WO2002052275A2 - Verfahren zur bestimmung der blutzellhämostase - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for determining blood cell hemostasis, in particular blood coagulation triggered by the intravascular tissue factor, and a kit for carrying out the method.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a simple and reliable method for determining blood coagulation in whole blood is to be specified.
  • Another object is to provide a kit for performing the method.
  • factor V ⁇ Ia (i) is added. This is factor Vlla, which is derivatized in the active center: factor V ⁇ Ia (i) binds with a higher affinity than factor Vlla. It does not activate coagulation and inhibits fibrin formation.
  • the method according to the invention has the particular advantage that it can be carried out simply and inexpensively. No plasma from the whole blood sample is required to carry out the method be won. Another advantage is that the coagulation triggered by TF can be measured specifically without the need for complex processes, for example processes to be carried out under flow conditions.
  • the method is based on the surprising finding that after stimulation of whole blood with collagen, platelet-leukocyte complexes quickly present TF on their surface.
  • the functionally active TF of the blood obviously plays a decisive role as a starter of blood coagulation and for the formation of arterial and venous thrombosis.
  • 3a and b show the triggering of functional TF activities in complexes from isolated leukocytes and platelets.
  • Fig. 1 The results shown in Fig. 1 were obtained by incubating whole blood for various time periods at 37 ° C without (unfilled symbols) and with collagen (12 ⁇ g / ml, filled symbols).
  • the leukocytes were fixed and incubated with FITC-labeled isotype-matching control antibodies and with FITC-labeled anti-TF antibodies.
  • the association of the antibodies with the leukocytes was analyzed using flow cytometry.
  • Fig. 1 represent the time course of the appearance of monocyte- (Fig. La) and neutrophil-associated TF (Fig. Lb).
  • the presentation of the TF associated with the leukocytes shows a maximum within 5-10 minutes after stimulation with collagen.
  • Fig. 2 show the rate of fibrin production and clot formation (r and k values). These values were determined by means of thrombography of the whole blood (at room temperature).
  • Fig. 2a control test;
  • Fig. 3a shows the activation of factor X by isolated monocytes (10 5 , prepared by micro-bead technique; white columns) and isolated neutrophils (10 6 , also prepared by micro-bead technique, gray columns) for 5 minutes were incubated at 37 ° C with or without collagen (12 ⁇ g / ml). If indicated, isolated platelets (10 7 ) were added to the leukocyte suspensions in question.
  • the picture Factor Xa was detected using the chromogenic substrate S2222, as essentially described in Surprenant, YM and Zuckerman, SH (1989) Thro b. Res. 53, pages 339-346.
  • factor Xa The activation of factor X by isolated neutrophils and monocytes remains unchanged after the addition of collagen. In suspensions of untreated platelets with isolated leukocytes, the formation of factor Xa is as low as in the presence of leukocytes alone. However, if the platelet-leukocyte suspension is activated by collagen, the factor Xa formation is significantly increased (FIG. 3a).
  • a whole blood sample is taken in a conventional manner.
  • the whole blood sample is then stabilized by adding a coagulant substance.
  • the anticoagulant substance can be citrate; a concentration of e.g. 0.38% (volume percent) set.
  • At least one component of the extracellular matrix is added to the stabilized whole blood sample, e.g. Collagen in a concentration of 8 to 15 ⁇ g / ml, preferably 12 ⁇ g / ml.
  • the factor V ⁇ Ia (i) is also added, preferably in a concentration of about 1 ⁇ M.
  • an inhibitor that excludes contact activation is added to the whole blood sample at any time prior to the addition of factor V ⁇ Ia (i), e.g. the com trypsin inhibitor in a concentration of 10 to 100 ⁇ g / ml, preferably 50 ⁇ g / ml.
  • the sample can be recalcified, preferably using a CaCl solution with a concentration of 100 mM.
  • the blood coagulation activity can then be determined using a conventional method, for example thromlastography, ball coagulometry or the crochet method.
  • Matrix components are preferably added to the recalculated whole blood.
  • the matrix components are highly specific activators that trigger coagulation in whole blood.
  • factor V ⁇ Ia (i) the proportion of fibrin formation induced by TF in the total fibrin production mediated by collagen can be determined.
