WO2002064811A2 - Procede pour produire des proteines recombinantes, marquees par au moins un isotope - Google Patents

Procede pour produire des proteines recombinantes, marquees par au moins un isotope Download PDF

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WO2002064811A2
WO2002064811A2 PCT/FR2002/000498 FR0200498W WO02064811A2 WO 2002064811 A2 WO2002064811 A2 WO 2002064811A2 FR 0200498 W FR0200498 W FR 0200498W WO 02064811 A2 WO02064811 A2 WO 02064811A2
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microorganisms
culture
recombinant
chosen
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PCT/FR2002/000498
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WO2002064811A3 (fr
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Dominique Desplancq
Bruno Kieffer
Karsten Schmidt
Etienne Weiss
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Universite Louis Pasteur
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/15—Non-radioactive isotope labels, e.g. for detection by mass spectrometry

Definitions

  • the invention relates to a method for producing recombinant proteins, labeled with at least one isotope, from recombinant cells or from recombinant microorganisms.
  • NMR nuclear magnetic resonance spectroscopy
  • strains of bacteria are generally used to express the protein of interest. These strains are then cultivated in media containing the 13 C-labeled carbon source and / or the 15 N-labeled nitrogen source (Le Master, 1994). The most commonly used bacterial strain is Escherichia Coli (E. coli) bacteria (Muchmore et al., 1989).
  • the methylotrophic yeast Pichia pastoris has also recently been used to produce large quantities of 13 C / 15 N labeled recombinant proteins (Laroche et al., 1994 - Wood and Komives, 1999).
  • hydrolysates of cyanobacteria cells cultivated in a medium containing labeled precursors are also used to enrich culture media intended either for E. coli (Brandner et al., 1999), or for Leuconostoc gelidum and Lactococcus Lactis (Sailer et al., 1993).
  • cyanobacteria which can be uniformly labeled when cultivated on media containing labeled salts, could, like E. coli, constitute a host of choice for the production of proteins labeled for NMR.
  • WO 97/07216 describes a process for producing deuterated compounds, such as proteins, using cultures containing in particular deuterium.
  • This process consists in cultivating an organism capable of producing these compounds in a deuterated medium, said organism having been modified by genetic engineering techniques, so that it produces approximately the same quantity of deuterated compounds as the unmodified organisms, put in culture on conventional media without isotopes.
  • a process does not allow the production of biochemical substances, in particular proteins, labeled with several different isotopes, in significant percentages close to 100%.
  • This method consists in culturing the cell or the recombinant organism in a culture medium which comprises a photosynthetic or autotrophic substrate marked with a stable isotope, chosen from the compounds containing 15 N 2 , 13 C0 2 and 2 H 2 0 , to recover the cells or microorganisms from the culture medium, then to isolate the protein before determining its structure by NMR. Also, there is the need to have a process, less expensive than those existing hitherto, for producing recombinant proteins of different natures, soluble or insoluble, labeled uniformly and completely, with at least one isotope stable or not.
  • the subject of the invention is therefore a method for producing recombinant proteins, soluble or insoluble, uniformly and completely labeled with at least one isotope from recombinant cells or from recombinant microorganisms.
  • This method consists in culturing said recombinant cells or said recombinant microorganisms which may be autotrophic and / or phototrophic on a culture medium which comprises at least one isotope, in isolating said cells or said cultured microorganisms, then in purifying the recombinant proteins from said cells, said microorganism or the culture medium.
  • This process is characterized in that said cells or said microorganisms are cultured in aerobic medium, in anaerobic medium or in fermentation, the culture in aerobic medium and being carried out in the presence of atmospheric C0 2 , the culture in anaerobic medium and in fermentation being carried out in the total absence of atmospheric C0 2 for enrichment in isotope 13 C, and in the presence of a gas, the anaerobic and fermentation cultures being carried out by regulating the pH, the intensity of a source of visible light and the duration of continuous exposure of cells or microorganisms to this light source.
  • the method according to the invention has the advantage of achieving a labeling yield greater than or equal to 90% in isotopes, such as 13 C, 15 N or 2 H, of the recombinant proteins, thus facilitating the analysis of the three-dimensional structure of the proteins, notably through NMR spectroscopy.
  • the method of the invention has a financial cost approximately ten times lower than that of known methods, which in particular use the E. coli strain, while providing similar qualitative results.
  • the transposition, in the method of the invention, of the constitutive expression system making it possible to obtain the accumulation of protein during growth also has the advantage of simplifying the steps of the method.
  • the pH can be regulated between 7 and 10
  • the duration of exposure to light can vary from 6 hours to 24 hours per day during the culture time.
  • the value of the intensity of the light source may be less than the inhibition value of the cells / microorganisms, this inhibition value varying depending on the nature of the cells / microorganisms and the nature of the light source.
  • the value of the intensity of this light source can vary from 33 micromoles photons / m 2 / s (2000 lux) to 140 micromoles photons / m 2 / s (5000 lux).
  • the gas is chosen from oxygen, hydrogen, nitrogen, rare gases such as argon.
  • the isotope may be selected from compounds comprising 13 C, 15 N, 18 0 2 H and mixtures thereof. These compounds can be NaH 13 C0 3 , Na 15 N0 3 , D 2 0, 13 C0 2 , labeled ammonia, sodium or potassium or ammonium salts labeled with 13 C, or 15 N and their mixtures.
  • the microorganism is chosen from recombinant photosynthetic microorganisms modified by the addition of a replicative plasmid or by the modification of their genome.
  • the photosynthetic organisms can be chosen from blue, green or red prokaryotic algae.
  • the alga can be chosen from cyanobacteria. Cyanobacteria are living beings of the photoautotrophic type.
  • the cyanobacterial can in particular be the strain Anabaena sp. CCP 7120.
  • the recombinant protein can be chosen from the 23 kDa N-terminal domain of E. gyrase B. coli (hereinafter referred to as GyrB (1,219)), the maltose binding protein of E. coli.
  • the use of non-protonated compounds to provide the microorganism / cell with the carbon source is an advantage during the production of fully lost-recombinant recombinant protein.
  • the Anabaena sp. PCC 7120 can successfully grow in heavy water (D 2 0), and easily produce recombinant proteins according to the method of the invention.
  • the plasmid vector can be the expression vector of the Anabaena sp. PCC 7120, and preferably the AnaJbaena vector pRL25C23K.
  • the method of the invention was tested using GyrB (1-219).
  • the cell or microorganism can be the A ⁇ aJbaena sp. PCC 7120 comprising in particular the plasmid vector pRL25C23K.
  • FIGS. 1A and 1B respectively give a schematic representation of the expression vector, E. coli pBL23K and, the Anabaena expression vector pRL25C23K used in the method of the invention;
  • Figures 2A and 2B represent the result of a comparative analysis on gel electrophoresis of the expression of the recombinant protein GyrB (1-219) according to the method of one invention, obtained in E. coli cells (figure 2A), and in AnaJbaena cells (Figure 2B);
  • FIGS. 3A and 3B represent the result of a comparative analysis on electrophoresis gel of the solubility of the recombinant protein GyrB (1-219) obtained in the process of one invention in E. coli cells ( Figure 3A) , and in AnaJbaena cells ( Figure 3B);
  • - Figures 4A and 4B represent the Optical Density curves (700nm , as a function of time, during a comparative study, for AnaJbaena cells being grown in a labeled medium and in an unmarked medium, both in aerobic condition (Figure 4A), and anaerobic condition (Figure 4B);
  • - Figure 5 shows the NMR spectrum HeteroNuclear Single Quantum Correlation (HSQC) 1S N of the protein GyrB (1-219) labeled with 13 C / 15 N obtained under aerobic conditions;
  • - Figure 6 shows the methyl region of the HSQC NMR spectrum of the GyrB protein (1-219) labeled with 13 C obtained under anaerobic conditions;
  • HSQC HeteroNuclear Single Quantum Correlation
  • FIGS. 7A and 7B show the HNCA NMR spectrum of the same region consisting of 14 amino acids for the protein GyrB (1-219) labeled in E. coli ( Figure 7A) and in Anabaena sp. PCC 7120 ( Figure 7B).
  • Figure 7A the N-terminal domain of the Gyr B protein of E. coli can be overexpressed both in the strain Anabaena sp.PCC 7120 and in the strain E. coli XLl-Blue, and that the NMR spectra are comparable.
  • the Anajbaena sp. PCC 7120 is used for all expression experiments in the cyanobacterial expression system.
  • the E. coli XLl-Blue strain (Stratagene, LaJolla, USA) is used as a host for cloning and expression in E. cells. coli.
  • the E. coli J53 strain containing the conjugate plasmid RP4 and the E. coli HB101 strain containing the plasmid pRL623 are used for conjugation in Anabaena cells.
