸類の合成と分泌は鉄欠乏条件によって強く誘導される。これまでに知られているムギネ酸類は 6種類存在し、それぞれのイネ科植物によって分泌されるムギネ酸の種類と分泌量は異なっており、この違いがイネ科植物間の鉄欠乏耐性の差となっていると考えられている。

イネ、トウモロコシ、コムギはムギネ酸類生合成経路の最初のムギネ酸である DM Aまでを分泌し、ォォムギは DMAと MA、さらに水酸化された（ e p i ) - HMAを分泌する。ライムギは DMA、 MA、 HMAを分泌する。ェンバクは DMA及びアベニン酸（AVA) を分泌する。調べられている限り「ストラテジ — 11」による鉄獲得機構を持っているイネ科植物はすべて DMAを分泌し、 DM Aまでの生合成経路をもつていると考えられる。

ムギネ酸類の生合成系において、 S AMから N Aへの反応を触媒するニコチアナミン合成酵素（NAS) と、 N Aからケト体への反応を触媒するニコチアナミンァミノ基転移酵素（NAAT) の活性は鉄欠乏処理で強く誘導される（Kanaza , et al. , 1995, ed J. Abadia, 37-41) 。そして、これらのいずれの酵素も鉄欠乏ォォムギ根から精製され、その遺伝子がクローニングされた（Takahashi, e t al. , 1999， Plant Physiol. , 121, 947-956； Higuchi, et al. , 1999， Plant Physiol. , 119, 471-479) 。

DMAから MAの合成に関与しているタンパク質として I D S 3が挙げられる。 I d s 3遺伝子は，鉄欠乏処理で最も強く発現する（Nakanishi, et al., 1993, Plant Cell Physiol. , 34, 401-410) 。 I D S 3タンパク質は、イネ科植物のうち MA以降を分泌するォォムギとライムギに検出され、 DMAのみを分泌し M Aを分泌しないコムギでは検出されない。また、コムギにォォムギの染色体を一本ずつ添加したコムギ -ォォムギ染色体添加系統を用いた実験により、ォォムギ第四染色体が加わった植物でのみ MAが分泌され、 I D S 3が第四染色体を添加した系統でのみ発現していることから、 I D S 3がムギネ酸合成酵素であろうと推定されてきた。さらに最近になって、 I d s 3遺伝子を導入した形質転換イネの分泌するムギネ酸類の解析によって、 D M Aに加えて M Aが分泌されていることがわかった。これらのことから、 I D S 3がムギネ酸合成酵素であると結論づけられた。また、メチォニンから S AMを生成させる S AM合成酵素の遺伝子も単離されており（Takizawa, et al. , 1996, J. Plant Nu. , 19 (8-9), 1189-1200) 、メチォニンからムギネ酸（MA) が生合成されるまでの経路に関わる酵素はほぼ得られたこととなった。しかし、ケト体から DMAを生成する酵素は NADH、または NAD P H依存型還元酵素であろうということは知られてはいるものの、そのタンパク質、遺伝子のいずれも精製 ·単離には至っていない。

本発明は、ケト体から DMAを生成させる還元酵素、及びその遺伝子を単離 · 同定することを目的とし、これによりムギネ酸の生合成に関与する全酵素の全貌を明らかにし、鉄欠乏耐性の植物における鉄獲得機構を導入する手段を提供する。ところで、植物におけるムギネ酸の分泌の特徴的な現象として、日周性が挙げられる。ォォムギは日の出後からムギネ酸の分泌を始め、 3 ~ 5時間をピークに減少し、日没時には分泌がなくなる（Takagi, et al. , 1984， J. Plant Nu.， 46 9-477) 。また、鉄欠乏によってォォムギ根の微細構造が変化し、根の先端細胞の特殊な顆粒の数および大きさに増加がみられる。その顆粒は表面にリボソームがついていて、膜がゴルジ由来の顆粒よりも薄く粗面小胞体（ r E R) 由来のものと考えられた。そして、この顆粒は皮層細胞、表皮細胞及び根冠細胞で観察され、この顆粒はムギネ酸が分泌される日の出前には膨潤した状態で存在し、ムギネ酸類が分泌されるに伴い収縮することから、ムギネ酸類の合成 ·貯蔵部位であると推定されていた（NisMzawa, et al. , 1987, J. Plant Nu. , 15, 695-713) 。そこで、ムギネ酸の生合成経路に関わるタンパク質（NAS, NA AT) の局在を免疫染色法およびクラゲ由来の緑色蛍光タンパク質（GF P) を用いたトランジェントアツセィ法により観察したところ、いずれの夕ンパク質も鉄欠乏ォォムギの根で増加する特殊な顆粒に局在することが明らかになった（未発表）。さらに、ケト体から DMAを生成させる還元酵素を同定し、その局在を明らかにすることで、当該顆粒がムギネ酸合成部位であることをより明確にすることができる。

また、最近 n a a t— Aを導入した形質転換イネの解析が行われた。その中で鉄欠乏土壌においてもクロ口シスにならす成長するものもあり、ムギネ酸の分泌量も増加することがわかってきた。これは、 n a a t— Aの導入によりケト体の生成量が増加し、内在する還元酵素で DM Aまで生成されたためであると考えられるが、この場合には内在する還元酵素によって DM Aやムギネ酸の産生量が規定されることから、イネに n a a t— Aと還元酵素の遺伝子を同時に導入した場合には、単に n a a t — Aを導入した形質転換イネより鉄欠乏に強いイネを創出することができるものと考えられる。

このように、より鉄欠乏耐性の大きい植物を創出するためには、鉄獲得機構におけるファイトシデロフォアと総称される鉄キレ一ターであるムギネ酸類を生合成する酵素群の全貌を明らかにすることが望まれている。発明の開示

