WO2002051998A1 - Nouvelle protease - Google Patents

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WO2002051998A1
WO2002051998A1 PCT/JP2001/011251 JP0111251W WO02051998A1 WO 2002051998 A1 WO2002051998 A1 WO 2002051998A1 JP 0111251 W JP0111251 W JP 0111251W WO 02051998 A1 WO02051998 A1 WO 02051998A1
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WO
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polypeptide
amino acid
acid sequence
seq
amino acids
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PCT/JP2001/011251
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Noboru Yamaji
Kouichi Nishimura
Kunitake Abe
Makoto Ogino
Original Assignee
Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes

Definitions

  • the present invention relates to a novel protease. '' Background technology
  • AD AMTS AD isintegrin and metalloprotease with thromb ospondin mo tif
  • TSP-1 repeat a thrombospondin type I repeat
  • the extracellular matrix aggrecan has a glutamic acid residue at position 373 and an alanine residue at position 374. It has been shown to selectively cleave between the base (GI u 373 and AI a 374 ), and may be the main enzyme in the degradation of the extracellular matrix aggrecan in arthritis and osteoarthritis. (Tortorella MD et al., Science, 284, 1664-1666, 1999; and Abbaszade I. et al., J. Biol. Chem., 274, 23443-23450, 1999). . ADAMTS 2
  • Procollagen IN-proteinase is an enzyme that cleaves and removes the N-terminal part of type I collagen pro-form, is involved in the conversion of type I collagen from pro-form to mature form, and plays an important role in the formation of collagen fibers. It has been shown that the abnormality of the gene is associated with the Ehlers-Danlos syndrome VII type C (CoI ige A. et al., Am. J. Hum. Genet., 65, 308-31 7, 1 999).
  • ADAMTS molecules are involved in metabolism such as degradation and maturation of extracellular matrix such as aggrecan and collagen.
  • chronic renal failure is a disease characterized by glomerular sclerosis and renal interstitial fibrosis, and qualitative changes and / or increases in the amount of extracellular matrix components are regarded as major pathogenesis and progress mechanisms.
  • TGF- ⁇ transforming growth factor
  • Anti-TGF— S administration
  • TGF- ⁇ is a differentiation and growth factor with a wide variety of physiological functions
  • inhibiting all of the physiological functions of TGF- ⁇ may have side effects in the treatment of chronic renal failure where long-term administration is expected. Dangerous from a point of view. It is desirable to suppress or inhibit only the part of the physiological action of TGF-yS involved in the qualitative change and increase in the amount of extracellular matrix components. .
  • An object of the present invention is to provide a novel protease which is induced by TGF-y8 and is involved in extracellular matrix metabolism, which is useful as a screening tool for a therapeutic agent for chronic renal failure, and a novel polynucleotide encoding the same.
  • the present inventor has conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, from human fetal kidney cDNA, amino acids 1 to 1224 in the sequence represented by SEQ ID NO: 2 And a polynucleotide encoding a novel protease consisting of 1224 amino acid residues.
  • the present inventor has found that the N-terminal partial fragment consisting of 750 amino acid residues of this novel protease also has a sufficient protease activity.
  • the protease comprises: (1) A DAM Being classified as a protease, it is considered to be a protease involved in the metabolism of extracellular matrix. (2) In fact, its expression in human kidney is observed. (3) Kidney In primary culture cells, the expression was induced by TGF-; 8, and (4) the gene expression level was increased in renal failure model animals.
  • the protease of the present invention is a polypeptide that causes renal failure.
  • TGF- ⁇ By using the polypeptide of the present invention to screen for a substance that inhibits its protease activity, TGF- ⁇ It is clear that it is possible to screen for a substance useful as a therapeutic agent for chronic renal failure that suppresses or inhibits only the part of the physiological action involved in qualitative changes and quantitative increase of extracellular matrix components. The present invention has been completed.
  • [1] (1) a sequence consisting of amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; (2) a sequence consisting of amino acids 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 In the sequence consisting of the amino acid No. 1, 10 to 10 amino acids have been deleted, substituted, modified or inserted, or (3) the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A polypeptide comprising an amino acid sequence in which 1 to 10 amino acids have been deleted, substituted, and / or inserted in the sequence consisting of the 1224th amino acid, and further exhibiting protease activity;
  • polypeptide comprising a sequence consisting of amino acids 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and further exhibiting protease activity;
  • [5] (1) homology to the sequence consisting of amino acids 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or (2) the homology to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology of 90% or more with a sequence consisting of the 1st to 1224th amino acids and exhibiting protease activity;
  • a method for producing a pharmaceutical composition for treating chronic renal failure comprising:
  • protease inhibitory protein As used herein, the term “protease activity” refers to a complex which is not dissociated by sodium dodecyl sulfate (SDS) and Z or a reducing agent with 2- macroglobulin, a protease inhibitory protein present in serum. Means properties. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • polypeptide comprising a sequence consisting of amino acids 1 to 50 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2;
  • homologous polypeptide A polypeptide comprising an amino acid sequence having a homology of 90% or more with a sequence consisting of amino acids of the first to second incense and exhibiting protease activity (hereinafter referred to as homologous polypeptide)
  • polypeptide of the present invention "a polypeptide comprising a sequence consisting of amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2" is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • the polypeptide is not particularly limited as long as it contains a sequence consisting of amino acids Nos. 1 to 50 and has a protease activity.
  • a method for determining whether or not a certain polypeptide (hereinafter, referred to as a test polypeptide) exhibits “protease activity” (hereinafter, may be referred to as a “method for determining protease activity”) is as follows.
  • the test polypeptide is brought into contact with 2— macroglobulin, a protease inhibitory protein present in serum, and SDS and / or a reducing agent [eg, 2— It can be confirmed by analyzing whether or not a complex that does not dissociate with mercaptoethanol (2-ME)] is formed. Can be confirmed, for example, by the method described in Example 4.
  • ⁇ 2 -macroglobulin is a protease inhibitory protein present in serum and is known to form a complex with many proteases. This complex Formation is dependent on the protease activity, and the complex formed is an amide bond between protease and 2- macroglobulin, so that SDS or reducing agent (eg, 2- ME) does not dissociate (Feinm an RD et al., Ann. New York Ac Ad. Sci., 737, 245-266, 19994; and Kuno K. et al. J. Bio, Chem., 274, 1882-188826, 1999).
  • SDS or reducing agent eg, 2- ME
  • the polypeptide (1a) that is, the “polypeptide consisting of amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2” has 750 amino acid residues exhibiting protease activity.
  • a novel protease consisting of The polypeptide (1a) corresponds to a partial polypeptide of “a polypeptide consisting of the 1st to 1224th amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2”.
  • the marker sequence in the polypeptide of the present invention for example, a sequence for easily confirming expression of the polypeptide, confirming intracellular localization, or purifying can be used.
  • a sequence for easily confirming expression of the polypeptide, confirming intracellular localization, or purifying can be used.
  • Examples include a LAG tag, a hex-histidine 'tag, a hemagglutinin' tag, or mycep I.
  • the functional equivalent variant of the present invention has 1 to 10 amino acids, preferably 1 to 10 amino acids at one or a plurality of positions in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, which comprises amino acids 1 to 50. 1 to 7, more preferably 1 to 5 (for example, 1 to several) amino acids contain an amino acid sequence in which deletion, substitution, and / or insertion has been performed, and exhibit protease activity It is not particularly limited as long as it is a polypeptide, and its origin is not limited to human.
  • mutant J includes not only a mutant in the human of a polypeptide consisting of amino acids 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, but also a non-human organism (eg, mouse, rat , Hamsters, or dogs). Furthermore, based on the polynucleotide encoding those natural polypeptides (ie, variants derived from humans or functionally equivalent variants derived from non-human organisms), or represented by SEQ ID NO: 2 That encodes a polypeptide consisting of amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence Polypeptides produced using polynucleotides artificially modified by genetic engineering based on leotide are included. In this specification, “mutant J
  • variable means an individual difference in the same polypeptide in the same species, or a difference in the homologous polypeptide between several species.
  • Mutants in humans of the polypeptide consisting of amino acids 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or functionally equivalent variants derived from organisms other than human can be obtained by those skilled in the art.
  • the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the polypeptide consisting of amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 for example, the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 (Array) information.
  • the genetic recombination technique is a known method (for example, Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning—AL aboratory Manual, Cold Spring Laboratories, NY, 1 989).
  • an appropriate primer or probe is designed based on information on the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding a polypeptide consisting of amino acids 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • a primer for example, total RNA or mRNA fraction, c
  • a mammal eg, human, mouse, rat, hamster, or dog
  • PCR Polymerase chain reaction
  • a polynucleotide encoding a polypeptide is obtained, and the polynucleotide is expressed using an appropriate expression system.
  • a desired polypeptide can be obtained by confirming that it exhibits protease activity by the method described in Example 4.
  • the above-mentioned polypeptide which has been artificially modified by genetic engineering can be obtained by a conventional method, for example, site-specific mu tagenesis (Mark, DF et al., Proc. Natl. Ac). a d. Sc in USA, 81, 5662-5666, 19984), a polynucleotide encoding the polypeptide is obtained, and the polynucleotide is expressed using an appropriate expression system.
  • the expressed polypeptide is, for example, as described in Example 4.
  • the desired polypeptide can be obtained by confirming the protease activity by the method.
  • An amino acid sequence to which a deleted sequence has been added which has an amino acid sequence to which an appropriate marker sequence or the like has been further added at the N-terminus and / or C-terminus thereof, and which further exhibits a protease activity. And so on.
  • the homologous polypeptide of the present invention has a homology with the sequence consisting of amino acids 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the first amino acid in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequence is not particularly limited as long as it contains an amino acid sequence having a homology of 90% or more with the sequence consisting of the amino acids Nos. 1 to 1224 and exhibits protease activity. With respect to the sequence consisting of amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the sequence consisting of amino acids Nos. 1 to 1224 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • homology to the sequence consisting of amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence having a homology of 90% or more (more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more) with a sequence consisting of the amino acids Nos. 1 to 1224;
  • a polypeptide exhibiting protease activity is more preferable.
  • BLAST Basic Ioca I aI ingmentsearchtoo I; Altscnul, SF et al., J. Mo, Biol., 2 15, 403-411). 0, 1990
  • BLAST search algorithm Specifically, the bI 2 seq program (Tatiana A. Tatusova and Thomas L.) of the BLAST package (sgi 32-bit version, version 2.0.12; obtained from NCBI) is available. M adden, F EMS Microbiol. Lett., 174, 27-250, 1999) and can be calculated according to default parameters.
  • a polypeptide consisting of amino acids 1 to 75 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Peptide "" a polypeptide J consisting of the 1st to 122nd amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; "1st to 75th amino acid sequence in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2"
  • a total of 1 to 10 preferably 1 to 7, more preferably 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, inserted, And / or a polypeptide J exhibiting protease activity, or ⁇ consisting of amino acids 1 to 1224 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • One or more positions in the sequence comprises an amino acid sequence in which 1 to 10 (preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5) amino acids are deleted, substituted, inserted, and / or added as a whole, and Polypeptide J exhibiting an activity of zeolites is preferable, "a polypeptide comprising amino acids Nos. 1 to 750 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2", or A polypeptide comprising amino acids Nos. 1 to 1224 in the amino acid sequence "is more preferable.
  • the polynucleotide of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the first to second nucleotides in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 Polynucleotides containing a sequence consisting of 250 incense bases may be mentioned. Particularly preferred are polynucleotides consisting of the first to second 250 incense bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the term “polynucleotide” in the present specification includes both DNA and RNA.
  • the method for producing the polynucleotide of the present invention is not particularly limited.
  • Examples of the method include (1) a method using PCR, and (2) a conventional genetic engineering method (that is, a method using a cDNA library). (A method of selecting a transformed strain containing the desired cDNA from the transformed transformant) or (3) a chemical synthesis method.
  • a method using PCR a method using a cDNA library
  • a conventional genetic engineering method that is, a method using a cDNA library
  • a chemical synthesis method a method using a method using a cDNA library.
  • mRNA is extracted from human cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention.
  • a set of two primers each capable of sandwiching the entire length of mRNA corresponding to the polypeptide of the present invention, Create a pair of primer sets that can sandwich the mRNA region.
  • RT-PCR reverse transcriptase-polymerase chain reaction
  • total RNA including mRNA encoding the polypeptide of the present invention is extracted from cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention by a known method.
  • the extraction method include the guanidine 'thiosinate, hot' phenol method, the guanidine 'thiosinate-guanidine-hydrochloric acid method, and the guanidine-thiosinate cesium chloride method. Preferably, it is used.
  • Cells or tissues capable of producing the polypeptide of the present invention include, for example, a Northern blotting method using a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention or a part thereof, or a polypeptide or a polynucleotide of the present invention. It can be identified by Western blotting using an antibody specific for the peptide.
  • mRNA is purified.
  • Purification of mRNA can be performed according to a conventional method. For example, mRNA can be purified by adsorbing it to an oligo (dT) cellulose column and then eluted. If desired, mRNA can be further fractionated by sucrose density gradient centrifugation or the like. Also, without extracting mRNA, commercially available extracted and purified mRNA can also be used.
  • the purified mRNA is subjected to a reverse transcriptase reaction in the presence of, for example, a random primer, an oligo dT primer, and a primer synthesized in a random or custom manner to synthesize a first-strand cDNA.
  • This synthesis can be performed by a conventional method.
  • Using the obtained first-strand cDNA perform PCR using two types of primers sandwiching the full-length or partial region of the target polynucleotide, and obtain the target cDNA.
  • the obtained DNA is fractionated by agarose gel electrophoresis or the like. If desired, the DNA can be obtained by cutting the DNA with a restriction enzyme or the like and connecting the DNA.
  • the polynucleotide of the present invention can be produced, for example, by the following procedure.
  • a single-stranded cDNA was synthesized using a reverse transcriptase, and then a double-stranded cDNA was synthesized from the single-stranded cDNA.
  • the method include the S1 nuclease method (E f S tratiadis, A. et al., Cell, 7, 279-288, 1976), the L and method (Land, H. et al., Nucleic Acids Res., 9, 2251 -2266, 1981), 0. Joon Yoo method (Yoo, OJ et al., Proc. Natl. Ac ad.
  • the recombinant plasmid is introduced into Escherichia coli (for example, DH5 strain, HB101 strain, or JM109 strain) and transformed. Recombinants are selected based on drug resistance to tetracycline, ampicillin, or kanamycin.
  • Methods for selecting a transformant having the desired cDNA from the thus obtained transformants include, for example, the following (i) a transformant screening method using a synthetic oligonucleotide probe; U) a method for screening a transformant using a probe prepared by PCR, (iii) a method for screening a transformant using an antibody against the polypeptide of the present invention, or (iv) a selective 'high' A transformant screening method using a bridging solution / translation system can be employed.
  • a transformant having the target cDNA can be selected by the following procedure.