  • These different strains as well as the E. coli / Anabaena shuttle vector pRL25C were demonstrated by Dr. P. Wolk (Wolk et al., 1988)
  • the expression vector pBL23K is obtained from the vector pF90-Y5 (Brino et al, 1998).
  • the vector pF90-Y5 contains the gene coding for the 43 kDa N-terminal domain of E. gyrase B. coli.
  • the sequence of the 24 kDa N-terminal domain is obtained by polymerase chain reaction (PCR) using the two primers
  • the amplified fragment is reinserted into the parent plasmid pF90-Y5, previously digested with two restriction enzymes EcoRI and HindIII (New England Biolabs, Beverly, MA, USA), so as to extract the region coding for the N-terminal domain 43kDa.
  • the plasmid pBL23K represented in FIG. 1A is then obtained.
  • the plasmid pRL25C (Wolk et al., 1988) is linearized with the restriction enzymes Notl and BamHI, then incubated with the enzyme Klenow (sold by New England
  • the plasmid pBL23K is digested with the restriction enzyme Hind III, then treated with the enzyme Klenow.
  • the vector linearized with Hind III is then digested with the restriction enzyme Sspl.
  • the Sspl / Hind III fragment coding for the tac promoter, and the GyrB coding region (1-219) is ligated with the large NotI-BamHI restriction fragment of the plasmid pRL25C to give the expression vector pRL25C23K represented in FIG. 1B.
  • the vector plasmid pRL25C23K is transferred into E. coli HB101 containing the plasmid pRL623 which provides the function of the trans-action mob gene (Elhai and Wolk, 1988) necessary for conjugation.
  • the plasmid pRL623 also codes for 3 methylases which protect the plasmid DNA from restriction by cyanobacterial enzymes.
  • the plasmid pRL25C23K is then transferred by conjugation from the E. coli HB101 strain pRL623 to the Anabaena sp. PCC 7120, as described by Elhai and Wolk (1988), except that the conjugation is carried out directly on the agar without the use of any filter.
  • neomycin is added under agar to a final concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • the incubation is continued until the transformants are visible to the naked eye.
  • the cultures are incubated at 30 ° C. with shaking at 150 revolutions / minute under a light intensity of 33 micromoles photons / m 2 / s (2000 lux) in a SANYO illuminated orbital incubator (Fisher Scientific SA, Elancourt, France).
  • OD 700 optical density at 700 nm
  • the labeling experiment optimized with 13 C is carried out, as explained above, with only NaH 13 C0 3 as labeled substrate, and the culture is grown in a flask under constant flow of nitrogen gas, U quality (Air Liquid, France , France) .
  • the pH of the culture is adjusted to 7.5 every twelve hours.
  • Fermentation is carried out in a two liter fermenter, equipped with temperature sensors, C0 2 , 0 2 and a pH probe.
  • the fermenter is illuminated with a visible light source having an intensity of 140 micromoles photons / m 2 / s (5000 lux).
  • the culture is carried out under a constant flow of argon.
  • the pH is maintained at 8 and the temperature at 28 ° C.
  • GyrB 1-219
  • SDS-PAGE sodium dodecylsulfate
  • the cells are passed through the French press to complete the cell grinding.
  • the resulting lysate is centrifuged for twenty minutes at 12,000 rpm to extract the cell debris, then filtered through a 0.22 ⁇ m filter (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), then the filtrate is loaded on a Sepharose column coupled to novobiocin (Staudenbauer and Orr, 1981) previously balanced in buffer A.
  • the column is then washed with buffer A containing 0.5 mol / 1 KC1, then with buffer A containing 1 mol / 1 KC1.
  • the bound protein is eluted with buffer A containing 5 mol / l of urea.
  • the 5 mol / l urea fractions containing denatured GyrB (1-219) are collected and mixed, then diluted to
  • the initially denatured protein is refolded by dialysis, initially against buffer A, and then against buffer A containing 25 mM KC1.
  • GyrB (1-219) is eluted with a linear gradient of
  • the protein is concentrated by ultrafiltration on MacroseplOK (Pall Filtron Corp, NorthBorough, MA, USA) then on Centricon-10 (Sartorius, Palaiseau, France).
  • these cell extracts are ground in a French press and then centrifuged for 10 minutes at 10,000 rpm.
  • the soluble fraction corresponds to the supernatant and the insoluble fraction to the pellet.
  • the plasmid pBL23K is obtained by replacing the gene coding for the N-terminal fragment 43kDa of GyrB in the plasmid pF90Y5 by the DNA sequence coding gyrase B (l-219), as indicated above .
  • the expression of the GyrB domain (1-219) is under the control of the tac promoter.
  • lac I q lac I q
  • tac promoter The lac repressor gene (lac I q ), which produces the repressor, and the tac promoter are also shown.
  • the rrnBTlT2 transcription terminator is placed downstream of the GyrB gene (1,219).
  • ColEl The origin of replication of ColEl (ColEl) allows the plasmid to be maintained in E. coli.
  • Amp R corresponds to the resistance gene of ampicillin.
  • the expression cassette for GyrB (1-219) is transferred from the plasmid pBL23K to pRL25C, as indicated above.
  • GyrB (1-219) is also under the control of the tac promoter.
  • the plasmid pRL25C23K is a shuttle vector in E. coli / Anabaena, and contains the origin of the replication of ColEl (ColEl ori), the origin ColEl of conjugation for the transfer of the plasmid from E. coli to Anabaena (bom), the origin of replication pDU1 for replication in Anajbaena cells (Wolk et al, 1984), and the neomycin resistance gene, Néo R.
  • the protocol for obtaining the comparative results of FIGS. 2A and 2B is as follows.
  • XL1-Blue cells carrying the pBL23K plasmid are induced with IPTG ImM.
  • the total cell extracts are analyzed on SDS-PAGE electrophoresis gel.
  • the total cellular extracts of the Anabaena cells carrying the plasmid pRL25C23K constitutively expressing the gyrase GyrB (1-219) also migrated in parallel on the gel.
  • the proteins are either stained with Coomassie blue dye ( Figure 2A), or transferred to a nylon membrane ( Figure 2B) and detected with the monoclonal antibody 2F12, as indicated above.
  • Tracks 1, 2, 3, 4 of electrophoresis in FIGS. 2A and 2B correspond to the following deposits:
  • Lane 1 20 ⁇ l of total extract of cells from an XLl-Blue culture not induced, carrying pBL23K;
  • Lane 2 20 ⁇ l of total extract of cells from an XL1-Blue culture carrying pBL23K, induced for two hours;
  • Lane 3 20 ⁇ l of total cell extract from a culture of Anabaena wild type cells
  • Lane 4 20 ⁇ l of total extract of cells from an Anabaena culture carrying the plasmid pRL25C23K;
  • - M is the low molecular weight marker (Amersham Pharmacia).
  • the arrow in FIGS. 2A and 2B indicates the band corresponding to the GyrB gyrase (l-219).
  • FIGS. 3A and 3B the soluble and insoluble fractions derived from XLl-Blue induced E. coli cells carrying the virus are analyzed, by means of SDS-PAGE and electrophoresis gel and immunoblotting techniques, as described above.
  • plasmid pBL23K and those from Anabaena cells carrying the plasmid pRL25C23K.
  • Lanes 1 and 2 of SDS PAGE gel of FIGS. 3A and 3B correspond to the following deposits: - Track 1: 20 ⁇ l of soluble fraction;
  • the Anabaena cells expressing GyrB (1-219) are cultured either on an unlabelled BG-11 medium, or on a BG-11 medium containing NaH 13 C0 3 and Na 15 N0 3 .
  • the growth is analyzed by following the OD 700nm each day.
  • curve 1 represents the growth in an unlabelled BG-11 medium
  • curve 2 that in a BG-11 medium containing NaH 13 C0 3 and Na 15 N0 3 .
  • This graph also includes the tracks obtained on SDS-PAGE electrophoresis gel, stained with Coomassie blue dye and, which shows the expression of GyrB (1-219) in Anabaena cells cultivated in a BG-11 medium labeled with 13 C / 1S N or not.
  • Lanes 1, 2 and 3 of acrylamide gel electrophoresis in this FIG. 4A correspond to the following deposits:
  • Lane 2 Total extract of cells from a culture carried out in an unlabelled BG-11 medium
  • - P te 3 Total extract of cells from a culture carried out in a BG-11 medium supplemented with NaH 13 C0 3 and Na 15 N0 3 .
  • the arrow indicates the band corresponding to GyrB (l-219).
  • Curve 3 represents the evolution of OD 700 as a function of time for cell growth in unlabeled BG-11 medium and, with pH regulation.