本発明は、鉄獲得機構におけるフアイトシデロフォアと総称される鉄キレ一夕 —であるムギネ酸類を生合成する酵素群の全貌を明らかにすることを目的とし、そのためのケト体から DMAを生成させる還元酵素、及びその遺伝子を単離 · 同定することを目的とする。

また、本発明は、植物におけるムギネ酸類を生合成する酵素群の全貌を明らかにし、より鉄欠乏耐性の大きい植物を創出することを目的としている。図面の簡単な説明

第 1図は、ィネ科植物におけるムギネ酸及びその誘導体の生合成経路を示したものである。

第 2図は、デイジエネレイトプライマーを用いた P C Rにより 3つの増幅された断片が得られたことを示す図面に代わる写真である。

第 3図は、ォォムギの鉄欠乏処理区（ 2週間）及び鉄供給区における地上部と根部におけるノ一ザンブロット解析の結果を示す図面に代わる写真である。 1は 2 0 0 b pの P C R断片を用いたもの、 2は 5 0 0 b pの P C R断片を用いたもの、 3は 7 0 0 b pの P C R断片を用いたものである。

第 4図は、 H P L Cによる本発明の還元酵素活性を測定した結果を示すものである。還元酵素活性量を DM A量として H P L Cにより測定したものである。 1 は DMAのみの場合、 2は還元酵素遺伝子 1の場合、 3は還元酵素遺伝子 2の場合、 4は還元酵素遺伝子 5の場合、 5は還元酵素遺伝子 7の場合、 6は N A AT + N a BH₄の場合、 7はべクタ一コントロール（PYH 2 3) の場合を示す。第 5図は、本発明の還元酵素遺伝子の鉄欠乏応答に対する経時的変化を調べたノーザンプロット解析の結果を示す図面に代わる写真である。ォォムギ根の鉄^ 乏処理 0、 2、 4、 7、 1 4日目、及び鉄欠乏処理 1 4日目から鉄を再投与し続けてから 5 日目のものを用いて行った。 1は還元酵素遺伝子 1の場合、 2は還元酵素遺伝子 2 ( 5) の場合を示す。

第 6図は、本発明の還元酵素遺伝子 1の c DNAの塩基配列及び推定されるァミノ酸配列を示す。

第 7図は、本発明の還元酵素遺伝子 2の c D N Aの塩基配列及び推定されるァミノ酸配列を示す。

第 8図は、本発明の還元酵素遺伝子 5の c DNAの塩基配列及び推定されるァミノ酸配列を示す。

第 9図は、本発明の還元酵素遺伝子 1、還元酵素遺伝子 2 ( 5) 、及びイネのダル夕チオン還元酵素とのアミノ酸配列の比較を示す。 ,

'第 1 0図は、本発明の還元酵素遺伝子とグル夕チオン還元酵素遺伝子の金属ストレスに対する発現応答を示す、図面に代わる写真である。第 1 0図中、 DMA Sは本発明の還元酵素遺伝子を意味し、 G Rはダルタチオン還元酵素遺伝子を意味する。また、 Rは根部、 Sは地上部（葉、茎等）をそれぞれ意味する。

第 1 1図は、本発明の還元酵素遺伝子とダルタチオン還元酵素遺伝子の金属ストレスに対する発現応答を調べる際に使用したプローブの領域のアミノ酸配列を示す。第 1 1図中、 DMA S 1及び DMA S 2は本発明の還元酵素遺伝子を意味し、 G Rはダルタチオン還元酵素遺伝子を意味する。また、第 1 1図上部の細長四角で囲った部分は GRの金属に対する応答を見る際に使用したプローブの領域を示し、上部から下部にかけての広く四角で囲った部分は、 DMASの金属に対する応答を見る際に使用したプローブの領域を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、ニコチアナミンのケト体を 2 ' —デォキシムギネ酸に還元する還元酵素、及びそれをコードする遺伝子に関する。

また、本発明は、ニコチアナミンのケト体を 2 ' —デォキシムギネ酸に還元する還元酵素をコードする遺伝子が導入された形質転換体、及び植物体に関する。さらに、本発明は、ニコチアナミンのケト体を 2 ' ーデォキシムギネ酸に還元する還元酵素、及び鉄キレ一ターであるムギネ酸類を生合成させるための少なくとも 1種の他の酵素を含有してなる、鉄キレーターであるムギネ酸類を生合成させるための酵素のキット、及びそれらの酵素をコードする遺伝子からなる鉄欠乏耐性が強化された植物を創生するための遺伝子キットに関する。

ムギネ酸類の生合成経路に関わる酵素類、タンパク質の多くは精製あるいは遺伝子の単離に成功しているが、ケト体から DM Aの反応を触媒する酵素、及びそれをコ一ドする遺伝子については未だに精製 ·単離に成功していない。そこで、本発明者らは、ムギネ酸類の生合成経路のケト体から DM Aの反応を触媒する酵素をコードする遺伝子の単離を試みた。この遺伝子は、 1 0年前の生嶋（S h o j i ma) による取り込み実験によって NAD ( P ) H依存性の酵素であることが報告されている（Shojima, et al. , 1990, Plant Physiol. , 93, 1497-1503) が、それ以降はタンパク質、遺伝子の精製 ·単離までには至っていない。

D Μ Αの分泌量から推察すると、イネに内在する還元酵素はォォムギに比べて少なく、ォォムギからの単離を試みた。

まず、目的の還元酵素が属すると思われる酵素ファミリ一を検索し、その結果. NADH、 NAD P H依存型還元酵素を広く網羅したアルドーケト還元酵素遺伝子スーノ、一ファミリー (aldo-keto reductase gene superf ami ly (Seery, et a l.， 1998, J. Mol. Evol. , 46, 139-146) ) が最も適切であると考え、そのファミリーのうちで比較的保存されているアミノ酸配列をもとに次の二つの領域を選んだ。

