JP2002171982A - 新規なｋ＋チャネル蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規ポリペプチド、前記ポリペプチドをコー
ドするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む
発現ベクター、前記発現ベクターでトランスフェクショ
ンされた細胞、前記ポリペプチドに結合する抗体、及び
疼痛治療剤を得るための簡便なスクリーニングツールを
提供する。 【解決手段】 前記ポリペプチドは、脊髄に発現してい
る新規のバックグラウンドＫ⁺チャネルである。前記ス
クリーニングツールは、前記細胞である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なカリウムイ
オン（Ｋ⁺）チャネルタンパク質に関する。

【０００２】

【従来の技術】脊髄は、一次知覚神経の投射を受けてお
り、侵害受容器により感受された痛みの刺激を脳に伝達
する役割を担っている神経組織である。侵害刺激は、一
次知覚神経を介して脊髄の神経細胞を興奮させ、脊髄神
経細胞はその刺激を視床へと伝達する。更に、その刺激
は大脳知覚領へと伝達され、痛みの認識及び識別という
過程をたどる。そのため、脊髄神経細胞の興奮性を低下
させる薬剤は、侵害刺激の伝達を抑制することができ
る。このような薬剤は、慢性関節リウマチや変形性関節
炎における痛みのような病的な痛みを抑える疼痛治療薬
として有用である。疼痛には、神経因性疼痛のように侵
害刺激を伴わないものも存在するが、神経因性疼痛は、
痛みの伝達に関わる神経細胞自体の興奮性が高まってい
るために誘発される疼痛と考えられているため、神経因
性疼痛に対しても脊髄神経細胞の興奮性を低下させる薬
剤は有効である（Ｓｏｔｇｉｕら，Ｓｏｍａｔｏｓｅｎ
ｓ．Ｍｏｔ．Ｒｅｓ．，９，２２７，１９９２；Ｚｈａ
ｎｇら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８４，７９８，２００
０；Ｍａ及びＷｏｏｌｆ，Ｐａｉｎ，６１，３８３，１
９９５；並びにＳｏｔｇｉｕ及びＢｉｅｌｌａ，Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔ．，２８３，１５３，２０００）。

【０００３】神経細胞の興奮性は、膜電位によって変化
する。膜電位が脱分極することによって神経細胞は興奮
し、逆に、膜電位が過分極すると興奮性は低下する。す
なわち、神経細胞の膜電位を制御することにより、その
興奮性をコントロールすることが可能である。膜電位
は、細胞の内外のＮａ⁺、Ｋ⁺、Ｃｌ^-、又はＣａ²⁺など
の無機イオンが担う電荷の分布によって決定されてお
り、この電荷分布は、膜タンパク質によって構成される
種々のイオンチャネルの開閉によって変化する。そのた
め、イオンチャネルの開閉は膜電位の変化において重要
な役割を担っている。特に、Ｋ⁺イオンを選択的に透過
する膜タンパク質であるＫ⁺チャネルは、静止膜電位の
維持や脱分極後の膜電位の再分極などに関与していると
考えられており、神経細胞の興奮性を制御するための良
いターゲットの１つである。

【０００４】Ｋ⁺チャネルは、機能的に、膜電位依存性
（ｖｏｌｔａｇｅ−ｇａｔｅｄ）Ｋ⁺チャネル、Ｃａ²⁺
依存性（Ｃａ²⁺−ａｃｔｉｖａｔｅｄ）Ｋ⁺チャネル、
ＡＴＰ依存性（ＡＴＰ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｋ⁺チャ
ネル、内向き整流性（ｉｎｗａｒｄ ｒｅｃｔｉｆｉｅ
ｒ）Ｋ⁺チャネル、及びバックグラウンド（ｂａｃｋｇ
ｒｏｕｎｄ）Ｋ⁺チャネル等に分類される。中でも、バ
ックグラウンドＫ⁺チャネルは、静止膜電位下で開口し
ている性質を持っているため、静止膜電位のコントロー
ルに大きく寄与していると考えられている（Ｌｅｓａｇ
ｅら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５，１００４，１９９６；及
びＤｕｐｒａｔら，ＥＭＢＯ Ｊ．，１６，５４６４，
１９９７）。

【０００５】バックグラウンドＫ⁺チャネルの活性化
は、過分極側への膜電位のシフトを引き起こす。例え
ば、ハロタンなどの吸入麻酔薬は、舌下神経又は頸動脈
小体知覚神経などのバックグラウンドＫ⁺チャネルを活
性化し、前記神経細胞の膜電位を過分極側にシフトさ
せ、その興奮性を低下させることが報告されている（Ｓ
ｉｒｏｉｓら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０，６３４
７，２０００；及びＢｕｃｋｌｅｒら，Ｊ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，５２５，１３５，２０００）。すなわち、これ
らの事実は、神経細胞のバックグラウンドＫ⁺チャネル
に対する活性化剤が、膜電位の過分極側へのシフトを引
き起こし、神経細胞の興奮性を低下させる作用を有する
ことを示している。更に、最初に述べたように、脊髄神
経細胞の興奮性を低下させる薬剤は、神経伝達を抑制
し、痛みを緩和する作用を有すると考えられるため、脊
髄神経細胞のバックグラウンドＫ⁺チャネルに対する活
性化剤は、脊髄神経細胞の興奮性を低下させることを作
用機序とする疼痛の治療剤として有用であると考えられ
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、新規
のバックグラウンドＫ⁺チャネルタンパク質、及びそれ
をコードする新規のポリヌクレオチドを提供し、脊髄神
経細胞の興奮性を低下させることを作用機序とする疼痛
治療剤として有用な物質を得るための簡便なスクリーニ
ング系を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）配列番
号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド、あ
るいは、（２）配列番号２で表されるアミノ酸配列の１
又は複数の箇所において、１又は複数個のアミノ酸が欠
失、置換、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、
しかも、バックグラウンドカリウムイオンチャネル活性
を示すポリペプチドに関する。また、本発明は、前記ポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。ま
た、本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクタ
ーに関する。また、本発明は、前記発現ベクターでトラ
ンスフェクションされた細胞に関する。また、本発明
は、前記ポリペプチドに結合する抗体に関する。また、
本発明は、前記細胞である、疼痛治療剤スクリーニング
ツールに関する。更に、本発明は、前記細胞（すなわ
ち、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを
含む発現ベクターでトランスフェクションされた細胞）
と、試験化合物とを接触させる工程、及び前記ポリペプ
チドが活性化されるか否かを分析する工程を含むことを
特徴とする、疼痛治療剤をスクリーニングする方法に関
する。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のポリペプチドには、（１）配列番号２で表され
るアミノ酸配列を有するポリペプチド；（２）配列番号
２で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所におい
て、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は
付加されたアミノ酸配列を有し、しかも、バックグラウ
ンドＫ⁺チャネル活性を示すポリペプチド（以下、機能
的等価改変体と称する）；及び（３）配列番号２で表さ
れるアミノ酸配列との相同性が９０％以上であるアミノ
酸配列を有し、しかも、バックグラウンドＫ⁺チャネル
活性を示すポリペプチド（以下、相同ポリペプチドと称
する）が含まれる。

【０００９】本発明のポリペプチドの１つである、配列
番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
は、３８４個のアミノ酸残基からなるヒト由来の新規の
バックグラウンドＫ⁺チャネルタンパク質である。バッ
クグラウンドＫ⁺チャネルタンパク質とは、（ａ）電圧
刺激により電流が生じること；（ｂ）電圧刺激により生
じた前記電流が、瞬時に惹起され、不活性化しないこ
と；及び（ｃ）Ｋ⁺イオン選択性が高いことの３条件を
満たすことを特徴とするＫ⁺チャネルタンパク質であ
る。本明細書において「バックグラウンドＫ⁺チャネル
活性を示す」とは、前記（ａ）〜（ｃ）の３つの特徴を
全て満たすことを意味する（Ｄｕｐｒａｔら，ＥＭＢＯ
Ｊ．，１６，５４６４，１９９７；又はＬｅｓａｇｅ
及びＬａｚｄｕｎｓｋｉ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．
Ｒｅｎａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２７９，Ｆ７９３，２
０００）。また、配列番号２で表されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドは、後述の実施例２に示すように、
脊髄に発現しているタンパク質である。

【００１０】本明細書において、或るポリペプチドが
「電圧刺激により電流が生じる」か否か、そして、前記
ポリペプチドにおいて「電流が瞬時に惹起され、不活性
化しない」か否かは、当業者に公知の方法（Ｈｉｌｌ
ｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ Ｅｘ
ｃｉｔａｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ Ｅ
ｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎ
ｃ．，ＭＡ，１９９２）で確認することができ、特に限
定されるものではないが、例えば、以下の方法（好まし
くは、後述の実施例４に記載の方法）を用いることがで
きる。すなわち、前記ポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチドを含む発現ベクターで細胞をトランスフェク
ションし、得られた細胞をホールセル膜電位固定（ｗｈ
ｏｌｅ−ｃｅｌｌｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法によ
り膜電位固定した状態で、保持電位−８０ｍＶから４０
０ミリ秒間、０ｍＶの脱分極パルスを与える。前記脱分
極パルスにより外向き電流が生じれば、前記ポリペプチ
ドが「電圧刺激により電流が生じる」と判定することが
できる。また、前記脱分極パルスにより生じた前記外向
き電流が、瞬時に惹起され、しかも、不活性化がみられ
なければ、前記ポリペプチドでは、「電流が瞬時に惹起
され、不活性化しない」と判定することができる。