  • an oligonucleotide corresponding to all or a part of the polypeptide of the present invention was synthesized, and this was used as a probe (labeled with 32 or 33 ) to obtain a nitrocellulose filter denatured and immobilized with the DNA of the transformant. Alternatively, it is hybridized with a polyamide filter, and the obtained positive strain is searched and selected.
  • a probe oligonucleotide a nucleotide sequence derived from codon usage can be used, or a plurality of nucleotide sequences obtained by combining possible nucleotide sequences can be used. Can also. In the latter case, the type can be reduced by including inosine.
  • a transformant having the desired cDNA can be selected by the following procedure.
  • oligonucleotides of a sense primer and an antisense primer corresponding to a part of the polypeptide of the present invention are synthesized, and PCR is performed by combining these primers to encode all or part of the target polypeptide.
  • the DNA fragment to be amplified As the type I DNA used herein, cDNA synthesized by reverse transcription reaction from mRNA of a cell producing the polypeptide of the present invention or genomic DNA can be used.
  • the DNA fragment prepared in this manner is labeled with, for example, 32 P or 33 P, and colony hybridization or plaque hybridization is performed using the labeled DNA as a probe to obtain the desired cDNA.
  • a transformant having the desired cDNA can be selected, for example, by the following procedure.
  • the cDNA was previously integrated into the expression vector, and the culture supernatant of the transformed strain,
  • the polypeptide is produced intracellularly or on the cell surface, and a desired polypeptide-producing strain is detected using an antibody against the polypeptide of the present invention and a secondary antibody against the antibody, to obtain the desired cDNA.
  • a transformant having the strain is selected.
  • a transformant having the desired cDNA can be selected by the following procedure.
  • cDNA obtained from the transformed strain was plotted on a nitrocellulose filter or the like, and mRNA separately prepared from cells capable of producing the polypeptide of the present invention was hybridized and then bound to the cDNA. Dissociate and recover mRNA.
  • the recovered mRNA is injected into an appropriate polypeptide translation system, for example, an oocyte of an African frog, or translated into a polypeptide using a cell-free system such as a heron reticulocyte lysate or wheat germ. .
  • a transformant having the desired cDNA is selected by detection using an antibody against the polypeptide of the present invention.
  • a method for collecting the polynucleotide of the present invention from the obtained transformant of interest can be obtained by a known method (for example, Sambrook, J. et al., "Molecular CI on ng—A Laboratory Manual, Col. Spring Harbor Laboratory, Y, 1989) For example, separating a fraction corresponding to plasmid DNA from cells and cutting out the cDNA region from the obtained plasmid DNA. Can be performed by
  • the polynucleotide of the present invention can be produced by binding the DNA fragment produced by the chemical synthesis method.
  • Each DNA is synthesized using a DNA synthesizer [for example, Oligo 100 OM DN AS ynthesizer (manufactured by Beckman) or 394 DNA ZRNA Synthesizer (manufactured by App Ied Biosystems)] can do.
  • the polynucleotide of the present invention can be prepared, for example, by the phosphite triester method (Hunkap IIer, M. et al., N. ature.10, 105-111, 1984), etc., and can also be produced by chemical synthesis of nucleic acids.
  • the codon for the desired amino acid is known per se and may be arbitrarily selected. For example, it can be determined according to a conventional method in consideration of the frequency of codon usage of the host to be used (Cranth am, R Et al., Nucleic Acids Res., 9, r 43—r 74, 198 1).
  • partial modification of the codons of these nucleotide sequences can be performed by a conventional method using site-directed mutagenesis using a primer consisting of a synthetic oligonucleotide encoding the desired modification) or (site-specific mu tagenesis) ( Sc. Natl. Acad. Sc, Mark, D. F. et al., USA, 81, 5662-5666, 19984).
  • the sequencing of DNA obtained by the various methods described so far can be performed, for example, by the chemical modification method of Maxam-Gilbert (MaXam, AM and Gibert, W., "Methodsin Enzymo Iogy”). , 65, 499-555, 1980) and dideoxynucleotide chain termination methods (Messing, J. and Vieira, J., Gene, 19, 269-276, 1982). You can do it.
  • “3.Expression vector and cell of the present invention-Eukaryotic or prokaryotic host cells can be transfected by re-incorporating the isolated polynucleotide of the present invention into an appropriate vector DMA.
  • the polynucleotide can be expressed in each host cell.
  • the expression vector of the present invention is not particularly limited as long as it contains the polynucleotide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention may be added to a known expression vector appropriately selected according to the host cell to be used. And an expression vector obtained by insertion.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it is transfected with the expression vector of the present invention and contains the polynucleotide of the present invention.
  • a cell integrated into the chromosome of a cell Alternatively, it can be a cell containing the polynucleotide according to the present invention in the form of an expression vector.
  • the cells can be cells expressing the polypeptide of the present invention, or cells not expressing the polypeptide of the present invention.
  • the cell of the present invention can be obtained, for example, by transfection of a desired host cell with the expression vector of the present invention.
  • a vertebrate cell expression vector those having a promoter, an RNA splice site, a polyadenylation site, a transcription termination sequence, etc., which are usually located upstream of the gene to be expressed, can be used. Furthermore, if necessary, a replication origin can be provided.
  • the expression vector include, for example, PSV 2 dhfr having an early promoter of SV40 (Subramani, S. et al., Mo to Ce I to Biol., 1, 854-864, 19981), PEF-BOS (Mizushima, S. and Nagata, S., Nucleic Acids Res., 18, 5,322, 1990) having a human elongation factor promoter, or cytomegalovirus promoter P CEP 4 (Invitrogen) and the like.
  • p CEP4 Invitrogen
  • S One having a V40 origin of replication, capable of autonomous growth in COS cells, and having a transcription promoter, a transcription termination signal, and an RNA splice site can be used.
  • pME18S Ma ruy ama, K. and Takebe, Y., Med.Immuno I., 20, 27-32, 1990
  • p EF—BOS Mizushima, S. and Nagata, S., N
  • pCDM8 Seed, B., Nature, 329, 840-842, 1987).
  • the expression vector is prepared, for example, by the DEA E-dextran method (Lutman, H. and Magnusson,-, Nucleic Acids Res., 11, 1295-1308, 1983). , Calcium phosphate-DNA coprecipitation method
  • a vector capable of expressing a neo gene functioning as a G418 resistance marker together with an expression vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention for example, p RS V neo (Sammbook, J. Ri, olecular Cloning — AL aboratory M tract ", Old Spring Harbor Laboratory, NY, 1 989) or p SV2—neo (S outhern, PJ and Berg, P., J. Mo, and App I. Gnet., 1, 327-341, 19882) were transfected, and G418 resistant colonies were selected. Transfected cells that stably produce the polypeptides of the invention can be obtained.
  • the cells of the present invention can be cultured according to a conventional method (for example, edited by The Biochemical Society of Japan, “New Cell Chemistry Experiment Course 18 Cell Culture Technology”, Tokyo Kagaku Dojin, 1990). By culturing, the polypeptide of the present invention is produced extracellularly.
  • a medium that can be used for the culture various types of commonly used media can be appropriately selected depending on the host cell used. For example, in the case of COS cells, for example, a medium such as RPMI-1640 medium or Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium (DMEM) to which serum components such as fetal bovine serum (FBS) are added as necessary. Can be used.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Minimum Essential Medium
  • FBS fetal bovine serum
  • the polypeptide of the present invention which is produced extracellularly by culturing the cell of the present invention, comprises various known separations utilizing the physical properties, biochemical properties, and the like of the polypeptide. Separation and purification can be performed by an operation method (for example, edited by Masato Okada and Kaoru Miyazaki, "Revised Protein Experiment Note: Up and Down", Yodosha, 1999). Specifically, a culture solution containing the polypeptide of the present invention may be treated with, for example, a normal protein precipitant, ultrafiltration, various liquid chromatography [eg, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, and the like. Chromatography, ion-exchange chromatography, affinity chromatography, high-performance liquid chromatography (HP LC), etc.], or dialysis, or a combination thereof, to purify the polypeptide of the present invention. Can be.
  • a normal protein precipitant for example, ultrafiltration, various liquid chromat
  • the expression of the polypeptide of the present invention can be easily confirmed or purified by expressing the polypeptide of the present invention by fusing it in-frame with the marker sequence.
  • the marker sequence include an F-tag and an AG tag, a hexahistidine 'tag, a hemagglutinin' tag, and a myctopine.
  • a protease for example, enzymatic kinase, factor Xa, or thrombin
  • polypeptide of the present invention makes it possible to detect whether or not a test compound inhibits the protease activity of the polypeptide of the present invention.
  • the present invention By using the detection method, a substance that inhibits the protease activity of the polypeptide of the present invention can be screened.
  • MDT S 9 which is the polypeptide of the present invention
  • the test compound that can be subjected to the detection method or screening method of the present invention is not particularly limited.
  • various known compounds including peptides registered in a chemical file, combinatorial compounds, and the like can be used.
  • a group of compounds obtained by the chemistry method (T errett, NK et al., Tetrahedron, 51, 8135-1813F, 1995) or a conventional synthesis technique, or a phage display method (Felici F. et al., J. Mo, and Bio, 222, 301-310, 19991) can be used.
  • the known compounds are known to have, for example, a protease inhibitory activity.
  • test polypeptide and Fei 2 - Li instead contacting the macroglobulin, polypeptides and alpha 2 of the present invention - except contacting a macro Gros purine with a test compound, of the aforementioned It can be carried out in the same manner as in the method for determining the protease activity.
  • the polypeptide of the present invention in the detection method of the present invention, the polypeptide of the present invention, the polypeptide for a substrate, and a test compound are brought into contact with each other, and in the presence of the test compound, the polypeptide of the present invention and ⁇ 2 -macroglobulin
  • a reducing agent for example, 2-ME
  • the polypeptide of the present invention and 2- macroglobulin do not form a complex that does not dissociate with SDS and / or a reducing agent (eg, 2-ME), or the extent of the formation
  • a reducing agent eg, 2-ME
  • polypeptides and 2 of the present invention - contacting the macro Gros purine with a test compound, Poribe peptide and 2 of the present invention in the presence of the test compound - formation of a complex between the macro Gros purine
  • the substance that inhibits the protease activity of the polypeptide of the present invention or the substance for treating chronic renal failure can be selected using the presence or absence or the degree of the index as an index.
  • the polypeptide of the present invention and 2- macroglobulin will not form a complex that does not dissociate with SDS and / or a reducing agent (eg, 2-ME), or If it decreases, the test compound
  • the substance can be determined to be a substance that inhibits the protease activity of the polypeptide described above or a substance for treating chronic renal failure.
  • the detection method of the present invention includes a step of detecting whether or not the protease activity of the polypeptide of the present invention is inhibited, and a step of formulating the same.
  • the present invention also includes a method for producing a pharmaceutical composition for treating chronic renal failure.
  • the present invention includes a method for producing a pharmaceutical composition for treating chronic renal failure, which comprises formulating a substance obtained by the screening method of the present invention including the detection step.
  • the preparation containing a substance that inhibits the protease activity of the polypeptide of the present invention as an active ingredient may be, depending on the type of the active ingredient, a carrier, an excipient, and / or other additives usually used for the formulation thereof. It can be prepared using an agent.
  • Administration may be, for example, oral administration of tablets, pills, capsules, granules, fine granules, powders, or oral solutions, or injections such as intravenous injection or intramuscular injection, suppositories, transdermal Parenteral administration using an agent for administration or an agent for transmucosal administration can be mentioned.
  • parenteral administration using an agent for administration or an agent for transmucosal administration
  • pharmaceutical preparations that do not undergo parenteral administration such as intravenous injection or digestion, for example, the pharmaceutical preparations described in WO 9528896 pamphlet are preferable. .
  • compositions for oral administration one or more active substances and at least one inert diluent such as lactose, mannitol, glucose, microcrystalline cellulose, hydroxypropylcellulose, starch, polyvinyl It can be mixed with pyrrolidone or magnesium aluminate metasilicate.
  • the composition may contain additives other than an inert diluent, for example, a lubricant, a disintegrant, a stabilizer, or a solubilizing or solubilizing agent, according to a conventional method. Tablets and pills may be coated, if necessary, with a sugar-coated or gastric or enteric coated film.
  • Liquid compositions for oral use can include, for example, emulsions, solutions, suspensions, syrups, or elixirs; commonly used inert diluents, such as purified water Or it may include ethanol.
  • the composition can contain additives other than inert diluents, for example, wetting agents, suspending agents, sweetening agents, fragrances, or preservatives.
  • Parenteral injections may include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, or emulsions.
  • the aqueous solution or suspension may contain, for example, distilled water for injection or physiological saline as a diluent.
  • a diluent for a water-insoluble solution or suspension for example, propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil (eg, olive oil), alcohols (eg, ethanol), polysorbate 80, etc. Can be.
  • the composition may further include a wetting agent, an emulsifying agent, a dispersing agent, a stabilizer, a solubilizing or solubilizing agent, or a preservative.
  • the composition can be sterilized by, for example, filtration through a bacteria-retaining filter, blending of a bactericide, or irradiation.
  • a sterile solid composition can be produced and dissolved in sterile water or another sterile injectable medium before use.
  • the dose can be appropriately determined in consideration of the activity intensity, symptom, age, sex, etc. of the active ingredient selected by the screening method.
  • the dose is usually about 0.01 to 100 mg / day, preferably 0.01 to 100 mg / day for an adult (as a body weight of 60 kg).
  • the dosage is 0.01 to 100 mg / day, preferably 0.01 to 100 mg / day in the form of injection.
  • An antibody that reacts with the polypeptide of the present invention (for example, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody) can be obtained by directly administering the polypeptide of the present invention or a fragment thereof to various animals. Further, using a plasmid into which a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention has been introduced, the DNA vaccine method (Raz, E. et al., Proc. Natl. Acad. , 951 9-952 3, 1994; or Donne IIy, JJ et al., J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996).
  • the polyclonal antibody was sensitized, for example, by immunizing an emulsion obtained by emulsifying the polypeptide of the present invention or a fragment thereof in an appropriate adjuvant (for example, Freund's complete adjuvant) in the abdominal cavity, subcutaneous region, or vein. It can be produced from serum or eggs of animals (eg, egrets, rats, goats, or chickens).
  • a polyclonal antibody can be separated and purified from the serum or eggs thus produced by a conventional polypeptide isolation and purification method. Examples of such separation and purification methods include centrifugal separation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatographic method with DEAE-cellulose, hydroxyapatite, or protein A agarose. it can.
  • Monoclonal antibodies can be readily prepared by those skilled in the art by, for example, the cell fusion method of Koehler and Milstein (Koh Ier, G. and M I Istein, C., Nature, 256, 495-497, 1975). It is possible to manufacture.
  • an instillation of the polypeptide of the present invention or a fragment thereof in an appropriate adjuvant is repeatedly inoculated into the mouse intraperitoneally, subcutaneously, or vein several times every several weeks.
  • an appropriate adjuvant for example, Freund's complete adjuvant
  • spleen cells are removed and fused with myeloma cells to produce hybridomas.
  • myeloma cells for obtaining hybridomas include myeloma cells having a marker such as hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency or thymidine kinase deficiency (for example, mouse myeloma cell line P 3X63Ag 8.U 1).