5 ' - YT I GAYTAYB T I GAC - 3 ' ( 5 ' 側）

5 ' - RTGRCAYT C 1 AYYTG— 3 ' ( 3 ' 側）その二つの領域の配列を塩基配列に置き換えたのを基にしてディジエネレイトプライマーを設計した。

このプライマーを用いて、ォォムギ（Hordeum vulgare L. cv. Ehimehadaka n o.l) の鉄欠乏状態の根からの c DN Aライブラリ一を铸型にして P C Rを行った, その結果、 3つの P C R断片（ 2 0 0， 5 0 0， 7 0 0 b p ) が得られた（第 2図）。第 2図は、得られた 3つの P C R断片を示す図面に代わる写真である。第 2図の右側のバンドがそれぞれ下から 2 0 0 b p、 5 0 0 b p、及び 7 0 0 b Pの断片を示している。

得られた P C R断片が目的の遺伝'子であることを調べるために、ォォムギの地上部と根での鉄欠乏区（一 F e) 及び鉄供給区（+ F e) での発現をノーザン解析でみた。結果を第 3図に図面に代わる写真で示す。第 3図の左上の 1は 2 0 0 b pの P C R断片を用いた場合であり、第 3図の右上の 2は 5 0 0 b pの P C R 断片を用いた場合であり、第 3図の中下の 3は 7 0 O b pの P C R断片を用いた場合である。各写真とも、左側の 2つが根部であり、右側の 2つが地上部である。根部及び地上部の各々の一 F eは鉄欠乏処理区（2週間）であり、 + F eは鉄供給区のものである。

5 0 0 b p及び 7 0 0 b pの P C R断片をプロ一プにしたものでは、地上部、根ともに鉄欠乏、鉄供給いずれでも発現がみられなかった。一方、 2 0 O b pの P C R断片をプロープに用いたものでは、全ての条件で発現しているバンドと鉄欠乏区の根でのみ発現しているバンドの二つが検出された（第 3図の 1参照）。ムギネ酸類生合成経路のうち、ケト体から DMAを生成する過程の前後の反応を触媒する酵素の遺伝子は、いずれも鉄欠乏ォォムギ根でのみ発現している。このことから目的の遺伝子は、鉄欠乏ォォムギ根でのみ発現している可能性が高いと考えられる。よって、 2 0 0 b pの P C R断片が目的の遺伝子の塩基配列を含むものであると考え、この塩基配列を含む c DN Aクロ一ンを単離することにした。ノ一ザン解析で根で鉄欠乏誘導のみられるものをプロ一ブにして、コロニーハイブリダィゼイシヨンにより c D N Aクローンの単離を行った。アンピシリンを含んだ L Bプレートに 2 5 0 0 0〜 5 0 0 0 0クロ一ン Z枚になるように計 8枚に鉄欠乏ォォムギ根 c DNAライブラリ一を塗付した。 1次スクリーニングでポジティブなクローンを単一クローンにするように 3次スクリ一ニングまで行った。その結果、 4つのポジティブクローンが得られた（各々 1、 2、 5、 7 と名付けた）。ここで得られた c DNAクローンについて、シークェンスを決定した。これらの遺伝子の塩基配列は、いずれ.もイネのグルタチオン還元酵素（Kaminaka, et al.， 1998, Plant Cell Physiol. , 39, 1269-1280) に最も高い相同性を示した。

次に、これらの c D N Aクローンについて、この c DN Aを用いて酵母を形質転換して得られたタンパク質を用いた酵素活性を調べた。基質となるケト体は不安定な化合物であるために、その前駆体であるニコチアナミンを出発物とした。高橋の方法（Takahashi, et al. , Plant Physiol. , 121, 947-956 (1999)) による N A AT活性測定法に準じて行った。即ち、 N A ATの存在下にニコチアナミンを反応させてケト体とした後、 N a B H₄による化学的な還元の代わりに、酵母の形質転換体から発現させたタンパク質を用いた。コントロールとして、インサートの入っていない空のベクタ一（p YH 2 3) から発現させたタンパク質を用いた。活性量は、 H P L Cを用いて DMA量を検出することにより測定した。

H P L Cの結果を第 4図に示す。第 4図の 1は DM Aのみの場合であり、標準 DMAにおける保持時間（retention time) を示す。第 4図の 2は還元酵素遺伝子 1を発現させたものである。第 4図の 3は還元酵素遺伝子 2を発現させたものである。第 4図の 4は還元酵素遺伝子 5を発現させたものである。第 4図の 5は還元酵素遺伝子 7を発現させたものである。第 4図の 6は N a BH₄による化学的な還元の場合であり、第 4図の 7はコントロールベクター（P YH 2 3 ) を発現させたものである。

ベクターのみで行ったとき（第 4図の 7 ) と比べて多く DMAがみられるものを活性ありと判断した。その結果、還元酵素遺伝子 7 (第 4図の 5) の c DNA から得られたタンパク質以外では DMAが検出された。そのうち、還元酵素遺伝子 2 (第 4図の 3 ) と還元酵素遗伝子 5 (第 4図の 4) の c DNAのものが最も高い活性がみられた。

次に、ここで活性がみられた 1、 2、 5について、鉄欠乏に対する応答をみることにした。得られた c D N Aクローンのうち活性がみられた還元酵素遺伝子 1 、 2及び 5 について、鉄欠乏に対する経時的変化をノーザン解析により行った。用いた R N Aはォォムギ根を鉄欠乏にする直前（ 0 日目）のものと、鉄欠乏にしてから 2、 4、 7 、 1 4日目のもの、さらに鉄欠乏にしてから 1 4日経過したものに 5 日間鉄を与え続けたものの計 6サンプルである。 R N Aの泳動から画像処理までは、 P C R断片のノーザン解析と同様に行った。