【００１１】また、本明細書において、或るポリペプチ
ドの「Ｋ⁺イオン選択性が高い」か否かは、当業者に公
知の方法（Ｈｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎｉｃ Ｃｈａｎｎ
ｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ Ｍｅｍｂｒａｎｅ
ｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２）で確認することが
でき、特に限定されるものではないが、例えば、以下の
方法（好ましくは、後述の実施例５に記載の方法）によ
り確認することができる。すなわち、前記ポリペプチド
をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細
胞をトランスフェクションし、得られた細胞をホールセ
ル膜電位固定法により膜電位固定した状態で、細胞外液
のＫ⁺濃度を変えながら、各Ｋ⁺濃度における反転電位を
ランプ波を用いて測定する。各Ｋ⁺濃度に対する反転電
位をプロットし、得られた直線の傾きが、ネルンスト
（Ｎｅｒｎｓｔ）の式から求められる傾きの理論値（５
９ｍＶ／ｄｅｃａｄｅ）とほぼ同様の数値が得られれ
ば、前記ポリペプチドの「Ｋ⁺イオン選択性が高い」と
判定することができる。

【００１２】本発明の機能的等価改変体は、配列番号２
で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、
１又は複数個（好ましくは１〜１０個、より好ましくは
１〜７個、更に好ましくは１〜５個）、例えば、１〜数
個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加されたアミ
ノ酸配列を有し、しかも、バックグラウンドＫ⁺チャネ
ル活性を示すポリペプチドである限り、特に限定される
ものではなく、その起源もヒトに限定されない。

【００１３】例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドのヒトにおける変異体が含まれ
るだけでなく、ヒト以外の生物（例えば、マウス、ラッ
ト、ハムスター、又はイヌ）由来の機能的等価改変体が
含まれる。更には、それらの天然ポリペプチド（すなわ
ち、ヒト由来の変異体、あるいは、ヒト以外の生物由来
の機能的等価改変体）を元にして、あるいは、配列番号
２で表されるアミノ酸配列で表されるアミノ酸配列を有
するポリペプチドを元にして、遺伝子工学的に人為的に
改変したポリペプチドなどが含まれる。なお、本明細書
において「変異体」（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）とは、同一
種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、あるいは、
数種間の相同ポリペプチドにみられる差異を意味する。

【００１４】配列番号２で表されるアミノ酸配列を有す
るポリペプチドのヒトにおける変異体、あるいは、ヒト
以外の生物由来の機能的等価改変体は、当業者であれ
ば、配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペ
プチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列（例え
ば、配列番号１で表される塩基配列における第１０番〜
第１１６４番の塩基からなる配列）の情報を基にして、
取得することができる。なお、遺伝子組換え技術につい
ては、特に断りがない場合、公知の方法（例えば、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施すること
が可能である。

【００１５】例えば、配列番号２で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
の塩基配列の情報を基にして適当なプライマー又はプロ
ーブを設計し、前記プライマー又はプローブと、目的と
する生物［例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、
ラット、ハムスター、又はイヌ）］由来の試料（例え
ば、総ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡ画分、ｃＤＮＡライブラ
リー、又はファージライブラリー）とを用いてポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．ら，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，４８７−４９１，１９８８）
又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、
ポリペプチドコードするポリヌクレオチドを取得し、そ
のポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、
発現したポリペプチドが、例えば、実施例４に記載の方
法により、脱分極パルスにより電流が生じ、しかも、電
流が瞬時に惹起され、不活性化しないことを確認し、更
に、実施例５に記載の方法により、Ｋ⁺イオン選択性が
高いことを確認することにより、所望のポリペプチドを
取得することができる。

【００１６】また、前記の遺伝子工学的に人為的に改変
したポリペプチドは、常法、例えば、部位特異的突然変
異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ；Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６６２−５６
６６，１９８４）により、ポリペプチドをコードするポ
リヌクレオチドを取得し、そのポリヌクレオチドを適当
な発現系を用いて発現させ、発現したポリペプチドが、
例えば、実施例４に記載の方法により、脱分極パルスに
より電流が生じ、しかも、電流が瞬時に惹起され、不活
性化しないことを確認し、更に、実施例５に記載の方法
により、Ｋ⁺イオン選択性が高いことを確認することに
より、所望のポリペプチドを取得することができる。

【００１７】また、本発明の機能的等価改変体には、配
列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
のＮ末端及び／又はＣ末端に、適当なマーカー配列等を
付加したポリペプチド（すなわち、融合ポリペプチド）
も、バックグラウンドＫ⁺チャネル活性を示す限り、含
まれる。前記マーカー配列としては、ポリペプチドの発
現の確認、細胞内局在の確認、あるいは、精製等を容易
に行なうための配列を用いることができ、例えば、ＦＬ
ＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、ヘマグル
チニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙げること
ができる。

【００１８】本発明の相同ポリペプチドは、配列番号２
で表されるアミノ酸配列との相同性が９０％以上である
アミノ酸配列を有し、しかも、バックグラウンドＫ⁺チ
ャネル活性を示すポリペプチドである限り、特に限定さ
れるものではないが、配列番号２で表されるアミノ酸配
列に関して、好ましくは９５％以上、より好ましくは９
８％以上、更に好ましくは９９％以上の相同性を有する
アミノ酸配列を有することができる。なお、本明細書に
おける前記「相同性」とは、Ｃｌｕｓｔａｌｐｒｏｇｒ
ａｍ（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ，７
３，２３７−２４４，１９８８；並びにＴｈｏｍｐｓｏ
ｎら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２，４
６７３−４６８０，１９９４）により得られた値を意味
する。

【００１９】本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポ
リペプチドをコードするポリヌクレオチドである限り、
特に限定されるものではなく、例えば、配列番号１で表
される塩基配列における第１０番〜第１１６４番の塩基
からなる配列を有するポリヌクレオチドを挙げることが
できる。なお、本明細書における用語「ポリヌクレオチ
ド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方が含まれる。

【００２０】本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、
特に限定されるものではないが、例えば、（１）ＰＣＲ
を用いた方法、（２）常法の遺伝子工学的手法（すなわ
ち、ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した形質転換株か
ら、所望のｃＤＮＡを含む形質転換株を選択する方法）
を用いる方法、又は（３）化学合成法などを挙げること
ができる。以下、各製造方法について、順次、説明す
る。

【００２１】前記（１）のＰＣＲを用いた方法では、例
えば、以下の手順により、本発明のポリヌクレオチドを
製造することができる。すなわち、本発明のポリペプチ
ドを産生する能力を有するヒト細胞又は組織からｍＲＮ
Ａを抽出する。次いで、本発明のポリペプチドをコード
するポリヌクレオチドの塩基配列に基づいて、本発明の
ポリペプチドに相当するｍＲＮＡの全長を挟むことので
きる２個１組のプライマーセット、あるいは、その一部
のｍＲＮＡ領域を挟むことのできる２個１組のプライマ
ーセットを作成する。抽出した前記ｍＲＮＡを鋳型とす
る逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）
を行なうことにより、本発明のポリペプチドの全長ｃＤ
ＮＡ又はその一部を得ることができる。

【００２２】より詳細には、まず、本発明のポリペプチ
ドの産生能力を有する細胞又は組織（例えば、ヒト脊
髄）から、本発明のポリペプチドをコードするｍＲＮＡ
を含む総ＲＮＡを既知の方法により抽出する。抽出法と
しては、例えば、グアニジン・チオシアネート・ホット
・フェノール法、グアニジン・チオシアネート−グアニ
ジン・塩酸法、又はグアニジン・チオシアネート塩化セ
シウム法等を挙げることができるが、グアニジン・チオ
シアネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。本
発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織
は、例えば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌ
クレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッティン
グ法、あるいは、本発明のポリペプチドに特異的な抗体
を用いたウエスタンブロッティング法などにより特定す
ることができる。

