WO2002074951A1 - Procede de construction d'un marqueur d'adnc servant a identifier un gene exprime, et procede d'analyse de l'expression d'un gene - Google Patents

Procede de construction d'un marqueur d'adnc servant a identifier un gene exprime, et procede d'analyse de l'expression d'un gene Download PDF

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WO2002074951A1
WO2002074951A1 PCT/JP2002/002338 JP0202338W WO02074951A1 WO 2002074951 A1 WO2002074951 A1 WO 2002074951A1 JP 0202338 W JP0202338 W JP 0202338W WO 02074951 A1 WO02074951 A1 WO 02074951A1
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restriction enzyme
type
cdna
linker
tag
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PCT/JP2002/002338
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Mikio Yamamoto
Naoki Yamamoto
Kunitaka Hirose
Jun Kasai
Original Assignee
Kureha Chemical Industry Company, Limited
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a cDNA tag for identifying an expressed gene, the cDNA tag library, and a method for analyzing gene expression. More specifically, the present invention relates to a method for preparing a cDNA tag for identification corresponding to a specific region of an expressed gene product, raRNA, cDNA for the mRNA or a cDNA fragment thereof, and a method for analyzing gene expression using the cDNA tag. Things.
  • the gene expression analysis methods include a direct method using the cDNA tag as it is and an indirect method using a ligated product of the cDNA tag.
  • Each species has a unique gene expression pattern based on its unique genomic sequence, and even if the species of the organism is the same, the degree of cell differentiation, physiological conditions such as proliferation and aging, canceration, and infection It is thought to have a different gene expression pattern than the normal state due to various pathological conditions such as diseases and immune diseases. Therefore, if such gene expression patterns can be established and the gene expression patterns between cells can be compared with each other, identification of appropriate therapeutic targets, identification of candidate genes for gene therapy, tissue typing, legal Wide variety of applications of gene expression patterns, such as gene identification, localization of disease-related genes, and identification of indicator genes for diagnosis and diagnosis, will be possible.
  • a serial analysis of gene expression (SAGE) method has been developed that can analyze a large number of transcripts by identifying limited regions of the transcript corresponding to the expressed gene region.
  • SAGE serial analysis of gene expression
  • a tag called “ditag” is prepared in which a short nucleotide sequence corresponding to each cDNA in a sample is dimerized, and the ditag is linked in a chain to form a single conjugate. It is to be cloned as a (container) and to determine the gene expression pattern by tag sequencing.
  • the present invention is for identifying an expressed gene, which enables efficient analysis of a gene expression pattern unique to each species, and a unique gene expression pattern in a physiological state, developmental stage, various pathological states, etc. of a cell.
  • a method for preparing a cDNA tag and a method for analyzing gene expression using the tag for identification.
  • the method of the present invention requires less amount of cell samples for the gene analysis of the gene expression than conventional techniques, and is efficient and highly reliable.
  • the expressed gene identification tag (Expressed Gene Identification cDNA Tag) is abbreviated as an EGI cDNA tag or EGI tag as necessary.
  • the present invention provides a method of making a cDNA tag for identifying an expressed gene, comprising: providing a complementary deoxyribonucleic acid (cDNA);
  • the cDNA fragment contains a recognition sequence for an ins type restriction enzyme, and a linker X that generates a recognition sequence for a second type S restriction enzyme is ligated to the junction with the cleaved end of the type ⁇ ⁇ restriction enzyme.
  • X Create a cDNA fragment concatenation
  • Linker X Linker X—Link the linker Y containing the recognition sequence of the 1st S-type restriction enzyme to the cleaved end of the cDNA tag with the 2nd S-type restriction enzyme, To create;
  • Linker X amplifies the cDNA tag-linker Y conjugate
  • the present invention relates to a method for forming a recognition sequence for a 2nd S-type restriction enzyme, which comprises a recognition sequence for an ins-type restriction enzyme, and a recognition sequence for a 2nd S-type restriction enzyme at a site where the cDNA fragment is cleaved with a type I restriction enzyme.
  • a linker X capable of
  • the present invention provides a gene expression analysis method characterized by contacting a cDNA tag library obtained by the method for producing a cDNA tag for expressing an expressed gene with a detection device having a nucleic acid to be detected immobilized thereon. I do.
  • the present invention provides a method for analyzing an expression gene, comprising the steps of: linking the tags obtained by the method for producing a cDNA tag for identifying an expressed gene to each other; and determining the nucleotide sequence of the linked product.
  • the analysis method includes determining the sequence of the ligated product, determining the sequence of each cDNA tag from the sequence, and determining the sequence and frequency of each cDNA tag from the sequence. And quantitative expression gene analysis methods.
  • the present invention provides a kit for preparing a cDNA tag for identifying an expressed gene, comprising a type I restriction enzyme, a first type S restriction enzyme, a second type S restriction enzyme, and a first type S restriction enzyme.
  • a linker X that generates a recognition sequence for a second S-type restriction enzyme at the junction with the cleaved end of the type I restriction enzyme, and a linker that includes a recognition sequence for the first type S-restriction enzyme
  • the kit which comprises one Y.
  • tags of short nucleotide sequences isolated from certain locations within a gene transcript contain enough information to identify the transcript.
  • a tag of 9 bp sequence can have 4 9, that is, 262,144 types of sequences, and can identify the corresponding number of transcripts.
  • the human genome encodes about 80,000-200,000 transcripts (Fields et al., Nature Genetics, 7: 345, 1994). Therefore, theoretically, if a 9 bp sequence tag can be obtained, all human gene transcripts can be identified. For lower eukaryotes and prokaryotes, the number of transcripts encoded by the genome is smaller, allowing for smaller tags.
  • tags as short as 6-7 bp are sufficient to identify transcripts. Since the method of the present invention provides a single cDNA tag for identification of an expressed gene having various nucleotide lengths corresponding to each gene transcript, it is useful for analyzing gene expression patterns.
  • the analysis of expressed genes can be performed by performing a single amplification process on a single short cDNA tag sandwiched between the upstream and downstream linkers, so that the bias caused by amplification and / or cloning can be obtained. Is unlikely to occur.
  • the cDNA corresponding to the EGI cDNA tag sequence can be qualitatively and quantitatively measured to examine the pattern of the corresponding expression gene. That is.
  • a linker (container) without or with a spacer sequence is prepared, and cloned using a vector or the like as necessary. It can be analyzed continuously and efficiently.
  • the cDNA tags are independent sequences, it is easy to analyze the sequence of the ligated product, and it is also easy to isolate a single cDNA tag from the ligated product.
  • the present invention and the above-described SAGE method are common in that they apply the first principle that a short nucleotide sequence tag contains a sufficient amount of information to identify a transcript.
  • the SAGE method utilizes a dimerized tag called “ditag”, and a single identification cDNA tag created by the present invention, a library thereof, a single library, and the like. The difference is that a continuum consisting of cDNA tags for identification of is not created.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the steps (1) to (6) of one embodiment of the method for producing a cDNA tag for identifying an expressed gene according to the present invention. It is an arbitrary base selected from A, T, C or G in FIG.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the steps (7) to (10) of one embodiment of the method for producing a cDNA tag for identifying an expressed gene according to the present invention.
  • EGI cDNA tag for identifying an expressed gene
  • FIGS. 1-10 A preferred embodiment of the present invention will be described based on a method for producing a cDNA tag for identifying an expressed gene (hereinafter referred to as an EGI cDNA tag) shown in the flowcharts of FIGS.
  • an EGI cDNA tag and its libraries that exhibit gene expression of a particular cell, tissue or cell extract at a particular stage of development or a particular disease state are readily obtained.
  • the cDNA fragment contains a recognition sequence for an ins type restriction enzyme, and a linker X that generates a recognition sequence for a second type S restriction enzyme is ligated to the junction with the cleaved end of the type ⁇ ⁇ restriction enzyme.
  • a linker Y containing a recognition sequence of the first S-type restriction enzyme is ligated to the cut end of the linker X-cDNA tag by the second S-type restriction enzyme, and the linker X-cDNA tag linker Create a Y-connection;
  • a method for producing a cDNA tag for identifying an expressed gene comprising separating the obtained cDNA tag for identifying an expressed gene as necessary.
  • a cDNA to be a sample In the step (1), prepare a cDNA to be a sample. Usually, first, raRNA is prepared from the test cells, and cDNA is prepared using reverse transcriptase.
  • the cDNA may be either a cDNA corresponding to the full-length mRNA or a fragment thereof.
  • the test cells are not limited as long as they produce mRNA having a poly A tail at the 3 'end, and include any cells such as animal cells, plant cells, and microbial cells. Animal cells, plant cells, and microbial cells infected with the virus can be used as test cells.
  • analysis can be performed if 1 ⁇ g of mRNA is present. Since 1 zg of mRNA is usually obtained from 1 mg of cells, the present invention is particularly effective when handling valuable human tissue samples obtained by eddle biopsy or the like.
  • raRNA separation of raRNA from test cells can be performed by a commonly used technique. For example, test cells are treated with guanidine reagent, phenol reagent, etc. to separate total RNA, and then affinity column method using poly-U-sepharose using oligo dT-cellulose ⁇ Sepharose 2B as carrier ⁇ batch method And the like to obtain mRNA.
  • a first-strand cDNA (single-strand cDNA) was synthesized using oligo dT primer and reverse transcriptase, Synthesize double-stranded cDNA).
  • the oligo dT primer include a solid-phase immobilized oligo dT primer, a coenzyme-labeled oligo dT primer, and the like.
  • a solid-phase immobilized oligo dT primer is preferable in terms of reproducibility and the recovery rate of a target DNA fragment. .
  • Oligo dT primers immobilized on latex beads, oligo dT primers immobilized on magnetic beads, and the like are used as the solid phase-immobilized oligo dT primers. Oligo d; r primers immobilized on magnetic beads are preferred.
  • the cDNA in the sample is cleaved with a type II restriction enzyme to form a cDNA fragment.
  • the cDNA in the c sample is a double-stranded cDNA bound to a solid-phase-immobilized oligo dT primer.
  • type II restriction enzyme refers to a restriction enzyme that recognizes a predetermined recognition sequence and cuts DNA at a specific position inside or adjacent to the recognition sequence.
  • a type II restriction enzyme having a recognition sequence consisting of 4, 5 or 6 ′ bases is preferable.
  • Examples of the type II restriction enzyme used in the present invention include Afal, Alul, CviRI, Dpnl,
  • These type II restriction enzymes include those having a recognition sequence containing all four bases ATCG, those containing only CG, and those containing only AT.
  • type II restriction enzymes whose recognition sequence includes all of ATCG include Afal, Alul, CviRI, Dpnl, HpyC, HpyF44III, Rsal, Bfal, Csp6I, HpyCH4IV, Mael, Maell, TaqAlphal, Taql, TthHBSI, Xspl, There are Bspl43I, DpnII, Mbol, Ndell, Sau3AI and NIalll.
  • type II restriction enzymes whose recognition sequence contains only CG include AccII, Bshl236I, BstUI, BsuRI, FnuDII, Haelll, Mvnl, Acil, BsiSI, HapII, Hin6I, HinPlI, Hpall, Mspl, SciNI, Cfol, and There is Hhal.
  • type II restriction enzymes whose recognition sequence contains only AT include Msel, Trull, Tru9I, Tasl, Tsp509I, and TspEI. It is preferable to select a type II restriction enzyme in consideration of the characteristics of these recognition sequences and the characteristics of the expressed gene whose IIS type restriction enzyme is to be analyzed.
  • the type II restriction enzyme is selected so as to form a cleaved end which becomes a recognition sequence for the desired type II II S restriction enzyme.
  • the recognition sequence is “5′-GTAC-3 ′”, and the type 11-type pentazyme, Rsal or Rsal, which cleaves the phosphodiester bond between T and Afal may be used.
  • the cDNA fragment contains a recognition sequence of the 1st S-type restriction enzyme, and a portion of the cDNA fragment which is connected to the cleavage end of the 1st-type restriction enzyme is a recognition sequence of the 2nd-S type restriction enzyme. Is ligated to create a linker X—cDNA fragment ligated product.
  • a cDNA fragment containing an oligo dT primer sequence is separated from the cDNA fragment group obtained in the step (2). Separation can be performed using the label of the oligo dT primer. For example, when the oligo dT primer immobilized on latex beads is used for the preparation of the cDNA, the cDNA containing the oligo dT primer sequence immobilized on the beads is treated with a type II restriction enzyme and centrifuged. Fragments can be sedimented and separated.
  • the cDNA fragment obtained here contains the poly A tail of raRNA and the cleavage end site of the type II restriction enzyme that first appears from the poly A tail toward the 5 ′ upstream side.
  • Linker-X is ligated to the cDNA fragment using DNA ligase (for example, T4 DNA ligase).
  • linker-1x includes a recognition sequence for an ins type restriction enzyme, and a second ⁇ S type restriction site at the junction of the cDNA fragment with the type ⁇ ⁇ restriction enzyme cleavage end.
  • the recognition sequence is preferably at a position where the first IIS type restriction enzyme cuts the cDNA tag so as not to leave a spacer sequence, or at an appropriate position so as to leave a desired spacer sequence. .
  • a linker X having a recognition sequence of BseRI as a recognition sequence of type II S restriction enzyme and linking to a cDNA fragment obtained when RsaJ is used as type II restriction enzyme has the following structure: There is a single-stranded DNA fragment.
  • ins-type restriction enzyme refers, in principle, to an IIS-type restriction enzyme capable of recognizing a common recognition sequence on Linker X and Linker Y and forming a desired EGI cDNA tag; It also includes type I and type II restriction enzymes that exert similar functions.
