WO2002053730A1 - Nouveau canal potassique - Google Patents

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WO2002053730A1
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Hiromichi Yokoi
Kohei Inamura
Yorikata Sano
Akira Miyake
Shinobu Mochizuki
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Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a novel power realm channel. Background art
  • the glands secrete insulin, a glycemic control hormone, from cells according to the glucose concentration in the blood to regulate blood glucose. Insulin deficiency causes chronic hyperglycemia and diabetes with various characteristic metabolic abnormalities.
  • Glucose taken up by iS cells is metabolized to produce various metabolites including ATP.
  • ATP-sensitive potassium (K +) channels K ATP channels
  • K ATP channels ATP-sensitive potassium channels
  • the K ATP channel has eight subunits, that is, four Kir6.2 subunits and four SUR (Sulphonylureareceptor) subunits, unless a channel structure is formed by associating the K ATP channel. Does not work.
  • the K ATP channel subsystem Kir6.2 is expressed in the mucous membrane, brain, heart muscle, skeletal muscle, etc., but in the kidney, ⁇ ⁇ r6.2 and SUR1 (SuI phonylureareceptor). 1) (I nagak ⁇ N. et al., Science, 270, 1166-1170, 1995; and Seino S. et al., Diabetes, 49, 311- 31 8, 2000) o
  • Dominant-negative transgenic mice with Kir6.2 showed increased resting membrane potential and increased intracellular calcium ion concentration in knee cells, indicating hyperinsulinemia and hypoglycemia (Miki et al., Pro c. N atl. Ac a d. S c, USA, 94, 1 969—1 973).
  • KATP channel inhibitors cause depolarization of the cell membranes of the three cells and promote secretion of inulin.
  • One of the most commonly used is SU (Sulphonylurea), which binds to the SUR1 subunit.
  • SU agents are known to have a disadvantage that they become ineffective secondary to the exhaustion of knee cells (Groop et al., Am. J. Med., 87, 183-190, 1989). Shigeta et al., Dictionary of Diabetes Therapy, Kyoikushoin, 1996).
  • glucose-stimulated insulin secretion is reduced in type 2 diabetes.
  • a non-obese type 2 diabetes model rat W-star rats were selected and mated in 1975 using the glucose tolerance test as an index, and were examined by patch clamp method whole cell recording (whole cell II recording).
  • patch clamp method whole cell recording whole cell II recording.
  • GK rats a non-obese type 2 diabetes model
  • activation of voltage-dependent Ca 2+ channels by depolarization stimulation was enhanced as compared to controls (Ka to S.
  • An object of the present invention is to provide a screening tool and a simple screening method for obtaining a substance useful as a therapeutic agent for diabetes, the mechanism of action of which is to increase the excitability of the knee ⁇ cells and promote insulin secretion. To provide a system.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-described problems, and as a result, obtained a human-derived polynucleotide encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 that is remarkably expressed in the knee, and Each rat or mouse-derived polynucleotide was obtained. Next, each polynucleotide is expressed, and the background By confirming the properties of the lithium channel, the present inventors have provided a useful tool for screening a therapeutic agent for diabetes, particularly an inulin secretion promoting agent. In addition, the present inventors constructed a system capable of easily detecting the potassium channel activity of the present invention and provided a simple method for screening a therapeutic agent for diabetes, particularly an insulin secretagogue, thereby completing the present invention.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 and exhibiting a background potassium channel activity, or (2) SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, in which 1 to 10 amino acids include a substituted, deleted, and / or inserted amino acid sequence, and further, have a background potassium channel activity.
  • Peptide
  • a polynucleotide comprising an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 and exhibiting a background rheumatoid channel activity.
  • polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 and having background potassium channel activity;
  • a method for detecting whether or not the test compound suppresses the polypeptide comprising a step of analyzing whether or not the polypeptide according to [4] is suppressed;
  • a method for screening a therapeutic agent for diabetes comprising a detection step according to the method of [9].
  • Figure 1 shows L929 cells transfected with the plasmid pI RES neo2-hPS I (A) or control vector (B), with the membrane potential clamped by whole-cell membrane voltage clamp.
  • 9 is a graph showing observation results of outward currents excited when a depolarizing pulse is given.
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10;
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 In one or more positions of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10, one or more amino acids are substituted, deleted, and / or inserted as a whole.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence and exhibiting background potassium channel activity hereinafter, referred to as a functionally equivalent variant
  • polypeptides comprising an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 and exhibiting a background rheumatoid channel activity ( Hereinafter, referred to as homologous polypeptides).
  • polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 as the polypeptide of the present invention is represented by SEQ ID NO :, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10
  • the polypeptide is not particularly limited as long as it is a polypeptide containing the amino acid sequence of the present invention and showing background potassium channel activity.
  • a fusion consisting of an amino acid sequence having an appropriate marker sequence added to the N-terminal and / or C-terminal of a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and exhibiting background rheumatoid channel activity A polypeptide;
  • polypeptides of the present invention which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • SEQ ID NO: 2 is a novel human-derived background potassium channel protein consisting of 294 amino acid residues.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is a protein that is remarkably expressed in fl extract as shown in Example 4 described later.
  • polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is a novel background force domain channel protein derived from a rat consisting of 292 amino acid residues.
  • polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is a novel mouse-derived background potassium channel protein consisting of 292 amino acid residues.
  • TALK-1 which is a background potassium channel specifically expressed in Teng.
  • this channel can be used for screening for therapeutic agents for diabetes, and that suppression of this channel suppresses the secretion of linjuulin. There is no disclosure.
  • marker sequence in the polypeptide of the present invention for example, a sequence for easily confirming expression of the polypeptide, confirming intracellular localization, or purifying can be used.
  • test polypeptide a certain polypeptide “generates a current due to voltage stimulation”, and “a current is instantaneously generated and inactivated by the test polypeptide”.
  • a test polypeptide “generates a current due to voltage stimulation”
  • a current is instantaneously generated and inactivated by the test polypeptide”.
  • a method known to those skilled in the art Hi Ile, B., Ionic Channels of Exc ⁇ tab I e Memb ranes, 2nd Ed., Sinauer A ssociates Inc., MA, 19992
  • the following method preferably, The method described in Example 6 can be used.
  • test polypeptide was transfected with an expression vector containing a polynucleotide encoding the test polypeptide, and the resulting cells were subjected to membrane potential fixation by a whole-cell membrane potential fixation (whole-eel I voltag eclamp) method.
  • a depolarizing pulse of OmV is applied for a holding potential of 8 OmV to 400 msec. If an outward current is generated by the depolarizing pulse, the test polypeptide can be determined as “a current is generated by voltage stimulation”. In addition, if the outward current generated by the depolarizing pulse is instantaneously induced and no inactivation is observed, the test polypeptide may state that “current is instantaneously induced and inactivated. No "can be determined.
  • the test polypeptide can be determined whether or not the potassium ion selectivity is high J by a method known to those skilled in the art (H ⁇ IIe, B., Ionic Channelsoftxcitab Ie Membranes, 2nd td., Sinauer As sociates Inc., MA, 19992), which is not particularly limited.
  • H ⁇ IIe, B., Ionic Channelsoftxcitab Ie Membranes, 2nd td., Sinauer As sociates Inc., MA, 19992 preferably, Example 7 described later
  • cells can be transfected with an expression vector containing a polynucleotide encoding the test polypeptide, and the obtained cells can be whole-cell S megapotential-clamped.
  • test polypeptide has “high potassium ion selectivity”.
  • the functionally equivalent variant of the present invention comprises one or more amino acid sequences as a whole at one or more positions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10.
  • an amino acid in which 1 to several amino acids are deleted, substituted, and / or inserted as a whole is not particularly limited as long as it is a polypeptide containing a sequence and showing background potassium channel activity, and its origin is not limited to human, rat, or mouse.
  • a human variant of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 a rat variant of the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, or a variant represented by SEQ ID NO: 10
  • mutants of the polypeptide having the amino acid sequence of the present invention but also functionally equivalent variants derived from organisms other than human, rat, or mouse (eg, hamster or dog).
  • polynucleotides encoding those natural polypeptides ie, variants derived from human, rat, or mouse, or functionally equivalent variants derived from organisms other than human, rat, or mouse are used.
  • the encoded amino acid sequence was artificially modified by genetic engineering.
  • Polypeptides produced using polynucleotides and the like are included.
  • the term "variant" (V ar i a tion) in Honmyo Saisho individual differences observed in the same polypeptide within the same species, or means the difference seen in the homologous polypeptides between several I do.
  • Specific examples of the functional equivalent variant of the present invention include, for example, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 consisting of an amino acid sequence in which six amino acids are substituted.
  • Polypeptides may be mentioned.
  • a mutant in a human of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, a variant in a rat of a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, represented by SEQ ID NO: 10 A variant of a polypeptide consisting of an amino acid sequence in a mouse, or a functional form derived from a human, rat, or organism other than a mouse
  • SEQ ID NO: 10 for example, SEQ ID NO: 1).
  • a sequence consisting of nucleotides 13 to 897 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; a sequence consisting of nucleotides 36 to 914 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5; or SEQ ID NO: 9 The sequence can be obtained on the basis of the information of the base sequence represented by the first to 879 incense bases. Genetic recombination technology, unless otherwise specified, known methods (for example, Maniatis, T.b, Molecular Cloning—Aboratory Manual, Cold Spring Laboratory, NY, 1 982).
  • an appropriate primer or probe is designed based on information on the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10.
  • a sample eg, a total RNA or mRNA fraction, c
  • the target organism eg, a mammal (eg, a human, a mouse, a rat, a hamster, or a dog)].
  • P ⁇ Polymerase chain reaction
  • a polynucleotide encoding the polypeptide is obtained, and the polynucleotide is expressed using an appropriate expression system.
  • the method described in Example 6 it was confirmed that a current was generated by the depolarizing pulse, and that the current was instantaneously generated and did not inactivate. Further, potassium ion was selected by the method described in Example 7. By confirming that the polypeptide is highly soluble, a desired polypeptide can be obtained.
  • the above-mentioned polypeptide which has been artificially modified by genetic engineering can be obtained by a conventional method, for example, site-specific mu tagenesis (ark, DF et al., Proc. Natl. Ac a d. Obtain a polynucleotide encoding the polypeptide from Sc, USA, 81, 5662-5666, 19984), express the polynucleotide using an appropriate expression system, For example, it was confirmed that the expressed polypeptide was generated by a depolarization pulse according to the method described in Example 6, and that the current was instantaneously induced and did not inactivate, and further described in Example 7. By confirming that potassium ion selectivity is high by the method described above, a desired polypeptide can be obtained.
  • the functional equivalent variant of the present invention includes one or more (preferably 1 to 10) amino acids at one or more positions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10.
  • the homologous polypeptide of the present invention comprises an amino acid sequence having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10, further comprising a background potassium channel
  • homologous polypeptides of the present invention may be homologous to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10.
  • the polypeptide contains an amino acid sequence of 95% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more, and further shows a knock-ground potassium channel activity.
  • a specific example of a homologous polypeptide having 90% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 includes, for example, a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the term "homology” as used herein refers to the term "Clustalprogram” (Higgs ns and Sharp, Gene, 73, 237-244, 1988; and D1111 pson et al., Nucleic Ac idRes., 22, 4673—4680, 1994) means the value obtained using the default parameters. The above parameters are as follows.
  • polypeptide of the present invention has been described.
  • ⁇ a polypeptide J consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; and a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6
  • the polypeptide exhibiting a background potassium channel activity has a homology of 90% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10.
  • polypeptide exhibiting background potassium channel activity (preferably 95% or more, more preferably 98 ⁇ 1 ⁇ 2 or more, and still more preferably 99% or more).
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotides of Nos. 13 to 897 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be used.
  • a polynucleotide consisting of a sequence consisting of the base No. 79 can be mentioned.
  • the term “polynucleotide” in the present specification includes both DNA and RNA.
  • the method for producing the polynucleotide of the present invention is not particularly limited. Examples of the method include (1) a method using PCR, (2) a conventional genetic engineering method (that is, a method using a single cDNA library). (A method of selecting a transformed strain containing the desired cDNA from the transformed transformant), or (3) a chemical synthesis method. Can be. Hereinafter, each manufacturing method will be sequentially described.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the following procedure.
  • mRNA is extracted from human cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention.
  • a pair of two primer sets capable of sandwiching the full length of the mRNA corresponding to the polypeptide of the present invention, or a part thereof Create a pair of primer sets that can sandwich the mRNA region.
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • total RNA including mRNA encoding the polypeptide of the present invention is extracted from cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention by a known method.
  • the extraction method include a guanidine 'thiosinate' hot-phenol method, a guanidine 'thiosine-to-guanidine-hydrochloric acid method, and a guanidine-thiosinate cesium chloride method. Preferably, it is used.
  • Cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention include, for example, a Northern blotting method using a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention or a part thereof, or a polypeptide or a polynucleotide of the present invention. It can be identified by a Western blotting method using an antibody specific for the peptide.
  • mRNA is purified.
  • Purification of mRNA can be performed according to a conventional method. For example, mRNA can be purified by adsorbing it to an oligo (dT) cellulose column and then eluted. If desired, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. Also, without extracting mRNA, commercially available extracted and purified mRNA can also be used.
  • the purified mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of, for example, a random primer, an oligo dT primer, and a primer synthesized in a customary manner, to synthesize first-strand cDNA.
  • This synthesis can be performed by a conventional method. Wear.
  • PCR can be performed using two types of primers sandwiching the full length or a partial region of the target polynucleotide to amplify the target cDNA.
  • the obtained DNA is fractionated by agarose gel electrophoresis or the like. If desired, the desired DNA fragment can be obtained by cleaving the DNA with a restriction enzyme or the like and connecting it.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the following procedure.
  • a single-stranded cDNA was synthesized using a reverse transcriptase, and then a double-stranded cDNA was synthesized from the single-stranded cDNA.
  • the method include the S1 nuclease method (E fstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), and the Land method (L and, H. et al., Nucleic Acid Res Res. , 9, 2251 -2266, 1981), 0. Joon Yoo method (Yoo, OJ et al., Proc. Natl. Ac a d. Sc in USA, 79, 1049-1 053, 1983), or the Okay ama—Berg method (Okayama, H. and Berg, P., Mo for Cell to Biol., 2, 161-170, 1982), etc. be able to.
  • a recombinant plasmid containing the double-stranded cDNA is prepared, and then introduced into E. coli (for example, strain DH50?) For transformation.
  • E. coli for example, strain DH50
  • the combination is performed based on drug resistance to tetracycline or ampicillin as an index. Select a conversion.
  • the transformation of the host cell is carried out by the method of Hanahan (Hanahan, DJ, Mo, Biol., 166, 557-580, 19983). 2
  • the method can be carried out by adding the recombinant DNA to competent cells prepared in the presence of MgC I 2 or RbC I.
  • a phage vector such as a lambda system can be used in addition to the plasmid.
  • Methods for selecting a transformant having the desired cDNA from the thus obtained transformants include, for example, the following U) a transformant screening method using a synthetic oligonucleotide probe, (ii) ) Professionals created by PCR (Iii) a transformant screening method using an antibody against the polypeptide of the present invention, or (iv) a transformant screening method using background cancer channel activity as an index. can do.
  • a transformant having the desired cDNII can be selected by the following procedure.