【００２３】続いて、抽出したｍＲＮＡを精製する。ｍ
ＲＮＡの精製は常法に従えばよく、例えば、ｍＲＮＡを
オリゴ（ｄＴ）セルロースカラムに吸着後、溶出させる
ことにより精製することができる。所望により、ショ糖
密度勾配遠心法等によりｍＲＮＡを更に分画することも
できる。また、ｍＲＮＡを抽出しなくても、市販されて
いる抽出精製済みのｍＲＮＡを用いることもできる。次
に、精製されたｍＲＮＡを、例えば、ランダムプライマ
ー、オリゴｄＴプライマー、及び／又はカスタム合成し
たプライマーの存在下で、逆転写酵素反応を行ない、第
１鎖ｃＤＮＡを合成する。この合成は、常法によって行
なうことができる。得られた第１鎖ｃＤＮＡを用い、目
的ポリヌクレオチドの全長又は一部の領域を挟んだ２種
類のプライマーを用いてＰＣＲを実施し、目的とするｃ
ＤＮＡを増幅することができる。得られたＤＮＡをアガ
ロースゲル電気泳動等により分画する。所望により、前
記ＤＮＡを制限酵素等で切断し、接続することによって
目的とするＤＮＡ断片を得ることもできる。

【００２４】前記（２）の常法の遺伝子工学的手法を用
いる方法では、例えば、以下の手順により、本発明のポ
リヌクレオチドを製造することができる。まず、前記の
ＰＣＲを用いた方法で調製したｍＲＮＡを鋳型として、
逆転写酵素を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、この
１本鎖ｃＤＮＡから２本鎖ｃＤＮＡを合成する。その方
法としては、例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ法（Ｅｆｓｔｒ
ａｔｉａｄｉｓ，Ａ．ら，Ｃｅｌｌ，７，２７９−２８
８，１９７６）、Ｌａｎｄ法（Ｌａｎｄ，Ｈ．ら，Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，２２５１−２
２６６，１９８１）、Ｏ．Ｊｏｏｎ Ｙｏｏ法（Ｙｏ
ｏ，Ｏ．Ｊ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，７９，１０４９−１０５３，１９８３）、
又はＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ法（Ｏｋａｙａｍａ，
Ｈ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１−１７０，１９８２）などを挙げるこ
とができる。

【００２５】次に、前記２本鎖ｃＤＮＡを含む組換えプ
ラスミドを作製した後、大腸菌（例えば、ＤＨ５α株）
に導入して形質転換させ、例えば、テトラサイクリン又
はアンピシリンに対する薬剤耐性を指標として、組換体
を選択する。宿主細胞の形質転換は、例えば、宿主細胞
が大腸菌の場合には、Ｈａｎａｈａｎの方法（Ｈａｎａ
ｈａｎ，Ｄ．Ｊ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６６，５５
７−５８０，１９８３）、すなわち、ＣａＣｌ₂、Ｍｇ
Ｃｌ₂、又はＲｂＣｌを共存させて調製したコンピテン
ト細胞に、前記組換えＤＮＡ体を加える方法により実施
することができる。なお、ベクターとしては、プラスミ
ド以外にもラムダ系などのファージベクターを用いるこ
ともできる。

【００２６】このようにして得られる形質転換株から、
目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する方法とし
ては、例えば、以下に示す（ｉ）合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用いる形質転換株スクリーニング法、（i
i）ＰＣＲにより作製したプローブを用いる形質転換株
スクリーニング法、（iii）他の動物細胞で目的ポリペ
プチドを産生させる形質転換株スクリーニング法、（i
v）本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転
換株スクリーニング法、（ｖ）バックグラウンドＫ ⁺チ
ャネル活性を指標とする形質転換株スクリーニング法、
又は（ｖｉ）セレクティブ・ハイブリダイゼーション・
トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニン
グ法を採用することができる。

【００２７】前記（ｉ）の合成オリゴヌクレオチドプロ
ーブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例え
ば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択することができる。すなわち、本発明のポリ
ペプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチド
を合成し、これをプローブ（³²Ｐ又は³³Ｐで標識する）
として、形質転換株のＤＮＡを変性固定したニトロセル
ロースフィルターとハイブリダイズさせ、得られた陽性
株を検索して、これを選択する。なお、プローブ用のオ
リゴヌクレオチドを合成する場合には、コドン使用頻度
を用いて導いたヌクレオチド配列とすることもできる
し、あるいは、考えられるヌクレオチド配列を組合せた
複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。後者の
場合には、イノシンを含ませてその種類を減らすことが
できる。

【００２８】前記（ii）のＰＣＲにより作製したプロー
ブを用いる形質転換株スクリーニング法では、例えば、
以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株
を選択することができる。すなわち、本発明のポリペプ
チドの一部に対応するセンスプライマー及びアンチセン
スプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、これら
を組合せてＰＣＲを行ない、目的ポリペプチドの全部又
は一部をコードするＤＮＡ断片を増幅する。ここで用い
る鋳型ＤＮＡとしては、本発明のポリペプチドを産生す
る細胞のｍＲＮＡより逆転写反応にて合成したｃＤＮ
Ａ、又はゲノムＤＮＡを用いることができる。このよう
にして調製したＤＮＡ断片を、例えば、³²Ｐ又は³³Ｐで
標識し、これをプローブとして用いてコロニーハイブリ
ダイゼーション又はプラークハイブリダイゼーションを
行なうことにより、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株
を選択する。

【００２９】前記（iii）の他の動物細胞で目的ポリペ
プチドを産生させる形質転換株スクリーニング法では、
例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形
質転換株を選択することができる。すなわち、形質転換
株を培養し、ポリヌクレオチドを増幅させ、そのポリヌ
クレオチドを動物細胞にトランスフェクトし、ポリヌク
レオチドにコードされたポリペプチドを細胞表面に産生
させる。なお、この場合、自己複製可能で転写プロモー
ター領域を含むプラスミド、あるいは、動物細胞の染色
体に組み込まれ得るようなプラスミドのいずれを用いる
こともできる。本発明のポリペプチドに対する抗体を用
いて、本発明のポリペプチドを検出することにより、元
の形質転換株の中から、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択する。

【００３０】前記（iv）の本発明のポリペプチドに対す
る抗体を用いる形質転換株スクリーニング法では、例え
ば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択することができる。すなわち、予め、ｃＤＮ
Ａを発現ベクターに組込み、形質転換株の細胞表面でポ
リペプチドを産生させ、本発明のポリペプチドに対する
抗体及び前記抗体に対する２次抗体を用いて、所望のポ
リペプチド産生株を検出し、目的のｃＤＮＡを有する形
質転換株を選択する。

【００３１】前記（ｖ）のバックグラウンドＫ⁺チャネ
ル活性を指標とする形質転換株スクリーニング法では、
例えば、以下の手順により、目的のｃＤＮＡを有する形
質転換株を選択することができる。すなわち、予め、ｃ
ＤＮＡを発現ベクターに組込み、形質転換株の細胞表面
でポリペプチドを産生させ、バックグラウンドＫ⁺チャ
ネル活性を指標として、所望のポリペプチド産生株を検
出し、目的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択する。

【００３２】前記（vi）のセレクティブ・ハイブリダイ
ゼーション・トランスレーション系を用いる形質転換株
スクリーニング法では、例えば、以下の手順により、目
的のｃＤＮＡを有する形質転換株を選択することができ
る。すなわち、形質転換株から得られるｃＤＮＡを、ニ
トロセルロースフィルター等にブロットし、本発明のポ
リペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製したｍ
ＲＮＡをハイブリダイズさせた後、ｃＤＮＡに結合した
ｍＲＮＡを解離させ、回収する。回収されたｍＲＮＡを
適当なポリペプチド翻訳系、例えば、アフリカツメガエ
ルの卵母細胞へ注入したり、あるいは、ウサギ網状赤血
球ライゼート又は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、ポリ
ペプチドに翻訳させる。本発明のポリペプチドに対する
抗体を用いて検出して、目的のｃＤＮＡを有する形質転
換株を選択する。

【００３３】得られた目的の形質転換株より本発明のポ
リヌクレオチドを採取する方法は、公知の方法（例え
ば、Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ，１９８２）に従って実施す
ることができる。例えば、細胞よりプラスミドＤＮＡに
相当する画分を分離し、得られたプラスミドＤＮＡから
ｃＤＮＡ領域を切り出すことにより行なうことができ
る。

【００３４】前記（３）の化学合成法を用いた方法で
は、例えば、化学合成法によって製造したＤＮＡ断片を
結合することによって、本発明のポリヌクレオチドを製
造することができる。各ＤＮＡは、ＤＮＡ合成機［例え
ば、Ｏｌｉｇｏ １０００ＭＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉ
ｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ社製）、又は３９４ ＤＮＡ／
ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）など］を用いて合成すること
ができる。また、本発明のポリヌクレオチドは、本発明
のポリペプチドの情報に基づいて、例えば、ホスファイ
ト・トリエステル法（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，Ｍ．
ら，Ｎａｔｕｒｅ，１０，１０５−１１１，１９８４）
等の常法に従い、核酸の化学合成により製造することも
できる。なお、所望アミノ酸に対するコドンは、それ自
体公知であり、その選択も任意でよく、例えば、利用す
る宿主のコドン使用頻度を考慮して、常法に従って決定
することができる（Ｃｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．ら，Ｎｕｃ
ｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，ｒ４３−ｒ７
４，１９８１）。更に、これら塩基配列のコドンの一部
改変は、常法に従い、所望の改変をコードする合成オリ
ゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異
的突然変異誘発法（ｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｕ
ｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｍａｒｋ，Ｄ．Ｆ．ら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，５６
６２−５６６６，１９８４）等により実施することがで
きる。