  • Examples of the first IIS type restriction enzyme include Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsraFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, Hgal, Lel, There are SfaNI, Aprl, BspMI, Hphl, MboII, Mnll, Bbsl, BciVI, BbvII, Bpil, Bpll, BpuAI, and Faul.
  • the first IIS type restriction enzymes whose distance from the recognition sequence to the longest end is 10 bases or more include Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, There are Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, and Hgal.
  • the first IIS type restriction enzymes having a distance of 16 bases or more include Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, and Gsul.
  • IIS restriction enzyme refers to the recognition sequence of the junction formed between linker X and the cDNA fragment in principle, and determines the appropriate position of the cDNA fragment. It contains type II restriction enzymes that cleave, and type I and type II restriction enzymes that exhibit similar functions. Cleavage of the second IIS type restriction enzyme yields a ligated product of linker X and a cDNA tag.
  • Examples of the second IIS type restriction enzyme include Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, Hgal, Lwel, SfaNI , Aprl, BspMI, Hphl, MboII, Mnll, Bbsl, BciVI, BbvII, Bpil, Bpll, BpuAI, and Faul.
  • the second IIS restriction enzymes whose distance from the recognition sequence to the longest end is 10 bases or more include Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, There are Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, and Hgal.
  • the second IIS type restriction enzymes having a distance of 16 bases or more include Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, and Gsul.
  • the first IIS type restriction enzyme does not need to limit the sequence of the cleavage site.
  • the combination of the second IIS type restriction enzyme is not limited.
  • the type II restriction enzyme one that can form a recognition sequence for the second type II restriction enzyme in the linkage between the linker X and the cDNA fragment must be selected. For example, there is a combination of the following type II restriction enzyme and the type II IS restriction enzyme.
  • the symbol * at the right end of the above table is a combination that requires a random sequence for the linker Y because the cleavage position of the positive strand is farther from the cleavage position of the complementary strand, and the number to the right of * is the number of bases. Is shown.
  • the linker-X-cDNA fragment ligated product is cleaved with a second S-type restriction enzyme to prepare a linker-X-cDNA-tagged product.
  • a second S-type restriction enzyme for example, when BsmFI is used as the second II S-type restriction enzyme, the enzyme is used as the recognition sequence “5′-GGGGAC-3 ′” formed in the linker X-cDNA fragment ligated product and its recognition sequence. Recognizes the double-stranded DNA consisting of complementary proteins, and cuts the position of "5'-GGGAC-3 '(10/14)".
  • BsmFI is a phosphodiester bond between the 10th base and the 11th base 3 'downstream from the 3'-terminal base C of the recognition sequence "5'-GGGAC-3'", and the recognition sequence "5'- GGGAC-3 ', the complementary strand ⁇ 3'-CCCTG-5' J cleaves the phosphoryl bond between the 14th base and the 15th base 5 'upstream from the 5' base G of the 5 'end of the J Generates a DNA fragment with a truncated end with a structure c
  • the linker X-cDNA fragment ligated product is cleaved with the second ⁇ S type restriction enzyme in the step (4).
  • the linker-X-cDNA tag ligated product thus obtained is purified. This purification can be performed by removing the remaining cDNA fragment from which the cDNA tag has been excised, using the label of the labeled oligo dT primer, as described in step (3).
  • the oligo dT primer immobilized on latex beads is In the preparation of DNA fragments, the remainder of the cDNA fragment containing the labeled oligo dT primer sequence can be sedimented and removed by centrifuging the restriction enzyme-treated solution using the sedimentation of latex beads. it can.
  • the centrifuged supernatant contains the linker X-cDNA tag conjugate.
  • the end of the cDNA tag of the linker X-cDNA tag conjugate is brought into a state in which a linker Y containing a recognition sequence of the first type S restriction enzyme can be bound.
  • the treatment method there is a method of adding a DNA polymerase and dNTP to a solution from which the remainder of the cDNA fragment containing the labeled oligo dT primer sequence has been removed, and filling the protruding ends.
  • Taq polymerase and dATP are further added, one base of adenine is added to the 3 'end.
  • the above-mentioned cleaved end obtained by the treatment with the II S type restriction enzyme BsmFI has the following terminal structure by the treatment with Taq polymerase.
  • the underlined part of the sequence is a newly synthesized sequence.
  • a linker Y is ligated to the linker X-cDNA tag ligated product at the end of the second ⁇ S-type restriction enzyme digestion to form a linker X-cDNA tag-linker Y ligated product. create.
  • linker Y is ligated to the linker X-cDNA tag ligated product which has been subjected to terminal treatment as necessary using DNA ligase (for example, T4 DNA ligase).
  • DNA ligase for example, T4 DNA ligase
  • linker Y refers to a linker that includes a recognition sequence for a Type II S restriction enzyme (eg, BseRI). Further, the recognition sequence is preferably located at a position where the first IIS type restriction enzyme cuts the cDNA tag so as not to leave the spacer sequence, or at an appropriate position so as to leave a desired spacer sequence. preferable.
  • a linker Y linked to a DNA fragment obtained by the step (6) and having one adenyl at the 3 ′ end added thereto there is a D fragment having the following structure.
  • the linker X-cDNA tag linker-amplified product is amplified.
  • the ligated product obtained in the step (7) has a sequence in which the primers X and Y hybridize to the linkers X and Y, respectively, and can be easily amplified by the polymerase chain reaction (PCR).
  • the PCR method may be a standard polymerase chain reaction method, for example, as described in US Pat. No. 4,683,195.
  • the ligation may be amplified by clawing which incorporates it into a vector compatible with prokaryotes, or other amplification methods known to those skilled in the art.
  • the amplification efficiency differs depending on the length of each type III DNA. .
  • the appearance ratio of the amplified DNA fragments corresponding to each type III DNA in the obtained amplification product is as follows: It reflects the abundance ratio of each DNA fragment in the type I DNA mixture. Therefore, in the present invention, there is theoretically no effect due to the difference in amplification efficiency due to PCR, and the appearance ratio of each cDNA fragment in the obtained amplification product is different from that expressed in the test cells. It reflects the ratio of mRNA.
  • the PCR can be performed under standard conditions such as time and temperature.
  • the linker X-cDNA tag-linker Y to be amplified in the present invention has a short sequence length, a uniform length, and a high amplification efficiency. Therefore, it is possible to reduce the number of cycles of the anneal Z sequence extension. Also, changing the sequence of the linker changes the efficiency of the PCR, so that the desired efficiency of the anneal / sequence extension cycle can be achieved depending on the linker used.
  • primer X '' as used herein is complementary to the nucleic acid strand of Linker-X and can act as a starting point for the reaction under conditions that induce the polymerase chain reaction. Possible, naturally occurring or synthesized oligonucleotide. Primer X hybridizes to a position on Linker X that can leave the recognition sequence of type II S-type restriction enzyme, and is long enough to start amplification in the presence of a polymerization agent. Must be something. The length required for primer X will depend on many factors, including temperature, pH, and ligase used.
  • primer Y is complementary to the nucleic acid strand of the linker and can act as a starting point for the reaction under conditions in which the polymerase chain reaction is induced. Means a naturally occurring or synthesized oligonucleotide. It should be noted that a person skilled in the art can easily prepare the amplification primer based on the nucleotide sequence of the linker in consideration of the type II S type restriction enzyme without undue experimentation. There will be.
  • the obtained amplification product is cleaved with a first USB type restriction enzyme to prepare a cDNA tag for identifying an expressed gene.
  • a first USB type restriction enzyme for example, when BseRI is used as the first II S-type restriction enzyme, the enzyme recognizes the double-stranded DNA consisting of the sequence “5′-GAGGAG-3,” on linker X and its complementary chain. And cut "5, -GAGGAG-3 '(10/8)". That is, BseRI is a phosphogester bond between the 10th base and the 11th base 3 'downstream from the 3'-terminal base G of the recognition sequence "5'-GAGGAG-3'", and the recognition sequence 5'- Complementary strand of GAGGAG-3
  • DNA fragment of linker X having a cleaved end having the following structure by cleaving the phosphodiester bond between the eighth base and the ninth base 5 'upstream from the base C at the 5' end of 3'-CTCCTC-5 ' Is generated.
  • the first II S-type restriction enzyme BseRI is obtained from the sequence “5′-GAGGAG-3 ′” on the linker Y and its phase capture. Recognize the double-stranded DNA and cut "5, -GAGGAG-3 '(10/8)". That is, BseRI is a phosphodiester bond between the 10th base and the 11th base 3 ′ downstream from the base G at the 3 ′ end of the recognition sequence “5′-GAGGAG-3 ′ J, and the recognition sequence
  • step (2) Rsel is used as a type II restriction enzyme, and in the step (3), a linker X containing a nucleotide chain consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 is used;
  • step (2) BsmFI is used as the second II S-type restriction enzyme, and in the step (2), a linker Y containing a nucleotide chain consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 6 is used.
  • step (9) When the method of the present invention was carried out using a cDNA library obtained from cell-derived mRNA, in step (9), the EGI cDNA tag live Rally is obtained.
  • the cDNA corresponding to the EGI cDNA tag sequence can be qualitatively and quantitatively measured to examine the pattern of the corresponding expressed gene. .
  • an EGI cDNA tag library corresponding to the cDNA to be detected is created in advance and prepared on a spotted detection device, and the sample of the subject, which is labeled with a different label, is brought into contact with the standard sample. Then, by comparing the relative signal intensities, a target can be selected.
  • Known labels such as fluorescent labels and isotopes can be widely used.
  • the EGI cDNA tag library is detected, and the pattern of the corresponding expressed gene is examined. Can be.
  • the detection device that can be used in the present invention includes a microarray such as a DNA chip and a macroarray such as a dot hybridization.
  • the support used for the detection device includes nylon membrane, nitrocellulose filter, glass plate, There are recon chips.
  • the detection device refers to, for example, a device in which the obtained EGI cDNA tag is immobilized on a support, and the DNA, RNA, and fragments thereof to be detected are hybridized and detected.
  • the mRNA is labeled so that cDNA can be detected.
  • a radioisotope a fluorescent compound, a bioluminescent compound, a chemiluminescent compound, a metal chelating agent, an enzyme, or the like can be used as a label.
  • the labeled cDNA to be detected is separated into single-stranded molecules, serially diluted as necessary, and, for example, an EGI cDNA tag corresponding to the gene to be detected is placed on each silicon chip grid. Contact with the held solid support.
  • an EGI cDNA tag corresponding to the gene to be detected is placed on each silicon chip grid. Contact with the held solid support.
  • the state of the sample cells and the like can be easily known.
  • the EGI cDNA tag of an unknown gene is fixed and the pattern is recorded, it may be possible to re-analyze the gene when it is found in the future.
  • the length of the EGI cDNA tag can be adjusted by the combination of the type II restriction enzyme and the second IIS type restriction enzyme, and the desired length varies depending on the type of organism for which the gene is analyzed.
  • the length is preferably 6 to 25 base pairs, more preferably 10 to 25 base pairs, particularly preferably 10 to 16 base pairs.
  • the obtained cDNA tag for identifying an expressed gene is separated as necessary.
  • the separation can be performed using a method commonly used by those skilled in the art, for example, polyacrylamide gel electrophoresis.
  • the expressed gene can be analyzed by linking EGI cDNA tags to each other and determining the nucleotide sequence of the linked product.
  • the EGI cDNA tag obtained in the step (9) can be ligated using T4 ligase or the like because the 3 ′ and 5 ′ cohesive ends are complementary.
  • the obtained EGI cDNA tag conjugate is analyzed by a method known to those skilled in the art, for example, by incorporating it into a vector and cloning it, or by reading the sequence using a sequencer. be able to.
  • the competent protein generally contains 3 to 200 EGI cDNA tags, more preferably 3 to 80 EGI cDNA tags, and particularly preferably 16 to 40 EGI cDNA tags.
  • the obtained concatenation contains the EGI cDNA tag phase according to the method of EGI cDNA tag formation. Some have no spacer sequence between them, while others have a spacer sequence.
  • the EGI cDNA tag conjugate of the present invention can be cloned by a standard method for amplification by inserting it into a vector such as a plasmid phage, for example.
  • the term "recombinant vector” refers to a plasmid, virus or other vehicle that has been created by insertion or integration of an EGI cDNA tag conjugate. Such vectors contain an origin of replication, a promoter, and specific genes that enable phenotypic selection of the transformed cells.
  • many known growing vectors suitable for sequences can be used. Examples thereof include pUC18, its modified vectors pUC118, pUC19, its modified vectors pUC119, M13mpl8RFI, M13mpl9RFI, pBR322, pCR3.1, pBAD-T0F0 and its improved vectors, and
  • host cell refers to a cell in which the vector can be propagated and the DNA can be expressed, and also the progeny of the host cell itself. Note that not all progeny are identical to the parent cell, as mutations may occur during replication.
  • a known stable transfer method can be used such that the exogenous DNA is continuously maintained in the host.
  • a known stable transfer method can be used such that the exogenous DNA is continuously maintained in the host.
  • the accommodation main such prokaryotic cells such as E. coli, harvested after exponential growth phase and subsequently RbCl method by a known technique, from cells treated with Ca Cl 2 method, a D NA uptake capacity Combi Prepare tent cells. Transformation can also be carried out by election-portion or a conventional method.
  • an EGI cDNA tag conjugate into a vector and determining the nucleotide sequence, 20 or more, 20 to 100, preferably about 20 to 3
  • the sequence of about 0 EGI cDNA tags can be easily checked.