  • Curve 4 represents the OD 700 as a function of time for cell growth in a BG-11 medium containing NaH 13 C0 3 and, with pH regulation.
  • Curve 5 represents the OD 700 as a function of time for cell growth in unlabeled BG-11 medium and without any regulation of the pH.
  • This FIG. 4B also shows (see SPS PAGE) the expression levels of GyrB (1-219) obtained when the cells are cultured under atmospheric conditions or under nitrogen gas. Lanes 1, 2 and 3 of polyacrylamide gel electrophoresis in this FIG. 4B correspond to the following elements:
  • This vector contains both the tac promoter and the lac repressor (lacl q ) which represses this promoter during growth.
  • GyrB (1-219) is induced by the addition of
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • the expression of the GyrB fragment (1-219) is carried out using the shuttle expression vector of E. coli / Anabaena, namely
  • the expression produced in each strain is analyzed by SDS-PAGE electrophoresis and by immunoblotting.
  • FIG. 2B Analysis of these extracts by immunoblotting (FIG. 2B) shows that this protein is recognized by the monoclonal antibody 2F12 directed against the gyrase B subunit of E. coli. This therefore confirms the expression of GyrB (l-219), both in the cells of E. coli and those of Anajbaena.
  • Lanes 1 and 2 in FIGS. 3A and 3B show that the protein is present exclusively in the soluble fraction, both in the cells of E. coli and those of AnaJbaena.
  • GyrB (1-219) is correctly folded in the cytoplasm of E. coli cells and in that of Anabaena sp.PCC 7120 cells.
  • GyrB (l-219) The yields of GyrB (l-219), overexpressed under these conditions, are approximately 10 mg / l with E. coli when growing in Martek 9-U medium, and 15 mg / 1 with Anabaena sp.PCC 7120 during growth in BG-11 medium. These data show that Anajbaena sp.PCC 7120 is capable, like E. coli, of expressing, in high yields, GyrB (1-219) soluble in its cytoplasm.
  • a culture of 1.5 liters is then carried out to prepare sufficient quantities of labeled protein for the NMR analysis.
  • 9 mg of pure 13 C / 15 N labeled GyrB (1-219) are purified, then analyzed by NMR spectroscopy.
  • Figure 5 shows the HSQC 1S N- 1 H spectrum of this sample. This spectrum, which can be considered as a fingerprint of the structure of the protein, is similar to that obtained from the E. coli sample (data not shown).
  • RubisCo Carboxylase / Oxygenase
  • Anabaena is able to discriminate between 12 C0 2 and 13 C0 2
  • the growth curves in FIG. 4B show a more reduced growth in the presence of aeration by nitrogen, compared to a growth in atmospheric condition, probably because the light transfers are less effective in a large bottle.
  • the level of isotopic incorporation is evaluated under these anaerobic conditions by producing 7 mg of GyrB (l-219), from 2.5 liters of Anabaena culture.
  • the protein is then analyzed by NMR spectroscopy and by mass spectrometry.
  • Figure 6 shows the methyl region of the HSQC NMR spectrum
  • the peaks which are marked with a star are attributed to the four methyl groups of the methionine residues present in the sequence of the GyrB protein (1-219).
  • the Anabaena cells expressing the recombinant protein are grown in a two liter fermenter.
  • Argon is used in place of nitrogen, since the Anajbaena cells are also capable of fixing nitrogen gas when organic nitrogen becomes limiting in the culture medium.
  • SDS-PAGE analysis of the total cell extracts sampled during fermentation shows that GyrB (1-219) is expressed continuously throughout the growth (data not shown). Under these conditions, it is found that the yield of GyrB (1-219) in the fermenter is equivalent to that obtained in Erlenmeyer flasks with stirring under atmospheric conditions.
  • GyrB (1-219) labeled with 13 C / 15 N are purified, then analyzed by NMR.
  • the HNCA NMR spectrum of this sample is compared with that of GyrB (1-219) labeled with 13 C / 1 N in E. coli.
  • the protein is produced with a high yield in soluble form and folded in the cytoplasm of the Anabaena cells, thus showing that the heterologous expression capacities of this strain are comparable to those of E. coli.
  • a constitutive expression system which allows the protein to accumulate during growth.
  • purification protocols can easily be transferred from extracts of E. cells. coli to those of AnaJbaena, although the protein composition of Anajbaena cells is very different from that of E. coli, since Anabaena cells include all of the pigmented proteins involved in photosystems I and II.
  • the labeling of the recombinant protein is carried out by culturing the Anabaena cells expressing cellular GyrB (1-219) in a medium containing the labeled substrates.
  • isotopic enrichment greater than 90% can be easily obtained for the 15 N isotope
  • isotope 13 C enrichment requires the growth of cyanobacteria under controlled atmospheric conditions. Indeed, the presence of atmospheric C0 2 dissolved in the culture medium significantly reduces the percentage of isotopic enrichment.
  • the ventilation of the culture medium with nitrogen gas or with argon makes it possible to achieve an enrichment of up to 94% in 13 C.
  • the method of the invention has a significantly lower financial cost than those known hitherto. This reduction is due to the possibility conferred on cyanobacteria to be able both to grow naturally on an environment poor in nutrients and to be able to use light as a source of energy.
  • One drawback to this Anabaena expression system is the reproduction time which is around 24 hours, while. coli divides in about 30 minutes, and therefore increases the time for carrying out the process of the invention.
  • the maltose binding protein of E. coli was also produced in a soluble form in the cytoplasm of AnaJbaena, at levels comparable to those obtained in E. coli.
  • the Anabaena sp.PCC 7120 strain can be successfully adapted to grow in a medium enriched in D 2 0, which can comprise up to 97% of D 2 0. According to the process of the invention, it is also possible to produce recombinant proteins by overexpressing E. coli lacrease in the Anabaena sp.PCC cell
  • IPTG in variable quantity makes it possible to vary the quantity of protein accumulated in the biomass, due to the variation in expression.

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Abstract

L'invention se rapporte à un procédé pour produire des protéines recombinantes, marquées de façon uniforme et complète par au moins un isotope, à partir de cellules ou de microorganismes recombinants autotrophes et/ou phototrophes. Ce procédé consiste à mettre en culture les cellules ou microorganismes dans un milieu comprenant au moins un isotope stable, à isoler ces microorganismes/cellules, puis à purifier les protéines recombinantes à partir des microorganismes, de cellules ou du milieu de culture. Les cellules/microorganismes sont mis en culture en aérobie, en anaérobie ou en fermentation; la culture en aérobie s'effectuant en présence de CO2 atmosphérique, celle en anaérobie et en fermentation sans CO2 atmosphérique. Les cultures en anaérobie et en fermentation s'effectuent en régulant le pH, l'intensité d'une source de lumière et la durée d'exploitation en continu à cette source.

Description

PROCEDE POUR PRODUIRE DES PROTEINES RECOMBINANTES, MARQUEES PAR AU MOINS UN ISOTOPE.
L ' invention se rapporte à un procédé pour produire des protéines recombinantes, marquées avec au moins un isotope à partir de cellules recombinantes ou de microorganismes recombinants.
Des améliorations récentes dans le domaine de la spectroscopie par Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) ont ouvert de nouveaux champs d'application dans l'analyse fonctionnelle et structurale de nouvelles protéines découvertes dans les différents projets de séquençage de génome.
Les développements les plus récents en spectroscopie RMN biologique comprennent l'amélioration de la sensibilité par le procédé de détection TROSY (Pervushin et al., 1997), l'utilisation de nouvelles contraintes telles que celles obtenues par couplage dipolaire résiduel (Tjandra and Bax, 1997) et, enfin la mesure des constantes de couplage de liaisons hydrogène
(Cordier et al, 1999) . Mais tous ces procédés nécessitent la disponibilité d'un matériel biologique enrichi par des isotopes stables (tels que 2H, 15N, 13C) .
Pour marquer les protéines avec des isotopes 13C, 15N, D, on utilise généralement des souches de bactéries modifiées génétiquement pour exprimer la protéine d'intérêt. Ces souches sont ensuite cultivées dans des milieux contenant la source de carbone marquée au 13C et/ou la source d'azote marquée au 15N (Le Master, 1994) . La souche bactérienne la plus couramment utilisée est la bactérie Escherichia Coli (E. coli) (Muchmore et al., 1989).
La levure méthylotrophe Pichia pastoris a également été récemment utilisée pour produire en grande quantité des protéines recombinantes marquées au 13C/15N (Laroche et al., 1994 - Wood and Komives, 1999).
Bien que l'expression hétérologue reste une approche attrayante pour produire des protéines marquées, plusieurs biomolécules ont déjà été marquées dans leurs hôtes naturels.
