WO2002072629A1 - Immunopotentiators - Google Patents

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WO2002072629A1
WO2002072629A1 PCT/JP2002/002258 JP0202258W WO02072629A1 WO 2002072629 A1 WO2002072629 A1 WO 2002072629A1 JP 0202258 W JP0202258 W JP 0202258W WO 02072629 A1 WO02072629 A1 WO 02072629A1
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serp
glu
amino acid
peptide
seq
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PCT/JP2002/002258
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Hajime Otani
Yasuhito Tashiro
Michihisa Sugihara
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Meiji Seika Kaisha, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to an immunopotentiator comprising a specific peptide.
  • Milk itself is a nutrient source and is widely consumed.
  • protein casein which is present in milk, has long been used as a protein source in infant formulas and special formulas, because of its good digestibility and the balance of essential amino acids consumed.
  • Casein generally contains the amino acid residue phosphoserine, which has a phosphate group that is rarely found in normal proteins.
  • a casein phosphopeptide (hereinafter sometimes abbreviated as “CPP”) is obtained by separating and purifying a fraction containing a large amount of phosphoserine residues from a casein digested with an enzyme.
  • CPP is known to have the effect of maintaining the solubilized state of calcium insoluble in the small intestine and promoting the absorption of calcium, and has already been put to practical use as a raw material for many foods or feeds.
  • CPPs are also known to enhance immunoglobulin A production in cultured cell lines or in the digestive tract of animals (see, for example, Milk Science vol. 49 (2000), pp. 73-79, and Food and Agricultural Immunolog y, 12 (2000), ppl65-173).
  • CPP Since CPP is obtained by degrading casein with an enzyme, its antigenicity is lower than that of casein, but it has not completely disappeared. For this reason, there is a concern that those who are allergic to milk casein may cause an allergic reaction if they ingest CPP in order to enhance immunity.
  • CPP is described, for example, in WO96 / 29340. Here, it is disclosed that CPP promotes mineral absorption in the small intestine, but there is no suggestion regarding immunological and potent activities. [Summary of Invention]
  • the present inventors have now found that, among peptides derived from casein, those having a specific amino acid sequence having a plurality of phosphoserines exhibit an excellent immunopotentiating effect. Such a peptide exhibited an excellent immunopotentiating action even with a relatively small molecular weight.
  • the present invention is based on such findings.
  • an object of the present invention is to provide a peptide having a specific amino acid sequence and excellent in immunopotentiating activity, and an immunopotentiator comprising such a peptide.
  • the immunopotentiator according to the present invention comprises a peptide having the following amino acid sequence (I).
  • SerP represents a phosphoserine residue
  • X represents any one to three amino acid residues
  • the peptide according to the present invention has the following amino acid sequence (la).
  • SerP represents a phosphoserine residue
  • X represents 1-3 arbitrary amino acid residues
  • Q 1 represents 0 to 14 arbitrary amino acid residues
  • Q 2 represents any of 0 to 8 amino acid residues
  • the peptide having the amino acid sequence (I) according to the present invention preferably has an immunopotentiating activity.
  • the immunopotentiator according to the present invention can be used for mitogenic activity of spleen cells and immunoglobulin. It has an excellent immunostimulatory activity such as an activity to enhance the production of protein.
  • the peptide having the amino acid sequence (I) contained in the immunostimulant of the present invention is a peptide containing a plurality of phosphoserine and having an immunopotentiating action of a small molecular weight. This is a distinctly different substance from CPP, which has been conventionally recognized as having an immunopotentiating activity and has a molecular weight of about 3000 to 5000.
  • the peptide comprising the amino acid sequence (I) of the present invention has an excellent immunopotentiating effect, and at the same time, significantly reduces the milk allergic reaction caused by using casein or CPP. Or those that do not cause an allergic reaction. That is, the immunopotentiator according to the present invention is excellent in safety.
  • the immunopotentiator according to the present invention is useful as a food material or a pharmaceutical ingredient that imparts an immunopotentiating effect to a person having a weak immune function.
  • immunity enhancement can be expected by giving an infant with the immunopotentiator according to the present invention. Newborn infants are protected from infection by antibodies transferred from breast milk. Immunoglobulin A is mainly used as the transfer antibody in breast milk. Therefore, if a mother who cannot give breast milk gives the infant the immunopotentiator of the present invention, an effect equivalent to that of giving breast milk can be expected.
  • the immunopotentiator according to the present invention can be composed of a peptide having a small molecular weight without antigenicity, it can be given to infants who are allergic to milk. Furthermore, even in an adult whose immunity has decreased due to aging, illness, fatigue, and the like, the use of the immunopotentiator of the present invention can safely promote daily health.
  • FIG. 1 shows the results of examining the effects of the peptides (1) to (8) and the control on the proliferation activity of mouse spleen cells in Example 1 of Example.
  • (1) to (8) represent the peptides (1) to (8) in Example 1, respectively.
  • the superscript * indicates a statistically significant difference from the control, and the superscript ** indicates P ⁇ 0.01 and the superscript *** indicates P ⁇ 0.001.
  • Fig. 2 shows the results of examining the effects of the peptides (1) to (8) and the control on immunoglobulin production in the mouse spleen cell culture system in Example 1 of the Example. The result is shown.
  • (1) to (8) indicate the peptides (1) to (1) in Example 1.
  • FIG. 3 shows the results of examining the effects of the peptides (8) to (11) and the control of (1) on the proliferation activity of spleen cells in mice in Example 1 of Example.
  • (1) and (8) correspond to peptides (1) and
  • FIG. 4 shows that, in Example 2 of the Example, the peptides (8) to (11) and the control (1) exerted an effect on the production of immunoglobulin (IgG + IgM + IgA) in a mouse spleen cell culture system.
  • IgG + IgM + IgA immunoglobulin
  • (1) and (8) denote peptides (1) and (8) in Example 1, respectively
  • (9) to (11) denote peptides (9) to (11) in Example 2 respectively.
  • the superscript * indicates a statistically significant difference from the control
  • the superscript * indicates P ⁇ 0.05
  • the superscript ** indicates P ⁇ 0.01, and the upper.
  • FIG. 5 shows that in Examples 2 of the Examples, the peptides (8) to (11) and the control (1) were used in the mouse spleen cell culture system. 3 shows the results of examining the effect on immunoglobulin A production in E. coli.
  • (1) and (8) are the peptides in Example 1.
  • (1) and (8) are represented respectively, and (9) to (11) represent the peptides (9) to (11) in Example 2, respectively.
  • the superscript * indicates a statistically significant difference from the control, and the superscript * indicates P ⁇ 0.05, and the superscript ** indicates P ⁇ 0.0.
  • the immunopotentiator according to the present invention comprises a peptide consisting of an amino acid sequence containing at least a “SerP—X—SerP” sequence as a basic skeleton. Therefore, the present invention
  • the immunopotentiator according to the present invention comprises a peptide having the following amino acid sequence (I). Q 1 -SerP- X -SerP- Q 2 (I)
  • SerP represents a phosphoserine residue
  • X represents one to three arbitrary amino acid residues
  • 0 1 and 0 2 are either or both absent, or each independently represent one or more arbitrary amino acid residues.
  • immune enhancer refers to an agent having immunopotentiating activity, and its use is not limited to pharmaceuticals, but may be for food, feed, and the like.
  • "having an immunopotentiating activity” means that a mammal, particularly a human, can increase an immunopotentiating effect such as a spleen cell mitogenic activity and an immunoglobulin production enhancing activity.
  • an immunopotentiating activity was significantly recognized by an index such as spleen fibrillation and an increase in the amount of immunoglobulin.
  • amino acid includes optical isomers, that is, both D-form and L-form.
  • amino acid as used herein means not only the 20 kinds of single amino acids that constitute a natural protein, but also other single amino acids, and / or other amino acids, such as 5-amino acids and non-natural amino acids. Etc. may be included.
  • X in the amino acid sequence (I), X consists of one arbitrary amino acid residue.
  • X in the amino acid sequence (I) consists of one arbitrary amino acid residue
  • X is a group consisting of Leu, GlUs Ile, Thr, Ala, Arg, Lys ⁇ Asn, His, Val ⁇ and SerP.