  • recombinant TF can also be added to the whole blood sample. This makes it possible to record the effects of vascular wall and blood cell TF.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Blutgerinnung, insbesondere der durch den intravaskulären tissue factor (TF) ausgelösten Blutgerinnung, mit folgenden Schritten: Entnahme einer Vollblutprobe; Stabilisieren der Vollblutprobe durch Zugabe einer gerinnungshemmenden Substanz; Zugabe mindestens einer Komponente der extrazellulären Matrix; Zugabe eines die Kontaktaktivierung ausschliessenden Inhibitors; Zugabe von Faktor VIIa(i) und Nachweis der Blutgerinnung nach einem herkömmlichen Verfahren.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Bestimmung der Blutzellhämostase
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Blutzellhämostase, insbesondere der durch den intravaskulären tissue factor ausgelösten Blutgerinnung, sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens .
Bekannte Verfahren der Bestimmung der Blutgerinnung haben zum einen den Nachteil, daß sie mit Blutplasma durchgeführt werden und daher die Beteiligung der Blutzellen nicht berücksichtigen. Die bestehenden Methoden der Erfassung der Gerinnung im Vollblut besitzen zum anderen den Nachteil, daß sie die Situation in vivo nicht adäquat simulieren. Insbesondere lassen sie keine Rückschlüsse über den durch den Kontakt des Blutes mit den Komponenten des Subendothels bedingten Startmechanismus zu.
Aus Giesen, P. .A. et al, Proc . Natl . Acad. Sei. USA (1999) 96, 2311 - 2315 ist ein Verfahren zur Messung der Aktivitäten des intravaskulären tissue factor (TF) an Plasma und Vollblut bekannt. Dieses Verfahren ist unter Strömungsbedingungen durchzuführen und dadurch unter Routinebedingungen schwer handhabbar .
In Rauch, U. & Nemerson, Y., Current opinion in hematologie, (2000) 7(5) 273-7 ist ein Verfahren zur Untersuchung des thrombogenen Potentials von Vollblut bekannt. Das Vollblut wird dazu über eine mit Kollagen beschichtete Glasplatte geführt. Die Fibrinbildung wird durch den Einschluß eines starken TF-Inhibitors gehemmt. Der TF-Inhibitor wird zum Nachweis verwendet, daß das abgeschiedene TF aktiv ist. Das bekannte Verfahren ist zur Bestimmung der Blutzellhämostase nicht geeignet .
Rand, M. u.a., Blood (1996) 88(9) 3432-3445 beschreibt ein Verfahren, bei dem bei minimal gealtertertem Vollblut durch den Zusatz von corn trypsin Inhibitor (CTI) der contact pa- thway während der durch zugefügten TF initiierten Gerinnung unterdrückt wird. Es werden Fibrinpeptid A, die Thrombin- Antithrombin III-Komplex-Bildung und Prothrombin Fragment 1.2 bestimmt. Die Aktivität von TF wird nicht bestimmt. Auch dieses Verfahren ist zur Bestimmung der Blutzellhämostase nicht geeignet .
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein einfach durchzuführendes und zuverlässiges Verfahren zur Bestimmung der Blutgerinnung im Vollblut angegeben werden. Eine weitere Aufgabe besteht darin, einen Kit zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 8 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 7 und 9 bis 11.
Nach einem Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Faktor VΙIa(i) zugegeben. Es handelt sich dabei um Faktor Vlla, der im aktiven Zentrum derivatisiert ist: Faktor VΙIa(i) bindet mit einer höheren Affinität als Faktor Vlla. Er aktiviert die Gerinnung nicht und hemmt die Fibrinbildung.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat insbesondere den Vorteil, daß es einfach und kostengünstig durchführbar ist. Zur Ausführung des Verfahrens muß aus der Vollblutprobe kein Plasma gewonnen werden. Ein weiterer Vorteil besteht darin, daß die durch TF ausgelöste Gerinnung spezifisch gemessen werden kann, ohne daß aufwendige Verfahren, z.B. unter Strömungsbedingungen durchzuführende Verfahren, erforderlich sind.
Das Verfahren beruht auf der überraschenden Erkenntnis, daß nach Stimulierung von Vollblut mit Kollagen Blutplättchen- Leukozyten-Komplexe schnell TF auf ihrer Oberfläche präsentieren. Der funktionell aktive TF des Blutes spielt offen- sichtlich eine entscheidende Rolle als Starter der Blutgerinnung und für die Bildung von arteriellen und venösen Thrombosen.
Das Verfahren wird anhand der beispielhaften Zeichnungen nä- her erläutert. Es zeigen:
Fig. la und b die Zeitabhängigkeit des Kollagen-stimulierten Erscheinens von TF auf der Oberfläche von Blutplättchen- eukozyten-Komplexen im Voll- blut,
Fig. 2a bis d die Auslösung der Blutgerinnung durch Kollagen über eine schnelle Aktivierung des TF/VIIa- Komplexes im Vollblut und
Fig. 3a und b das Auslösen funktioneller TF-Aktivitäten in Komplexen aus isolierten Leukozyten und Blut- plättchen.