その結果を第 5図に図面に代わる写真で示す。第 5図の 1は還元酵素遺伝子 1 を用いたものであり、第 5図の 2は還元酵素遺伝子 2を用いたものである。第 5 図の 0 d、 2 d、 4 d、 7 d、 1 4 1及び5 01は、それぞれォォムギ根の鉄欠乏処理 0 、 2、 4、 7、 1 4日目、及び鉄欠乏処理 1 4日目から鉄を再投与し続けてから 5 日目のものを示す。

この結果、いずれの遺伝子においても鉄欠乏が進むにつれて発現が誘導されており、さらに、鉄を与えたことで発現が減少することがわかった（第 5図の 5 d ) 。

次に、活性がみられた還元酵素遺伝子 1 、 2及び 5の c D N Aクローンの塩基配列を決定した。その結果、還元酵素遺伝子 2と 5はオープンリーディングフレーム（O R F ) 部分の塩基配列が同一のものであった。また、還元酵素遺伝子 1 の 0 R Fは他の二つの 0 R F部分の 5 ' 末端側に 3 1 5 b p多いものであった。還元酵素遺伝子 1のアミノ酸配列を配列表の配列番号 1に、還元酵素遺伝子 2 のアミノ酸配列を配列表の配列番号 2にそれぞれ示す。また、還元酵素遺伝子 1 の塩基配列を配列表の配列番号 3に、還元酵素遺伝子 2の塩基配列を配列表の配列番号 4に、還元酵素遺伝子 5の塩基配列を配列表の配列番号 5に、それぞれ示す。さらに、還元酵素遺伝子 1の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を第 6図に、還元酵素遺伝子 2の塩基配列及び推定されるアミノ酸配列を第 7図に、還元酵素遺伝子 5の塩基配列及び推定されるァミノ酸配列を第 8図に、それぞれ示す, 次に、決定された塩基配列を基に予測されるアミノ酸配列から、得られる情報について調べた。それぞれのアミノ酸配列は、イネのグルタチオン還元酵素に 8 9 . 5 %の相同性があった（第 9図参照）。第 9図の上段は還元酵素遺伝子 1のアミノ酸配列を、中段は還元酵素遺伝子 2又は 5のアミノ酸配列を、下段はイネのグルタチオン還元酵素のアミノ酸配列をそれぞれ示している。

次に、得られたタンパク質の P S ORTによる局在予測を行った。その結果、還元酵素遺伝子 1によるものは原形質膜（plasmamembrane) に、還元酵素遺伝子 2 ( 5 ) によるものは小胞体（endoplasmic ret iculum (membrane) ) に局在する可能性があることがわかった。一方、本発明の還元酵素遺伝子のアミノ酸配列とァミノ酸配列で 8 9. 3 %と最も高い相同性を示したイネのグル夕チオン還元酵素は細胞質（cytoplasm) に最も高い可能性を示した。

本発明の還元酵素、及びその遺伝子は、デイジエネレイトプライマーの設計のもとになつた NAD (P) H依存型還元酵素ファミリ一とは相同性がなく、ダルタチオン還元酵素に最も高い相同性を示した。また、遺伝子 2 (又は 5) はアミノ酸配列から予測される局在場所が小胞体の膜であった。このことと、鉄欠乏ォォムギ根に特異的な粗面小胞体由来の顆粒にムギネ酸類生合成経路に関わる N A Sと NAATが局在することとを考えあわせると単離された遺伝子のうち 2あるいは 5が目的の遺伝子である可能性が高いといえる。さらに、鉄欠乏に対する経時的変化ではいずれも、鉄欠乏による誘導と鉄投与による発現の減少がみられたことから、これらの遺伝子が鉄に対する応答性を持つことが明らかになった。 ' 以上を総合して考えると、本発明の遺伝子はムギネ酸類生合成経路中のケト体から DMAの反応を触媒する還元酵素であり、将来的に今までにない強度な鉄欠乏耐性イネの創出への道が開けたといえる。

このように、本発明の還元酵素は、ニコチアナミンのケト体を 2 ' —デォキシムギネ酸に還元する還元酵素であり、本発明により植物の鉄獲得機構の「ストラテ一ジ II」と呼ばれている手法におけるフアイトシデロフォアと総称される天然の鉄キレ一タ一であるムギネ酸類を生合成するための酵素群の全てが解明されたしとに /よ ₀

したがって、これらの酵素又はこれらの酵素をコ一ドする遺伝子を植物体に導入することにより、植物は「ストラテジー II」と呼ばれている鉄獲得機構を取得することができ、鉄欠乏耐性が強化されることになる。

ムギネ酸類を生合成するための酵素群の中の 1種である NAATでは n a a t ゲノムを導入した形質転換イネが作られてきた。 NAATは、ムギネ酸類合成経路の N Aからケト体への反応を触媒する酵素であり、この遺伝子が導入されることにより、鉄欠乏土壌でクロ口シスにならず生育できることがわかった。この N A A Tの遺伝子が単独で形質転換されたイネは、鉄欠乏により n a a t遺伝子の発現誘導によって過剰量のケト体が生成し、そして、過剰に存在するケト体は内在の還元酵素によって D M Aに変換され、この結果鉄欠乏土壌でクロロシスにならず生育できたと考えられる。

