ES2280306T3 - Proteasa novedosa. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido que muestra una actividad proteasa y que comprende (1) la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, (2) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, o (3) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2.

Description

Proteasa novedosa.

Campo técnico

La presente invención se refiere a una proteasa novedosa.

Antecedentes de la técnica

ADAMTS (Una desintegrina y metaloproteasa con motivo de trombospondina) es un grupo de moléculas que contienen un dominio tipo desintegrina, un dominio tipo metaloproteasa y una secuencia repetida de trombospondina tipo I (denominada en lo sucesivo en el presente documento secuencia repetida TSP-1). Hasta ahora se han notificado nueve moléculas ADAMTS humanas.

Entre las moléculas ADAMTS humanas, se ha observado que ADAMTS4 (agrecanasa-1) y ADAMTS11 (agrecanasa-2) muestran una actividad de digestión selectiva entre el residuo de ácido glutámico 373º y el residuo de alanina 374º (entre Glu^{373}-Ala^{374}) de un agrecano de sustrato extracelular, y además, se sugirió una posibilidad de que sean enzimas esenciales que degradan el agrecano de sustrato extracelular en cartílago de artritis u osteoartritis (Tortorella M.D. et al., Science, 284, 1664-1666, 1999; y Abbaszade I. et al., J. Biol. Chem., 274, 23443-23450, 1999). Además se ha mostrado que ADAMTS2 (procolágeno I N-proteinasa) está implicada en la conversión de procolágeno tipo I para dar un tipo maduro del mismo como una enzima que escinde y elimina la parte N-terminal del procolágeno tipo I, y desempeña un papel importante en la formación de fibras de colágeno, y que una aberración en el gen del mismo está relacionada con el síndrome de Ehlers-Danlos tipo VIIC (Colige A. et al., Am. J. Hum. Genet., 65, 308-317, 1999).

Concretamente se ha mostrado que las moléculas ADAMTS están implicadas en el metabolismo tal como la degradación y la maduración de una matriz extracelular (por ejemplo, agrecano, colágeno o similar).

El fallo renal crónico es una enfermedad caracterizada por fibrosis mesangial y glomerulosclerosis. Se considera que un cambio cualitativo y/o aumento cuantitativo de componentes de matriz extracelular son los principales mecanismos de un desarrollo y una progresión del mismo. En un experimento usando un modelo de fallo renal, se mostró que una introducción de gen de decorina (una proteína que suprime específicamente la actividad del factor de crecimiento transformante \beta (TGF-\beta) (Isaka Y. et al., Nature Med., 2, 418-423, 1996) y una administración de anti-TGF-\beta (Ziyadeh F.N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97, 8015-8020; Sharma K. et al., Diabetes, 45, 522-530, 1996; y Border W.A. et al., Nature, 346, 371-374, 1990) fueron eficaces. A partir de estos resultados se considera que una supresión o inhibición de las acciones fisiológicas de TGF-\beta conduce a un tratamiento de fallo renal crónico.

Sin embargo, en las actuales circunstancias en las que no se conoce un agente eficaz para tratar la fallo renal crónico, se desea un agente para inhibir el TGB-\beta pero no ha estado fácilmente disponible hasta ahora.

Descripción de la invención

TGF-\beta es un factor de crecimiento y diferenciación que muestra varias acciones fisiológicas. Por tanto, es peligroso inhibir todas las acciones fisiológicas del TGF-\beta en un tratamiento de fallo renal crónico en el que se prevé una administración a largo plazo, a la vista de los efectos secundarios. Es preferible suprimir o inhibir solo una parte implicada con un cambio cualitativo y un aumento cuantitativo de componentes de matriz extracelular entre las acciones fisiológicas de TGF-\beta.

El objeto de la presente invención es proporcionar una proteasa novedosa que sea inducida por TGF-\beta, que esté implicada en el metabolismo de la matriz extracelular, y que sea útil como una herramienta de selección para detectar un agente para tratar el fallo renal crónico, y un polinucleótido novedoso que codifica para la proteasa.

Con el objetivo de solucionar los problemas anteriormente mencionados, los presentes inventores han realizado estudios intensivos y como resultado encontraron un polinucleótido que codifica para una proteasa novedosa que consiste en una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 y que consiste en 1224 residuos de aminoácidos de ADNc de riñón fetal humano. Además, los presentes inventores encontraron que un fragmento parcial que consiste en 750 residuos de aminoácidos en el lado del extremo N-terminal de la proteasa novedosa tiene una actividad proteasa eficaz. Además, se encontró que (1) la proteasa se clasifica dentro de las proteasas ADAMTS, y por tanto debe considerarse como una proteasa implicada en el metabolismo de matriz extracelular, (2) la proteasa se expresa actualmente en el riñón humano, (3) una expresión de la misma se induce por TGF-\beta en una célula cultivada primaria de riñón, y (4) una cantidad del gen expresado de la misma aumenta en un animal con modelo de fallo renal. A partir de estos hallazgos, los presentes inventores revelaron que la proteasa de la presente invención es un polipéptido causante de fallo renal, y eso mediante selección usando el polipéptido de la presente invención, puede seleccionarse una sustancia que inhibe la actividad proteasa de la misma, una sustancia que suprime o inhibe sólo una parte implicada con un cambio cualitativo y un aumento cuantitativo de componentes de matriz extracelular entre las acciones fisiológicas de TGF-\beta y que es útil como un agente para tratar el fallo renal crónico, puede seleccionarse, y se completa la presente invención.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a:

[1] un polipéptido que muestra una actividad proteasa y que comprende (1) una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, (2) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, o (3) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2;

[2] un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra actividad proteasa;

[3] un polipéptido que muestra actividad proteasa y que consiste en (1) un secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, o (2) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2;

[6] un polipéptido que consiste en (1) los aminoácidos 1º a 750º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2, o (2) los aminoácidos 1º a 1224º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2;

[7] un polinucleótido que codifica para el polipéptido de los puntos [1] a [6];

[8] un vector de expresión que comprende el polinucleótido del punto [7];

[9] una célula transfectada con el vector de expresión del punto [8];

[10] un anticuerpo o fragmento del mismo, que se une al polipéptido de los puntos [1] a [6];

[11] un procedimiento para producir el polipéptido de los puntos [1] a [6], que comprende las etapas de:

cultivar la célula del punto [9], y

recuperar el polipéptido de los puntos [1] a [6];

[12] un método para detectar si un compuesto que debe someterse a prueba inhibe o no la actividad proteasa del polipéptido de los puntos [1] a [6], que comprende las etapas de:

poner en contacto (1) el polipéptido, (2) \alpha_{2}-macroglobulina, y (3) el compuesto que debe someterse a prueba, y

analizar si el polipéptido y la \alpha_{2}-macroglobulina forman o no un complejo que no se disocia por SDS y/o un agente reductor;

[13] un método para seleccionar una sustancia que inhiba la actividad proteasa del polipéptido de los puntos [1] a [6], que comprende las etapas de:

detectar mediante el método del punto [12], y

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad proteasa;

[14] un método para seleccionar una sustancia para tratar el fallo crónico mediante el método del punto [13].

El término "actividad proteasa" tal como se usa en el presente documento significa una propiedad en que puede formarse un complejo, que no se disocia por dodecilsulfato de sodio (SDS) y/o un agente reductor, con \alpha_{2}-macroglobulina, una proteína inhibidora de proteasa presente en un suero.

Mejor modo de realizar la invención

La presente invención se explicará con detalle a continuación en el presente documento.

[1] El polipéptido de la presente invención

El polipéptido de la presente invención incluye

(1) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2;

\newpage

(2) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en total en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestran la actividad proteasa (denominada en lo sucesivo en el presente documento variación funcionalmente equivalente); y

(3) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 o la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra la actividad proteasa (denominado en lo sucesivo en el presente documento polipéptido homólogo).

El "polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2" como el polipéptido de la presente invención no está limitado, siempre que sea un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra la actividad proteasa. Incluye, por ejemplo,

(1a) un polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2;

(1b) un polipéptido de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se añade una secuencia marcadora apropiada o similar al extremo N-terminal y/o al extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra la actividad proteasa;

(1c) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se añade una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 751º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 o una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan de 1 a 473 aminoácidos del extremo C-terminal de la misma, al extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 (es decir, el aminoácido del extremo C-terminal es cualquiera de los aminoácidos 751º a 1224º; denominada en lo sucesivo en el presente documento "la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 o una secuencia con eliminación en el extremo C-terminal de la misma");

(1d) un polipéptido de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se añade una secuencia marcadora apropiada o similar al extremo N-terminal y/o extremo C-terminal de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 o la secuencia con eliminación en el extremo C-terminal de la misma, y que muestra actividad proteasa; y similares.