  • peripheral blood monocytes were collected from peripheral blood derived from healthy humans using NycoPrepl. 077A (Nyco Med Pharma).
  • the obtained peripheral blood monocytes were cultured at 37 ° C. for 3 hours in the presence or absence of lO g / ml lipopolysaccharide (LPS), and then, from each cultured cell, Isogen (manufactured by Nitsubon Gene) was used.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Isogen manufactured by Nitsubon Gene
  • mRNA was isolated from the total RNA by adsorption, and cDNA synthesis kit (Takara Shuzo) was used to prepare two-strand cDNA from the mRNA. .
  • the resulting double-stranded cDNA was digested with a restriction enzyme Rsal (manufactured by New England Biolabs) at 37 ° C. for 2 hours, cut, and the magnet beads were collected on a wall with a magnet and collected to obtain the raRA.
  • a fraction containing a cDNA fragment containing the nucleotide sequence between the poly A tail and the Rsal recognition cleavage site first appearing 5 ′ upstream from the poly A tail was obtained.
  • a linker X containing a recognition sequence of the IIse type S restriction enzyme BseRI was ligated to the cDNA fragment fraction using T4 DNA ligase by the following three methods. In each case, the ligation of linker X could be suitably performed.
  • Linker-X having the following structure was directly ligated to the blunt end generated by cutting with Rsal.
  • linker X having the following structure was ligated to the cohesive end by treatment with T4 DNA ligase at 16 ° C. for 2 hours.
  • the supernatant was subjected to T4 DNA polymerase treatment at 16 ° C for 2 hours in the presence of dATP, dCTP, dGTP and dTTP, and then Z-Taq for 30 minutes at 70 ° C in the presence of dATP. (Takara Shuzo) After treatment, the fragment was recovered and treated in the presence of dATP. The above treatment resulted in a protruding end with one A at the 3 'end, and a second linker Y having the following structure was connected to this by T4 DNA ligase treatment at 16 ° C for 2 hours.
  • amplification was carried out by PCR with Taq DNA polymerase.
  • PCR 96 Denaturation at 30 ° C for 30 seconds, annealing at 50 ° C for 1 minute, a total of 25 cycles of amplification at 72 ° C for 1 minute, and a final extension reaction at 72 ° C for 2 minutes. went.
  • the obtained PCR product was treated with IIS type restriction enzyme BseRI (New England Biolabs). Since the cleavage site of this enzyme is located at "5'-GAGGAG-3 '(10/8)", the following structure was used to generate a DNA fragment.
  • the obtained cDNA tag was ligated again with T4 ligase, and then subjected to 4.5 ° / 0 polyacrylamide electrophoresis to recover a binding fragment of 500 to 1000 bp.
  • the recovered binding fragment has the following structure.
  • the 5'-03, also adjacent to ⁇ 14, is a base derived from the 1 ⁇ 31 recognition sequence on 0.
  • (N) 14 is 14 bases from cDNA 5'- ⁇ NNN NNNNN NN-3 '(SEQ ID NO: 19) is shown.
  • the sequence of about 20 EGI cDNA tags was clarified in a single nucleotide sequencing operation.By sequencing about 500 samples, the types of mRNA expressed in cells and the number of each 10,000 sequences, which are thought to be able to be clarified, were identified.
  • Tables 1 and 2 list some of the genes identified by this method. A homology search was performed on the base sequences of these EGI cDNA tags against a known database. Table 1 shows genes whose expression is increased by LPS stimulation, and Table 2 shows genes whose expression is suppressed by LPS stimulation. Gene whose expression is activated by LPS stimulation
  • nucleotide sequence can be treated numerically regardless of its length. For example, when dealing with a base sequence having 14 bases, it can be specified numerically as follows.
  • mini fragment ID (mf ID).
  • the EGI cDNA tag library obtained in Example 1 can be detected by a detection device described below, and gene expression can be analyzed.
  • Oligo DNA containing the corresponding sequence of the mf base sequence of 220597775, 69402230, 232235060, 110001478, and 196314601 is synthesized and spotted on a slide glass by a conventional method to prepare a DNA chip.
  • the mRNA derived from LPS-stimulated peripheral blood monocytes (PBMC) obtained in Example 1 was labeled as type III and labeled with a fluorescent compound Cy 3-dUTP (* 1) (Amersham's Pharmacia) and labeled with LPS.
  • This probe solution was mixed and hybridized with the DNA chip at 45 ° C in 6XSET [0.9 M NaCl N 10 ⁇ g / ml Yeast tRNA N 0.1% SDS, 120 mM Tris-HCl (pH 7.8)]. I do.
  • CDNA prepared with reverse transcriptase was used as the type III mRNA for LPS-stimulated peripheral blood monocytes (P BMC) and mRNA for LPS unstimulated P BMC, respectively, and spotted on a membrane. Treat with C for 2 hours.
  • P BMC LPS-stimulated peripheral blood monocytes
  • mRNA for LPS unstimulated P BMC LPS unstimulated P BMC
  • mf ID 26 18 Synthesizing oligo DN A comprising a nucleotide sequence of 49128, labels T 4 polynucleotide cinchona one peptidase in the DNA the [Y- 32 P] ATP (Amersham. Pharmacia, Inc.) using a 32 P (radioisotope) To obtain a probe solution.
  • This probe solution is subjected to hybridization with the above nylon membrane at 45 ° C. in 6 ⁇ SET. After washing with a washing solution [6 XS SC, 0.1% SDS] at 52 ° C, perform autoradiography.
  • the signal on the X-ray film of the cDNA derived from the mRNA of LPS-stimulated PBMC is more than twice as strong as that of the LPS-unstimulated PBMC.
  • EGI cDNA tag library was prepared in the same manner as in Example 1, except that HpyCH4V was used in place of the type II restriction enzyme Rsal and RleAI was used in place of the type II restriction enzyme BsmFI.
  • a linker-X-cDNA fragment ligated product is prepared by one of the following methods (1) to (3).
  • the DNA is cleaved with RleAI using the restriction enzyme RleAI recognition sequence 5'-CCCACA-3 'generated by the connection of linker X, and the centrifuged supernatant is collected.
  • the cleavage site for this enzyme is 5 '— CCCACA — 3' (1 2/9), so the recovered portion will contain a 12-base tag from cDNA following Linker-1X .
  • the EGI cDNA tag library obtained in Example 4 can be detected by the detection device described below to analyze gene expression.
  • Oligo D which corresponds to the genes corresponding to 69402230, 232235060, 110001478, and 196314601 and contains the corresponding sequence of the EGI cDNA tag obtained in Example 3, is synthesized, spotted on a slide glass by a conventional method, and DNA chip.
  • PBMCs peripheral blood monocytes
  • PBMCs peripheral blood monocytes
  • a probe solution is obtained by fluorescently labeling the mRNA derived from PBMC not stimulated with LPS with the fluorescent compound Cy5-dUTP (* 2) (Amersham 'Pharmacia) as type II.
  • This probe solution is mixed and mixed with the DNA chip in 6XSET [0.9 M NaCl, 10 / _ig / ml yeast tRNA, 0.1% SDS, 120 mM Tris-HCl (pH 7.8)] at 45 ° C for 10 minutes. Perform bridging.
  • a test cDNA or a gene specifically expressed in a test cell can be accurately detected and analyzed with good reproducibility.