しかし、ィネに内在する還元酵素は D M Aの分泌量から推察するにォォムギに比べて少なく、 n a a t遺伝子の発現誘導によって過剰に生成されたケト体を効率よく D M Aに変換していない可能性が高い。そうしたことから考えると、ケ卜体から D M Aへの反応を触媒する酵素をコ一ドする本発明の遺伝子を、 n a a t ゲノムと共に形質転換したイネは、 N A A Tにより過剰に作られたケト体を還元酵素により効率よく D M Aに変換して、 n a a tゲノム単独で形質転換したイネよりも数段鉄欠乏耐性に強くなると期待される。こうした点から考えると、ケト体から D M Aの反応を触媒する還元酵素を単離することは非常に重要なことであるといえる。本発明は、植物の鉄獲得機構に関与するムギネ酸類を生合成する過程における，ニコチアナミンのケト体を 2 ' —デォキシムギネ酸に還元する還元酵素を提供するものである。本発明の還元酵素は好ましくは配列表の配列番号 1又は 2に記載のアミノ酸配列を有するものである。このアミノ酸配列は、ムギネ酸類を生合成する過程における、ニコチアナミンのケト体を 2 ' —デォキシムギネ酸に還元する活性を有するのであれば、 1個又は 2個以上のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されてもよいし、 1個又は 2個以上のアミノ酸が欠失してもよいし、 1個又は 2 個以上のアミノ酸がさらに付加してもよい。また、これらの置換、欠失、付加が組み合わされれて生起したアミノ酸配列を有するものであってもよい。

また、本発明は前記した本発明の還元酵素をコードしてなる遺伝子を提供するものである。本発明の遺伝子の好ましい塩基配列は、配列表の配列番号 3、配列番号 4又は配列番号 5のいずれかに記載される塩基配列からなるものであるが、これに限定されるものではない。前記したアミノ酸配列をコードするものであれば、これを発現しやすい塩基配列に変更することもできる。また、これらの塩基配列の相補的な配列や、ストリージェントな条件下で当該塩基配列とハイプリダィズし得る塩基配列からなる遺伝子もまた本発明の遺伝子に包含される。

さらに、本発明の遺伝子の一部からなる塩基配列も本発明に包含される。これらの部分的な配列は P C R用のプライマーとしても使用できるものであり、本発明はこのような方法に使用される部分配列を包含している。

また、本発明の遺伝子はその上流に必要なプロモ一夕一領域を有していてもよい。このようなプロモ一夕一は下記の配列表に示されるものに限定されるものではなく、本発明の遺伝子が導入される植物体に応じてその植物に適したプロモー夕一を選択することができる。

本発明は、前記した本発明の遺伝子で形質転換された形質転換体を提供するものである。本発明の形質転換体における宿主細胞としては、大腸菌などの細菌類やハムスターなどの動物細胞、植物細胞、酵母類などの各種の細胞を使用することができる。これらの形質転換体により本発明の還元酵素を発現させて製造することができる。

また、本発明は、前記した本発明の遺伝子が導入された植物を提供する。本発明の還元酵素の解明によりムギネ酸類の生合成に関与する酵素群の全貌が明らかにされたことから、鉄獲得機構としてムギネ酸類が鉄キレ一ト剤として作用するストテジ一I Iを有さない植物においてもこれらの酵素群をコードする遺伝子をセットにして植物に導入し、新たにストラテジ一 I Iによる鉄獲得機構を付与することも可能となる。したがって、本発明の遺伝子が導入される植物としては、ストラテ一ジ I Iによる鉄獲得機構を有するイネ科植物に限定されるものではないが、イネ科植物への導入が好ましい。

また、本発明の遺伝子を単独で導入しても鉄欠乏耐性の強化を期待することはできるが、好ましくは他の酵素をコードする遺伝子、好ましくは n a a tを同時に導入することにより、より鉄欠乏耐性が強化された植物をえることができる。前述してきたように、本発明の還元酵素の解明により第 1図に示されるムギネ酸類の生合成経路におけるすべての酵素が解明され、その全貌が明らかになった, したがって、本発明は、ストラテ一ジ I Iに関与するムギネ酸類の生合成のための酵素群を提供するものでもある。即ち、本発明はメチォニンを S —アデノシルメチォニン（S A M ) に変換する「S—アデノシルメチォニン合成酵素」、それをニコチアナミン（N A ) に変換する「ニコチアナミン合成酵素」、それをケト体に変換する「ニコチアナミンァミノ基転移酵素（N A A T ) 」、及び本発明の

「還元酵素」、さらにムギネ酸に変換する「 I D S 3」などからなる、鉄キレーターであるムギネ酸類を生合成させるための酵素のキットを提供するものである。本発明の酵素のキットは、本発明の還元酵素を必須の酵素とし、他の酵素の少なくとも 1種を含有してなるものであり、好ましくはメチォニンからの生合成を完成させ得る全酵素を含有するキットである。本発明の酵素のキットを用いることによりメチォニンまたはその生合成過程の生成物からムギネ酸類を簡便に製造させることができることになる。

また、本発明は、前記した酵素群の各酵素をコードする遺伝子を含有してなる、鉄欠乏耐性が強化された植物を創生するための遺伝子キットを提供するものである。これらの遺伝子を植物に導入することにより鉄欠乏耐性の強化された植物を創生することができる。前記した全酵素についてそれらをコードする遺伝子を導入することにより、メチォニンからムギネ酸類の生合成過程が強化された植物を創生することができる。

植物に導入される各酵素の遺伝子は、当該遺伝子が導入される植物のプロモー夕一領域を含有している遺伝子であることが好ましい。また、各遺伝子が導入される植物としては、イネ科植物に限定されるものではないが、イネ科植物が好ましい。実施例

次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。実施例 1 ォォムギの栽培

ォォムギ（Hor deum vu l gare L . cv. E ime adaka no . 1 ) の種子を、蒸留水で湿らせたペーパータオル上に並べ、アルミホイルで遮光して室温に 3日間置き発芽させた。芽生えを水耕液に浮かべたネットの上に移植し、ポンプで通気しながら育てた。第二葉が現れた後、 2 0 Lの容器に移植し、水耕栽培を続けた。

