WO2002063947A1 - Carporphore de lentinula edodes et procede de selection et de culture correspondants - Google Patents

Carporphore de lentinula edodes et procede de selection et de culture correspondants Download PDF

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breeding
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PCT/JP2002/001031
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Tetsuo Toyomasu
Shinjiro Muraoka
Original Assignee
Mori & Company Ltd.
The Mushroom Research Institute Of Japan
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/07—Basidiomycota, e.g. Cryptococcus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/182—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system

Definitions

  • the present invention relates to shiitake mushroom fruit bodies containing a high content of eriyudenin, a component specific to shiitake, exhibiting a serum cholesterol-lowering effect, and Lenti nu laed odes having a high eriyudenine-producing ability and breeding thereof. And cultivation methods, and belongs to shiitake cultivation technology. Background art
  • Shiitake mushroom was found to have a substance that lowers serum cholesterol levels (Kaneda, T., Tokuda, S., J Nutr 90 (4) 371-376 (1966) Dec), and the active ingredient was isolated ( Chibata, I., Okumura, K., Kmeyama, S., Kotera, K., Experientia 25 (12) 1237-1238 (1969) Dec 15) and Eritadenine.
  • Erythenodenine is a compound in which hydroxybutyric acid is added to adenine. It is not found in other mushrooms except in trace amounts in pine shroom (Kuritake), and is a component unique to shiitake.
  • This eritadenine is said to increase serum cholesterol, which is a risk factor for arteriosclerosis. If you eat 9 g of dried shiitake mushrooms or 90 g of raw shiitake mushrooms daily for one week, the cholesterol concentration will be about 6%. (Suzuki S., Ohshima, S., Mushroom Science IX (Part I) Proceedings of the Ninth International Scientific Congress on the Cultivation of Edible Fungi, Tokyo, 1974, 463-467 ).
  • homocysteine an intermediate in amino acid metabolism
  • erythrodenin inhibits the synthesis of homocysteine.
  • Eryubidenine which has these medicinal effects, is present together with deoxyeridenine in shiitake mushrooms, and is abundantly contained in shiitake fruit bodies, especially in fungal umbrellas, but the abundance of each is 50.7 to 92.7 mg / day.
  • l 00 gDW, 7.7 to 13.6mg / 100 gDW (Yasuo Aoyagi, Etsuko Masada, Tatsuyuki Sugawara, “Nutrition and Food” Vol. 29; No. 8, 460-461 (1976)) Considering the average Shiyuga intake per person (0.58 dry matter per day), the content is low to expect its medicinal effect.
  • traits that show continuous mutations are considered to be polygene-controlled in the same way as yield, and in order to accumulate genes related to erythrodenin content, multiple selected strains with a high erythrodenine-producing ability were cross-crossed.
  • spores isolated from the selected mating parent were crossed, high-content strains were selected from among them, and crossing was repeated between them.
  • the second generation strain was air-conditioned (at 17 ° C). C, RH 90%), it is possible to harvest shiitake mushrooms that contain 2 to 4 times the amount of conventional And the ability to obtain high yields (400 g / l.
  • An object of the present invention is to provide shiitake mushrooms that can contribute to maintaining health with conventional intakes and even lower intakes by growing and cultivating shiitake mushrooms containing a larger amount of eriyudenine. is there.
  • Another object of the present invention is to use the shiitake mushrooms cultivated in this way as a health food material. Disclosure of the invention
  • the present invention provides
  • a shiitake mushroom body characterized in that the fungus umbrella contains at least 170 mgZl 00 gDW of erythrodenin.
  • Le nti nu lae dod characterized in that it has the ability to produce fruiting bodies having an eritadenine content of 17 Omg / 100 gDW or more in a fungus umbrella at a temperature of 15 to 20 ° C by culturing. es).
  • Lenti nu lae do des From the known Lenti nu lae do des, a plurality of those having high erythrogenic denin-producing ability were selected and bred in a mass. The above fruiting bodies were cultured at room temperature.