【００３５】これまで述べた種々の方法により得られる
ＤＮＡの配列決定は、例えば、マキサム−ギルバートの
化学修飾法（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．及びＧｉｌｂｅｒ
ｔ，Ｗ．，“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ”，６５，４９９−５５９，１９８０）やジデオキ
シヌクレオチド鎖終結法（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．及びＶ
ｉｅｉｒａ，Ｊ．，Ｇｅｎｅ，１９，２６９−２７６，
１９８２）等により行なうことができる。

【００３６】単離された本発明のポリヌクレオチドを、
適当なベクターＤＮＡに再び組込むことにより、真核生
物又は原核生物の宿主細胞をトランスフェクションする
ことができる。また、これらのベクターに適当なプロモ
ーター及び形質発現にかかわる配列を導入することによ
り、それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを発
現させることが可能である。

【００３７】本発明の発現ベクターは、本発明のポリヌ
クレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、
例えば、用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発
現ベクターに、本発明のポリヌクレオチドを挿入するこ
とにより得られる発現ベクターを挙げることができる。

【００３８】また、本発明の細胞も、本発明の前記発現
ベクターでトランスフェクションされ、本発明のポリヌ
クレオチドを含む限り、特に限定されるものではなく、
例えば、本発明のポリヌクレオチドが、宿主細胞の染色
体に組み込まれた細胞であることもできるし、あるい
は、本発明によるポリヌクレオチドを含む発現ベクター
の形で含有する細胞であることもできる。また、本発明
のポリペプチドを発現している細胞であることもできる
し、あるいは、本発明のポリペプチドを発現していない
細胞であることもできる。本発明の細胞は、例えば、本
発明の発現ベクターにより、所望の宿主細胞をトランス
フェクションすることにより得ることができる。

【００３９】例えば、真核生物の宿主細胞には、脊椎動
物、昆虫、及び酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞と
しては、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Ｇｌｕ
ｚｍａｎ，Ｙ．，Ｃｅｌｌ，２３，１７５−１８２，１
９８１）、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨ
Ｏ）のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株（Ｕｒｌａｕ
ｂ，Ｇ．及びＣｈａｓｉｎ，Ｌ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６−４
２２０，１９８０）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細
胞、前記ＨＥＫ２９３細胞にエプスタイン・バーウイル
スのＥＢＮＡ−１遺伝子を導入した２９３−ＥＢＮＡ細
胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、及び後述の実施例３で
使用したＬ９２９細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２１４８）
等を挙げることができる。

【００４０】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通
常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位、及
び転写終結配列等を有するものを使用することができ、
更に必要により、複製起点を有していることができる。
前記発現ベクターの例としては、例えば、ＳＶ４０の初
期プロモーターを有するｐＳＶ２ｄｈｆｒ（Ｓｕｂｒａ
ｍａｎｉ，Ｓ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，
１，８５４−８６４，１９８１）、ヒトの延長因子プロ
モーターを有するｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍ
ａ，Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａ
ｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又
はサイトメガロウイルスプロモーターを有するｐＣＥＰ
４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）等を挙げることができ
る。

【００４１】宿主細胞としてＣＯＳ細胞を用いる場合に
は、発現ベクターとして、ＳＶ４０複製起点を有し、Ｃ
ＯＳ細胞において自律増殖が可能であり、更に、転写プ
ロモーター、転写終結シグナル、及びＲＮＡスプライス
部位を備えたものを用いることができ、例えば、ｐＭＥ
１８Ｓ（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．及びＴａｋｅｂｅ，
Ｙ．，Ｍｅｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０，２７−３２，
１９９０）、ｐＥＦ−ＢＯＳ（Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ，
Ｓ．及びＮａｇａｔａ，Ｓ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．，１８，５３２２，１９９０）、又はｐ
ＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２９，８
４０−８４２，１９８７）等を挙げることができる。

【００４２】前記発現ベクターは、例えば、ＤＥＡＥ−
デキストラン法（Ｌｕｔｈｍａｎ，Ｈ．及びＭａｇｎｕ
ｓｓｏｎ，Ｇ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，１１，１２９５−１３０８，１９８３）、リン酸
カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法（Ｇｒａｈａｍ，Ｆ．Ｌ．
及びｖａｎ ｄｅｒ Ｅｄ，Ａ．Ｊ．，Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ，５２，４５６−４５７，１９７３）、市販のトラン
スフェクション試薬（例えば、ＦｕＧＥＮＥ^TM６ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ；Ｒｏｃｈｅ
Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた方法、あるい
は、電気パスル穿孔法（Ｎｅｕｍａｎｎ，Ｅ．ら，ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，１，８４１−８４５，１９８２）等によ
り、ＣＯＳ細胞に取り込ませることができる。

【００４３】また、宿主細胞としてＣＨＯ細胞を用いる
場合には、本発明のポリペプチドをコードするポリヌク
レオチドを含む発現ベクターと共に、Ｇ４１８耐性マー
カーとして機能するｎｅｏ遺伝子を発現することのでき
るベクター、例えば、ｐＲＳＶｎｅｏ（Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋ，Ｊ．ら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−
Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ，ＮＹ，１９８９）又はｐＳＶ２−ｎｅｏ（Ｓｏｕｔ
ｈｅｒｎ，Ｐ．Ｊ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ．
Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１，３２７−３４１，１９８
２）等をコ・トランスフェクトし、Ｇ４１８耐性のコロ
ニーを選択することにより、本発明のポリペプチドを安
定に産生するトランスフェクションされた細胞を得るこ
とができる。

【００４４】更に、宿主細胞として２９３−ＥＢＮＡ細
胞を用いる場合には、発現ベクターとして、エプスタイ
ン・バーウイルスの複製起点を有し、２９３−ＥＢＮＡ
細胞で自己増殖が可能なｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社）などを用いることができる。

【００４５】本発明の細胞は、常法に従って培養するこ
とができ、前記培養により細胞内又は細胞表面に本発明
のポリペプチドが生産される。前記培養に用いることの
できる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用さ
れる各種の培地を適宜選択することができる。例えば、
ＣＯＳ細胞の場合には、例えば、ＲＰＭＩ−１６４０培
地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地（ＤＭＥ
Ｍ）等の培地に、必要に応じて牛胎仔血清（ＦＢＳ）等
の血清成分を添加した培地を使用することができる。ま
た、２９３−ＥＢＮＡ細胞の場合には、牛胎仔血清（Ｆ
ＢＳ）等の血清成分を添加したダルベッコ修正イーグル
最小必須培地（ＤＭＥＭ）等の培地にＧ４１８を加えた
培地を使用することができる。

【００４６】本発明の細胞を培養することにより、前記
細胞の細胞内又は細胞表面に生産される本発明のポリペ
プチドは、前記ポリペプチドの物理的性質や生化学的性
質等を利用した各種の公知の分離操作法により、分離精
製することができる。具体的には、例えば、本発明のポ
リペプチドを表面に発現した細胞を培養し、これらをバ
ッファーに懸濁した後、ホモジナイズし、遠心分離する
ことにより、本発明のポリペプチドを含む細胞膜画分を
得ることができる。得られた細胞膜画分を可溶化した
後、通常のタンパク質沈殿剤による処理、限外濾過、各
種液体クロマトグラフィー［例えば、分子ふるいクロマ
トグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、
イオン交換体クロマトグラフィー、アフィニティクロマ
トグラフィー、又は高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）等］、若しくは透析法、又はこれらの組合せ等に
より、本発明のポリペプチドを精製することができる。
なお、細胞膜画分を可溶化する際には、できるだけ緩和
な可溶化剤（例えば、ＣＨＡＰＳ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、又はジキトニン等）を用いることにより、可溶
化後も受容体の特性を保持することができる。

【００４７】本発明のポリペプチドは、マーカー配列と
インフレームで融合して発現させることにより、本発明
のポリペプチドの発現の確認、細胞内局在の確認、又は
精製等が容易になる。前記マーカー配列としては、例え
ば、ＦＬＡＧエピトープ、ヘキサ−ヒスチジン・タグ、
ヘマグルチニン・タグ、又はｍｙｃエピトープなどを挙
げることができる。また、マーカー配列と本発明のポリ
ペプチドとの間に、プロテアーゼ（例えば、エンテロキ
ナーゼ、ファクターＸａ、又はトロンビンなど）が認識
する特異的なアミノ酸配列を挿入することにより、マー
カー配列部分をこれらのプロテアーゼにより切断除去す
ることが可能である。例えば、ムスカリンアセチルコリ
ン受容体とヘキサーヒスチジン・タグとをトロンビン認
識配列で連結した報告がある（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．
Ｋ．及びＨａｇａ，Ｔ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２
０，１２３２−１２３８，１９９６）。