  • fusion agent for example, polyethylene glycol can be used.
  • a medium for producing hybridomas for example, 10-30% of a commonly used medium such as Eagle's minimum essential medium, Dulbecco's modified minimum essential medium, or RPMI-1640 is used. Maggot fetal serum can be used as appropriate. Fusion strains can be selected by the HAT selection method. The screening of hybridomas can be performed by using well-known methods such as ELISA or immunohistochemical staining using the culture supernatant to select clones of hybridomas secreting the desired antibody. You. In addition, by repeating subcloning by the limiting dilution method, the monoclonality of the hybridoma can be guaranteed.
  • the hybridoma obtained in this way can be purified by culturing it in the medium for 2 to 4 days or in the abdominal cavity of BALB BZc mice pretreated with pristane for 10 to 20 days. An amount of antibody can be produced.
  • the monoclonal antibody thus produced can be separated and purified from the culture supernatant or ascites by a conventional method for isolating and purifying the polypeptide.
  • separation and purification methods include centrifugation, dialysis, salting out with ammonium sulfate, and chromatographic method with DEAE-cellulose, hydroxyapatite, or protein A agarose. .
  • the antibody fragment containing the monoclonal antibody or a part thereof may be obtained by incorporating all or a part of the gene encoding the monoclonal antibody into an expression vector, and using a suitable host cell (for example, Escherichia coli, yeast, or animal cell). It can also be introduced and produced.
  • a suitable host cell for example, Escherichia coli, yeast, or animal cell. It can also be introduced and produced.
  • Antibodies (including polyclonal antibodies and monoclonal antibodies) separated and purified as described above are digested with a polypeptide-degrading enzyme (for example, pepsin or papain, etc.) by a conventional method.
  • a polypeptide-degrading enzyme for example, pepsin or papain, etc.
  • An antibody fragment containing a part of an active antibody, for example, F (ab ') 2 , Fab, Fab', or Fv can be obtained by separation and purification by an isolation and purification method.
  • an antibody reactive with the polypeptide of the present invention can be obtained by the method of Kraxon et al. Or the method of Zebede et al. (CI ackson, T. et al., Nature, 352, 624-628, 1991, or Zebedee, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sc in USA, 89, 3175-3179, 1992), a single strand (s ⁇ ng Iechain) 'Fv or F It can also be obtained as ab.
  • Human antibodies can also be obtained by immunizing transgenic nick mice (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1999), in which the mouse antibody gene has been replaced with a human antibody gene. It is possible.
  • Plasmid p CEP4 (manufactured by Invitrogen) was digested with restriction enzymes CIaI and NsiI, blunt-ended, and self-ligated to obtain an EBN A1 expression unit derived from Epstein-Barr virus.
  • the removed expression vector pCEP4d was prepared.
  • the obtained expression vector pCEP4d is digested with restriction enzymes NheI and BamHI, and then extracted by agarose gel.
  • the expression vector pCEP4d is obtained by inserting a double-stranded oligonucleotide obtained by annealing the oligonucleotide consisting of the sequence and the oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4. — Created FL AG.
  • the nucleotide sequence confirmed that the obtained expression vector had the target sequence.
  • the obtained expression vector P CE P 4 d-FLAG was designated as type III, and a combination of an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 and an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 6 PCR was performed using Pyro Best TM DNA polymerase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) as a primer. In the PCR, heat denaturation was first performed at 94 ° C (2 minutes), and then a cycle consisting of 94 ° C (30 seconds), 55 ° C (30 seconds), and 72 ° C (30 seconds) was performed. The elongation reaction was repeated 5 times, and finally an extension reaction was performed at 72 ° (7 minutes).
  • the expression vector pCEPdE2-FLAG was prepared by inserting the DNA into 7 Kbp).
  • the cloning sites X ba I recognition sequence, N he I recognition sequence, Not I recognition sequence, and Bam HI recognition sequence and FLAG tag are arranged in this order.
  • Example 2 Clonin of the full-length ORF gene of the novel protease gene MDTS 9 Oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 7 (a Spe I recognition sequence and a Kozak sequence are added on the 5 'side) Using a combination with an oligonucleotide consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 8 (with a Not I recognition sequence added to the 5 'side) as a primer, a human fetal kidney cDNA (Marathon-Ready TM PCR was carried out using DNA polymerase (TaKaRa LATaq ⁇ ; Takara Shuzo) with cDNA ; In the above-mentioned PCR, heat denaturation was first performed at 94 ° C (2 minutes), and then a cycle consisting of 98 ° C (10 seconds) and 68 ° C (2 minutes 30 seconds) was repeated 40 times.
  • SEQ ID NO: 7 a Spe I recognition sequence and a Kozak
  • Plasmid p CEP d E2-MDTS 9 Cys 1-FLAG was constructed by inserting into the Xba I and Not I sites.
  • the obtained plasmid pMDT S9 (5S2-2) was digested with the restriction enzymes SpeI and NcoI to generate a S pel-N col DNA fragment A of about 0.2 kbp.
  • the approximately 2.0 kbp NcoI-NotI DNA fragment obtained by digesting the obtained plasmid pMDTS9Cys1 with restriction enzymes NcoI and NotI was constructed in Example 1 described above.
  • Plasmid pCEP dE2-MDTS9Cys2-FLAG was constructed by insertion into the XbaI and NotI sites of pCEPdE2-FLAG.
  • DNA fragment A and the DNA fragment B are inserted into the Spe I and Not I sites of the plasmid p ZErO-2 (Invitrogen, Inc.), whereby the plasmid p ZE r O— MDTS 9Cys2 was constructed.
  • a human fetal kidney cDNA (Marathon-Ready TM) PCR was carried out using DNA DNA (Ta Ka Ra LA Taq TM ; Takara Shuzo) with cDNA (Clontech) as type II.
  • DNA DNA Ta Ka Ra LA Taq TM ; Takara Shuzo
  • cDNA Clontech
  • a clone pMDTS 9-3H was obtained by subcloning about 2.11 ⁇ 08 fragment generated by the PCR into plasmid PCR2.1 (Invitrogen).
  • the obtained plasmid pMDTS9-3H was cleaved with restriction enzymes SphI and NotI, and a DNA fragment of about 2.1 kbp generated, and the plasmid pCEPdE2- Plasmid p CEP d E 2-MDT is obtained by ligating MDTS 9 Cys 2-F LAG with a DNA fragment of about 9.3 kbp generated by cutting with restriction enzymes SphI and NotI. S9FuII—FLAG was constructed.
  • This plasmid p CEP d E2 -MD TS 9 Fu II-FLAG is a new pro
  • Thease gene MDTS9 contains a gene consisting of nucleotides 1 to 3672 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and nucleotides 1 to 1224 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 added to the C-terminus of a sequence consisting of the following amino acids can be expressed using animal cells as a host.
  • the plasmid p CEP d E2—MDTS 9Cys 2—FLAG obtained above is the base of the first to 2250 incense in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the novel protease gene MDTS 9.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 is added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 at the C-terminal of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 at the C-terminus.
  • Peptides can be expressed mainly in animal cells.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is considered to be A DAMTS protease.
  • Example 3 Expression of MPTS 9 short-length protein (MDTS 9 Cv s 2) and MDTS 9 full-length protein (MDTS 9 FuII)
  • Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2-FLAG or plasmid pCEPdE2-MDTS9FuII-FLAG prepared in Example 2 (or as a control, The prepared plasmid p CEP d E2-FLAG was purified using a commercially available transfection reagent (FuGENE TM 6 Transcription Reagent; manufactured by Boehringer 100 Mannheim) in accordance with the attached instructions, and the serum medium [ HEK293 that had been cultured in DMEM (GI BCO—BRL), 10% fetal bovine serum, 100 gZmL penicillin, 100 gZmL streptomycin, and 250 g / mL—G418 (Nacalai Tesque) — Transfected into EBNA cells (Invitrogen).
  • DMEM GI BCO—BRL
  • 10% fetal bovine serum 100 gZmL penicillin, 100 gZmL streptomycin, and 250 g /
  • the cells After the introduction of the plasmid, the cells are cultured for 48 hours (hereinafter referred to as serum culture). Alternatively, after the introduction of the plasmid, the cells are cultured for 16 hours and washed twice with PBS, and then the serum-free medium [DMEM (GIB CO- BRL) ", 100 g / ml penicillin, 100 gZmL streptomycin, 250 gZmL—G418 (manufactured by Nacalai Tesque)] for 32 hours (hereinafter referred to as serum-free culture). .
  • serum-free medium DMEM (GIB CO- BRL) ", 100 g / ml penicillin, 100 gZmL streptomycin, 250 gZmL—G418 (manufactured by Nacalai Tesque)
  • a culture supernatant was obtained by centrifugation (3000 rpm, 10 minutes) of each culture solution obtained by the serum culture or serum-free culture using a centrifuge (Model 8800; manufactured by Kubota Seisakusho). .
  • each cell remaining after removing the culture solution was extracted with an extract [2 Ommo I LH EPES (pH 7.4), 1% triton 100, 1% glycerol, 0.1% ⁇ After treatment with serum albumin (BSA)] for 15 minutes, the cells are detached from the culture plate by pipetting, and the resulting cell suspension is centrifuged (type 8800; manufactured by Kubota Seisakusho).
  • BSA serum albumin
  • each of the obtained fractions ie, culture supernatant, cell membrane-bound fraction, and cell fraction
  • an antibody against the FLAG tag added to the C-terminus mouse anti-FLAG monoclonal antibody. M 2; manufactured by Sigma). That is, each of the above fractions was subjected to electrophoresis using SDSZ1 0% to 20% acrylamide gel (manufactured by Daiichi Kagaku) under reducing conditions using 2-ME, and then subjected to a blotting apparatus.
  • PVDF Polyvinylidene difluoride
  • a blocking agent (Blockace; manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added to the transcribed PVDF membrane, and the mouse anti-F
  • the LAG monoclonal antibody M2 was sequentially reacted with horseradish peroxidase-labeled ⁇ heron anti-mouse IgG polyclonal antibody (manufactured by Zymed or Tago).
  • Antibody M2 Sigma
  • horseradish peroxidase-labeled streptavidin (Amersham Pharmacia Biotech) were reacted sequentially.
  • the expression of the target protein was confirmed using a western blotting detection system (ECL Western Blotting Detection System; manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) Plasmid p CE Pd E 2—MDTS 9 Cys 2—FLAG was introduced Of proteins detected in each fraction obtained by serum-free culturing of isolated cells (ie, MDTS 9 short-length protein) in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) The apparent molecular mass is about 55 to 65 KDa in the culture supernatant, and about 55 to 65 KDa in the cell membrane-bound fraction. The fraction was 80-95 KDa.
  • ECL Western Blotting Detection System Plasmid p CE Pd E 2—MDTS 9 Cys 2—FLAG was introduced Of proteins detected in each fraction obtained by serum-free culturing of isolated cells (ie, MDTS 9 short-length protein) in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
  • SDS-PAGE SDS
  • the protein detected in each fraction obtained by serum-free culturing of cells transfected with plasmid pCEP d E2-M DTS9 Fu II-FLAG (that is, MDTS9 full-length protein) is mainly associated with cell membrane binding.
  • the apparent molecular mass in the SDS-PAGE was detected in both the fraction and the cell fraction, and was about 130 to 140 KDa.
  • a plasmid pZEr0—MDTS9Cys2EZQ containing the gene MDTS9Cys2EZQ in which (glutamic acid) was replaced with GIn (glutamine) was prepared.
  • the plasmid pZEr0-MDTS9Cys2 prepared in Example 2 was used as the type III, and the primer set was an oligonucleotide comprising a base sequence represented by SEQ ID NO: 13 and an oligonucleotide.
  • An oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 was used.
  • Plasmid pCEPdE2-MDTS9Cys2E / Q-FLAG was obtained by inserting into the XbaI and NotI sites of plasmid pCEPdE2-FLAG.
  • the PVDF membrane was blocked by adding a pro- and diking agent (Block Ace; manufactured by Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and then a goat anti- 2- macroglobulin antibody [CEDAR LAN E) Manufactured by Zymed Laboratories, Inc.) and a horseradish peroxidase-labeled rabbit heron anti-goat IgG polyclonal antibody (Zymed Laboratories). After reaction, commercially available Western blotting detection system
  • Plasmid p CEPd E2 MDTS 9 Cys 2—Fragment culture supernatant from serum transfected cells with FLAG contains plasmid p CEPd E2—M DTS 9Cys 2 EZQ—FLAG or plasmid p CEP d E2— F A band of about 250 KDa, which was not detected in the culture supernatant of each serum culture derived from cells transfected with LAG, was detected. This result indicates that the MDTS9 short protein (MDTS 9Cys2) formed a complex with 2— macroglobulin, and therefore, the protease activity of the MDTS9 short protein (MDTS9Cys2) was observed. It was confirmed that there was.
  • a combination of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 15 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 was used as a primer, and the cDNA panel was used as a ⁇ type, DN a polymerase (T a K a Ra LA T aq ⁇ M; manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was carried out PCR using. In the PCR described above, heat denaturation was first performed at 94 ° C (2 minutes), followed by 98 ° C (10 seconds). A cycle consisting of 8 ° C (1 minute 30 seconds) was repeated 44 times.
  • agarose gel electrophoresis of the reaction solution was performed to detect a DNA fragment of about 1.1 kbp derived from mRNA of MDTS9 gene. As a result, it was found that the mRNA of the MDTS 9 gene was expressed in the kidney.
  • a normal human kidney proximal tubule epithelial cell [CI onetics] was spread on a 6-well plate (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) to a size of 5 x 10 5 cells. For 1 day. After converting to serum-free renal epithelial cell medium and culturing for another day, serum-free kidney was added to a final concentration of 10 ng / mI with TG.F-) S1 (Sigma). The medium was replaced with an epithelial cell medium and cultured for 24 hours. The control group was replaced with a serum-free renal epithelial cell medium to which TGF-1 had not been added, and cultured for 24 hours.
  • RNA was prepared using a commercially available total RNA purification reagent (ISOGEN; manufactured by Nippon Gene). The obtained total RNA was reacted at 37 ° C. for 90 minutes using DNase (manufactured by Nippon Gene). 5 g of the total RNA treated with DNase was converted to cDNA using Superscript II First Strand System (for RT-PCR) (GIBCO-BRL).
  • the cycle reaction consisting of 5 seconds), 60 ° C (30 seconds) and 72 ° C (60 seconds) was repeated 40 times.
  • the cDNA was designated as ⁇
  • an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 19, and represented by SEQ ID NO: 20 PCR under the same conditions was performed using a combination with an oligonucleotide consisting of a base sequence as a primer set.
  • the TGF-; 91 unstimulated human kidney proximal tubular epithelial cells cDNA prepared in Example 6 (1) above were defined as type III
  • the primer set i.e., a combination of an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 and an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 or represented by SEQ ID NO: 19
  • PCR under the same conditions was carried out using a combination of an oligonucleotide having a base sequence and an oligonucleotide having a base sequence represented by SEQ ID NO: 20).