Des organismes, aussi variés que Tolypocladium inflation (Senn et al. 1991), Trichoderma viride (Yee et al., 1996), Streptomyces nashvillensis (Ikeda et al., 1992) et des cyanobactéries, telles que la souche Synechocystis sp. PCC 6308 (Suarez et al., 1999), la souche Synechocystis sp. PCC 6803 (Lelong et al., 1995) et Spirulina maxima (Tropis et al., 1996) ont été cultivées dans des milieux auxquels on a ajouté des précurseurs marqués, et ont été capables de produire des protéines, des peptides ou de plus petites molécules, marquées, endogènes.
En outre, les hydrolysats de cellules de cyanobactéries cultivées dans un milieu contenant des précurseurs marqués, sont également utilisés pour enrichir des milieux de culture destinés soit à E. coli (Brandner et al., 1999), soit aux Leuconostoc gelidum et aux Lactococcus Lactis (Sailer et al., 1993).
Ces résultats montrent que les cyanobactéries, qui peuvent être uniformément marquées lorsque cultivées sur des milieux contenant des sels marqués, pourraient comme E. coli constituer un hôte de choix pour la production de protéines marquées pour la RMN. La disponibilité des outils génétiques, tels que les plasmides, les protocoles de sélection et les procédures de transformation, permet la modification génétique de plusieurs souches de cyanobactéries dans le but de produire des protéines recombinantes (Elhai and olk, 1988 - Porter, 1988) . Le document WO 97/07216 décrit un procédé pour produire des composés deutérés, tels que des protéines, à l'aide de cultures contenant notamment du deutérium. Ce procédé consiste à cultiver un organisme pouvant produire ces composés dans un milieu deutéré, ledit organisme ayant été modifié par des techniques de génie génétique, de manière à ce qu'il produise approximativement la même quantité de composés deutérés que les organismes non modifiés, mis en culture sur des milieux classiques sans isotopes. Malheureusement, un tel procédé ne permet pas la production de substances biochimiques, notamment des protéines, marquées avec plusieurs isotopes différents, en des pourcentages importants proches des 100%. Il est encore connu du document W097/18321 un procédé pour produire une protéine recombinante uniformément marquée avec un isotope stable. Ce procédé consiste à mettre en culture, la cellule ou l'organisme recombinant dans un milieu de culture qui comprend un substrat photosynthétique ou autotrophe marqué par un isotope stable, choisi parmi les composés contenant 15N2, 13C02 et 2H20, à récupérer les cellules ou microorganismes du milieu de culture, puis à isoler la protéine avant de déterminer sa structure par RMN. Aussi, il existe le besoin de disposer d'un procédé, moins onéreux que ceux existants jusque-là, pour produire des protéines recombinantes de natures différentes, solubles ou insolubles, marquées de façon uniforme et complète, par au moins un isotope stable ou non, à partir de cellules ou à partir de microorganismes recombinants, pouvant être autotrophes et/ou phototrophes selon les conditions opératoires dans lesquelles ils sont mis, ledit procédé pouvant éventuellement utiliser le même système d'expression de protéines . L'invention a donc pour objet un procédé destiné à produire des protéines recombinantes, solubles ou insolubles, marquées de façon uniforme et complète avec au moins un isotope à partir de cellules recombinantes ou de microorganismes recombinants. Ce procédé consiste à mettre en culture lesdites cellules recombinantes ou lesdits microorganismes recombinants pouvant être autotrophes et/ou phototrophes sur un milieu de culture qui comprend au moins un isotope, à isoler lesdites cellules ou lesdits microorganismes cultivés, puis à purifier les protéines recombinantes à partir desdites cellules, desdits microorganisme ou du milieu de culture. Ce procédé est caractérisé en ce que lesdites cellules ou lesdits microorganismes sont mis en culture en milieu aérobie, en milieu anaérobie ou en fermentation, la culture en milieu aérobie et s 'effectuant en présence de C02 atmosphérique, la culture en milieu anaérobie et en fermentation s ' effectuant en absence totale de C02 atmosphérique pour un enrichissement en isotope 13C, et en présence d'un gaz, les cultures en anaérobie et en fermentation s 'effectuant en régulant le pH, l'intensité d'une source de lumière visible et la durée d'exposition en continu des cellules ou des microorganismes à cette source de lumière. Le procédé selon l'invention présente l'avantage de réaliser un rendement de marquage supérieur ou égal à 90 % en isotopes, tels que 13C, 15N ou 2H, des protéines recombinantes, facilitant ainsi l'analyse de la structure tridimensionnelle des protéines, par le biais notamment de la spectroscopie RMN. En outre, le procédé de l'invention présente un coût financier environ dix fois plus faible que celui des procédés connus, qui utilisent notamment la souche E. coli , tout en procurant des résultats qualitatifs semblables .
Par ailleurs, on peut appliquer très facilement dans le procédé de l'invention, le protocole de purification habituellement utilisé sur E. coli lorsque cette souche est utilisée dans la production de protéine recombinante.
Enfin, la transposition, dans le procédé de l'invention, du système d'expression constitutif permettant d'obtenir l'accumulation de protéine pendant la croissance, présente aussi l'avantage de simplifier les étapes du procédé.
En milieu anaérobie et en fermentation, le pH peut être régulé entre 7 et 10, la durée d'exposition à la lumière peut varier de 6 heures à 24 heures par jour pendant le temps de culture. La valeur de 1 ' intensité de la source de lumière peut être inférieure à la valeur d'inhibition des cellules/microorganismes, cette valeur d'inhibition variant en fonction de la nature des cellules/microorganismes et de la nature de la source de lumière. Par exemple, la valeur de l'intensité de cette source de lumière peut varier de 33 micromoles photons /m2 /s (2000 lux) à 140 micromoles photons /m2 /s (5000 lux) . De préférence, le gaz est choisi parmi l'oxygène, l'hydrogène, l'azote, les gaz rares tels que l'argon.
L'isotope peut être choisi parmi les composés comprenant 13C, 15N, 2H 180 et leurs mélanges. Ces composés peuvent être NaH13C03, Na15N03, D20, 13C02, l'ammoniaque marqué, les sels de sodium ou de potassium ou d'ammonium marqués au 13C, ou 15N et leurs mélanges. De préférence, le microorganisme est choisi parmi les microorganismes photosynthétiques recombinant modifié par l'ajout d'un plasmide replicatif ou par la modification de leur génome. Les organismes photosynthétiques peuvent être choisis parmi les algues procaryotes bleues, vertes ou rouges. L'algue peut être choisie parmi les cyanobactéries. Les cyanobactéries sont des êtres vivants du type photoautotrophes . La cyanobacterie peut notamment être la souche Anabaena sp. PCC 7120.
La protéine recombinante peut être choisie parmi le domaine 23 kDa N-terminal de la gyrase B d'E. coli (dénommée ci-après GyrB(l-219) ) , la protéine de liaison au maltose d'E. coli .
L'utilisation de composés non protonés pour fournir au microorganisme/cellule la source de carbone est un avantage lors de la production de protéine recombinante totalement perdeutérée. La souche Anabaena sp. PCC 7120 peut croître avec succès dans de l'eau lourde (D20) , et produire facilement des protéines recombinantes selon le procédé de l'invention.
Le vecteur plasmidique peut être le vecteur d'expression de la souche Anabaena sp. PCC 7120, et de préférence le vecteur d'AnaJbaena pRL25C23K.
Le procédé de l'invention a été testé en utilisant GyrB (1-219) .
La cellule ou le microorganisme peut être la souche AπaJbaena sp. PCC 7120 comprenant notamment le vecteur plasmidique pRL25C23K.