  • a nitrocellulose filter in which the DNA of the transformant was denatured and fixed was synthesized by synthesizing an oligonucleotide corresponding to all or a part of the polypeptide of the present invention and using it as a probe (labeled with 32 P or 33 P). Hybridize with the strain, search for the obtained positive strain, and select it.
  • the nucleotide sequence may be derived using codon usage, or a plurality of nucleotide sequences obtained by combining possible nucleotide sequences may be used. Can also.
  • a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure.
  • oligonucleotides of a sense primer and an antisense primer corresponding to a part of the polypeptide of the present invention are synthesized, and PCR is performed by combining them to encode all or a part of the target polypeptide. Amplify the DNA fragment.
  • type ⁇ DNA used herein cDNA or genomic DNA synthesized by reverse transcription reaction from mRNA of a cell producing the polypeptide of the present invention can be used.
  • the DNA fragment prepared in this way is labeled with, for example, 32 P or 33 P, and colony hybridization or plaque hybridization is performed using the labeled DNA as a probe to obtain a DNA having the desired cDNA.
  • Select convertible strain is performed using the labeled DNA as a probe to obtain a DNA having the desired cDNA.
  • a transformant having the desired cDNA can be selected, for example, by the following procedure. That is, cDNA is previously integrated into an expression vector, polypeptide is produced on the cell surface of the transformed strain, and a desired antibody is produced using an antibody against the polypeptide of the present invention and a secondary antibody against the antibody. A polypeptide-producing strain is detected, and a transformant having the desired cDNA is selected.
  • a transformant having a target cDNA can be selected by the following procedure.
  • cDNA is previously integrated into an expression vector, polypeptides are produced on the cell surface of the transformed strain, and the desired polypeptide producing strain is detected using the background force channel activity as an index, and Select a transformant having cDNA.
  • a method for collecting the polynucleotide of the present invention from the obtained transformant of interest can be obtained by a known method (for example, Maniatis, T. et al., "Molecular CI oning—A Laboratory Manual 'Cold Spring H”). arbor La boratory, NY, 982) For example, by separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and cutting out the cDNA region from the obtained plasmid DNA. Can be done.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by binding the DNA fragment produced by the chemical synthesis method.
  • Each DNA can be synthesized using a DNA synthesizer [for example, Oligo 100 OM DNA Synthesizer (manufactured by Beckman), or 394 DNA ZRNA Synthesizer (manufactured by App Ied Biosystems)]. it can.
  • the polynucleotide of the present invention can be prepared, for example, by the phosphate triester method (Hunkap IIer, M. et al., Nature, 10, 105-11-1) based on the information of the polypeptide of the present invention. , 1984)), and can be produced by chemical synthesis of nucleic acids.
  • the codon for the desired amino acid is known per se, and the selection may be arbitrary.
  • the codon usage of the host to be used Can be determined according to a conventional method (Cranth am, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981).
  • partial modification of the codons of these nucleotide sequences can be performed by a site-directed mutagenesis using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification in a conventional manner; ⁇ (sitespecific mu tagenesis) ( Sc. Natl. Ac Ad. Sc, Mark, DF et al., USA, 81, 5662-5666, 19984).
  • Eukaryotic or prokaryotic host cells can be transfected by reintegrating the isolated polynucleotide of the present invention into the appropriate vector DNA. Also, by introducing an appropriate promoter and a sequence involved in expression into these vectors, the polynucleotide can be expressed in each host cell.
  • the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention may be added to a known expression vector appropriately selected according to the host cell to be used. And an expression vector obtained by insertion.
  • the cells of the present invention are also not particularly limited as long as they are transfected with the expression vector of the present invention and contain the polynucleotide of the present invention. It can be a cell integrated into the chromosome of the present invention, or a cell containing the polynucleotide of the present invention in the form of an expression vector. In addition, the cells can be cells expressing the polypeptide of the present invention, or can be cells expressing the polypeptide of the present invention. It can be a cell that does not exist. The cell of the present invention can be obtained, for example, by transfection of a desired host cell with the expression vector of the present invention.
  • eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects, and yeast.
  • vertebrate cells include monkey COS cells (GIzman, Y., C. e II, 23, 175-182, 1981), a dihydrofolate reductase-deficient strain of Chinese hamster ovary cells (CHO) (UrI aub, G. and C hasin, shi. A., Proc. Ac at Ad.
  • Example 9 human fetal kidney-derived HEK293 cells, 293- EBN A cells (InV Itrogen) in which Epstein-Barr virus EBN A-1 gene was introduced into EK293 cells, and L 929 cells (ATCC: CRL-2148) used in Example 5 described below. Can be mentioned.
  • vertebrate cell expression vectors those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, and the like, which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. With this, it is possible to have a replication origin.
  • the expression vector include, for example, pSV 2 dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al., Mo. Cell. Biol., 1, 854-864, 19981), P EF—BOS (Mizushima, S.
  • COS cell When a COS cell is used as a host cell, it has an SV40 origin of replication as an expression vector, is capable of autonomous growth in COS cells, and has a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice site.
  • pME18S Maruyama, K. and Takebe, Y., Med. Immun, 20, 27-32, 1990
  • pME18S E FB OS Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 8, 5322, 1990
  • pCDM8 S eed, B., Nature, 329, 840-842, 1 987.
  • the expression vector is, for example, a DEAE-dextran method (Lutman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1, 295-1308, 1983), calcium phosphate, (I) DNA co-precipitation method (Graham, FL, and vander Ed, AJ, Virology, 52, 456-457, 1973), a commercially available transfection reagent (for example, FuGENE TM 6 Transcription Reagent) Roche Diagnostics), or by electric pulse perforation (Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982). Can be made.
  • a DEAE-dextran method Litman, H. and Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1, 295-1308, 1983
  • calcium phosphate (I) DNA co-precipitation method (Graham, FL, and vander Ed, AJ, Virology, 52, 456-457, 1973), a commercially available transfection reagent
  • a vector capable of expressing a neo gene functioning as a G418 resistance marker together with an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention for example, pRSVn eo (S amb rook, J., Mo lecular Cloning AL ALboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator, NY, 1989) or pSV2-neo (S outhern, PJ and Berg, P., J. , 1, 327-341, 1982) etc. are transfected into Mo and Ap, and the G418-resistant colonies are selected to stably produce the polypeptide of the present invention. Transfected cells can be obtained.
  • pRSVn eo S amb rook, J., Mo lecular Cloning AL ALboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborator, NY, 1989
  • pSV2-neo S outhern, PJ and Berg, P., J. , 1, 327-341, 1982
  • p CEP4 Invitrogen
  • p CEP4 which has an Epstein-Barr virus replication origin as an expression vector and is capable of self-replication in 293-EBNA cells. It is easy to use such as.
  • the cells of the present invention can be cultured according to a conventional method (for example, edited by The Biochemical Society of Japan, “New Biochemistry Experiment Course 18 Cell Culture Technology”, Tokyo Chemical Dojin, 1990). By culturing, the polypeptide of the present invention is produced intracellularly or on the cell surface.
  • a medium that can be used for the culture various types of commonly used media can be appropriately selected depending on the host cell used.
  • serum components such as fetal calf serum (FBS) are added to a medium such as RPMI-1640 medium or Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM) as necessary. Medium can be used.
  • FBS fetal calf serum
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium
  • 293-EBNA cells use a medium such as Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium (DMEM) supplemented with serum components such as Fetal Serum Serum (FBS) plus G418. can do.
  • the polypeptide of the present invention produced in the cell of the cell or on the surface of the cell can be obtained by various known methods utilizing the physical properties and biochemical properties of the polypeptide.
  • cells containing the polypeptide of the present invention are cultured by culturing cells expressing the polypeptide of the present invention on the surface thereof, suspending them in a buffer, homogenizing the mixture, and centrifuging the suspension.
  • a cell membrane fraction can be obtained.
  • the polypeptide of the present invention can be purified by chromatography, affinity mouth chromatography, high performance liquid chromatography (HP LC), or the like, or dialysis, or a combination thereof.
  • a mild solubilizer eg, CHAPS, Triton X-100, or dichitonin
  • Characteristics can be maintained.
  • the fusion of the polypeptide of the present invention with a marker sequence in-frame facilitates confirmation of expression of the polypeptide of the present invention, confirmation of intracellular localization, or purification.
  • the marker sequence include a FLAG epitope, a hexifer histidine 'tag, a hemagglutinin' tag, and a mycepitope.
  • a protease eg, enterokinase, factor Xa, or thrombin
  • the marker sequence can be cleaved and removed by these proteases by inserting a specific amino acid sequence recognized by the protease.
  • a muscarinic phosphatidylcholine receptor is linked to a hexahistidine 'tag by a thrombin recognition sequence (Hayashi, MK and Haga, T., J. Biochem., 1, 20, 1). 232-1238, 1996).
  • the cells of the present invention in which the polypeptide of the present invention has been expressed it is possible to detect whether or not the test compound suppresses the polypeptide of the present invention. Further, by using the detection method of the present invention, a substance that suppresses the polypeptide of the present invention can be screened.
  • the polypeptide of the present invention is a background potassium channel that is significantly expressed in the kidney.
  • Membrane potential of cells, N a + inside and outside the cell, K +, CI-, or C a 2 + are determined by the distribution of inorganic ions responsible charge such as the charge distribution, various constituted by membrane proteins It depends on the opening and closing of the ion channel. Therefore, the opening and closing of ion channels plays an important role in changing the membrane potential.
  • the potassium channel a membrane protein that selectively permeates potassium ions, is thought to be involved in maintaining the resting membrane potential and repolarizing the membrane potential after depolarization, etc. It is one of the good targets for controlling excitability. This fact indicates that the inhibitor of the potassium channel of the cell has the effect of increasing the excitability of the cell by causing the membrane potential to shift toward the depolarization side.
  • the force Riu ⁇ channel functionally, membrane potential-dependent (voltage- gated) potassium channels, Ca 2+ dependency (Ca 2 + - activated) force Liu Muchaneru, A TP-dependent (A TP- sensitive) potassium channel It is classified into potassium channel, inward rectifier, and potassium channel in the background. Among them, the background potassium channel has the property of being open under the resting membrane potential, and is therefore considered to greatly contribute to the control of the resting membrane potential (Lesage et al., EMBO J. Phys. , 1 5, 1004, 1996; and D up rat et al., EMBO J., 16, 5464, 1 997).
  • insulin secretion occurs due to the shift of the membrane potential to the depolarized side (Henquin, J et al., Joslin's Diabetes Me II itus, 13 ted., Le a &. F ebiger, Pennsylvania, 56-80, 1994; Ascroft, FM et al., Insulin: Molecular Biology to Pathology, IRL press, Ox ford, 97-150, 1992).
  • drugs that increase excitability of the (knee) 8 cells are thought to cause insulin secretion.
  • the polypeptide of the present invention exhibits the properties of a background force channel under the same pH conditions as in physiological conditions, and thus is useful for maintaining resting membrane potential and repolarizing the membrane. It is thought to be involved. Therefore, the inhibitor of the present invention for a polypeptide is considered to be useful as a therapeutic agent for diabetes having an action mechanism of increasing excitability of Teng8 cells and promoting insulin secretion. Therefore, the cell of the present invention itself can be used as a screening tool for a therapeutic agent for diabetes (particularly, an inhibitor of the polypeptide of the present invention).
  • suppressing means suppressing the channel function of the polypeptide of the present invention, and by suppressing the expression of the polypeptide. Including the suppression of channel functions.
  • test compound that can be subjected to the detection method or screening method of the present invention is not particularly limited.
  • various known compounds (including peptides) registered in a chemical file, combinatorial compounds, and the like can be used.
  • B. A group of compounds obtained by the chemistry technique (Terrett, NK et al., Tetrahedron, 51, 81 35-81 37, 1995) or a phage display method (Felici, F. et al., MoI. B). iol., 222, 301 1 310, 1991) can be used.
  • culture supernatants of microorganisms, natural components derived from plants or marine organisms, or animal tissue extracts can also be used as test compounds for screening.
  • a compound (including a peptide) obtained by chemically or biologically modifying a compound (including a peptide) selected by the screening method of the present invention can be used.
  • the detection method of the present invention includes a step of bringing the cell of the present invention into contact with a test compound, and a step of analyzing whether or not the polypeptide is suppressed.
  • the detection method of the present invention is directed to a cell of the present invention in which the polypeptide of the present invention is expressed so as to function as a background column channel (ie, an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention).
  • a background column channel ie, an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the substance that suppresses the polypeptide of the present invention which is useful as a therapeutic agent for diabetes, is detected using the voltage-clamping method of the above (1), in particular, the whole-cell membrane voltage-clamping method
  • the cell of the present invention in which the polypeptide is expressed on the cell surface is subjected to voltage-clamping by a voltage-clamp method, particularly a whole-cell membrane voltage-clamp method, and the total cell current of the cell in the presence of the test compound is measured.
  • analyzing ie, measuring or detecting
  • the cells of the present invention in which the polypeptide of the present invention is expressed on the cell surface are subjected to the voltage-clamp method, particularly Contacting the cell with a test compound in a state where the membrane potential is fixed by a membrane potential fixing method, and analyzing a change in whole cell current in the cell.
  • test compound when a test compound is added to the extracellular fluid of a cell whose membrane potential is fixed at a holding potential of 40 mV, if the outward current is suppressed, the test compound suppresses the polypeptide of the present invention. It can be determined that the substance is a chemical substance.
  • the polypeptide of the present invention is used.
  • the amount of radioactivity released outside the cell when the test compound is added is analyzed ( That is, it is analyzed whether or not the polypeptide of the present invention is suppressed by measurement or detection (Maingret et al., J. Bio, Chem., 274, 1381, 1999).
  • radioactive isotope rubidium (86 Rb +) ions in the cells of the present invention that the Poribe peptide of the present invention was expressed on the cell surface, radioisotope rubidium (86 After incorporating the Rb +) ions, a step of contacting the cells with a test compound and a step of analyzing the amount of radioactivity released outside the cells of the cells are included.
  • This detection makes use of the property that potassium channels are generally able to pass rubidium ions, similar to potassium ions. More specifically, it is preferable to carry out the method described in Example 10 below.
  • the cells of the present invention that the polypeptides of the present invention was expressed on the cell surface 86
  • rubidium ( 86 Rb +) ions can be taken into the cells.
  • the cells are washed with a solution containing potassium ions at a normal concentration (eg, 2.5 mmo I ZL) to remove unincorporated rubidium ( 86 Rb +) ions.
  • a solution containing potassium ions at a normal concentration eg, 2.5 mmo I ZL
  • rilvidil ( 86 Rb +) ions are released from the cells.
  • Poribe peptide of the present invention is suppressed reduction Can be analyzed.
  • analyzing ie, measuring or detecting) the radioactivity released outside the cells when the test compound is added, a substance that suppresses the polypeptide of the present invention can be detected.
  • the polypeptide of the present invention is applied to the cell surface.
  • the change in the fluorescence intensity of the dye in the cells when a test compound is added is analyzed (that is, measured or detected), whereby the present invention is obtained. Analyze whether the polypeptide of the invention is suppressed.
  • the cell of the present invention in which the polypeptide of the present invention is expressed on the cell surface, incorporates the membrane potential-sensitive dye into Contacting with a compound; and analyzing a change in the fluorescence intensity of the dye in the cell.