  • the expression amount of mRNA of MDTS 9 gene under each condition is expressed as a ratio to the expression amount of ⁇ -actin gene under each condition.
  • mRN ⁇ of the MDTS9 gene was induced about 8-fold in gene expression by TGF-81.
  • Example 7 Expression fluctuation of MDTS 9 gene in rat renal failure model
  • the cDNA was prepared from the kidney of a rat 56 nephrectomy model (Kenichiro Kimura, “Kidney and Dialysis”, 1991 Special Issue, 431-439). After completion of 5Z6 nephrectomy, 56 nephrectomized rats and 5 sham-operated rats were dissected at 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 8 weeks, and 10 weeks, and the kidneys were dissected. It was excised and immediately frozen and stored at 180 ° C.
  • the kidneys of each of these groups were crushed using a cell crusher (Cryopress CP-100; Microtech Nichion) under liquid nitrogen freezing, and then a total RNA purification reagent (ISOGEN; Nippon Gene) was used. Was used to prepare total RNA.
  • the extracted total RNA was reacted at 37 ° C. for 90 minutes using DNase (manufactured by Futaba Gene). 25 ⁇ g of the total RNAO treated with DNase was converted to cDNA using a Superscript II First Strand System (for RT-PCR) (GIBCO-BRL).
  • PCR For the PCR, an initial denaturation reaction was performed at 95 ° C (10 minutes) using a commercially available PCR reagent [Syber Green PCR Coreage Agent (SYBR Green PCR corereagent); manufactured by Applied Biosystems). Thereafter, a cycle reaction consisting of 94 ° C (15 seconds), 60 ° C (30 seconds) and 72 ° C (60 seconds) was repeated 45 times.
  • SYBR Green PCR Coreage Agent SYBR Green PCR corereagent
  • the above-mentioned cDNA was used as a type II, and the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 25 was used. And an oligonucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 26 were used as primer sets for PCR under the same conditions. Further, in order to obtain a standard curve used for calculating the mRNA expression level, PCR was carried out under the same conditions using the above-mentioned primer set with Rad genomic DNA (manufactured by Clontech) as type III.
  • G3PDH human glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
  • the expression level of rat MDTS 9 gene mRNA under each condition was It was shown as a percentage of the PDH gene expression level.
  • the rat MDTS 9 gene mRNA was expressed about 5 times as much as the sham-operated rat one week after surgery in the 56 nephrectomy model, and the amount of urinary protein was significantly increased.
  • the plasmid pGEX-6P-1 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) is used as an expression vector in accordance with Yodosha, p. Fusion protein of peptide consisting of amino acids 280-410 in the amino acid sequence with glutathione S-transferase (GST)
  • GST-MDTS 9A was produced in the inclusion body fraction using E. coli. Subsequently, the inclusion body fraction was subjected to preparative SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), and the desired GST-MDTS9A protein was extracted from the gel by the diffusion method (Masato Okada and Kazu Miyazaki) , "Revised Protein Experiment Note", Yodosha, p. 48-51).
  • the obtained GST-MDTS 9A protein was immunized to a heron (Japanese white species) 5 times at intervals of 10 to 14 days, and then an antiserum was prepared. From the second antiserum, the IgG fraction was first affinity-purified using a protein G Sepharose F column (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), followed by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • Example 8 After reacting the anti-human MDTS 9 antibody prepared in Example 8 (1) with a tissue section fixed in formalin and embedded in paraffin on a slide glass, a commercially available staining kit (Vectorstin ABC-AP kit, catalog number AK) was used. — 5000; manufactured by Vector) according to the attached instructions. At this time, a biotin-labeled anti-magpie antibody (Catalog No. BA-1 000; manufactured by Vector Inc.) as a secondary antibody Alkaline phosphatase substrate kit I (catalog number SK-5100; manufactured by Vector) was used. As a result, staining of epithelial cells, especially glomerular epithelial cells (podocytes), was observed in the kidneys of healthy individuals and diabetic nephropathy (early or late stage) patients.
  • a commercially available staining kit Vectorstin ABC-AP kit, catalog number AK
  • the polypeptide of the present invention is a novel protease that is induced by TGF-8 and is involved in the metabolism of the extracellular matrix and is expressed in the kidney, the polypeptide activity of the polypeptide of the present invention Inhibitors are likely to inhibit or inhibit only the part of the physiological action of TGF- ⁇ involved in the qualitative change and increase in the amount of extracellular matrix components.
  • Useful as a therapeutic that is, according to the polypeptide of the present invention, a simple screening system for a therapeutic agent for chronic renal failure can be provided.
  • the polynucleotide, the expression vector, the cell, and the antibody of the present invention are useful for producing the polypeptide of the present invention. Sequence listing free text
  • each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing is an artificially synthesized linker sequence.
  • Each base sequence represented by the sequences of SEQ ID NOS: 5 to 9 and 12 to 14 in the sequence listing is an artificially synthesized primer sequence.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 in the sequence listing is an amino acid sequence obtained by expression of a DNA containing a nucleotide sequence encoding a restriction enzyme Not I recognition nucleotide sequence and a FLAG tag amino acid sequence. is there.

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Description

明 細 書 新規プロテアーゼ 技術分野
本発明は、 新規なプロテアーゼに関する。 ' 背景技術
A D AM T S (A D i s i n t e g r i n a n d Me t a l l o p r o t e a s e w i t h T h r omb o s p o n d i n mo t i f ) は、 丁ィ スインテグリン様ドメイン、 金属プロテアーゼ様ドメイン、 及びトロンボスポン ジン I型繰り返し配列 （以下、 TS P— 1繰り返し配列と称する） を含む分子群 であり、 現在までに 9種のヒト ADAMTS分子が報告されている。
前記ヒト AD AMT S分子の中で、 ADAMTS 4 (ァグリカナーゼー 1 ) 及 び ADAMTS 1 1 (ァグリカナ一ゼ一 2) では、 細胞外基質ァグリカンを第 3 73番目のグルタミン酸残基と第 374番目のァラニン残基との間 （G I u373 一 A I a 374の間） で選択的に切断する活性が示され、 関節炎や変形性関節症に おける軟骨細胞外基質ァグリカンの分解の本体の酵素である可能性が示唆されて いた （To r t o r e l l a M. D. ら， S c i e n c e, 284, 1 664 - 1 666, 1 999 ；及び A b b a s z a d e I . ら， J. B i o l . C h em. , 274, 23443-23450, 1 999) 。 また、 ADAMTS 2
(プロコラーゲン I N—プロティナーゼ） は、 I型コラーゲンプロ体の N末部 の切断除去酵素として、 I型コラーゲンのプロ体から成熟型への転換に関与し、 コラーゲン線維の形成に重要な役割を果たしておリ、 その遺伝子の異常と VII C 型エーラース■ダンロス （E h l e r s—Da n l o s) 症候群との関連性が示 されている （Co I i g e A. ら， Am. J . H um. Ge n e t . , 65, 308-31 7, 1 999) 。
すなわち、 ADAMTS分子は、 ァグリカンやコラーゲン等の細胞外マトリク スの分解及び成熟といった代謝に関与することが示されている。 一方、 慢性腎不全は、 糸球体硬化及び腎間質線維化を特徴とする疾患であり、 細胞外マトリクス成分の質的変化及び 又は量的増加が主要な発病及び進行機序 とされている。 腎不全疾患モデルを用いた実験において、 トランスフォーミング 増殖因子 (TG F— ^) の特異的な作用抑制タンパク質であるデコリンの遺伝 子導入 （ I s a k a Y. ら， N a t u r e M e d . , 2, 4 1 8 -423, 1 9 96) ゃ抗 TG F— ) S投与 （Z i y a d e h F. N. ら， P r o c. N a t に A c a d. S c i . U. S. A. , 97， 80 1 5- 8020, 200
0 ; S h a r m a K. ら， D i a b e t e s , 45， 52 2-530, 1 99 6 ;及び B o r d e r W. A. ら， N a t u r e, 346, 37 1— 37 4,
1 9 90) が有効性を示したことより、 T G F— j8の生理機能を抑制又は阻害す ること力《慢性腎不全の治療に繋がると考えられている。
し力、し、 満足のいく慢性腎不全治療薬がない現状のもと、 期待されているにも 係わらず、 現在までに TG F— ^阻害剤は上市されていない。 発明の開示
T G F— ^は、 多種多様の生理機能を示す分化及び成長因子であるため、 T G F-βの生理機能全てを阻害することは、 長期投与が想定される慢性腎不全の治 療においては副作用の観点から危険である。 TG F— ySの生理作用のうち、 細胞 外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害する ことが望ましい。 .
本発明の課題は、 TG F— y8により誘導され、 細胞外マトリクスの代謝に関与 する、 慢性腎不全治療剤のスクリーニングツールとして有用な新規のプロテア一 ゼ、 及びそれをコードする新規のポリヌクレオチドを提供することにある。 本発明者は、 前記課題を解決するために銳意研究を行なった結果、 ヒト胎児腎 臓 c D N Aより、 配列番号 2で表される配列における第 1番〜第 1 2 24番のァ ミノ酸からなる配列からなり、 1 224個のアミノ酸残基からなる新規プロテア ーゼをコードするポリヌクレオチドを見出した。 更に、 本発明者は、 この新規プ 口テア一ゼの 7 50アミノ酸残基からなる N末端側部分断片も、 充分なプロテア ーゼ活性を有することを見出した。 また、 前記プロテアーゼは、 （1 ) A DAM 丁 sプロテアーゼに分類されることより、 細胞外マトリックスの代謝に関与する プロテア一ゼであると考えられること、 （2) 実際に、 ヒトの腎臓での発現が認 められること、 （3) 腎臓の初代培養細胞において、 TGF—；8により発現誘導 されること、 及び （4) 腎不全モデル動物において、 その遺伝子発現量が増加し ていることを見出した。 これらにより、 本発明のプロテアーゼは、 腎不全の原因 となるポリペプチドであり、 本発明のポリペプチドを用いて、 そのプロテアーゼ 活性を阻害する物質をスクリ一二ングすることにより、 TG F-βの生理作用の うち、 細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又 は阻害する慢性腎不全治療剤として有用な物質をスクリーニングすることができ ることを明ら力、にし、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
[1 ] (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750香の アミノ酸からなる配列、 （ 2 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 1 番〜第フ 50番のアミノ酸からなる配列において、 1 ~1 0個のアミノ酸が欠失、 置換、 及ぴノ又は挿入されたアミノ酸配列、 あるいは、 （3) 配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列における第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列におい て、 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列を 含 、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
[2] 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァミノ 酸からなる配列を含み、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；