Die in Fig. 1 gezeigten Ergebnisse sind erzielt worden, indem Vollblut für verschiedene Zeitperioden bei 37°C ohne (nicht ausgefüllte Symbole) und mit Kollagen (12 μg/ml, ausgefüllte Symbole) inkubiert wurde . Die Leukozyen wurden fixiert und mit FITC-markierten Isotyp-passenden Kontroll-Antikörpern sowie mit FITC-markierten Anti-TF-Antikörpern inkubiert. Die Assoziation der Antikörper mit den Leukozyten wurde mittels Flow-Zytometrie analysiert.
Die Ergebnisse in Fig. 1 stellen den Zeitverlauf des Erscheinens von monozyten- (Fig. la) und neutrophilen-assoziiertem TF dar (Fig. lb) . Die Präsentation des mit den Leukozyten assoziierten TF zeigt innerhalb von 5-10 Minuten nach Stimula- tion mit Kollagen ein Maximum.
Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigen die Rate der Fibrinerzeugung und der Gerinnselbildung (r- und k-Werte) . Diese Werte wurden mittels Thro belastographie des Vollbluts (bei Raumtemperatur) ermittelt. Fig. 2a: Kontrollversuch;
Fig. 2b: Versuch mit Kollagen (12 μg/ml); Fig. 2c: Versuch mit Kollagen (12 μg/ml) und Faktor VΙIa(i) (500 nmol/1); Fig.
2d: Versuch mit Kollagen (12 μg/ml) und Anti-TF-Antikörper
(20 μg/ml) . Wie aus Fig. 2a und b ersichtlich ist, wird die Rate der Fibrinerzeugung durch Kollagen wesentlich verkürzt. Faktor VΙIa(i), welcher den Faktor Vlla aus der Bindung an das TF-Protein verdrängt, verhindert die Stimulation der Koagulationsparameter durch Kollagen (Fig. 2c) . Auch der Zusatz von Anti-TF-Antikörper hemmt die Aktivierung der Gerinnungs- parameter durch Kollagen (Fig. 2d) .
Fig. 3a zeigt die Aktivierung von Faktor X durch isolierte Monozyten (105, präpariert durch micro-bead Technik; weiße Säulen) und isolierte Neutrophile (106, ebenfalls durch die micro-bead Technik präpariert, graue Säulen) , die für 5 Minuten bei 37 °C ohne oder mit Kollagen (12 μg/ml) inkubiert wurden. Sofern angezeigt, wurden isolierte Blutplättchen (107) zu den betreffenden Leukozytensuspensionen gegeben. Die Bil- dung von Faktor Xa wurde unter Verwendung des chromogenen Substrats S2222 nachgewiesen, wie es im wesentlichen bei Sur- prenant, Y.M. und Zuckerman, S.H. (1989) Thro b. Res . 53, Seiten 339 - 346 beschrieben ist. Nach der Inkubation wurde das 2,2-fache Volumen Harns-F10-Medium zugegeben, welches 0,88 U/ml Faktor VII eines die Faktoren II, VII, IX und X enthaltenden Gerinnungsfaktorkonzentrats (Beriplex P/N 500) , 8 mmol/1 CaCl2 und 125 μg/ml (Endkonzentrationen) des chromogenen Substrats S2222 enthielt. Die Mischung wurde für 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Anstieg der Absorption bei 405 nm in 5 aufeinanderfolgenden 360 s- Intervallen in einem ELISA-Leser gemessen. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von Verdünnungen von Gerinnungsfaktor- konzentraten hergestellt.
Die Aktivierung von Faktor X durch isolierte Neutrophile und Monozyten bleibt nach Zugabe von Kollagen unverändert. In Suspensionen von unbehandelten Blutplättchen mit isolierten Leukozyten ist die Bildung von Faktor Xa so niedrig wie in Anwesenheit von Leukozyten alleine. Wird jedoch die Blut- plättchen-Leukozytensuspension durch Kollagen aktiviert, so ist die Faktor Xa Bildung deutlich erhöht (Fig. 3a) .