  • This detection utilizes the property that the membrane potential-sensitive dye can optically detect changes in membrane potential associated with the opening of potassium channels.
  • Di BAG bis- (1,3-dibutylbarbituricaci ⁇ trime thineoxonol; manufactured by Molecular Probe
  • the membrane potential-sensitive dye Di BAG [bis- (1,3-dibutylbarbituricaci ⁇ trime thineoxonol; manufactured by Molecular Probe) or a derivative thereof
  • the dye of (1) the activity of the polypeptide of the present invention can be analyzed (that is, measured or detected).
  • By comparing the change in the fluorescence intensity of the dye in the presence and absence of the test compound It is possible to detect a substance that suppresses the polypeptide of the present invention. Then, the fluorescence intensity increases.
  • the therapeutic agent for diabetes of the present invention detects whether or not a test compound suppresses the polypeptide of the present invention. Based on the results, a substance that suppresses the polypeptide of the present invention or a therapeutic agent for diabetes is selected. More specifically, for example, the test compound is brought into contact with the cells of the present invention in which the polypeptide of the present invention has been expressed, and the presence or absence or degree of inhibition of the polypeptide in the presence of the test compound is determined. As an index, a substance that suppresses the polypeptide of the present invention or a therapeutic agent for diabetes can be selected.
  • An antibody that reacts with the polypeptide of the present invention (for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) can be obtained by directly administering the polypeptide of the present invention or a fragment thereof to various animals.
  • the DNA vaccine method (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. , 9519-952, 3 994; or Donnelly, JJ et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996).
  • the polyclonal antibody was sensitized, for example, by immunizing an emulsion obtained by emulsifying the polypeptide of the present invention or a fragment thereof in an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) in the abdominal cavity, subcutaneous region, or vein. It can be produced from serum or eggs of animals (eg, egrets, rats, goats, or chickens).
  • a polyclonal antibody can be separated and purified from the serum or eggs thus produced by a conventional polypeptide isolation and purification method. Examples of such separation and purification methods include centrifugal separation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatographic method with DEAE-cellulose, hydroxyapatite, or protein A agarose. .
  • Monoclonal antibodies can be readily produced by those skilled in the art, for example, by the cell fusion method of Koehler and Milstein (Koh Ier, G. and M ⁇ Istein, C., Nature, 256, 495-497, 1975). It is possible to That is, an emulsion obtained by emulsifying the polypeptide of the present invention or a fragment thereof in an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) is repeatedly inoculated several times into the abdominal cavity, subcutaneous, or vein of a mouse every few weeks. Immune by. After the final immunization, spleen cells are removed and fused with myeloma cells to produce hybridomas.
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • Myeloma cells for obtaining hybridomas include, for example, myeloma cells having markers such as hypoxanthine-guanine-phospholiposyltransferase deficiency or thymidine kinase deficiency (for example, mouse myeloma cell line P3X63 Ag8.U1) can be used.
  • the fusion agent for example, polyethylene daryl can be used.
  • a medium for preparing hybridomas for example, a commonly used medium such as Eagle's minimum essential medium, Dulbecco's modified minimum essential medium, or RPM 1-1640 is used. 30% fetal calf serum can be appropriately added and used.
  • Fusion strains can be selected by the HAT selection method.
  • the screening of hybridomas is performed by using well-known methods such as ELISA or immunohistochemical staining using the culture supernatant, and the clones of hybridomas secreting the desired antibody can be selected.
  • the monoclonality of the hybridoma can be guaranteed.
  • the high-purity doma obtained in this way can be purified in a medium for 2-4 days or in the abdominal cavity of a BAL BZc mouse pretreated with pristane for 10-20 days. Can be produced.
  • the monoclonal antibody thus produced can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional polypeptide isolation and purification method.
  • a separation and purification method include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatography using DAE-cellulose, hydroxyapatite, or protein A agarose.
  • an antibody fragment containing a monoclonal antibody or a part thereof is obtained by incorporating all or a part of the gene encoding the monoclonal antibody into an expression vector and introducing the gene into an appropriate host cell (eg, Escherichia coli, yeast, or animal cell). It can also be produced.
  • Antibodies including polyclonal antibodies and monoclonal antibodies separated and purified as described above are digested with a polypeptide-degrading enzyme (for example, pepsin or papain, etc.) by a conventional method.
  • An antibody fragment containing a part of an active antibody for example, F (ab ') 2 , Fab, Fab', or Fv can be obtained by separation and purification by the polypeptide isolation and purification method described in (1).
  • an antibody reactive with the polypeptide of the present invention can be obtained by the method of Cracson et al. Or the method of Zebede et al. (CI ackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991; or Zebedee, S. Et al., Proc. Natl. Acad. Sc, USA, 89, 3175—3179, 1992), and can also be obtained as a single chain Fv or Fab.
  • human antibodies can be obtained by immunizing transgenic mice (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1999) in which the mouse antibody gene has been replaced with a human antibody gene. Is also possible.
  • the full-length cDNA encoding the novel force realm channel of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is obtained by reverse transcriptase-polymerase chain reaction using human kidney-derived poly A + RNA (Clontech) as type III. (RT-PCR) and obtained by the following procedure. First, using human kidney poly A + RNA (10 ng) as a type II, commercially available RT-PCR kit (SUPERSCRIPT FIrststrand Synthesis System for RT-PGR; GI BCO-BRL) ) was used for reverse transcription to synthesize first-strand cDNA.
  • human kidney poly A + RNA 10 ng
  • commercially available RT-PCR kit SUVPERSCRIPT FIrststrand Synthesis System for RT-PGR; GI BCO-BRL
  • the resulting first-strand cDNA was designated as type III, an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 was used as a forward primer, and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 was used as a reverse primer.
  • PCR was carried out using DNA polymerase (PLATINUM Taq DNA Polymerase High-Fidelity; GI BCO-BRL). In the PCR described above, heat denaturation was first performed at 95 ° C (5 minutes), and then a cycle consisting of 95 ° C (for 15 seconds) and 68 ° C (for 2 minutes) was repeated 35 times. As a result, the DNA fragment power of about 0.9 kbp was amplified.
  • the obtained DNA fragment was cloned using a commercially available cloning kit (TOPO XL PCR CloninKit; Invitrogen).
  • the obtained plasmid was digested with restriction enzymes SpeI and NotI, and then a DNA fragment of about 0.9 kbp was purified.
  • plasmid pIRES Neo2 (CLONTECH) was digested with restriction enzymes NeI and NotI, and then a DNA fragment of about 5.5 kbp was purified. by coupling about 0. 9 kbp of DN a fragment purified previously noted c to give the plasmid p I RES neo 2-h PS I, the plasmid p I RES neo 2 is derived from site cytomegalovirus It has a promoter sequence and can be used to express novel potassium channels in animal cells.
  • the nucleotide sequence of the clone p I RES neo 2-PSl obtained was analyzed by the dideoxida-mineta method using a DNA sequencer (AB I377 DNA Sequencer; Applied Biosystems).
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 was obtained.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 has an open leader frame consisting of 885 base pairs (a sequence consisting of bases 13 to 897 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1). Predicted from the open reading frame The amino acid sequence was an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consisting of 294 amino acid residues.
  • Example 2 Isolation of rat gene encoding a novel calcium channel and construction of expression vector
  • the full-length cDNA encoding the novel potassium channel of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is obtained by using a rat A-derived poly A + RNA (CI ontech) as a type III, reverse transcriptase-polymerase chain Obtained by the following procedure according to the reaction (RT-PCR).
  • RT-PCR kit kit SUP ERSCR IPT First Strand Synthesis System for RT-PCR; GI BCO-BRL
  • SUP ERSCR IPT First Strand Synthesis System for RT-PCR GI BCO-BRL
  • First Strand cDNA was synthesized by reverse transcription.
  • an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (with an XbaI recognition sequence added to the 5 'end) was used as a first primer.
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 8 (with an EcoRI recognition sequence added to the 5 'end) was used as a reverse primer, and DNA polymerase (PLAT INUM Taq DNA Pol) was used.
  • PCR was performed using the following method: ymerase High Fidelity (GI BCO—BRL). The PCR, after performing thermal denaturation at first 95 (5 min), 95 ° C (1 5 seconds) and 68 ° C (2 min) and the cycle consisting of 35 repetitions c result, about 0 The 9 kbp DNA fragment was amplified.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes XbaI and EcoRI, and cloned into a plasmid pIRES neo2 (CLONTECH) to obtain a plasmid pIRESneo2-r. I got PS I.
  • the nucleotide sequence of the obtained clone p I RES neo 2-rPS I was analyzed using the DNA sequencer (AB I 377 DNA Sequencer; Ap p
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5 has 879 base pairs of open reading Gframe (a sequence consisting of bases 36 to 914 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5).
  • the amino acid sequence predicted from the open reading frame was the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 consisting of 292 amino acid residues.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 is the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the numerical value of the homology is a value obtained by the above-mentioned CIustaIprogram.
  • Example 3 Novel power stream channel >> Nesting of mouse gene coding and construction of expression vector
  • the full-length cDNA encoding the novel rheumatoid channel of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is composed of a mouse mutagen-derived poly A + RNA (Clontech) as a type III, reverse transcriptase polymer Obtained by the following procedure using the ze-chain reaction (RT-PCR).
  • mouse ⁇ poly A + RNA of (1 0 ng) as ⁇ , reversed have use a commercially available RT- P CR kit (SUPE RS CRIPTF irststrand S ynthesis S yst em for RT- PC N GI BCO- BL)
  • the first strand cDNA was synthesized.
  • the resulting DNA fragment was digested with the restriction enzyme S pe I and Ec o R l, by cloning into a plasmid P I RES neo 2 (C LONTECH Co.) to obtain a plasmid p I RES neo 2-mPS I .
  • the nucleotide sequence of the clone p I RES neo 2-mPS I obtained was analyzed by the dideoxy terminator method using a DNA sequencer (AB I 377 DNA Sequencer; Ap I ied Biosystems). As a result, the nucleotide sequence represented by System No. 9 was obtained.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 has an open reading frame consisting of 879 base pairs (a sequence consisting of the bases from No. 1 to 879 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 9).
  • the amino acid sequence predicted from the open reading frame was the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 consisting of 292 amino acid residues.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 has 87% and 97.9% homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6, respectively.
  • the numerical value of the homology is a value obtained by the above-mentioned CIustaIprogram.
  • RNA DNA polymerase (PLAT INUM Taq DNA Polymerase; GI BCO—BRL). In the PCR, a cycle consisting of 95 ° C. (30 seconds) and 68 ° C. (2 minutes) was repeated 30 times after first performing thermal denaturation at 95 ° C. (5 minutes).
  • the protein was expressed in animal cells in order to detect the channel activity of the novel force-rhyme channel comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10.
  • animal cells 929 cells (ATCC: CRL-2148), which do not generate a current through an endogenous channel due to a change in membrane potential, were used.
  • Example 5 Each cell obtained in Example 5 was fixed with a membrane potential by the whole-cell membrane potential fixing method, and the whole cell current was measured.
  • Plasmid p I RES neo 2—h PS I, plasmid p I RES neo 2- r PS I or plasmid p I RES neo2-mPS I in any of the cells transduced, a depolarizing pulse with a holding potential of 80 mV to 400 msec gives an outward current. Measured. This current was evoked instantaneously, without any inactivation, and was in good agreement with the nature of the background potassium channel. On the other hand, when a similar depolarization pulse was given to control cells, no such current was observed.
  • FIG. 1 shows the results for cells transfected with plasmid pIRESneo2-hPSI.
  • the graph (A) shows the results when 929 cells transfected with the plasmid pI RES neo2-hPSI were used, and the graph (B) shows the results obtained when the control vector (plasmid) was used.
  • the results are obtained using L929 cells transfected with pI RES neo 2).
  • the potassium ion concentration of the extracellular solution was The values were changed to 5 mmo I ZL, 15 mmo l, 3 Ommo I ZL, 75 mmo I, and 15 Ommo I ZL, and the reversal potential at that time was measured using a ramp wave. As a result, the inversion potential shifted to the depolarization side as the potassium ion concentration was increased. The reversal potential for each potassium ion concentration was plotted and linear regression was performed.
  • any of the novel force-rhyme channels of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 has high selectivity for force-rhyme ions.
  • novel potassium channel of the present invention comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 on extracellular pH was examined.
  • Cells transfected with plasmid pI RES neo2-hPSI, plasmid pI RES neo2-rPSI, or plasmid pI RES neo2-mPSI In the vesicle, when the pH of the extracellular fluid was changed stepwise from 7.3 to pH 8.9 on the alkaline side, the channel was activated at all membrane potentials. On the other hand, when the stepwise change the p H of the extracellular fluid from 7.3 to P H 5. 6 the acidic side, the channel is suppression at all membrane potential.
  • Example 10 Detection of channel activity of a novel potassium channel using rubidium ( 86 Rb) ion release
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 6, or SEQ ID NO: 10 is based on the property that potassium channels are generally able to pass rubidium ions in the same manner as potassium ion.
  • the ion permeability was examined by measuring the radioactivity of rubidium ions in the novel potassium channel of the present invention consisting of:
  • Example 9 Each of the cells obtained in Example 9 was cultured in a culture solution containing rubidium chloride ( 86 Rb ch Ioride; 2 mCi / mL), and rubidium ions were incorporated into the cells.
  • Example 11 Expression of a novel potassium channel in animal cells 1 NS-1E
  • a novel porphyrin channel of the present invention consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was prepared by using a mouse vaginal cell line (1NS—1E; DaniIoJanjic et al., Biochamica IP Harmacology, 57, 639). — 648, 199 9).
  • Example 2 Using the expression vector pI RES neo2-hPSI obtained in Example 1 and a commercially available transfection reagent (Lipofect AM I NE2000; Invitrogen), a 24-well cell culture plate was prepared. Transfection of the seeded INS-1 E cells was performed to express potassium channels in the cells. Each of the obtained cells was subjected to RPMI 1640 containing 5% fetal calf serum (FBS), 1 mmo I ZL-pyruvic acid, 50 mo IL-2 2-mercaptoethanol, and 1 Ommo I ZL-HEP ES. Cultured. The specific procedure was performed according to the manual attached to the above-mentioned transfusion reagent. Industrial applicability
  • the polypeptide of the present invention is a background potassium channel that is remarkably expressed in the brain, screening for a substance that suppresses the present polypeptide using the polypeptide of the present invention can be used for diabetes.
  • Therapeutic agent can be obtained It is for.
  • each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 7, 8, 11, and 12 in the sequence listing is an artificially synthesized primer sequence.