【００４８】本発明の細胞を用いると、本発明のポリペ
プチドを活性化する物質をスクリーニングすることがで
きる。先に述べたように、本発明のポリペプチドは、脊
髄に発現しているバックグラウンドＫ⁺チャネルであ
る。バックグラウンドＫ⁺チャネルを活性化させる物質
は、従来技術欄で述べたように、神経細胞の興奮性を低
下させ、神経伝達を抑制することにより、痛みを緩和さ
せることが知られている。従って、本発明のポリペプチ
ドを活性化する物質も、脊髄神経のバックグラウンドＫ
⁺チャネルを活性化することにより、脊髄神経細胞の興
奮性を低下させ、脊髄神経伝達を抑制し、その結果、疼
痛を緩和することができるものと予想されるため、疼痛
治療剤の候補物質として有用である。従って、本発明の
細胞それ自体を、疼痛治療剤（特には、本発明のポリペ
プチドの活性化剤）のスクリーニングに用いることがで
きる。すなわち、本発明の細胞それ自体を、疼痛治療剤
治療剤（特には、本発明のポリペプチドの活性化剤）の
スクリーニングツールとして使用することができる。な
お、本明細書において、本発明のポリペプチドを「活性
化」するとは、本発明のポリペプチドを介したＫ⁺の細
胞外への放出を促進し、外向き電流が惹起することを意
味する。

【００４９】本発明の疼痛治療剤スクリーニングツール
を用いてスクリーニングにかけることのできる試験化合
物としては、特に限定されるものではないが、例えば、
ケミカルファイルに登録されている種々の公知化合物
（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー
技術（Ｔｅｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｋ．ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄ
ｒｏｎ，５１，８１３５−８１３７，１９９５）によっ
て得られた化合物群、あるいは、ファージ・ディスプレ
イ法（Ｆｅｌｉｃｉ，Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２２２，３０１−３１０，１９９１）などを応用
して作成されたランダム・ペプチド群を用いることがで
きる。また、微生物の培養上清、植物若しくは海洋生物
由来の天然成分、又は動物組織抽出物などもスクリーニ
ングの試験化合物として用いることができる。更には、
本発明の疼痛治療剤スクリーニングツールにより選択さ
れた化合物（ペプチドを含む）を、化学的又は生物学的
に修飾した化合物（ペプチドを含む）を用いることがで
きる。

【００５０】本発明の疼痛治療剤（特には、本発明のポ
リペプチドの活性化剤）スクリーニング方法は、Ｋ⁺チ
ャネルとして機能するように本発明のポリペプチドを発
現させた本発明の細胞（すなわち、本発明のポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで
トランスフェクションされ、前記ポリペプチドがＫ⁺チ
ャネルとして機能するように発現された細胞）と試験化
合物とを接触させる工程、及び前記ポリペプチドが活性
化されるか否かを分析する工程を含む限り、特に限定さ
れるものではないが、本発明のポリペプチドの活性化を
分析するのに用いる方法の違いに基づいて、例えば、
［１］電位固定（ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法、特
にはホールセル膜電位固定（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ ｖ
ｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法を利用するスクリーニン
グ方法、［２］放射性同位元素⁸⁶Ｒｂ⁺イオンの放出を
利用するスクリーニング方法、あるいは、［３］膜電位
感受性色素を利用するスクリーニング方法を挙げること
ができ、これらの方法の中でも、電位固定法、特にはホ
ールセル膜電位固定法を利用するスクリーニング方法が
好ましい。

【００５１】前記［１］の電位固定法、特にはホールセ
ル膜電位固定法を利用して、疼痛治療剤の候補物質とし
て有用な、本発明のポリペプチドを活性化する物質をス
クリーニングする場合には、本発明のポリペプチドを細
胞表面に発現させた本発明の細胞を、電位固定法、特に
はホールセル膜電位固定法により膜電位固定し、試験化
合物の存在下における前記細胞の全細胞電流を分析（す
なわち、測定又は検出）することにより、本発明のポリ
ペプチドが活性化されるか否かを分析する。すなわち、
電位固定法、特にはホールセル膜電位固定法を利用する
本発明のスクリーニング方法では、本発明のポリペプチ
ドを細胞表面に発現させた本発明の細胞を、電位固定
法、特にはホールセル膜電位固定法により膜電位固定し
た状態で、前記細胞と試験化合物とを接触させる工程、
及び前記細胞における全細胞電流の変化を分析する工程
を含む。

【００５２】より具体的には、後述の実施例４に記載の
方法により実施することが好ましい。例えば、細胞外液
としては、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ
／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ₂、及び１０
ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．３）を含
む溶液を使用し、細胞内液としては、１４９ｍｍｏｌ／
Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ₂、４．５
ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴＡ、及び９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰ
ＥＳ−Ｋ（ｐＨ＝７．３）を含む溶液を用いることがで
きる。例えば、保持電位−４０ｍＶに膜電位固定された
細胞の細胞外液に、試験化合物を添加した場合に、外向
き電流が惹起されれば、前記試験化合物は、本発明のポ
リペプチドを活性化する物質であると判定することがで
きる。

【００５３】前記［２］の放射性同位元素⁸⁶Ｒｂ⁺イオ
ンの放出を利用して、疼痛治療剤の候補物質として有用
な、本発明のポリペプチドを活性化する物質をスクリー
ニングする場合には、本発明のポリペプチドを細胞表面
に発現させた本発明の細胞に、放射性同位元素⁸⁶Ｒｂ⁺
イオンを取り込ませた後、試験化合物を添加した際の細
胞外へ放出される放射活性の量を分析（すなわち、測定
又は検出）することにより、本発明のポリペプチドが活
性化されるか否かを分析する（Ｍａｉｎｇｒｅｔら，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７４，１３８１，１９９
９）。すなわち、放射性同位元素⁸⁶Ｒｂ⁺イオンの放出
を利用する本発明のスクリーニング方法では、本発明の
ポリペプチドを細胞表面に発現させた本発明の細胞に、
放射性同位元素⁸⁶Ｒｂ⁺イオンを取り込ませた後、前記
細胞と試験化合物とを接触させる工程、及び前記細胞の
細胞外へ放出される放射活性の量を分析する工程を含
む。このスクリーニングは、Ｋ⁺チャネルが、一般にＫ⁺
イオンと同様にＲｂ⁺イオンを通すことができる性質を
利用するものである。

【００５４】より具体的には、本発明のポリペプチドを
細胞表面に発現させた本発明の細胞を、⁸⁶ＲｂＣｌとイ
ンキュベート（例えば、３７℃で１８時間）することに
より、⁸⁶Ｒｂ⁺を前記細胞内に取り込ませることができ
る。前記細胞を、通常濃度（例えば、２．５ｍｍｏｌ／
Ｌ）のＫ⁺を含む生理食塩水で洗浄し、取り込まれなか
った⁸⁶Ｒｂ⁺を取り除く。Ｋ⁺チャネルが活性化すると、
細胞外への⁸⁶Ｒｂ⁺放出量が増加するので、細胞外液の
放射活性をチャネル活性の指標とし、本発明のポリペプ
チドが活性化されるか否かを分析することができる。試
験化合物を添加した際の細胞外へ放出された放射活性を
分析（すなわち、測定又は検出）することにより、本発
明のポリペプチドを活性化する物質をスクリーニングす
ることができる。

【００５５】前記［３］の膜電位感受性色素を利用し
て、疼痛治療剤の候補物質として有用な、本発明のポリ
ペプチドを活性化する物質をスクリーニングする場合に
は、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現させた本発
明の細胞に、膜電位感受性色素を取り込ませた後、試験
化合物を添加した際の、細胞内の前記色素の蛍光強度変
化を分析（すなわち、測定又は検出）することにより、
本発明のポリペプチドが活性化されるか否かを分析す
る。すなわち、膜電位感受性色素を利用する本発明のス
クリーニング方法では、本発明のポリペプチドを細胞表
面に発現させた本発明の細胞に、膜電位感受性色素を取
り込ませた後、前記細胞と試験化合物とを接触させる工
程、及び前記細胞内の前記色素の蛍光強度変化を分析す
る工程を含む。このスクリーニングは、膜電位感受性色
素が、Ｋ⁺チャネルの開口に伴う膜電位の変化を光学的
に検出することできるという性質を利用するものであ
る。

【００５６】より具体的には、前記膜電位感受性色素と
して、ＤｉＢＡＣ［ｂｉｓ−（１，３−ｄｉｂｕｔｙｌ
ｂａｒｂｉｔｕｒｉｃ ａｃｉｄ）ｔｒｉｍｅｔｈｉｎ
ｅｏｘｏｎｏｌ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社
製］又はその誘導体などを用いることができる。これら
の色素を用いると、本発明のポリペプチドの活性を分析
（すなわち、測定又は検出）することができ、試験化合
物存在下と非存在下とで前記色素の蛍光強度変化を比較
することにより、本発明のポリペプチドを活性化する物
質をスクリーニングすることができる。具体的には、Ｋ
⁺チャネルが活性化すると、細胞の膜電位が過分極側に
シフトするので、膜電位感受性色素の蛍光強度が減少す
る。