Un método para confirmar si un polipéptido que debe someterse a prueba (denominado en lo sucesivo en el presente documento polipéptido prueba) "muestra o no la actividad proteasa" tal como se usa en el presente documento (denominado en lo sucesivo en ocasiones en el presente documento "método para confirmar la actividad proteasa") no está particularmente limitado, siempre y cuando pueda confirmarse si el polipéptido de prueba muestra o no "una propiedad en la que puede formarse un complejo, que no se disocia por SDS y/o un agente reductor, con \alpha_{2}-macroglobulina, una proteína inhibidora de proteasa presente en un suero". Puede confirmarse, por ejemplo, poniendo el polipéptido de prueba en contacto con \alpha_{2}-macroglobulina, una proteína inhibidora de proteasa presente en un suero, y analizando después si se forma o no un complejo que no se disocia por SDS y/o un agente reductor [tal como 2-mercaptoetanol (2-ME)], más particularmente por un método descrito en el ejemplo 4.

Se sabe que la \alpha_{2}-macroglobulina es una proteína inhibidora de proteasa presente en un suero y que puede formar un complejo con varias proteasas. Se sabe que la formación del complejo depende de la actividad proteasa, y que el complejo formado se forma mediante un enlace amida de proteasa y \alpha_{2}-macroglobulina, y por tanto no se disocia por SDS o un agente reductor tal como 2-ME (Feinman R.D. et al., Ann. New York Acad. Sci., 737, 254-266, 1994; y Kuno K. et al., J. Biol. Chem., 274, 18821-18826, 1999).

El polipéptido anterior (1a), es decir, "el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2" es una proteasa novedosa que consiste en 750 residuos de aminoácidos y muestra la actividad proteasa. El polipéptido (1a) corresponde a un polipéptido parcial "del polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2".

Como secuencia marcadora en el polipéptido de la presente invención, puede usarse, por ejemplo, una secuencia para realizar fácilmente una confirmación de la expresión de polipéptido, confirmación de la localización intracelular del mismo, purificación del mismo, o similares. Como secuencia, pueden mencionarse, por ejemplo, el marcador FLAG, el marcador hexa-histidina, el marcador hemaglutinina, el epítopo myc, o similares.

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención no está particularmente limitada, siempre y cuando sea un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10, preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5 (por ejemplo, de uno a varios aminoácidos) en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra la actividad proteasa. Además, un origen de la variación funcionalmente equivalente no se limita a los seres humanos.

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención incluye, por ejemplo, variaciones humanas del polipéptido que consisten en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 y variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos a los seres humanos (tales como ratón, rata, hámster o perro), y se preparan polipéptidos adicionales usando polinucleótidos obtenidos mediante modificación artificial de polinucleótidos que codifican para estos polipéptidos nativos (es decir, variaciones humanas o variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos al ser humano) o polinucleótidos que codifican para el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 mediante técnicas de ingeniería genética. El término "variación" tal como se usa en el presente documento, significa diferencias individuales entre los mismos polipéptidos en la misma especie o diferencias entre polipéptidos homólogos en varias especies.

Pueden obtenerse variaciones humanas del polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 o variaciones funcionalmente equivalentes derivadas de organismos distintos al ser humano por los expertos en la técnica según la información de una secuencia de bases (por ejemplo, la secuencia de bases de SEQ ID No: 1) de un polinucleótido que codifica para el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2. Con respecto a esto, generalmente pueden realizarse técnicas de ingeniería genética según métodos conocidos (por ejemplo, Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989).

Por ejemplo, se diseñan una sonda apropiada o unos cebadores apropiados según la información de una secuencia de bases de un polinucleótido que codifica para el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2. Se lleva a cabo un método de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487-491, 1988) o un método de hibridación usando una muestra (por ejemplo ARN total o una fracción de ARNm, una biblioteca ADNc, o una biblioteca fago) preparada a partir de un organismo (por ejemplo un mamífero tal como un ser humano, ratón, rata, hámster o perro) de interés y los cebadores o la sonda para obtener un polinucleótido que codifica para el polipéptido. Puede obtenerse un polipéptido deseado expresando el polinucleótido resultante en un sistema de expresión apropiado y confirmando que el polipéptido expresado muestra la actividad proteasa mediante, por ejemplo, el método descrito en el ejemplo 4.

Además, puede obtenerse el polipéptido modificado artificialmente por técnicas de ingeniería genética mediante, por ejemplo, el siguiente procedimiento. Puede obtenerse un gen que codifica para el polipéptido mediante un método convencional, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 5662-5666, 1984). Puede obtenerse un polipéptido deseado expresando el polinucleótido resultante en un sistema de expresión apropiado y confirmando que el polipéptido expresado muestra la actividad proteasa mediante, por ejemplo, el método descrito en el ejemplo 4.

La variación funcionalmente equivalente de la presente invención incluye, por ejemplo,

(2a) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en total en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra la actividad proteasa;

(2b) un polipéptido de fusión que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en total en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 y se añade una secuencia marcadora apropiada, o similar, al extremo N-terminal y/o extremo C-terminal de la misma, y que muestra actividad proteasa;

(2c) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en total en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y al extremo C-terminal de la misma se añade una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 751º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 o una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan de 1 a 473 aminoácidos del extremo C-terminal de la misma, y que muestra actividad proteasa; y

(2d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en total en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y al extremo C-terminal de la misma se añade una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 751º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, o una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan de 1 a 473 aminoácidos del extremo C-terminal de la misma, y además se añade una secuencia marcadora apropiada o similar al extremo N-terminal y/o extremo C-terminal de la misma, y que muestra actividad proteasa.

Tal como anteriormente, se explica el polipéptido de la presente invención, pero se prefiere como polipéptido de la presente invención "el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2", "el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2", "un polipéptido que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5) en total en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra actividad proteasa" o "un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o añaden de 1 a 10 (preferiblemente de 1 a 7, más preferiblemente de 1 a 5) en total en una o varias posiciones en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, y que muestra la actividad proteasa", y más preferiblemente "el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2" o "el polipéptido que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2".

[2] El polinucleótido de la presente invención

El polinucleótido de la presente invención no está particularmente limitado, siempre y cuando codifique para el polipéptido de la presente invención. Como polinucleótido de la presente invención, pueden mencionarse, por ejemplo, un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que consiste en las bases 1ª a 2250ª en la secuencia de bases de SEQ ID No: 1. Lo más preferible es un polinucleótido que consiste en las bases 1ª a 2250ª en la secuencia de bases de SEQ ID No: 1. Con respecto a esto, el término "polinucleótido" tal como se usa en el presente documento incluye tanto ADN como ARN.

Un método para producir el polinucleótido de la presente invención no está particularmente limitado, pero pueden mencionarse por ejemplo, (1) un método que utiliza PCR, (2) un método que utiliza técnicas de ingeniería genética convencionales (es decir, un método para seleccionar un transformante que comprende un ADNc deseado a partir de cepas transformadas con una biblioteca de ADNc), o (3) un método de síntesis química. Estos métodos se explicarán en este orden a continuación en el presente documento.

En el método que utiliza PCR del punto (1), el polinucleótido de la presente invención puede producirse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se extrae ARNm de tejidos o células humanos que pueden producir el polipéptido de la presente invención. Se sintetizan un par de cebadores, entre los se localiza el ARNm de longitud total correspondiente al polipéptido de la presente invención o una región parcial del ARNm, basándose en la secuencia de bases de un polinucleótido que codifica para el polinucleótido de la presente invención. Puede obtenerse ADNc de longitud total que codifica para el polipéptido de la presente invención o una parte del ADNc realizando una reacción en cadena de la polimerasa por transcriptasa inversa (RT-PCR) usando el ARNm extraído como molde.

Más preferiblemente, se extrae ARN total que contiene ARNm que codifica para el polipéptido de la presente invención mediante un método conocido a partir de células o tejidos que pueden producir el polipéptido de la presente invención. Como método de extracción, pueden mencionarse, por ejemplo, un método de tiocianato de guanidina-fenol caliente, un método de tiocianato de guanidina-clorhidrato de guanidina o un método de tiocianato de guanidina-cloruro de cesio. Se usa preferiblemente el método de tiocianato de guanidina-cloruro de cesio. Pueden identificarse las células o tejido que pueden producir el polipéptido de la presente invención, por ejemplo, mediante un método de inmunotransferencia tipo northern usando un polinucleótido o una parte del mismo que codifica para el polipéptido de la presente invención o un método de inmunotransferencia tipo western usando un anticuerpo específico para el polipéptido de la presente invención.

Después se purifica el ARNm extraído. La purificación del ARNm puede realizarse según un método convencional. Por ejemplo puede purificarse el ARNm mediante adsorción y elución usando una columna oligo(dT)-celulosa. El ARNm puede fraccionarse adicionalmente mediante, por ejemplo, una centrifugación en gradiente de densidad de sacarosa, si es necesario. Alternativamente, puede usarse ARNm extraído y purificado disponible comercialmente sin llevar a cabo la extracción de ARNm.

A continuación, se sintetiza el ADNc de primera cadena llevando a cabo una reacción con transcriptasa inversa del ARNm purificado en presencia de un cebador al azar, un cebador oligodT, y/o un cebador adaptado. Esta síntesis puede llevarse a cabo según un método convencional. El ADNc de primera cadena resultante se somete a PCR usando dos cebadores entre los que se localizan una longitud total o una región parcial del polinucleótido de interés, amplificando de esta manera el ADNc de interés. Se fracciona el ADN resultante mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de agarosa. Puede obtenerse el fragmento de ADN de interés llevando a cabo una digestión del ADN con enzimas de restricción y la ligación posterior, si es necesario.