  • X is SerP or Leu, more preferably, X is SerP.
  • the number of amino acid residues in Q1 is 1-201, more preferably 1-128, still more preferably 1-45, even more preferably 1-23, especially It is preferably 1 to 14.
  • Q 2 represents one or more arbitrary amino acid residues.c
  • the number of amino acid residues in Q 2 is 1 to 203, more preferably The number is preferably 1 to 192, more preferably 1 to 151, still more preferably 1 to 76, particularly preferably 1 to 31, and most preferably 1 to 11.
  • the number of amino acid residues represented by Q 1 is 0 to 14, and the amino acid represented by Q 2
  • the number of residues is 0-8. More preferably, Q1 has 0 to 8 amino acid residues, and Q2 has 0 to 5 amino acid residues. More preferably, Q1 has 0 to 1 amino acid residues, and Q2 has 0 to 2 amino acid residues.
  • the number of amino acid residues of Q1 is 14 and the number of amino acid residues of Q2 is 8, except when the number is eight.
  • SerP represents a phosphoserine residue
  • X represents 1-3 arbitrary amino acid residues
  • Q 1 represents 0 to 14 arbitrary amino acid residues
  • Q 2 represents any of 0 to 8 amino acid residues
  • This novel peptide can be the same as the peptide having the amino acid sequence (I) as long as it is included in the one represented by the formula (la).
  • the amino acid residues represented by Q 1 and Q 2 do not exist. That is, the amino acid sequence (I) is preferably an oligopeptide consisting of “SerP—X—SerP”. No. When the number of amino acid residues in the amino acid sequence (I) is small as described above, no antigenicity is exhibited, and thus no allergic reaction is caused when an immunopotentiator is used. Therefore, a highly safe immunopotentiator can be obtained.
  • amino acid sequence (I) is amino acid sequence (I)
  • amino acid sequence (I) comprises:
  • amino acid sequence (I) is:
  • the amino acid sequence (I) is Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP- Leu-SerP ⁇ SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Y-Ile-Asn-Lys (SEQ ID NO: 11)
  • Y is one arbitrary amino acid residue, preferably Arg or Cys, more preferably,
  • a derivative of the peptide when referred to as a peptide, a derivative of the peptide is also included.
  • the peptide derivative has the above-mentioned immunopotentiating activity, and has the basic skeleton sequence “SerP-X” in the peptide.
  • the peptide according to the present invention comprises the amino acid sequence (I) as a repetitive sequence obtained by repeating at least twice.
  • the number of repetitions of the amino acid sequence (I) in the peptide according to the present invention is at least 2 times, preferably 2 to 70 times, more preferably 2 to 30 times, still more preferably 2 to 10 times, More preferably, it is 2 to 4 times. From the viewpoint of exhibiting the above-mentioned effects more remarkably, the larger the number of repetitions, the better. However, the cost increases due to the complexity of the repetitive processing, and the safety or From the viewpoint of convenience and the like, the number of repetitions is preferably 2 to 10, more preferably 2 to 4.
  • the number of amino acids constituting the peptide is as follows: The number is preferably 224 or less, more preferably 100 or less, and still more preferably 30 or less. Manufacturing method of peptide
  • the peptides according to the present invention may be produced by utilizing various conventional synthetic methods or may be of natural origin. Since the amino acid sequence of the peptide according to the present invention has been determined, it may be obtained by synthesizing the entire amino acid sequence. It may be obtained by further synthesizing.
  • the peptide of the present invention is obtained as a natural source, it can be obtained, for example, by the following procedure.
  • casein for example, milk casein or yolk protein containing a protein containing a plurality of phosphoserine such as as 1-casein, hys 2 -casein, power zein, and fosvitin is prepared.
  • CPP casein phosphopeptide
  • ⁇ -Casein is hydrolyzed with crystalline tribcine to form CPP, and then unreacted casein and some impurities are precipitated and removed at pH 4.7, and barium chloride and ethanol (final) are added to the supernatant. 50% (v / v)) to recover CPP as a precipitate (e.g., RFPeterson, LW Norman and TL cMeekin, Journal of the American Chemical Society, 80, pp95-99 (1958)),
  • Casein is hydrolyzed by trypsin at a predetermined temperature and pH conditions (for example, pH 7.0-8.5s 50 ° C) to generate CPP, and then, at around pH 5, unrestressed zein After removing some impurities by precipitation, CPP is precipitated and recovered by adding calcium salt or calcium acetate and an organic solvent such as ethanol to the supernatant (Japanese Patent Publication No. 2-76166) ).
  • the CPP obtained as described above is required for endoproteases such as trypsin and chymotrypsin, and various beptose enzymes such as aminopeptidase and carboxypeptidase. Is processed using the combination of As a result, a peptide according to the present invention having a desired length depending on the application can be obtained.
  • the resulting phosphopeptide is reacted with an enzyme selected from the group consisting of aminopeptidylase, carboxypeptidylase, and a combination thereof to obtain the above-mentioned peptide.
  • a method comprising:
  • the peptide according to the present invention is obtained by utilizing various conventional synthesis methods, it can be obtained, for example, by the following procedure.
  • the peptide according to the present invention can be obtained by a conventional method, for example, a method according to Paquet et al. (A. Paquet and M. Johns, Int. J. Pept Protein Res, 36 (2), pp97-103, (1990)). It can be prepared by applying an ordinary peptide synthesis method.
  • a specific example first, phosphoserine in which an amino acid is protected with a t-butoxycarbonyl group (Boc) or the like and various amino acids are subjected to a stepwise activating method or a condensation method, which is a conventional method for the synthesis of peptides.
  • a phosphopeptide containing a phosphoserine group at an arbitrary position can be prepared. This method can be carried out by a liquid phase method or a solid phase method.
  • the immunopotentiator according to the present invention can be used for a drug, food or feed.
  • an immunopotentiator used as a medicament. More preferably, the immunopotentiator is used as a medicament for enhancing immunoglobulin production.
  • the immunopotentiator When the immunopotentiator according to the present invention is used as a medicament, the immunopotentiator can be prepared in an appropriate dosage form depending on the administration route. Specifically, injections such as intravenous injections and intramuscular injections, capsules, wraps, drops, tablets, granules, powders, pills, fine granules, dragees, lozenges, troches and the like, and rectal administration And lipophilic suppositories can be prepared.
  • the immunopotentiator may be in the form of a liquid or a liquid-encapsulated capsule, if necessary.
  • formulations contain commonly used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, preservatives, It can be produced in a usual manner by further using pharmaceutically acceptable additives for pharmaceutical preparations such as a flavoring agent, a soothing agent, a stabilizer and the like. That is, the immunopotentiator according to the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable additive for a pharmaceutical preparation.
  • Pharmaceutical additives that can be used include, for example, lactose, fructose, glucose, starch, gelatin, magnesium carbonate, synthetic magnesium silicate, talc, magnesium stearate, methylcellulose or salts thereof, gum arabic, polyethylene glycol, syrup Oral, petrolatum, glycerin, ethanol, propylene glycol, citric acid, sodium chloride, sodium sulfite, sodium phosphate and the like.
  • the administration form of the immunopotentiator can adopt various forms such as oral administration, parenteral administration, inhalation, rectal administration and topical administration.
  • parenteral administration includes subcutaneous injection, intravenous administration, intramuscular administration, intranasal administration or infusion. Therefore, for example, mucosal administration such as nose, buccal cavity, sublingual, rectal, etc., or transdermal administration, or administration using an implant may be used. And patients selected from the group consisting of non-human animals
  • the dose is appropriately determined in consideration of the usage, the age of the patient, the sex, the degree of the symptoms, and the like. However, in terms of the amount of the peptide in the immunopotentiator, it is usually about 10 to 100 per adult per day. 0 mg ⁇ Preferably, the dose is 50 to 50 mg, which can be administered once or several times a day.
  • the immunopotentiator according to the present invention thus provided in the form of a medicine can be advantageously used in the treatment or prevention of various infectious diseases, and in the treatment of diseases such as allergic diseases and autoimmune diseases. it can.