  • a method for breeding Lentinula 1 aedodes, characterized in that Lentinula edodes (Lenti nu laed odes) having the ability to produce Lentinu la edodes is obtained.
  • Lentinu la aedodes is formed by culturing Lenti nu 1 aedodes at a temperature of 25 to 34 to form a fruiting body after formation of a primordium, and Le nti nu lae dod es. The cultivation method. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • Fig. 1 is a photograph showing the electrophoresis of the DNA of the strain H44 by RAPD method.
  • a size marker consisting of a 200 bp ladder DNA from the left side (200 bp and 400 bp increasing sequentially from the bottom), an H44 strain, The four strains on the right are commercial strains of the H78 strain.
  • Fig. 2 is a photograph showing the electrophoresis of the DNA of strain H44 by the IGRA2 method.
  • the size is composed of 200 bp ladder DNA from the left side (200 bp and 400 bp increase sequentially from the bottom).
  • the H44 strain and the H78 strain, the four on the right are commercial strains.
  • beech and corn plan were mixed at a weight ratio of 4: 1 and the medium adjusted to 65% water was packed in 1.3 kg in a plastic culture bag, and the temperature was 121 ° C for 90 minutes.
  • inoculate with shiitake mushroom for screening culture at 70% humidity for 90 to 120 days while maintaining the temperature at 22 to 23 ° C, remove the culture bag, and temperature to 17 °
  • the fruiting body was generated under the conditions of C, humidity of 90% and light.
  • the resulting fruiting bodies were freeze-dried immediately after harvest and powdered to obtain a sample for erythrodenine quantification.
  • the thus obtained erythridine denin fraction was dissolved in acetonitrile containing 5 mM tetra-n-butylammonium bromide and 2 OmM dipotassium hydrogen phosphate, and subjected to liquid chromatography (D e V e 1 osi 1 RP Quantify at 260 nm with detection wavelength of Aqu eou s 4.5 x 250 mm, flow rate 1. Om 1 Z min).
  • Basidiospores were collected from each fruiting body of the selected “strain numbers 8123, C-04, and A-123 strains” and suspended in sterilized distilled water.
  • Matometa one f the spore concentration, after diluted to about ixi 0 6 spores Zm 1, the same ratio (1: 1: 1) were mixed in by seeding the agar plate medium and (collective cross), After culturing at a temperature of 25 ° C for 1 to 2 weeks, the mycelium growing on an agar plate medium (a 9 cm diameter petri dish) was cut off and inoculated on an agar slant medium.
  • This operation is performed by inoculating about 10 agar slant media (test tubes) for one agar plate medium and inoculating about 10 agar media into 100 test tubes. After that, the growing tip of the cultured hypha was transferred to a new agar slant medium (test tube) and further cultured. By repeating this operation several times, a uniform dikaryon was obtained.
  • the obtained binuclear hypha was cultivated in a fungal bed medium to harvest fruit bodies, and its basidiomyocytes were collected, and at the same time, the erythrocyte denin content was measured.
  • strain number 8123, C_04, and A-123 strains As described above, about 100 strains of binuclear hyphae were cultivated by collective crossing of “strain number 8123, C_04, and A-123 strains”, and eritadenine content was measured for 81 strains that formed fruiting bodies.
  • the H44 strain is superior in terms of the amount and duration of fruiting body occurrence, so it is designated as "Le nti nu laed odes H44" and is deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST). Deposited at the Center (address: Tsukuba-Higashi 1-chome 1-1 Chuo No. 6 Ibaraki, Japan) under the deposit number FERM BP_ 7852 (Deposit date: October 6, 2000).
  • the mycological and biochemical properties of the H44 strain are as follows.
  • Pattern color skin color
  • the back surface becomes brown by adding 0.1% of gallic acid, showing the characteristics of white rot fungi.
  • the hypha pre-cultured on GMY agar medium is punched out with a cork pole, inoculated on PDA medium and GMY medium, cultured for 3 days, and then cultured for 5 days at each temperature using a temperature gradient culture device. Hyphal elongation was measured.