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Description

明 細 書 新規カリウムチャネル 技術分野
本発明は、 新規力リゥムチャネルに関する。 背景技術
塍臓は、 血中のグルコース濃度に応じ、 血糖調節ホルモンであるインシュリン を 細胞より分泌し、 血糖調節を行なう。 インシュリン作用不足は、 慢性高血糖 を引き起こし、 種々の特徴的な代謝異常を伴う糖尿病を引き起こす。
iS細胞に取り込まれたグルコースは代謝され、 AT Pをはじめとする種々の代 謝産物を生成する。 細胞には ATP感受性カリウム （K + ) チャネル （KATP チャネル） が存在しており、 グルコースの代謝により生成された ATPにより K ATPチャネルが閉鎖すると、 細胞膜の脱分極、 電位依存性カルシウム （Ca2 + ) チャネルの活性化、 及び細胞内 C a 2 +濃度上昇が起こり、 インシュリン分泌顆粒 が開口放出される。
前記 KATPチャネルは、 8個のサブユニット、 すなわち、 4個の K i r 6. 2 サブュニットと 4個の S UR (S u l p h o n y l u r e a r e c e p t o r) サブユニットとが会合してチャネル構造をとらなければ、 KATPチャネルと して機能しない。 KATPチャネルサブュニッ卜の K i r 6. 2は、 睦臓、 脳、 心 筋、 及び骨格筋等で発現するが、 塍臓においては Κ ί r 6. 2と SUR 1 (S u I p h o n y l u r e a r e c e p t o r 1 ) との複合体を形成している ( I n a g a k ί N. ら， S c i e n c e, 270, 1 1 66-1 1 70, 1 995 ;及び S e i n o S. ら， D i a b e t e s, 49， 31 1 -31 8, 2000) o
K i r 6. 2のドミナントネガティブなトランスジエニックマウスでは、 膝臓 細胞の静止膜電位上昇と細胞内カルシウムイオン濃度の上昇がみられ、 高イン シュリン血症と低血糖を示す （M i k i ら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 94， 1 1 969— 1 1 973) 。
KATPチャネル阻害剤は、 3細胞の細胞膜の脱分極を引き起こし、 インシユリ ン分泌を促す。 最も多く使用されているものに、 SUR1サブユニットに結合す る SU (S u l p h o n y l u r e a) 剤がある。 しかし、 S U剤には、 膝臓 細胞の疲弊に伴い、 二次無効となる欠点が知られている （G r o o p し ら， Am. J. Me d. , 87, 1 83-1 90, 1 989 ;繁田ら， 糖尿病治療辞 典， 医学書院， 1 996) 。
一般に、 2型糖尿病においては、 グルコース刺激によるインシュリン分泌は低 下する。 し力、し、 パッチクランプ法ホールセルレコーディング （wh o l e c e I I r e c o r d i n g) による検討により、 非肥満 2型糖尿病モデルラッ 卜 （75年に W ί s t a rラットをブドウ糖負荷試験を指標に選抜交配を進め、 得られた非肥満 2型糖尿病モデル） である GKラッ卜では、 対照に比して脱分極 刺激による電位依存性 C a 2 +チャネルの活性化が亢進し （Ka t o S. ら， C I i n l n v e s t . , 97, 241 7-2425, 1 996) 、 そして、 ェ レク卜ロノ一ミ ビリゼ一シヨン (e I e c t r o p e rme a b i I i z a t i o n) 法により処理した塍臓ラ氏島を用いた検討から、 GKラットでは対照に 比して細胞内 C a 2 +濃度上昇に対する分泌顆粒放出系の感受性が亢進した （Ok amo t o Y. ら， D i a b e t o l o g i a, 38， 772— 778, 1 9 95) 。 よって、 2型糖尿病においてはグルコース以外の脱分極刺激に対しては 分泌は保たれているか、 あるいは、 亢進していると考えられる。 発明の開示
本発明の課題は、 膝臓^細胞の興奮性を上昇させ、 インシュリン分泌を促進さ せることを作用機序とする糖尿病治療剤として有用な物質を得るためのスクリー ニングに用いるツール及び簡便なスクリーニング系を提供することにある。
本発明者は、 前記課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、 膝臓に顕著 に発現する配列番号 2で表されるァミノ酸配列をコードするヒト由来ポリヌクレ ォチドを取得し、 これに対応するラッ卜又はマウス由来の各ポリヌクレオチドを 取得した。 次いで、 各ポリヌクレオチドを発現させ、 いずれもバックグランド力 リウ厶チャネルの性質を示すことを確認し、 糖尿病治療剤、 特には、 インシユリ ン分泌促進剤をスクリーニングするために有用なツールを提供した。 また、 本力 リウムチャネル活性を簡便に検出することができる系を構築し、 簡便な糖尿病治 療剤、 特には、 インシュリン分泌促進剤スクリーニング方法を提供し、 本発明を 完成した。
すなわち、 本発明は、
[1 ] (1 ) 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配 列を含み、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリペプチド、 あるいは, (2) 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列にお いて、 1〜1 0個のアミノ酸が置換、 欠失、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列 を含み、 しかも、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリペプチド；
[ 2 ] 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるァミノ酸配列との 相同性が 90%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 バックグランド力リウ ムチャネル活性を示すポリべプチド；
[3] 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号.1 0で表されるアミノ酸配列を含 み、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリペプチド；
[4] 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列から なるポリペプチド；
[5] [1 ] 〜 [4] 記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
[6] [5] 記載のポリヌクレオチドを含む発現べクタ一；
[7] [6] 記載の発現ベクターでトランスフ: Eクシヨンされた細胞；
[8] [1 ] 〜 [4] 記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片；
[9] [7] 記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程、 及び
[1：！ 〜 [4] 記載のポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程 を含む、 前記試験化合物が前記ポリべプチドを抑制化するか否かを検出する方 法；並びに
[1 0] [9] 記載の方法による検出工程を含む、 糖尿病治療剤スクリーニング 方法
に関する。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミ ド p I RES n e o 2— h PS I (A) 又はコントロールべ クタ一 （B) でトランスフエクシヨンされた L929細胞を、 ホールセル膜電位 固定法により膜電位固定した状態で、 脱分極パルスを与えた場合に励起される外 向き電流の観察結果を示すグラフである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
「11 本発明のポリペプチド、
本発明のポリべプチドには、
(1 ) 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列を含 むポリペプチド；
(2) 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列の 1 又は複数の箇所において、 全体として 1又は複数個のアミノ酸が置換、 欠失、 及 び 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 バックグランドカリウムチヤ ネル活性を示すポリペプチド （以下、 機能的等価改変体と称する） ；及び
(3) 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列との 相同性が 90%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 バックグランド力リウ ムチャネル活性を示すポリペプチド （以下、 相同ポリペプチドと称する） が含まれる。
本発明のポリペプチドである 「配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で 表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド」 は、 配列番号、 配列番号 6、 又は配 列番号 1 0で表されるアミノ酸配列を含み、 しかも、 バックグランドカリウムチ ャネル活性を示すポリペプチドである限り、 特に限定されるものではなく、 例え ば、
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプチド；
配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチド；
配列番号 1 0で表されるァミノ酸配列からなるポリべプチド； 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリペプチドの N末端及び 又は C 末端に、 適当なマーカ一配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、 しかも、 バ ックグランド力リウ厶チャネル活性を示す融合ポリべプチド；
配列番号 6で表されるァミノ酸配列からなるポリべプチドの N末端及び 又は C 末端に、 適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、 しかも、 バ ックグランド力リウ厶チャネル活性を示す融合ポリぺプチド；及び
配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドの N末端及び 又は
C末端に、 適当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列からなり、 しかも、 バックグランドカリウムチャネル活性を示す融合ポリぺプチド
が含まれる。
本発明のポリペプチドの 1つである、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列から なるポリペプチドは、 2 9 4個のアミノ酸残基からなるヒト由来の新規のバック グランドカリウムチャネルタンパク質である。 配列番号 2で表されるアミノ酸配 列からなるポリペプチドは、 後述の実施例 4に示すように、 fl萃臓で顕著に発現し ているタンパク質である。
また、 配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、 2 9 2個 のアミノ酸残基からなるラッ卜由来の新規のバックグランド力リゥ厶チャネルタ ンパク質である。
更に、 配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、 2 9 2 個のアミノ酸残基からなるマウス由来の新規のバックグランド力リウムチャネル タンパク質である。
G e n B a n kに登録されている A L 1 3 6 0 8 7に、 ゲノムドラフ卜シーク ェンスが開示されておリ、 そのゲノム中の推測される C D S及び推定ァミノ酸配 列が記載されている。 このうちの 1つの推定アミノ酸配列が、 配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列と一致する。 しかし、 データベース中に、 「証拠は実験的でな し、」 ( e V i d e n c e = n o t e x p e r i m e n t a I ノ と §ヒ載されてし、 るとおり、 実際に配列番号 1で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドも、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリペプチドも取得されているわけ ではない。 また、 前記データベース中には、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列 からなるポリペプチドの製造法の記載、 本チャネルの組織発現分布、 及び生体内 での役割の記載はなく、 本チャネルを糖尿病治療剤のスクリーニングに用いるこ とができることは何ら示唆されていない。
また、 本願の優先日後に公表された G i r a r d, C. ら， B i o c h em. B i o p y s . Re s. Commu n. ， 282, 249-256 (200 1 ) 3月 23曰号に、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列 （アミノ酸残基数 =2 94) の内の 27 1アミノ酸残基が一致するアミノ酸配列 （相同性 =92.
9%) である、 滕臓特異的に発現しているバックグラウンドカリウムチャネルで ある TALK-1が記載されている。 しかし、 生体内での役割は明確になってお らず、 本チャネルを糖尿病治療剤のスクリーニングに用いることができるとの開 示、 及び本チャネルを抑制化することによリインシユリン分泌が抑制されるとの 開示はない。
本発明のポリペプチドにおける前記マーカー配列としては、 例えば、 ポリぺプ チドの発現の確認、 細胞内局在の確認、 あるいは、 精製等を容易に行なうための 配列を用いることができ、 例えば、 F LAGタグ、 へキサーヒスチジン■タグ、 へマグルチニン 'タグ、 又は my cェピ! ^一プなどを挙げることができる。
本明細書において、 「バックグランドカリウムチャネル活性を示す」 とは、
(a) 電圧刺激により電流が生じること ；
(b) 電圧刺激により生じた前記電流が、 瞬時に惹起され、 不活性化しないこ と ；及び
(c) カリウムイオン選択性が高いこと
の 3つの特徵を全て満たすことを意味する （D u p r a tら， EMBO J. , 1 6, 5464, 1 997 ；又は L e s a g e及び L a z d u n s k ί , Am. J. P h y s i o l . R e n a I . P y s i o l . , 279, F 793, 20 00) o
本明細書において、 或るポリペプチド （以下、 試験ポリペプチドと称する） が 「電圧刺激により電流が生じる」 か否か、 そして、 前記試験ポリペプチドにおい て 「電流が瞬時に惹起され、 不活性化しない」 か否かは、 当業者に公知の方法 (H i I l e, B. , I o n i c Ch a n n e l s o f E x c ι t a b I e Memb r a n e s, 2 n d Ed. , S i n a u e r A s s o c i a t e s I n c. , MA, 1 992) で確認することができ、 特に限定されるもの ではないが、 例えば、 以下の方法 （好ましくは、 後述の実施例 6に記載の方法） を用いることができる。 すなわち、 前記試験ポリペプチドをコードするポリヌク レオチドを含む発現ベクターで細胞をトランスフエクシヨンし、 得られた細胞を ホールセル膜電位固定 （wh o l e— e e l I v o l t a g e-c l amp) 法により膜電位固定した状態で、 保持電位一 8 OmVから 400ミリ秒間、 Om Vの脱分極パルスを与える。 前記脱分極パルスにより外向き電流が生じれば、 前 記試験ポリぺプチドが 「電圧刺激によリ電流が生じる」 と判定することができる。 また、 前記脱分極パルスにより生じた前記外向き電流が、 瞬時に惹起され、 しか も、 不活性化がみられなければ、 前記試験ポリペプチドでは、 「電流が瞬時に惹 起され、 不活性化しない」 と判定することができる。
また、 本明細書において、 試験ポリペプチドの 「カリウムイオン選択性が高 しゝ J か否かは、 当業者に公知の方法 （H ί I I e, B. , I o n i c Ch a n n e l s o f t x c i t a b I e Memb r a n e s, 2 n d td. , S i n a u e r As s o c i a t e s I n c. , MA, 1 992) で確認す ることができ、 特に限定されるものではないが、 例えば、 以下の方法 （好ましく は、 後述の実施例 7に記載の方法） により確認することができる。 すなわち、 前 記試験ポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を トランスフエクシヨンし、 得られた細胞をホールセル S莫電位固定法によリ膜電位 固定した状態で、 細胞外液のカリウムイオン濃度を変えながら、 各カリウムィォ ン濃度における反転電位をランプ波を用いて測定する。 各カリウムイオン濃度に 対する反転電位をプロッ卜し、 得られた直線の傾きが、 ネルンス卜 （N e r n s t ) の式：
E= (2. 303 RTZF) l o g ( [K] ο u t / [Κ] i n)
(式中、 Eは膜電位であり、 [K] o u tは細胞外カリウムイオン濃度であり、 [K] i nは細胞内カリウムイオン濃度であり、 Rはガス定数であり、 Fはファ ラデー定数であり、 Tは絶対温度である）
から求められる傾きの理論値とほぼ同様の数値 （好ましくは 47〜58mVZd e c a d e ) が得られれば、 前記試験ポリペプチドの 「カリウムイオン選択性が 高い」 と判定することができる。
本発明の機能的等価改変体は、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で 表されるアミノ酸配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1又は複数個
(好ましくは 1〜1 0個、 より好ましくは 1〜7個、 更に好ましくは 1〜5個） 、 例えば、 全体として 1〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたァ ミノ酸配列を含み、 しかも、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリべ プチドである限り、 特に限定されるものではなく、 その起源もヒ卜、 ラット、 又 はマウスに限定されない。