[3] (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番の アミノ酸からなる配列において、 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び Z又 は挿入されたアミノ酸配列、 あるいは、 （2) 配列番号 2で表されるアミノ酸配 列における第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列において、 1〜1 0個 のアミノ酸が欠失、 置換、 及び Ζ又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリぺプチド；
[4] (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750香の アミノ酸からなる配列との相同性、 あるいは、 （2) 配列番号 2で表されるアミ ノ酸配列における第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列との相同性が、 90%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリべ プチド；
[5] (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番の アミノ酸からなる配列との相同性、 あるいは、 （2) 配列番号 2で表されるアミ ノ酸配列における第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列との相同性が、 90%以上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリ ぺプチド；
[6] (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750香の アミノ酸からなる、 あるいは、 （3) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列におけ る第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなるポリべプチド；
[7] [1] 〜 [6] 記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； [8] [7] 記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター；
[9] [8] 記載の発現ベクターでトランスフエクシヨンされた細胞；
[1 0] [1：] 〜 [6] 記載のポリペプチドに結合する抗体又はその断片； [1 1 ] [9] 記載の細胞を培養し、 [1 ] 〜 [6] 記載のポリペプチドを回収 することを含む、 [1 ] 〜 [6] 記載のポリペプチドの製造方法；
[1 2] (1 ) [1 ] 〜 [： 6] 記載のポリペプチドと、 （2) 2—マクログロ ブリンと、 （3) 試験化合物とを接触させる工程、 及び
前記ポリペプチドと 0 ^—マクログロブリンとが、 S D S及ぴ 又は還元剤では 解離しない複合体を形成するか否かを分析する工程
を含む、 試験化合物が前記ポリぺプチドのプロテア一ゼ活性を阻害するか否かを 検出する方法；
[1 3] [1 2] 記載の方法による検出工程、 及び
プロテア一ゼ活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、 [1 ] 〜 [6] 記載のポリペプチドのプロテア一ゼ活性を阻害する物質 をスクリーニングする方法；
[1 ] [1 3] 記載の方法により、 慢性腎不全治療用物質をスクリーニングす る方法；並びに
[1 5] [1 2] 記載の方法による検出工程、 及び 製剤化工程
を含む、 慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法
に関する。
本明細書において 「プロテアーゼ活性」 とは、 血清中に存在するプロテアーゼ 阻害タンパク質であるひ 2—マクログロブリンと、 ドデシル硫酸ナトリウム （S D S ) 及び Z又は還元剤では解離しない複合体を形成することのできる性質を意 味する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。
「1 1 本発明のポリべプチド
本発明のポリべプチドには、
( 1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第つ 5 0番のァミノ 酸からなる配列を含むポリべプチド；
( 2 ) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 1番〜第つ 5 0番のァミノ 酸からなる配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜1 0個のアミノ酸 が欠失、 置換、 及び Z又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 プロテア一 ゼ活性を示すポリペプチド （以下、 機能的等価改変体と称する） ；並びに
( 3 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0番のァミノ 酸からなる配列との相同性、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列にお ける第 1番〜第 1 2 2 4香のアミノ酸からなる配列との相同性が 9 0 %以上であ るアミノ酸配列を含み、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリペプチド （以下、 相同ポリべプチドと称する）
が含まれる。
本発明のポリべプチドである 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0香のアミノ酸からなる配列を含むポリペプチド」 は、 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第フ 5 0番のアミノ酸からなる配列を 含み、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリペプチドである限り、 特に限定され るものではなく、 例えば、 ( 1 a ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0香のアミ ノ酸からなるポリぺプチド；
( 1 b ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0番のアミ ノ酸からなる配列の N末端及び Z又は C末端に、 適当なマーカー配列等が付加さ れたアミノ酸配列を有し、 しかも、 プロテアーゼ活性を示す融合ポリペプチド；
( 1 c ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0番のアミ ノ酸からなる配列の C末端に、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 7 5 1番〜第 1 2 2 4番のァミノ酸からなる配列又はその C末端から 1 ~ 4 7 3個 のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸配列 [すなわち、 C末端が第 7 5 1番〜第 1 2 2 4番のアミノ酸のいずれかである；以下、 「配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列又はその C末端欠失配列」 と称する] を有するポリペプチド； 並びに
( 1 d ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列又はその C末端欠失配列において、 その N末端及び Z又は C末端に、 適当なマーカー配列等が更に付加されたァミノ 酸配列を有し、 しかも、 プロテアーゼ活性を示す融合ポリペプチド
などが含まれる。
本明細書において、 或るポリペプチド （以下、 試験ポリペプチドと称する） が 「プロテアーゼ活性を示す」 か否かを判定する方法 （以下、 「プロテアーゼ活性 の判定方法」 と称することがある） は、 「血清中に存在するプロテアーゼ阻害タ ンパク質である 2—マクログロブリンと、 S D S及びノ又は還元剤では解離し ない複合体を形成することのできる性質」 を示すか否かを判定することができる 限り、 特に限定されるものではないが、 例えば、 前記の試験ポリペプチドと、 血 清中に存在するプロテアーゼ阻害タンパク質である 2—マクログロブリンとを 接触させ、 S D S及び 又は還元剤 [例えば、 2—メルカプトエタノール （2— M E ) ] では解離しない複合体を形成するか否かを分析することにより、 確認す ることができ、 具体的には、 例えば、 実施例 4に記載の方法で確認することがで きる。
α 2—マクログロブリンは、 血清中に存在するプロテアーゼ阻害タン / \°ク質で あり、 多くのプロテアーゼと複合体を形成することが知られている。 この複合体 の形成はプロテアーゼ活性に依存しており、 また、 形成された複合体は、 プロテ ァ一ゼとひ 2—マクログロブリンとがアミド結合したものであるため、 SDS又 は還元剤 （例えば、 2— ME) では解離しないことが知られている （F e i nm a n R. D. ら， An n. N ew Yo r k Ac a d. S c i . , 737, 245— 266， 1 994 ;及び Ku n o K. ら， J. B i o に Ch e m. , 274, 1 8821 -1 8826, 1 999) 。
前記ポリペプチド （1 a) 、 すなわち、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列 における第 1番〜第 750香のアミノ酸からなるポリペプチド」 は、 プロテア一 ゼ活性を示す、 750個のアミノ酸残基からなる新規プロテアーゼである。 前記 ポリペプチド （1 a) は、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番 〜第 1 224番のアミノ酸からなるポリペプチド」 の部分ポリペプチドに相当す る。
本発明のポリペプチドにおける前記マーカー配列としては、 例えば、 ポリぺプ チドの発現の確認、 細胞内局在の確認、 あるいは、 精製等を容易に行なうための 配列を用いることができ、 例えば、 F LAGタグ、 へキサ一ヒスチジン 'タグ、 へマグルチニン 'タグ、 又は my cェピ I ^一プなどを挙げることができる。
本発明の機能的等価改変体は、 配列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 1番〜第フ 50番のアミノ酸からなる配列の 1又は複数の箇所において、 1〜 1 0個、 好ましくは 1〜7個、 より好ましくは 1〜5個 （例えば、 1〜数個） のァ ミノ酸が欠失、 置換、 及ぴ 又は挿入されたアミノ酸配列を含み、 しかも、 プロ テア一ゼ活性を示すポリペプチドである限り、 特に限定されるものではなく、 そ の起源もヒ卜に限定されない。
例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァ ミノ酸からなるポリペプチドのヒ卜における変異体が含まれるだけでなく、 ヒト 以外の生物 （例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 又はィヌ） 由来の機能的等 価改変体が含まれる。 更には、 それらの天然ポリペプチド （すなわち、 ヒト由来 の変異体、 あるいは、 ヒト以外の生物由来の機能的等価改変体） をコードするポ リヌクレオチドを元にして、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列にお ける第 1番〜第 750香のアミノ酸からなるポリべプチドをコ一ドするポリヌク レオチドを元にして、 遺伝子工学的に人為的に改変したポリヌクレオチドを用い て製造したポリペプチドなどが含まれる。 なお、 本明細書において 「変異体 J
(v a r i a t i o n) とは、 同一種内の同一ポリペプチドにみられる個体差、 あるいは、 数種間の相同ポリべプチドにみられる差異を意味する。
配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のアミノ酸か らなるポリペプチドのヒトにおける変異体、 あるいは、 ヒト以外の生物由来の機 能的等価改変体は、 当業者であれば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列におけ る第 1番〜第 750香のアミノ酸からなるポリべプチドをコ一ドするポリヌクレ 才チドの塩基配列 （例えば、 配列番号 1で表される塩基配列） の情報を基にして、 取得することができる。 なお、 遺伝子組換え技術については、 特に断りがない場 合、 公知の方法 （例えば、 S amb r o o k, J. ら， " Mo l e c u l a r C l o n i n g— A L a b o r a t o r y Ma n u a l , Co l d S p r i n H a r b o r L a b o r a t o r y, N Y, 1 989) に従って実 施することが可能である。
例えば、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァ ミノ酸からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列の情報を 基にして適当なプライマー又はプローブを設計し、 前記プライマー又はプローブ と、 目的とする生物 [例えば、 哺乳動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 ハム スター、 又はィヌ） ] 由来の言式料 （例えば、 総 RN A若しくは mRN A画分、 c DNAライブラリー、 又はファージライブラリー） とを用いてポリメラ一ゼ連鎖 反応 （P C R) 法 （S a ί k ί , R. Κ. ら， S c i e n c e, 239, 487 -491 , 1 988) 又はハイブリダイゼーション法を実施することにより、 ポ リペプチドコ一ドするポリヌクレオチドを取得し、 そのポリヌクレオチドを適当 な発現系を用いて発現させ、 発現したポリペプチドが、 例えば、 実施例 4に記載 の方法により、 プロテアーゼ.活性を示すことを確認することにより、 所望のポリ ぺプチドを取得することができる。
また、 前記の遺伝子工学的に人為的に改変したポリペプチドは、 常法、 例えば、 部位特異的突然変異誘発法 （s i t e— s p e c i f i c mu t a g e n e s i s ； Ma r k, D. F. ら， P r o c. N a t l . Ac a d. S c に USA, 81 , 5662-5666, 1 984) により、 ポリペプチドをコードするポリ ヌクレオチドを取得し、 そのポリヌクレオチドを適当な発現系を用いて発現させ、 発現したポリペプチドが、 例えば、 実施例 4に記載の方法により、 プロテアーゼ 活性を示すことを確認することにより、 所望のポリベプチドを取得することがで きる。
本発明の機能的等価改変体には、 例えば、
(2 a) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750香のアミ ノ酸からなる配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜1 0個のアミノ 酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列を有し、 しかも、 プロテア ーゼ活性を示すポリペプチド；
(2 b) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のアミ ノ酸からなる配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜10個のアミノ 酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入され、 更に、 その N末端及ぴ 又は C末端に適 当なマーカー配列等が付加されたアミノ酸配列を有し、 しかも、 プロテアーゼ活 性を示す融合ポリべプチド；
(2 c) 配列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァミ ノ酸からなる配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜 1 0個のアミノ 酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入され、 更に、 その C末端に、 配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列における第フ 51番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列又 はその C末端から 1〜473個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸 配列を有し、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリペプチド；並びに
(2 d) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のアミ ノ酸からなる配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜1 0個のアミノ 酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入され、 更に、 その C末端に、 配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列における第 751番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列又 はその C末端から 1〜473個のアミノ酸が欠失した配列が付加されたアミノ酸 配列であって、 その N末端及び 又は C末端に、 適当なマーカー配列等が更に付 加されたアミノ酸配列を有し、 しかも、 プロテアーゼ活性を示す融合ポリべプチ などが含まれる。
本発明の相同ポリべプチドは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のアミノ酸からなる配列との相同性、 あるいは、 配列番号 2で 表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列と の相同性が 90%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 プロテアーゼ活性を 示すポリペプチドである限り、 特に限定されるものではないが、 配列番号 2で表 されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750香のアミノ酸からなる配列に関し て、 あるいは、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 1 224 番のアミノ酸からなる配列に関して、 好ましくは 95%以上、 より好ましくは 9 8%以上、 更に好ましくは 99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を含む。 本 発明の相同ポリべプチドとしては、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における 第 1番〜第 750香のアミノ酸からなる配列との相同性、 あるいは、 配列番号 2 で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列 との相同性が 90%以上 （より好ましくは 95%以上、 更に好ましくは 98%以 上、 特に好ましくは 99%以上） であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 プロテ ァーゼ活性を示すポリべプチドがより好ましい。