En el método que utiliza técnicas de ingeniería genética convencionales del punto (2), puede producirse el polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

En primer lugar, se sintetiza ADNc de cadena sencilla usando transcriptasa inversa de ARNm preparado mediante el método PCR anteriormente mencionado como molde, y después se sintetiza ADNc de doble cadena a partir del ADNc de cadena sencilla. Como este método, pueden mencionarse, por ejemplo, un método de nucleasa S1 (Efstratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), un método Land (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251-2266, 1981), un método O. Joon Yoo (Yoo, O. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1049-1053, 1983), y un método Okayama-Berg (Okayama, H. y Berg, P., Mol. Cell. Biol., 2, 161-170, 1982).

Después se prepara un plásmido recombinante que comprende el ADNc de doble cadena y se introduce en una cepa de Escherichia coli, tal como DH 5\alpha, HB101, o JM109, transformando así la cepa. Se selecciona un transformante usando una resistencia a fármaco frente a, por ejemplo, tetraciclina, ampicilina, o canamicina como marcador. Cuando la célula huésped es E. coli, puede realizarse la transformación de la célula huésped, por ejemplo, mediante el método de Hanahan (Hanahan, D.J., Mol. Biol., 166, 557-580, 1983); concretamente un método en el que el ADN recombinante se añade a células competentes preparadas en presencia de CaCl_{2}, MgCl_{2} o RbCl. Además, como un vector distinto a un plásmido, puede usarse un vector fago tal como un sistema lambda.

Como un método para seleccionar un transformante que contiene el ADNc de interés a partir de los transformantes resultantes, pueden usarse varios métodos, tales como (i) un método para seleccionar un transformante usando una sonda de oligonucleótido sintético, (ii) un método para seleccionar un transformante usando una sonda producida por PCR, (iii) un método para seleccionar un transformante usando un anticuerpo frente al polipéptido de la presente invención, o (iv) un método para seleccionar un transformante usando un sistema de traducción por hibridación selectiva.

En el método del punto (i) para seleccionar un transformante usando una sonda oligonucleótido sintético, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se sintetiza un oligonucleótido que corresponde al total o a una parte del polipéptido de la presente invención (en este caso, puede ser o bien una secuencia de nucleótido teniendo en cuenta el uso del codón o bien una pluralidad de secuencias de nucleótidos como una combinación de posibles secuencias de nucleótidos, y en el último caso, puede reducirse su número incluyendo inosina) y, usando este oligonucleótido como sonda (marcado con ^{32}P O ^{33}P), se hibrida con filtro de nitrocelulosa o filtro de poliamida sobre los que se desnaturalizan los ADN de los transformantes y se fijan, para detectar y seleccionar las cepas positivas resultantes.

En el método del punto (ii) para seleccionar un transformante usando una sonda producida por PCR, puede seleccionarse el transformante que contiene el ADNc de interés, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

Se sintetizan oligonucleótidos de un cebador sentido y un cebador antisentido correspondientes a una parte del polipéptido de la presente invención, y se amplifica un fragmento de ADN que codifica para todo o parte del polipéptido de interés realizando una PCR usando estos cebadores juntos. Como ADN molde usado en este método, puede usarse el ADNc sintetizado mediante reacción de transcripción inversa a partir de ARNm de células que pueden producir el polipéptido de la presente invención, o ADN genómico. El fragmento de ADN resultante está marcado con ^{32}P O ^{33}P, y un transformante que contiene el ADNc de interés se selecciona realizando una hibridación de colonias o una hibridación de placa de lisis usando este fragmento como sonda.

En el método del punto (iii) para seleccionar un transformante usando un anticuerpo frente al polipéptido de la presente invención, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

En primer lugar, se integra el ADNc en un vector de expresión, y se producen polipéptidos en un sobrenadante de cultivo, dentro de las células, o en la superficie celular de los transformantes. Se selecciona un transformante que contiene el ADNc de interés detectando una cepa que produce el polipéptido deseado usando un anticuerpo frente al polipéptido de la presente invención y un segundo anticuerpo frente al primer anticuerpo.

En el método del punto (iv) para seleccionar un transformante usando un sistema de traducción por hibridación selectiva, el transformante que contiene el ADNc de interés puede seleccionarse, por ejemplo, mediante el siguiente procedimiento.

En primer lugar, se somete el ADNc obtenido de cada transformante a inmunotransferencia sobre, por ejemplo, filtro de nitrocelulosa y se hibrida con ARNm preparado a partir de células que pueden producir el polipéptido de la presente invención, y entonces se disocia y recupera el ARNm unido al ADNc. El ARNm recuperado se traduce para dar un polipéptido en un sistema de traducción de polipéptido apropiado, por ejemplo, inyección en ovocitos de Xenopus o un sistema libre de células tal como un lisado de reticulocito de conejo o germen de trigo. Se selecciona un transformante que contiene el ADNc de interés detectándolo con el uso de un anticuerpo frente a polipéptido de la presente invención.

Puede realizarse un método para recoger el polinucleótido de la presente invención a partir del transformante resultante de interés según un método conocido (por ejemplo, Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989). Por ejemplo puede realizarse separando una fracción correspondiente al ADN del plásmido de las células y cortando la región de ADNc del ADN del plásmido.

En el método de síntesis química del punto (3), puede producirse el polinucleótido de la presente invención, por ejemplo, uniendo fragmentos de ADN producidos mediante un método de síntesis química. Puede sintetizarse cada ADN usando un sintetizador de ADN [por ejemplo, Oligo 1000M DNA Synthesizer (Beckman) o 394 DNA/RNA Synthesizer (Applied Biosystems)].

Además el polinucleótido de la presente invención puede producirse mediante síntesis química de ácido nucleico según un método convencional tal como un método de triéster de fosfito (Hunkapiller, M. et al., Nature, 10, 105-111, 1984), basado en la información sobre el polipéptido de la presente invención. Con respecto a esto, se conocen codones para cada aminoácido y opcionalmente pueden seleccionarse y determinarse mediante el método convencional, por ejemplo, teniendo en cuenta el uso de codón de cada huésped que debe usarse (Crantham, R. et al., Nucleic Acids Res., 9, r43-r74, 1981). Además puede realizarse una modificación parcial de los codones de estas secuencias de bases según un método convencional, tal como mutagénesis dirigida al sitio que usa un cebador comprendido por un oligonucleótido sintético que codifica para una modificación deseada (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5662-5666, 1984).

La determinación de secuencias de ADN obtenidas mediante, por ejemplo, los métodos mencionados anteriormente puede realizarse mediante, por ejemplo, un método de modificación química Maxam-Gilbert (Maxam, A.M. y Gilbert, W., "Methods in Enzymology", 65, 499-559, 1980) o un método de terminación en cadena de didesoxinucleótido (Messing, J. y Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982).

[3] El vector de expresión y la célula de la presente invención

Se reintegra un polinucleótido aislado de la presente invención en un ADN de vector apropiado y puede transfectarse una célula huésped eucariota o procariota mediante el vector de expresión resultante. Además, puede expresarse el polinucleótido en una célula huésped deseada, introduciendo un promotor apropiado y una secuencia relacionada con la expresión del gen en el vector.

El vector de expresión de la presente invención no está particularmente limitado, siempre y cuando comprenda el polinucleótido de la presente invención. Como el vector de expresión, pueden mencionarse, por ejemplo, un vector de expresión obtenido introduciendo el polinucleótido de la presente invención en un vector de expresión conocido seleccionado apropiadamente según una célula huésped que debe usarse.

La célula de la presente invención no está particularmente limitada, siempre y cuando se transfecte con el vector de expresión de la presente invención y comprenda el polinucleótido de la presente invención. La célula de la presente invención puede ser, por ejemplo, una célula en la que el polinucleótido se integra en un cromosoma de una célula huésped, o una célula que contiene el polinucleótido como un vector de expresión que comprende un polinucleótido. Además, la célula de la presente invención puede ser una célula que expresa el polipéptido de la presente invención o una célula que no expresa el polipéptido de la presente invención. La célula de la presente invención puede obtenerse me-
diante, por ejemplo, la transfección de una célula huésped deseada con el vector de expresión de la presente invención.

En células huésped eucariotas se incluyen, por ejemplo, células de animales vertebrados, insectos y levaduras. Como célula de animal vertebrado puede mencionarse, por ejemplo, una célula COS de simio (Gluzman, Y., Cell, 23, 175-182, 1981), una cepa carente de dihididrofolato reductasa de una célula de ovario de hámster chino (CHO)(Urlaub, G. y Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220, 1980), una célula HEK293 derivada de riñón fetal humano, o una célula 293-EBNA (Invitrogen) obtenida introduciendo un gen de EBNA-1 del virus Epstein Barr en una célula HEK293.

Como un vector de expresión de una célula de animal vertebrado, generalmente puede usarse un vector que contiene un promotor ubicado en sentido 5' del gen que debe expresarse, un sitio de corte y empalme de ARN, un sitio de poliadenilación, una secuencia de terminación de transcripción y similares. El vector puede contener adicionalmente un origen de replicación, si es necesario. Como vector de expresión, puede mencionarse, por ejemplo, pSV2dhfr que contiene un promotor temprano SV40 (Subramani, S. et al., Mol. Cell. Biol., 1, 854-864, 1981), pEF-BOS que contiene un promotor de factor de elongación humano (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), o pCEP4 que contiene un promotor de citomegalovirus (Invitrogen).