例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのヒトにお ける変異体、 配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのラット における変異体、 あるいは、 配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなるポリ ペプチドのマウスにおける変異体が含まれるだけでなく、 ヒト、 ラッ卜、 又はマ ウス以外の生物 （例えば、 ハムスター又はィヌ) 由来の機能的等価改変体が含ま れる。 更には、 それらの天然ポリペプチド （すなわち、 ヒト、 ラット、 又はマウ ス由来の変異体、 あるいは、 ヒト、 ラッ卜、 又はマウス以外の生物由来の機能的 等価改変体） をコードするポリヌクレオチドを元にして、 あるいは、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレ ォチドを元にして、 遺伝子工学的に、 コードするアミノ酸配列を人為的に改変し たポリヌクレオチドを用いて製造したポリペプチドなどが含まれる。 なお、 本明 細書において 「変異体」 （V a r i a t i o n ) とは、 同一種内の同一ポリぺプ チドにみられる個体差、 あるいは、 数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を 意味する。 本発明の機能的等価改変体の具体例としては、 例えば、 配列番号 6で 表されるアミノ酸配列と 6個のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列からなる配列 番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなるポリべプチドを挙げることができる。 配列番号 2で表されるァミノ酸配列からなるポリぺプチドのヒ トにおける変異 体、 配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのラッ卜における 変異体、 配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドのマウスに おける変異体、 あるいは、 ヒ卜、 ラッ卜、 又はマウス以外の生物由来の機能的等 価改変体は、 当業者であれば、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表 されるァミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基 配列 （例えば、 配列番号 1で表される塩基配列における第 1 3番〜第 897番の 塩基からなる配列、 配列番号 5で表される塩基配列における第 36番〜第 91 4 番の塩基からなる配列、 あるいは、 配列番号 9で表される塩基配列における第 1 番〜第 879香の塩基からなる配列） の情報を基にして、 取得することができる。 なお、 遺伝子組換え技術については、 特に断りがない場合、 公知の方法 （例えば、 Ma n i a t i s , T . b, Mo l e c u l a r C l o n i n g— A し a b o r a t o r y Ma n u a l , Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, NY, 1 982 ) に従って実施することが可能である。 例えば、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列 からなるポリべプチドをコ一ドするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を基にし て適当なプライマー又はプローブを設計し、 前記プライマー又はプローブと、 目 的とする生物 [例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒ卜、 マウス、 ラット、 ハムスター、 又はィヌ） ] 由来の試料 （例えば、 総 RN A若しくは mRN A画分、 c DNAラ イブラリー、 又はファージライブラリー） とを用いてポリメラーゼ連鎖反応 （P 〇 ） 法 （53 ! ( 1' , R. K. ら， S c i e n c e, 239, 487-491 , 1 988) 又はハイブリダィゼーシヨン法を実施することにより、 ポリペプチド コードするポリヌクレオチドを取得し、 そのポリヌクレオチドを適当な発現系を 用いて発現させ、 発現したポリペプチドが、 例えば、 実施例 6に記載の方法によ リ、 脱分極パルスにより電流が生じ、 しかも、 電流が瞬時に惹起され、 不活性化 しないことを確認し、 更に、 実施例 7に記載の方法により、 カリウムイオン選択 性が高いことを確認することにより、 所望のポリべプチドを取得することができ る。
また、 前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、 常法、 例えば, 部位特異的突然変異誘発法 （s i t e— s p e c i f i c mu t a g e n e s i s ; a r k, D. F. ら, P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 81， 5662-5666, 1 984) により、 ポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを取得し、 そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ, 発現したポリペプチドが、 例えば、 実施例 6に記載の方法により、 脱分極パルス により電流が生じ、 しかも、 電流が瞬時に惹起され、 不活性化しないことを確認 し、 更に、 実施例 7に記載の方法により、 カリウムイオン選択性が高いことを確 認することにより、 所望のポリぺプチドを取得することができる。
本発明の機能的等価改変体には、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0 で表されるアミノ酸配列の 1又は複数の箇所において、 1又は複数個 （好ましく は 1〜10個） のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入され、 更に、 その N末 端及び Z又は C末端に適当なマーカー配列等が付加されたァミノ酸配列からなリ , しかも、 バックグランド力リゥムチャネル活性を示す融合ポリべプチドが含まれ る。
本発明の相同ポリペプチドは、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で 表されるァミノ酸配列との相同性が 90 %以上であるアミノ酸配列を含み、 しか も、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリペプチドである限り、 特に 限定されるものではないが、 本発明の相同ポリペプチドとしては、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列との相同性が、 より好ま しくは 95%以上、 更に好ましくは 98%以上、 特に好ましくは 99%以上であ るアミノ酸配列を含み、 しかも、 ノくックグランドカリウムチャネル活性を示すポ リベプチドが好ましい。 配列番号 6で表されるアミノ酸配列との相同性が 90% 以上である相同ポリペプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号 10で表され るアミノ酸配列からなるポリペプチドを挙げることができる。 なお、 本明細書に おける前記 「相同性」 とは、 C l u s t a l p r o g r am (H i g g ί n s 及び S h a r p, Ge n e, 73， 237— 244, 1 988 ;並びに丁11 01 1 p s o nら， N u c l e i c Ac i d Re s. , 22, 4673— 4680, 1 994) により、 デフォルトで用意されているパラメータを用いて得られた値 を意味する。 前記のパラメータは、 以下のとおりである。
P a i rw i s e A l i g nme n t P a r ame t e r sとして
K t u p l e 1
Ga p P e n a l t y 3
W i n d ow 5 D i a g o n a l s S a v e d 5。
以上、 本発明のポリペプチドについて説明したが、 本発明のポリペプチドとし ては、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド J 、 「配列番 号 6で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド」 、 「配列番号 10で表され るアミノ酸配列からなるポリペプチド」 、 「配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列 番号 1 0で表されるアミノ酸配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜 1 0 (好ましくは 1〜7個、 より好ましくは 1〜5個） 、 例えば、 全体として 1 〜数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 及び Z又は付加されたアミノ酸配列から なり、 しかも、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリペプチド」 、 あ るいは、 「配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 10で表されるアミノ酸配列 との相同性が 90%以上 （好ましくは 95%以上、 より好ましくは 98 <½以上、 更に好ましくは 99%以上） からなリ、 しかも、 バックグランドカリウムチヤネ ル活性を示すポリペプチド」 が好ましく、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列 からなるポリべプチド」 、 「配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなるポリべ プチド J 、 あるいは、 「配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなるポリぺプ チド J がより好ましい。
「21 本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ ォチドである限り、 特に限定されるものではなく、 例えば、 配列番号 1で表され る塩基配列における第 1 3番〜第 897番の塩基からなる配列からなるポリヌク レオチド、 配列番号 5で表される塩基配列における第 36番〜第 91 4番の塩基 からなる配列、 あるいは、 配列番号 9で表される塩基配列における第 1番〜第 8 79番の塩基からなる配列からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。 な お、 本明細書における用語 「ポリヌクレオチド」 には、 DNA及ぴRNAの両方 が含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、 特に限定されるものではないが、 例 えば、 （1 ) PCRを用いた方法、 （2) 常法の遺伝子工学的手法 （すなわち、 c D N Aライブラリ一で形質転換した形質転換株から、 所望の c D N Aを含む形 質転換株を選択する方法） を用いる方法、 又は （3) 化学合成法などを挙げるこ とができる。 以下、 各製造方法について、 順次、 説明する。
前記 （1 ) の PCRを用いた方法では、 例えば、 以下の手順により、 本発明の ポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、 本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織か ら mRNAを抽出する。 次いで、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ ォチドの塩基配列に基づいて、 本発明のポリべプチドに相当する mRNAの全長 を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセット、 あるいは、 その一部の mRN A領域を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセッ卜を作成する。 抽出した前 記 mRN Aを錶型とする逆転写酵素一ポリメラ一ゼ連鎖反応 （RT— PCR) を 行なうことにより、 本発明のポリべプチドの全長 c DN A又はその一部を得るこ とができる。
より詳細には、 まず、 本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織 から、 本発明のポリべプチドをコ一ドする mRN Aを含む総 RN Aを既知の方法 により抽出する。 抽出法としては、 例えば、 グァニジン 'チオシァネート 'ホッ 卜 - フエノール法、 グァニジン 'チオシァネ一トーグァニジン■塩酸法、 又はグ ァニジン■チオシァネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、 グァニジ ン■チオシァネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。 本発明のポリぺプ チドの産生能力を有する細胞又は組織は、 例えば、 本発明のポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッテイング法、 ある いは、 本発明のポリべプチドに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッテイング 法などにより特定することができる。
続いて、 抽出した mRN Aを精製する。 mRN Aの精製は常法に従えばよく、 例えば、 mRN Aをオリゴ （d T) セルロースカラムに吸着後、 溶出させること により精製することができる。 所望により、 ショ糖密度勾配遠心法等により mR N Aを更に分画することもできる。 また、 mRN Aを抽出しなくても、 市販され ている抽出精製済みの mRN Aを用いることもできる。
次に、 精製された mRNAを、 例えば、 ランダムプライマー、 オリゴ d Tブラ イマ一、 及ぴノ又はカスタム合成したプライマーの存在下で、 逆転写酵素反応を 行ない、 第 1鎖 c DNAを合成する。 この合成は、 常法によって行なうことがで きる。 得られた第 1鎖 c DN Aを用い、 目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の 領域を挟んだ 2種類のプライマーを用いて PCRを実施し、 目的とする c DNA を増幅することができる。 得られた D N Aをァガロースゲル電気泳動等によリ分 画する。 所望により、 前記 DN Aを制限酵素等^切断し、 接続することによって 目的とする DN A断片を得ることもできる。
前記 （2) の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、 例えば、 以下の手順 により、 本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、 前記の PCRを用いた方法で調製した mRN Aを錶型として、 逆転写酵 素を用いて 1本鎖 c DN Aを合成した後、 この 1本鎖 c DN Aから 2本鎖 c DN Aを合成する。 その方法としては、 例えば、 S 1ヌクレアーゼ法 （E f s t r a t i a d i s , A. ら， Ce l I , 7, 279-288, 1 976) 、 La n d 法 （L a n d, H. ら， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 9, 2251 -2266, 1 981 ) 、 0. J o o n Yo o法 （Yo o, O. J. ら， P r o c. Na t l . Ac a d. S c に USA, 79, 1 049-1 053, 1 9 83) 、 又は O k a y ama— Be r g法 （Ok a y ama, H. 及び B e r g, P. , Mo に Ce l に B i o l . ， 2, 1 61 - 1 70, 1 982) などを 挙げることができる。
次に、 前記 2本鎖 c DNAを含む組換えプラスミドを作製した後、 大腸菌 （例 えば、 DH50?株） に導入して形質転換させ、 例えば、 テトラサイクリン又はァ ンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、 組換体を選択する。 宿主細胞の形質 転換は、 例えば、 宿主細胞が大腸菌の場合には、 H a n a h a nの方法 （H a n a h a n, D. J. , Mo に B i o l . ， 1 66, 557-580, 1 98 3) 、 すなわち、 Ca C I 2、 MgC I 2、 又は RbC I を共存させて調製したコ ンピテン卜細胞に、 前記組換え DNA体を加える方法により実施することができ る。 なお、 ベクターとしては、 プラスミド以外にもラムダ系などのファージべク ターを用いることもできる。
このようにして得られる形質転換株から、 目的の c DN Aを有する形質転換株 を選択する方法としては、 例えば、 以下に示す U) 合成オリゴヌクレオチドプ ローブを用いる形質転換株スクリーニング法、 （ii) PCRにより作製したプロ ーブを用いる形質転換株スクリーニング法、 （iii) 本発明のポリペプチドに対 する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、 又は （iv) バックグランドカリ ゥムチャネル活性を指標とする形質転換株スクリーニング法を採用することがで きる。
前記 （ ί ) の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリ一二 ング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の cDN Αを有する形質転換株を 選択することができる。
すなわち、 本発明のポリべプチドの全部又は一部に対応するォリゴヌクレオチ ドを合成し、 これをプローブ （32P又は33 Pで標識する） として、 形質転換株 の DN Aを変性固定したニトロセルロースフィルタ一とハイブリダィズさせ、 得 られた陽性株を検索して、 これを選択する。 なお、 プローブ用のオリゴヌクレオ チドを合成する場合には、 コドン使用頻度を用いて導いたヌクレオチド配列とす ることもできるし、 あるいは、 考えられるヌクレオチド配列を組合せた複数個の ヌクレオチド配列とすることもできる。
前記 （ii) の PCRにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリーニン グ法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の cDN Aを有する形質転換株を選 択することができる。
すなわち、 本発明のポリべプチドの一部に対応するセンスプライマー及びアン チセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、 これらを組合せて PC R を行ない、 目的ポリべプチドの全部又は一部をコードする DN A断片を増幅する。 ここで用いる錶型 DN Aとしては、 本発明のポリべプチドを産生する細胞の mR N Aより逆転写反応にて合成した c DN A、 又はゲノム DN Aを用いることがで きる。 このようにして調製した DN A断片を、 例えば、 32 P又は33 Pで標識し、 これをプローブとして用いてコロニーハイブリダィゼーシヨン又はプラークハイ ブリダイゼーションを行なうことにより、 目的の c DNAを有する形質転換株を 選択する。
前記 （iii) の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリ 一二ング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DN Aを有する形質転換 株を選択することができる。 すなわち、 予め、 c DN Aを発現ベクターに組込み、 形質転換株の細胞表面で ポリぺプチドを産生させ、 本発明のポリべプチドに対する抗体及び前記抗体に対 する 2次抗体を用いて、 所望のポリペプチド産生株を検出し、 目的の c DNAを 有する形質転換株を選択する。
前記 （iv) のバックグランドカリウムチャネル活性を指標とする形質転換株ス クリーニング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DNAを有する形質 転換株を選択することができる。