  • Hyphal pieces punched out with a cork pole were inoculated with GMY liquid medium adjusted to each pH, and cultured at a temperature of 25 for 30 days.
  • the protein was dissolved in TE and treated with liponuclease (RNase 20 gZm1) to remove proteins with phenol.
  • RNase 20 gZm1 liponuclease
  • the DNA prepared in this manner was diluted to a concentration of 25 ng / l (see Ann E R. Kubelic Les J. Szabo, Curr Genet (1995) 28, 384— 389).
  • PCR amplification conditions
  • PAPD random amplified polymorphic DNA
  • OPA-04 5'-1A ATCGGGCTG
  • IGR2 liposome RNA gene Of the non-translated region
  • the amplified product was electrophoresed on a 1.5% agar gel and stained with ethibumuchimid.
  • Beech and corn bran were mixed at a weight ratio of 4: 1 and the water content was adjusted to 65%. After 1.3 kg of the bacterial bed was cultured for 120 days (at a temperature of 22 to 23 ° C), the temperature was raised to a temperature of 10 to 28 ° C. When the fruiting body was generated under the conditions, as a result, the first generation of the fruiting body generated 57 to 204 g of fruiting body in any range, and the adaptation temperature had wide characteristics.
  • Beech and corn bran are mixed at a weight ratio of 4: 1.
  • the culture medium adjusted to 65% water is packed in 1.3 kg into a plastic culture bag, sterilized at a temperature of 121 ° C for 90 minutes, and then the strain is added to the culture medium. H44 was inoculated.
  • the initial amount of fruiting bodies generated was 135 gZl. 3 kg of bacterial bed, and the erythrodenine content was 214 mg / l 00 gDW, about 2.4 times higher than the conventional product.
  • cultivation tests were performed with the temperature of the air-conditioning chamber at 17 ° C, 25 ° C (:, 28 ° C, and 30 ° C) to generate fruiting bodies, and the content of erythridine denin in the fruiting bodies.
  • the higher the temperature during fruiting body growth the higher the value.At a temperature of 30 ° C, the value was 393 mgZl 00 gDW, and at a temperature of 17 ° C, The content was about twice as high.
  • the temperature of the air-conditioning chamber is increased to 17 ° C, 25 ° C, 28 ° C (:, 30 ° C
  • the fruiting bodies were grown at a temperature of 32 ° C and a temperature of 35 ° C, and the content of eritadenine in the fruiting bodies was measured.As shown in Table 2, the content increased as the temperature increased, The maximum was reached at the upper limit temperature of 32 ° C for body growth, at which time the content was about 6.2 times that of the fruiting body cultivated at 17 ° C.
  • the Shiyuka fruit body obtained by the present invention contains a large amount of erythrodenine, which has a cholesterol-lowering effect, and has very good yield, and is expected to have new demand as a nutritional food and as a health food material. It has excellent effects.

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Abstract

By mass mating breeding, Lentinula edodes c apable of producing mushroom fruit body containing 170 mg/100 g DW or more of eritadenine in the cap is obtained. By cultivating this Lentinula edodes or growing it at a high temperature, mushr oom fruit bodies containing much eritadenine in caps are obtained.