  • secreted IgA an immunoglobulin secreted into milk, inhibits the binding of strong pathogenic microorganisms to the intestinal mucosa and inactivates its action by specifically binding to bacterial toxins. It is known that it binds to a dietary antigen acting as an allergen and prevents it from passing through the digestive tract wall to suppress allergic reactions.
  • IgG antibodies to dietary antigens appear frequently and allergic diseases And the occurrence frequency of autoimmune diseases is known to be high.
  • the immunopotentiator of this invention since the induction
  • the immunopotentiator When the immunopotentiator according to the present invention is used as a food, the immunopotentiator may be provided in the form of gum, biscuit, chocolate, candy, jelly, tablet, confection, milk powder, and beverage.
  • the provision of the immunopotentiator according to the present invention in the form of a food is It is effective for nutritional supplementation and health promotion of inferior young and elderly people, patients after illness, etc., and also for health improvement of patients with diseases such as allergic diseases.
  • the immunopotentiator When the immunopotentiator according to the present invention is used as a feed, the immunopotentiator is provided in the form of feed for livestock such as feed for dairy cattle, feed for pigs, feed for poultry, pet food, various compound feeds and the like. May be done.
  • livestock such as feed for dairy cattle, feed for pigs, feed for poultry, pet food, various compound feeds and the like. May be done.
  • the amount of feed is determined as appropriate in consideration of the type, age, weight, sex, feeding environment, etc. of livestock animals, but the amount of the immunopotentiator component as feed is 0 to the total amount of feed to be fed. It is preferably contained in an amount of 0.1 to 1% by weight, more preferably 0.05 to 0.5% by weight. It is preferable to supply this to a domestic animal such as a baby for a fixed period of time, preferably for 3 weeks or more, more preferably for about 5 weeks.
  • the immunopotentiator according to the present invention which is provided in the form of feed, can easily enhance the immunity of livestock animals. Therefore, for example, infectious diseases and allergic reactions of livestock animals such as cattle on ranches and the like are possible. It can treat and prevent diseases and the like.
  • the immunopotentiator according to the present invention as a feed, it is possible to reduce the amount of use and increase the ratio of other feed components as compared with a feed using CPP, according to another aspect of the present invention.
  • a method for enhancing immunity of a patient having reduced or weak immunity comprising administering the peptide according to the present invention to a patient having reduced or weak immunity.
  • Example 1
  • phosphopeptides Based on the amino acid sequence of the obtained phosphopeptide, five types of synthetic phosphopeptides corresponding to the partial structure thereof, such as the following peptides (3) to (7), were synthesized. These phosphopeptides were synthesized by a solid phase synthesis method using Fmoc amino acids. Specifically, these were synthesized by sequentially attaching a high amino acid whose side chain was protected to a resin. At this time, an Fmoc group (9-Fluorenylmethoxycarbonyl group), which can be removed with a strong base, was used as the amino acid protecting group. After removing this protecting group, the next amino acid was bound using a binder. The peptide thus obtained was cleaved from the resin with a strong acid, and at the same time, the protecting group of the side chain was removed. Thereafter, the obtained crude peptide was purified by HPLC to obtain the target synthetic peptide .
  • Fmoc group 9-Fluorenylmeth
  • Peptide (7) was obtained from Biologica Co., Ltd., and Peptides (3) to (6) were obtained from Vex Inc., each of which was commissioned for synthesis. These were each 80% pure and had a peptide content of 1 Omg.
  • a peptide consisting only of phosphoserine (peptide (2)), a control containing no amino acid or peptide (peptide (1)), and 1 to 28 And casein phosphopeptide (peptide (8)).
  • the peptides (1) to (8) obtained above were subjected to the following evaluation tests to evaluate the immunopotentiating ability of each peptide.
  • Mouse spleen cells used in the test were aseptically collected from 6-week-old male C3H / HeN mice. This was cultured in Celgrosser-P medium containing 10 OU / ml of penicillin and 10 ⁇ g / ml of streptomycin.
  • each peptide as the sample described above was added to a concentration of 2 nM, and 0.5 ⁇ g of concanavalin (ConA), Magglutinin (PHA) or 50 g of lipopolysaccharide (LPS) was added to 5 g of the phytofat, and they were cultured under 37 ° C. and 5% CO 2.
  • ConA concanavalin
  • PHS lipopolysaccharide
  • Test 1 A Cell proliferation activity
  • the proliferation activity of the cells was evaluated by the number of cells after 48 hours.
  • Test 1B Immunoglobulin production
  • Immunoglobulin production was measured at 72-120 hours of culture.
  • the amount of immunoglobulin A was measured by a sandwich ELISA method (Williams, DJL et al., Vet. Immunol. Immunopath., 24 (1990), pp267-283). You That is, a cell culture solution is added to a plate coated with anti-mouse immunoglobulin A from Bhutan, washed, and reacted with anti-mouse immunoglobulin 8 from sheep labeled with horseradish peroxidase. Determined by
  • the peptides (9) to (11) were obtained from Vex Inc. by outsourcing their synthesis. These were each 80% pure and the amount of peptide was 1 Omg. In addition to these synthetic peptides (9) to (11), a control (peptide (1)) to which no amino acid or peptide was added and a casein phosphopeptide (peptide (8)) comprising 1 to 28 regions were used. Was prepared. Evaluation test 2:
  • the peptides (9) to (11), and the peptides (1) and (8) obtained above were subjected to the following evaluation test to evaluate the immunopotentiating ability of each peptide.
  • mice spleen cells used in the test were prepared and cultured in the same manner as in Example 1 above.
  • the growth promoting activity of spleen cells in mice was evaluated in the same manner as in Example 1 above.
  • the cell proliferation number was determined from the MTT value based on the absorbance at 570 nm, as in Example 1 above.
  • Immunoglobulin production was measured at 72-120 hours of culture.
  • the amount of immunoglobulin was measured by the sandwich ELI SA method (Williams, D.J.L. et al., Vet. Immunol. Cell Biol., 74 (1990). Pp323-329). That is, a cell culture solution was added to a plate coated with goat anti-mouse immunoglobulin (IgG + IgM + IgA or IgA), washed, and labeled with horseradish peroxidase. The anti-mouse immunoglobulin antibody of IgG (IgG + IgM + IgA) or the same sheep anti-mouse immunoglobulin antibody A was used for the reaction. The results were as shown in FIGS.