  • differences in the function and morphology of any two cells can be clarified as differences in the expression state of genes, so that it can be widely applied to the analysis of all biological phenomena under living conditions or pathological conditions. it can. '

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Description

明 細 書 発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法、 及び遺伝子発現解析方法 技術分野
本発明は、 発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法、 該 cDNAタグライブラリ一、 及び遺伝子発現解析方法に関するものである。 さらに詳細に述べると、 発現遺伝 子産物である raRNA、該 mRNAに対する cDNA又はその cDNA断片の特定領域に対応する、 同定用 cDNAタグを作成する方法、 及び該 cDNAタグを利用した遺伝子発現解析方法 に関するものである。 該遺伝子発現解析方法は、 該 cDNAタグをそのまま用いる直 接的な方法と、 該 cDNAタグの連結物を用いる間接的な方法とを含んでいる。
背景技術
各生物種は独自のゲノム配列に基づく、 固有の遺伝子発現パターンを有し、 ま た、 生物の種が同一でも、 細胞の分化の程度、 増殖、 老化などの生理的状態や、 癌化、 感染症、 免疫病などの各種病的状態などにより、 正常な状態と比べ異なる 遺伝子発現パターンを有すると考えられている。 したがって、 このような遺伝子 発現パターンを確立し、 細胞間の遺伝子発現パターンを相互に比較することがで きれば、 適切な治療ターゲットの同定、 遺伝子治療用の候補遺伝子の同定、 組織 タイピング、 法的な遺伝子確認、 疾病関連遺伝子の位置決定、 診断 '予診用のィ ンジケ一ター遺伝子の同定など、遺伝子発現パターンの幅広い応用が可能になる。 従来、 遺伝子発現を評価するため、 ノーザンブロッテイング法、 R Nァーゼプ ロテクション法、及ぴ逆転写酵素ーポリメラーゼ連鎖反応（RT- PCR)分析法 (Alwine ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.、 74: 5550、 1977； Zinnら、 Cell、 34: 865、 1983； Veresら、 Science, 237 : 415、 1987)、 さらに遺伝子を検索するための有用 なエクスプレスド，シークェンス -タグ（expressed sequence tag: EST)法（Adams ら、 Science 252 : 1656、 1991 ; Adamsら、 Nature, 355： 632、 1992 ; Okuboら、 Nature Genetics, 2 : 173、 1992)などが開発されたが、 一度に限られた数の遺伝子しか評 価できなかった。例えば、 Okuboらは二本鎖 cDNAを 4塩基認識酵素 Sau3AIで切断し、 mRNAの 3，末端部分だけからなる cDNAライブラリーを得て、 これをクローニングし 二塩基配列決定を行い遺伝子発現プロフィールを得る方法を開発した
[Nature Genet. 2、 173 (1992) ]が、 この方法で得られるそれぞれのクローンの長 さは平均約 300塩基であり、 配列決定はークローンずつ行わねばならず、 このた め最終的に配列決定された mRNAの総数は一つの細胞種当たりわずか 1000個程度で あって、細胞における真の遺伝子発現パターンからは程遠いものであった。また、 これらの方法は、 大量の原材料 （例えば、 ヒ トの組織） が必要なこと、 ポリメラ ーゼ連鎖反応 (PCR)を繰り返すためバイアスがかかること、 結果に再現性がない こと等の理由により、 研究室で用いられているに過ぎないのが現状であった。
近年、 発現された遺伝子の領域に対応する転写産物の限定領域を同定すること により、 多数の転写産物を分析することができる遺伝子発現の逐次分析 (serial analysis of gene expressi on : SAGE) 法が開発された（国際公開公報 W097/10363、 米国特許出願第 5， 695， 937号及び第 5， 866, 330号）。この方法では、試料中の各 cDNA に対応する短いヌクレオチド配列が二量体化された 「ジタグ」 （ditag)と称するタ グを調製し、 このジタグを鎖状に連結して単一の連結体 （コン力テマ一） として クローン化しタグの配列決定により遺伝子発現パターンを明らかにするものであ る。 この SAGE法では、 試料中の各 cDNAに対応する単一の発現遺伝子同定用 cDNAタ グを得ることはできず、 また一度に同定できる発現遺伝子の数は連結体が含み得 るジタグの限界から 1 0 0 0以下、 通常 4 0◦以下である。
発明の開示
本発明は、 各生物種に固有な遺伝子発現パターン、 及び細胞の生理的状態、 発 生段階、 各種病的状態などにおける特有な遺伝子発現パターンの効率的な解析を 可能にする、 発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法、 及び該同定用タグを用いる 遺伝子発現解析方法を提供する。 本発明の方法は、 従来の技術に比べ、 遺伝子発 現の角军析に要する細胞試料の量が少なくて済み、 効率的で、 かつ信頼度の高いも のである。なお、発現遺伝子同定用タグ（Expressed Gene Identification cDNA Tag) を、 必要に応じて EGI cDNA タグ又は EGIタグという略号で表す。
本発明が提供するのは、 発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法であって： 相補的デォキシリボ核酸 (cDNA)を準備し；
該 cDNAを Π型制限酵素で切断して cDNA断片を作成し； 該 cDNA断片に、 第 i n s型制限酵素の認識配列を含み、 かつ前記 Π型制限酵素 の切断末端との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列を生じるリンカー Xを 連結して、 リンカー X— cDNA断片連結物を作成し；
該リンカ一 X— cDNA断片連結物を第 2 Π S型制限酵素で切断して、 リンカー X 一 cDNAタグ連結物を作成し；
リンカー X— cDNAタグの第 2 Π S型制限酵素による切断末端に、 第 1 Π S型制 限酵素の認、識配列を含むリンカー Yを連結して、 リンカー X _cDNAタグ一リンカ 一 Y連結物を作成し；
リンカー X— cDNAタグーリンカー Y連結物を増幅し；かつ
得られた増幅産物を第 1 Π S型制限酵素で切断して、 発現遺伝子同定用 cDNAタ グを得る前記作成方法である。
また、 本発明は、 第 i n s型制限酵素の認、識配列を含み、.かつ Π型制限酵素で 切断された cDNA断との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列を形成すること ができるリンカー Xを提供する。
さらに、 本発明は、 前記発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法で得られた cDNA タグライブラリ一を、 検出すべき核酸を固定した検出装置に接触させることを特 徴とする遺伝子発現解析方法を提供する。
さらに、 本発明は、 前記発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法で得られた該タ グを互レヽに連結する工程、 及び該連結物の塩基配列を決定する工程を含む発現遺 伝子解析方法を提供する。 該解析方法には、 該連結物の配列を決定し、 その配列 からそれぞれの cDNAタグの配列を決定する定性的解析方法、 及びその配列からそ れぞれの cDNAタグの配列及び出現頻度を求める、 定量的発現遺伝子解析方法が含 まれる。
さらに、 本発明が提供するのは、 発現遺伝子同定用 cDNAタグ作成キットであつ て、 Π型制限酵素、 第 1 Π S型制限酵素、 第 2 Π S型制限酵素、 第 1 Π S型制限 酵素の認識配列を含み、 かつ前記 Π型制限酵素の切断末端との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列を生じるリンカー X、 及び第 1 Π S型制限酵素の認識配 列を含むリンカ一 Yを含む、 該キットである。
本発明はいくつかの基本的な原理に基づいている。 まず第一は、 伝子転写産物内の一定の位置から単離された短いヌクレオチド 配列のタグが、 その転写産物を同定するのに十分な情報量を含むということであ る。 例えば、 9 bpの配列のタグは、 4の 9乗、 すなわち 262， 144種の配列が可能 であり、 これに対応する同数の転写産物を識別することができる。 一 、 ヒト · ゲノムは約 80， 000〜200， 000の転写産物をコードすると示唆されている（Fieldsら、 Nature Genetics, 7 : 345、 1994) 。 したがって、 理論的には 9 bpの配列のタグ を得られれば、 すべてのヒト遺伝子転写産物を同定することができる。 下等な真 核生物や原核生物の場合、 ゲノムによりコードされる転写産物の数はより少ない ので、 タグのサイズをもっと短くすることができる。 例えば、 酵母では転写産物 を識別するのに 6〜 7 bp ほどの短いタグで十分である。 本発明の方法は、 それ ぞれの遺伝子転写産物に対応する、 様々なヌクレオチド長さを有する、 単一の発 現遺伝子同定用 cDNAタグを提供するので、 遺伝子発現パターンを解析するのに有 ±£ める。
第二は、 上流及び下流をリンカーに挟まれた単一の短い cDNAタグを 1回増幅処 理するだけで、 発現遺伝子の解析を行なうことができるので、 増幅及び/又はク ローニングに起因するバイアスが起こり難いことである。
第三は、 本発明の方法により得られた EGIcDNAタグライブラリーを利用して、 EGIcDNAタグ配列に対応する cDNAを定性的、 また定量的に測定し、対応する発現遺 伝子のパターンを調べられることである。
. 第四は、 本発明の方法で作成された同定用 cDNAタグにより、 スぺーサー配列の 無い、 又は有る連結体 （コン力テマ一） を作成し、 必要に応じてベクターなどを 用いてクローン化し連続的、 かつ効率的に解析することができる。 特に、 該 cDNA タグがそれぞれ独立した配列なので、連結体の配列を解析するのも容易であるし、 連結体から単独の cDNAタグを単離することも容易に行なうことができる。
なお、 本発明と先に記載した SAGE法とは、 短いヌクレオチド配列のタグが転写 産物を同定するのに十分な情報量を含むという第一原理を応用する点で共通する。 し力 し、 SAGE法は、 「ジタグ」 （ditag) と称する二量体化されたタグを利用する ものであり、 本発明で作成される単一の同定用 cDNAタグ、 そのライブラリー、 単 一の同定用 cDNAタグからなる連続体を作成しないという点で相違する。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明における発現遺伝子同定用 cDNAタグ作成方法の一実施態様のう ち（1 )から（6)の工程を示す概略図である。 図 1中の" ΝΊま A、 T、 C又は Gから選ば れる任意の塩基である。
図 2は、 本発明における発現遺伝子同定用 cDNAタグ作成方法の一実施態様のう ち（7)から（10)の工程を示す概略図である。
発明の好ましい実施の形態
本発明の好ましい実施の形態を、 図 1及び 2に示すフローチヤ一トで示す発現 遺伝子同定用 cDNAタグ （以下、 EGI cDNAタグという。 ） の作成方法に基づき説明す る。 この方法により、 例えば、 特定の発生段階または特定の疾病状態における、 特定の細胞、 組織または細胞抽出物の遺伝子発現を示す、 EGIcDNAタグ及びその ライプラリーが容易に得られる。
この図 1及び 2に示されているのは、発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法であ つて：
( 1)相捕的デォキシリボ核酸 (cDNA)を準備し、
(2)該 cDNAを Π型制限酵素で切断して cDNA断片を作成し；
(3)該 cDNA断片に、 第 i n s型制限酵素の認識配列を含み、 かつ前記 Π型制限酵素 の切断末端との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列を生じるリンカー Xを 連結して、 リンカー X— cDNA断片連結物を作成し；
(4)該リンカー X— cDNA断片連結物を第 2 Π S型制限酵素で切断して、 リンカー X 一 cDNAタグ連結物を作成し；
(5)必要に応じて該リンカ一 X— cDNAタグ連結物を純化し；
(6)必要に応じて該リンカー X— cDNAタグ連結物の cDNAタグの末端を、第 1 Π S型 制限酵素の認識配列を含むリンカー Yが結合可能な状態に処理し；
(7)該リンカー X— cDNAタグの第 2 Π S型制限酵素による切断末端に、第 1 Π S型 制限酵素の認識配列を含むリンカ一 Yを連結して、 リンカー X— cDNAタグ一リン カー Y連結物を作成し；
(8)該リンカー X— cDNAタグ一リンカ一 Y連結物を増幅し；かつ
(9)得られた増幅産物を第 1 Π S型制限酵素で切断して、発現遺伝子同定用 cDNAタ グを得て、
(10)必要に応じて、 得られた発現遺伝子同定用 cDNAタグを分離することを含む、 発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法である。
(1)の工程では、 試料となる cDNAを準備する。 通常、 まず被検細胞から raRNAを調 製し、 逆転写酵素を用いて cDNAを作成する。 該 cDNAは、 全長 mRNAに対応するもの 及びそのフラグメントのいずれであってもよい。 該被検細胞は、 3'末端にポリ A テールを有する mRNAを産生する細胞である限り限定されず、動物細胞、植物細胞、 微生物細胞等のあらゆる細胞を含む。 ウィルス感染した動物細胞、 植物細胞、 微 生物細胞を被検細胞として用いることも可能である。
本発明では、 1 μ gの mRNAがあれば解析を行うことができる。 1 z gの mRNAは、 通常 l mgの細胞から得られるので、 本発明は、 エードルバイオプシーなどで得た 貴重な人体組織サンプルなど取り扱う際には特に有効である。
被検細胞からの raRNAの分離は、 通常行われる手法により行うことができる。 例 えば、被検細胞を、 グァニジン試薬、 フエノール試薬等で処理してトータル RNAを 分離後、オリゴ dT-セルロースゃセファロース 2Bを担体とするポリ U-セファロース 等を用いるァフィニティーカラム法ゃバツチ法等により mRNAを得る。
次いで、得られた mRNAを铸型とし、オリゴ dTプライマー及び逆転写酵素を用いて、 第一鎖 cDNA (—本鎖 cDNA) を合成後、 該第一鎖 cDNAを铸型として第二鎖 cDNA (二 本鎖 cDNA) を合成する。 ここのオリゴ dTプライマーとしては、 固相固定化オリゴ dTプライマー、 補酵素標識オリゴ dTプライマー等が挙げられるが、 再現性や目的 DNA断片の回収率の点から、 固相固定化オリゴ dTプライマーが好ましい。 該固相固 定化オリゴ dTプライマーには、 ラテックスビーズ固定化オリゴ dTプライマー、 マ グネットビーズ固定化ォリゴ dTプライマー等があるが、 マグネットビーズ固定化 オリゴ d;rプライマーが好ましい。