Cuando se usa la célula 293-EBNA como la célula huésped, por ejemplo, puede usarse como vector de expresión pCEP4 (Invitrogen) que contiene un origen de replicación del virus Epstein Barr y que puede realizar una replicación autónoma en la célula 293-EBNA.

Cuando se usa la célula COS como célula huésped, puede usarse como vector de expresión un vector que tiene un origen de replicación SV40, puede realizar una replicación autónoma en la célula COS, y tiene un promotor de transcripción, una señal de terminación de transcripción y un sitio de corte y empalme de ARN. Como el vector, pueden mencionarse, por ejemplo, pME18S (Maruyama, K. y Takebe, Y., Med. Immunol., 20, 27-32, 1990), pEF-BOS (Mizushima, S. y Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5322, 1990), o pCDM8 (Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987).

Puede incorporarse el vector de expresión a las células COS mediante, por ejemplo, un método DEAE-dextrano (Luthman, H. y Magnusson, G., Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983), un método de coprecipitación de fosfato de calcio-ADN (Graham, F. L. y van der Ed, A. J., Virology, 52, 456-457, 1973), un método que utiliza un reactivo de transfección disponible comercialmente (por ejemplo, FuGENE™6 Transfection Reagent; Boeringer Mannheim), o un método de electroporación (Neumann, E. et al., EMBO J., 1, 841-845, 1982).

Cuando se usa la célula CHO como célula huésped, puede obtenerse una célula transfectada que puede producir de manera estable el polipéptido de la presente invención realizando cotransfección de un vector de expresión que comprende el polinucleótido que codifica para el polipéptido de la presente invención, junto con un vector que puede expresar un gen neo que funciona como un marcador de resistencia G418, tal como pRSVneo (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning-A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989) o pSV2-neo (Southern, P. J. y Berg, P., J. Mol. Appl. Genet., 1, 327-341, 1982), y seleccionar una colonia resistente G418.

Puede cultivarse la célula de la presente invención según el método convencional [por ejemplo, "Shin Seikagaku Jikken Koza 18, Saibou Baiyou Gijyutsu (Japanese Biochemical Society)", Tokyo Kagaku Dojin, 1990], y se produce el polipéptido de la presente invención fuera de las células. Como medio que debe usarse en el cultivo, puede seleccionarse apropiadamente un medio comúnmente usado en una célula huésped deseada. En el caso de la célula COS puede usarse, por ejemplo, un medio tal como un medio RPMI-1640 o un medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM), suplementándolo con un componente de suero tal como suero bovino fetal (FBS) si es necesario. En el caso de la célula 293-EBNA, puede usarse un medio tal como un medio esencial mínimo de Eagle modificado por Dulbeco (DMEM) con un componente de suero tal como suero bovino fetal (FBS) y G418.

El polipéptido de la presente invención producido fuera de la célula de la presente invención mediante cultivo de las células puede separarse y purificarse de las mismas mediante varias técnicas de separación conocidas [por ejemplo, Okada, M. y Miyazaki K., "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Jyo-Ge (Revision, Notebook for Protein Experiments)", Yodo-sha 1999] haciendo uso de las propiedades físicas, propiedades químicas y similares del polipéptido. Más particularmente, puede purificarse el polipéptido de la presente invención tratando un líquido de cultivo que contiene el polipéptido de la presente invención con un tratamiento comúnmente empleado, por ejemplo, un tratamiento con un precipitante de proteína, ultrafiltración, varias técnicas de cromatografía de líquidos, tal como cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), o diálisis, o una combinación de las mismas.

Cuando se expresa el polipéptido de la presente invención como una proteína de fusión con una secuencia marcadora en marco, puede realizarse fácilmente la identificación de la expresión del polipéptido de la presente invención, purificación del mismo, o similar. Como secuencia marcadora pueden mencionarse, por ejemplo, una etiqueta TAG, una etiqueta hexa-histidina, una etiqueta hemaglutinina o un epítope myc. Además, puede eliminarse la secuencia marcadora por la proteasa insertando una secuencia de aminoácidos específica reconocida por una proteasa tal como enterocinasa, factor Xa o trombina entre la secuencia marcadora y el polipéptido de la presente invención.

[4] El método de detección y el método de selección de la presente invención

Es posible detectar si un compuesto que debe someterse a prueba inhibe o no la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención, usando el polipéptido de la presente invención. Además, usando este método de detección de la presente invención, es posible seleccionar una sustancia que inhibe la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención. Se considera que MDTS9 (metaloproteasa y desintegrina con repeticiones de trombospondina tipo-1 9), el polipéptido de la presente invención, es una proteasa ADAMTS a partir de su secuencia, y por tanto que es una proteasa que está implicada en el metabolismo de la matriz extracelular. MDTS9 es una proteína expresada en el riñón, tal como se muestra en los ejemplos 5 y 8, y la proteasa ADAMTS inducida por TGF-\beta tal como se muestra en el ejemplo 6. Por tanto una sustancia que inhiba la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención es útil como un agente para tratar el fallo renal crónico en la que se prevé una administración a largo plazo, porque es sumamente posible que la sustancia suprima o inhiba sólo una parte que está implicada en un cambio cualitativo y un aumento cuantitativo de los componentes de matriz extracelular, entre las acciones fisiológicas de TGF-\beta. Además, puede usarse por sí mismo el polipéptido de la presente invención como una herramienta para seleccionar una sustancia que inhibe la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención o una sustancia para tratar el fallo renal crónico.

Los compuestos que deben someterse a prueba que pueden aplicarse al método de detección o método de selección de la presente invención no están particularmente limitados, pero pueden mencionarse, por ejemplo, diversos compuestos conocidos (incluyendo péptidos) registrados en archivos químicos, compuestos obtenidos mediante técnicas de química combinatoria (Terrett, N.K., et al., Tetrahedron, 51, 8135-8137, 1995) o técnicas de síntesis convencionales o péptidos aleatorios preparados empleando un método de presentación de fago (Felici, F. et al., J. Mol. Biol., 222, 301-310, 1991) o similares. Estos compuestos conocidos incluyen compuestos (incluyendo péptidos) que se sabe que muestran una actividad inhibidora de proteasa pero que se desconoce que inhiban la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención. Además, pueden usarse los sobrenadantes de cultivos de microorganismos, componentes naturales derivados de plantas u organismos marinos o extractos de tejidos animales como compuestos prueba para seleccionar. Además, pueden usarse compuestos (incluyendo péptidos) obtenidos modificando química o biológicamente compuestos (incluyendo péptidos) seleccionados mediante el método de selección de la presente invención.

El método de detección de la presente invención comprende las etapas de:

poner en contacto (1) el polipéptido de la presente invención, (2) \alpha_{2}-macroglobulina y (3) un compuesto que debe someterse a prueba, y

analizar si el polipéptido de la presente invención y la \alpha_{2}-macroglobulina forman o no un complejo que no se disocia por SDS y/o un agente reductor (tal como 2-ME).

Puede llevarse a cabo el método de detección de la presente invención mediante un método similar al mencionado anteriormente para confirmar la actividad proteasa, excepto que el polipéptido de la presente invención, la \alpha_{2}-macroglobulina y el compuesto prueba se ponen en contacto los unos con los otros en lugar de poner en contacto el polipéptido prueba con \alpha_{2}-macroglobulina. Concretamente, en el método de detección de la presente invención, se detecta si el compuesto prueba inhibe o no la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención poniendo en contacto el polipéptido de la presente invención, la \alpha_{2}-macroglobulina, y el polipéptido prueba, y después analizando si el polipéptido de la presente invención y la \alpha_{2}-macroglobulina forman o no un complejo que no se disocia por SDS y/o un agente reductor (tal como 2-ME) en presencia del compuesto prueba. Cuando el polipéptido de la presente invención y la \alpha_{2}-macroglobulina no forman un complejo que no se disocia por SDS y/o un agente reductor (tal como 2-ME) en presencia del compuesto prueba, o disminuye el grado de formación, es posible confirmar que el compuesto prueba inhibe la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención.

En el método de selección de la presente invención, se selecciona una sustancia que inhibe la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención o una sustancia para tratar el fallo renal crónico, basándose en los resultados obtenidos detectando si el compuesto prueba inhibe o no la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención usando el método de detección de la presente invención. Más particularmente, por ejemplo, cuando se ponen en contacto el polipéptido de la presente invención, la \alpha_{2}-macroglobulina y el compuesto prueba los unos con los otros, puede seleccionarse una sustancia que inhibe la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención para tratar el fallo renal crónico basándose en la presencia o grado de formación del complejo del polipéptido de la presente invención y la \alpha_{2}-macroglobulina en presencia de compuesto prueba. Cuando el polipéptido de la presente invención y la \alpha_{2}-macroglobulina no forman un complejo que no se disocia por SDS y/o un agente reductor (tal como 2-ME) en presencia del compuesto prueba, o disminuye el grado de formación, es posible confirmar que el compuesto prueba es una sustancia que inhibe la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención o una sustancia para tratar el fallo renal crónico.