Description

明 細 書 免疫増強剤 [発 明 の 背 景]
発明の分野
本発明は、 特定のぺプチドを含んでなる免疫増強剤に関するものである。
背景技術
牛乳はそれ自身栄養源であり、 広く飲用されている。 また、 牛乳中に存在する タンパク質カゼインも、 その消化性とそれより摂取される必須アミノ酸バランス が良好なことから、 育児用調製乳や特殊調製乳のタンパク質源として古く利用さ れている。
カゼインは、 一般的に、 通常のタンパク質にはあまり存在しないリン酸基を有 するホスホセリンというアミノ酸残基を含んでいる。 カゼィンを酵素で消化した ものから、 このホスホセリン残基を多く含む画分を分離 '精製したものが、 カゼ インホスホペプチド （以下、 「C P P」 と略すことがある） である。
C P Pには、 小腸で不溶化するカルシウムの可溶化状態を保ち、 カルシウムの 吸収を促進する作用があることが知られており、 既に数々の食品または飼料原料 として実用化されている。 また C P Pには、 培養細胞系または動物の消化管中で 免疫グロブリン Aの産生を増強する作用があることも知られている （例えば、 Mi lk Science vol.49 (2000), pp73- 79、 および Food and Agricultural Immunolog y, 12 (2000), ppl65-173) 。
C P Pは、 カゼインを酵素で分解したものであるため、 その抗原性はカゼィン に比較すると低いものの、 完全に消失はしてはいない。 このため、 牛乳カゼイン に対してアレルギーのある者が、 免疫増強を期待して C P Pを摂取すると、 ァレ ルギ一反応を引き起こしてしまうことが懸念される。
また C P Pは、 例えば WO 9 6 / 2 9 3 4 0号公報に記載されている。 ここで は、 C P Pは小腸におけるミネラル吸収を促進することが開示されているが、 免 疫增強活性に関しては何ら示唆されていない。 [発 明 の 概 要]
本発明者らは、 今般、 カゼイン由来のペプチドのうち、 ホスホセリンを複数有 する特定のァミノ酸配列を有するものが、 優れた免疫増強作用を示すことを見出 した。 このようなぺプチドは比較的小分子量のものであっても優れた免疫増強作 用を示すものであった。 本発明は、 かかる知見に基づくものである。
したがって、 本発明は、 特定のアミノ酸配列を有し、 かつ免疫増強活性にすぐ れたぺプチド、 およびそのようなぺプチドを含んでなる免疫増強剤を提供するこ とをその目的とする。
そして、 本発明による免疫増強剤は、 下記のアミノ酸配列 （I ) からなるぺプ チドを含んでなる。
Q 1 -SerP- X -SerP- Q 2 - ( I )
[式中、
SerPはホスホセリン残基を表し、
Xは 1〜3個の任意のアミノ酸残基を表し、 かつ
<3 1ぉょび(3 2は、 いずれか一方もしくは両方が存在しないか、 または、 それそれ独立して 1個以上の任意のアミノ酸残基を表す] 。
また、 本発明によるペプチドは、 下記のアミノ酸配列 （l a ) からなる。
Q 1 - SerP- X -SerP- Q 2 ( l a )
[式中、
SerPはホスホセリン残基を表し、
Xは 1〜 3個の任意のアミノ酸残基を表し、
Q 1は 0〜 1 4個の任意のアミノ酸残基を表し、
Q 2は 0〜 8個の任意のアミノ酸残基を表し、
(ただし、 Q 1のアミノ酸残基の数が 1 4であって、 かつ Q 2のアミノ酸残 基の数が 8である場合を除く） ] 。
本発明によるアミノ酸配列 （I ) からなる前記ペプチドは、 好ましくは免疫増 強活性を有するものである。
本発明による免疫増強剤は、 脾臓細胞のマイ トジェン活性および免疫グロプリ ンの産生増強活性のような免疫賦活作用に優れたものである。 また、 本発明の免 疫增強剤に含まれるアミノ酸配列 （I) からなるペプチドは、 ホスホセリンを複 数含有する小分子量の免疫増強作用を有するペプチドである。 これは、 従来から 免疫増強活性の認められていた分子量 3000〜 5000程度とされる CPPと は、 明らかに異なる物質である。 このため、 本発明のアミノ酸配列 （I) からな るペプチドは、 優れた免疫増強作用を有すると同時に、 カゼインや CPPを使用 した場合に比べて引き起こされるミルクアレルギー反応が大幅に低減されるか、 またはアレルギー反応を引き起こすことのないものである。 すなわち、 本発明に よる免疫増強剤は、 安全性に優れたものである。
本発明による免疫増強剤は、 免疫機能が弱い者に対して、 免疫増強作用を賦与 する食品素材または医薬品素材として有用である。 例えば、 本発明による免疫増 強剤を乳児に与えることにより、 免疫増強が期待できる。 生後まもない乳児にお いては、 母乳からの移行抗体により感染から守られている。 母乳中の移行抗体は 免疫グロブリン Aが主体である。 このため、 母乳を与えることができない母親が、 乳児に本発明の免疫増強剤を与えれば、 母乳を与えるのと同等の効果が期待でき る。 また、 本発明による免疫増強剤は、 抗原性のない小分子量のペプチドからな ることができるので、 ミルクアレルギーの幼児にも安心して与えることができる。 さらに、 加齢、 疾病および疲労等に伴って免疫力が低下した成人においても、 本 発明の免疫増強剤を使用することにより、 日常の健康増進を安全に図ることがで きる。
[図面の簡単な説明]
図 1は、 実施例の例 1において、 （1) 〜 （8) のペプチドおよびコントロー ルについて、 マウスの脾臓細胞の増殖活性へ及ぼす影響を調べた結果を示す。 こ の図において、 （1) 〜 （8) は例 1におけるペプチド （1) 〜 （8) をそれそ れ表す。 また図中、 上付きの *印はコントロールに対する統計学的有意差を表し、 それそれ、 上付きの **は P<0. 01、 上付きの ***は P<0. 001を意味する, 図 2は、 実施例の例 1において、 （1) 〜 （8) のペプチドおよびコント口一 ルが、 マウス脾臓細胞培養系での免疫グロプリ Aン産生に及ぼす影響を調べた結 果を示す。 この図において、 （ 1) 〜 （8) は例 1におけるペプチド （ 1) 〜
(8) をそれそれ表す。 また図中、 上付きの *印はコントロールに対する統計学的 有意差を表し、 それそれ、 上付きの *は Pく 0. 05、 上付きの **は P<0. 0 1、 および上付きの ***は P < 0. 00 1を意味する。
図 3は、 実施例の例 1において、 （8) ~ (11) のペプチドおよび （1) のコ ントロールについて、 マウスの脾臓細胞の増殖活性へ及ぼす影響を調べた結果を 示す。 この図において、 （ 1) と （8) は例 1におけるペプチド （ 1) および
(8) をそれそれ表し、 （9) 〜 （11) は例 2におけるペプチド （9) 〜 （11) をそれそれ表す。 また図中、 上付きの *印はコントロールに対する統計学的有意差 を表し、 上付きの ***は P<0. 00 1を意味する。
図 4は、 実施例の例 2において、 （8) 〜 （11) のペプチドおよび （1) のコ ントロールが、 マウス脾臓細胞培養系での免疫グロブリン （I gG+I gM+ I gA) 産生に及ぼす影響を調べた結果を示す。 この図において、 （ 1) と （8) は例 1におけるペプチド （ 1) および （8) をそれそれ表し、 （ 9) 〜 （11) は 例 2におけるペプチド （9) 〜 （11) をそれそれ表す。 また図中、 上付きの *印は コントロールに対する統計学的有意差を表し、 それそれ、 上付きの *は P<0. 0 5、 上付きの **は Pく 0. 0 1、 および上付きの ***は P< 0. 00 1を意味する c 図 5は、 実施例の例 2において、 （8) 〜 （11) のペプチドおよび （ 1) のコ ントロールが、 マウス脾臓細胞培養系での免疫グロプリン A産生に及ぼす影響を 調べた結果を示す。 この図において、 （ 1) と （8) は例 1におけるペプチド
( 1) と （8) をそれぞれ表し、 （9) 〜 （11) は例 2におけるペプチド （9) 〜 （11) をそれそれ表す。 また図中、 上付きの *印はコントロールに対する統計学 的有意差を表し、 それそれ、 上付きの *は P< 0. 05、 上付きの **は Pく 0. 0
1、 および上付きの ***は P<0. 00 1を意味する。
[発明の具体的説明]
ぺプチド