Wie aus Fig. 3b ersichtlich ist, werden die durch Kollagen ausgelösten prokoagulatorischen Aktivitäten der Suspensionen aus Blutplättchen und Monozyten (weiße Säulen) bzw. Neutro- philen (graue Säulen) , fast vollständig durch Anti-TF- Antikörper und durch den Faktor VΙIa(i) gehemmt. Im Gegensatz dazu verändert der Kontroll-Antikörper die durch Kollagen hervorgerufene Zunahme der prokoagulatorischen Aktivität nicht. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, daß der TF/VIIa Komplex der Hauptauslöser für die Stimulation der Faktor Xa Synthese in den Blutplättchen-Leukozytaggregaten ist. Aus den vorerwähnten experimentellen Ergebnissen ergibt sich, daß die gesamte Koagulationskaskade von der Wechselwirkung des TF mit dem Faktor VII/Vlla bis zur Synthese des Thrombins auf der Oberfläche aktivierter Blutplättchen stattfinden kann. Auf der Grundlage dieser Erkenntnis wird beispielhaft das folgende Verfahren zur Bestimmung der Blutgerinnung vorgeschlagen:
Zunächst erfolgt in herkömmlicher Weise die Entnahme einer Vollblutprobe. Die Vollblutprobe wird dann durch Zugabe einer gerinnungshe menden Substanz stabilisiert. Bei der gerin- nungshe menden Substanz kann es sich um Citrat handeln; es wird eine Konzentration von z.B. 0,38% (Volumenprozent) ein- gestellt.
Anschließend wird der stabilisierten Vollblutprobe mindestens eine Komponente der extrazellulären Matrix zugegeben, z.B. Kollagen in einer Konzentration von 8 bis 15 μg/ml, vorzugs- weise 12 μg/ml. Weiterhin zugegeben wird der Faktor VΙIa(i), vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 1 μM. Ferner wird der Vollblutprobe zu einem beliebigen Zeitpunkt vor der Zugabe von Faktor VΙIa(i) ein die Kontaktaktivierung ausschließender Inhibitor zugefügt, z.B. der com trypsin Inhi- bitor in einer Konzentration von 10 bis 100 μg/ml, vorzugsweise 50 μg/ml. Die Probe kann, vorzugsweise über eine CaCl -Lösung mit einer Konzentration von 100 mM, recalzifi- ziert werden.
Anschließend kann die Blutgerinnungsaktivität mit einem herkömmlichen Verfahren, z.B. Thrombelastographie, Kugelcoagulo- metrie oder das Häkel-Verfahren, bestimmt werden. Die Zugabe von Matrixkomponenten erfolgt vorzugsweise zum re- calzifizierten Vollblut. Bei den Matrixkomponenten handelt es sich um hochspezifische Aktivatoren, welche die Gerinnung im Vollblut auslösen. Durch die Zugabe von Faktor VΙIa(i) kann der Anteil der durch TF induzierten Fibrinbildung an der gesamten durch Kollagen vermittelten Fibrinerzeugung ermittelt werden .
Nach einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung kann zur Vollblutprobe zusätzlich rekombinanter TF zugegeben werden. Damit ist es möglich, die Wirkungen von Gefäßwand- und Blut- zell-TF zu erfassen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung der Blutzellhämostase, insbesondere der durch den intravaskulären tissue factor (TF) aus- gelösten Blutgerinnung, mit folgenden Schritten
a) Entnahme einer Vollblutprobe,
b) Stabilisieren der Vollblutprobe durch Zugabe einer ge- rinnungshe menden Substanz,
c) Zugabe mindestens einer Komponente der extrazellulären Matrix,
d) Zugabe eines die Kontaktaktivierung ausschließenden Inhibitors,
e) Zugabe von Faktor VΙIa(i) und
f) Nachweis der Blutgerinnung nach einem herkömmlichen Verfahren .
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei beim Schritt lit. b als gerinnungshemmende Substanz Citrat zugegeben wird.
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vollblutprobe vor dem Schritt lit.f, insbesondere vor dem Schritt lit. c, recalcifiziert wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Vollblutprobe vor dem Schritt lit. f rekombinanter tissue factor (TF) zugegeben wird.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei beim Schritt lit. d als Inhibitor der corn trypsin Inhibitor (CTI) zugegeben wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als herkömmliches Verfahren beim Schritt lit. f die Thrombe- lastographie, die Kugelkoagulometrie oder das Häkel-Verfahren verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Matrixkomponente Kollagen enthält.
8. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die folgenden Komponenten: Faktor VΙIa(i) und CTI.
9. Kit nach Anspruch 9, umfassend weiterhin Citrat.
10. Kit nach einem der Ansprüche 9 oder 10, umfassend wei- terhin ein mit einem gerinnungshemmenden Mittel beschichtetes
Blutentnahmeröhrchen.
11. Kit nach einem der Ansprüche 8 bis 11, umfassend weiterhin rekombinanten tissue factor (TF) .
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