【００５７】本発明のポリペプチドに反応する抗体（例
えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体）
は、各種動物に、本発明のポリペプチド、又はその断片
を直接投与することで得ることができる。また、本発明
のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入し
たプラスミドを用いて、ＤＮＡワクチン法（Ｒａｚ，
Ｅ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，９１，９５１９−９５２３，１９９４；又はＤｏｎ
ｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉ
ｓ．，１７３，３１４−３２０，１９９６）によっても
得ることができる。

【００５８】ポリクローナル抗体は、例えば、本発明の
ポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント（例え
ば、フロイント完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁
液を、腹腔、皮下、又は静脈等に免疫して感作した動物
（例えば、ウサギ、ラット、ヤギ、又はニワトリ等）の
血清又は卵から製造することができる。このように製造
された血清又は卵から、常法のポリペプチド単離精製法
によりポリクローナル抗体を分離精製することができ
る。そのような分離精製方法としては、例えば、遠心分
離、透析、硫酸アンモニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ
−セルロース、ハイドロキシアパタイト、若しくはプロ
テインＡアガロース等によるクロマトグラフィー法を挙
げることができる。

【００５９】モノクローナル抗体は、例えば、ケーラー
とミルスタインの細胞融合法（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．及び
Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９
５−４９７，１９７５）により、当業者が容易に製造す
ることが可能である。すなわち、本発明のポリペプチド
又はその断片を適当なアジュバント（例えば、フロイン
ト完全アジュバントなど）に乳濁した乳濁液を、数週間
おきにマウスの腹腔、皮下、又は静脈に数回繰り返し接
種することにより免疫する。最終免疫後、脾臓細胞を取
り出し、ミエローマ細胞と融合してハイブリドーマを作
製する。

【００６０】ハイブリドーマを得るためのミエローマ細
胞としては、例えば、ヒポキサンチン−グアニン−ホス
ホリボシルトランスフェラーゼ欠損又はチミジンキナー
ゼ欠損のようなマーカーを有するミエローマ細胞（例え
ば、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．Ｕ１）
を利用することができる。また、融合剤としては、例え
ば、ポリエチレングリーコールを利用することができ
る。更には、ハイブリドーマ作製における培地として、
例えば、イーグル氏最小必須培地、ダルベッコ氏変法最
小必須培地、又はＲＰＭＩ−１６４０などの通常よく用
いられている培地に、１０〜３０％のウシ胎仔血清を適
宜加えて用いることができる。融合株は、ＨＡＴ選択法
により選択することができる。ハイブリドーマのスクリ
ーニングは培養上清を用い、ＥＬＩＳＡ法又は免疫組織
染色法などの周知の方法により行ない、目的の抗体を分
泌しているハイブリドーマのクローンを選択することが
できる。また、限界希釈法によってサブクローニングを
繰り返すことにより、ハイブリドーマの単クローン性を
保証することができる。このようにして得られるハイブ
リドーマは、培地中で２〜４日間、あるいは、プリスタ
ンで前処理したＢＡＬＢ／ｃ系マウスの腹腔内で１０〜
２０日間培養することで、精製可能な量の抗体を産生す
ることができる。

【００６１】このように製造されたモノクローナル抗体
は、培養上清又は腹水から常法のポリペプチド単離精製
法により分離精製することができる。そのような分離精
製方法としては、例えば、遠心分離、透析、硫酸アンモ
ニウムによる塩析、又はＤＥＡＥ−セルロース、ハイド
ロキシアパタイト、若しくはプロテインＡアガロース等
によるクロマトグラフィー法を挙げることができる。ま
た、モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片
は、前記モノクローナル抗体をコードする遺伝子の全部
又は一部を発現ベクターに組み込み、適当な宿主細胞
（例えば、大腸菌、酵母、又は動物細胞）に導入して生
産させることもできる。

【００６２】以上のように分離精製された抗体（ポリク
ローナル抗体及びモノクローナル抗体を含む）につい
て、常法により、ポリペプチド分解酵素（例えば、ペプ
シン又はパパイン等）によって消化を行ない、引き続
き、常法のポリペプチド単離精製法により分離精製する
ことで、活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、例え
ば、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、又はＦｖを得
ることができる。

【００６３】更には、本発明のポリペプチドに反応する
抗体を、クラクソンらの方法又はゼベデらの方法（Ｃｌ
ａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３５２，６２４
−６２８，１９９１；又はＺｅｂｅｄｅｅ，Ｓ．ら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，
３１７５−３１７９，１９９２）により、一本鎖（ｓｉ
ｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ）Ｆｖ又はＦａｂとして得ること
も可能である。また、マウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺
伝子に置き換えたトランスジェニックマウス（Ｌｏｎｂ
ｅｒｇ，Ｎ．ら，Ｎａｔｕｒｅ，３６８，８５６−８５
９，１９９４）に免疫することで、ヒト抗体を得ること
も可能である。

【００６４】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の範囲を限定するものではな
い。なお、特に断らない限り、公知の方法（Ｍａｎｉａ
ｔｉｓ，Ｔ．ら，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ，ＮＹ，１９８２；及びＨｉｌｌｅ，Ｂ．，Ｉｏｎ
ｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ ｏｆ Ｅｘｃｉｔａｂｌｅ
Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｓｉｎａｕｅｒ
Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．，ＭＡ，１９９２）
に従って実施した。

【００６５】

【実施例１】《新規バックグラウンドＫ⁺チャネルタン
パク質をコードするポリヌクレオチドの単離と発現ベク
ターの構築》配列番号２で表されるアミノ酸配列を有す
る本発明の新規バックグラウンドＫ ⁺チャネルタンパク
質をコードする全長ｃＤＮＡは、ヒト脊髄由来のｐｏｌ
ｙＡ⁺ ＲＮＡ（ｐｏｌｙ Ａ⁺ ＲＮＡ；Ｃｌｏｎｔｅ
ｃｈ社）を鋳型とし、逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反
応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、以下の手順で取得した。

【００６６】まず、ヒト脊髄ｐｏｌｙ Ａ⁺ ＲＮＡ
（１０ｎｇ）を鋳型として、ＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｄ
ｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣＲ Ｋｉｔ；Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ社）を用いて逆転写させ、第１鎖ｃＤＮＡ
を合成した。得られた第１鎖ｃＤＮＡを鋳型として、配
列番号３で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチ
ド（５’末端にＥｃｏＲＩ認識配列が付加してある）を
フォワードプライマーとして、配列番号４で表される塩
基配列からなるオリゴヌクレオチド（５’末端にＸｈｏ
Ｉ認識配列が付加してある）をリバースプライマーとし
て、Ｔａｑポリメラーゼ（ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏ
ｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒造社）を用いて、ホットスター
ト法によるＰＣＲを行なった。前記ＰＣＲは、最初に９
８℃（１分間）で熱変性を行なった後、９８℃（１５秒
間）と６８℃（２分間）とからなるサイクルを３５回繰
り返した。その結果、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増
幅された。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩ及
びＸｈｏＩで消化した後、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１
（＋）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いてクローニン
グした。得られたクローンをｐｃＤＮＡ３．１−２８３
Ｓと命名した。なお、前記プラスミドｐｃＤＮＡ３．１
（＋）は、サイトメガロウイルス由来のプロモーター配
列を持っており、動物細胞に新規バックグラウンドＫ⁺
チャネルタンパク質を発現させるために使用することが
できる。

【００６７】得られたクローンｐｃＤＮＡ３．１−２８
３Ｓの塩基配列を、ジデオキシターミネーター法により
ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７ ＤＮＡ Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｒ；Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
社）を用いて解析し、配列番号１で表される塩基配列が
得られた。配列番号１で表される塩基配列は、１１５５
塩基対からなるオープンリーディングフレーム（配列番
号１で表される塩基配列における第１０番〜第１１６４
番の塩基からなる配列）を有する。前記オープンリーデ
ィングフレームから予測される３８４アミノ酸残基から
なるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配
列であった。相同性解析の結果、既知の遺伝子の中で相
同性の高い遺伝子はなく、最も相同性が高いものでも、
Ｋ⁺チャネルの１種であるヒトＴＷＩＫ−１（米国特許
第６０１３４７０号明細書）が１９％の相同性を示した
にすぎなかった。