L'invention va maintenant être décrite de façon plus détaillée et de façon non limitative à l'aide des dessins annexés, et dans lesquels : les figures 1A et 1B donnent respectivement une représentation schématique du vecteur d'expression, d ' E. coli pBL23K et, du vecteur d'expression Anabaena pRL25C23K utilisé dans le procédé de l'invention ;
- les figures 2A et 2B représentent le résultat d'une analyse comparative sur gel electrophorese de l'expression de la protéine recombinante GyrB (1-219) selon le procédé de 1 ' invention, obtenue dans les cellules d ' E. coli (figure 2A) , et dans les cellules d'AnaJbaena (figure 2B) ;
- les figures 3A et 3B représentent le résultat d'une analyse comparative sur gel electrophorese de la solubilité de la protéine recombinante GyrB (1-219) obtenue dans le procédé de 1 ' invention dans les cellules d ' E. coli (figure 3A) , et dans les cellules d'AnaJbaena (figure 3B) ; - les figures 4A et 4B représentent les courbes de Densité Optique(700nm, en fonction des temps, lors d'une étude comparative, pour des cellules AnaJbaena en cours de croissance dans un milieu marqué et dans un milieu non marqué, à la fois en condition aérobie (figure 4A) , et en condition anaérobie (figure 4B) ;
- la figure 5 représente le spectre RMN HeteroNuclear Single Quantum Corrélation (HSQC) 1SN de la protéine GyrB (1-219) marquée au 13C/15N obtenue en condition aérobie ; - la figure 6 représente la région méthyl du spectre RMN HSQC de la protéine GyrB (1-219) marquée au 13C obtenue en condition anaérobie ;
- les figures 7A et 7B représentent le spectre RMN HNCA de la même région constituée de 14 acides aminés pour la protéine GyrB (1-219) marquée chez E. coli (figure 7A) et chez Anabaena sp. PCC 7120 (figure 7B) . Dans cette description plus détaillée de l'invention, on démontre que le domaine N-terminal de la protéine Gyr B de E. coli peut être surexprimé aussi bien dans la souche Anabaena sp.PCC 7120 que dans la souche E. coli XLl-Blue, et que les spectres RMN sont comparables .
Matériels et méthodes utilisés dans la mise en oeuyre de 1 ' invention .
1) Cellules hôtes, vecteurs et produits chimiques
La souche Anajbaena sp. PCC 7120 est utilisée pour toutes les expériences d'expression dans le système d'expression cyanobactérien. La souche E. coli XLl-Blue (Stratagene, LaJolla, USA) est utilisée comme hôte pour le clonage et l'expression dans les cellules d'E. coli . On utilise la souche d ' E. coli J53 contenant le plasmide conjugatif RP4 , et la souche E. coli HB101 contenant le plasmide pRL623 pour la conjugaison dans les cellules Anabaena. Ces différentes souches ainsi que le vecteur navette E. coli /Anabaena pRL25C ont été mis en évidence par le Dr. P.Wolk (Wolk et al., 1988)
Les composés marqués suivants : Na15N03 et NaH13C03 ont été obtenus auprès de la Société ISOTEC Inc.
(Miamisburg, OH, USA) ou du Groupe EURISO-TOP S.A.-CEA
(Saint-Aubin, France) . Les milieux marqués 13C et 15N Martek9 C-N pour le marquage de E. coli ont été obtenus auprès de la
Société Martek Corp. (Columbia, MD, USA) .
2) Construction du vecteur d ' expressi nn d_E. coli pB 23K
Le vecteur d'expression pBL23K est obtenu à partir du vecteur pF90-Y5 (Brino et al, 1998) . Le vecteur pF90-Y5 contient le gène codant pour le domaine N-terminal 43 kDa de la gyrase B d'E. coli . La séquence du domaine N-terminal 24 kDa est obtenue par réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en utilisant les deux amorces
ADN 5 ' -ATGTCGAATTCTTATGACTCC-3 ' et ADN simple brin 5 ' -CGCGAAGCTTTTATTAGCCTTCATAGTGGAAGTGGTC-3 ' , et le plasmide parent pF90-Y5 comme matrice.
Le fragment amplifié est réinséré dans le plasmide parent pF90-Y5, auparavant digéré avec deux enzymes de restriction EcoRI et HindIII (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) , de façon à extraire la région codant pour le domaine N-terminal 43kDa.
On obtient alors le plasmide pBL23K représenté sur la figure 1A.
3) Construction du vecteur d'expression de la souche Anabaena sp. PCC. 7120
Le plasmide pRL25C (Wolk et al., 1988) est linéarisé avec les enzymes de restriction Notl et BamHI, puis incubé avec l'enzyme Klenow (vendue par New England
Biolabs) pour générer des extrémités à bouts francs.
Le plasmide pBL23K est digéré avec l'enzyme de restriction Hind III, puis traité avec l'enzyme Klenow.
Le vecteur linéarisé par Hind III est ensuite digéré avec l'enzyme de restriction Sspl.
Le fragment Sspl/Hind III codant le promoteur tac, et la région codant GyrB (1-219) est ligué avec le grand fragment de restriction Notl-BamHI du plasmide pRL25C pour donner le vecteur d'expression pRL25C23K représenté sur la figure 1B.
4) Transformation de la souche Anabaena sp. PCC 7120
Le vecteur plasmide pRL25C23K est transféré dans E. coli HB101 contenant le plasmide pRL623 qui fournit la fonction du gène trans-action mob (Elhai and Wolk, 1988) nécessaire à la conjugaison.
Le plasmide pRL623 code aussi 3 méthylases qui protègent l'ADN plasmidique de la restriction par les enzymes cyanobactériennes .
Le plasmide pRL25C23K est ensuite transféré par conjugaison de la souche E. coli HB101 pRL623 vers la souche Anabaena sp. PCC 7120, comme décrit par Elhai et Wolk (1988) , excepté que la conjugaison est réalisée directement sur 1 ' agar sans l'utilisation d'aucun filtre.
Après 24 heures d'incubation à 30°C et sous une intensité de lumière de 33 micromoles photons/m2/s (2000 lux), on ajoute la néomycine sous 1 ' agar à une concentration finale de lOOμg/ml.
On poursuit l'incubation jusqu'à ce que les transformants soient visibles à l'oeil nu.
5) E ression e_t ma quage a 13d/15N rie GyrB M -219) ç]ιez__Anajbaena sp. PCC 7120
On fait pousser des cultures d'AnaJbaena sp. PCC 7120 contenant le plasmide pRL25C23K dans un milieu BG-11 (Castenholtz, 1988) contenant lg/1 de NaHC03 et 300μg/ml de néomycine.
Les cultures sont incubées à 30°C en les agitant à 150 tours/minute sous une intensité de lumière de 33 micromoles photons/m2/s (2000 lux) dans un incubateur orbital illuminé SANYO (Fisher Scientific S.A., Elancourt, France) .
La croissance cellulaire est suivie quotidiennement en mesurant la densité optique à 700 nm (DO700) . Pour le double marquage au 13C/15N, on inocule les cellules AnaJbaena à DO700 = 0,2 dans un milieu BG-11 contenant lg/1 de NaH13C03, l,5g/l de Na15N03 dans un erlenmeyer sous agitation, et on les fait pousser jusqu'à ce que la densité optique à 700 nm atteigne la valeur numérique 2.
L'expérience de marquage optimisée au 13C est réalisée, comme expliqué précédemment, avec seulement NaH13C03 comme substrat marqué, et on fait pousser la culture dans un flacon sous flux constant d'azote gazeux, qualité U (Air Liquid, Strasbourg, France) . On ajuste le pH de la culture à 7,5 toutes les douze heures .
Dans ce cas, on récolte les cellules à une DO700=0,5.
6) Fermentation de Anabaena sp. PCC 7120 exprimant la protéine GyrB (1-219)
On réalise la fermentation dans un fermenteur de deux litres, équipé de capteurs de température, de C02, de 02 et d'une sonde pH. Le fermenteur est illuminé avec une source de lumière visible ayant une intensité de 140 micromoles photons/m2/s (5000 lux) . La culture est réalisée sous un flux constant d'argon.
On maintient le pH à 8 et la température à 28°C. Pendant la fermentation, on agite la culture à 100 tours/minute. La fermentation est réalisée sur deux litres de cultures. Deux litres de BG 11 contenant lg/1 NaH13C03 et lg/1 de Na15N03 sont inoculés à une DO700= 0,2 avec la souche Anabaena contenant le plasmide pRL 25C23K. On contrôle les concentrations en nitrate et en carbonate dans le milieu de culture pendant toute la fermentation.
On ajoute à la culture environ lg de bicarbonate de sodium marqué lorsque la concentration mesurée est de l'ordre de 0,1 g/1. On suit la croissance cellulaire en mesurant la densité optique à 700 nm deux fois par jour.
On contrôle l'expression continue de GyrB(l-219) dans ces conditions par l'analyse des extraits cellulaires totaux par electrophorese sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) . On arrête la fermentation lorsque la culture atteint la phase stationnaire à D0700=2,1. Les cellules sont alors récupérées par centrifugation, puis sont conservées à une température d'environ -20°C.
7) Puri fi cat n d≤ GyrB (1 -219) issue des cellules
Anabaena
On met à nouveau en suspension les cellules exprimant GyrB (1-219) dans un tampon A (contenant 50mM Tris-HCl, 10 % glycérol, lOmM β-mercaptoéthanol, ImM EDTA, pH=8) , à D0700=50, puis elles subissent deux sonications pendant deux minutes sur un appareil "Branson Sonifier 450" (vendue par la Société Branson Ultrasonic, Danbury, CT, USA) .