本発明による免疫増強剤は、 「SerP— X— SerP」 の配列を少なくとも基本骨格 として含むアミノ酸配列からなるペプチドを含んでなる。 したがって、 本発明に よる免疫増強剤は、 下記のアミノ酸配列 （I ) からなるペプチドを含んでなる。 Q 1 -SerP- X -SerP- Q 2 ( I )
[式中、
SerPはホスホセリン残基を表し、
Xは 1〜 3個の任意のアミノ酸残基を表し、 かつ
0 1ぉょび0 2は、 いずれか一方もしくは両方が存在しないか、 または、 それそれ独立して 1個以上の任意のアミノ酸残基を表す] 。
本発明において 「免疫増強剤」 とは、 免疫増強活性を有する剤のことをいい、 その用途が医薬に限られず、 食品用、 飼料用等であってもよい。
本発明において、 「免疫増強活性を有する」 とは、 哺乳動物、 特にヒトにおい て、 脾臓細胞のマイ トジェン活性および免疫グロブリンの産生増強活性のような 免疫増強作用を増加させることができることをいい、 例えば、 本明細書の実施例 の例 1に記載の測定法と同様の条件において測定した場合に、 脾臓細増殖および 免疫グロプリン量増加のような指標によって免疫増強活性が有意に認められたと 評価されることを意味する。
本発明において、 「アミノ酸」 とは、 光学異性体、 すなわち D体および L体の いずれをも包含する。 また、 ここでいうアミノ酸には、 天然のタンパク質を構成 する 2 0種のひ一アミノ酸のみならず、 それら以外のひ一アミノ酸、 ならびに/? 一、 ァ —、 （5—アミノ酸および非天然のアミノ酸等も包含されてもよい。
本発明の好ましい態様によれば、 前記アミノ酸配列 （I ) において、 Xは 1個 の任意のアミノ酸残基からなる。
前記アミノ酸配列 （I ) における Xが 1個の任意のアミノ酸残基からなる場合 には、 Xは、 Leu、 GlUs Ile、 Thr、 Ala、 Arg、 Lysヽ Asn、 His、 Valヽ および SerP からなる群から選択されるものであることが好ましく、 より好ましくは、 Xは Se rPまたは Leuであり、 さらに好ましくは、 Xは SerPである。
前記アミノ酸配列 （I ) において、 Q 1が存在する場合には、 1は1個以上 の任意のァミノ酸残基を表す。 好ましくは Q 1におけるアミノ酸残基の数は 1〜 2 0 1個であり、 より好ましくは 1〜 1 2 8個、 さらに好ましくは 1〜 4 5個、 さらにより好ましくは 1 ~ 2 3個、 特に好ましくは 1〜 1 4個である。 また、 Q 2が存在する場合には、 Q 2は 1個以上の任意のアミノ酸残基を表す c 好ましくは、 Q 2におけるアミノ酸残基の数は 1〜2 0 3個であり、 より好まし くは 1〜 1 9 2個、 さらに好ましくは 1〜 1 5 1個、 さらにより好ましくは 1〜 7 6個、 特に好ましくは 1〜3 1個、 最も好ましくは 1〜 1 1個である。
本発明の一つの好ましい態様によれば、 前記アミノ酸配列 （I ) において、 Q 1で表されるアミノ酸残基の数は 0〜 1 4個であって、 かつ Q 2で表されるアミ ノ酸残基の数は 0〜 8個である。 より好ましくは、 Q 1のアミノ酸残基数は 0〜 8個であって、 かつ Q 2のアミノ酸残基数は 0〜 5個である。 さらに好ましくは、 Q 1のァミノ酸残基数は 0〜 1個であって、 かつ Q 2のァミノ酸残基数は 0〜 2 個である。
なお、 本発明による免疫増強剤に用いられるペプチドにおいては、 好ましくは、 Q 1のアミノ酸残基の数が 1 4であって、 かつ Q 2のアミノ酸残基の数が 8であ る場合は除かれる。
本発明の別の態様によれば、 新規なペプチドが提供され、 そのペプチドは下記 の式 （l a ) で表されるものである。
Q 1 - SerP— X— SerP— Q 2 ( l a )
[式中、
SerPはホスホセリン残基を表し、
Xは 1〜 3個の任意のァミノ酸残基を表し、
Q 1は 0〜 1 4個の任意のアミノ酸残基を表し、
Q 2は 0〜8個の任意のアミノ酸残基を表し、
(ただし、 Q 1のアミノ酸残基の数が 1 4であって、 かつ Q 2のアミノ酸残 基の数が 8である場合を除く） ] 。
この新規なペプチドは、 前記した式 （l a ) で表されるものに包含される限り において、 前記したアミノ酸配列 （I ) からなるペプチドと同一であることがで きる。
本発明の別の好ましい態様によれば、 前記アミノ酸配列 （I ) において、 Q 1 および Q 2で表されるアミノ酸残基はともに存在しない。 すなわち、 前記アミノ 酸配列 （ I ) は 「SerP— X— SerP」 からなるオリゴペプチドであることが好まし い。 このようにアミノ酸配列 （I ) のアミノ酸残基数が少ないものであると、 抗 原性が示されないので、 免疫増強剤を使用した場合にアレルギー反応を引き起こ さない。 このため、 安全性の高い免疫増強剤を得ることができる。
本発明のより好ましい態様によれば、 前記アミノ酸配列 （ I ) は、
Glu- SerP-X- SerP- SerP- SerP- Glu-Glu (配列番号 1 ) 、
Glu-SerP-X-SerP-SerP (配列番号 2 ) 、
SerP- X- SerP- Glu- Glu (配列番号 3 )、
SerP- X- SerP、 および
Glu-SerP-X-SerP-Glu (配列番号 4 ) 、
からなる群より選択され、 より好ましくは、
SerP— X— SerP
である。
本発明のさらに好ましい態様によれば、 前記アミノ酸配列 （I ) は、
Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (配列番号 5 ) 、
Glu- SerP- Leu- SerP- SerP (配列番号 6 ) 、
SerP- SerP- SerP- Glu- Glu (配列番号 7 ) 、
SerP-Leu- SerP、
SerP-SerP-SerP, および
Glu- SerP-Leu- SerP- Glu (配列番号 8 ) 、
からなる群より選択され、 より好ましくは、
SerP-Leu-SerPs または
SerP- SerP- SerP
である。
本発明の別の好ましい態様によれば、 前記アミノ酸配列 （ I ) は、
Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-X-SerP- SerP-SerP-Glu-Glu-Ser- 1 le-Thr-Arg (配列番号 9 )
であり、 さらに好ましくは、
Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP- SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-I le-Thr-Arg (配列番号 1 0 ) である。
本発明のさらに別の好ましい態様によれば、 前記アミノ酸配列 （I ) は、 Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP~ SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Y-Ile-Asn-Lys (配列番号 1 1 )
(式中、 Yは 1個の任意のアミノ酸残基であり、 好ましくは Argまたは Cysであ であり、 さらに好ましくは、
Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP- SerP-SerP-Glu-Glu-Ser- 1 le-Thr-Arg- 1 le-Asn-Lys (配列番号 1 2 ) である。
本発明において、 ペプチドというときには、 該ペプチドの誘導体も包含される ここでペプチドの誘導体とは、 前記した免疫増強活性を有するものであって、 か つ、 ペプチドにおける前記した基本骨格配列 「SerP— X— SerP」 以外の部分につ いて、 アミノ酸末端 （N末端） のアミノ酸または各アミノ酸の側鎖のァミノ基の 一部もしくは全部、 および/またはカルボキシル末端 （C末端） のカルボキシル 基または各種アミノ酸の側鎖のカルボキシル基の一部もしくは全部、 および ま たは、 ぺプチドの各アミノ酸の側鎖のアミノ基およびカルボキシル基以外の官能 基 （例えば、 水素基、 チオール基、 アミ ド基等） の一部もしくは全部が、 適当な 他の置換基によって修飾を受けたものをいう。 適当な他の置換基による修飾は、 例えば、 ペプチド中に存在する官能基の保護、 安全性および組織移行性の向上、 または活性の増強等を目的として行われることがある。 したがって、 上記した配 列番号 1〜1 2のべプチドの誘導体も本発明に包含される。