すなわち、 予め、 c DN Aを発現ベクターに組込み、 形質転換株の細胞表面で ポリべプチドを産生させ、 バックグランド力リウムチャネル活性を指標として、 所望のポリべプチド産生株を検出し、 目的の c DN Aを有する形質転換株を選択 する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、 公知の方法 （例えば、 M a n i a t i s , T. ら， " Mo l e c u l a r C I o n i n g— A La b o r a t o r y Ma n u a l ' Co l d S p r i n g H a r b o r La b o r a t o r y, NY, 1 982) に従って実施す ることができる。 例えば、 細胞よりプラスミ ド DNAに相当する画分を分離し、 得られたプラスミド DN Aから c DN A領域を切り出すことにより行なうことが できる。
前記 （3) の化学合成法を用いた方法では、 例えば、 化学合成法によって製造 した DN A断片を結合することによって、 本発明のポリヌクレオチドを製造する ことができる。 各 DNAは、 DNA合成機 [例えば、 O l i g o 100 OM DNA S y n t h e s i z e r ( B e c k m a n社製） 、 又は 394 DNA ZRNA S y n t h e s i z e r (A p p I i e d B i o s y s t ems社 製） など] を用いて合成することができる。
また、 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリペプチドの情報に基づいて、 例えば、 ホスフェイト■ 卜リエステル法 （H u n k a p ί I I e r , M. ら， N a t u r e, 1 0, 1 05-1 1 1 , 1 984 ) 等の常法に従い、 核酸の化学合 成により製造することもできる。 なお、 所望アミノ酸に対するコドンは、 それ自 体公知であり、 その選択も任意でよく、 例えば、 利用する宿主のコドン使用頻度 を考慮して、 常法に従って決定することができる （C r a n t h am, R. ら， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 9, r 43— r 74, 1981 ) 。 更 に、 これら塩基配列のコドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコードす る合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘 発；;≤ (s i t e s p e c i f i c mu t a g e n e s i s) (Ma r k, D. F. ら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 81， 5662-5 666, 1 984) 等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られる DNAの配列決定は、 例えば、 マキ サム—ギルバートの化学修飾法 （Ma x am, A. M. 及び G i I b e r t， W. ， "Me t o d s i n En z ymo I o g y" , 65， 499— 55 9, 1 980) ゃジデォキシヌクレオチド鎖終結法 （Me s s ί n g, J . 及び V i e i r a, J. ， G e n e, 1 9, 269-276, 1 982) 等により行 なうことができる。
「31 本発明の発現ベクター及び細胞
単離された本発明のポリヌクレオチドを、 適当なベクター DN Aに再び組込む ことにより、 真核生物又は原核生物の宿主細胞をトランスフエクシヨンすること ができる。 また、 これらのベクターに適当なプロモーター及び形質発現にかかわ る配列を導入することにより、 それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを 発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、 本発明のポリヌクレオチドを含む限り、 特に限定さ れるものではなく、 例えば、 用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現べ クタ一に、 本発明のポリヌクレオチドを揷入することにより得られる発現べクタ 一を挙げることができる。
また、 本発明の細胞も、 本発明の前記発現ベクターでトランスフエクシヨンさ れ、 本発明のポリヌクレオチドを含む限り、 特に限定されるものではなく、 例え ば、 本発明のポリヌクレオチドが、 宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞である こともできるし、 あるいは、 本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクター の形で含有する細胞であることもできる。 また、 本発明のポリペプチドを発現し ている細胞であることもできるし、 あるいは、 本発明のポリペプチドを発現して いない細胞であることもできる。 本発明の細胞は、 例えば、 本発明の発現べクタ 一により、 所望の宿主細胞をトランスフエクシヨンすることにより得ることがで さる。
例えば、 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 及び酵母等の細胞が含ま れ、 脊椎動物細胞としては、 例えば、 サルの細胞である COS細胞 （G I u zm a n, Y. , C e I I , 23, 1 75-1 82, 1 981 ) 、 チャイニーズ■ハ ムスター卵巣細胞 （CHO) のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株 (U r I a u b, G. 及び C h a s i n, し. A. , P r o c. N a t l . Ac a d. S c に U S A, 77, 421 6-4220, 1 980 ) 又は後述の実施例 9で使用した C HO-K 1細胞、 ヒ卜胎児腎臓由来 H EK293細胞、 前記 H EK293細胞に ェプスタイン■バーウィルスの EBN A— 1遺伝子を導入した 293— EBN A 細胞 （ I n V i t r o g e n社） 、 及び後述の実施例 5で使用した L 929細胞 (ATCC ： CRL-21 48) 等を挙げることができる。
脊椎動物細胞の発現べクターとしては、 通常発現しょうとする遺伝子の上流に 位置するプロモーター、 RNAのスプライス部位、 ポリアデニル化部位、 及び転 写終結配列等を有するものを使用することができ、 更に必要により、 複製起点を 有していることができる。 前記発現ベクターの例としては、 例えば、 SV40の 初期プロモーターを有する p SV 2 d h f r (S u b r ama n i , S. ら， M o に Ce l l . B i o l . , 1 , 854— 864， 1 981 ) 、 ヒ卜の延長因 子プロモータ一を有する p E F— BOS (M i z u s h i m a , S. 及び N a g a t a, S. ， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 1 8, 5322, 1 9 90) 、 サイ 卜メガロウィルスプロモータ一を有する pCEP4 ( I n v i t r o g e n社） 、 又は p I RES n e o 2 (CLONTECH) 等を挙げることが でさる。
宿主細胞として COS細胞を用いる場合には、 発現べクタ一として、 SV40 複製起点を有し、 COS細胞において自律増殖が可能であり、 更に、 転写プロモ 一ター、 転写終結シグナル、 及び RN Aスプライス部位を備えたものを用いるこ とができ、 例えば、 pME 1 8 S (Ma r u y ama, K. 及び T a k e b e, Y. , Me d. I mmu n o に ， 20, 27-32, 1 990) 、 p E F-B OS (M i z u s h i m a , S. 及び N a g a t a, S. , N u c l e i c A c i d s Re s. , 1 8, 5322, 1 990) 、 又は pCDM8 (S e e d, B. , N a t u r e, 329, 840-842, 1 987) 等を挙げることがで きる。
前記発現べクタ一は、 例えば、 DEAE—デキストラン法 （Lu t hma n, H. 及び M a g n u s s o n, G. , N u c l e i c Ac i d s Re s. , 1 1， 1 295-1 308, 1 983 ) 、 リン酸カルシウム一 D N A共沈殿法 (G r a h am, F. L . 及び v a n d e r Ed, A. J. , V i r o l o g y , 52， 456-457, 1 973 ) 、 市販のトランスフエクシヨン試薬 (例えば、 F uGENETM6 T r a n s f e c t i o n Re a g e n t ; R o c h e D i a g n o s t i c s社製） を用いた方法、 あるいは、 電気パスル 穿孔法 （N e uma n n, E. ら， EMBO J . , 1 , 841 -845, 1 9 82) 等により、 COS細胞に取り込ませることができる。
また、 宿主細胞として CHO細胞を用いる場合には、 本発明のポリペプチドを コードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、 G41 8耐性マーカー として機能する n e o遺伝子を発現することのできるベクター、 例えば、 pRS Vn e o (S amb r o o k, J . , Mo l e c u l a r C l o n i n g 一 A L a b o r a t o r y Ma n u a l , Co l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r , NY, 1 989) 又は pSV2— n e o (S o u t h e r n , P. J. 及び B e r g, P. , J. Mo に Ap p に Ge n e t . , 1， 327-341 , 1 982) 等をコ ■ トランスフエクトし、 G41 8耐性のコロニーを選択することにより、 本発明のポリべプチドを安定に産生す るトランスフエクシヨンされた細胞を得ることができる。
更に、 宿主細胞として 293— EBN A細胞を用いる場合には、 発現ベクター として、 ェプスタイン 'バーウィルスの複製起点を有し、 293— EBNA細胞 で自己増殖が可能な p CEP4 ( I n V i t r o g e n社） などを用いることが でさる。
本発明の細胞は、 常法 （例えば、 日本生化学会編， 「新生化学実験講座 1 8 細胞培養技術」 ， 東京化学同人， 1 990) に従って培養することができ、 前記 培養により細胞内又は細胞表面に本発明のポリべプチドが生産される。 前記培養 に用いることのできる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種 の培地を適宜選択することができる。 例えば、 COS細胞の場合には、 例えば、 RPM I— 1 640培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地 （DMEM) 等の培地に、 必要に応じてゥシ胎仔血清 （FBS) 等の血清成分を添加した培地 を使用することができる。 また、 293— EBN A細胞の場合には、 ゥシ胎仔血 清 （FBS) 等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル最小必須培地 （D MEM) 等の培地に G 41 8を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、 前記細胞の細胞内又は細胞表面に生産さ れる本発明のポリべプチドは、 前記ポリべプチドの物理的性質や生化学的性質等 を利用した各種の公知の分離操作法 （例えば、 岡田雅人及び宮崎香編， 「改訂タ ンパク質実験ノート上 '下」 ， 羊土社， 1 999) により、 分離精製することが できる。 具体的には、 例えば、 本発明のポリペプチドを表面に発現した細胞を培 養し、 これらをバッファ一に懸濁した後、 ホモジナイズし、 遠心分離することに より、 本発明のポリペプチドを含む細胞膜画分を得ることができる。 得られた細 胞膜画分を可溶化した後、 通常のタンパク質沈殿剤による処理、 限外濾過、 各種 液体クロマトグラフィー [例えば、 分子ふるいクロマトグラフィー （ゲル濾過） 、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換体クロマトグラフィー、 ァフィ二テイク口 マ卜グラフィ一、 又は高速液体クロマトグラフィー （HP LC) 等] 、 若しくは 透析法、 又はこれらの組合せ等により、 本発明のポリペプチドを精製することが できる。 なお、 細胞膜画分を可溶化する際には、 できるだけ緩和な可溶化剤 （例 えば、 CHAPS、 T r i t o n X— 1 00、 又はジキ卜ニン等） を用いるこ とにより、 可溶化後もカリウムチヤネルの特性を保持することができる。
本発明のポリべプチドは、 マーカー配列とインフレームで融合して発現させる ことにより、 本発明のポリペプチドの発現の確認、 細胞内局在の確認、 又は精製 等が容易になる。 前記マ一カー配列としては、 例えば、 F LAGェピトープ、 へ キサーヒスチジン 'タグ、 へマグルチニン 'タグ、 又は my cェピトープなどを 挙げることができる。 また、 マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、 プ 口テアーゼ （例えば、 ェンテロキナーゼ、 ファクター X a、 又はトロンビンな ど） が認識する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、 マーカー配列部分 をこれらのプロテアーゼにより切断除去することが可能である。 例えば、 ムス力 リンァセチルコリン受容体とへキサーヒスチジン 'タグとをトロンビン認識配列 で連結した報告がある （H a y a s h i， M. K. 及び H a g a, T. , J. B i o c h em. , 1 20, 1 232- 1 238, 1 996) 。
Γ41 本発明の検出方法及びスクリーニング方法
本発明のポリべプチドを発現させた本発明の細胞を用いると、 試験化合物が本 発明のポリペプチドを抑制化するか否かを検出することができる。 また、 この本 発明の検出方法を用いると、 本発明のポリぺプチドを抑制化する物質をスクリー ニングすることができる。
先に述べたように、 本発明のポリペプチドは、 塍臓に顕著に発現しているバッ クグランドカリウムチャネルである。 細胞の膜電位は、 細胞の内外の N a+、 K+、 C I—、 又は C a 2 +などの無機イオンが担う電荷の分布によって決定されており、 この電荷分布は、 膜タンパク質によって構成される種々のイオンチャネルの開閉 によって変化する。 そのため、 イオンチャネルの開閉は、 膜電位の変化において 重要な役割を担っている。 特に、 カリウムイオンを選択的に透過する膜タンパク 質である力リウムチャネルは、 静止膜電位の維持や脱分極後の膜電位の再分極な どに関与していると考えられており、 細胞の興奮性を制御するための良いターゲ ッ卜の 1つである。 この事実は、 細胞のカリウムチャネルに対する抑制化剤が、 膜電位の脱分極側へのシフトを引き起こし、 細胞の興奮性を上昇させる作用を有 することを示している。
力リゥ厶チャネルは、 機能的に、 膜電位依存性 （v o l t a g e— g a t e d) カリウムチャネル、 Ca2+依存性 （Ca2 +— a c t i v a t e d ) 力リウ ムチャネル、 A TP依存性 （A TP— s e n s i t i v e) カリウムチャネル、 内向き整流性 （ i nwa r d r e c t i f i e r) カリウムチャネル、 及びバ ックグランド （b a c k g r o u n d) 力リウムチャネル等に分類される。 中で も、 バックグランドカリウムチャネルは、 静止膜電位下で開口している性質を持 つているため、 静止膜電位のコントロールに大きく寄与していると考えられてい る （L e s a g eら， EMBO J. , 1 5, 1 004, 1 996 ;及び D u p r a tら， EMBO J. ， 1 6, 5464, 1 997) 。 ノ ックグランド力リ ゥ厶チャネルの抑制化は、 脱分極側への膜電位のシフトを引き起こす。 例えば、 小脳顆粒細胞のバックグランド力リゥムイオン電流は、 細胞外の酸性化によリ抑 制されることがわかっており、 それに伴い、 同神経細胞の膜電位も脱分極側にシ フ卜することが報告されている （M i I l a rら， P r o c. N a t l . A c a d. S c に USA, 97, 3614-361 8, 2000) 。
一方、 fl萃臓) 8細胞では、 膜電位の脱分極側へのシフトによりインシュリン分泌 が起こる (H e n q u i n, Jら， J o s l i n' s D i a b e t e s Me I I i t u s , 1 3 t e d . , Le a &.F e b i g e r, P e n n s y l v a n i a , 56— 80, 1 994 ; As h c r o f t , F. M. ら， I n s u l i n : Mo l e c u l a r B i o l o g y t o Pa t h o l o g y, I R L p r e s s, Ox f o r d, 97— 1 50, 1 992 ) 。 つまり、 膝臓) 8細胞 の興奮性を上昇させる薬剤は、 インシュリン分泌を引き起こすと考えられる。 本発明のポリペプチドは、 後述の実施例 8に示すように、 生理条件下と同じ p H条件下においてバックグランド力リウムチャネルの性質を示すことから、 静止 膜電位の維持や膜の再分極に関与すると考えられる。 従って、 本発明のポリぺプ チドに対する抑制化剤は、 滕臓) 8細胞の興奮性を上昇させ、 インシュリン分泌を 促進させることを作用機序とする糖尿病治療剤として有用であると考えられる。 従って、 本発明の細胞それ自体を、 糖尿病治療剤 （特には、 本発明のポリぺプ チドの抑制化剤） のスクリーニングツールとして使用することができる。
なお、 本明細書において、 本発明のポリペプチドを 「抑制化」 するとは、 本発 明のポリべプチドのチャネル機能を抑制化することを意味し、 ポリべプチドの発 現を抑制することにより、 チャネル機能を抑制化することも含む。
本発明の検出方法又はスクリーニング方法にかけることのできる試験化合物と しては、 特に限定されるものではないが、 例えば、 ケミカルファイルに登録され ている種々の公知化合物 （ペプチドを含む） 、 コンビナトリアル■ケミストリ一 技術 （T e r r e t t , N. K. ら， T e t r a h e d r o n, 51 , 81 35 -81 37, 1 995) によって得られた化合物群、 あるいは、 ファージ■ディ スプレイ法 （F e l i c i , F. ら， Mo l . B i o l . , 222， 301 一 31 0, 1991 ) などを応用して作成されたランダム■ペプチド群を用いる ことができる。 また、 微生物の培養上清、 植物若しくは海洋生物由来の天然成分、 又は動物組織抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができ る。 更には、 本発明のスクリーニング方法により選択された化合物 （ペプチドを 含む） を、 化学的又は生物学的に修飾した化合物 （ペプチドを含む） を用いるこ とができる。
本発明の検出方法は、 本発明の細胞と試験化合物とを接触させる工程、 及び前 記ポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する工程を含む。