水耕液の組成は、 [ 7 X 1 0— ⁴M K₂S〇4、 1 X 1 0— ⁴M KC し 1 X 1 0 -⁴ M KH₂P 0₄、 2 X 1 0 - ³M C a (N O ₃) ₂、 5 X 1 0 "⁴M Mg S〇 ₄、 1 X 1 0- ⁵M H₂B 0₃、 5 X 1 0 "⁷M Mn S 0₄、 5 X 1 0 "⁷M Z n S 0₄、 2 X 1 0 - ⁷M C u S O 4 , 1 X 1 0 - ⁸M (N H₄) _eMo 0₂₄、 1. 5 X 1 0 "⁴M F e— EDTA] であった。

毎日 p H 5. 5付近になるように水耕液の p Hを I N HC 1で調整した。水耕液は蒸留水を用いて調製し、 1週間ごとに取り替えた。第四葉が現れたら、根を蒸留水で洗浄して付着した鉄を除いた後、鉄分を除いた水耕液に移して、鉄欠乏処理を始め目的の期間まで栽培した。実施例 2 デイジエネレイトプライマーの設計とそれを用いた P CR

まず、目的の還元酵素が属すると思われる酵素ファミリ一を見つけることから始めた。その結果、 NADH、 NAD PH依存型還元酵素を広く網羅したアルドケ卜盧元酵禁遺伝子スーパ一ファミリ一 ^aldo-keto reductase gene super f am ily) が最も適切であると考えた。次に、そのファミリ一のうちで比較的保存されているアミノ酸配列をもとに二つの領域を選んだ。その二つの領域の配列を塩基配列に置き換えたのを基にしてディジエネレイトプライマ一を設計した。デイジエネレイトプライマーは合成した。

L D Y V/L D · - · 5 ' - YT I GAYTAYB T I GAC - 3 ' ( 5 ' 側）

Q V/ I E C H · - · 5 ' - RTGR CAYT C 1 AYYTG- 3 ' ( 3 ' 側）

このプライマ一を用いて、鉄欠乏ォォムギ根の c DN Aライブラリ一を铸型にして P C Rを行った。

その結果、 2 0 0 b p、 5 0 0 b p、及び 7 0 0 b pの 3つの P CR断片を得た。結果を第 2図に示す。実施例 3 鉄欠乏ォォムギ根で誘導される P C R断片の選抜

P C Rによって増幅した断片のうち目的のものは、鉄欠乏の根で誘導されるものと考えられるのでその選抜の方法としてノーザン解析を用いた。 RNAは、鉄欠乏を 2週間かけたォォムギの根と地上部をサンプリングしたものから抽出した。 RN Aの抽出方法は以下の通りである。

植物を液体窒素を用いて擦り潰したものを抽出バッファー（ 1 5 OmM L i C l， 5mM E D T A p H 8 , 5 % S D S , 8 0 mMT r i s - H C 1 H 9 ) に溶かした。次に、フエノール - クロ口ホルム抽出を 2回行った。その上清に 0. 3 M酢酸ナトリウムと 1容量のイソプロパノールを入れて遠心した。沈殿物を 3 M塩化リチウムで溶解し 1 0分間氷冷させた後、遠心した。沈殿物を 8 0 %エタノールで洗浄して、滅菌水によって RN Aを溶解した。保存は - 8 0でで行った。得られた RNAを 1. 2 %ァガロースゲルに泳動した後、メンブレン (Hy b o n d— N + , アマシャムフアルマシア）にブロッテイングした。

ハイブリダィゼ一ションに用いるプロ一プは、 P C R断片をそれぞれランダムプライマ一ラベリングキット（Random Primer DNA Labelling Kit) V e r . 2 0 (T a K a R a ) により作製した。ハイプリダイゼ一シヨンは、チヤ一チハイブリダィゼ一シヨン液（ 0. 5 Mチヤ一チリン酸バッファー， I mM EDTA， 7 % (w/ v) S D S) を用いて 6 5 °Cで 1 8時間行った。チャーチハイプリ洗浄液（ 4 0 mM チャーチリン酸バッファー， 1 % (w/ V ) S D S) で 6 5°C、 1 0分間を 2回行った。洗浄後、メンブレンをサランラップに包んでカセット内で I Pイメージングプレート（Fuji Film) に 1晚露光した。画像処理は B A S 2 0 0 0イメージングアナライザ一（Fuji Film) で行った。

結果を第 3図に示す。第 3図の 1は 2 0 0 b pの P C R断片を用いたもの、第 3図の 2は 5 0 O b pの P C R断片を用いたもの、第 3図の 3は 7 0 0 b pの P CR断片を用いたものである。実施例 4 スクリーニング

ノ一ザン解析で根で鉄欠乏誘導のみられるものをプローブにして、コロニーハイブリダィゼイシヨンにより c D N Aクローンの単離を行った。アンビシリンを含んだ L Bプレートに 2 5 0 0 0〜 5 0 0 0 0クロ一ン Z枚になるように計 8枚に鉄欠乏ォォムギ根 c DNAライブラリ一を塗付した。 1次スクリーニングでポジティブなクローンを単一クローンにするように 3次スクリ一二ングまで行った。そこで得られた c DNAクロ一ンについてはシークェンスを決定した。実施例 5 活性測定による選抜