(2)の工程では、試料中の該 cDNAを II型制限酵素で切断して cDNA断片を作成する c 試料中の該 cDNAは、 固相固定化オリゴ dTプライマーに結合した二本鎖 cDNAとす ることができる。 本明細書中の 「II型制限酵素」 という用語は、 所定の認識配列 を認識して、該認識配列の内側又はその隣接した特異的な位置で DNAを切断する制 限酵素をいう。 本発明で用いる II型制限酵素としては、 解析する mRNA中に少なく とも 1つは認識配列を有すると考えられるもの、 例えば、 4、 5あるいは 6個の' 塩基からなる認識配列を有する II型制限酵素が好ましい。 特に mRNAの平均鎖長が 2000塩基である点を考慮すると、 4の 4乗 = 2 5 6塩基に 1つの割合で制限部位 が出現し得る 4塩基の認識配列を有する II型制限酵素が好ましい。
本発明に用いる II型制限酵素の例を挙げると、 Afal, Alul, CviRI, Dpnl,
HpyCH4'V, HpyF44Iir, Rsal, Bfal, Csp6I, HpyCH4IV, Mael, Maell, TaqAlphal, Taql, TthHB8I, Xspl, Bspl43I, Dpnl I, Mbol, Ndell, Sau3AI, NIalll, AccII, Bshl236I, BstUI, BsuRI, FnuDII, Haelll, Mvnl, Acil, BsiSI, HapII, Hin6I, HinPlI, Hpall, Mspl, SciNI, Cfol, Hhal, Msel, Trull, Tru9I, Tasl, Tsp509I, 及び TspEIがあ る。
これらの II型制限酵素には、認識配列が 4塩基 ATCGすべてを含むもの、 CGのみ を含むもの及び ATのみを含むものがある。
認識配列が ATCGすべてを含む II型制限酵素の例を挙げると、 Afal， Alul, CviRI, Dpnl, HpyC勝, HpyF44III, Rsal, Bfal, Csp6I, HpyCH4IV, Mael, Maell, TaqAlphal, Taql, TthHBSI, Xspl, Bspl43I， DpnII, Mbol, Ndell, Sau3AI及び NIalllがある。 認識配列が CGのみを含む II型制限酵素の例を挙げると、 AccII， Bshl236I, BstUI, BsuRI, FnuDII, Haelll, Mvnl, Acil, BsiSI, HapII, Hin6I, HinPlI, Hpall, Mspl, SciNI, Cfol, 及び Hhalがある。 また、 認識配列が ATのみを含む II型制限酵素の例 を挙げると、 Msel， Trull, Tru9I, Tasl, Tsp509I， 及び TspEIがある。 これらの 認識配列の特徴と、 IIS型制限酵素を解析すべき発現遺伝子の特性とを考慮して、 II型制限酵素を選択するがの好ましい。
なお、前記 II型制限酵素は、図 1のように（2)の工程で得られる cDNA断片に、 （3) の工程でリンカー Xを連結したとき、 該 cDNA断片とリンカー Xとの連結部分が所 望の第 2 II S型制限酵素の認識配列となる切断末端を形成するように II型制限酵 素を選択する。例えば、第 2 11 S型制限酵素として認識配列「5' -GGGAC-3'」の BsmFI を選択する場合、 cDNA断片とリンカー Xとの連結部分がその認識配列と一致する よう 3'末端が 「5' -GGG- 3'」 のリンカ一 Xと、 5'切断末端 「5' - AC-3'」 の cDNA断片 を用いればよい。 したがって、 当該（2)の工程では、 認識配列が 「5' - GTAC- 3'」 で あって、 Tと Aとの間のホスホジエステル結合を切断する 11型制 P艮酵素 Rsal又は Afalを用いればよい。
(3)の工程では、 該 cDNA断片に、 第 1 Π S型制限酵素の認識配列を含み、 かつ前 記 Π型制限酵素の切断末端との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列を生じ るリンカー Xを連結して、 リンカー X— cDNA断片連結物を作成する。
まず、 （2)の工程で得られた cDNA断片群から、 オリゴ dTプライマー配列を含む cDNA断片を分離する。 分離は、 オリゴ dTプライマーの標識を利用して行うことが できる。 例えば、 ラテックスビーズ固定化オリゴ dTプライマーを前記 cDNAの調製 に用いている場合には、 II型制限酵素で処理した後、遠心分離することによって、 該ビーズに固定されたオリゴ dTプライマー配列を含む cDNA断片を沈降、 分離する ことができる。 ここで得られる cDNA断片は、 raRNAのポリ Aテールと該ポリ Aテー ルから 5'上流側に向かって最初に出現する前記 II型制限酵素の切断末端部位を含 むものである。 次いで、 該 cDNA断片に、 リンカ一 Xを DNAリガーゼ （例えば、 T4 DNAリガーゼ） を用いて連結する。
本明細書中で用いる 「リンカ一 x」 という用語は、 第 i n s型制限酵素の認識 配列を含み、 かつ前記 cDNA断片の Π型制限酵素の切断末端との連結部分に、 第 2 Π S型制限酵素の認識配列を形成できるリンカ一をいう。 また、 該認識配列は、 第 1 IIS型制限酵素がスぺーサー配列を残さないよう該 cDNAタグを切断する位置、 又は所望のスぺーサー配列を残すような適切な位置に在るのが好ましい。
例えば、 第 I II S型制限酵素の認識配列として BseRIの認識配列を含み、 かつ II 型制限酵素として RsaJを用いたときに得られる cDNA断片に連結させるリンカー X としては、 次の構造を有する二本鎖 DNA断片がある。
5' GAGGAGNNNN GGG-3' (配列番号 1 )
3， CTCCTC NNNNCCC-5' (配列番号 2 ) 該リンカ一 X中の配列 「5' - GAGGAG- 3'」 は第 1IIS型制限酵素 BseRIの認識配列で ある。 また該リンカ一 X中の 3'末端配列 「5' - GGG- 3'」 は、 cDNA断片の Rsalの切断 末端 「5' - AC - 3，」 との連結により BsraFIの認識配列「5' - GGGAC- 3'」を形成させるこ とを意図して設定した配列である。 なお、 本明細書中の塩基配列において使用す る N又は nは、 任意の塩基を意味する。
本明細書中で用いる 「第 i n s型制限酵素」 という用語は、 原則として、 リン カー X及びリンカー Y上の共通の認識配列を認識し、所望の EGIcDNAタグを形成で きる IIS型制限酵素及び、同様の機能を発揮する I型及び ΠΙ型制限酵素をも含むも のである。
該第 1 IIS型制限酵素の例を挙げると、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsraFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, Hgal, L el, SfaNI, Aprl, BspMI, Hphl, MboII, Mnll, Bbsl, BciVI, BbvII, Bpil, Bpll, BpuAI，及び Faulがある。
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が 1 0塩基以上の第 1 IIS型制 限酵素には、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, 及び Hgalがある。 また、 該距 離が 1 6塩基以上の第 1 IIS型制限酵素には、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, 及ぴ Gsulがある。
本明細書中で用いる 「第 2 II S型制限酵素」 という用語は、 原則としてリンカ 一 Xと cDNA断片の間に形成された連結部の認識配列と認識して、 cDNA断片の適切 な位置を切断する IIS型制限酵素、及び同様の機能を発揮する I型及び ΠΙ型制限酵 素を含むものである。 該第 2 IIS型制限酵素の切断により、 リンカ一 Xと cDNAタグ の連結物が得られる。
該第 2 IIS型制限酵素の例を挙げると、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I， Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, Hgal, Lwel, SfaNI, Aprl, BspMI, Hphl, MboII, Mnll, Bbsl, BciVI, BbvII, Bpil, Bpll, BpuAI，及び Faulがある。
これらのうち、認識配列から最長末端までの距離が 1 0塩基以上の第 2 IIS型制 限酵素には、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, 及ぴ Hgalがある。 また、 該距 離が 1 6塩基以上の第 2 IIS型制限酵素には、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, 及び Gsulがある。
なお、第 1 IIS型制限酵素は切断部位の配列を限定する必要はないので、第 1及 ぴ第 2の IIS型制限酵素の組み合わせは限定されない。 一方、 II型制限酵素は、 リ ンカー Xと cDNA断片との連結物に第 2 IIS型制限酵素の認識配列を形成できるも のを選択しなければならない。 例えば、 次の II型制限酵素と第 2 I IS型制限酵素と の組み合わせがある。
II型 第 2 IIS型 タグ長
A f a I Mm e I 2 0 + 4 b t) * 2
R s a I Mm e I 2 0 + 4 b t) 氺 2
A f a I B s m F I 1 4 - 4 b p
R s a I B s m F I 1 4 + 4 b p
C v • i R I R 1 e A I 1 2 + 4 b p * 3
H y C H 4 V R 1 e A I 1 2 + 4 b r» * 3
H p y F 4 4 I I I R 1 e A I 1 2 + 4 b p * 3
A c i I H g a I 1 0 + 4 b t)
H h a I H g a I 1 0 + 4 b p
H i n 6 I H g a I 1 0 + 4 b p
S c i N I H g a I 1 0 + 4 b r>
H i n P 1 I H g a I 1 0 + 4 b p
D p n I L w e I Q + 4 b r>
D p n I S f a N I 9 + 4 b t>
D p n I M n 1 I 7 + 4 b p * 1
A f a I B b s I 6 + 4 b p
R s a I B b s I 6 + 4 b p
A f a I B b y I I 6 + 4 b p
R s a I B b v I I 6 + 4 b p
A f a I B p i I 6 + 4 b p
R s a I B p i I 6 + 4 b p
A f a I B 1 I 6 + 4 b p
R s a I B 1 I 6 + 4 b p A f a I B p u A I 6 + 4 b p
R s a I B p u A I 6 + 4 b p
A c i I F a u I 6 + 4 b p
C f o I F a u I 6 + 4 b p
H h a I F a u I 6 + 4 b p
H i n 6 I F a u I 6 + 4 b p
H i n P 1 I F a u I 6 + 4 b p
S c i N I F a I 6 + 4 b _
なお、 上記表の右端の記号 *は正鎖の切断位置が相補鎖の切断位置よりも離れ ているため、 リンカ一 Yにランダム配列を必要とする組み合わせで、 *の右側の 数字はその塩基数を示す。
(4)の工程では、 該リンカ一 X— cDNA断片連結物を第 2 Π S型制限酵素で切断 して、 リンカ一 X— cDNAタグ連結物を作成する。 例えば、 第 2 II S型制限酵素と して BsmFIを用いる場合には、 当該酵素は、 該リンカ一 X— cDNA断片連結物に形 成された認識配列 「5' - GGGAC- 3'」 及びその相補鎮からなる二本鎖 DNAを認識し、 「5' -GGGAC- 3' (10/14)」 .の位置を切断する。 すなわち、 BsmFI は、 認識配列 「5' -GGGAC-3'」 の 3'末端の塩基 Cから 3'下流側 10番目の塩基と 11番目との間 のホスホジエステル結合、及び認識配列 「5' -GGGAC- 3'」 の相補鎖「3' - CCCTG- 5' J の 5'末端の塩基 Gから 5'上流側 14番目の塩基と 15番目との間のホスホ- ル結合を切断し、 以下の構造を有する切断末端を有する DNA断片を生じる c
5' -3' (配列番号 3 )
3' CCCTGNNNNNN N NN - 5' (配列番号 4 ) (5)の工程では、 必要に応じて、 （4)の工程で該リンカ一 X—cDNA断片連結物を 第 2 Π S型制限酵素で切断して得られた、 該リンカ一 X— cDNAタグ連結物を純化 する。 この純化は、 前記 cDNAタグが切除された cDNA断片残部を、 （3)の工程で記載 したように、 標識オリゴ dTプライマーの標識を利用して除去することにより行う ことができる。 例えば、 ラテックスビーズ固定化オリゴ dTプライマーを前記 cDNA の調製に用いている場合には、 ラテックスビーズの沈降性を利用して、 制限酵素 処理液を遠心分離することによって、 標識オリゴ dTプライマー配列を含む cDNA断 片残部を沈降し、除去することができる。 ここで遠心上清には、 リンカー X— cDNA タグ連結物が含まれることになる。
(6)の工程では、 必要に応じて該リンカー X— cDNAタグ連結物の cDNAタグの末端 を、 第 1 Π S型制限酵素の認識配列を含むリンカ一 Yが結合可能な状態にする。 該処理方法としては、 標識オリゴ dTプライマー配列を含む cDNA断片残部を除去 した溶液に、 DNAポリメラーゼ及び dNTPを加え突出末端を埋める方法がある。 さら に Taqポリメラーゼ及び dATPを加えると 3'末端にアデニンが 1塩基付加する。例え ば、 II S型制限酵素 BsmFI処理により得られた上記切断末端は、 Taqポリメラーゼ 処理によって以下の末端構造を有することになる。 なお、 該配列に置いて下線部 が新たに合成された配列である。
5' GGGACNNWJ NNN N A-3' (配列番号 5 )
3' CCCTG N N NN NNNN -5' (配列番号 4 )
(7)の工程では、 該リンカー X— cDNAタグ連結物の第 2 Π S型制限酵素による 切断末^に、 リンカ一 Yを連結して、 リンカ一 X— cDNAタグ一リンカ一 Y連結物 を作成する。
必要に応じて末端処理した該リンカー X— cDNAタグ連結物にリンカー Yを DNA リガーゼ (例えば、 T4 DNAリガーゼ） を用いて連結する。 本明細書中で用いる 「リ ンカー Y」 という用語は、 第 I II S型制限酵素 （例えば BseRI) の認識配列を含む リンカ一をいう。 また、 該認識配列は、 第 1 IIS型制限酵素がスぺーサー配列を残 さないよう該 cDNAタグを切断する位置、 又は所望のスぺーサー配列を残すような 適切な位置に在るのが好ましい。 例えば、 （6)の工程で得られ 3'末端にアデユン が 1塩基付加した DNA断片に連結するリンカー Yとしては、 下記構造を有する D退 断片がある。
5' GAGGAG NNWJNNGT-3' (配列番号 6 ) 3' CTCCTC NNNNNNNC - 5' (配列番号 7 ) 該工程により、 「5' - [リンカ一 X] - [cDNAタグ（EGIcDNAタグ） ] -[リンカ一
Y] -3'」 の構造を有する連結物が得られる。
(8)での工程は、 該リンカ一 X— cDNAタグ一リンカ一 Υ連結物を増幅する。