本発明の好ましい態様によれば、 本発明によるペプチドは、 前記アミノ酸配列 ( I ) を少なくとも 2回反復した反復配列として含んでなる。
本発明によるペプチドにおけるアミノ酸配列 （I ) の反復回数は、 少なくとも 2回であり、 好ましくは 2〜7 0回、 より好ましくは 2〜3 0回、 さらに好まし くは 2 ~ 1 0回、 さらにより好ましくは 2〜4回である。 前記効果をより顕著に 発揮させる観点からは、 その反復回数は多いほど好ましい。 ただし、 反復処理の 煩雑によるコス卜の上昇、 および免疫増強剤として使用する際の安全性もしくは 利便性等の観点からは、 前記反復回数は、 好ましくは 2〜10回であり、 より好 ましくは 2〜4回である。
本発明の一つの好ましい態様によれば、 本発明によるべプチドが前記アミノ酸 配列 （I) を少なくとも 2回反復した反復配列として含んでなる場合には、 該ぺ プチドを構成するアミノ酸の数は、 224個以下であることが好ましく、 より好 ましくは 100個以下、 さらに好ましくは 30個以下である。 ぺプチドの製造法
本発明によるべプチドは、 慣用の各種合成法を利用することによって製造した ものであっても、 天然起源のものであってもよい。 本発明によるペプチドは、 そ のァミノ酸配列が決定されていることから、 その配列全てを合成することによつ て得てもよく、 また、 天然起源のものを一部利用してそれを基にさらに合成を行 つて得たものであってもよい。
本発明によるペプチドを、 天然起源のものとして得る場合には、 例えば下記の ような手順により得ることができる。
まず、 カゼインとして例えば、 as 1—カゼイン、 ひ s 2—カゼイン、 力 ゼィン、 フォスビチンのようなホスホセリンを複数含有するタンパク質を含む牛 乳カゼイン、 または、 卵黄タンパク質を用意する。
次いで、 これを慣用の条件下に所謂トリブシン処理に付して加水分解させた後、 得られた上清を分離回収し、 これよりカゼインホスホペプチド （CPP) を得る。 このような CPP調製法の具体例としては、 下記 （1) 〜 （3) のような方法が 挙げられる ：
(1) 結晶卜リブシンで^—カゼインを加水分解して、 CPPを生成させ、 次いで pH4. 7で未反応カゼインと一部の不純物を沈殿除去した後、 上清部に 塩化バリウムとエタノール （終濃度 50%(v/v)) を加えて CPPを沈殿として回 収する方法 （例えば、 R.F.Peterson, L.W.Norman and T.L. cMeekin, Journal o f the American Chemical Society, 80, pp95-99(1958))、
(2) 結晶トリプシンで/?一カゼインを加水分解して、 CPPを生成させ、 ついでトリクロロ酢酸で処理して不溶物を除去後、 水酸化ナトリウムにより中和 (pH5.0) し、 その後、 ゲル濾過カラム （Sephadex G-25", Pharmacia社） により粗 分画し、 さらにイオン交換カラム （Dowex 50x2* 3 Dow Chemical Co. ) にいつたん 吸着させた後、 ピリジン—酢酸緩衝液 （0.2規定 PH2.5) で溶出させて C P Pを精 製して得る方法 (H.Naito and H. Suzuki, Agricultural Biological Chemistry,
38, ppl543-1545( 1974)) 、 および
( 3 ) カゼインをトリプシンにより所定の温度および p H等の条件 （例えば pH7.0-8.5s 50°C) 下に加水分解し、 C P Pを生成させ、 次いで p H 5前後で未反 応力ゼィンと一部の不純物を沈殿除去した後、 上清部にカルシウム塩もしくは酢 酸カルシウムとエタノールなどの有機溶媒とを加えて、 C P Pを沈殿させて回収 する方法 （特公平 2— 7 6 1 6号公報） 。
次いで、 上記のようにして得られた C P Pを、 トリプシン、 キモトリブシン等 のエンドプロテア一ゼと、 アミノぺプチ夕ーゼ、 カルボキシぺプチ夕一ゼのよう な種々のべプチ夕一ゼとを必要により組み合わせたものを用いて処理する。 これ によって、 用途に応じた所望する長さを有する本発明によるべプチドを得ること ができる。
したがって、 本発明の別の態様によれば、 前記したペプチドの製造方法であつ て、
カゼインを用意し、
該カゼインをトリプシン処理した後、 カルシウム塩とエタノールによる沈殿処 理によって、 ホスホペプチドを得、 次いで
得られたホスホペプチドに、 アミノぺプチ夕一ゼ、 カルボキシぺプチ夕一ゼ、 およびそれらの組合せからなる群より選択された酵素を作用させて、 前記べプチ ドを得る
ことを含んでなる方法が提供される。
また本発明によるペプチドを、 慣用の各種合成法を利用することによって得る 場合は、 例えば下記のような手順により得ることができる。
すなわち、 本発明によるペプチドは、 慣用の方法、 例えば Paquet等による方法 (A. Paquet and M. Johns, Int. J. Pept Protein Res, 36(2), pp97-103, ( 199 0)) に従い、 通常のペプチド合成法を応用することにより調製することができる。 具体例を挙げて示すと、 まずアミノ酸を t—ブトキシカルボニル基 （B o c ) など で保護したホスホセリンと各種アミノ酸とをべプチド合成の常法である活性化工 ステル法や縮合法を用いて、 段階的に鎖長を延ばすことにより、 任意の位置にホ スホセリン基を含有するホスホぺプチドを調製することができる。 この方法は液 相法でも固相法であっても実施可能である。 免疫増強剤
本発明による免疫増強剤は、 医薬、 食品または飼料としての用途に用いること ができる。
したがって、 本発明の一つの好ましい態様によれば、 医薬として用いられる免 疫増強剤が提供される。 より好ましくは、 該免疫増強剤は、 免疫グロブリン産生 を増強するための医薬として用いられる。
本発明による免疫増強剤が医薬として用いられる場合には、 免疫増強剤は、 投 与経路に応じて適当な剤形に調製することができる。 具体的には、 主として静注、 筋注等の注射剤、 カプセル剤、 包み剤、 ドロップ剤、 錠剤、 顆粒剤、 散剤、 丸剤、 細粒剤、 糖衣錠、 トローチ錠等の経口剤、 直腸投与剤、 油脂性座剤等のいずれか の製剤形態に調製することができる。 また、 該免疫増強剤は必要に応じて、 液剤 や液剤封入カプセル剤等の形であってもよい。
これらの製剤は通常用いられている賦形剤、 増量剤、 結合剤、 湿潤化剤、 崩壊 剤、 表面活性剤、 滑沢剤、 分散剤、 緩衝剤、 保存剤、 溶解補助剤、 防腐剤、 矯味 矯臭剤、 無痛化剤、 安定化剤等の薬学上許容可能な製剤用添加剤をさらに用いて 常法により製造することができる。 すなわち、 本発明による免疫増強剤は、 薬学 上許容可能な製剤用添加剤をさらに含んでなることができる。
使用可能な製剤用添加剤としては、 例えば乳糖、 果糖、 ブドウ糖、 デンプン、 ゼラチン、 炭酸マグネシウム、 合成ケィ酸マグネシウム、 タルク、 ステアリン酸 マグネシウム、 メチルセルロース、 またはその塩、 アラビアゴム、 ポリエチレン グリコ一ル、 シ口ヅプ、 ワセリン、 グリセリン、 ェ夕ノール、 プロピレングリコ ール、 クェン酸、 塩化ナトリウム、 亜硫酸ソーダ、 リン酸ナトリウム等が挙げら れる。 本発明による免疫増強剤が医薬として用いられる場合には、 免疫増強剤の投与 形態は、 経口投与、 非経口投与、 吸入、 絰直腸投与、 局所投与などの各種形態を 採用することができる。 このうち、 非経口投与には、 皮下注射、 静脈内投与、 筋 肉内投与、 鼻腔内投与または注入などが含まれる。 従って、 例えば鼻、 口腔、 舌 下、 直腸等の粘膜投与あるいは経皮投与、 埋め込み剤による投与であってもよい したがって、 このようないずれかの投与経路により、 本発明による免疫増強剤を、 ヒトおよびヒト以外の動物からなる群より選択される患者に投与することができ る
投与量は、 用法、 患者の年齢、 性別、 症状の程度等を考慮して適宜決定される が、 免疫増強剤における前記ペプチド量換算で、 通常成人 1日 1人当たり約 1 0 〜： I 0 0 0 m g\ 好ましくは 5 0〜 5 0 O m gの投与量であり、 これを 1日 1回 または数回にわけて投与することができる。
このように医薬の形態で提供される本発明による免疫増強剤は、 種々の感染症 の治療または予防や、 アレルギー性の疾患や自己免疫疾患のような疾患の治療等 において有利に使用することができる。