Après sonication, les cellules sont passées dans la presse de French pour achever le broyage cellulaire. On centrifuge le lysat résultant pendant vingt minutes à 12000 tours/minute pour extraire les débris cellulaires, on filtre ensuite au travers d'un filtre à 0,22 μm (Millipore Corp., Bedford, MA, USA), puis on charge le filtrat sur une colonne de Sépharose couplée à la novobiocine (Staudenbauer and Orr, 1981) préalablement équilibrée dans le tampon A.
La colonne est ensuite lavée avec le tampon A contenant 0,5 mol/1 KC1, puis avec le tampon A contenant 1 mol/1 KC1. La protéine liée est éluée avec un tampon A contenant 5 mol/1 d'urée. Les fractions à 5 mol/1 d'urée contenant GyrB (1-219) dénaturée sont collectées et mélangées, puis diluées à
0,5 mg/ml avec le tampon A contenant 5 mol/1 d'urée.
La protéine initialement dénaturée est repliée par dialyse, initialement contre le tampon A, et ensuite contre le tampon A contenant 25mM KC1.
Après dix minutes de centrifugation à
12 000 tours/minute de la solution dialysée, le surnageant est chargé sur une colonne Q-Sépharose Fast Flow (Amersham-Pharmacia, Uppsala, Sweden) équilibrée dans le même tampon : TpA 25mM KCl .
La GyrB (1-219) est éluée avec un gradient linéaire de
25 à 400 mM KCl.
Enfin, on concentre la protéine par ultrafiltration sur MacroseplOK (Pall Filtron Corp, NorthBorough, MA, USA) puis sur Centricon-10 (Sartorius, Palaiseau, France) .
On conserve la protéine purifiée à une température d'environ 4°C après une dialyse finale contre 10 mM de phosphate de sodium à pH = 7.
8) Analyse par Electrophorese sur gel e polyacrylamide en présence de dodécylsul fate de so ium (SDS-PAGE) et immunoempreinte
Les extraits cellulaires totaux correspondent au culot de cellules resuspendu dans du TpA à une DO700 = 2 pour E. coli et à une D0700 = 10 pour AnaJbaena.
Pour obtenir les fractions solubles et insolubles, ces extraits cellulaires sont broyés à la presse de French puis centrifugés 10 minutes à 10000 tours/min. La fraction soluble correspond au surnageant et la fraction insoluble au culot.
Des quantités identiques de fractions solubles et insolubles sont ensuite analysées sur SDS-PAGE. La description qui suit expose de façon plus détaillée, mais non limitative, la méthodologie et les résultats expérimentaux obtenus, basés sur les figures annexées.
Comme le montre la figure 1A, le plasmide pBL23K est obtenu en remplaçant le gène codant pour le fragment N-terminal 43kDa de la GyrB dans le plasmide pF90Y5 par la séquence ADN codant la gyrase B(l-219), tel qu ' indiqué précédemment . L'expression du domaine GyrB (1-219) est sous le contrôle du promoteur tac.
Le gène répresseur lac (lac Iq) , qui produit le répresseur, et le promoteur tac sont également représentés . Le terminateur de transcription rrnBTlT2 est placé en aval du gène de la GyrB(l-219).
L'origine de replication de ColEl (ColEl) permet le maintien du plasmide dans E. coli . AmpR correspond au gène de résistance de 1 ' ampicilline .
Comme le montre la figure 1B, la cassette d'expression pour GyrB (1-219) est transférée du plasmide pBL23K vers pRL25C, tel qu'indiqué précédemment.
L'expression de GyrB (1-219) est également sous le contrôle du promoteur tac.
Le plasmide pRL25C23K est un vecteur navette dans E. coli /Anabaena, et contient l'origine de la replication de ColEl (ColEl ori) , l'origine ColEl de conjugaison pour le transfert du plasmide de E. coli vers Anabaena (bom), l'origine pDUl de replication pour la replication dans les cellules d'Anajbaena (Wolk et al, 1984) , et le gène de résistance de la néomycine, NéoR. Le protocole pour obtenir les résultats comparatifs des figures 2A et 2B est le suivant.
Les cellules XLl-Blue porteuses du plasmide pBL23K sont induites avec ImM d'IPTG. Les extraits cellulaires totaux sont analysés sur gel d' electrophorese SDS-PAGE. Les extraits cellulaires totaux des cellules Anabaena porteuses du plasmide pRL25C23K exprimant de façon constitutive la gyrase GyrB (1-219) ont également migres en parallèle sur le gel. Après electrophorese, les protéines sont soit colorées avec le colorant bleu de Coomassie (figure 2A) , soit transférées sur une membrane en nylon (figure 2B) et détectées avec l'anticorps monoclonal 2F12, comme indiqué précédemment . Les pistes 1, 2, 3, 4 d' electrophorese des figures 2A et 2B correspondent aux dépôts suivants :
- Piste 1 : 20 μl d'extrait total de cellules d'une culture XLl-Blue non induites, porteuses de pBL23K ;
- Piste 2 : 20 μl d'extrait total de cellules d'une culture de XLl-Blue porteuses de pBL23K, induite pendant deux heures ;
- Piste 3 : 20 μl d'extrait total de cellules d'une culture de cellules Anabaena de type sauvage ;
- Piste 4 : 20 μl d'extrait total de cellules d'une culture d' Anabaena porteuses du plasmide pRL25C23K ;
- M : est le marqueur de faible poids moléculaire (Amersham Pharmacia) .
La flèche, sur les figures 2A et 2B, indique la bande correspondant à la gyrase GyrB(l-219).
Sur les figures 3A et 3B, on analyse, par le biais des techniques sur gel electrophorese SDS-PAGE et d' immunoempreinte, telles que décrites ci-dessus, les fractions solubles et insolubles issues de cellules E. coli XLl-Blue induites porteuses du plasmide pBL23K, et celles issues des cellules Anabaena porteuses du plasmide pRL25C23K.
Les pistes 1 et 2 de du gel SDS PAGE des figures 3A et 3B, correspondent aux dépôt suivants : - Piste 1 : 20 μl de fraction soluble ;
- Pi ste 2 : 20 μl de fraction insoluble ;
- M : marqueur de faible poids moléculaire.
Les courbes de la figure 4A, sont obtenues à 1 ' issue du mode expérimental suivant :
Les cellules Anabaena exprimant la GyrB (1-219) sont mises en culture, soit sur un milieu BG-11 non marqué, soit sur un milieu BG-11 contenant NaH13C03 et Na15N03. La croissance est analysée en suivant chaque jour la DO700nm.
Sur la figure 4A, obtenue lorsque la croissance est réalisée dans un erlenmeyer sous agitation dans des conditions atmosphériques, la courbe 1 représente la croissance dans un milieu BG-11 non marqué, et la courbe 2, celle dans un milieu BG-11 contenant NaH13C03 et Na15N03.
Ce graphique comprend en outre les pistes obtenues sur gel electrophorese SDS-PAGE, coloré avec le colorant bleu de Coomassie et, qui montre l'expression de GyrB (1-219) dans les cellules Anabaena cultivées dans un milieu BG-11 marqué au 13C/1SN ou non. Les pistes 1, 2 et 3 d' electrophorese sur gel d'acrylamide de cette figure 4A correspondent aux dépôts suivants :
- Piste 1 : Marqueur de faible poids moléculaire (Amersham Pharmacia) ;
- Piste 2 : Extrait total de cellules à partir d'une culture réalisée dans un milieu BG-11 non marqué ; - P te 3 : Extrait total de cellules à partir d'une culture réalisée dans un milieu BG-11 additionné de NaH13C03 et de Na15N03.
La flèche indique la bande correspondant à GyrB(l-219) .
Les courbes de la figure 4B sont obtenues avec des conditions de culture sous azote gazeux. Les cultures sont ventilées avec de l'azote gazeux. La courbe 3 représente 1 ' évolution de la DO700 en fonction du temps pour une croissance cellulaire dans un milieu BG-11 non marqué et, avec une régulation du pH.
La courbe 4 représente la DO700 en fonction du temps pour une croissance cellulaire dans un milieu BG-11 contenant NaH13C03 et, avec une régulation du pH.