[6] El anticuerpo y el fragmento del mismo de la presente invención

Puede obtenerse un anticuerpo, tal como un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, que reacciona con el polipéptido de la presente invención, administrando directamente el polipéptido de la presente invención o un fragmento del mismo a varios animales. Alternativamente, puede obtenerse mediante un método de vacuna de ADN (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994; o Donnelly, J.J. et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996), usando un plásmido en el que se inserta un polinucleótido que codifica para el polinucleótido de la presente invención.

El anticuerpo policlonal puede producirse a partir de un suero u ovarios de una animal tal como un conejo, una rata, una cabra o una gallina, en el que se inmuniza el animal y se sensibiliza mediante el polipéptido de la presente invención o un fragmento del mismo emulsionado en un adyuvante apropiado (por ejemplo, adyuvante completo de Freund) mediante administración intravenosa, subcutánea o intraperitoneal. Puede separarse y purificarse el anticuerpo policlonal del suero u óvulos resultantes según los métodos convencionales para el aislamiento y purificación de polipéptidos. Ejemplos de los métodos de separación y purificación incluyen, por ejemplo, separación centrífuga, diálisis, desalar con sulfato de amonio o una técnica cromatográfica que utiliza celulosa-DEAE, hidroxipatita, agarosa de proteína A y similares.

El anticuerpo monoclonal puede producirse fácilmente por los expertos en la técnica según, por ejemplo, un método de fusión celular de Kohler y Milstein (Kohler, G. y Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975).

Se inmuniza un ratón por vía intraperitoneal, subcutánea o intravenosa varias veces con un intervalo de una pocas semanas mediante una inoculación repetida de emulsiones en las que el polipéptido de la presente invención o un fragmento del mismo se emulsiona en un adyuvante adecuado tal como un adyuvante completo de Freund. Se extraen células de bazo tras la inmunización final, y después se fusionan con células de mieloma para preparar hibridomas.

Como célula de mieloma para obtener un hibridoma, puede usarse una célula de mieloma que tiene un marcador tal como una carencia de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa o timidina cinasa (por ejemplo, línea celular de mieloma de ratón P3X63Ag8.U1). Puede usarse polietilenglicol como agente de fusión. Como medio de preparación de hibridomas, puede usarse, por ejemplo, un medio comúnmente usado tal como un medio esencial mínimo de Eagle, un medio esencial mínimo modificado de Dubelco, o un medio RPMI-1640 añadiendo apropiadamente del 10 al 30% de suero bovino fetal. Pueden seleccionarse las cepas fusionadas mediante un método de selección HAT. Se selecciona un sobrenadante de cultivo de los hibridomas mediante un método bien conocido tal como un método ELISA o un método inmunohistológico, para seleccionar clones de hibridoma que segregan el anticuerpo de interés. Se garantiza la monoclonalidad del hibridoma seleccionado mediante la repetición de la subclonación por un método de dilución limitante. Se producen anticuerpos, en una cantidad que puede purificarse, mediante cultivo de los hibridomas resultantes en un medio durante de 2 a 4 días, o en la cavidad peritoneal de una cepa BALB/c de ratón tratada previamente con pristano durante de 10 a 20 días.

Los anticuerpos monoclonales resultantes en el sobrenadante del cultivo o los ascitis pueden separarse y purificarse por métodos de purificación y aislamiento de polipéptido convencionales. Ejemplos de los métodos de purificación y separación incluyen, por ejemplo, separación centrífuga, diálisis, desalar con sulfato de amonio o una técnica cromatográfica usando celulosa-DEAE, hidroxipatita, agarosa de proteína A y similares.

Además, pueden producirse los anticuerpos monoclonales o los fragmentos de anticuerpos que contienen una parte del mismo insertando el total o una parte del gen que codifica para el anticuerpo monoclonal en un vector de expresión e introduciendo el vector de expresión resultante en la célula huésped adecuada (tal como E. coli, células animales o levaduras).

Pueden obtenerse fragmentos de anticuerpo que comprenden una parte activa del anticuerpo tal como F(ab')_{2}, Fab, Fab' o Fv mediante un método convencional, por ejemplo, mediante digestión de los anticuerpos separados y purificados (incluyendo anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales) con una proteasa tal como pepsina o papaina, y separando y purificando los fragmentos resultantes mediante métodos de purificación y aislamiento de polipéptido habituales.

Además, puede obtenerse un anticuerpo que reacciona con el polipéptido de la presente invención en forma de Fv o Fab de cadena sencilla según un método de Clackson et al., o un método de Zebedee et al., (Clackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991; o Zebedee S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992). Además, puede obtenerse un anticuerpo humanizado inmunizando un ratón transgénico en el que los genes de anticuerpo de ratón se sustituyen con genes de anticuerpo humanos (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1994).

Ejemplos

La presente invención se ilustrará ahora adicionalmente por, pero no se limita de ninguna manera a, los siguientes ejemplos. Se realizaron los procedimientos según los métodos conocidos (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning - A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1989), a no ser que se especifique otra cosa.

Ejemplo 1 Preparación del vector de expresión que tiene FLAG añadido a su extremo C-terminal

Se construye un vector de expresión pCEP4d en el que se ha eliminado la unidad de expresión EBNA1 del virus Epstein-Barr digiriendo el plásmido pCEP4 (fabricado por Invitrogen) con enzimas de restricción ClaI y NsiI, obteniendo extremos romos y después auto ligándose. Se digirió el vector de expresión resultante pCEP4d con enzimas de restricción NheI y BamHI, y se extrajo el fragmento de ADN resultante de aproximadamente 7,7 kpb del gel de agarosa, al que se insertó el oligonucleótido de doble cadena preparado por apareamiento del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 3 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 4 para construir el vector de expresión pCEP4d-FLAG. Se analizó la secuencia de bases del vector de expresión resultante para confirmar que la secuencia deseada estaba incluida en el mismo.

Se realizó una PCR, usando como molde el vector de expresión pCEP4d-FLAG, el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 5 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 6 como cebadores y ADN polimerasa PyroBest (PyroBest^{TM}; fabricado por Takara-shuzo). En la PCR, se realizó una reacción de desnaturalización térmica primero a 94ºC durante 2 minutos. Después, se repitió 15 veces una reacción en ciclo compuesta por tratamientos a 94ºC durante 30 segundos, a 55ºC durante 30 segundos y a 72ºC durante 30 segundos. A continuación, se realizó una reacción de extensión a 72ºC durante 7 minutos. Se digirió un fragmento de ADN resultante de aproximadamente 0,4 kpb con una enzima de restricción, SpeI, y se insertó en un vector de expresión pCEP4d-FLAG (de aproximadamente 7,7 kpb) que se había digerido con XbaI para obtener un vector de expresión pCEPdE2-FLAG. En el vector de expresión resultante pCEPdE2-FLAG se ordenaron la secuencia de reconocimiento XbaI, la secuencia de reconocimiento NheI, la secuencia de reconocimiento NotI, la secuencia de reconocimiento BamHI y la etiqueta FLAG desde el promotor hacia el sentido 3' del mismo.

Ejemplo 2 Clonación del gen de ORF de longitud total del gen de proteasa novedosa MDTS9

Se realizó una PCR, usando una combinación de oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 7 (que tiene una secuencia de reconocimiento SpeI y una secuencia Kozak añadida al extremo 5'-terminal) y el oligonucleótido consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 8 (que tiene una secuencia de reconocimiento NotI añadida al extremo 5'-terminal) como cebadores, una biblioteca de ADNc de riñón fetal humano (ADNc Marathon-Ready^{TM}; fabricado por Clontech) como una molde, y ADN polimerasa (TaKaRa LA Taq^{TM}; fabricado por Takara-shuzo) como ADN polimerasa. En la PCR, se realizó en primer lugar una reacción de desnaturalización térmica a 94ºC durante 2 minutos. Entonces se repitió 40 veces un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 2 minutos y 30 segundos. A continuación, se realizó una reacción de extensión a 68ºC durante 7 minutos. Se subclonaron en un plásmido PCR2.1 (fabricado por Invitrogen) un producto de PCR resultante, un fragmento de ADN con aproximadamente 2,2 kpb (que tiene la secuencia de reconocimiento de SpeI y la secuencia Kozak añadida al extremo 5'-terminal y la secuencia de reconocimiento NotI añadida al extremo 3'-terminal) para obtener un clon pMDTS9Cys1.

Se digirió el plásmido resultante pMDTS9Cys1 con enzimas de restricción, SpeI y NotI, y se insertó un fragmento de ADN resultante de aproximadamente 2,2 kpb en el sitio XbaI y NotI del plásmido pCEPdE2-FLAG construido el ejemplo 1 para construir un plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys1-FLAG.