すなわち、 乳汁中に分泌される免疫グロブリンである分泌型 I g Aは、 強力な 病原性をもつ微生物の腸管粘膜への結合阻害および細菌毒素と特異的に結合して その作用を不活化すること、 および、 アレルゲンとして作用する食餌性の抗原と 結合し消化管壁を通過することを防止してアレルギー反応を抑制すること等が知 られている。 一方で、 分泌型 I g Aのない育児粉乳で育てられた人工栄養児およ び I g A欠損症の患者では、 食餌性抗原に対する I g G抗体が高頻度に出現し、 ァレルギー性の疾患や自己免疫疾患の発現頻度が高いことが知られている。 本発 明の免疫増強剤によれば、 感染防御やアレルギー反応の抑制効果を有する I g A の体内での誘導を促進することができるので、 生体の免疫能を増強させることが できる。
本発明による免疫増強剤が食品として用いられる場合には、 免疫増強剤は、 ガ ム、 ビスケッ ト、 チョコレート、 キャンディ、 ゼリー、 錠菓、 粉乳、 および飲料 などの形で提供されてもよい。
このように本発明による免疫増強剤が食品形態で提供されることは、 体力的に 劣る幼年者や老年者、 病後の患者等の栄養補給や健康増進、 さらには、 アレルギ 一性疾患のような疾患を有する患者の健康増進等を図る上で有効である。
本発明による免疫増強剤が飼料として用いられる場合には、 免疫増強剤は、 乳 牛用飼料、 養豚用飼料、 養鶏用飼料等の家畜用飼料、 ペットフード、 各種配合飼 料などの形で提供されてもよい。
このとき給与量は、 家畜動物の種類、 年齢、 体重、 性別、 給餌する環境等を考 慮して適宜決定されるが、 飼料としての免疫増強剤成分が、 給与する飼料全量に 対して 0 . 0 1〜 1重量％含まれることが好ましく、 より好ましくは 0 . 0 5〜 0 . 5重量％含まれる。 これを一定期間、 好ましくは 3週間以上、 より好ましく は 5週間程度継続して子ブ夕のような家畜動物に給与することが好ましい。 飼料形態で提供される本発明による免疫増強剤は、 家畜動物の免疫能を簡便に 増強することができるものであり、 したがって、 例えば、 牧場等における牛のよ うな家畜動物の感染症やアレルギー性疾患等の治療および予防を図ることができ る。
また本発明による免疫増強剤を飼料として利用することにより、 C P Pを用い る飼料に比べて、 その使用量を少なくし、 他の飼料成分の比率を高めることがで 本発明の別の態様によれば、 免疫力の低下したまたは免疫力の弱い患者に、 本 発明によるべプチドを投与することを含んでなる、 前記患者の免疫力を増強させ る方法が提供される。
本発明のさらに別の態様によれば、 免疫増強剤を製造するための本発明によ るぺプチドの使用が提供される。 施 例]
以下、 本発明を実施例により具体的に説明するが、 これらは本発明を限定する ものではない。 例 1
ぺプチドの調製： ?一力ゼィン 1— 28域の活性中心の同定を検討するため、 以下の実験を行な つ 7こ o
?一カゼイン （純度 90%以上） （シグマ社より入手可能） を、 濃度 15%(w /w)とし、 これにトリプシン （Novo社製） を加えて、 pH7. 0、 60°Cの条件下 において、 2時間反応させた。 その後、 pH4. 5に調整して不純物を沈殿とし て除去した。 得られた上清に、 カルシウムを対液 1. 1%、 およびエタノールを 終濃度 50% (v/v)添加し、 沈殿としてカゼインホスホペプチド （CPP) を得 た。 これは、 下記に示したペプチド（ 8)のような 1一 28域からなるホスホぺプ チドであった。
得られた前記ホスホぺプチドのアミノ酸配列に基づいて、 その部分構造に相当 する下記ペプチド（ 3 )〜（ 7 )のような 5種類の合成ホスホペプチドを合成した。 これらのホスホぺプチドは、 Fmo cアミノ酸を用いた固相合成法により行った。 具体的には、 これらの合成は、 樹脂に側鎖を保護したひ—アミノ酸を順次結合さ せることにより合成した。 このときひアミノ酸保護基には、 強塩基で除去できる Fmo c基 ( 9-F luorenylmethoxycarbonyl group) を用い、 この保護基を取り除 いた後、 結合剤を用いて次のアミノ酸を結合させた。 このようにして得られたぺ プチドを、 強酸によって樹脂から切断し、 同時に側鎖の保護基を除去し、 その後、 得られた粗ぺプチドを HPLCにより精製して目的の合成べプチドを得た。
なお、 ペプチド（7)は株式会社バイオロジカ社製に、 またペプチド（3)〜（6) は株式会社ベックス社製に、 それそれ合成を委託して入手した。 これらは、 それ それ純度 80 %であり、 ぺプチド量は 1 Omgであった。
前記した合成ペプチド（3 )~( 7)の他に、 さらに、 ホスホセリンのみからなる もの （ペプチド（2)) と、 アミノ酸またはペプチドを無添加とするコントロール (ペプチド（1)) と、 1〜28域からなるカゼインホスホペプチド （ペプチド (8)) とを用意した。
ぺプチド（ 1 ) コントロール
ペプチド（2) SerP (単独）
ペプチド（3) SerP'5-Leu-SerP"-«
ペプチド（4) GluH-SerP-Leu-SerP"- Glu21 ペプチド（5) SerP"-SerP-SerP-Glu-Glu21
ペプチド（6) Glu1'- SerP- Leu- SerP- SerP18-觀
ペプチド（7) GluH-SerP-Leu-SerP-SerP~SerP-Glu- Glu21
ペプチド（8) Arg'-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-
GluH-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu~Glu21-Ser-Ile-Thr-Arg-Ile-Asn-Lys23 評価試験 1 ：
以上で得られたペプチド（1)〜（8)を、 下記のような評価試験に付して、 各ぺ プチドの免疫増強能を評価した。
試験で使用したマウス脾臓細胞は、 6週齢の C 3 H /H e N系雄マウスから無 菌的に採取した。 これを、 10 OU/mlのペニシリンと 10 Ο zg/mlのス トレブトマイシンとを含む Celgrosser- P培地において培養した。
マイクロプレート中で 5x 106個の脾臓細胞に対して、 前記したサンプルであ る各ペプチドをそれそれ 2 nMの濃度になるように添加し、 さらに、 0. 5〃g のコンカナバリン （ConA)、 5 gのフィ 卜へマグルチニン （PHA)、 ま たは 50 gのリポ多糖 （LPS) のいずれかを、 それそれに加えて、 それらを、 37° 5%の炭酸ガス下において培養した。
試験 1 A： 細胞の増殖活性
細胞の増殖活性は、 48時間後の細胞数で評価した。
培養終了後、 免疫細胞の増殖は、 色素 MTT法 （Mosman， T.， J. Immunol. Me thod, 65 (1983), pp55-63) により測定し、 フオルマゾンの生成は、 570 nm の吸光度をマイクロプレートリーダー （Bio- Rad model 450) で測定することによ り求めた。
なお、 効果の有意差の判定は、 Studentの t検定を用いた。
結果は、 図 1に示されるとおりであった。
試験 1B： 免疫グロブリン産生
免疫グロプリンの産生は、 72〜120時間の培養で測定した。
免疫グロブリン Aの量は、 サンドイッチ EL I SA法 （Williams, D.J.L. et al.， Vet. Immunol. Immunopath. , 24 (1990), pp267-283) により測定した。 す なわち、 ブ夕の抗マウス免疫グロプリン Aをコートしたプレートに細胞培養液を 添加し、 洗浄後、 西洋ヮサビパーォキシダ一ゼを標識した羊の抗マウス免疫グロ ブリン八抗 を反応させることにより求めた。
結果は、 図 2に示されるとおりであった。 例 2
ぺプチドの調製：
例 1と同様にして下記のような合成ペプチドを得た。 ここでペプチド（ 11 )が本 発明に関するものである。
ペプチド（ 9) GluH-Ser-Leu-Ser-Ser-Ser-Glu-Glun (配列番号 1 3 ) ぺプチド（10) SerP-SerP
ベプチド（11) SerP"-SerP-SerP'5
なお、 ぺプチド（9 )~(11)は株式会社ベックス社製にそれそれ合成を委託して 入手した。 これらは、 それそれ純度 80%で、 ペプチド量は 1 Omgであった。 また、 これら合成ペプチド（ 9)〜（11)の他に、 アミノ酸またはペプチドを無添 加とするコントロール （ペプチド（ 1 )) と、 1〜28域からなるカゼインホスホ ペプチド （ペプチド（8)) とを用意した。 評価試験 2 ：