Description

明 細 書 シィタケ子実体、 レンチヌラ ·ェドデス並びにその育種及び栽培方法 技術分野
この発明は、 血清コレステロール低下作用を示す、 シィタケ固有の成分エリ夕 デニンを高含量に含むシィタケ子実体、 及びエリ夕デニン産生能の高いレンチヌ ラ ·ェドデス （L e n t i nu l a e d ode s) 並びにその育種及び栽培方 法に関するもので、 シィタケ栽培技術に属するものである。 背景技術
シィタケに、 血清コレステロール濃度を低下させる物質があることが見出され (Kaneda, T.， Tokuda, S. , J Nutr 90(4) 371-376 (1966) Dec) 、 有効成分も単離 され ( Chibata, I., Okumura, K. , Kmeyama, S. , Kotera, K. , Experientia 25 (12) 1237-1238 (1969)Dec 15) 、 ェリタデニンという名称が付されている。 エリ夕デニンは、 アデニンにヒドロキシ酪酸が付加した化合物であって、 マツ シュルーム （ックリタケ） に微量検出される以外、 他のキノコには存在せず、 シ ィタケ固有の成分である。
このエリタデニンは、 その上昇が動脈硬化の危険因子である血清コレステロ一 ル値を下げる働きがあるとされ、 乾燥シィタケ 9 g又は生シィタケ 90 gを 1週 間毎日食べ続けると、 コレステロール濃度がおよそ 6〜12%低下することが報 告されている （Suzuki S.， Ohshima, S. , Mushroom Science IX (Part I) Proceedings of the Ninth International Scientific Congress on the Cultivation of Edible Fungi, Tokyo, 1974, 463-467) 。
また、 アミノ酸代謝の中間体、 ホモシスティンの濃度は、 脳梗塞の危険因子と して知られているとともに、 エリ夕デニンは、 そのホモシスティンの合成を阻害 することも報告されている（A.M. Svardal, R. Djurhuns, H. Refsum, P.M. Ueland, Cancer Research 46, 5095-5100, October 1986)。
これら薬効の認められるエリ夕デニンは、 シィタケ中にデォキシエリ夕デニン とともに存在し、 シィタケ子実体、 特に菌傘部に多く含まれているが、 それぞれ の存在量は、 50. 7〜92. 7mg/l 00 gDW, 7. 7〜13· 6mg/ 100 gDWである （青柳康夫， 正田悦子， 菅原龍幸著 「栄養と食糧」 Vo l . 29 ; No. 8、 460 -461 (1976) ) ので、 日本人一人あたりのシ ィ夕ケ平均摂取量 （0. 58乾物量 1日） を考慮すると、 その薬効を期待する には含量が低いものである。
一方、 シイタケ新菌株の開発目標の多くは、 多収性、 耐病性、 作型など種菌と して販売することを目的とするもので、 かかる観点からみれば、 これまでに優れ た品種が開発されてきたが、 食用となる子実体に含まれる、 このような生体調節 機能に関する成分や栄養価に関して、 品種を開発し、 育種し、 また栽培すること はこれまでに殆どなされていないのが現状である。
このような現状に鑑み、 発明者等は、 生体調節機能に関する成分や栄養価の高 レ 特にエリ夕デニン含有量の多いシィタケの品種を開発し、 育種し、 またエリ 夕デニン含有量の多いシィタケを栽培する方法を求めて検討を行った。
その結果、発明者等は、エリ夕デニン含量に品種間差異があると推測し、まず、 市販されているシィ夕ケ菌株、 保存されている野生シィタケ菌株を集め、 それら を空調栽培し、 エリ夕デニン産生能の高い菌株を選択した。