La courbe 5 représente la DO700 en fonction du temps pour une croissance cellulaire dans un milieu BG-11 non marqué et, sans aucune régulation du pH. Cette figure 4B montre de plus (voir SPS PAGE) les niveaux d'expression de la GyrB (1-219) obtenus lorsque les cellules sont cultivées en condition atmosphériques ou sous azote gazeux. Les pistes 1, 2 et 3 d' electrophorese sur gel de polyacrylamide de cette figure 4B correspondent aux éléments suivants :
- Pi ste 1 : Marqueurs de faible poids moléculaire ;
- Pi ste 2 -. Extrait total de cellules cultivées en erlenmeyer sous agitation en condition atmosphérique, cultivées dans un milieu BG-11 non marqué ;
- Pi ste 3 : Extrait total de cellules cultivées dans un flacon ventilé avec de l'azote dans un milieu BG-11 marqué au 13C . Au vu des éléments techniques exposés précédemment, on peut noter que l'expression de la GyrB(l-219), à la fois dans les cellules E. coli et Anabaena est réalisée sous le contrôle du promoteur tac. Chez E. coli , l'expression de GyrB (1-219) est réalisée en utilisant la souche XLl-Blue porteuse du vecteur pBL23K (figure 1A) .
Ce vecteur contient aussi bien le promoteur tac que le répresseur lac (laclq) qui réprime ce promoteur pendant la croissance.
L'expression de GyrB (1-219) est induite par l'ajout de
1 ' inducteur :
1 ' isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG) .
Dans les cellules Anabaena, l'expression du fragment GyrB (1-219) est réalisée en utilisant le vecteur d'expression navette d'E. coli/ Anabaena, à savoir
PRL25C23K (figure 1B) , dans la souche PCC 7120.
Dans ce cas, l'absence du répresseur lac conduit à l'expression constitutive de GyrB (1-219) à partir du promoteur tac.
L'expression produite dans chaque souche est analysée par electrophorese SDS-PAGE et par immunoempreinte .
Comme le montrent les pistes 1 et 2 de la figure 2A, la comparaison des extraits cellulaires totaux obtenus à partir de cellules XLI Blue porteuses du vesteur pBL23K non induites et induites montrent la présence d'une protéine supplémentaire d'environ 28kDa, dans les extraits de cellules induites à l'IPTG.
Sur les pistes 3 et 4 de la figure 2A, la comparaison de l'extrait de cellules Anabaena de type sauvage avec les cellules Anabaena porteuses de pRL25C23K, révèle également la présence d'une protéine supplémentaire d'environ 28kDa dans les cellules porteuses du vecteur d'expression pRL 25C23K.
L'analyse de ces extraits par immunoempreinte (figure 2B) montre que cette protéine est reconnue par l'anticorps monoclonal 2F12 dirigé contre la sous-unité gyrase B d'E. coli . Ceci confirme donc l'expression de GyrB(l-219), à la fois dans les cellules d'E. coli et dans celles d 'Anajbaena.
Selon les pistes 1 et 2 de la figure 2A, on peut, dans les extraits d'E. coli , aussi détecter une autre protéine d'environ 80 kDa qui correspond à la protéine gyrase B endogène.
Par ailleurs, pour caractériser la GyrB (1-219) produite dans chaque hôte, on a effectué une analyse des fractions insolubles et solubles, des extraits E. coli et Anabaena contenant GyrB (1-219).
Les pistes 1 et 2 des figures 3A et 3B montrent que la protéine est présente exclusivement dans la fraction soluble, à la fois dans les cellules d'E. coli et dans celles d'AnaJbaena. On a effectué des essais de liaison de GyrB (1-219) à la novobiocine, qui est connue pour lier et inhiber Gyr B, pour tester l'activité de la protéine exprimée chez E. coli et chez Anabaena. Des fractions solubles obtenues à partir de chaque souche sont chargées sur une colonne de novobiocine- Sépharose (Staudenhauer and Orr, 1981) . La protéine liée pure, est récupérée après élution avec un tampon dénaturant contenant 5M d'urée (TpA 5Murée) . Dans la mesure où le domaine N-terminal 24kDa de la gyrase B fixe la novobiocine, ces résultats suggèrent que la GyrB (1-219) est correctement repliée dans le cytoplasme des cellules E. coli et dans celui des cellules Anabaena sp.PCC 7120.
Les rendements de GyrB(l-219), surexprimée dans ces conditions, sont d'environ 10mg/l avec E. coli lors d'une croissance dans le milieu Martek 9-U, et 15 mg/1 avec Anabaena sp.PCC 7120 lors d'une croissance dans le milieu BG-11. Ces données montrent que Anajbaena sp.PCC 7120 est capable, tout comme E. coli , d'exprimer avec des rendements élevés, la GyrB (1-219) soluble dans son cytoplasme.
- Marquage double ail 13Ç/15N de la protéine N- ermina]
24kDa dans Anabaena sp PCC7120 dans des conditions en aérobie
La présence de NaH13C03 et de NalsN03 marqués n'a aucun effet sur la croissance cellulaire, ni sur le rendement d'expression de GyrB(l-219), comme le montre l'analyse des extraits totaux cellulaires à partir des cultures correspondantes (voir figure 4A SDS-PAGE) .
Une culture de 1,5 litres est ensuite réalisée pour préparer des quantités suffisantes de protéine marquée pour l'analyse RMN. On purifie 9mg de GyrB (1-219) marquée au 13C/15N pure, puis on les analyse en spectroscopie RMN.
La figure 5 montre le spectre HSQC 1SN-1H de cet échantillon. Ce spectre, qui peut être considéré comme une empreinte digitale de la structure de la protéine, est similaire à celui obtenu à partir de l'échantillon E. coli (données non représentées) .
Le niveau d'enrichissement isotopique est examiné par spectrométrie de masse et par RMN. Dans un échantillon marqué uniformément, on suppose que tous les pics méthyl du spectre de corrélation hétéronuclaires 13C se voient nettement sous forme de doublets, grâce au couplage homonucléaire 13C-13C (Jcc = 30HZ) .
Dans le spectre RMN HSQC 13C-XH enregistré sur ce premier échantillon, on a observé que la plupart des pics méthyl résonne sous forme de triplets, indiquant dans ce cas que le marquage des 12C au 13C n'est pas uniforme.
Le rapport (R) de la surface située au-dessous de la ligne centrale, ainsi que les lignes de doublets donnent une estimation du taux P de marquage. Ce taux est estimé se trouver entre 20 % et 30 %. Ces résultats sont en bonne harmonie avec ceux issus de la spectrométrie de masse, dans l'hypothèse où le taux de marquage à l'azote 1SN est égale à 90 %.
- Production de GyrBM-21 ) marquée uniformément au 13C dans Anabaena sp.PCC 7120 dans. des cond ions anaérobies
Puisque NaH13C03 est l'unique source de carbone dans le milieu de culture, l'hypothèse a été faite selon laquelle le carbone C12 assimilé par les cellules
Anabaena proviendrait probablement du C02 atmosphérique dissous .
En effet, la Ribulose Biophosphate
Carboxylase/Oxygénase (RubisCo) , qui est l'enzyme principale responsable de la fixation de C02 chez
Anabaena , est capable de discriminer entre 12C02 et 13C02
(Kaplan et al, 1995) et d'utiliser préférentiellement le 12C02.
Pour tester cette possibilité, on réalise le marquage au 13C de cultures Anabaena en croissance dans des flacons en verre ventilés uniquement avec de l'azote gazeux.
Les courbes de croissance de la figure 4B montrent une croissance plus réduite en présence d'aération par l'azote, comparée à une croissance en condition atmosphérique, probablement parce que les transferts de lumière sont moins efficaces dans un grand flacon. On peut par ailleurs noter une sensibilité supérieure au pH élevé, qui conduit à la mort cellulaire en absence de régulation du pH.
On effectue alors une régulation du pH deux fois par jour, permettant aux cellules de croître jusqu'à ce qu'on atteigne une DO700 = 0,7. On évalue le niveau d'incorporation isotopique dans ces conditions en anaérobie en produisant 7mg de GyrB(l-219), à partir de 2,5 litres de culture d ' Anabaena .
La protéine est ensuite analysée par spectroscopie RMN et par spectrométrie de masse.
La figure 6 montre la région méthyl du spectre RMN HSQC
13C - 1H enregistré en utilisant cet échantillon.
Comme on peut le voir sur la figure 6, la structure en doublet des pics de corrélation qui est due aux couplages homonucléaire 1JCC témoigne du marquage uniforme en 13C .
Les pics qui sont marqués d'une étoile sont attribués aux quatre groupements méthyl des résidus de méthionine présent dans la séquence de la protéine GyrB (1-219) .
La plupart des pics de corrélation 13C - 1H s'affiche comme des doublets purs . Ceci indique un niveau d'enrichissement en carbone supérieur à 90 %. On constate que ce taux de marquage est uniforme le long de la séquence, dans la mesure où tous les Cα et les Cβ résonnent, respectivement, comme des triplets et comme des quadruplets . Ce résultat est confirmé par l'analyse en spectrometrie de masse ES de cet échantillon, qui montre une différence de masse de 994 Da entre les échantillons marqués et les non-marqués (respectivement de 25 067 Da et 24 073 Da) . Ceci correspond à un niveau d'enrichissement de 94 % en 13C .