なお、 本明細書における前記 「相同性」 とは、 B LAS T (B a s i c I o c a I a I i n g m e n t s e a r c h t o o I ; A l t s c n u l , S. F. ら， J. Mo に B i o l . , 2 1 5, 403-4 1 0, 1 990) により 得られた値を意味し、 アミノ酸配列の相同性は、 B LAS T検索アルゴリズムを 用いて決定することができる。 具体的には、 B LAS Tパッケージ （s g i 32 b i t版， バ一ジョン 2. 0. 1 2 ； N C B Iより入手） の b I 2 s e qプログ フム (T a t i a n a A. T a t u s o v a及び T h oma s L . M a d d e n, F EMS M i c r o b i o l . L e t t . , 1 74, 2 7 -250, 1 999) を用い、 デフォルトパラメーターに従って算出することができる。 ぺ ァワイズ■アラインメント 'パラメーターとして、 プログラム名 「b I a s t p J を使用し、 G a p揷入 Co s t値を 「0」 で、 G a p伸長 C o s t値を 「0」 で、 Q u e r y配列のフィルターとして Γ S E G J を、 M a t r ί xとし て 「B LOS UM62」 をそれぞれ使用する。 以上、 本発明のポリペプチドについて説明したが、 本発明のポリペプチドとし ては、 「配列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0番のァミ ノ酸からなるポリペプチド」 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 1 2 2 4番のアミノ酸からなるポリペプチド J 、 「配列番号 2で表され るァミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0番のァミノ酸からなる配列の 1又は複 数の箇所において、 全体として 1〜 1 0個 （好ましくは 1 ~ 7個、 より好ましく は 1〜5個） のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 及び 又は付加されたアミノ酸配 列からなり、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリペプチド J 、 あるいは、 「配 列番号 2で表されるァミノ酸配列における第 1番〜第 1 2 2 4番のアミノ酸から なる配列の 1又は複数の箇所において、 全体として 1〜 1 0個 （好ましくは 1〜 フ個、 より好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入、 及び 又は付 加されたアミノ酸配列からなり、 しかも、 プロテア一ゼ活性を示すポリべプチ ド J が好ましく、 「配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 7 5 0香のアミノ酸からなるポリペプチド」 、 あるいは、 「配列番号 2で表されるァ ミノ酸配列における第 1番〜第 1 2 2 4香のアミノ酸からなるポリペプチド」 が より好ましい。
「2 1 本発明のポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレ ォチドである限り、 特に限定されるものではなく、 例えば、 配列番号 1で表され る塩基配列における第 1番〜第 2 2 5 0香の塩基からなる配列を含むポリヌクレ ォチドを挙げることができ、 配列番号 1で表される塩基配列における第 1番〜第 2 2 5 0香の塩基からなるポリヌクレオチドが特に好ましい。 なお、 本明細書に おける用語 「ポリヌクレオチド」 には、 D N A及ぴ R N Aの両方が含まれる。 本発明のポリヌクレオチドの製造方法は、 特に限定されるものではないが、 例 えば、 （1 ) P C Rを用いた方法、 （2 ) 常法の遺伝子工学的手法 （すなわち、 c D N Aライブラリーで形質転換した形質転換株から、 所望の c D N Aを含む形 質転換株を選択する方法） を用いる方法、 又は （3 ) 化学合成法などを挙げるこ とができる。 以下、 各製造方法について、 順次、 説明する。
前記 （1 ) の P C Rを用いた方法では、 例えば、 以下の手順により、 本発明の ポリヌクレオチドを製造することができる。
すなわち、 本発明のポリペプチドを産生する能力を有するヒ卜細胞又は組織か ら mRN Aを抽出する。 次いで、 本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレ ォチドの塩基配列に基づいて、 本発明のポリべプチドに相当する mRN Aの全長 を挟むことのできる 2個 1組のプライマ一セット、 あるいは、 その一部の mRN A領域を挟むことのできる 2個 1組のプライマーセッ卜を作成する。 抽出した前 記 mRNAを錶型とする逆転写酵素一ポリメラーゼ連鎖反応 （RT— PCR) を 行なうことにより、 本発明のポリべプチドの全長 c DN A又はその一部を得るこ とができる。
より詳細には、 まず、 本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞又は組織 から、 本発明のポリペプチドをコードする m R N Aを含む総 R N Aを既知の方法 により抽出する。 抽出法としては、 例えば、 グァニジン 'チオシァネート，ホッ ト ' フエノール法、 グァニジン 'チオシァネー卜一グァニジン■塩酸法、 又はグ ァニジン■チオシァネート塩化セシウム法等を挙げることができるが、 グァニジ ン チオシァネート塩化セシウム法を用いることが好ましい。 本発明のポリぺプ チドの産生能力を有する細胞又は組織は、 例えば、 本発明のポリペプチドをコー ドするポリヌクレオチド又はその一部を用いたノーザンブロッテイング法、 ある いは、 本発明のポリべプチドに特異的な抗体を用いたウェスタンブロッテイング 法などによリ特定することができる。
続いて、 抽出した mRN Aを精製する。 mRN Aの精製は常法に従えばよく、 例えば、 mRN Aをオリゴ （d T) セルロースカラムに吸着後、 溶出させること により精製することができる。 所望により、 ショ糖密度勾配遠心法等により mR N Aを更に分画することもできる。 また、 mRN Aを抽出しなくても、 市販され ている抽出精製済みの m R N Aを用いることもできる。
次に、 精製された mRN Aを、 例えば、 ランダムプライマー、 オリゴ d Tブラ イマ一、 及びノ又はカスタム合成したプライマーの存在下で、 逆転写酵素反応を 行ない、 第 1鎖 c DN Aを合成する。 この合成は、 常法によって行なうことがで きる。 得られた第 1鎖 c DNAを用い、 目的ポリヌクレオチドの全長又は一部の 領域を挟んだ 2種類のプライマーを用いて PCRを実施し、 目的とする c DNA を増幅することができる。 得られた DN Aをァガロースゲル電気泳動等により分 画する。 所望により、 前記 DN Aを制限酵素等で切断し、 接続することによって 目的とする DN A断片を得ることもできる。
前記 （2) の常法の遺伝子工学的手法を用いる方法では、 例えば、 以下の手順 により、 本発明のポリヌクレオチドを製造することができる。
まず、 前記の PCRを用いた方法で調製した mRN Aを錶型として、 逆転写酵 素を用いて 1本鎖 c DN Aを合成した後、 この 1本鎖 c DN Aから 2本鎖 c DN Aを合成する。 その方法としては、 例えば、 S 1ヌクレアーゼ法 （E f S t r a t i a d i s, A. ら， Ce l I , 7， 279-288, 1 976) 、 L a n d 法 （La n d, H. ら， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 9, 2251 -2266, 1 981 ) 、 0. J o o n Yo o法 （Yo o， O. J. ら' P r o c . N a t l . Ac a d. S c に USA, 79, 1 049- 1 053, 1 9 83) 、 又は O k a y ama— B e r g法 （O k a y ama, H. 及び B e r , P. , Mo に Ce l に B i o l . , 2, 1 61 - 1 70, 1 982) などを 挙げることができる。
次に、 前記 2本鎖 c DN Aを含む組換えプラスミドを作製した後、 大腸菌 （例 えば、 DH 5 株、 H B 1 01株、 又は J M 1 09株） に導入して形質転換させ、 例えば、 テトラサイクリン、 アンピシリン、 又はカナマイシン等に対する薬剤耐 性を指標として、 組換体を選択する。 宿主細胞の形質転換は、 例えば、 宿主細胞 が大腸菌の場合には、 H a n a h a nの方法 （H a n a h a n, D. J. ， Mo に B i o に ， 1 66, 557-580, 1 983) 、 すなわち、 C a C I 2、 Mg C I 2 又は R b C I を共存させて調製したコンビテント細胞に、 前記組換 え DN A体を加える方法により実施することができる。 なお、 ベクターとしては、 プラスミド以外にもラムダ系などのファージべクターを用いることもできる。 このようにして得られる形質転換株から、 目的の c DN Aを有する形質転換株 を選択する方法としては、 例えば、 以下に示す （ i ) 合成オリゴヌクレオチドプ ローブを用いる形質転換株スクリーニング法、 （U) PCRにより作製したプロ ーブを用いる形質転換株スクリーニング法、 （iii) 本発明のポリペプチドに対 する抗体を用いる形質転換株スクリーニング法、 又は （iv) セレクティブ'ハイ ブリダイゼ一シヨン■ トランスレーション系を用いる形質転換株スクリーニング 法を採用することができる。
前記 （ ί ) の合成オリゴヌクレオチドプローブを用いる形質転換株スクリー二 ング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DN Αを有する形質転換株を 選択することができる。
すなわち、 本発明のポリぺプチドの全部又は一部に対応するオリゴヌクレオチ ドを合成し、 これをプローブ （32 又は33 で標識する） として、 形質転換株 の DN Aを変性固定したニトロセルロースフィルタ一又はポリアミドフィルタ一 とハイブリダィズさせ、 得られた陽性株を検索して、 これを選択する。 なお、 プ ローブ用のオリゴヌクレオチドを合成する場合には、 コドン使用頻度を用いて導 いたヌクレオチド配列とすることもできるし、 あるいは、 考えられるヌクレオチ ド配列を組合せた複数個のヌクレオチド配列とすることもできる。 後者の場合に は、 イノシンを含ませてその種類を減らすことができる。
前記 （ii) の PCRにより作製したプローブを用いる形質転換株スクリ一ニン グ法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DN Aを有する形質転換株を選 択することができる。
すなわち、 本発明のポリべプチドの一部に対応するセンスプライマ一及びアン チセンスプライマーの各オリゴヌクレオチドを合成し、 これらを組合せて P CR を行ない、 目的ポリぺプチドの全部又は一部をコードする DN A断片を増幅する。 ここで用いる錶型 DN Aとしては、 本発明のポリべプチドを産生する細胞の mR N Aより逆転写反応にて合成した c DNA、 又はゲノム DN Aを用いることがで きる。 このようにして調製した DN A断片を、 例えば、 32 P又は33 Pで標識し、 これをプローブとして用いてコロニーハイブリダィゼーシヨン又はプラークハイ ブリダイゼ一ションを行なうことにより、 目的の c DNAを有する形質転換株を 選択する。
前記 （Mi) の本発明のポリペプチドに対する抗体を用いる形質転換株スクリ 一二 グ法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c DN Aを有する形質転換 株を選択することができる。
すなわち、 予め、 c DN Aを発現ベクターに組込み、 形質転換株の培養上清、 細胞内、 又は細胞表面にポリペプチドを産生させ、 本発明のポリペプチドに対す る抗体及び前記抗体に対する 2次抗体を用いて、 所望のポリべプチド産生株を検 出し、 目的の c DN Aを有する形質転換株を選択する。
前記 （iv) のセレクティブ'ハイブリダィゼーシヨン ' トランスレーション系 を用いる形質転換株スクリーニング法では、 例えば、 以下の手順により、 目的の c D N Aを有する形質転換株を選択することができる。
すなわち、 形質転換株から得られる c D N Aを、 ニトロセルロースフィルター 等にプロットし、 本発明のポリペプチドの産生能力を有する細胞から別途調製し た m R N Aをハイブリダイズさせた後、 c D N Aに結合した m R N Aを解離させ、 回収する。 回収された mRN Aを適当なポリペプチド翻訳系、 例えば、 アフリカ ッメガエルの卵母細胞へ注入したり、 あるいは、 ゥサギ網状赤血球ライゼート又 は小麦胚芽等の無細胞系を用いて、 ポリペプチドに翻訳させる。 本発明のポリべ プチドに対する抗体を用いて検出して、 目的の c DNAを有する形質転換株を選 択する。
得られた目的の形質転換株より本発明のポリヌクレオチドを採取する方法は、 公知の方法 （例えば、 S amb r o o k, J. ら， " Mo l e c u l a r C I o n I n g— A La b o r a t o r y Ma n u a l , Co l d S p r i n g Ha r b o r L a b o r a t o r y, Y, 1 989) に従って実施す ることができる。 例えば、 細胞よりプラスミド DN Aに相当する画分を分離し、 得られたプラスミド DN Aから c DN A領域を切り出すことにより行なうことが できる。
前記 （3) の化学合成法を用いた方法では、 例えば、 化学合成法によって製造 した DN A断片を結合することによって、 本発明のポリヌクレオチドを製造する ことができる。 各 DNAは、 DNA合成機 [例えば、 O l i g o 1 00 OM DN A S y n t h e s i z e r (B e c kma n社製） 、 又は 394 DNA ZRNA S y n t h e s i z e r (A p p I i e d B i o s y s t ems社 製） など] を用いて合成することができる。
また、 本発明のポリヌクレオチドは、 本発明のポリペプチドの情報に基づいて、 例えば、 ホスフアイ卜■ トリエステル法 （H u n k a p ί I I e r , M. ら， N a t u r e, 1 0， 1 05- 1 1 1 , 1 984 ) 等の常法に従い、 核酸の化学合 成により製造することもできる。 なお、 所望アミノ酸に対するコドンは、 それ自 体公知であり、 その選択も任意でよく、 例えば、 利用する宿主のコドン使用頻度 を考慮して、 常法に従って決定することができる （C r a n t h am, R. ら， N u c l e i c A c i d s R e s. , 9 , r 43— r 74, 1 98 1 ) 。 更 に、 これら塩基配列のコ ドンの一部改変は、 常法に従い、 所望の改変をコードす る合成オリゴヌクレオチドからなるプライマーを利用した部位特異的突然変異誘 発)お (s i t e s p e c i f i c mu t a g e n e s i s) (Ma r k, D . F. ら， P r o c. N a t l . A c a d. S c に USA, 8 1 , 5662— 5 666, 1 984) 等により実施することができる。
これまで述べた種々の方法により得られる DN Aの配列決定は、 例えば、 マキ サム一ギルバートの化学修飾法 （Ma X am, A. M. 及び G i I b e r t， W. , "M e t h o d s i n E n z ymo I o g y" , 65， 499— 55 9, 1 980) やジデォキシヌクレオチド鎖終結法 （Me s s i n g, J. 及び V i e i r a, J. , G e n e, 1 9, 269— 276， 1 982) 等によリ行 なうことができる。
「3Ί 本発明の発現ベクター及び細胞- 単離された本発明のポリヌクレオチドを、 適当なベクター DMAに再び組込む ことにより、 真核生物又は原核生物の宿主細胞を卜ランスフエクシヨンすること ができる。 また、 これらのベクターに適当なプロモータ一及び形質発現にかかわ る配列を導入することにより、 それぞれの宿主細胞においてポリヌクレオチドを 発現させることが可能である。
本発明の発現ベクターは、 本発明のポリヌクレオチドを含む限り、 特に限定さ れるものではなく、 例えば、 用いる宿主細胞に応じて適宜選択した公知の発現べ クタ一に、 本発明のポリヌクレオチドを揷入することにより得られる発現べクタ 一を挙げることができる。
また、 本発明の細胞も、 本発明の前記発現ベクターでトランスフ: Lクシヨンさ れ、 本発明のポリヌクレオチドを含む限り、 特に限定されるものではなく、 例え ば、 本発明のポリヌクレオチドが、 宿主細胞の染色体に組み込まれた細胞である こともできるし、 あるいは、 本発明によるポリヌクレオチドを含む発現べクタ一 の形で含有する細胞であることもできる。 また、 本発明のポリペプチドを発現し ている細胞であることもできるし、 あるいは、 本発明のポリペプチドを発現して いない細胞であることもできる。 本発明の細胞は、 例えば、 本発明の発現べクタ —により、 所望の宿主細胞をトランスフエクシヨンすることにより得ることがで さる。
例えば、 真核生物の宿主細胞には、 脊椎動物、 昆虫、 及び酵母等の細胞が含ま れ、 脊椎動物細胞と ては、 例えば、 サルの細胞である COS細胞 （G I u zm a n, Y. ， C e I I , 23, 1 75- 1 82, 1 981 ) 、 チャイニーズ■ハ ムスター卵巣細胞 （CHO) のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株 （U r I a u b, G. 及び C h a s i n , L. A. , P r o c. N a t l . Ac a d. S c に U S A, 77, 421 6-4220, 1 980 ) 、 ヒト胎児腎臓由来 H E K 293 細胞、 及ぴ前記 H EK293細胞にェプスタイン■バーウィルスの EBNA— 1 遺伝子を導入した 293— E B N A細胞 （ I n v i t r o g e n社） 等を挙げる ことができる。
脊椎動物細胞の発現べクタ一としては、 通常発現しょうとする遺伝子の上流に 位置するプロモーター、 RN Aのスプライス部位、 ポリアデニル化部位、 及び転 写終結配列等を有するものを使用することができ、 更に必要により、 複製起点を 有していることができる。 前記発現ベクターの例としては、 例えば、 SV40の 初期プロモーターを有する P S V 2 d h f r (S u b r ama n i , S. ら，、 M o に Ce I に B i o l . , 1， 854-864, 1 981 ) 、 ヒ卜の延長因 子プロモーターを有する p E F— BOS (M i z u s h i ma, S. 及び N a g a t a , S. ， N u c l e i c Ac i d s Re s. , 1 8, 5322, 1 9 90) 、 又はサイトメガロウィルスプロモータ一を有する p CEP 4 ( I n v i t r o g e n社） 等を挙げることができる。