Se realizó una PCR, usando una combinación del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 9 (que tiene una secuencia de reconocimiento de SpeI y una secuencia Kozak añadida al extremo 5'-terminal) y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 10 como cebadores, una biblioteca de ADNc de riñón fetal humano (ADNc Marathon-Ready^{TM}; fabricado por Clontech) como molde y ADN polimerasa (TaKaRa LA Taq^{TM}; fabricada por Takara-shuzo) como ADN polimerasa. En la PCR, se realizó en primer lugar una reacción de desnaturalización térmica a 94ºC durante 2 minutos. Después se repitió 45 veces un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 10 segundos, y 68ºC durante 30 segundos. A continuación, se realizó una reacción de extensión a 68ºC durante 7 minutos. Se subclonaron en un plásmido PCR2.1 (fabricado por Invitrogen) un producto de PCR resultante, un fragmento de ADN con aproximadamente 0,2 kpb (que tiene la secuencia de reconocimiento de SpeI y la secuencia Kozak añadida al extremo 5'-terminal y la secuencia de reconocimiento de NotI añadida al extremo 3'-terminal) para obtener un clon pMDTS9(5S2-12).

Se insertaron un fragmento A de ADN de SpeI-NcoI de aproximadamente 0,2 kpb obtenido por digestión del plásmido resultante pMDTS9(5S2-12) con enzimas de restricción SpeI y NcoI, y un fragmento B de ADN de NcoI-NotI de aproximadamente 2,0 kpb obtenido por digestión del plásmido resultante anterior pMDTS9Cys1 con enzimas de restricción NcoI y NotI, en el sitio de XbaI y NotI del pCEPdE2-FLAG construido en el ejemplo 1 para construir un plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG. De manera similar, se insertaron el fragmento A de ADN y el fragmento B de ADN en el sitio de SpeI y NotI de un plásmido pZErO-2 (fabricado por Invitrogen) para construir un plásmido pZErO-MDTS9Cys2.

Se realizó una PCR, usando una combinación del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 11 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 12 como cebadores, una biblioteca de ADNc de riñón fetal humano (ADNc Marathon-Ready^{TM}; fabricado por Clontech) como una molde, y ADN polimerasa (TaKaRa LA Taq^{TM}; fabricado por Takara-shuzo) como ADN polimerasa. En la PCR, se realizó en primer lugar una reacción de desnaturalización térmica a 94ºC durante 2 minutos. Después, se repitió 40 veces un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 2 minutos y 30 segundos. A continuación, se realizó una reacción de extensión a 68ºC durante 7 minutos. Se subclonaron en un plásmido PCR2.1 (fabricado por Invitrogen) un producto de PCR resultante, un fragmento de ADN con aproximadamente 2,1 kpb para obtener un clon pMDTS9-3H.

Se ligó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,1 kpb, generado mediante digestión del plásmido resultante pMDTS9-3H con enzimas de restricción SphI y NotI, en un fragmento de ADN de aproximadamente 9,3 kpb generado mediante digestión del plásmido resultante anterior pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG con enzimas de restricción SphI y NotI para construir un plásmido pCEPdE2-MDTS9Full-FLAG.

El plásmido resultante pCEPdE2-MDTS9Full-FLAG contiene un gen que consiste en las bases 1ª a 3672ª en la secuencia de bases SEQ ID No: 1, es decir, la secuencia de bases del gen de proteasa novedosa MDTS9. Puede expresarse un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 21 añadida al extremo C-terminal de la misma a partir de una célula animal como un huésped.

Además, el plásmido resultante anterior pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG contiene un gen que consiste en las bases 1ª a 2250ª en la secuencia de bases de SEQ ID No: 1, es decir, la secuencia de bases del gen de la proteasa novedosa MDTS9. Puede expresarse un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 y la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 21 añadida al extremo C-terminal de la misma a partir de una célula animal como un huésped. Con respecto a esto, se considera que el polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 es una proteasa ADAMTS.

Ejemplo 3 Expresión de la proteína MDTS9 truncada (MDTS9Cys2) y de la proteína MDTS9 de longitud total (MDTS9Full)

Se usó un reactivo de transfección disponible comercialmente (FuGENE^{TM}6 Transfection Reagent; fabricado por Boehringer Mannheim) según un protocolo relacionado con el mismo, para introducir el plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG o el plásmido pCEPdE2-MDTS9Full-FLAG preparado en el ejemplo 2, o el plásmido pCEPdE2-FLAG preparado en el ejemplo 1 como control, en una célula HEK293-EBNA (fabricada por Invitrogen) cultivada en un medio que contiene suero [DMEM (GIBCO-BRL), suero bovino fetal al 10%, penicilina 100 \mug/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, y G418 250 \mug/ml (fabricado por Nakarai Tesque Inc.)].

Tras la introducción del plásmido, se cultivaron células durante 48 horas (denominado en lo sucesivo en el presente documento cultivo con suero). Alternativamente, tras la introducción del plásmido, se cultivaron las células durante 16 horas, se lavaron con PBS dos veces, y se cultivaron en un medio sin suero [DMEM (GIBCO-BRL), penicilina 100 \mug/ml, estreptomicina 100 \mug/ml, y G418 250 \mug/ml (fabricado por Nakarai Tesque Inc.)] durante 32 horas (denominado en lo sucesivo en el presente documento cultivo sin suero).

Se centrifugó cada líquido de cultivo obtenido en el cultivo con suero o cultivo sin suero a 3000 rpm durante 10 minutos usando una centrífuga (tipo 8800; fabricada por Kubota Corporation) para obtener un sobrenadante de cultivo. Se trató cada célula restante tras la eliminación del medio de cultivo con una disolución de extracción [HEPES 20 mmol/l (pH 7,4), Tritón X-100 al 1%, glicerol al 1% y albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1%] durante 15 minutos, y se retiró de una placa de cultivo pipeteando. Se centrifugó la suspensión celular resultante a 3000 rpm durante 10 minutos usando una centrífuga (tipo 8800; fabricada por Kubota Corporation) para separar una fracción unida de membrana celular (sobrenadante) de una fracción celular (sedimento).

Se confirmó la expresión de las proteínas deseadas en las fracciones resultantes (es decir, sobrenadante de cultivo, fracción unida de membrana celular, y fracción celular) mediante inmunotransferencia tipo Western usando un anticuerpo (anticuerpo M2 monoclonal de ratón anti-FLAG; fabricado por Sigma) frente a la etiqueta FLAG añadida al extremo C-terminal. Más particularmente, se sometió cada fracción a electroforesis en un gel SDS/acrilamida al 10%-20% (fabricado por Daiichi Pure Chemicals) en condiciones reductoras usando 2-ME, y se transfirió a una membrana difluoruro de polivinilideno (PVDF) mediante un aparato de inmunotransferencia. Se añadió a la membrana PVDF resultante, un agente bloqueante (Block-ace, fabricado por Dainippon Pharmaceutical) para realizar un bloqueo. Después, se hizo reaccionar los productos sobre la membrana sucesivamente con el anticuerpo M2 monoclonal de ratón anti-FLAG y un anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa del rábano (fabricado por Zymed o TAGO). Alternativamente, tras el bloqueo, se hizo reaccionar satisfactoriamente los productos sobre la membrana con un anticuerpo M2 biotinilado (fabricado por Sigma) y una estreptoavidina marcada con peroxidasa del rábano (fabricada por Amersham Pharmacia Biotech). Tras la reacción, se confirmó una expresión de la proteína deseada mediante un sistema de detección mediante inmunotransferencia tipo Western disponible comercialmente (ECL Western Blotting Detecting System; fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

Un peso molecular aparente en la electroforesis en gel de SDS/poliacrilamida (SDS-PAGE) de la proteína detectada (es decir, proteína MDTS9 truncada) en cada fracción obtenida mediante el cultivo sin suero de la célula en la que se introdujo el plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG fue de aproximadamente 55 a 65 kDa en el sobrenadante de cultivo, de aproximadamente 55 a 65 kDa en la fracción unida de membrana celular, y de aproximadamente 80 a 95 kDa en la fracción celular.

Además, la proteína detectada (es decir, proteína MDTS9 de longitud total) en cada fracción obtenida mediante cultivo sin suero de la célula en la que se introdujo el plásmido pCEPdE2-MDTS9Full-FLAG, se detectó principalmente en la fracción unida de membrana celular y la fracción celular. Un peso molecular aparente en SDS-PAGE de la misma fue de aproximadamente 130 a 140 kDa en todas las fracciones.

Ejemplo 4 Confirmación de actividad proteasa de proteína MDTS9 truncada (1) Construcción de plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG

Se usó un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange^{TM} (fabricado por Stratagene), según un protocolo relacionado con el mismo, para construir un plásmido pZErO-MDTS9Cys2E/Q que contiene un gen MDTS9Cys2E/Q en el que se sustituye Glu (ácido glutámico) en His-Glu-Ser-Gly-His (SEQ ID No: 22) con Gln (glutamina). Se considera que Glu es un centro activo. En esta construcción, se usó el plásmido pZErO-MDTS9Cys2 preparado en el ejemplo 2 como molde, y se usaron el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 3 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases SEQ ID No: 14 como conjunto de cebadores.

Se insertó un fragmento de ADN de aproximadamente 2,3 kpb generado mediante digestión del plásmido resultante pZErO-MDTS9Cys2E/Q con enzimas de restricción SpeI y NotI, dentro del sitio XbaI y NotI del plásmido pCEPdE2-FLAG construido en el ejemplo 1 para obtener el plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG.