以上で得られたペプチド（ 9)〜（11)、 およびペプチド（ 1 )および（8)を、 下記 のような評価試験に付して、 各ぺプチドの免疫増強能を評価した。
試験で使用したマウス脾臓細胞は、 上記例 1と同様にして、 用意し培養を行つ た。
試験 2A : 細胞の増殖活性
マウスにおける脾臓細胞の増殖促進活性について、 上記例 1と同様にして評価 した。
細胞の増殖数は、 上記例 1と同様に、 570 nmの吸光度による MTT値によ り求めた。
結果は、 図 3に示されるとおりであった。 試験 2B： 免疫グロプリン産生
免疫グロブリンの産生は 72〜120時間の培養で測定した。
免疫グロブリンの量は、 サンドイッチ ELI SA法 （Williams, D.J.L. et a l.,Vet. Immunol. Cell Biol., 74 (1990). pp323-329) により測定した。 すなわ ち、 ャギの抗マウス免疫グロプリン （I gG+I gM+I gAまたは IgA) を コートしたプレートに細胞培養液を添加し、 洗浄後、 西洋ヮサビパーォキシダー ゼを標識したャギの抗マウス免疫グロブリン抗体 （I gG+ I gM+I gA) ま たは同様の羊の抗マウス免疫グロプリン抗体 Aを反応させることにより求めた。 結果は、 図 4および図 5に示されるとおりであった。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 下記のアミノ酸配列 （I) からなるペプチドを含んでなる、 免疫増強 剤：
Q 1 -SerP-X-SerP-Q 2. (I)
[式中、
SerPはホスホセリン残基を表し、
Xは 1〜3個の任意のアミノ酸残基を表し、 かつ
Q1および Q2は、 いずれか一方もしくは両方が存在しないか、 または、 それそれ独立して 1個以上の任意のアミノ酸残基を表す] 。
2. Xが 1個の任意のアミノ酸残基からなる、 請求項 1に記載の免疫増強剤 c
3. Xが SerPまたは Leuである、 請求項 2に記載の免疫増強剤。
4. Q 1で表されるアミノ酸残基の数が 0〜128個であり、 かつ、 Q2で 表されるアミノ酸残基の数が 0〜 192個である、 請求項 1〜3のいずれか一項 に記載の免疫増強剤。
5. Q1で表されるアミノ酸残基の数が 0〜14個であり、 かつ、 Q2で表 されるアミノ酸残基の数が 0〜 8個である、 請求項 1〜3のいずれか一項に記載 の免疫増強剤。
6. Q 1および Q 2で表されるアミノ酸残基がともに存在しない、 請求項 1 〜 5のいずれか一項に記載の免疫増強剤。
7. 前記アミノ酸配列 （I) が、
Glu-SerP-X-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (配列番号 1 )、
Glu-SerP-X-SerP-SerP (配列番号 2 )、 SerP-X-SerP-Glu-Glu (配列番号 3 )、
SerP-X- SerP、 および
Glu-SerP-X-SerP-Glu (配列番号 4 ) 、
からなる群より選択される、 請求項 5に記載の免疫増強剤。
8 . 前記アミノ酸配列 （I ) が、
Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (配列番号 5 )、
Glu-SerP-Leu-SerP-SerP (配列番号 6 )、
SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (配列番号 7 )、
SerP- Leu- SerP、
SerP-SerP- SerP、 および
Glu-SerP-Le -SerP-Glu (配列番号 8 ) 、
からなる群より選択される、 請求項 7に記載の免疫増強剤。
9 . 前記アミノ酸配列 （ I ) が、
Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-X-SerP- SerP-SerP-Glu-Glu-Ser-Ile-Thr-Arg (配列番号 9 )
である、 請求項 5に記載の免疫増強剤。
1 0 . 前記アミノ酸配列 （ I ) が、
Arg-Glu-Leu-Glu-Glu-Leu-Asn-Val-Pro-Gly-Glu-Ile-Val-Glu-SerP-Leu-SerP- SerP-SerP-Glu-Glu-Ser- 1 le-Thr- Y - 1 le-Asn-Lys (配列番号 1 1 )
(式中、 Yは 1個の任意のアミノ酸残基である）
である、 請求項 1に記載の免疫増強剤。
1 1 . 請求項 1〜1 0のいずれか一項に記載のアミノ酸配列 （I ) を、 少な くとも 2回反復した反復配列として含んでなるぺプチドを含んでなる、 免疫増強 剤。
12. 医薬として用いられる、 請求項 1~11のいずれか一項に記載の免疫 増強剤。
13. 薬学上許容可能な製剤用添加剤をさらに含んでなる、 請求項 12に記 載の免疫増強剤。
14. 食品として用いられる、 請求項 1〜11のいずれか一項に記載の免疫 増強剤。
15. 飼料として用いられる、 請求項 1〜1 1のいずれか一項に記載の免疫 増強剤。
16. 下記のアミノ酸配列 （l a) からなる、 ペプチド ：
Q 1 -SerP-X-SerP-Q 2 (l a)
[式中、
SerPはホスホセリン残基を表し、
Xは 1 ~ 3個の任意のアミノ酸残基を表し、
Q 1は 0〜 14個の任意のアミノ酸残基を表し、
Q 2は 0~ 8個の任意のアミノ酸残基を表し、
(ただし、 Q 1のアミノ酸残基の数が 14であって、 かつ Q 2のアミノ酸残 基の数が 8である場合を除く） ] 。
17. Xが 1個の任意のアミノ酸残基からなる、 請求項 16に記載のぺプチ
18. Xが SerPまたは Leuである、 請求項 17に記載のペプチド。
19. Q 1および Q 2で表されるアミノ酸残基がともに存在しない、 請求項 16〜 18のいずれか一項に記載のぺプチド。
2 0 . 前記アミノ酸配列 （I a ) が、
Glu-SerP-X-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (配列番号 1 ) 、
Glu-SerP-X-SerP-SerP (配列番号 2 ) 、
SerP-X-SerP-Glu-Glu (配列番号 3 ) 、
SerP-X-SerPN および
Glu-SerP-X-SerP-Glu (配列番号 4 ) 、
からなる群より選択される、 請求項 1 6〜1 8のいずれか一項に記載のペプチド
2 1 . 前記アミノ酸配列 （I a ) が、
Glu-SerP-Leu-SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (配列番号 5 ) 、
Glu-SerP-Leu-SerP-SerP (配列番号 6 ) 、
SerP-SerP-SerP-Glu-Glu (配列番号 7 ) 、
SerP-Leu-SerPs
SerP-SerP-SerPs および
Glu-SerP-Leu-SerP-Glu (配列番号 8 ) 、
からなる群より選択される、 請求項 2 0に記載のペプチド。
2 2 . 請求項 1 6〜2 1のいずれか一項に記載のアミノ酸配列 （l a ) を、 少なくとも 2回反復した反復配列として含んでなる、 ぺプチド。
2 3 . 免疫増強活性を有するものである、 請求項 1 6〜2 2のいずれか一項 に記載のぺプチド。
2 4 . 請求項 1 6〜 2 3のいずれか一項に記載のぺプチドの製造方法であつ て、
カゼィンを用意し、
該カゼインをトリブシン処理した後、 カルシウム塩とエタノールによる沈殿処 理によって、 ホスホペプチドを得、 次いで 得られたホスホペプチドに、 アミノぺプチ夕ーゼ、 カルボキシぺプチ夕一ゼ、 およびそれらの組合せからなる群より選択された酵素を作用させて、 前記べプチ ドを得る
ことを含んでなる、 方法。
2 5 . 免疫力の低下したまたは免疫力の弱い患者に、 請求項 1 6〜2 3のい ずれか一項に記載のぺプチドを投与することを含んでなる、 前記患者の免疫力を 増強させる方法。
2 6 . 免疫増強剤を製造するための、 請求項 1 6〜2 3のいずれか一項に記 載のぺプチドの使用。
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