(7)の工程で得られる連結物は、 リンカー X及び Yにそれぞれプライマー X及 び Yがハイブリダィズする配列を有し、 ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)で容易に増 幅することができる。 該 PCR法は標準的なポリメラーゼ連鎖反応法、 例えば、 米国 特許第 4， 683, 195号に記載されているような方法でよい。 さらに、該連結物を原核 生物に適合するベクターに組み込むクローユング、 又は当業者に公知の他の増幅 法により増幅してもよい。
なお、 末端にプラマーァニール用のリンカ一を連結させた多種類の長さの異な る DNAを含む鐘型混合物を用いて PCRを行った場合、 増幅効率は各铸型 DNAの鎖長 によって異なる。 一般に、 鎮長が長いほど增幅効率は低く、 鎖長が短いほど増幅 効率は高い。 そのため、 得られた増幅産物中の各铸型 DNAに対応する増幅 DNA断片 の出現比率は、 铸型 DNA混合物中の各 DNA断片の存在比を反映しない結果となる。 しかし、 本発明の方法では、 铸型として使用する DNAの混合物は、 鎖長が等しく、 かつ短いので、 得られた増幅産物中の各铸型 DNAに対応する増幅 DNA断片の出現比 率は、 铸型 DNA混合物中の各 DNA断片の存在比を反映したものとなる。 従って、 本 発明においては、 PCRによる増幅効率の差による影響は理論的に皆無であり、 力、 つ得られる増幅産物中の各 cDNA断片の出現比率は、 被検細胞中で発現されている 各 mRNAの比率を反映したものとなる。
該 PCRは、時間、温度などの条件は、標準的な設定で行なうことができる。なお、 本発明で増幅するリンカー X— cDNAタグーリンカー Yは、 配列長が短く、 長ざが 均一で増幅効率が高いので、 ァニール Z配列延長サイクル数を減らすことが可能 である。 また、 リンカ一の配列を変えると P C Rの効率が変わるので、 用いるリ ンカーによりァニール/配列延長サイクルの所望の効率にすることができる。
本明細書中の「プライマー X」 という用語は、 リンカ一 Xの核酸鎖に相捕的で、 ポリメラーゼ連鎖反応が誘導される条件下で反応の開始点として作用することが できる、天然に存在するまたは合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。なお、 プライマー Xは、 リンカー X上の第 1 II S型制限酵素の認識酉己列を残すことがで きる位置にハイプリダイズし、 かつ重合剤の存在下で増幅を開始させるに足る長 さのものでなければならない。 該プライマー Xに必要な長さは温度、 p H、 使用 するリガーゼなど多くの要因により決まってくるであろう。 また同様に、 本明細 書中で用いる 「プライマー Y」 という用語は、 リンカ一 Υの核酸鎖に相補的で、 ポリメラーゼ連鎖反応が誘導される条件下で反応の開始点として作用することが できる、 天然に存在するまたは合成されたオリゴヌクレオチドを意味する。 . なお、 当業者であれば、 過度の実験を行わなくとも、 第 1 II S型制限酵素等を 考慮に入れ、 リンカーのヌクレオチド配列に基づいて容易に該増幅用プライマー を作製することができるであろう。
(9)の工程では、 得られた増幅産物を第 1 U S型制限酵素で切断して、発現遺伝 子同定用 cDNAタグを作成する。 例えば、第 1 II S型制限酵素として BseRIを用いた 場合には、 該酵素はリンカ一 X上の配列 「5' - GAGGAG- 3，」 及びその相捕鎖からな る二本鎖 DNAを認識し、 「5， -GAGGAG- 3' (10/8)」 を切断する。すなわち、 BseRIは、 認識配列 「5' - GAGGAG - 3'」 の 3'末端の塩基 Gから 3'下流側 10番目の塩基と 11番目 との間のホスホジェステル結合、 及び認識配列 5' -GAGGAG - 3，の相補鎖
3' -CTCCTC-5'の 5'末端の塩基 Cから 5'上流側 8番目の塩基と 9番目との間のホス ホジエステル結合を切断し、下記構造を有する切断末端を有するリンカー Xの DNA 断片を生じる。
5' GAGGAGNWWW N-3' (配列番号 8 )
3' _ · · · CTCCTCNNN NNN -5' (配列番号 9 ) また同様に、第 1 II S型制限酵素 BseRIは、 リンカー Y上の配列「5' -GAGGAG- 3'」 及びその相捕鎮からなる二本鎖 DNAを認識し、 「5， -GAGGAG-3' (10/8)」を切断する。 すなわち、 BseRIは、 認識配列 「5' - GAGGAG-3' J の 3'末端の塩基 Gから 3'下流側 10 番目の塩基と 11番目との間のホスホジエステル結合、 及び認識配列
「5' - GAGGAG - 3，」 の相捕鎖 3' - CTCCTC - 5'の 5'末端の塩基 Cから 5'上流側 8番目の 塩基と 9番目との間のホスホジエステル結合を切断する。 この結果、 リンカ一 X 及ぴ Yを含む DNA断片から、 EGIcDNAタグが切り離されることになる。
すなわち、 （2)の工程において、 II型制限酵素として Rselを使用し （3)の工程 において、 配列番号 1で表される塩基配列からなるヌクレオチド鎖を含むリンカ 一 Xを使用し、 （4)の工程において、 第 2 II S型制限酵素として BsmFIを使用し、 ）の工程において、配列番号 6で表される塩基配列からなるヌクレオチド鎖を含 むリンカ一 Yを使用.し、 （9)の工程において、 第 1 II S型制限酵素として BseRIを 使用することによって、 被検 cDNA由来の Rsal切断部位（5' -AC- 3' )に隣接する cDNA 由来の連続する 14塩基のヌクレオチド鎖を含む、 下記の EGIcDNAタグが得られる。
5' - NWroWNNNNNWWAC- 3， （配列番号 1 0 )
3' -TG NNWINN NN -5， （配列番号 1 1 ) ' 細胞由来の mRNAから得た cDNAライブラリ一を使用し、 本発明の方法を実施した 場合、 （9)の工程で、 EGIcDNAタグのライブラリーが得られる。
本発明では、 得られた該 EGI cDNAタグライブラリーを利用して、 EGI cDNAタグ配 列に対応する cDNAを定性的、 また定量的に測定し、 対応する発現遺伝子のパター ンを調べることができる。
例えば、 検出すべき cDNAに応じた EGIcDNAタグライブラリ一を前もって作成し、 それをスポットした検出装置に準備しておき、 これに異なる標識などでラベルし た被検者の試料と標準試料とを接触させ、 相対的な信号強度を比較して、 タ一ゲ ットの選択などを行なうことができる。 この標識として蛍光標識、 アイソトープ など公知のものを広く使用することができる。
また、 例えば、 該 EGIcDNAタグライブラリーを、 検出すべき cDNAなどを固定した 検出装置に接触させることにより、該 EGIcDNAタグライブラリーに含まれる cDNAを 検出して、 対応する発現遺伝子のパターンを調べることができる。
本発明で用いることができる検出装置には、 DNAチップなどのマイクロアレイと、 ドットハイブリダィゼーシユンなどのマクロアレイがある。 該検出装置に用いる 支持体には、 ナイロンメンプレン、 二トロセルロースフィルター、 ガラス板、 シ リコンチップなどがある。 また、 該検出装置とは、 例えば、 得られた EGIcDNAタグ を支持体上に固定し、 検出すべき D NA、 R NA、 及ぴそのフラグメントなどを ハイブリダィズさせて、 検出できる装置をいう。
なお、 mRNAあるレ、は cDNAを検出できるように標識することが好ましい。例えば、 標識としてラジオアイソトープ、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、 金属キレート剤、 または酵素などを使用することができる。
例えば、 標識した検出すべき cDNAを一本鎖分子に分離し、 必要に応じて段階的 に希釈し、 そして、 例えば、 シリコンチップの各グリッド中に、 検出すべき遺伝 子に対応した EGIcDNAタグを保持した固相支持体と接触させる。得られた遺伝子発 現パターンを標準となる遺伝子発現パターンと比較することにより、 容易に試料 細胞などの状態を知ることができる。 また、未知の遺伝子の EGIcDNAタグを固定し ておいてパターンを記録しておくと、 将来この遺伝子が判明したときに、 再解析 できる可能もある。
本発明では、 II型制限酵素と第 2 IIS型制限酵素の組み合わせにより、 EGIcDNA タグの長さを調整でき、 また遺伝子を解析する生物の種類などにより所望の長さ は変わってくる ί 一般に EGIcDNAタグの長さは 6〜 2 5塩基対、 さらに 1 0〜 2 5塩基対、 特に 1 0〜1 6塩基対とするのが好ましい。
(10)の工程では、 必要に応じて、 得られた発現遺伝子同定用 cDNAタグを分離す る。 当該分離は、 当業者が通常使用する方法、 例えば、 ポリアクリルアミドゲル 電気泳動法を利用して行うことができる。
さらに、 EGIcDNAタグを互いに連結し、 該連結物の塩基配列を決定することによ り発現遺伝子を解析することができる。 例えば、 （9)の工程で得た EGIcDNAタグは 3 ' 及び 5 ' の接着末端が相補的であるため、 T4リガーゼなどを用いて連結する ことができる。 そして、 得られた EGIcDNAタグの連結物（コン力テマ一）を当業者に ■ 公知な方法、 例えば、 ベクターに組み込んでク口一ユングしたり、 シークェンサ 一を用いて配列を読む方法で解析することができる。
本発明においては、 該コン力テマ一は、 一般に 3〜2 0 0の EGIcDNAタグ、 さら に3〜 8 0の EGIcDNAタグ、 特に 1 6〜 4 0の EGIcDNAタグを含むのが好ましい。 な お、 得られたコンカテマ一には、 EGIcDNAタグの形成方法により、 EGIcDNAタグ相 互の間にスぺーサー配列がないものと、 スぺーサ一配列があるものがある。
本発明の EGIcDNAタグ連結体は、 例えば、、 プラスミドゃファージのようなべク タ一に挿入して増幅する標準的な方法でクローニングすることができる。
本明細書の 「組換えベクター」 という用語は、 EGIcDNAタグ連結体を揷入し、 又 は組み込みにより作成されたプラスミド、 ウィルスまたは他の運搬体を指す。 こ のようなベクターは、 複製起点、 プロモーター、 及び形質転換細胞の表現型選択 を可能とする特定の遺伝子を含むものである。 本発明では、 公知でシーケンスに 適した多くのグローニングベクターを用いることができる。 その例を挙げると、 pUC18、その改変ベクター pUC118、 pUC19、その改変ベクター pUC119, M13mpl8RFI, M13mpl9RFI, pBR322, pCR3. 1, pBAD- T0F0及びその改良ベクター、 及ぴ
pBluescript (R) IIなどがある。
次に、 該組換えベクターを適当な宿主細胞に移入する。 本明細書の 「宿主細胞」 とは、 その細胞内でベクターが増殖できかつその D NAが発現され得る細胞、 及 び宿主細胞自体の子孫をも意味する。 なお、 複製の間に突然変異が起こることが あるので、 すべての子孫が親細胞と同一であるとは限らない。
また、 本発明では外来 D NAが宿主内で連続して維持されるような、 公知の安 定した移入法を用いることができる。 例えば、 大腸菌のような原核細胞などの宿 主を用いる場合は、指数増殖期後に収穫し、続いて公知の手法による RbCl法、 Ca Cl2 法で処理した細胞から、 D NA取込み能のあるコンビテント細胞を調製する。 ま た、 エレクト口ポレーシヨンや常法により形質転換を行うこともできる。
なお、本発明では、ベクターに EGIcDNAタグ連結体を組み込み塩基配列の決定を行 うことで、 一回の操作で 2 0個以上、 2 0個〜 1 0 0個、 好ましくは約 2 0〜 3 0個程度の EGIcDNAタグの配列を簡単に調べることができる。
これまで、 本発明の好ましい実施態様について記載してきたが、 当業者ならば これらの記載に基づき、 本発明の技術思想を逸脱することなしに種々の改変がで きることは明かである。また次に、本発明の実施例を示して具体的に説明するが、 これらの実施例は本発明の保護範囲は制限することを意図するのもではない。 し たがって、 本発明は特許請求の範囲によってのみ限定されるものである。
(実施例） 〔実施例 1〕 末梢血リンパ球細胞の遺伝子発現解析
まず、 健常人由来の末梢血から、 NycoPrepl. 077A (Nyco Med Pharma社製） を用 いて、 末梢血単球 （PBMC) を集めた。 得られた末梢血単球を、 lO g/mlリポ多糖 (LPS) の存在下又は非存在下、 37°Cで 3時間培養後、 それぞれの培養細胞から、 Isogen (二ツボンジーン社製） を用いて全 RNAを抽出した。 得られた全 RNA抽出物 を、 DNasel (宝酒造社製）で 37°C30分間処理後、 R easy (QIAGEN社製）を用いて精製 した。 次いで、 Oligotex-MAG mRNA精製キット （宝酒造社製） を用いて、 全 RNAか ら mRNAを吸着により単離後、 cDNA合成キット （宝酒造社製） を用いて、 mRNAから ニ本鎮 cDNAを調製した。
得られた二本鎖 cDNAを制限酵素 Rsal (New England Biolabs社製） で 37°C 2時間 処理することにより切断後、 磁石によってマグネットビーズ部分を壁面に集め、 回収することによって、 前記 raR Aにおけるポリ Aテールと該ポリ Aテールから 5' 上流側に向かって最初に出現する前記 Rsal認識切断部位との間の塩基配列を含む cDNA断片が存在する画分を得た。 次いで、 該 cDNA断片画分に、 T4 DNAリガーゼを 用い、 次の 3つの方法によって、 第 I II S型制限酵素 BseRIの認識配列を含むリン カー Xを連結した。 なお、 いずれにおいてもリンカ一 Xの連結は好適に行うこと ができた。
(1) Rsal切断末端にリンカ一 Xを直接連結する方法
Rsalで切断することにより生じた平滑末端に、 以下の構造を有するリンカ一 X を直接連結した。
5' -TGCAGCTGAGGAGTCCATGGG-3' (配列番号 1 2 )
3' - ACGTCGACTCCTCAGGTACCC- 5' (配列番号 1 3 ) (2) Rsal切断末端を一塩基付カ卩により接着末端化しリンカ一 Xを連結する方法 dCTPの存在下で Taq DNAポリメラーゼ処理することにより、 Rsal切断により生じ た平滑末端の 3'末端に、 以下のように （下線部） 、 Cを 1塩基導入した。
5， - AC 3' 3'一 CTG 5， 次いで、 上記接着末端に、 以下の構造を有するリンカ一 Xを連結した。 5' -TGCAGCTGAGGAGTCCATGGG-3' (配列番号 1 2 )
3' - ACGTCGACTCCTCAGGTACC -5' (配列番号 1 4 )
(3) Rsal切断末端を一塩基除去により接着末端化しリンカ一 Xを連結する方法 dATP、 dGTP及び dCTPの存在下で T4 DNAポリメラーゼ処理することにより、 Rsal 切断により生じた平滑末端の 3'末端から、 以下のように （下線部） 、 Tを 1塩基 除去した。
5' -AC 3，
3' - G 5' 次いで、上記接着末端に、以下の構造を有するリンカー Xを、 16°C 2時間の T4DNA リガーゼ処理により連結した。
5' TGCAGCTGAGGAGTCCATGGG _3' (配列番号 1 2 )
3' -ACGTCGACTCCTCAGGTACCCT-5' (配列番号 1 5 ) 次いで、 リンカー Xの接続により生じた制限酵素 BsmFIの認識配列 5' - GGGAC - 3， を利用して、 BsmFI (New England Biolabs社製） での 65°C 2時間の切断を行い、 今度は前回とは逆にマグネットビーズがない部分、すなわち遠心上清を回収した。 この酵素の切断部位は 5' - GGGAC- 3' (10/14)の位置であるから、 回収された部分に はリンカーに引き続く cDNA由来の 14塩基が含まれることになる （Rsal部位由来の 共通の AC2残基を除く） 。