【００６８】

【実施例２】《新規バックグラウンドＫ⁺チャネル遺伝
子の発現分布の解析》ヒト組織における、配列番号２で
表されるアミノ酸配列を有する新規バックグラウンドＫ
⁺チャネルをコードするポリヌクレオチドの発現分布
を、ＲＴ−ＰＣＲ法により以下の手順で解析した。ヒト
の各組織由来のｐｏｌｙ Ａ⁺ ＲＮＡ（各５ｎｇ；Ｃ
ｌｏｎｔｅｃｈ社）をＤＮアーゼ処理した後、ＲＴ−Ｐ
ＣＲキット（Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＲＴ−ｆｏｒ−ＰＣ
Ｒ Ｋｉｔ；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）を用いて逆転写さ
せ、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた第１鎖ｃＤＮ
Ａを鋳型として、配列番号５で表される塩基配列からな
るオリゴヌクレオチドをフォワードプライマーとして、
配列番号６で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオ
チドをリバースプライマーとして、Ｔａｑポリメラーゼ
（ＬＡ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ；宝酒
造社）を用いて、ホットスタート法によるＰＣＲを行な
った。前記ＰＣＲは、最初に９８℃（１分間）で熱変性
を行なった後、９８℃（３０秒間）と６８℃（２分間）
とからなるサイクルを４５回繰り返した。なお、前記各
プライマーの塩基配列は、配列番号２で表されるアミノ
酸配列を有する本発明の新規バックグラウンドＫ⁺チャ
ネルタンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的
な配列である。

【００６９】ヒトの各組織（扁桃体、尾状核、海馬、脳
梁、黒質、視床、小脳、前頭葉、視床下部、脊髄、下垂
体、全脳、心臓、胎盤、肺、気管、肝臓、骨格筋、腎
臓、膵臓、小腸、胃、脾臓、骨髄、胸腺、甲状腺、唾液
腺、副腎、乳腺、及び前立腺）についてＲＴ−ＰＣＲ解
析を行なったところ、約１ｋｂｐのＤＮＡ断片が脊髄に
おいて増幅された。この結果から、本発明の新規バック
グラウンドＫ⁺チャネルのｍＲＮＡの発現は、脊髄に集
中していることが明らかになった。

【００７０】

【実施例３】《新規バックグラウンドＫ⁺チャネルタン
パク質の動物細胞における発現》配列番号２で表される
アミノ酸配列を有する本発明の新規バックグラウンドＫ
⁺チャネルタンパク質のチャネル活性を検出するため
に、前記実施例１で得られた発現ベクターｐｃＤＮＡ
３．１−２８３Ｓを、動物細胞にトランスフェクション
することにより、前記タンパク質を発現させた。前記動
物細胞としては、膜電位の変化によって、内在性のチャ
ネルによる電流を発生しないＬ９２９細胞（ＡＴＣＣ：
ＣＲＬ−２１４８）を用いた。前記発現ベクターｐｃＤ
ＮＡ３．１−２８３Ｓと、市販のトランスフェクション
試薬（ＦｕＧＥＮＥ６；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ
ｎｈｅｉｍ社）とを用いて、Ｌ９２９細胞のトランスフ
ェクションを行ない、前記細胞にてバックグラウンドＫ
⁺チャネルタンパク質を発現させた。なお、具体的な手
順は、前記トランスフェクション試薬に添付のマニュア
ルに従って実施した。また、コントロール細胞として、
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクションし
た細胞も同様にして作成した。得られたこれらのトラン
スフェクションされた細胞を、以下の実施例４及び実施
例５で使用した。

【００７１】

【実施例４】《新規バックグラウンドＫ⁺チャネルタン
パク質のチャネル活性の検出》前記実施例３で得られた
各細胞を、ホールセル膜電位固定（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌ
ｌ ｖｏｌｔａｇｅ−ｃｌａｍｐ）法により膜電位固定
し、全細胞電流を測定した。細胞外液として、１４９ｍ
ｍｏｌ／Ｌ−ＮａＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、２ｍ
ｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ₂、及び１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥ
ＰＥＳ−Ｎａ（ｐＨ＝７．３）を含む溶液を使用し、細
胞内液として、１４９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＫＣｌ、１．８ｍ
ｍｏｌ／Ｌ−ＭｇＣｌ₂、４．５ｍｍｏｌ／Ｌ−ＥＧＴ
Ａ、及び９ｍｍｏｌ／Ｌ−ＨＥＰＥＳ−Ｋ（ｐＨ＝７．
３）を含む溶液を用いた。

【００７２】プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−２８３Ｓで
トランスフェクションされた細胞では、保持電位−８０
ｍＶから４００ミリ秒間、０ｍＶの脱分極パルスを与え
ると、外向き電流が測定された。この電流は、瞬時に惹
起され、しかも、不活性化がみられず、バックグラウン
ドＫ⁺チャネルの性質とよく一致していた。一方、コン
トロール細胞に、同様に脱分極パルスを与えてみたが、
この様な電流は観測されなかった。

【００７３】

【実施例５】《新規バックグラウンドＫ⁺チャネルタン
パク質のＫ⁺イオン選択性の確認》配列番号２で表され
るアミノ酸配列を有する本発明の新規バックグラウンド
Ｋ ⁺チャネルのＫ⁺イオンの選択性を検証するために、細
胞外液のＫ⁺濃度を５ｍｍｏｌ／Ｌから種々濃度（１５
ｍｍｏｌ／Ｌ、３０ｍｍｏｌ／Ｌ、７５ｍｍｏｌ／Ｌ、
及び１５０ｍｍｏｌ／Ｌ）に変え、そのときの反転電位
をランプ波を用いて測定した。その結果、Ｋ⁺濃度を高
くするに従って、反転電位は脱分極側に移動した。各Ｋ
⁺濃度に対する反転電位をプロットし、直線回帰したと
ころ、その傾きはネルンスト（Ｎｅｒｎｓｔ）の式から
求められる傾きの理論値（５９ｍＶ／ｄｅｃａｄｅ）に
近い値であった。この結果から、配列番号２で表される
アミノ酸配列を有する本発明の新規バックグラウンドＫ
⁺チャネルは、Ｋ⁺イオンの選択性が高いと考えられる。

【００７４】

【発明の効果】本発明のポリペプチドは、脊髄に発現し
ているバックグラウンドＫ⁺チャネルであるので、本発
明のポリペプチドを活性化する物質は、疼痛（例えば、
神経因性疼痛、又は慢性関節リウマチ若しくは変形性関
節症由来の疼痛）治療剤の候補物質として有用である。
また、本発明のポリペプチドを細胞表面に発現する本発
明の細胞によれば、疼痛治療剤の簡便なスクリーニング
系を提供することができる。更に、本発明のポリヌクレ
オチド、発現ベクター、細胞、及び抗体は、本発明のポ
リペプチドを製造するのに有用である。

【００７５】

【配列表フリーテキスト】以下の配列表の数字見出し＜
２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎ
ｃｅ」の説明を記載する。具体的には、配列表の配列番
号３及び４の配列で表される各塩基配列は、人工的に合
成したプライマー配列である。