一方、 連続的変異を示す形質は、 収量と同じくポリジーン支配のものと考え、 エリ夕デニン含量関連遺伝子の集積を図るため、 それら選択されたエリ夕デニン 産生能の高い菌株の複数を集団交配、 すなわち、 選定した交配親から分離した胞 子を交配し、 その中から高含量菌株を選抜し、 それらの間でさらに交配を繰り返 したところ、 二世代目の菌株に、 空調栽培 （温度 17°C、 RH90 %) すること によって、 従来の 2〜 4倍量のェリ夕デニンを含むシィタケを収穫することが可 能であることを見出すとともに、 多収量性 （400 g/l. 3 kg菌床以上） で あって、 かつ、 傘の色、 形態等に優れた特徴を有するシィタケ子実体が得られる ことを見出し、 さらに、 原基形成後、 高温下に培養して子実体を形成させると、 エリ夕デニンの含有量の多いシィ夕ケ子実体が得られることを見出し、 この発明 を完成したのである。
この発明の目的は、 より多くのエリ夕デニンを含むシィタケを育成栽培するこ とによって、 従来の摂取量、 さらにはより少ない摂取量で健康維持に寄与するこ とのできるシィタケを提供することである。
この発明の他の目的は、 このように栽培して得たシィタケを、 健康食品素材と して利用することである。 発明の開示
前記の目的を達成するため、 この発明は、
菌傘部に、 エリ夕デニンを 170mgZl 00 gDW以上含有することを特徴 とするシィタケ子実体である。
また、 この発明は、
菌傘部のエリタデニン含量が 17 Omg/100 gDW以上である子実体を、 温度 15〜20°Cの条件下で培養により産生する能力を有することを特徴とする レンチヌラ ·ェドアス （Le n t i nu l a e dod e s) である。
さらに、 この発明は、
寄託番号 F E RM BP— 7852を有するレンチヌラ ·ェドデス （L e n t i nu l a e do d e s) に属する新規な菌株 H 44である。
また、 この発明は、
公知のレンチヌラ ·エドデス（L e n t i nu l a e do d e s)の中から、 エリ夕デニン産生能の高いものを複数選択し、 集団交配育種して、 菌傘部のエリ 夕デニン含量が、 17 OmgZl 00 gDW以上である子実体を、 常温培養によ り産生する能力を有するレンチヌラ 'エドデス （L e n t i nu l a e d od e s ) を取得すること、 を特徴とするレンチヌラ ·ェドデス （L en t i n u 1 a e d o d e s ) の育種方法である。
また、 この発明は、
レンチヌラ ·エドデス （L e n t i nu 1 a e d o d e s ) を原基形成後、 温度 25〜34 の条件下に培養して、 子実体を形成させること、 を特徴とする レンチヌラ ·エドデス（Le n t i nu l a e dod e s)の栽培方法である。 図面の簡単な説明
第 1図は、 菌株 H44の DNAの RAPD法による電気泳動を示す写真で、 左 側から 200 b pラダー DN Aからなるサイズマ一カー （下から 200 bp、 4 00 bpと順次上昇） 、 H44菌株、 H78菌株で、 右 4本は市販品の菌株のも のである。
第 2図は、 菌株 H 44の DN Aの I GR 2法による電気泳動を示す写真で、 左 側から 200 b pラダー DNAからなるサイズマ一力一 （下から 200 b p、 4 00 bpと順次上昇） 、 H44菌株、 H 78菌株で、 右 4本は市販品の菌株のも のである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 この発明のシィタケ子実体、 レンチヌラ ·エドデス並びに育種及び栽培 方法を、 具体的な実施例に基づいて詳述する。
ぐ育種方法 >
市販されているシイタケ菌株、 及び出願人が保存している野生シィ夕ケ菌株合 計 67菌株を集め、 空調栽培によるスクリーニングを行った。
まず、 ブナとコーンプランを重量比 4 ： 1で混合し、 水分を 65%に調製した 培地をプラスチック製の培養袋に 1. 3 kg詰め込み、 温度 121°Cで 90分間 殺菌したのち、 スクリーニング用のシイタケ菌を接種し、 温度を 22〜23°Cに 維持しながら、 湿度 70%の条件下で 90〜120日培養したのち、 培養袋を取 り除き、 温度 17°C、 湿度 90%、 明条件下で子実体を発生させた。