本発明の検出方法は、 バックグランドカリゥ厶チャネルとして機能するように 本発明のポリペプチドを発現させた本発明の細胞 （すなわち、 本発明のポリぺプ チドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフエクシヨン され、 前記ポリべプチドがバックグランドカリウムチャネルとして機能するよう に発現された細胞） と試験化合物とを接触させる工程、 及び前記ポリペプチドが 抑制化されるか否かを分析する工程を含む限り、 特に限定されるものではないが、 本発明のポリべプチドの抑制化を分析するのに用いる方法の違いに基づいて、 例 えば、
(1 ) 電位固定 （v o l t a g e— c l amp) 法、 特にはホールセル膜電位固 定 、 wh o l e— c e l l v o l t a g e— c l amp) 法 ¾：禾 (I用する探出万 法、
(2) 放射性同位元素ルビジウム （86Rb+) イオンの放出を利用する検出方法、 あるいは、
(3) 膜電位感受性色素を利用する検出方法
を挙げることができ、 これらの方法の中でも、 放射性同位元素ルビジウム （36R b+) イオンの放出を利用する検出方法が好ましい。
前記 （1 ) の電位固定法、 特にはホールセル膜電位固定法を利用して、 糖尿病 治療剤として有用な、 本発明のポリべプチドを抑制化する物質を検出する場合に は、 本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞を、 電位固定法、 特にはホールセル膜電位固定法によリ膜電位固定し、 試験化合物の存在下におけ る前記細胞の全細胞電流を分析 （すなわち、 測定又は検出） することにより、 本 発明のポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する。 すなわち、 電位固定法、 特にはホールセル膜電位固定法を利用する本発明の検出方法では、 本発明のポリ ぺプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞を、 電位固定法、 特にはホールセ ル膜電位固定法により膜電位固定した状態で、 前記細胞と試験化合物とを接触さ せる工程、 及び前記細胞における全細胞電流の変化を分析する工程を含む。
よリ具体的には、 後述の実施例 6に記載の方法によリ実施することが好ましい。 例えば、 細胞外液としては、 1 49mmo l L— N a C I、 5mmo l ZL— KC I、 2mmo I ZL— Mg C I 2、 及び 1 Ommo I ZL— HEP ES— N a (p H = 7. 3) を含む溶液を使用し、 細胞内液としては、 1 4 9 ΓηΓη0 ΐ Ζ L一 KC I、 1. 8 mm o I / L— M g C I 2 4. 5 mm o I ZL—EGTA、 及び 9mmo I ZL— H E P ES— K (p H = 7. 3) を含む溶液を用いること ができる。 例えば、 保持電位一 40m Vに膜電位固定された細胞の細胞外液に、 試験化合物を添加した場合に、 外向き電流が抑制されれば、 前記試験化合物は、 本発明のポリべプチドを抑制化する物質であると判定することができる。
前記 （2) の放射性同位元素ルビジウム （86Rb+) イオンの放出を利用して、 糖尿病治療剤として有用な、 本発明のポリべプチドを抑制化する物質を検出する 場合には、 本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、 放射 性同位元素ルビジウム （86Rb+) イオンを取り込ませた後、 試験化合物を添加 した際の細胞外へ放出される放射活性の量を分析 （すなわち、 測定又は検出） す ることにより、 本発明のポリペプチドが抑制化されるか否かを分析する （Ma i n g r e tら， J. B i o に C h e m. , 274， 1 381 , 1999) 。 す なわち、 放射性同位元素ルビジウム （86Rb+) イオンの放出を利用する本発明 の検出方法では、 本発明のポリべプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、 放射性同位元素ルビジウム （86Rb+) イオンを取り込ませた後、 前記細胞と試 験化合物とを接触させる工程、 及び前記細胞の細胞外へ放出される放射活性の量 を分析する工程を含む。 この検出は、 カリウムチャネルが、 一般にカリウムィォ ンと同様にルビジウムイオンを通すことができる性質を利用するものである。 より具体的には、 後述の実施例 1 0に記載の方法により実施することが好まし い。 例えば、 本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞を、 86 RbC I とインキュベートすることにより、 ルビジウム （86Rb + ) イオンを前 記細胞内に取り込ませることができる。 前記細胞を、 通常濃度 （例えば、 2. 5 mmo I ZL) のカリウムイオンを含む溶液で洗浄し、 取り込まれなかったルビ ジゥム （86Rb+) イオンを取り除く。 次に、 前記細胞を高カリウム濃度 （例え ば、 1 00mmo I /L) のカリウムイオンで刺激すると、 前記細胞よリルビジ ゥム （86Rb + ) イオンが放出される。 カリウムチャネルが抑制化すると、 前記 細胞からのルビジウム （86Rb+) イオン放出量が減少するので、 細胞外液の放 射活性をチャネル活性の指標とし、 本発明のポリべプチドが抑制化されるか否か を分析することができる。 試験化合物を添加した際の細胞外へ放出された放射活 性を分析 （すなわち、 測定又は検出） することにより、 本発明のポリペプチドを 抑制化する物質を検出することができる。
前記 （3) の膜電位感受性色素を利用して、 糖尿病治療剤として有用な、 本発 明のポリべプチドを抑制化する物質を検出する場合には、 本発明のポリべプチド を細胞表面に発現させた本発明の細胞に、 膜電位感受性色素を取り込ませた後、 試験化合物を添加した際の、 細胞内の前記色素の蛍光強度変化を分析 （すなわち、 測定又は検出） することにより、 本発明のポリペプチドが抑制化されるか否かを 分析する。 すなわち、 膜電位感受性色素を利用する本発明の検出方法では、 本発 明のポリべプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、 膜電位感受性色素を 取り込ませた後、 前記細胞と試験化合物とを接触させる工程、 及び前記細胞内の 前記色素の蛍光強度変化を分析する工程を含む。 この検出は、 膜電位感受性色素 が、 カリウムチャネルの開口に伴う膜電位の変化を光学的に検出することできる という性質を利用するものである。
より具体的には、 前記膜電位感受性色素として、 D i BAG [b i s- (1 , 3— d i b u t y l b a r b i t u r i c a c i α t r i me t h i n e o x o n o l ； Mo l e c u l a r P r o b e社製] 又はその誘導体などを用 いることができる。 これらの色素を用いると、 本発明のポリペプチドの活性を分 析 （すなわち、 測定又は検出） することができ、 試験化合物存在下と非存在下と で前記色素の蛍光強度変化を比較することにより、 本発明のポリべプチドを抑制 化する物質を検出することができる。 具体的には、 カリウムチャネルが抑制化す ると、 蛍光強度が上昇する。
本発明の糖尿病治療剤 （特には、 本発明のポリペプチドの抑制化剤） スクリー ニング方法では、 本発明の検出方法により、 試験化合物が本発明のポリペプチド を抑制化するか否かを検出し、 その結果に基づいて、 本発明のポリペプチドを抑 制化する物質、 あるいは、 糖尿病治療剤を選択する。 より具体的には、 例えば、 本発明のポリべプチドを発現させた本発明の細胞と試験化合物とを接触させ、 前 記試験化合物の存在下における前記ポリべプチドの抑制化の有無又は程度を指標 として、 本発明のポリペプチドを抑制化する物質、 あるいは、 糖尿病治療剤を選 択することができる。
Γ51 本発明の杭休叉はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体 （例えば、 ポリクローナル抗体又はモノ クロ一ナル抗体） は、 各種動物に、 本発明のポリペプチド、 又はその断片を直接 投与することで得ることができる。 また、 本発明のポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、 DN Aワクチン法 （Ra z， E. ら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 91 , 9519-952 3, 1 994 ;又は Do n n e l l y, J. J. ら， J. I n f e c t . D i s. ， 173, 314-320, 1996 ) によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、 例えば、 本発明のポリペプチド又はその断片を適当な アジュバント （例えば、 フロイン卜完全アジュバントなど） に乳濁した乳濁液を, 腹腔、 皮下、 又は静脈等に免疫して感作した動物 （例えば、 ゥサギ、 ラッ卜、 ャ ギ、 又はニヮトリ等） の血清又は卵から製造することができる。 このように製造 された血清又は卵から、 常法のポリべプチド単離精製法によりポリクローナル抗 体を分離精製することができる。 そのような分離精製方法としては、 例えば、 遠 心分離、 透析、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 又は DE A E—セルロース、 ハイ ドロキシァパタイ卜、 若しくはプロテイン Aァガロース等によるクロマ卜グラフ ィ一法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、 例えば、 ケーラーとミルスタインの細胞融合法 （Ko h I e r , G. 及び M ί I s t e i n, C. ， N a t u r e, 256, 495— 497, 1975) により、 当業者が容易に製造することが可能である。 すなわち、 本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバン卜 （例えば、 フロイント完全アジュバントなど） に乳濁した乳濁液を、 数週間おきにマウスの 腹腔、 皮下、 又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。 最終免疫後、 脾臓細胞を取り出し、 ミエローマ細胞と融合してハイプリ ドーマを作製する。 ハイプリ ドーマを得るためのミエローマ細胞としては、 例えば、 ヒポキサンチ ン一グァニン一ホスホリポシルトランスフエラ一ゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠 損のようなマーカーを有するミエローマ細胞 （例えば、 マウスミエローマ細胞株 P 3 X 6 3 A g 8 . U 1 ) を利用することができる。 また、 融合剤としては、 例 えば、 ポリエチレンダリ一コールを利用することができる。 更には、 ハイプリ ド 一マ作製における培地として、 例えば、 イーグル氏最小必須培地、 ダルベッコ氏 変法最小必須培地、 又は R P M 1 - 1 6 4 0などの通常よく用いられている培地 に、 1 0〜3 0 %のゥシ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。 融合株は、 H A T選択法により選択することができる。 ハイプリ ドーマのスクリーニングは 培養上清を用い、 E L I S A法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行な い、 目的の抗体を分泌しているハイプリ ドーマのクローンを選択することができ る。 また、 限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、 ハイブ リ ドーマの単クローン性を保証することができる。 このようにして得られるハイ プリ ドーマは、 培地中で 2〜4日間、 あるいは、 プリスタンで前処理した B A L BZ c系マウスの腹腔内で 1 0〜 2 0日間培養することで、 精製可能な量の抗体 を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、 培養上清又は腹水から常法のポ リぺプチド単離精製法によリ分離精製することができる。 そのような分離精製方 法としては、 例えば、 遠心分離、 透析、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 又は D E A E—セルロース、 ハイドロキシァパタイト、 若しくはプロテイン Aァガロース 等によるクロマトグラフィ一法を挙げることができる。
また、 モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、 前記モノクロ一 ナル抗体をコードする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、 適当な 宿主細胞 （例えば、 大腸菌、 酵母、 又は動物細胞） に導入して生産させることも できる。 以上のように分離精製された抗体 （ポリクローナル抗体及びモノク口一ナル抗 体を含む） について、 常法により、 ポリペプチド分解酵素 （例えば、 ペプシン又 はパパイン等） によって消化を行ない、 引き続き、 常法のポリペプチド単離精製 法により分離精製することで、 活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、 例えば、 F (a b' ) 2、 F a b, F a b' 、 又は F vを得ることができる。
更には、 本発明のポリペプチドに反応する抗体を、 クラクソンらの方法又はゼ ベデらの方法 （C I a c k s o n, T. ら， N a t u r e, 352, 624— 6 28, 1 991 ;又は Z e b e d e e, S. ら， P r o c. Na t l . Ac a d. S c に USA, 89, 31 75— 31 79， 1 992 ) により、 一本鎖 （ s i n g l e c h a i n) Fv又は F a bとして得ることも可能である。 また、 マ ウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジヱニックマウス （L o n b e r g, N. ら， N a t u r e, 368， 856-859, 1 994) に 免疫することで、 ヒト抗体を得ることも可能である。 実施例
以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定するものではない。 なお、 特に断らない限り、 公知の方法 （例えば、 Ma n I a t i s , Γ . Ό, Mo l e c u l a r C l o n i n g— A L a b o r a t o r y Ma n u a l " , Co l d S p r i n g H a r b o r La b o r a t o r y, NY, 1 982 ;及び H i I I e, B. , I o n i c C h a n n e I s o f E x c i t a b l e Memb r a n e s, 2 n d Ed. , S i n a u e r As s o c i a t e s I n c. , MA, 1 992) に従って 実施した。
実施例 1 ：新規カリウムチャネル》コードするヒト遣伝子の単離及び発現べクタ —の横築
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規力リゥムチャネルを コードする全長 c DNAは、 ヒト塍臓由来のポリ A+ RNA (C l o n t e c h社） を錶型とし、 逆転写酵素一ポリメラーゼ連鎖反応 （RT— PCR) により, 以下の手順で取得した。 まず、 ヒト塍臓ポリ A+ RNA (1 0 n g) を錶型として、 市販の R T— P CRキッ卜キッ卜 （SUPERSCR I PT F i r s t s t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r RT— PGR； G I BCO-BRL 社） を用いて逆転写させ、 第 1鎖 cDNAを合成した。
得られた第 1鎖 c D N Aを錶型として、 配列番号 3で表される塩基配列からな るオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、 配列番号 4で表される塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、 DN Aポリメ ラ一ゼ （P LAT I NUM T a q DN A Po l yme r a s e H i g h -F i d e l i t y ; G I BCO— BR L社） を用いて、 P CRを行なった。 前 記 PCRは、 最初に 95°C (5分間） で熱変性を行なった後、 95°C (1 5秒 間） と 68°C (2分間） とからなるサイクルを 35回繰り返した。 その結果、 約 0. 9 k b pの DN A断片力《増幅された。 得られた DN A断片を、 市販のクロー ニングキッ卜 （TOPO X L PCR C l o n i n K i t ； I n v i t r o g e n社） を用いてクローニングした。
得られたプラスミドを制限酵素 S p e I及び N o t Iで消化した後、 約 0. 9 k b pの DN A断片を精製した。 この DN A断片とは別に、 プラスミド p I RE S n e o 2 (C LON T ECH社） を制限酵素 N e I及び N o t Iで消化した 後、 約 5. 5 k b pの DN A断片を精製し、 先に精製した約 0. 9 k b pの DN A断片と連結することにより、 プラスミド p I RES n e o 2-h PS Iを得た c なお、 前記プラスミド p I RES n e o 2は、 サイ トメガロウィルス由来のプロ モーター配列を持っており、 動物細胞に新規カリウムチャネルを発現させるため に使用することができる。
得られたクローン p I RES n e o 2- PS lの塩基配列を、 ジデォキシタ —ミネ一ター法により D N Aシークェンサ一 （AB I 377 DNA S e q u e n c e r ； A p p I i e d B i o s y s t ems社） を用いて解析し、 配列 番号 1で表される塩基配列が得られた。
配列番号 1で表される塩基配列は、 885塩基対からなるオープンリーディン ダフレーム （配列番号 1で表される塩基配列における第 1 3番〜第 897番の塩 基からなる配列） を有する。 前記オープンリーディングフレームから予測される ァミノ酸配列は、 294ァミノ酸残基からなる配列番号 2で表されるァミノ酸配 列であった。
実施例 2 ：新規力リウムチャネルをコードするラット遺伝子の単離及び発現べク ターの横築
配列番号 6で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規カリウムチャネルを コードする全長 c DN Aは、 ラット滕臓由来のポリ A+ RNA (C I o n t e c h社） を錶型とし、 逆転写酵素一ポリメラーゼ連鎖反応 （RT— PCR) によ リ、 以下の手順で取得した。
まず、 ラット睦臓ポリ A+ RNA (10 n g) を錶型として、 市販の R T— PCRキッ卜キッ卜 （S U P ERSCR I PT F i r s t s t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r RT— PCR ； G I BCO— BRL 社） を用いて逆転写させ、 第 1鎖 cDNAを合成した。