Dans la mesure où ceci a pu être reproduit deux fois avec deux préparations différentes de GyrB (1-219) marquée au 13C, on peut conclure que l'absence de 12C02 atmosphérique est la condition préalable au marquage uniforme en 13C de la protéine recombinante dans les cellules Anabaena, en utilisant NaH13C03 comme source unique de carbone.
- Production dε GyrB (1 -219) marquée au 13C/15N par fermentati n
De façon à optimiser la croissance de GyrB (1-219) en conditions anaérobie, on fait pousser les cellules Anabaena exprimant la protéine recombinante dans un fermenteur de deux litres.
Pour obtenir une croissance jusqu'à une D0700 = 2, le pH est maintenu à 8 avec une exposition à la lumière adéquate .
On utilise de l'argon, à la place de l'azote, dans la mesure où les cellules Anajbaena sont également capables de fixer l'azote gazeux lorsque l'azote organique devient limitant dans le milieu de culture. L'analyse SDS-PAGE des extraits cellulaires totaux échantillonnés pendant la fermentation, montre que GyrB (1-219) est exprimée de façon continue pendant toute la croissance (données non représentées) . Dans ces conditions, on constate que le rendement en GyrB (1-219) dans le fermenteur est équivalent à celui obtenu dans des erlenmeyers sous agitation en condition atmosphérique .
En partant de cellules issues de la fermentation, on purifie 9mg de GyrB (1-219) marquée au 13C/15N, puis on les analyse par RMN. Le spectre RMN HNCA de cet échantillon est comparé à celui de GyrB (1-219) marquée au 13C/1N dans E. coli .
Comme le montrent les figures 7A et 7B, on constate que le spectre (régions issues des résidus 188 à 198) obtenu avec GyrB (1-219) produit dans les cellules Anabaena est identique à celui obtenu avec GyrB (1-219) marquée dans les cellules E. coli .
Ces résultats indiquent que la protéine GyrB (1-219) produite dans Anabaena, dans les conditions exposées précédemment, est totalement marquée avec les atomes 13C et 1SN.
En outre, ceci présente l'avantage que ce marquage avec Anabaena a un coût de revient dix fois moins cher qu'avec E. coli .
En conclusion de cette étude, on peut noter que la protéine est produite avec un rendement élevé sous forme soluble et repliée dans le cytoplasme des cellules Anabaena, montrant ainsi que les capacités d'expression hétérologue de cette souche sont comparables à celles d'E. coli.
On utilise dans cette invention un système d'expression constitutif qui permet l'accumulation de la protéine pendant la croissance. De plus, les protocoles de purification peuvent facilement être transférés des extraits de cellules d'E. coli vers ceux d'AnaJbaena, bien que la composition en protéine des cellules Anajbaena est très différente de celle d'E. coli , puisque les cellules Anabaena comprennent toutes les protéines pigmentées impliquées dans les photosystèmes I et II.
Le marquage de la protéine recombinante est réalisé en cultivant les cellules Anabaena exprimant GyrB (1-219) cellulaire dans un milieu contenant les substrats marqués .
L'analyse de la protéine marquée, par spectroscopie RMN et spectrometrie de masse, montre qu'un taux de marquage élevé peut être atteint en utilisant le système d'expression Anabaena .
Bien que l'enrichissement isotopique supérieur à 90 % peut être facilement obtenu pour l'isotope 15N, l'enrichissement en isotope 13C nécessite la croissance des cyanobactéries sous des conditions atmosphériques contrôlées. En effet, la présence de C02 atmosphérique dissous dans le milieu de culture diminue de façon importante le pourcentage d'enrichissement isotopique. Dans la présente invention, la ventilation du milieu de culture à l'azote gazeux ou à l'argon permet d'atteindre un enrichissement allant jusqu'à 94 % en 13C.
Par ailleurs, le procédé de l'invention présente un coût financier nettement inférieur à ceux connus jusqu' ici . Cette réduction est due à la possibilité conférée aux cyanobactéries de pouvoir à la fois pousser naturellement sur un milieu pauvre en nutriments et, de pouvoir utiliser la lumière comme source d'énergie. Un inconvénient à ce système d'expression Anabaena est le temps de reproduction qui est d'environ 24 heures, alors qu'E. coli se divise en environ 30 minutes, et par conséquent augmente la durée de réalisation du procédé de l'invention.
Mais un tel inconvénient peut être réduit avec un contrôle efficace des conditions de croissance, et en particulier en fournissant une exposition à la lumière des cyanobactéries optimale.
Ceci peut notamment être réalisé à l'aide d'un fermenteur permettant une irradiation lumineuse uniforme pour optimiser la vitesse de croissance cellulaire.
Enfin, en utilisant le même système d'expression constitutif, la protéine de liaison au maltose d'E. coli a été également été produite sous une forme soluble dans le cytoplasme d'AnaJbaena, à des niveaux comparables à ceux obtenus dans E. coli .
Ces résultats suggèrent que les protéines solubles, qui sont surexprimées dans E. coli , peuvent aussi être surexprimées dans les cellules Anabaena, et par conséquent marquées à faible coût, faisant d ' Anabaena un hôte privilégié pour le marquage de protéines recombinantes .
De plus, la nature non-protonée de la source de carbone (C02) est un grand avantage lorsqu'on considère la production de protéine totalement deutérée.
En effet, la souche Anabaena sp.PCC 7120 peut être adaptée avec succès pour croître dans un milieu enrichi en D20, qui peut comprendre jusqu'à 97% de D20. Selon le procédé de l'invention, on peut aussi produire des protéines recombinantes en surexprimant la lacperméase d' E. coli dans la cellule Anabaena sp.PCC
7120, de façon à favoriser l'entrée d'IPTG présent dans le milieu de culture, et par conséquent de mieux réguler l'expression à partir du promoteur tac en présence du répresseur lac. Ceci a d'autant plus d'intérêt lorsque la protéine recombinante présente des propriétés toxiques pour la cellule.
La présence d'IPTG en quantité variable permet de varier la quantité de protéine accumulée dans la biomasse, du fait de la variation de l'expression.

Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1. Procédé pour produire des protéines recombinantes, marquées de façon uniforme et complète avec au moins un isotope à partir de cellules recombinantes ou de microorganismes recombinants pouvant être autotrophes et/ou phototrophes, ledit procédé consistant à mettre en culture lesdites cellules ou lesdits microorganismes sur un milieu de culture qui comprend au moins un isotope, à isoler lesdites cellules ou lesdits microorganismes cultivés, puis à purifier les protéines recombinantes à partir desdites cellules, desdits microorganismes ou du milieu de culture, caractérisé en ce que lesdites cellules ou lesdits microorganismes sont mis en culture en milieu aérobie, en milieu anaérobie ou en fermentation, la culture en milieu aérobie s 'effectuant en présence de C02 atmosphérique, la culture en milieu anaérobie et en fermentation s 'effectuant en absence totale de C02 atmosphérique pour un enrichissement en isotope 13C,et en présence d'un gaz, les cultures en anaérobie et en fermentation s 'effectuant en régulant le pH, l'intensité d'une source de lumière visible et la durée d'exposition en continu des cellules ou des microorganismes à cette source de lumière.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur du pH va de 7 à 10.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la valeur de l'intensité de la source de lumière est inférieure à la valeur d'inhibition des cellules/microorganismes, et la durée d'exposition à la lumière varie de 6 heures à 24 heures par jour pendant le temps de la culture.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le gaz est choisi parmi l'oxygène, hydrogène, l'azote, les gaz inertes tel que l'argon.
5. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que 1 ' isotope est choisi parmi les composés comprenant 13C, 1SN, 2H 180 et leurs mélanges.
6. Procédé selon la revendication 1 ou 5 , caractérisé en ce que les composés sont choisis parmi NaH I13CCO
Na15N03, D20, l'ammoniaque marquée, 13C02, les sels de sodium, ou de potassium ou d'ammonium marqués au 13C et au 15N et leurs mélanges.
7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le microorganisme est choisi parmi les microorganismes photosynthétiques recombinant modifiés par l'ajout d'un plasmide réplicatif ou par la modification de leur génome.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le microorganisme photosynthétique est choisi parmi les algues procaryotes bleues, vertes ou rouges.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que l'algue est choisie parmi les cyanobactéries.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cyanobacterie est la souche Anajbaena sp. PCC
7120.
11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la protéine recombinante est choisie parmi la gyrase B(l-219), la protéine de liaison au maltose d'E. coli .
12. Procédé selon la revendication 1 ou 10, caractérisé en ce que la cellule ou le microorganisme comprend le vecteur plasmidique d'Anajbaena pRL 25C23K.
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