発生した子実体は、 収穫後直ちに凍結乾燥し、 粉末化してエリ夕デニン定量の 試料とした。
<エリ夕デニンの定量 >
エリ夕デニンの定量は、 以下の手順で行った。
20 Omgのシィタケ乾燥粉末に 4mlの 5 %過塩素酸を加え、 遠心分離で抽 出液を回収し、 得た抽出液を KOHで中和したのち、 活性炭カラムに添加し、 蒸 留水で洗浄後、 1. 4%アンモニア含有 50 %エタノールでェリタデニン画分を 溶出し、 遠心エバポレ一夕一で濃縮乾固した。
かくして得られたエリ夕デニン画分を、 5 mM臭化テトラ— n—プチルアンモ 二ゥム、 2 OmMリン酸水素二カリウム含有ァセトニトリルに溶解し、 液体クロ マトグラフィ一 （D e V e 1 o s i 1 RP Aqu e ou s 4. 5 X 25 0 m m装着、 流速 1. Om 1 Z分） で、 検出波長 260 nmで定量する。
このスクリーニングで、 子実体の発生収量及びその形態、 エリ夕デニン含量の 3項目について調べ、 出願人 （財団法人日本きのこ研究所） が保管する 「菌株番 号 8123、 C—04、 A— 123株」 を交配親として選定した。
選定した 「菌株番号 8123、 C— 04、 A— 123株」 のそれぞれの子実体 から、 担子胞子を採取して滅菌した蒸留水に懸濁した。
胞子濃度をへマトメータ一で計測し、 約 i x i 06s p o r e s Zm 1になる よう希釈してから、 同じ割合 （1 : 1 : 1) で混合して寒天平板培地に播種 （集 団交配） し、 温度 25 °Cで 1〜 2週間培養した後、 寒天平板培地 （直径 9 cmの シャーレ） に生育した菌糸を切り取り、 寒天斜面培地に接種した。
このような操作を、 1つの寒天平板培地について約 10本の寒天斜面培地 （試 験管） に接種して、 約 10枚の寒天培地から 100本の試験管に接種して培養し たのち、 培養した菌糸の成長先端を、 新しい寒天斜面培地 （試験管） に移してさ らに培養した。 この操作を数回繰り返すことによって、 均一な二核菌糸 （d i k a r y o n) を得た。
得た二核菌糸は、 菌床培地で栽培して子実体を収穫し、 その担子細胞を採取す ると同時に、 エリ夕デニン含量を測定した。
以上のように、 「菌株番号 8123、 C_04、 A— 123株」 の集団交配に よって、 約 100菌株の二核菌糸を栽培し、 子実体を形成した 81株についてェ リタデニン含量を測定した。
子実体発生量が多く、 なおかつエリ夕デニン含量の高かった 10株の胞子を、 さらに前述の操作のように集団交配して、 エリ夕デニン含量関連遺伝子の集積と 形質の安定化を図った。
このようにして F 2世代で、 菌傘部のエリ夕デニン含量が 17 OmgZl 00 gDW以上である子実体産生能を有する菌株を 3株得、 それらを 「H44」 「H 78」 「C 18」 と命名した。
なお、 それらの菌株を、 後述する培養条件で発生させた子実体中のエリタデニ ン含量は、 それぞれ
H44 ； 214mg/l 00 gDW
H78 ； 186mg/l 00 gDW
C 18 ； 184mg/l 00 gDW
である。
これら 3株のなかでも、 H44株は、 子実体の発生量及び発生期間で優れたも ので、 「Le n t i nu l a e d od e s H 44」 と表示し、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター （住所： 日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1 中央第 6) に、 「寄託番号 FERM BP_ 7852」 として寄 託した （寄託日 ：平成 12年 10月 6日） 。
以下に、 H44株の特性を示す。 H 44株の特性
H 44株の菌学的諸性質並びに生化学的性質は、 以下のとおりである。
傘色：茶褐色
形 ：円形で肉厚
鱗皮：繊維状
ひだ：密
柄色：肌色
1) ポテト ·デキストロース寒天培地 （PDA, D i f c o) における生育状態 温度 25 °Cでの菌糸成長は 4. 5mmZl日、 菌糸は白色で放射状に伸びる。 裏 面は一様で変色はない。