得られた第 1鎖 c D N Aを錶型として、 配列番号 7で表される塩基配列からな るオリゴヌクレオチド （5' 末端に X b a I認識配列が付加してある） をフォヮ 一ドプライマ一として、 配列番号 8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオ チド （5' 末端に E c o R I認識配列が付加してある） をリバースプライマーと して、 DN Aポリメラーゼ (P LAT I NUM T a q D N A Po l yme r a s e H i g h-F i d e l i t y ; G I BCO— BRL社） を用いて、 P CRを行なった。 前記 PCRは、 最初に 95 (5分間） で熱変性を行なった後、 95°C (1 5秒間） と 68°C (2分間） とからなるサイクルを 35回繰り返した c その結果、 約 0. 9 k b pの DN A断片が増幅された。
得られた DN A断片を制限酵素 X b a I及び E c o R Iで消化し、 プラスミド p I RES n e o 2 (C LON T ECH社） にクローニングすることによリ、 プ ラスミド p I RES n e o 2— r PS Iを得た。
得られたクローン p I RES n e o 2- r PS Iの塩基配列を、 ジデォキシタ 一ミネ一ター法により DN Aシークェンサ一 （AB I 377 DNA S e q u e n c e r ; Ap p | i e d B i o s y s t ems社） を用いて解析し、 配列 番号 5で表される塩基配列が得られた。
配列番号 5で表される塩基配列は、 879塩基対からなるオープンリーデイン グフレーム （配列番号 5で表される塩基配列における第 36番〜第 91 4番の塩 基からなる配列） を有する。 前記オープンリーディングフレームから予測される アミノ酸配列は、 292アミノ酸残基からなる配列番号 6で表されるアミノ酸配 列であった。
配列番号 6で表されるァミノ酸配列は、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列と
86. 30/0の相同性を有する。 なお、 前記相同性の数値は、 前記 C I u s t a I p r o g r a mにより得られた値である。
実施例 3 ：新規力リゥムチャネル》コ一ドするマウス遺伝子の巣離および発現べ クタ一の構築
配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規力リゥムチャネル をコードする全長 c DN Aは、 マウス睦臓由来のポリ A+ RNA (C l o n t e c h社） を錶型とし、 逆転写酵素ポリメラ一ゼ連鎖反応 （RT— PCR) によ リ、 以下の手順で取得した。
まず、 マウス塍臓ポリ A+ RNA (1 0 n g) を錶型として、 市販の R T— P CRキット （S U P E RS C R I P T F i r s t s t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r RT— PC N G I BCO— B L) を用 いて逆転写させ、 第 1鎖 c DN Aを合成した。
得られた第 1鎖 c DNAを錶型として、 配列番号 1 1で表させる塩基配列から なるオリゴヌクレオチド （5' 末端に S p e I認識配列が付加してある） をフォ ワードプライマーとして、 配列番号 1 2で表される塩基配列からなるオリゴヌク レオチド （5' 末端に E c o R I認識配列が付加してある） をリバースプライマ 一として、 DN Aポリメラ一ゼ （P LAT I NUM T a q DN A p o l y me r a s e H i g h-F i d e l i t y ; G I B CO— BRL社） を用いて、 PCRを行なった。 前記 PCRは、 最初に 95°C (5分間） で熱変性を行った後、
95°C (1 5秒間） と 68°C (2分間） とからなるサイクルを 35回繰り返した。 その結果、 約 0. 9 k b pの DNA断片が増幅された。
得られた DNA断片を制限酵素 S p e I及び Ec o R lで消化し、 プラスミド P I RES n e o 2 (C LONTECH社） にクローニングすることにより、 プ ラスミド p I RES n e o 2-mPS Iを得た。 得られたクローン p I RES n e o 2-mPS Iの塩基配列を、 ジデォキシタ ーミネーター法により DN Aシークェンサ一 （AB I 377 DNA S e q u e n c e r ； Ap p I i e d B i o s y s t ems社) を用し、て角军析し、 歹 ϋ 番号 9で表される塩基配列が得られた。
配列番号 9で表される塩基配列は、 879塩基対からなるオープンリーデイン グフレーム （配列番号 9で表される塩基配列における第 1番〜第 879香の塩基 からなる配列） を有する。 前記オープンリーディングフレームから予測されるァ ミノ酸配列は、 292アミノ酸残基からなる配列番号 1 0で表されるアミノ酸配 列であった。
配列番号 10で表されるアミノ酸配列は、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列 及び配列番号 6で表されるアミノ酸配列と、 それぞれ 87%及び 97. 9%の相 同性を有する。 なお、 前記相同性の数値は、 前記 C I u s t a I p r o g r a mにより得られた値である。
実施例 4 ：新規カリウムチャネル遣伝子の発現分布の解析
ヒ卜組織における、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる新規カリウム チャネルをコードする遺伝子の発現分布を、 RT— P CR法により以下の手順で 解析した。
ヒ卜の各組織由来のポリ A+ RNA (各 5 n g ; C l o n t e c h社） を D Nァーゼ処理した後、 RT— PCRキット （SUP ERSCR I PT F i r s t s t r a n d S y n t h e s i s S y s t em f o r RT— PC R； G I B CO— BR L社） を用いて逆転写させ、 第 1鎖 c D N Aを合成した。 得られた第 1鎖 c D N Aを錶型として、 配列番号 3で表される塩基配列からな るオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、 配列番号 4で表される塩 基配列からなるオリゴヌクレオチドをリバースプライマーとして、 DN Aポリメ ラーゼ （P LAT I NUM T a q DNA Po l yme r a s e ; G I BC O— BRL社） を用いて、 PCRを行なった。 前記 PCRは、 最初に 95°C (5 分間） で熱変性を行なった後、 95°C (30秒間） と 68°C (2分間） とからな るサイクルを 30回繰り返した。
ヒ卜の各組織 （扁桃体、 尾状核、 海馬、 脳梁、 黒質、 視床、 小脳、 前頭葉、 視 床下部、 脊髄、 下垂体、 全脳、 心臓、 胎盤、 肺、 気管、 肝臓、 骨格筋、 腎臓、 滕 臓、 小腸、 胃、 脾臓、 骨髄、 胸腺、 甲状腺、 唾液腺、 副腎、 乳腺、 及び前立腺） について RT— PCR解析を行なったところ、 約 0. 9 k b pの DNA断片が、 塍臓において顕著に増幅され、 また、 胃及び小腸においてわずかに増幅された。 実施例 5 ：新規力リゥムチャネルの動物細胞 |_ 929細朐における 現
配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる 本発明の新規力リゥムチャネルのチャネル活性を検出するために、 動物細胞に前 記タンパク質を発現させた。 前記動物細胞としては、 膜電位の変化によって内在 性のチャネルによる電流を発生しないし 929細胞 （ATCC : CRL— 21 4 8) を用いた。 前記実施例 1で得られた発現ベクター p I RES n e o 2-h P S I、 前記実施例 2で得られた発現べクター p I RES n e o 2— r PS I、 又 は前記実施例 3で得られた発現べクター p I RES n e o 2—mPS I と、 市販 のトランスフエクション試薬 （L i p o f e c t AM I NE ; G I BCO-BR L社） とを用いて、 L 929細胞のトランスフエクシヨンを行ない、 前記細胞に てカリウムチャネルを発現させた。 なお、 具体的な手順は、 前記トランスフエク シヨン試薬に添付のマニュアルに従って実施した。 また、 コントロール細胞とし て、 プラスミド p I RES n e o 2でトランスフエクシヨンした細胞も同様にし て作成した。
得られたこれらのトランスフ Iクシヨンされた細胞を、 以下の実施例 6〜実施 例 8で使用した。
実施例 6 ：新規力リウムチャネルのチャネル活性の検出
前記実施例 5で得られた各細胞を、 ホールセル膜電位固定法によリ膜電位固定 し、 全細胞電流を測定した。 細胞外液として、 1 49mmo l ZL— N a C 5 mm o I ZL— KC I、 2 mm o I /L- g C I 2、 及び 1 Omm o I / L -HEPES-N a (p H = 7. 3) を含む溶液を使用し、 細胞内液として、 1 49 mm o l ZL— KC 1、 1. 8mmo l ZL— MgC I 2、 4. 5 mm o I ZL— EGTA、 及び 9mmo I ZL— HEPES— K (p H = 7. 3) を含む 溶液を用いた。
プラスミド p I RES n e o 2— h PS I、 プラスミド p I RES n e o 2- r PS I、 又はプラスミ ド p I RES n e o 2-mPS Iで卜ランスフエクショ ンされた細胞では、 いずれも保持電位一 80 mVから 400ミリ秒間、 脱分極パ ルスを与えると、 外向き電流が測定された。 この電流は、 瞬時に惹起され、 しか も、 不活性化がみられず、 バックグランドカリウムチャネルの性質とよく一致し ていた。 一方、 コントロール細胞に、 同様の脱分極パルスを与えてみたが、 この 様な電流は観測されなかつた。
これらの結果の内、 プラスミ ド p I RES n e o 2-h PS Iで卜ランスフエ クシヨンされた細胞に関する結果を図 1に示す。 図 1において、 グラフ （A) は、 プラスミド p I RES n e o 2— h PS Iでトランスフエクシヨンされたし 92 9細胞を用いた場合の結果であり、 グラフ （B) は、 コントロールベクター （プ ラスミド p I RES n e o 2) で卜ランスフエクシヨンされた L 929細胞を用 いた場合の結果である。
実施例 7 ：新規力リゥムチャネルの力リゥムイオン選択性の確認
配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる 本発明の新規力リゥ厶チャネルの力リゥムイオンの選択性を検証するために、 細 胞外液のカリウムイオン濃度を 5mmo I ZL、 1 5mmo l し、 3 Ommo I ZL、 75mmo I し、 及び 1 5 Ommo I ZLと変え、 そのときの反転電 位をランプ波を用いて測定した。 その結果、 カリウムイオン濃度を高くするに従 つて、 反転電位は脱分極側に移動した。 各カリウムイオン濃度に対する反転電位 をプロッ卜し、 直線回帰したところ、 その傾きは 52mVZd e c a d eで、 ネ ルンスト （N e r n s t ) の式から求められる傾きの理論値に近い値であった。 この結果から、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸 配列からなる本発明の新規力リゥムチャネルは、 いずれも力リゥムイオンの選択 性が高いと考えられる。
実施例 8 ：新規カリウムチャネルの D H感受性の確認
配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる 本発明の新規カリウムチャネルの細胞外 p Hに対する効果を検討した。 プラスミ ド p I RES n e o 2— h PS I、 プラスミド p I RES n e o 2— r PS I、 又はプラスミド p I RES n e o 2— mPS Iでトランスフエクシヨンされた細 胞において、 細胞外液の p Hを 7. 3からアルカリ側の p H 8. 9まで段階的に 変えると、 全ての膜電位でチャネルが活性化した。 一方、 細胞外液の p Hを 7. 3から酸性側の PH 5. 6まで段階的に変えると、 全ての膜電位でチャネルが抑 制された。 また、 OmVにおける電流値を、 pH7. 3での値を基準にしたとき の相対値として各 p Hに対してプロッ卜すると、 アルカリ側では pH 9程度で 1 50 %の増加でほぼ飽和し、 酸性側では p H 6程度で 400/0の抑制で飽和がみら れた。 このプロットをボルツマン （Bo l t zma n n) 式でフィッティングす ると、 P。 = ( h a I f — ma x i ma l a c t ι ν ι t y ) は pH /1. 2と 求められた。 これらの結果から明らかなように、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は 配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規力リウ厶チャネルは、 いずれも生理的条件下で細胞外 p H変化に対して高い感受性を有していることが 確認された。
H施例 9 ：新規カリウムチャネルの動物細胞 CHO—K 1における発現
動物細胞として CHO— K 1細胞を用いたこと以外は、 前記実施例 5に記載の 手順を繰り返すことにより、 前記細胞にカリウムチャネルを発現させた。 得られ たこれらの卜ランスフエクシヨンされた細胞を、 以下の実施例 1 0で使用した。 実施例 1 0 ：ルビジウム （86 Rb) イオン放出を利用した新規カリウムチャネル のチャネル活性の検出
カリウムチャネル活性を簡便に測定するため、 カリウムチャネルが、 一般に力 リウムィオンと同様にルビジウムイオンを通すことができる性質に基づき、 配列 番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からなる本発明 の新規カリウムチャネルにおけるルビジウムイオンの放射活性を測定することに より、 イオン透過性を検討した。
前記実施例 9で得られた各細胞を、 塩化ルビジウム （86Rb c h I o r i d e ； 2mC i /mL) を含む培養液にて培養し、 ルビジウムイオンを細胞に取り 込ませた。 前記細胞を、 1 50mmo l ZL— N a C し 2. 5mmo l /L— KC I、 1. 8mmo l /L— Ca C I 2、 0. 8mmo l ZL— MgC I 。、 及 び 5mmo I ZL— H E P ES— N a (p H = 7. 4) を含む溶液にて洗浄し、 取り込まれなかったルビジウムイオンを取り除いた。 続いて、 高カリウムイオン 濃度 （H i g h K) 溶液 [52. 5mmo I /L-N a C I , 1 0 Ommo I ZL— KC I、 1. 8mmo I ZL— Ca C I 2、 0. 8mmo I L一 Mg C I 2、 及び 5 mm o l /L— H EPES— N a (p H = 7. 4) を含む溶液] に 置換した後、 前記高カリウムイオン濃度溶液に含まれるルビジウムイオンの放射 活性を液体シンチレーシヨンカウンタ一にて測定することで分析したところ、 放 射活性が測定された。
この結果、 本発明の新規カリウムチャネルを発現させた細胞は、 高カリウムィ オン濃度刺激 （H i g h K刺激） によリルビジゥムイオンを透過させると考え られる。 この系でも、 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるァ ミノ酸配列からなる本発明のポリべプチドが、 いずれもカリウムチャネル活性を 示すことが確認できた。
卖施.例 1 1 ：新規カリウムチャネルの動物細胞 1 NS-1 Eにおける発現
配列番号 2で表されるアミノ酸配列からなる本発明の新規力リウムチャネルを、 マウス膣臓 細胞株 （ 1 NS— 1 E ; Da n i I o J a n j i cら， B i o c h a m i c a I P h a rma c o l o g y, 57, 639— 648, 1 99 9) で発現させた。
前記実施例 1で得られた発現ベクター p I RES n e o 2— h PS Iと、 市販 のトランスフエクシヨン試薬 （L i p o f e c t AM I NE2000 ; I n v i t r o g e n社） とを用いて、 24ゥエル細胞培養用プレートに蒔いた I N S— 1 E細胞のトランスフ Iクシヨンを行ない、 前記細胞にてカリウムチャネルを発 現させた。 得られた各細胞は、 5%ゥシ胎仔血清 （FBS) 、 1 mmo I ZL— ピルビン酸、 50 mo I L— 2—メルカプトエタノール、 及び 1 Ommo I ZL— H E P ESを含む RPM I 1 640にて培養した。 なお、 具体的な手順は， 前記卜ランスフエクシヨン試薬に添付のマニュアルに従って実施した。 産業上の利用可能性
本発明のポリべプチドは、 滕臓に顕著に発現しているバックグランド力リウム チャネルであるので、 本発明のポリペプチドを用いて、 本ポリペプチドを抑制化 する物質をスクリーニングすることにより、 糖尿病治療剤を得ることができ、 有 用である。
また、 本発明のポリペプチドを細胞表面に発現する本発明の細胞によれば、 糖 尿病治療剤の簡便なスクリーニング系を提供することができる。 更に、 本発明の ポリヌクレオチド、 発現ベクター、 細胞、 及び抗体は、 本発明のポリペプチドを 製造するのに有用である。 配列寒フリーテキス卜
以下の配列表の数字見出し < 223>には、 「A r t i f i c i a l S e q u e n c e」 の説明を記載する。 具体的には、 配列表の配列番号 7、 8、 1 1、 及び 1 2の配列で表される各塩基配列は、 人工的に合成したプライマー配列であ る。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ( 1 ) 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列 を含み、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリペプチド、 あるいは、
( 2 ) 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列にお いて、 1〜1 0個のアミノ酸が置換、 欠失、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列 を含み、 しかも、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリペプチド。
2 . 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列との相 同性が 9 0 %以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 バックグランドカリウム チャネル活性を示すポリべプチド。
3 . 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列を含み、 バックグランドカリウムチャネル活性を示すポリべプチド。
4 . 配列番号 2、 配列番号 6、 又は配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列からな るポリべプチド。
5 . 請求項 1〜 4のいずれか一項に記載のポリぺプチドをコードするポリヌクレ ォチド。
6 . 請求項 5に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクタ一。
7 . 請求項 6に記載の発現べクターでトランスフヱクシヨンされた細胞。
8 . 請求項 1〜4のいずれか一項に記載のポリべプチドに結合する抗体又はその 断片。
9 . 請求項 7に記載の細胞と試験化合物とを接触させる工程、 及び
請求項 1〜 4のいずれか一項に記載のポリべプチドが抑制化されるか否かを分析 する工程
を含む、 前記試験化合物が前記ポリべプチドを抑制化するか否かを検出する方法
1 0 . 請求項 9に記載の方法による検出工程を含む、 糖尿病治療剤スクリーニン グ方法。
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