スクリーニングで得られた c DN Aクローンについて、酵素活性を調べた。用いるタンパク質は、酵母に c DNAを形質転換して得られたものを用いた。また、ムギネ酸類の生合成経路中のケト体は不安定な化合物であるために、その前駆体であるニコチアナミンを出発物とした。高橋らの方法（Takahashi, ei al. , Pla nt Physiol., 121, 947-956 (1999)) による N A A T活性測定法に準じて行った。ニコチアナミンを NAATで反応させケト体を作った後、 N a BH₄による化学的還元の代わりに得られた c DNAクローンより発現させたタンパク質を反応させた。用いたタンパク質は全て酵母を破砕して得られたタンパク質を分子量 3 0 k D a以上のものをウルトラフリ一（Ultrafree) C 3 - L TK (Japan milli pore Co.) にトラップして、そのカップ上で酵素反応させた。還元酵素の反応に用いるバッファ一は、 0. 1 M T r i s， 0. I mM EDTA, 1 0mM NAD ( P ) H， p H 8. 5を用いた。コントロールとして、インサートの入つていないベクター（p YH 2 3) から発現させたタンパク質を用いた。活性量は、 H P L Cを用いて DM A量を検出することにより測定した。

結果を第 4図に示す。第 4図の 1は DMAのみの場合であり、標準 DMAにおける保持時間（retention time) を示す。第 4図の 2は還元酵素遺伝子 1を発現させたものである。第 4図の 3は還元酵素遺伝子 2を発現させたものである。第 4図の 4は還元酵素遺伝子 5を発現させたものである。第 4図の 5は還元酵素遺伝子 7を発現させたものである。第 4図の 6は N a B H ₄による化学的な還元の場合であり、第 4図の 7はコントロールベクタ一（ P YH 2 3 ) を発現させたものである。

ベクターでのみで行ったとき（第 4図の 7 ) と比べて多く DMAがみられるものを活性ありと判断した。その結果、還元酵素遺伝子 7 (第 4図の 5) の c DN Aから得られたタンパク質以外では DMAが検出された。そのうち、還元酵素遺伝子 2 (第 4図の 3) と還元酵素遺伝子 5 (第 4図の 4) の c DNAのものが最も高い活性がみられた。実施例 6 ノーザン解析

得られた c DN Aクローンのうち活性がみられたものについて、鉄欠乏に対する経時的変化をノーザン解析により行った。用いた RNAはォォムギ根の鉄欠乏をかける直前（0 日目）と、かけてから 2、 4、 7、 1 4日目、さらに鉄欠乏をかけてから 1 4日経過したものに 5 日間鉄を与え続けたものの計 6サンプルである。 RN Aの泳動から画像処理までは、 P C R断片のノーザン解析と同様に行つた。

結果を第 5図に示す。第 5図の 1は還元酵素遺伝子 1を用いたものであり、第 5図の 2は還元酵素遺伝子 2を用いたものである。第 5図の 0 d、 2 d、 4 d、 7 d、 1 4 d及び 5 dは、それぞれォォムギ根の鉄欠乏処理 0、 2、 4、 7、 1 4日目、及び鉄欠乏処理 1 4日目から鉄を再投与し続けてから 5日目のものを示す。

この結果、いずれの遺伝子においても鉄欠乏が進むにつれて発現が誘導されており、さらに、鉄を与えたことでの発現が減少することがわかった（第 5図の 5 d) 。実施例 7 本発明の還元酵素遺伝子とダルタチオン還元酵素遺伝子の金属ストレスに対する発現応答

イネの還元酵素遺伝子（DMAS l , DMA S 2) と、イネのグルタチオン還元酵素遺伝子（GR) の塩基配列を比較すると、前者は G Rの一部であることがわかる。したがって、 GRそのものが鉄欠乏で誘導されてその産物であるダル夕チオン還元酵素そのものが DMA S活性を持った可能性がある。この可否を確認するために、 G R遗伝子の 5 '上流のみに属する塩基配列をプローブにして、鉄と亜鉛の金属ストレス下でのノーザン法による遺伝子発現を調べた。 ( 1 ) 植物材料

ォォムギ（Hordeum vulgare L. cv. Eh imehadaka no.1) の種子を、蒸留水で湿らせたペーパータオル上に並べ、アルミホイルで遮光して室温に 3日間置き発芽させた。芽生えを水耕液に浮かべたネットの上に移植し、ポンプで通気しながら育てた。第二葉が現れた後、 2 0 Lの容器に移植し、水耕栽培を続けた。水耕液の組成は [ 7 X 1 0— ⁴M K S 0 1 X 1 0— ⁴M KC 1 、 1 X 1 0— ⁴M K H₂P 0₄、 2 X 1 0 "³Μ C a (N O ₃) 、 2. 5 X 1 0 ~⁴U Mg S 0₄、 I X 1 0— ⁵M H₂B〇 ₃、 5 X 1 0— ⁷M Mn S 0₄、 5 X 1 0— ⁷M Z n S〇₄、 2 X 1 0 - ⁷M C u S O 1 X 1 0 -⁸ M (NH₄) ₆Mo ₇〇 ₂₄、 1. 5 X 1 0一⁴ M F e— EDTA] とした。毎日 pH 5. 5付近になるように水耕液の p Hを I N HC 1で調整した。水耕液は蒸留水を用いて調製し、 1週間ごとに取り替えた。第四葉が現れたら、根を蒸留水で洗浄して付着している金属を除いた後、各々の金属（F e、 Z n) だけを除いた水耕液に移して、金属欠乏処理（F e、 Z n) を始め、目的の期間まで栽培した。

(2 ) ノーザン解析

金属欠乏（F e、 Z n) をかけたォォムギの根と地上部をサンプリングし、 R N Aを抽出した。

R N Aの抽出方法は以下の通りである。

液体窒素で凍結した植物を乳鉢中で擦り潰し、抽出バッファー（ 1 5 0mM L i C l、 5 mM EDTA p H 8、 5 % S D S、 8 0 mM T r i s - H C 1 p H 9 ) に溶解した。次に、フエノールークロロホルムによる抽出を 2回行った。得られた上清に 0. 3 M酢酸ナトリウムと 1容量のィソプロパノールを入れて遠心した。沈殿物を 3 M塩化リチウムで溶解し 1 0分間氷冷した後、さらに遠心した。その沈殿物を 8 0 %エタノールで洗浄した後、滅菌水により RN Aを溶解した。保存は— 8 0 °Cで行った。