2) グルコース ·麦芽エキス ·酵母エキス寒天培地 （GMY、 1 %グルコース、 1%麦芽エキス、 0. 4%酵母エキス） における生育状態。
温度 25 での菌糸成長は 3. 5mm/ 1日、'菌糸は白色で放射状に伸びる。 裏面は一様で変色はない。
3) フエノールォキシダーゼ検定用培地
没食子酸 0. 1%添加により裏面が褐色になり、 白色腐朽菌の特徴を示す。
4) 最適生育温度ならびに各温度における生育速度
GMY寒天培地で予め前培養した菌糸をコルクポーラ一で打ち抜き、 PDA培 地および GMY培地に接種して 3日間培養したのち、 温度勾配培養装置を使用し て各温度で 5日間培養し、 その間の菌糸伸長を測定した。
その結果、 温度 15〜30°Cの範囲で良く生育し、 最適の温度は、 温度 25〜 26°Cであった。
5) 最適生育 pH
各 pHに調整した GMY液体培地に、 コルクポーラ一で打ち抜いた菌糸片を接 種し、 温度 25 で 30日間培養した。
集菌後、 乾燥重量から最適 pHは 4〜 5付近で、 生育範囲は 4〜7であった。 6) DN Aによる菌株識別
液体培地 （グルコース 1 %、 マルツエキス 1 %、 酵母エキス 0. 4 %) で培養 し、 凍結乾燥して粉末化した 50〜10 Omgの菌糸を、 1. 5ml遠心チュー ブに入れ、 約 0. 1mlの抽出用緩衝液 （ 1 % S D Sを含む 50 mMトリス塩酸 緩衝液： p H=8. 0、 5mM EDTA、 以下 TEという。 ） を加え、 同量の フエノール Zクロロフォルム混合液 （1 ： 1) を加えて混合し、 12， 000回 転で遠心分離したのち、 下層は捨て、 上層の液を回収して 2. 5倍量のェタノ一 ルを加えて DN Aを沈殿させた。
70 %エタノールでよく洗浄した後、 TEに溶かし、 リポヌクレアーゼ （RN a s e 20 gZm 1) 処理してフエノールで蛋白を除去した。
このようにして調整した DN Aは、 25 ng/ 1濃度になるように希釈した (参照： Ann e R. Kub e l i c L e s J. S z ab o、 Cu r r G e n e t (1995) 28、 384— 389) 。
P CR法による DNAの増殖には、 株式会社サヮデ一テクノロジ一の 「Sup e r T a q P r em i x」 に、 铸型となる菌糸の DN Aを 20 n gと、 0. 4 Mプライマ一を加え （反応液量 25 1) 、 パーキンエルマ一 アプライド バイオシステムス （PE Ap p l i e d B i o s y s t e m s ) 社製の 「G e n e Amp PGR Sy s t em 9700」 で DNAを増殖した。
増幅条件 （PCR) は、 以下のとおりである。
また、 PAPD法 （Rand om Amp l i f i e d P o l ymo r ph i c DNA) には、 オペロン （〇p e r o n) 社製の OPA— 04 (5 ' 一 A ATCGGGCTG) をプライマーにして、 また、 リポゾ一ム R N A遺伝子の非 翻訳領域（I n t e r Gen i e R e g i o n；以下、 「I GR2」と略す。） の一部（上流側
下流側（5' -
Figure imgf000010_0001
を、 プライマーにして DNAを増殖した。 <RAPD法 >
(温度 94°CX 5 min) 1 cycle
( (温度 94°CX 1 min) + (温度 36°CX 1 min) + (温度 72°CX 4 min) ) 45 cycle
(温度 72 °C X 10 min) 1 cycle
ぐ I G R 2法 >
(温度 94°CX 5 min) 1 cycle
( (温度 94°CX 1 min) + (温度 55°CX 1 min) + (温度 72°CX2.
5 min) ) 30 cycle
(温度 72°CX 5 min) 1 cycle
増幅産物は 1. 5%寒天ゲルで泳動し、 ェチヂゥムブ口ミドで染色した。
その結果、 OP A— 04をプライマーにして、 RAP D法では、 0. 4, 0.