宿主細胞として 293— EBN A細胞を用いる場合には、 発現ベクターとして, ェプスタイン 'バーウィルスの複製起点を有し、 293— EBN A細胞で自己増 殖が可能な p CEP4 ( I n v i t r o g e n社） などを用いることができる。 また、 宿主細胞として COS細胞を用いる場合には、 発現べクタ一として、 S V40複製起点を有し、 COS細胞において自律増殖が可能であり、 更に、 転写 プロモータ一、 転写終結シグナル、 及び RN Aスプライス部位を備えたものを用 いることができ、 例えば、 pME 1 8 S (Ma r u y ama, K. 及び T a k e b e, Y. , Me d. I mm u n o I . ， 20, 27-32, 1 990) 、 p E F— BOS (M i z u s h i m a , S. 及び N a g a t a , S. , N u c l e i c A c i d s R e s. , 1 8, 5322, 1 990) 、 又は p C DM 8 (S e e d， B. , N a t u r e, 329, 840— 842， 1 987) 等を挙げる ことができる。
前記発現べクタ一は、 例えば、 D EA E—デキストラン法 （L u t hma n, H . 及び M a g n u s s o n, - ， N u c l e i c A c i d s R e s. ， 1 1 , 1 295- 1 308, 1 983 ) 、 リン酸カルシウム一 D N A共沈殿法
(G r a h am, F. L . 及び v a n d e r E d, A. J. , V i r o l o g y , 52, 456-457, 1 973 ) 、 市販のトランスフエクシヨン試薬
(例えば、 F u GEN E™6 T r a n s f e c t i o n R e a g e n t ； B o e r i n g e r Ma n n h e i m社製） を用いた方法、 あるいは、 電気パス ル穿孔法 （N e uma n n, E. ら， EMBO J . ， 1， 84 1 -845, 1 982) 等により、 COS細胞に取り込ませることができる。
更に、 宿主細胞として CHO細胞を用いる場合には、 本発明のポリペプチドを コードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターと共に、 G41 8耐性マーカ一 として機能する n e o遺伝子を発現することのできるベクタ一、 例えば、 p RS V n e o (S a mb r o o k, J. り， o l e c u l a r C l o n i n g — A L a b o r a t o r y M a n u a l " , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y, N Y, 1 989) 又は p SV2— n e o (S o u t h e r n, P. J. 及ぴ B e r g, P. , J . Mo に A p p I . G e n e t . , 1 , 327-34 1 , 1 982) 等をコ ' トランスフエク卜し、 G 41 8耐性のコロニーを選択することにより、 本発明のポリべプチドを安定に産生す るトランスフエクシヨンされた細胞を得ることができる。
本発明の細胞 (ま、 常法 （例えば、 日本生化学会編， 「新生化学実験講座 1 8 細胞培養技術」 ， 東京化学同人， 1 990) に従って培養することができ、 前記 培養により細胞外に本発明のポリべプチドが生産される。 前記培養に用いること のできる培地としては、 採用した宿主細胞に応じて慣用される各種の培地を適宜 選択することができる。 例えば、 COS細胞の場合には、 例えば、 RPM I— 1 640培地又はダルベッコ修正イーグル最小必須培地 （DMEM) 等の培地に、 必要に応じて牛胎仔血清 （FBS) 等の血清成分を添加した培地を使用すること ができる。 また、 293— EBN A細胞の場合には、 牛胎仔血清 （FBS) 等の 血清成分を添加したダルべッコ修正イーグル最小必須培地 （ D M E M) 等の培地 に G41 8を加えた培地を使用することができる。
本発明の細胞を培養することにより、 前記細胞の細胞外に生産される本発明の ポリべプチドは、 前記ポリべプチドの物理的性質や生化学的性質等を利用した各 種の公知の分離操作法 （例えば、 岡田雅人及び宮崎香編， 「改訂タンパク質実験 ノート上 '下」 ， 羊土社， 1 999) により、 分離精製することができる。 具体 的には、 本発明のポリペプチドを含む培養液を、 例えば、 通常のタンパク質沈殿 剤による処理、 限外濾過、 各種液体クロマトグラフィー [例えば、 分子ふるいク 口マトグラフィー （ゲル濾過） 、 吸着クロマトグラフィー、 イオン交換体クロマ トグラフィ一、 ァフィ二ティクロマトグラフィー、 又は高速液体クロマトグラフ ィー （HP LC) 等] 、 若しくは透析法、 又はこれらの組合せ等により、 本発明 のポリべプチドを精製することができる。
本発明のポリべプチドは、 マーカー配列とインフレームで融合して発現させる ことにより、 本発明のポリペプチドの発現の確認、 又は精製等が容易になる。 前 記マーカ一配列としては、 例えば、 Fし AGタグ、 へキサーヒスチジン 'タグ、 へマグルチニン 'タグ、 又は my cェピ卜一プなどを挙げることができる。 また、 マーカー配列と本発明のポリペプチドとの間に、 プロテア一ゼ （例えば、 ェン亍 口キナーゼ、 ファクター Xa、 又はトロンビンなど） が認識する特異的なアミノ 酸配列を挿入することにより、 マーカー配列部分をこれらのプロテア一ゼにより 切断除去することが可能である。
「41 太 明の検出方法及びスクリーニング方法
本発明のポリペプチドを用いると、 試験化合物が、 本発明のポリペプチドのプ 口テアーゼ活性を阻害するか否かを検出することができる。 また、 この本発明の 検出方法を用いると、 本発明のポリべプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質 をスクリ一ニングすることができる。 本発明のポリべプチドである MDT S 9
(M e t a l l o p r o t e a s e a n d D i s i n t e g r i n w i t h T h r omb o s p o n d i n t y p e— 1 r e p e a t s 9) は、 その配列より ADAM TSプロテアーゼであると考えられることから、 細胞外マ トリクスの代謝に関与するプロテアーゼであると考えられ、 後述の実施例 5及び 実施例 8に示すように、 腎臓で発現しているタンパク質であり、 しかも、 後述の 実施例 6に示すように、 TG F— ;8により誘導される ADAMT Sプロテアーゼ である。 従って、 本発明のポリペプチドのプロテア ゼ活性を阻害する物質は、 TG F-βの生理作用のうち、 細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に 係わる部分だけを抑制又は阻害する可能性が高く、 長期投与が想定される慢性腎 不全治療剤の有効成分として有用であり、 本発明のポリペプチドそれ自体を、 本 発明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質、 あるいは、 慢性腎不全 治療用物質のスクリーニングツールとして使用することができる。
本発明の検出方法又はスクリーニング方法にかけることのできる試験化合物と しては、 特に限定されるものではないが、 例えば、 ケミカルファイルに登録され ている種々の公知化合物 （ペプチドを含む） 、 コンビナトリアル■ケミストリ一 技術 （T e r r e t t , N. K. ら， T e t r a h e d r o n, 51 , 8 1 35 一 8 1 3フ， 1 995) 又は通常の合成技術によって得られた化合物群、 あるい は、 ファージ 'ディスプレイ法 （F e l i c i , F. ら， J. Mo に B i o に , 222, 30 1—3 1 0， 1 99 1 ) などを応用して作成されたランダ ム -ペプチド群を用いることができる。 前記公知化合物には、 例えば、 プロテア ーゼ阻害活性を有することが知られているが、 本発明のポリべプチドのプロテア
—ゼ活性に対して阻害するか否かが不明な化合物 （ペプチドを含む） が含まれる また、 微生物の培養上清、 植物若しくは海洋生物由来の天然成分、 又は動物組織 抽出物などもスクリーニングの試験化合物として用いることができる。 更には、 本発明のスクリーニング方法により選択された化合物 （ペプチドを含む） を、 化 学的又は生物学的に修飾した化合物 （ペプチドを含む） を用いることができる。 本発明の検出方法は、 ( 1 ) 本発明のポリペプチドと、 （2 ) α ^—マクログロブリンと、 （3 ) 試験 化合物とを接触させる工程、 及び
本発明のポリペプチドと α 2—マクログロブリンとが、 S D S及び Ζ又は還元剤
(例えば、 2— M E ) では解離しない複合体を形成するか否かを分析する工程 を含む。
本発明の検出方法においては、 試験ポリぺプチドとひ 2—マクログロブリンと を接触させる代わリに、 本発明のポリペプチドと α 2—マクログロプリンと試験 化合物とを接触させること以外は、 先述のプ口テア一ゼ活性の判定方法と同様に して実施することができる。 すなわち、 本発明の検出方法では、 本発明のポリぺ プチドと基質用ポリぺプチドと試験化合物とを接触させ、 前記試験化合物の存在 下において、 本発明のポリぺプチドと α 2—マクログロプリンとが S D S及び 又は還元剤 （例えば、 2— M E ) では解離しない複合体を形成するか否かを分析 することにより、 前記試験化合物が、 本発明のポリペプチドのプロテア一ゼ活性 を阻害するか否かを検出する。 試験化合物の存在下において、 本発明のポリぺプ チドとひ 2—マクログロブリンとが S D S及び 又は還元剤 （例えば、 2— M E ) では解離しない複合体を形成しないか、 あるいは、 前記形成の程度が減少す る場合には、 前記試験化合物が、 本発明のポリペプチドのプロテア一ゼ活性を阻 害すると判断することができる。
本発明のスクリーニング方法では、 本発明の検出方法により、 試験化合物が、 本発明のポリべプチドのプロテア一ゼ活性を阻害するか否かを検出し、 その結果 に基づいて、 本発明のポリペプチドのプロテア一ゼ活性を阻害する物質、 あるい は、 慢性腎不全治療用物質を選択する。 より具体的には、 例えば、 本発明のポリ ペプチドと 2—マクログロプリンと試験化合物とを接触させ、 前記試験化合物 の存在下における本発明のポリべプチドと 2—マクログロプリンとの複合体の 形成の有無又は程度を指標として、 本発明のポリべプチドのプロテアーゼ活性を 阻害する物質、 あるいは、 慢性腎不全治療用物質を選択することができる。 試験 化合物の存在下において、 本発明のポリペプチドと 2—マクログロブリンと力《 S D S及び 又は還元剤 （例えば、 2—M E ) では解離しない複合体を形成しな いか、 あるいは、 前記形成の程度が減少する場合には、 前記試験化合物が、 本発 明のポリペプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質、 あるいは、 慢性腎不全治 療用物質であると判定することができる。
「5 1 本発明の慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法
本発明には、 本発明のスクリーニング方法により選択される、 本発明のポリべ プチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質を有効成分とする慢性腎不全治療用医 薬組成物が包含される。
慢性腎不全治療用医薬組成物の品質規格の確認試験において、 本発明の検出方 法により、 本発明のポリべプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを検出す る工程、 及び製剤化工程を含む、 慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法も本発 明に含まれる。
また、 前記検出工程を含む本発明のスクリーニング方法で得られた物質を製剤 化することからなる、 慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法も本発明に含まれ る。
本発明のポリべプチドのプロテアーゼ活性を阻害する物質を有効成分とする製 剤は、 前記有効成分のタイプに応じて、 それらの製剤化に通常用いられる担体、 賦形剤、 及び 又はその他の添加剤を用いて調製することができる。
投与としては、 例えば、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 又 は経口用液剤などによる経口投与、 あるいは、 静注若しくは筋注などの注射剤、 坐剤、 経皮投与剤、 又は経粘膜投与剤などによる非経口投与を挙げることができ る。 特に胃で消化されるペプチドにあっては、 静注等の非経口投与又は消化を受 けない製剤化手段、 例えば、 W0 9 5 2 8 9 6 3号パンフレツ卜に記載の製剤 化手段が好ましい。
経口投与のための固体組成物においては、 1又はそれ以上の活性物質と、 少な くとも一つの不活性な希釈剤、 例えば、 乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 微結晶 セルロース、 ヒドロキシプロピルセルロース、 デンプン、 ポリビニルピロリ ドン、 又はメタケイ酸アルミン酸マグネシウムなどと混合することができる。 前記組成 物は、 常法に従って、 不活性な希釈剤以外の添加剤、 例えば、 滑沢剤、 崩壊剤、 安定化剤、 又は溶解若しくは溶解補助剤などを含有することができる。 錠剤又は · 丸剤は、 必要によリ糖衣又は胃溶性若しくは腸溶性物質などのフィルムで被覆す ることができる。
経口のための液体組成物は、 例えば、 乳濁剤、 溶液剤、 懸濁剤、 シロップ剤、 又はエリキシル剤を含むことができ、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例え ば、 精製水又はエタノールを含むことができる。 前記組成物は、 不活性な希釈剤 以外の添加剤、 例えば、 湿潤剤、 懸濁剤、 甘味剤、 芳香剤、 又は防腐剤を含有す ることができる。
非経口のための注射剤としては、 無菌の水性若しくは非水性の溶液剤、 懸濁剤、 又は乳濁剤を含むことができる。 水溶性の溶液剤又は懸濁剤には、 希釈剤として、 例えば、 注射用蒸留水又は生理用食塩水などを含むことができる。 非水溶性の溶 液剤又は懸濁剤の希釈剤としては、 例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレ ングリコール、 植物油 （例えば、 ォリーブ油） 、 アルコール類 （例えば、 ェタノ ール） 、 又はポリソルベート 80等を含むことができる。 前記組成物は、 更に湿 潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤、 溶解若しくは溶解補助剤、 又は防腐剤などを 含むことができる。 前記組成物は、 例えば、 バクテリア保留フィルターを通す濾 過、 殺菌剤の配合、 又は照射によって無菌化することができる。 また、 無菌の固 体組成物を製造し、 使用の際に、 無菌水又はその他の無菌用注射用媒体に溶解し、 使用することもできる。
投与量は、 前記スクリーニング法により選択された有効成分の活性の強さ、 症 状、 投与対象の年齢、 又は性別等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、 経口投与の場合、 その投与量は、 通常、 成人 （体重 60 k gとして） において、 1 日につき約 0. 01〜 1 00 Omg、 好ましくは 0. 01〜1 00 mgである。 また、 非経口投与の場合、 注射剤の形では、 1日につき 0. 01〜 1 00 Omg、 好ましくは 0. 01〜 1 00mgである。
「61 本発明の杭休又はその断片
本発明のポリペプチドに反応する抗体 （例えば、 ポリクローナル抗体又はモノ クロ一ナル抗体） は、 各種動物に、 本発明のポリペプチド、 又はその断片を直接 投与することで得ることができる。 また、 本発明のポリペプチドをコードするポ リヌクレオチドを導入したプラスミドを用いて、 DN Aワクチン法 （Ra z, E. ら， P r o c. N a t l . A c a d. S c に USA, 91 , 951 9-952 3 , 1 994 ;又は D o n n e I I y, J. J. ら， J. I n f e c t . D i s . , 1 73, 31 4— 320， 1 996) によっても得ることができる。
ポリクローナル抗体は、 例えば、 本発明のポリペプチド又はその断片を適当な アジュバント （例えば、 フロイン卜完全アジュバントなど） に乳濁した乳濁液を、 腹腔、 皮下、 又は静脈等に免疫して感作した動物 （例えば、 ゥサギ、 ラッ卜、 ャ ギ、 又はニヮトリ等） の血清又は卵から製造することができる。 このように製造 された血清又は卵から、 常法のポリべプチド単離精製法によりポリクローナル抗 体を分離精製することができる。 そのような分離精製方法としては、 例えば、 遠 心分離、 透析、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 又は DEAE—セルロース、 ハイ ドロキシァパタイト、 若しくはプロテイン Aァガロース等によるクロマ卜グラフ ィ一法を挙げることができる。
モノクローナル抗体は、 例えば、 ケーラーとミルスタインの細胞融合法 （Ko h I e r , G. 及び M i I s t e i n, C. , N a t u r e, 256, 495— 497, 1 975) により、 当業者が容易に製造することが可能である。
すなわち、 本発明のポリペプチド又はその断片を適当なアジュバント （例えば, フロイント完全アジュバントなど） に乳濁した乳濁液を、 数週間おきにマウスの 腹腔、 皮下、 又は静脈に数回繰り返し接種することにより免疫する。 最終免疫後、 脾臓細胞を取り出し、 ミエローマ細胞と融合してハイプリ ドーマを作製する。 ハイプリ ドーマを得るためのミエローマ細胞としては、 例えば、 ヒポキサンチ ンーグァニン一ホスホリボシルトランスフ iラーゼ欠損又はチミジンキナーゼ欠 損のようなマーカーを有するミエローマ細胞 （例えば、 マウスミエローマ細胞株 P 3X63Ag 8. U 1 ) を利用することができる。 また、 融合剤としては、 例 えば、 ポリエチレングリーコールを利用することができる。 更には、 ハイプリ ド 一マ作製における培地として、 例えば、 イーグル氏最小必須培地、 ダルベッコ氏 変法最小必須培地、 又は RPM I— 1 640などの通常よく用いられている培地 に、 1 0〜30%のウジ胎仔血清を適宜加えて用いることができる。 融合株は、 HAT選択法により選択することができる。 ハイプリ ドーマのスクリーニングは 培養上清を用い、 EL I S A法又は免疫組織染色法などの周知の方法により行な い、 目的の抗体を分泌しているハイプリ ドーマのクローンを選択することができ る。 また、 限界希釈法によってサブクローニングを繰り返すことにより、 ハイブ リ ドーマの単クローン性を保証することができる。 このようにして得られるハイ ブリ ド一マは、 培地中で 2〜4日間、 あるいは、 プリスタンで前処理した BA L BZc系マウスの腹腔内で 1 0〜20日間培養することで、 精製可能な量の抗体 を産生することができる。