この上清部分に対し、 dATP、 dCTP、 dGTP及ぴ dTTPの存在下で、 16°C 2時間の T4 DNA ポリメラーゼ処理を行った後、 dATPの存在下で 70°C、 30分間の Z- Taq (宝酒造社製） 処理を行なった後、 そのフラグメントを回収し、 dATPの存在下で処理を行った。 上記処理により、 3'末端に一個の Aがついた突出末端を生じるので、 これに以下 の構造を有する第二のリンカー Yを、 16°C 2時間の T4DNAリガーゼ処理により接続 した。
5' - CATGTGTCGCTCCTCACTAGAC- 3' (配列番号 1 6 )
3' -TGTACACAGCGAGGAGTGATCTG-5' (配列番号 1 7 ) 上記リンカー Yの接続により、 両端を既知のリンカーで挟まれた cD退由来の 14 塩基対を含む総延長 60塩基対の DNAの一群 「リンカ一 X- AC- cDNA由来の 14塩基対
(EGIcDNAタグ） -AC-リンカ一 Y」 の小断片 cDNA連結物ライブラリーを得た。 この 小断片は、 以下のような塩基配列及びその相補鎖からなるものである。
5' -TGCAGCTGAGGAGTCCATGGGACNNNWW NN N NACATGTGTCGCTCCTCACTAGAC-3'
(配列番号 1 8 ) 次に、 この小断片 cDNA連結物ライブラリーを、 リンカー X部分にハイプリダイ ズするプライマー X 「5' TGCAGCTGAGGAGTCCATGGG- 3，」 （配列番号 1 2 ) 及びリン カー Y部分にハイプリダイズするプライマー Y
「5' - GTCTAGTGAGGAGCGACACATGT- 3'」 （配列番号 1 7 ) を用いて、 Taq DNAポリメ ラーゼで PCRにより増幅した。 PCRは、 96。Cで 30秒間の変性、 50°Cで 1分間のァニ ーリング、 72°Cで 1分間の伸長を 1サイクルとする合計 25サイクルの増幅反応、 及び 72°Cで 2分間の最終伸長反応により行った。
得られた PCR産物を IIS型制限酵素 BseRI (New England Biolabs社製） で処理し た。 この酵素の切断部位は 「5' - GAGGAG- 3' (10/8)」 の位置であるから、 以下の構 造を DNA断片を生じさせた。
5' - N NN N NNN NAC-3' (配列番号 1 0 )
3' -TGN NN NNN NNNN -5' (配列番号 1 1 ) 次いで、 処理物を 12°/0ポリアクリルアミド電気泳動に供し、 リンカ一断片と分 離して上記小断片 DNAを回収した。
得られた cDNAタグを再び T4リガーゼで連結後、 4. 5°/0ポリアクリルアミ ド電気泳 動に供することによって、. 500〜1000bpの結合断片を回収した。 回収された結合断 片は、 以下の構造を有するものであり、 （^ 14に隣接する5' - 03，も。0 上の1^31 認識配列由来の塩基であるから、.人為的に付加したスぺーサー配列を含まない、 完全に cDNA由来の cDNAタグ連結物ライブラリーが得られたことになる。 以下の塩 基配列中、 （N) 14は cDNA由来の 14塩基 5' -丽 NNN NNNNN NN- 3' (配列番号 1 9 ) を表 している。
5' AC (N) 14 AC (N) 14AC (N) 14AC (N) 14AC (N) 14AC (N) 14AC 3' (配列番号 2 0 )
3， TG (N) 14TG (N) 14TG (N) 14TG (N) 14TG (N) 14TG (N) 14TG 5' (配列番号 2 1 ) 上記結合断片をプラスミド pUC118に組み込み、 ABI377型 DNAシーケンサ一により 塩基配列を決定した結果、 PBMC細胞及びこれを LPSにより刺激した細胞に特異的に 発現している遺伝子断片を解析することができた。 一回の塩基配列決定操作で約 20個程度の EGIcDNAタグの配列を明らかにできたので、 約 500サンプルの塩基配列 決定を行うことにより、 細胞で発現されている mR Aの種類とそれぞれの個数をお おむね明らかにできると考えられる 1万個の配列を明らかできた。
表 1及び 2にこの方法で同定された遺伝子をいくつか示した。 これらの EGIcDNA タグの塩基配列を既知のデータベースに対し、 ホモロジ一検索を行った。 表 1に は LPS刺激により発現が高まる遺伝子を、 表 2には逆に LPS刺激で発現が抑制され る遺伝子を示した。 LPS刺激によって発現が活性化される遺伝子
raf ID mf塩基配列 遺伝子名
44924901 5' -AGGGTCCTTTTGCA-3' ヒストン H3. 3の hII3. 3B
(配列番号 22) 遺伝子 （Hs. 180877)
261849128 5， -TTGCGTGAAAAGCT-3' Arg-セルピン mRNA (プラ
(配列番号 23) スミノーゲン活性化因子イン ヒビター 2， PAI-2) (Hs. 75716)
88602527 5' -CCCACTTTCTGCTG-3' 未知
(配列番号 24)
220597775 5' -TCAGCGAATGAATG-3' IL-I受容体アンタゴニスト
(配列番号 25) IL- IRa (IL- IRN)遺伝子、
完全コード配列
(lis. 81134)
69402230 5' -CAAGAGTTTGCTCC-3' ί駆体
(配列番号 26)
232235060 5' -TCTCCTGGAAATATJ3' サイトカインサブ
(配列番号 27) フアミリー B (Cys- X- Cys)、 メンバー 10 (SCYA10)mR A
110001478 5， -CGGATGCTTCCACC-3' インターフエ口ン制御因子 1
(配列番号 28) (IRF-l) mR A
247718478 5' - TGTAATTGAGCATC - 3' 推定翻訳開始因子
(配列番号 29) (SUI-l) mRNA
196314601 5 ' -GTGTATGACCTGGA - 3' 活性化（Act_2) mRNA、
(配列番号 30) 完全 cds (Hs. 75703)
97872251 5， - CCTCCCCGGCCTGG - 3， JAK結
(配列番号 31) (SSI-l) mRNA 表 2 '
LPS刺激によつて発現が抑制される遺伝子
mf ID mf塩基配列 遺伝子名
123160542 5， -CTCCCTCACTTCTC-3' ガードナ一-ラッシードネコ
5 (配列番号 32) 肉) 3重ゥイノレス（v_fgr)ガン遺伝 子ホモログ（FGR) mRNA '
129504303 5 ' -CTGTGAACCAAGTG-3' リボソームタンパク質 L3
(配列番号 33) (RPL3) mRNA
10
ΠΛ7ΛΟ C C
0 一ししし Mし し Αし i — ό 王要祖黻倉口-還†K十俊-口 W
(配列番号 34) クラス Π、 DM CK
(HLA-DMA) mRNA
15 70355926 55 -CAATACGAGTTCCC-3 ' ァクチン関連タンパク質 2/3 d歹 !J番 35) 极含体、 サノユーッ 卜 1B
(41kD) (ARPC1B)、 mRNA
233301643 5， - TCTGCTTGCGGAGG- 3， ザィキシン（ZYX) mRNA
A
20 ( l夕 lj番 3りソ
0 IT 5 ΓしΡしΡしΓしΤ丄Τ丄ΓしΤ丄Γ（JΡLTΓLIΓし ΛΔ Τ ό Q n ij -τ 一 、ヽ, 丄— ク 具 ノ 一—
(配列番号 37) ト（アデ-ル酸シクラーゼ阻害
GTP—結合タ、ノノ ク暫）
25 (Hs. 77269) mRNA
77904298 5 ' -CAGGCAGTGCGGGC-3' CARDを含有するアポトーシ
(配列番号 38) ス関連スペック様タンパク質
(ASし) mRNA
30
208646773 5 ' - TACGTTGTAGCTCA - 3' ミ トコンドリア DNA、
(配列番号 39) 完全配列
68307279 5 ' -CMCAGCAGCCATG- 3 造血細胞タンパク質 -チ口シ
35 (配列番号 40) ンキナーゼ (HCK)遺伝子、
完全コード配列、 ラムダ - a2 クローン（Hs. 89555)
237072942 5' - TGAGACCTAGAGTC- 3' ADP/ATP トランスロカーゼ
40 (配列番号 41) m醒、 3 ' UTR なお、 表 1及び表 2中、 mf IDとして塩基配列の前に示してある数字はコンビ, 一ター処理のために 14塩基を 1◦進法の数字により表示したものである。 すなわ ち、 m f I Dは、 塩基配列の各塩基を、 aを 0、 cを 1、 gを 2、 tを 3とそれ ぞれ読み替えてできた 4進数を 1 0進数に変換し、 1を加えた数である。 この ID により、 塩基配列を、 その長短にかかわらず数字で扱うことができる。 例えば、 塩基数 14の塩基配列を扱う場合、 次のように数値で特定することができる。
0 ― 333.3.333.3.3333.33.― (配列番号 42) 000000001 (又は単に 1)
― 3.3,3.3333333H33C― (配列番号 43) 000000002 (又は単に 2)
0 -aaaaaaaaaaaaag-3， (配列番号 44) 000000003 (又は単に 3 )
~ aaaaaaaaaaaaai― (配列番号 45) 000000004 (又は単に 4)
一 一 o (配列番号 46) 000000005 (又は単に 5)
5' -ttttttttttttgt-3' (配列番号 47) 268435452
5' -ttttttttttttta-3' (配列番号 48) 268435453
5' -tttttttttttttc-3' (配列番号 49) 268435454
5' -tttttttttttttg-3' (配列番号 50) 268435455
5' -tttttttttttttt-3' (配列番号 51) 268435456
このように該 IDにより如何なる 14塩基よりなる配列が現れても、 全てこれら の 9桁の数字の 1つに割り当てることができる。 これらの数字を小断片 ID (mini fragment ID:mf ID)と呼ぶ。
〔実施例 2〕
実施例 1で得られた EGIcDNAタグライブラリーを、次に述べる検出装置により検 出し、 遺伝子の発現を解析することができる。
表 1記載の LPS刺激により活性化される遺伝子のうち、 mfID261849128，
220597775, 69402230, 232235060, 110001478, 及び 196314601の m f塩基配列の 対応配列を含むオリゴ DNAを合成し、 常法によりスライドグラスにスポットして DNAチップを作成する。 実施例 1で得た LPS刺激末梢血単球 （PBMC) 由来の mRNAを鍀型として蛍光性 化合物 C y 3 - d UT P (* 1 ) (アマシャム'フアルマシア社製）で蛍光標識し、 かつ LPS無刺激 PBMC由来の: mRN Aを鑤型として蛍光性化合物 C y 5— dUT P (* 2) (アマシャム■フアルマシア社製） で蛍光標識しプローブ溶液を得る。
このプローブ溶液を混合し、 6XSET [0.9M NaClN 10 μ g/ml Yeast tRNAN0.1%SDS, 120mM Tris-HCl (pH7.8) ]中で前記 DNAチップと 45°Cでー晚ハイブリダイゼーショ ンを行う。
洗浄液 [6XSSC、 0.1 %SDS] により 5 2°Cで洗浄後、 スキャナーを用いて各蛍 光物質をスキャニングして蛍光強度データを得て、 そのデータの解析を行う。 各 スポットの C y 3と C y 5とのシグナノレ強度のスキヤッタープロット （Scatter Plot) の結果、 L P S刺激を受けた P BMC由来の mRNAに由来するプローブ が発する蛍光は、 すべてのスポット、において、 L P S無刺激のものよりもシグナ ル強度が 2倍以上強くなる。
* 1 CAS RN C y 3 CAS RN 1 4 6 3 6 8— 1 6— 3
CN 3H - Indolium, 2- [3- [1- [6- [ (2, 5-dioxo-l-pyrrol idinyl) oxy] -6- oxonexyl] - 1， 3 - dihydro- 3， 3 - dimethyl - 5 - sulfo - 2H - indol - 2_ylidene] - 1 - propenyl]—l- ethyl- 3, 3 - dimethyl- 5-sulfo_, inner salt (9CI) (CA INDEX NAME) *2 CAS RN C y 5 CAS RN 1 4 6 3 6 8 - 1 4- 1
CN 3H-Indolium， 2 - [5_[1- [6- [ (2, 5_dioxo- 1 - pyrrolidinyl)oxy」 - 6- oxohexyl] - 1， 3 - dihydro - 3, 3 - dimethyl- 5 - sulfo - 2H-indol - 2-ylidene]-l， 3 pentadienyl] 1 - ethyl- 3， 3 - dimethyl - 5 - sulfo -, inner salt (9CI)
(CA INDEX NAME)
〔実施例 3〕
実施例 1で得られた個々の EGIpDNAタグライブラリ一の任意のタグを用いて、一 組の被検試料における該遺伝子の発現の違いを解析することができる。
L P S刺激刺激末梢血単球 （P BMC) 由来 mRNA、 L P S無刺激 P BMC 由来 mRN Aをそれぞれ铸型として逆転写酵素で調製した c DNAをナイ口ンメ ンブレンにそれぞれスポットした後、 8ひ。 Cで 2時間処理する。 ' 表 1記載の L P S刺激により発現が誘導される遺伝子のうち m f I D 2 6 1 8 49128の塩基配列を含むオリゴ DN Aを合成し、 T 4ポリヌクレオチドキナ 一ゼで該 DNAを [Y- 32P] ATP (アマシャム . フアルマシア社製）を用いて32 P (放射性同位体)でラベルしプローブ溶液を得る。
このプローブ溶液を 6 X S ET中で前記ナイロンメンプレンと 45°Cでー晚ハ イブリダィゼーシヨンを行う。 洗浄液 [6 XS SC、 0. 1%SDS] により 5 2 °Cで洗浄後、 オートラジォダラフィーを行う。 X線フィルム上のシグナルは、 LP S刺激 PBMCの mRNA由来 c DNAのものの方が LP S無刺激 PBMC のものよりも 2倍以上強くなる。
〔実施例 4〕
II型制限酵素 Rsalの代わりに HpyCH4Vを用い、 第 2IIS型制限酵素 BsmFIの代わり に RleAIを用いた他は、実施例 1と同様の方法で EGIcDNAタグライブラリーを作成し た。 まず、 下記（1)〜（3)のいずれかの方法でリンカ一 X—cDNA断片連結物を作成す る。
(1) 試料中の cDNAを、 II型制限酵素 HpyCH4Vで切断することにより生じた平滑末 端に、 下記構造を有するリンカ一 Xを直接連結する。
5' - TGGAGCTGAGGAGTCATCCCA- 3 ' (配列番号 52)
3' — ACGTCGACTCCTCAGTAGGGT— 5， （配列番号 53 )
(2) 試料中の cDNAを、 II型制限酵素 HpyCH4Vで切断することにより生じた平滑末 端に、 dTTPの存在下で次のように、 塩基 Tを 1個導入する。
5' - CA■ · ■ - -3
3' -TGT■ · · ·—5' 次いで、 上記接着末端に、 次の構造を有するリンカ一 Xを連結する。
5' - TGGAGCTGAGGAGTCATCCCA - 3 ' (配列番号 52)
3' - ACGTCGACTCCTCAGTAGGG- 5 ' (配列番号 54 ) (3) 試料中の cDNAを、 II型制限酵素 HpyCH4Vで切断することにより生じた平滑末 端から、 dATP、 dTTP及び dCTPの存在下で、 次のように、 塩基 Gを 1個除去する。 5' -CA■ ■ ■— 3，
3, — T■ . ■一 5 , .