65， 1. 05 kbの 3本の増幅 DNA断片（図 1参照）が、 I GR法では、 1. 1， 0. 88, 0. 64 k bの 3本の増幅 DNA断片 （図 2参照） が検出された が、 その電気泳動パターンで、 いずれも既存のシィタケ栽培種とも、 識別が可能 であった。
7) 子実体形成における最適温度
ブナとコーンブランを重量比 4 ： 1で混合し、 水分を 65%に調整した 1. 3 k gの菌床を 120日間培養 （温度 22〜 23 °C) したのち、 温度 10〜 28 °C の条件下で子実体を発生させたところ、 その結果、 いずれの範囲でも初回の発生 で 57〜204 gの子実体を発生し、 適応温度は広い特性を有していた。
<培養例 1 >
ブナとコーンブランを重量比 4 ： 1で混合し、 水分を 65%に調整した培地を プラスチック製の培養袋に 1. 3 kg詰め込み、 温度 121°Cで 90分間殺菌し たのち、 培地に菌株 H 44を接種した。
比較のため、 従来菌を同時に接種し、 接種後は温度 22〜23°C、 湿度 70% の条件下で 90〜120日間培養した。
その後、 培養袋を取り除き温度 17°C、 湿度 90%、 明条件下で子実体を発生 させた。
その結果を表 1に示す。
表 1から明らかなように、 初回の子実体体発生量は 135 gZl. 3 kg菌床 で、 エリ夕デニン含量は 214mg/l 00 gDWと、 従来品に比べ約 2. 4倍 であった。
表一 1
Figure imgf000012_0001
<培養例 2 >
また、 空調発生室の温度を、温度 17 °C、 温度 25° (：、 温度 28 °C及び 温度 30°Cとして栽培試験を行い、 子実体を発生させ、 その子実体中のエリ夕デ ニン含量を測定したところ、 表 2に示されるように、 子実体生育時の温度が高い ほど、 その値は高くなり、 温度 30°Cでは 393mgZl 00 gDWで、 温度 1 7 °Cで栽培した子実体の約 2倍の含量であつた。
表 _2
エリ夕デニン含量
栽培温度
(m g / 100 gDW)
17°C 184
25°C 205
28°C 227
30°C 393 <培養例 3 >
培養例 2において、 子実体生育時の温度が高いほど、 子実体中のエリ夕デニン 含量が多くなることが見出されたため、 栽培品種として市販されている菌株 （森 産業株式会社 「活活」 ） について、 温度 1 7 Xで子実体原基を形成させた後、 空 調発生室の温度を、温度 1 7 °C、温度 2 5 °C、温度 2 8 ° (：、温度 3 0 °C、温度 3 2 °C 及び温度 3 5 °Cとして、 子実体を生育させ、 その子実体中のエリタデニン含量を 測定したところ、表 2に示されるように、温度が高くなるに伴い含量も高くなり、 子実体生育の上限温度 3 2 °Cで最高に達し、 その時の含量は 1 7 °Cで栽培した子 実体の約 6 . 2倍であった。
表一 3
Figure imgf000013_0001
産業上の利用分野
この発明で得られるシィ夕ケ子実体は、 コレステロール低下作用をもつエリ夕 デニンを多く含み、 なおかつ収量性がきわめて良好で、 滋養食品として、 さらに は健康食品素材として、 新規需要が期待されるという優れた効果を奏するもので ある。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 菌傘部に、 エリ夕デニンを 17 Omgノ 100 gDW以上含有することを特 徴とするシィタケ子実体。
2.菌傘部のエリ夕デニン含量が 170mg/100 g DW以上である子実体を、 温度 15〜20°Cの条件下で培養により産生する能力を有することを特徴とする レンチヌラ ·工ドテス (L e n t i n u 1 a e d od e s) 。
3. 寄託番号 F ERM BP— 7852を有するレンチヌラ ·ェドデス （L e n t i nu l a e d o d e s ) に属する新規な菌株 H 44。
4. 公知のレンチヌラ ·エドデス （Le n t i nu l a e dod e s) の中か ら、 エリ夕デニン産生能の高いものを複数選択し、 集団交配育種して、 菌傘部の ェリタデニン含量が 17 Omg/100 gDW以上である子実体を、 常温培養に より産生する能力を有するレンチヌラ ·ェドデス （L e n t i nu l a e d o d e s ) を取得することを特徴とするレンチヌラ ·エドデス （Le n t i n u 1 a e d od e s) の育種方法。
5. レンチヌラ ·エドデス（L e n t i nu 1 a e d o d e s )を原基形成後、 温度 25〜34°Cの条件下に培養して子実体を形成させることを特徴とするレン チヌラ ·ェドデス （L e n t i nu l a e do d e s) の栽培方法。
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