(2) Confirmación de la actividad proteasa basándose en la formación de complejo con \alpha_{2}-macroglobulina

Se sometió a electroforesis (SDS-PAGE) en condiciones reductoras usando 2-ME cada sobrenadante de cultivo (cultivo con suero) de cada célula transfectada con el plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG preparado en el ejemplo 2 o el plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG preparado en el ejemplo 4(1), o el plásmido pCEPdE2-FLAG preparado en el ejemplo 1 como control, y se transfirió a una membrana de PVDF, tal como se describe en el ejemplo 3. A la membrana de PVDF resultante, se añadió un agente bloqueante (Block-Ace fabricado por Dainippon Pharmaceutical) para realizar un bloqueo. Entonces, se hicieron reaccionar sucesivamente los productos sobre la membrana con el anticuerpo de cabra anti-\alpha_{2}-macroglobulina (fabricado por CEDARLANE) y un anticuerpo policlonal de conejo anti-IgG de cabra marcado con peroxidasa del rábano (fabricado por Zymed Laboratories). Tras la reacción, se confirmó una expresión de la proteína deseada mediante un sistema de detección mediante inmunotransferencia de tipo western comercialmente disponible (ECL Western Blotting Detecting System; fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

En el sobrenadante de cultivo (cultivo con suero) de la célula transfectada con el plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG, se detectó una banda de aproximadamente 250 kDa. La banda no se detectó en cada sobrenadante de cultivo (cultivo con suero) de la célula transfectada con plásmido pCEPdE2-MDTS9Cys2E/Q-FLAG o el plásmido pCEPdE2-FLAG. Este resultado muestra que la proteína MDTS9 truncada (MDTS9Cys2) formó un complejo con \alpha_{2}-macroglobulina, y por tanto se confirmó que la proteína MDTS9 truncada (MDTS9Cys2) tenía una actividad proteasa.

Ejemplo 5 Confirmación de la distribución tisular de la expresión del gen de MDTS9

Se analizó una distribución tisular de la expresión del gen de MDTS9 según los siguientes procedimientos, usando un panel de ADNc comercialmente disponible [Human MTC Panel I ("Panel I de MTC humano") (nº de catálogo K1420-1), Human MTC Panel II ("Panel II de MTC humano") (nº de catálogo K1421-1), Human Fetal MTC Panel ("panel de MTC fetal humano") (nº de catálogo K1425-1), y Human Tumor MTC Panel ("panel de MTC de tumor humano") (nº de catálogo K1422-1) en Multiple Tissue cDNA (MTC^{TM}) Panel (panel de ADNc de múltiples tejidos) fabricado por Clontech].

Más particularmente, se llevó a cabo una PCR usando una combinación del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases SEQ ID No: 15 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 16 como cebadores, el panel de ADNc como molde, y ADN polimerasa (TaKaRa KA Taq^{TM}; fabricada por Takara-shuzo). En la PCR, se realizó en primer lugar la reacción de desnaturalización térmica a 94ºC durante 2 minutos. Entonces, se repitió 44 veces un ciclo compuesto por tratamientos a 98ºC durante 10 segundos y 68ºC durante 1 minuto y 30 segundos. Se sometió a electroforesis cada líquido de reacción sobre gel de agarosa para detectar un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1 kpb derivado de ARNm del gen de MDTS9. Como resultado, se reveló que se expresaba ARNm del gen de MDTS9 en un riñón.

Ejemplo 6 Introducción de expresión de gen de MDTS9 mediante TGF-\beta (1) Preparación de ADNc molde

Se sembraron células epiteliales de túbulo proximal humano normal (5 x 10^{5} células; fabricadas por Clonetics) en una placa de 6 pocillos (fabricada por ASAHI TECHNOGLASS CORPORATION), y se cultivaron durante 1 día usando un kit Renal Epithelial Cell Medium ("medio de células epiteliales renales") (fabricado por Clonetics). Se cambió el medio por medio de células epiteliales renales libre de suero, y se continuó adicionalmente el cultivo durante 1 día. Se cambió el medio por medio de células epiteliales renales libres de suero que contenía 10 ng/ml (concentración final) de TGF-\beta1 (fabricado por Sigma), y se cultivaron las células durante 24 horas. Con respecto a esto, se cambió el medio de un grupo control por medio de células epiteliales renales libre de suero sin TGF-\beta1, y se cultivaron las células durante 24 horas.

Se preparó un ARN total de cada grupo tratado usando un reactivo de purificación de ARN total disponible comercialmente (ISOGEN; fabricado por Nippon Gene). Se hizo reaccionar el ARN total resultante con ADNasa (fabricada por Nippon Gene) a 37ºC durante 90 minutos. Se convirtió el ARN total tratado con ADNasa (0,5 \mug) en ADNc mediante el sistema de primera cadena Superscipt (para RT-PCR; fabricado por GIBCO-BRL).

(2) Determinación cuantitativa de ARNm de MDTS9 mediante PCR cuantitativa

Se llevó a cabo un análisis de un cambio de la expresión en la célula epitelial del tubo proximal humano normal usando el ADNc preparado en el ejemplo 6(1) como molde y un detector de secuencias (Prism 7700 Sequence Detector; fabricado por Applied Biosystems). Se usó una combinación del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 17 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 18 como conjunto de cebadores. Se llevó a cabo una PCR, usando un reactivo de PCR disponible comercialmente (reactivo de núcleo SYBR Green PCR; fabricado por Applied Biosystems), llevando a cabo una reacción de desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 minutos, y repitiendo 40 veces una reacción en ciclo compuesta por tratamientos a 94ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos.

Con respecto a esto, para calcular, como patrón interno, una cantidad de \beta-actina humana expresada, se llevó a cabo una PCR, usando el ADNc anterior como molde y una combinación del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 19 y el oligonucleótido que consiste en la SEQ ID No: 20 como conjunto de cebadores en las mismas condiciones. Además, para obtener una curva patrón para calcular una cantidad de ARNm expresado, se llevó a cabo una PCR, usando el ADNc [preparado en el ejemplo 6(1)] a partir de células epiteliales de túbulo proximal humano sin la estimulación mediante TGF-\beta1 como molde y el conjunto de cebadores anterior (es decir, una combinación del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 17 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 18, o una combinación del oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 19 y el oligonucleótido que consiste en la SEQ ID No: 20) en las mismas condiciones. Se mostró una cantidad del ARNm de MDTS9 expresado en cada condición como una razón con respecto a una cantidad de ARNm del gen de \beta-actina expresado en cada condición para obtener una cantidad del ARNm del gen de MDTS9 con respecto a una cierta cantidad del ARN total. Como resultado, se reveló que TGF- \beta1 inducía la expresión génica de ARNm del gen de MDTS9 en aproximadamente 8 veces.

Ejemplo 7 Cambio de la expresión del gen de MDTS9 en un modelo de fallo renal de ratas (1) Preparación de ADNc molde

Se preparó ADNc a partir de un riñón de un modelo de nefrectomía 5/6 de rata [Kenjuro Kimura, "jin to toseki (kidney and dialysis)", 1991 (sup.), 431-439]. Tras 1, 2, 3, 4, 6, 8, y 10 semanas desde la nefrectomía 5/6, se anatomizaron cinco ratas con nefrectomía 5/6 y cinco ratas con operación fingida para extirpar los riñones. Se congelaron inmediatamente los riñones y se mantuvieron a -80ºC. Se trituraron los riñones derivados de cada grupo usando un triturador celular (CRYO-PRESS CP-100; fabricado por Microtec Nition) mientras estaban congelados con nitrógeno líquido, y luego se preparó un ARN total usando un reactivo de purificación de ARN total (ISOGEN; fabricado por Nippon Gene). Se hizo reaccionar el ARN total extraído con ADNasa (fabricad por Nippon Gene) a 37ºC durante 90 minutos. Se convirtió el ARN total tratado con ADNasa (0,25 \mug) en ADNc mediante un sistema de primera cadena Superscript (para RT-PCR; fabricado por GIBCO-BRL).

(2) Determinación cuantitativa de ARNm de contraparte de MDTS9 de rata mediante PCR cuantitativa

Se llevó a cabo un análisis de un cambio de la expresión en un modelo de fallo renal de rata usando el ADNc preparado en el ejemplo 7(1) como molde y un detector de secuencias (Prism 7700 Sequence Detector; fabricado por Applied Biosystems). Se usaron el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 23 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 24 como conjunto de cebadores. Se llevó a cabo una PCR, usando un reactivo de PCR disponible comercialmente (reactivo de núcleo SYBR Green PCR; fabricado por Applied Biosystems), llevando a cabo una reacción de desnaturalización inicial a 95ºC durante 10 minutos, y repitiendo 45 veces una reacción en ciclo compuesta por tratamientos a 94ºC durante 15 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 60 segundos.