得られた RNAを 1 . 2 %ァガロースゲルに泳動した後、メンブレン（Hy b 0 n d— N +、アマシャムフアルマシア）にブロッテイングした。

ハイプリダイゼィションに用いたプローブは、 P C R断片をそれぞれランダムプライマーラベリングキット（Random Primer DNA Labelling Kit) V e r . 2. 0 (T a K a R a ) により標識して作製した。ハイブリダィゼイシヨンは、チヤ —チハイブリダィゼイシヨン液（ 0. 5 Mチヤ一チリン酸バッファ一、 I mM EDTA、 7 % (w/v) S D S) を用いて 6 5 °Cで 1 8時間行った。洗浄は、チャーチハイブリ洗浄液（ 40 mMチヤ一チリン酸バッファ一、 1 % (w/ V ) S D S) で 6 5°C、 1 0分間を 2回行った。洗浄後、メンブレンをサランラップに包み、カセット内で I Pイメージングプレート（Fuji Film) に 1晚露光した。画像処理は B A S 3 0 0 0イメージングアナライザ一（Fuj i Film) で行った。

( 3) 結果と考察

第 1 0図に DMA S 1の配列（第 1 1図の広く四角で囲った、 DMA S l , D MAS 2 , G Rの共通配列に相当する）をプローブにしてノーザンした結果を示す。これは鉄欠乏の根部で強く発現している（ほかに、亜鉛欠乏の根部と地上部 (葉、茎等）でも比較的強く発現している）。しかし GR固有の配列（第 1 1図の細長四角で囲った配列）をプローブにした場合は、対照区（コントロール）でも、どのストレス下でも発現していない。この 2つの結果は G Rの遺伝子発現が鉄欠乏と何ら関係がないことを意味しており、通常条件でもほとんど発現していない遺伝子であることを示している。逆に DMAS 1または DMAS 2がォォムギの鉄欠乏の根部で強く誘導される遺伝子であることを示している。したがって DMASは鉄欠乏条件下で遺伝子発現が誘導され、ケト体からデォキシムギネ酸を合成する酵素であると結論できる。 DMASのゲノム遺伝子はまだク口一ニングされていないが、このゲノム遺伝子の 5 '上流にはまだ未知の鉄欠乏応答性シスエレメントが含まれていると考えられる。産業上の利用可能性

本発明は、植物の鉄獲得機構に関与するムギネ酸類を生合成する過程における、ニコチアナミンのケト体を 2 ' —デォキシムギネ酸に還元する還元酵素、それをコードする遺伝子、及び当該遺伝子が導入されることによる鉄欠乏耐性が強化された植物を提供するものである。植物の鉄欠乏耐性を強化することにより、アル力リ土壌などの鉄の供給が困難な土壌においても植物の栽培が可能となり、栽培可能な耕地面積が拡大され、今後の食糧問題や資源問題を解決することが可能となる。また、本発明の還元酵素の解明により植物のムギネ酸類の生合成経路の全貌を解明することができた。したがって、これらの生合成に関与している酵素群，及びそれらをコードする遺伝子を用いて、鉄欠乏耐性を格段に強化した植物を創生するも可能となった。

したがって、本発明は、ムギネ酸類の生合成に必要な一連の酵素系、及びそれらをコ一ドする一連の遺伝子系を提供するものであり、これにより植物にストラテージ I Iによる鉄獲得機構を付与させることも可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . ニコチアナミンのケト体を 2 ' ーデォキシムギネ酸に還元する還元酵素。

2 . 還元酵素が、ォォムギ由来のものである請求の範囲第 1項に記載の還元酵素。

3 . 還元酵素が、配列表の配列番号 1又は 2に記載されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列における 1個若しくは 2個以上のアミノ酸が欠失、付加若しくは置換されてなるアミノ酸配列からなるものである請求の範囲第 1項又は第 2項に記載の還元酵素。

4 . 請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の還元酵素をコ一ドしてなる遺子。

5 . 遺伝子が、配列表の配列番号 3、配列番号 4又は配列番号 5のいずれかに記載される塩基酸配列、又はストリージェン卜な条件下で当該塩基配列とハイブリダイズし得る塩基配列からなるものである請求の範囲第 4項に記載の遺伝子。

6 . 請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の遺伝子で形質転換された形質転換体,

7 . 形質転換体の宿主細胞が、植物細胞である請求の範囲第 6項に記載の形質転換体。

8 . 請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の遺伝子が導入された植物。

9 . 植物がィネ科植物である請求の範囲第 8項に記載の植物。

1 0. 鉄欠乏耐性が強化された植物である請求の範囲第 8項又は第 9項に記載の植物。

1 1. 請求の範囲第 1項〜第 3項に記載の還元酵素、及び鉄キレーターであるムギネ酸類を生合成させるための少なくとも 1種の他の酵素を含有してなる、鉄キレ一ターであるムギネ酸類を生合成させるための酵素のキット。

1 2. 請求の範囲第 4項又は第 5項に記載の遺伝子、及び鉄キレ一夕一であるムギネ酸類を生合成させるための少なくとも 1種の他の酵素をコ一ドする遺伝子を含有してなる、鉄欠乏耐性が強化された植物を創生するための遺伝子キット。

1 3. 遺伝子が、当該遺伝子が導入される植物のプロモーター領域を含有している遺伝子である請求の範囲第 1 2項に記載の遺伝子キット。

1 4. 遺伝子が導入される植物がイネ科植物である請求の範囲第 1 3項に記載の遺伝子キット。