【００７６】

【配列表】 <110> Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Novel potassium ion channel protein <130> YAM002993P <160> 6 <210> 1 <211> 1211 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (10)..(1164) <400> 1 tcagggacg atg gag gtc tcg ggg cac ccc cag gcc agg aga tgc tgc cca 51 Met Glu Val Ser Gly His Pro Gln Ala Arg Arg Cys Cys Pro 1 5 10 gag gcc ctg gga aag ctc ttc cct ggc ctc tgc ttc ctc tgc ttt ctg 99 Glu Ala Leu Gly Lys Leu Phe Pro Gly Leu Cys Phe Leu Cys Phe Leu 15 20 25 30 gtg acc tac gcc ctg gtg ggt gct gtg gtc ttc tct gcc att gag gac 147 Val Thr Tyr Ala Leu Val Gly Ala Val Val Phe Ser Ala Ile Glu Asp 35 40 45 ggc cag gtc ctg gtg gca gca gat gat gga gag ttt gag aag ttc ttg 195 Gly Gln Val Leu Val Ala Ala Asp Asp Gly Glu Phe Glu Lys Phe Leu 50 55 60 gag gag ctc tgc aga atc ttg aac tgc agt gaa aca gtg gtg gaa gac 243 Glu Glu Leu Cys Arg Ile Leu Asn Cys Ser Glu Thr Val Val Glu Asp 65 70 75 aga aaa cag gat ctc cag ggg cat ctg cag aag gtg aag cct cag tgg 291 Arg Lys Gln Asp Leu Gln Gly His Leu Gln Lys Val Lys Pro Gln Trp 80 85 90 ttt aac agg acc aca cac tgg tcc ttc ctg agc tcg ctc ttt ttc tgc 339 Phe Asn Arg Thr Thr His Trp Ser Phe Leu Ser Ser Leu Phe Phe Cys 95 100 105 110 tgc acg gtg ttc agc acc gtg ggc tat ggc tac atc tac ccc gtc acc 387 Cys Thr Val Phe Ser Thr Val Gly Tyr Gly Tyr Ile Tyr Pro Val Thr 115 120 125 agg ctt ggc aag tac ttg tgc atg ctc tat gct ctc ttt ggt atc ccc 435 Arg Leu Gly Lys Tyr Leu Cys Met Leu Tyr Ala Leu Phe Gly Ile Pro 130 135 140 ctg atg ttc ctc gtt ctc acg gac aca ggc gac atc ctg gca acc atc 483 Leu Met Phe Leu Val Leu Thr Asp Thr Gly Asp Ile Leu Ala Thr Ile 145 150 155 tta tct aca tct tat aat cgg ttc cga aaa ttc cct ttc ttt acc cgc 531 Leu Ser Thr Ser Tyr Asn Arg Phe Arg Lys Phe Pro Phe Phe Thr Arg 160 165 170 ccc ctc ctc tcc aag tgg tgc ccc aaa tct ctc ttc aag aaa aaa ccg 579 Pro Leu Leu Ser Lys Trp Cys Pro Lys Ser Leu Phe Lys Lys Lys Pro 175 180 185 190 gac ccc aag ccc gca gat gaa gct gtc cct cag atc atc atc agt gct 627 Asp Pro Lys Pro Ala Asp Glu Ala Val Pro Gln Ile Ile Ile Ser Ala 195 200 205 gaa gag ctt cca ggc ccc aaa ctt ggc aca tgt cct tca cgc cca agc 675 Glu Glu Leu Pro Gly Pro Lys Leu Gly Thr Cys Pro Ser Arg Pro Ser 210 215 220 tgc agc atg gag ctg ttt gag aga tct cat gcg cta gag aaa cag aac 723 Cys Ser Met Glu Leu Phe Glu Arg Ser His Ala Leu Glu Lys Gln Asn 225 230 235 aca ctg caa ctg ccc cca caa gcc atg gag agg agt aac tcg tgt ccc 771 Thr Leu Gln Leu Pro Pro Gln Ala Met Glu Arg Ser Asn Ser Cys Pro 240 245 250 gaa ctg gtg ttg gga aga ctc tca tac tcc atc atc agc aac ctg gat 819 Glu Leu Val Leu Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Ile Ile Ser Asn Leu Asp 255 260 265 270 gaa gtt gga cag cag gtg gag agg ttg gac atc ccc ctc ccc atc att 867 Glu Val Gly Gln Gln Val Glu Arg Leu Asp Ile Pro Leu Pro Ile Ile 275 280 285 gcc ctt att gtt ttt gcc tac att tcc tgt gca gct gcc atc ctc ccc 915 Ala Leu Ile Val Phe Ala Tyr Ile Ser Cys Ala Ala Ala Ile Leu Pro 290 295 300 ttc tgg gag aca cag ttg gat ttc gag aat gcc ttc tat ttc tgc ttt 963 Phe Trp Glu Thr Gln Leu Asp Phe Glu Asn Ala Phe Tyr Phe Cys Phe 305 310 315 gtc aca ctc acc acc att ggg ttt ggg gat act gtt tta gaa cac cct 1011 Val Thr Leu Thr Thr Ile Gly Phe Gly Asp Thr Val Leu Glu His Pro 320 325 330 aac ttc ttc ctg ttc ttc tcc att tat atc atc gtt gga atg gag att 1059 Asn Phe Phe Leu Phe Phe Ser Ile Tyr Ile Ile Val Gly Met Glu Ile 335 340 345 350 gtg ttc att gct ttc aag ttg gtg caa aac agg ctg att gac ata tac 1107 Val Phe Ile Ala Phe Lys Leu Val Gln Asn Arg Leu Ile Asp Ile Tyr 355 360 365 aaa aat gtt atg cta ttc ttt gca aaa ggg aag ttt tac cac ctt gtt 1155 Lys Asn Val Met Leu Phe Phe Ala Lys Gly Lys Phe Tyr His Leu Val 370 375 380 aaa aag tga aggtttcatt atctctcagg tgacagacac tggctgagct ggttttc 1211 Lys Lys 385 <210> 2 <211> 384 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Val Ser Gly His Pro Gln Ala Arg Arg Cys Cys Pro Glu Ala 1 5 10 15 Leu Gly Lys Leu Phe Pro Gly Leu Cys Phe Leu Cys Phe Leu Val Thr 20 25 30 Tyr Ala Leu Val Gly Ala Val Val Phe Ser Ala Ile Glu Asp Gly Gln 35 40 45 Val Leu Val Ala Ala Asp Asp Gly Glu Phe Glu Lys Phe Leu Glu Glu 50 55 60 Leu Cys Arg Ile Leu Asn Cys Ser Glu Thr Val Val Glu Asp Arg Lys 65 70 75 80 Gln Asp Leu Gln Gly His Leu Gln Lys Val Lys Pro Gln Trp Phe Asn 85 90 95 Arg Thr Thr His Trp Ser Phe Leu Ser Ser Leu Phe Phe Cys Cys Thr 100 105 110 Val Phe Ser Thr Val Gly Tyr Gly Tyr Ile Tyr Pro Val Thr Arg Leu 115 120 125 Gly Lys Tyr Leu Cys Met Leu Tyr Ala Leu Phe Gly Ile Pro Leu Met 130 135 140 Phe Leu Val Leu Thr Asp Thr Gly Asp Ile Leu Ala Thr Ile Leu Ser 145 150 155 160 Thr Ser Tyr Asn Arg Phe Arg Lys Phe Pro Phe Phe Thr Arg Pro Leu 165 170 175 Leu Ser Lys Trp Cys Pro Lys Ser Leu Phe Lys Lys Lys Pro Asp Pro 180 185 190 Lys Pro Ala Asp Glu Ala Val Pro Gln Ile Ile Ile Ser Ala Glu Glu 195 200 205 Leu Pro Gly Pro Lys Leu Gly Thr Cys Pro Ser Arg Pro Ser Cys Ser 210 215 220 Met Glu Leu Phe Glu Arg Ser His Ala Leu Glu Lys Gln Asn Thr Leu 225 230 235 240 Gln Leu Pro Pro Gln Ala Met Glu Arg Ser Asn Ser Cys Pro Glu Leu 245 250 255 Val Leu Gly Arg Leu Ser Tyr Ser Ile Ile Ser Asn Leu Asp Glu Val 260 265 270 Gly Gln Gln Val Glu Arg Leu Asp Ile Pro Leu Pro Ile Ile Ala Leu 275 280 285 Ile Val Phe Ala Tyr Ile Ser Cys Ala Ala Ala Ile Leu Pro Phe Trp 290 295 300 Glu Thr Gln Leu Asp Phe Glu Asn Ala Phe Tyr Phe Cys Phe Val Thr 305 310 315 320 Leu Thr Thr Ile Gly Phe Gly Asp Thr Val Leu Glu His Pro Asn Phe 325 330 335 Phe Leu Phe Phe Ser Ile Tyr Ile Ile Val Gly Met Glu Ile Val Phe 340 345 350 Ile Ala Phe Lys Leu Val Gln Asn Arg Leu Ile Asp Ile Tyr Lys Asn 355 360 365 Val Met Leu Phe Phe Ala Lys Gly Lys Phe Tyr His Leu Val Lys Lys 370 375 380 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 3 ggaattctca gggacgatgg aggtct 26 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: an artificially synthesized primer sequence <400> 4 gcctcgagga aaaccagctc agccagtg 28 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tggtgggtgc tgtggtcttc tct 23 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 agcctgtttt gcaccaactt gaaag 25

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (72)発明者 横井 宏理 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 (72)発明者 三宅 哲 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 (72)発明者 望月 忍 茨城県つくば市御幸が丘21 山之内製薬株 式会社内 Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA40 CB01 DA12 DA13 DA14 DA36 DA77 FB03 4B024 AA01 BA21 BA44 CA04 DA02 EA04 GA11 HA01 4B063 QQ42 QQ61 QR77 QS36 4B064 AG27 CA10 CA19 CC24 DA03 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA25 CA44 CA46 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA01 DA76 EA20 EA50 FA74

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （１）配列番号２で表されるアミノ酸配
   列を有するポリペプチド、あるいは、（２）配列番号２
   で表されるアミノ酸配列の１又は複数の箇所において、
   １又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、及び／又は付加
   されたアミノ酸配列を有し、しかも、バックグラウンド
   カリウムイオンチャネル活性を示すポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリペプチドをコード
   するポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 請求項２に記載のポリヌクレオチドを含
   む発現ベクター。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の発現ベクターでトラン
   スフェクションされた細胞。
5. 【請求項５】 請求項１に記載のポリペプチドに結合す
   る抗体。
6. 【請求項６】 請求項４に記載の細胞である、疼痛治療
   剤スクリーニングツール。
7. 【請求項７】 請求項１に記載のポリペプチドをコード
   するポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフ
   ェクションされた細胞と、試験化合物とを接触させる工
   程、及び前記ポリペプチドが活性化されるか否かを分析
   する工程を含むことを特徴とする、疼痛治療剤をスクリ
   ーニングする方法。