Para calcular, como patrón interno, una cantidad de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH) humana expresada, se llevó a cabo una PCR, usando el ADNc anterior como molde y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 25 y el oligonucleótido que consiste en la secuencia de bases de SEQ ID No: 26 como conjunto de cebadores en las mismas condiciones. Además, para obtener una curva patrón para calcular una cantidad de ARNm expresado, se llevó a cabo una PCR, usando el ADN genómico de rata (fabricado por Clontech) y el conjunto de cebadores anterior en las mismas condiciones. Se mostró una cantidad del ARNm de gen de MDTS9 expresado en cada condición como una razón con respecto a una cantidad de ARNm del gen de G3PDH expresado en cada condición para comparar una cantidad del ARNm del gen de MDTS9 de rata con respecto a una cierta cantidad del ARN total en cada grupo. Como resultado, se encontró que el ARN, del gen de MDTS9 de rata se expresaba en la rata con nefrectomía 5/6 aproximadamente 5 veces comparado con la rata con operación fingida tras 1 semana desde la operación, y que se expresaba aproximadamente 2 veces tras 3 semanas (una cantidad de proteínas en la orina remarcablemente aumentada), 6 semanas (el peso del riñón comenzó a aumentar comparado con el peso del riñón normal), y 8 semanas (se agravaron los síntomas) desde la operación.

A partir de este ejemplo se reveló que se induce una expresión del gen de MDTS9 en el modelo de fallo renal.

Ejemplo 8 Tinción inmunohistoquímica de la sección de tejido renal (1) Preparación de anticuerpo anti-MDTS9 humano

Se preparó una proteína de fusión (GST-MDTS9A) de un péptido que consiste en los aminoácidos 280º a 410º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 y glutatión S-transferasa (GST), usando un plásmido pGEX-6P-1 (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech) como un vector de expresión y E. coli, en una fracción de cuerpo de inclusión, según un manual de laboratorio [Masato Okada y Maoru Miyazakim, "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Jyo (revision, notebook for protein experiments)", Yodo-sha, págs. 162-179]. Se llevó a cabo una electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (PAGE) preparativa usando la fracción de cuerpo de inclusión, y luego se extrajo la proteína GST-MDTS9 deseada del gel mediante un método de difusión [Masato Okada y Kaoru Miyakazi, "Kaitei, Tanpakushitsu Jikken Noto, Ge (revision, notebook for protein experiments)", Yodo-sha, págs.48-51].

Se inmunizó un conejo (blanco japonés) mediante la proteína GST-MDTS9A resultante 5 veces en total con un intervalo de 10 a 14 días para obtener antisuero. Se purificó una fracción de IgG del antisuero mediante cromatografía de afinidad usando una columna de Sepharose FF de proteína G (fabricada por Amersham Pharmacia Biotech). Entonces, se purificó un anticuerpo anti-MDTS9 humano a partir de la fracción de IgG mediante cromatografía de afinidad usando una columna (columna MBP-MDTS9A) en la que se inmovilizaron una proteína de fusión (MBP-MDTS9A) de un péptido que consiste en los aminoácidos 280º a 410º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2 y proteína de unión a la manosa (MBP). La purificación por afinidad mediante la columna de Sepharose FF de proteína G, inmovilización de MBP-MDTS9A a una columna de Sepharose FF activada con CNBr (fabricada por Amersham Pharmacia Biotech), y la purificación por afinidad mediante columna de MBP-MDTS9A se llevaron a cabo según protocolos relacionados con las mismas. Además, se llevó a cabo una preparación de MBP-MDTS9A en E. coli y purificación de la misma usando pMALc2E (fabricado por New England Biolabs) como vector de expresión según unas instrucciones "pMAL protein fusion and purification system" publicadas por la misma.

(2) Detección de proteína MDTS9 en riñón humano

Se hizo reaccionar el anticuerpo anti-MDTS9 humano preparado en el ejemplo 8(1) con una sección de tejido que se había fijado mediante formalina e incrustado en parafina sobre un portaobjetos. Entonces, se tiñó la sección de tejido usando un kit de tinción disponible comercialmente (kit VECTORSTAIN ABC-AP, nº de catálogo AK-5000; fabricado por VECTOR LABORATORIES) según un protocolo relacionado con el mismo. En este procedimiento, se usaron un anticuerpo anti-conejo marcado con biotina (nº de catálogo BA-1000; fabricado por Vector) como segundo anticuerpo y un kit I de sustrato de fosfatasa alcalina (nº de catálogo SK-5100; fabricado por Vector) como sustrato de revelado de color. Como resultado, se observó tinción en células epiteliales (particularmente podocitos) de riñones de una persona sana y un paciente que padece nefropatía diabética (fase temprana o fase tardía).

Resulta claro a partir de este ejemplo que la proteína MDTS9 se expresa en el riñón humano.

Aplicabilidad industrial

El polipéptido de la presente invención es una proteasa novedosa, que se expresa en un riñón, inducida por TGF-\beta e implicada con un metabolismo en una matriz extracelular. Por tanto, una sustancia que inhibe la actividad proteasa del polipéptido de la presente invención es útil como agente para tratar el fallo renal crónico en la que se prevé una administración a largo plazo, dado que es sumamente posible que la sustancia suprima o inhiba únicamente una parte que está implicada con un cambio cualitativo y un aumento cuantitativo de componentes de matriz extracelular, entre las acciones fisiológicas de TGF-\beta. Esto es, según el polipéptido de la presente invención, un sistema de selección conveniente para detectar un agente para tratar el fallo renal crónico. Además, el polinucleótido, el vector de expresión, la célula y el anticuerpo de la presente invención son útiles para producir el polipéptido de la presente invención.

Texto libre en la lista de secuencias

Las características de la "secuencia artificial" se describen en el identificador numérico <223> en la lista de secuencias. Más particularmente, cada una de las secuencias de bases de SEQ ID Nos: 3 y 4 es una secuencia ligadora sintetizada artificialmente. Cada una de las secuencias de bases de SEQ ID Nos: 5-9 y 12-14 son una secuencia de cebador sintetizada artificialmente. La secuencia de bases de SEQ ID No: 21 es una secuencia de aminoácidos obtenida mediante expresión de ADN que contiene una secuencia de nucleótido de reconocimiento de enzima de restricción NotI y una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos de etiqueta FLAG.

<110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<120> Proteasa novedosa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<130> YO132PCT-664

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<150> JP 2000-393372

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 25-12-2000

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 3675

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(3675)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

1

2

3

4

5

6

7

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1224

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

9

10

11

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia ligadora sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctagcgcggc cgcaggatcc gactacaagg acgacgatga caaatgataa

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia ligadora sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcttatca tttgtcatcg tcgtccttgt agtcggatcc tgcggccgcg

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtct agaagctggg taccagctgc tagc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtgt cgaccggtca tggctgcgc

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtgc catgggaccc gcagcggcag cgcctggg

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcggccgc acccctgtga atcgtgcagg ctgagttatt

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggactagtac catgaagccc cgcgcgcgcg gatggcgggg c

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctgtggtc aacctcgtag gcagagacca

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcagttcgg agagaaagcc aagctct

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggcggccgc caagttggac ttagagcaag tcttgcagca

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggccttcac cattgcccat cagtctggac acaactttgg c

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de cebador sintetizada artificialmente

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gccaaagttg tgtccagact gatgggcaat ggtgaaggcc a

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caccttaagt agcttctgcc agtggcagtc t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acaaacatta cggctatcct ccgagcatgg ag

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttctaagcac cgctcaagct atc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gggccttcat caccatattt ca

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgccatc ctgcgtctg

\hfill

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggggccgga ctcgtcatac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de secuencia artificial: una secuencia de aminoácidos obtenida mediante expresión de un ADN que contiene una secuencia de nucleótido de reconocimiento de enzima de restricción NotI y una secuencia de nucleótido que codifica para una secuencia de aminoácidos de etiqueta FLAG

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Glu Ser Gly His}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agcctagctc ccgatccaa

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccaccag agtctccaca t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aagcaggcgg ccgag

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Rattus sp.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atcaaaggtg gaagaatggg a

\hfill

21

Claims (12)

1. Un polipéptido que muestra una actividad proteasa y que comprende (1) la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, (2) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, o (3) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácido de SEQ ID No: 2.

3. Polipéptido según la reivindicación 1, que consiste en (1) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, o (2) una secuencia de aminoácidos en la que se eliminan, sustituyen y/o insertan de 1 a 10 aminoácidos en la secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, que consiste en (1) aminoácidos 1º a 750º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2, o (2) aminoácidos 1º a 1224º en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 2.

5. Un polinucleótido que codifica el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido según la reivindicación 5.

7. Una célula transfectada con el vector de expresión según la reivindicación 6.

8. Un anticuerpo o fragmento del mismo, que se une al polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

9. Un procedimiento para producir el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:

cultivar la célula según la reivindicación 7, y

recuperar el polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

10. Un método para detectar si un compuesto que debe someterse a prueba inhibe o no la actividad proteasa del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende las etapas de:

poner en contacto (1) dicho polipéptido, (2) \alpha_{2}-macroglobulina, y (3) dicho compuesto que debe someterse a prueba, y analizar si dicho polipéptido y \alpha_{2}-macroglobulina forman o no un complejo que no se disocia por SDS y/o un agente reductor.

11. El método según la reivindicación 10, que comprende además la etapa de:

seleccionar una sustancia que inhiba la actividad proteasa.

12. El método para seleccionar una sustancia para tratar el fallo renal crónico mediante el método según la reivindicación 11.