次いで、 上記接着末端に、 下記構造を有するリンカ一 Xを連結する。
5， 一 TGCAGCTGAGGAGTCATCCCA — 3， （配列番号 5 2 )
3' 一 ACGTCGACTCCTCAGTAGGGTG— 5， （配列番号 5 5 )
次いで、 リンカ一 Xの接続により生じた制限酵素 RleAIの認識配列 5' — CCCACA— 3' を利用して、 RleAIで切断を行い、 遠心上清を回収する。 この酵素の切断部位 は 5' — CCCACA— 3' ( 1 2 / 9 ) の位置であるから、 回収された部分にはリンカ 一 Xに続く cDNA由来の 1 2塩基のタグが含まれることになる。
続いて下記構造を有するリンカ一 Yを接続した。 続いて、 実施例 1と同じ方法 で增幅し、 第 1 IIS型制限酵素で消化することにより所望の EGIcDNAタグライブラ リーを得た。
5， 一 CACTGTGTCGCTCCTCACTAGAC— 3 ' (配列番号 5 6 )
3' —画 GTGACACAGCGAGGAGTGATCTG— 5， （配列番号 5 7 )
〔実施例 5〕
'実施例 4で得られた EGIcDNAタグライブラリーを、次に述べる検出装置により検 出し、 遺伝子の発現を解析することができる。
表 1記載の LPS刺激により活性化され、 かつ mfID261849128, 220597775,
69402230, 232235060, 110001478, 及び 196314601に対応する遺伝子に対応し、 か つ実施例 3で得られる EGIcDNAタグの対応配列を含むォリゴ D通を合成し、 常法に よりスライドグラスにスポットして DNAチップを作成する。
実施例 3で得た LPS刺激末梢血単球 （PBMC) 由来の m R N Aを铸型として蛍光性 化合物 C y 3— d U T P ( * l ) (アマシャム 'フアルマシア社製）で蛍光標識し、 かつ LPS無刺激 PBMC由来の mRNAを铸型として蛍光性化合物 C y 5— dUTP (* 2) (アマシャム 'フアルマシア社製） で蛍光標識しプローブ溶液を得る。
このプロ"ブ溶液を混合し、 6XSET [0.9M NaCl、 10 /_ig/ml Yeast tRNA、0.1%SDS、 120mM Tris-HCl (pH7.8) ]中で前記 DNAチップと 45°Cで一晚ハイブリダイゼーショ ンを行う。
洗浄液 [6XSSC、 0.1 %SDS] により 52°Cで洗浄後、 スキャナーを用いて各 蛍光物質をスキヤエングして蛍光強度データを得て、 そのデータの解析を行う。 各スポットの Cy 3と Cy 5とのシグナル強度のスキヤッタープロット（Scatter Plot) の結果、 L P S刺激を受けた P BMC由来の mRNAに由来するプローブ が発する蛍光は、 すべてのスポットにおいて、 LP S無刺激のものよりもシグナ ル強度が 2倍以上強くなる。
産業上の利用可能性
本発明により、被検 cDNA又は被検細胞に特異的に発現している遺伝子を再現性 よく正確に検出し、 解析することができる。 本発明の方法により、 任意の二つの 細胞における機能、 形態上の違いを遺伝子の発現状態の差として明らかにできる ので、 生 a的条件下、 あるいは病的状態におけるあらゆる生物現象の解析に広く 応用できる。 '

Claims

請求の範囲
1 . 発現遺伝子同定用 cDNAタグの作成方法であって：
相補的デォキシリポ核酸 (cDNA)を準備し、
該 cDNAを Π型制限酵素で切断して cDNA断片を作成し；
該 cDNA断片に、第 1 Π S型制限酵素の認識配列を含み、かつ前記 Π型制限酵の 切断末端との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列を生じるリンカー Xを 連結して、 リンカ一 X— cDNA断片連結物を作成し；
該リンカー X—cDNA断片連結物を第 2 Π S型制限酵素で切断して、 リンカー X —cDNAタグ連結物を作成し；
該リンカー X— cDNAタグの第 2 Π S型制限酵素による切断末端に、第 1 Π S型 制限酵素の認識配列を含むリンカ一 Yを連結して、 リンカ一 X— cDNAタグ一リ ンカー Y連結物を作成し；
該リンカー X— cDNAタグーリンカー Y連結物を増幅し；かつ
得られた増幅産物を第 1 Π S型制限酵素で切断して、 発現遺伝子同定用 cDNA タグを得る前記作成方法。
2 . さらに前記リンカ一 X— cDNA断片連結物を純化する工程を含む、 請求項 1記 載の方法。
3 . さらに、 前記リンカ一 X— cDNA断片連結物の cDNA断片の末端を、 第 I D S型 制限酵素の認識配列を含むリンカ一 Yが結合可能な状態に処理する工程を含む、 請求項 1記載の方法。
4 . さらに、 前記リンカ一 X— cDNA断片連結物の cDNA断片の末端を、 第 1 1I S 型制限酵素の認識配列を含むリンカー Yが結合可能な状態に処理する工程を含 む、 請求項 2記載の方法。
5 . 得られた発現遺伝子同定用 cDNAタグを分離する工程を含む、 請求項 1、 2、 3又は 4のいずれか 1項記載の方法。
6 . 被検細胞由来の mRNAから cDNAを調製する請求項 1記載の方法。
7 . オリゴ dTプライマーとして、 固相固定化オリゴ dTプライマーを用いて、 被 検細胞由来の mRNAから cDNAを調製する請求項 1記載の方法。
. 固相固定化オリゴ dTプライマーが、ラテックスビーズ又はマグネットビーズ 固定化オリゴ dTプライマーである請求項 7記載の方法。
9 . 前記]!型制限酵素が、 4塩基対の認識部位を有する請求項 1記載の方法。
1 0 . 前記 II型制限酵素が、 Afal, Alul, CviRI, Dpnl, HpyCH4V, HpyF44III, Rsal, Bfal, Csp6I, HpyCH4IV, Mael, Maell, TaqAlphal, Taql, TthHB8I, Xspl, Bspl43I,
Dpnl I, Mbol, Ndell, Sau3AI， Nlalll, AccII, Bshl236I, BstUI, BsuRI, FnuDII, Haelll, Mvnl, Acil, BsiSI, HapII, Hin6I， HinPlI, Hpall, Mspl, SciNI, Cfol, Hhal, Msel, Trull, Tru9I, Tasl, Tsp509I， 及び TspEIからなる群から選ばれ たものである請求項 1記載の方法。
1 1 . 前記第 1 IIS型制限酵素が、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Ec。57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, Hgal, Lwel, SfaNI, Aprl, BspMI, Hphl, MboII, Mnll, Bbsl, BciVI, BbvII, Bpil, Bpll, BpuAI, 及び Fau]^ らなる群から選ばれたものである、 請求項 1記載の方法。
1 2 .前記第 1 IIS型制限酵素が、 Mrael, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, 及び Hgal からなる群から選ばれたものである、 請求項 1記載の方法。
1 3 . 前記第 1 IIS型制限酵素が、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, 及び Gsul からなる群から選ばれたものである請求項 1記載の方法。
1 4 . 前記第 2 IIS型制限酵素が Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, Hgal, Lwel,
SfaNI, Aprl, BspMI, Hphl, MboII, Mnll, Bbsl, BciVI, BbvII, Bpil, Bpll, BpuAI, 及び Faulからなる群から選ばれたものである請求項 1記載の方法。
1 5 .前記第 2 IIS型制限酵素が、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, Gsul, BsmFI, Bcefl, Fokl, Bbvl, Bsp423I, Bst71I, RleAI, Ecil, BseMII, BseRI, 及び Hgal からなる群から選ばれたものである、 請求項 1記載の方法。
1 6 . 前記第 2 IIS型制限酵素が、 Mmel, Bpml, Bsgl, BspGI, Eco57I, 及び Gsul からなる群から選ばれたものである、 請求項 1記載の方法。
1 7 .前記 II型制限酵素が、 Afal， Rsal, CviRI, HpyCH4V, HpyF44III, Acil, Hhal, HinPlI, Hin6I, SciNI, Dpnl及ぴ Cfolからなる群から選ばれたものであり、 前記第 2 IIS型制限酵素が、 Mmel, BsmFI, RleAI, Hgal, Lwel, SfaNI, Mnll,- Bbsl, BbvII, Bpil, Bpll, BpuAI及び Faulからなる群から選ばれたものである、 請 求項 1記載の方法。
1 8 . 前記 II型制限酵素が HpyCH4Vであり、 前記第 2 IIS型制限酵素が RleAIで ある、 請求項 1記載の方法。
1 9 . 前記 II型制限酵素が Afalであり、 前記第 2 IIS型制限酵素が BsmFIであ る、 請求項 1記載の方法。
2 0 . 前記 II型制限酵素が Rsalであり、 前記第 2 IIS型制限酵素が BsmFIであ る、 請求項 1記載の方法。
2 1 . 前記 II型制限酵素が HinPlIであり、 前記第 2 IIS型制限酵素が Hgalであ る、 請求項 1記載の方法。
2 2 .前記 II型制限酵素が Afalであり、前記第 2 IIS型制限酵素が Mmelである、 請求項 1記載の方法。
2 3 .前記 II型制限酵素が Rsalであり、前記第 2 IIS型制限酵素が Mmelである、 請求項 1記載の方法。 '
2 4.発現遺伝子同定用タグの長さが 6〜 2 5塩基対である、請求項 1記載の方法。
2 5 . 発現遺伝子同定用タグの長さが 1 0〜2 5塩基対である、 請求項 1記載の 方法。
2 6 . 発現遺伝子同定用タグの長さが 1 0〜1 6塩基対である、 請求項 1記載の 方法。
2 7 . 第 1 Π S型制限酵素の認識配列を含み、 かつ Π型制限酵素で切断された cDNA断片との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列を形成することがで きるリンカー X。
2 8 .配列番号 1 2及び 1 3の塩基配列を有する、請求項 2 7記載のリンカ一 X。
2 9 . Π型制限酵素で切断された cDNA断片と、第 1 Π S型制限酵素の認識配列を 含み、 かつ前記 Π型制限酵素の切断末端との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の 認、識配列を生じるリンカ一 Xとを含む、 リンカー X— cDNA断片連結物。
3 0 . 請求項 2 9記載のリンカ一 X— cDNA断片連結物の切断末端に、 第 1 Π S型 制限酵素の認識配列を含むリンカ一 Yを連結したリンカ一 X— cDNA タグ一リ ンカー Y連結物。
3 1 . 配列番号 1 8の塩基配列及びその相補鎖を含む、 請求項 2 9記載のリンカ
— X -cDNAタグーリンカー Y連結物。
3 2 . 請求項 1、 2、 3又は 4のいずれか 1項記載の方法で得られた発現遺伝子 同定用 cDNAタグライブラリ一。
3 3 . 請求項 3 1の同定用 cDNAタグライブラリーを、 検出すべき核酸を固定した 検出装置に接触させることを特徴とする遺伝子発現解析方法。
3 4 . 該検出装置が、 同定すべき一群の核酸を各スポットに有する DNAチップであ る、 請求項 3 3記載の遺伝子発現解析方法。
3 5 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の方法で得られた発現遺伝子同定用タグ を互!/、に連結する工程、 及び該連結物の塩基配列を決定する工程を含む発現遺 伝子解析方法。
3 6 . 該連結物が 3〜 2 0 0の発現遺伝子同定用タグを含む、 請求項 3 5記載の 方法。
3 7 . 該連結物が 3 ~ 8 0の発現遺伝子同定用タグを含む、 請求項 3 5記載の方 法。
3 8 . 該連結物が 1 6 ~ 4 0の発現遺伝子同定用タグを含む、 請求項 3 5記載の 方法。
3 9 . 該連結物の配列を決定し、 その配列からそれぞれの cDNAタグの配列を決定 する、 請求項 3 6記載の定性的発現遺伝子解析方法。
4 0 . 該連結物の配列を決定し、 その配列からそれぞれの cDNAタグの配列及び出 現頻度を求める、 請求項 3 6記載の定量的発現遺伝子解析方法。
4 1 . 請求項 1〜 4のいずれか 1項記載の方法で得られた cDNAタグの連結物であ つて、 該 cDNAタグの間にスぺーサ一配列がなレ、連結物。
4 2 . 3〜2 0 0の cDMタグを含む、 請求項 4 1記載の連結物。
4 3 . 3 ~ 8 0の該 cDNAタグを含む、 請求項 4 1記載の連結物。
4 4 . 1 6〜 4 0の該 cDNAタグを含む、 請求項 4 1記載の連結物。
4 5 . 請求項 1 ~ 4のいずれか 1項記載の方法で得られた cDNAタグの連結物であ つて、 該 cDNAタグの間にスぺーサー配列がある連結物。
46. 3〜 200の cDNAタグを含む、 請求項 45記載の連結物。
47. 3〜 80の該 cDNAタグを含む、 請求項 45記載の連結物。
48. 16〜 40の該 cDNAタグを含む、 請求項 45記載の連結物。
49. 発現遺伝子同定用 cDNAタグ作成キットであって、 Π型制限酵素、 第 1 Π S 型制限酵素、 第 2II S型制限酵素、 第 1 H S型制限酵素の認識配列を含み、 か つ前記 Π型制限酵素の切断末端との連結部分に第 2 Π S型制限酵素の認識配列 を生じるリンカー X、 及び第 1 Π S型制限酵素の認識配列を含むリンカー Yを 含む、 該キット。
50. さらにリンカ一 Xにハイブリダイズするプライマー X、 及びリンカー Y ハイブリダィズするプライマー Yを含む、 請求項 49記載の該キット。
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