このように製造されたモノクローナル抗体は、 培養上清又は腹水から常法のポ リベプチド単離精製法により分離精製することができる。 そのような分離精製方 法としては、 例えば、 遠心分離、 透析、 硫酸アンモニゥムによる塩析、 又は D E AE—セルロース、 ハイドロキシァパタイ卜、 若しくはプロテイン Aァガロース 等によるクロマ卜グラフィ一法を挙げることができる。
また、 モノクローナル抗体又はその一部分を含む抗体断片は、 前記モノクロ一 ナル抗体をコ一ドする遺伝子の全部又は一部を発現ベクターに組み込み、 適当な 宿主細胞 （例えば、 大腸菌、 酵母、 又は動物細胞） に導入して生産させることも できる。
以上のように分離精製された抗体 （ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗 体を含む） について、 常法により、 ポリペプチド分解酵素 （例えば、 ペプシン又 はパパイン等） によって消化を行ない、 引き続き、 常法のポリペプチド単離精製 法により分離精製することで、 活性のある抗体の一部分を含む抗体断片、 例えば、 F (a b' ) 2、 F a b、 F a b' 、 又は F vを得ることができる。
更には、 本発明のポリペプチドに反応する抗体を、 クラクソンらの方法又はゼ ベデらの方法 （C I a c k s o n， T. ら， N a t u r e, 352, 624— 6 28, 1 99 1 ;又は Z e b e d e e, S. ら， P r o c. N a t l . A c a d. S c に USA, 89, 3 1 75-3 1 79, 1 992 ) により、 一本鎖 （ s ί n g I e c h a i n) 'F v又は F a bとして得ることも可能である。 また、 マ ウスの抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に置き換えたトランスジ Xニックマウス （L o n b e r g, N. ら, N a t u r e, 368, 856-859, 1 994) に 免疫することで、 ヒト抗体を得ることも可能である。 実施例 以下、 実施例によって本発明を具体的に説明するが、 これらは本発明の範囲を 限定する'ものではない。 なお、 特に断らない限り、 公知の方法 （例えば、 S am b r ο ο , J . b， o I e c u I a r し l o n i n g— A L a b o r a t o r y Ma n u a l " , Co l d S p r i n H a r b o r La b o r a t o r y, NY, 1 989) に従って実施した。
実施例 1 ： C末 F LAG付加型発現ベクターの作製
プラスミド p CEP4 (インビトロジェン社製） を、 制限酵素 C I a I及び N s i Iで切断し、 平滑末端化した後、 自己連結反応を行なうことにより、 ェプス タイン■バーウィルス由来の EBN A 1発現ュニットを除去した発現ベクター p CEP4 dを作製した。 得られた発現ベクター p CEP4 dを、 制限酵素 N h e I及び BamH Iで切断した後、 ァガロースゲル抽出することにより得られた約 7. 7 k b pの DN A断片に、 配列番号 3で表される塩基配列からなるオリゴヌ クレオチドと配列番号 4で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとをァ ニールさせて得られた二重鎖ォリゴヌクレオチドを揷入することにより、 発現べ クタ一 p CE P 4 d— F L AGを作成した。 なお、 得られた発現ベクターが目的 の配列を有することは、 塩基配列により確認した。
得られた発現べクタ一 P CE P 4 d - F LAGを錶型とし、 配列番号 5で表さ れる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 6で表される塩基配列から なるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマ一として、 パイ口べスト （P y r o B e s t™) D N Aポリメラーゼ （宝酒造社製） を用いて PC Rを行なつ た。 前記 PC Rでは、 最初に 94°C (2分間） で熱変性を行なった後、 94°C (30秒間） と 55°C (30秒間） と 72°C (30秒間） とからなるサイクルを 5回繰り返し、 最後に 72¾ (7分間） の伸長反応を行なった。 前記 PCRに より生じた約 0. 4 k b pの DN A断片を制限酵素 S p e Iで切断した後、 この DNA断片を、 制限酵素 X b a Iで切断した p CEP 4 d— F LAG (約 7. 7 Kb p) に挿入することによリ、 発現ベクター p C E P d E 2— F L AGを作成 した。 得られた発現べクタ一 p CEP d E2— F LAGにおいては、 プロモータ 一から下流に向かって、 クローニングサイトである X b a I認識配列、 N h e I 認識配列、 N o t I認識配列、 及び B a m H I認識配列、 並びに F L A Gタグが この順に配列されている。
実施例 2 ：新規プロテアーゼ遺伝子 MDTS 9の全長 OR F遺伝子のクローニン 配列番号 7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド （5' 側に S p e I認識配列及び Ko z a k配列が付加してある） と配列番号 8で表される塩基配 列からなるオリゴヌクレオチド （5' 側に N o t I認識配列が付加してある） と の組み合わせをプライマーとし、 ヒ卜胎児腎臓 c DNA (Ma r a t h o n— R e a d y™ c D N A ； クロンテック社製） を錶型として、 DN Aポリメラーゼ (T a Ka Ra LA T a q τΜ；宝酒造社製） を用いて P C Rを行なった。 前 記 PC Rでは、 最初に 94°C (2分間） で熱変性を行なった後、 98°C (1 0秒 間） と 68°C (2分 30秒間） とからなるサイクルを 40回繰り返し、 最後に 6 8°C (7分間） の伸長反応を行なった。 前記 PCRにより生成した約 2. 2 k b pの DNA断片 （5' 側に S p e I認識配列及び Ko z a k配列が付加され、 3' 側に N o t I認識配列が付加されている） を、 プラスミド PCR2. 1 (ィ ンビトロジェン社製） にサブクローンすることにより、 クローン pMDTS9 C y s 1を得た。
得られたプラスミド pMDTS9Cy s 1を制限酵素 S p e I及び N o t Iで 切断して生成した約 2. 2 k b Pの DNA断片を、 前記実施例 1で構築した p C EP d E2— F LAGの Xb a I部位及び N o t I部位に揷入することにより、 プラスミド p CEP d E2—MDTS 9 Cy s 1 - F LAGを構築した。
配列番号 9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド （5' 側に S p e I認識配列及び Ko 2 a k配列が付加してある） と配列番号 1 0で表される塩基 配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーとし、 ヒト胎児腎 臓 c DNA (Ma r a t h o n-Re a d y™ c DNA ; クロンテック社製） を錶型として、 DNAポリメラ一ゼ （T aKa Ra LA T a qTM ; 宝酒造社 製） を用いて P CRを行なった。 前記 PC Rでは、 最初に 94°C (2分間） で熱 変性を行なった後、 98°C (1 0秒間） と 68°C (30秒間） とからなるサイク ルを 45回繰り返し、 最後に 68°C (7分間） の伸長反応を行なった。 前記 PC Rにより生成した約 0. 2 l< b PのDNA断片 （5' 側に S p e I認識配列及び Ko z a k配列が付加されている） を、 プラスミド P CR2. 1 (インビトロジ ェン社製） にサブクローンすることにより、 クローン pMDTS 9 (5 S 2- 1
2) を得た。
得られたプラスミド pMDT S 9 (5 S 2- 2) を制限酵素 S p e I及ぴ N c o Iで切断して生成した約 0. 2 k b pの S p e l— N c o l DNA断片 A と、 先に得られたプラスミド pMDTS 9 Cy s 1を制限酵素 N c o I及び N o t Iで切断して生成した約 2. 0 k b pの N c o I— N o t I DNA断片巳と を、 前記実施例 1で構築した p CEP d E2— F LAGの X b a I部位及び N o t I部位に挿入することにより、 プラスミド pCEP d E2— MDTS9Cy s 2— F LAGを構築した。 同様に、 前記 DN A断片 Aと前記 DNA断片 Bとを、 プラスミド p Z E r O— 2 (インビトロジェ,ン社製） の S p e I及び N o t I部 位に揷入することにより、 プラスミド p ZE r O— MDTS 9Cy s 2を構築し た。
配列番号 1 1で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列番号 1 2 で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプライマーと し、 ヒト胎児腎臓 c DNA (Ma r a t h o n-Re a d y™ c DNA ;クロ ンテック社製） を錶型として、 DN Aポリメラ一ゼ （Ta Ka Ra LA T a qTM ;宝酒造社製） を用いて PCRを行なった。 前記 PCRでは、 最初に 94°C
(2分間） で熱変性を行なった後、 98°C (1 0秒間） と 68°C (2分 30秒 間） とからなるサイクルを 40回繰り返し、 最後に 68°C (7分間） の伸長反応 を行なった。 前記 PC Rにより生成した約 2. 1 1< の0 八断片を、 プラス ミド PCR2. 1 (インビトロジェン社製） にサブクローンすることにより、 ク ローン pMDTS 9— 3 Hを得た。
得られたプラスミ ド pMDTS 9— 3 Hを制限酵素 S p h I及び N o t Iで切 断して生成した約 2. 1 k b pの DNA断片と、 先に得られたプラスミ ド p CE P d E2-MDTS 9 Cy s 2-F LAGを制限酵素 S p h I及ぴ N o t Iで切 断して生成した約 9. 3 k b pの DNA断片とを連結することにより、 プラスミ ド p C E P d E 2-MDT S 9 F u I I— F LAGを構築した。
このプラスミ ド p CEP d E2 -MD T S 9 F u I I一 F LAGは、 新規プロ テアーゼ遺伝子 M DTS 9の配列番号 1で表される塩基配列における第 1番〜第 3672香の塩基からなる遺伝子を含有し、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列 における第 1番〜第 1 224香のアミノ酸からなる配列の C末端に、 配列番号 2 1で表されるァミノ酸配列が付加したポリペプチドを、 動物細胞を宿主として、 発現することができる。
また、 先に得られたプラスミド p CEP d E2— MDTS 9Cy s 2— F LA Gは、 新規プロテアーゼ遺伝子 MDTS 9の配列番号 1で表される塩基配列にお ける第 1番〜第 2250香の塩基からなる遺伝子を含有し、 配列番号 2で表され るァミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァミノ酸からなる配列の C末端に、 配列番号 21で表されるアミノ酸配列が付加したポリべプチドを、 動物細胞を宿 主として、 発現することができる。 なお、 配列番号 2で表されるアミノ酸配列か らなるポリべプチドは、 A DAMTSプロテアーゼであると考えられる。
実施例 3 ： MP T S 9短長タンパク質 （MDTS 9 Cv s 2) 及び MDTS 9全 長タンパク質 (MDTS 9 F u I I ) の発現
前記実施例 2で作製したプラスミド p CEP d E2— MDTS 9Cy s 2— F L AG又はプラスミド p C E P d E 2— MD T S 9 F u I I -F LAG (あるい は、 対照として、 前記実施例 1で作製したプラスミ ド p CEP d E2— F LA G) を、 市販のトランスフエクション試薬 （F uGENETM6 T r a n s f e c t i o n Re a g e n t ；ベーリンガ一■マンハイム社製） を用いて、 添付 指示書に従い、 血清培地 [DMEM (G I BCO— BRL社） 、 1 0%牛胎児血 清、 1 00 gZmLペニシリン、 1 00 gZm Lストレプトマイシン、 及び 250 g/mL— G41 8 (ナカライテスク社製） ] で培養していた HEK2 93— EBNA細胞 （インビトロジェン社製） に導入した。
プラスミド導入後、 そのまま 48時間培養する （以下、 血清培養と称する） か、 あるいは、 前記プラスミド導入後、 そのまま 1 6時間培養し、 PBSで 2回洗浄 した後に、 無血清培地 [DMEM (G I B CO-B R L社)" 、 1 00 g/m L ペニシリン、 1 00 gZm Lストレプトマイシン、 250 gZm L— G 41 8 (ナカライテスク社製） ] にて 32時間培養した （以下、 無血清培養と称す る） 。 前記血清培養又は無血清培養で得られた各培養液を、 遠心分離器 （8800 型；久保田製作所社製） により遠心分離 （3000 r pm, 1 0分間） すること により、 培養上清を得た。 また、 前記培養液を除去した後に残った各細胞を、 抽 出液 [ 2 Omm o I L-H E P ES (p H 7. 4) 、 1 %トリ トンズー 1 00、 1 %グリセロール、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （BSA) ] にて 1 5分間処理 した後、 ピペッティングにより細胞を培養プレートより剥離し、 得られた細胞懸 濁液を遠心分離器 （8800型；久保田製作所社製） によリ遠心分離 （3000 r pm, 1 0分間） することにより、 細胞膜結合画分 （上清） と細胞画分 （沈 澱） とに分画した。
得られた各画分 （すなわち、 培養上清、 細胞膜結合画分、 及び細胞画分） にお ける目的タンパク質の発現は、 C末端に付加した F LAGタグに対する抗体 （マ ウス抗 F LAGモノクローナル抗体 M 2 ； シグマ社製） を用いたウェスタンプロ ッティングで確認した。 すなわち、 前記の各画分を、 2— MEを用いた還元条件 下、 S DSZ1 0%〜20%アクリルアミ ドゲル （第一化学薬品社製） を用いて 電気泳動した後、 ブロッテイング装置を用いてポリビニリデンジフルオリ ド （P VD F) 膜 (こ転写した。 転写後の PVD F膜に、 ブロッキング剤 （ブロックェ一 ス；大日本製薬社製） を添加してブロッキングした後、 前記マウス抗 F LAGモ ノクローナル抗体 M 2と、 西洋わさびパーォキシダーゼ標識ゥサギ抗マウス I g Gポリクロ一ナル抗体 （ザィメッド社製又はタゴ社製） とを、 順次反応させた。 あるいは、 前記ブロッキングに続いて、 ピオチン化 M 2抗体 （シグマ社製） と、 西洋わさびパーォキシダーゼ標識ストレブトアビジン (アマシャムフアルマシア バイオテク社製） とを、 順次反応させた。 反応後、 市販のウェスタンプロッティ ング検出システム （ECLウェスタンブロッテイング検出システム；アマシャム フアルマシアバイオテク社製） を用いて、 目的タンパク質の発現を確認した。 プラスミド p CE P d E 2— MDTS 9 C y s 2— F L A Gを導入した細胞を 無血清培養することにより得られた各画分において検出されたタンパク質 （すな わち、 MDTS 9短長タンパク質） の S DS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (S DS-P AG E) における見かけ上の分子質量は、 培養上清において約 55 〜65 KD aであり、 細胞膜結合画分において約 55〜65 KD aであり、 細胞 画分において 80〜 95 KD aであった。 一方、 プラスミド pCEP d E2— M DTS9 Fu I I—F LAGを導入した細胞を無血清培養することにより得られ た各画分において検出されたタンパク質 （すなわち、 MDTS 9全長タンパク 質） は、 主として細胞膜結合画分及び細胞画分に検出され、 その SDS— PAG Eにおける見かけ上の分子質量は、 いずれも約 1 30〜1 40KDaであった。 実施例 4 ： MDTS 9短長タンパク質のプロテアーゼ活性の確認
( 1 ) プラスミ ド p CEP d E2— MDTS 9Cy s 2 EZQ— F LAGの構築 クイックチェンジ■サイトダイレクテド■ ミュータジエネシス 'キッ ト （Q u
1 c kCh a n g e™ S i t e— D i r e c t e d u t a g e n e s i s K ί t ； ストラタジーン社製） を用い、 添付の指示書に従って、 活性中心と考 えられる H i s— G l u— S e r— G l y_H i s (配列番号 22 ) の G I u
(グルタミン酸） を G I n (グルタミン） に置換した遺伝子 MDTS 9 C y s 2 EZQを含有するプラスミド p Z E r 0— MDTS 9 C y s 2 EZQを作製した。 なお、 錶型としては、 前記実施例 2で作製したプラスミド p Z E r 0— MDTS 9 Cy s 2を用い、 プライマーセットとしては、 配列番号 1 3で表される塩基配 列からなるオリゴヌクレオチド及ぴ配列番号 14で表される塩基配列がらなるォ リゴヌクレオチドを用いた。
得られたプラスミ ド p ZE r O— MDTS 9 Cy s 2 EZQを制限酵素 S p e I及び No t Iで切断して生成した約 2. 3 k b pの DN A断片を、 前記実施例 1で構築したプラスミド p CEP d E2— F LAGの X b a I及び N o t I部位 に揷入することにより、 プラスミ ド p C E P d E 2-MDT S 9 C y s 2 E/Q - F LAGを得た。
(2) 2—マクログロブリンとの複合体形成を指標としたプロテアーゼ活性の 前記実施例 2で作製したプラスミド p CEPd E2— MDTS9Cy s 2— F LAG, 又は前記実施例 4 (1 ) で作製したプラスミ ド pCEP d E2—MDT S 9 Cy s 2 E/Q-F LAG (あるいは、 対照として、 前記実施例 1で作製し たプラスミド p CEP d E2— F LAG) でトランスフエクシヨンした各細胞の 血清培養の培養上清を、 前記実施例 3で示した手順と同様にして、 2—MEを用 いた還元条件下、 SDS— PAGEし、 P VD F膜に転写した。 転写後の P VD F膜に、 プロ、ジキング剤 （ブロックエース；大日本製薬社製） を添加してブロッ キングした後、 ャギ抗 2—マクログロブリン抗体 [セダ一レーン （CEDAR LAN E) 社製] と、 西洋わさびパーォキシダーゼ標識ゥサギ抗ャギ I gGポリ ク口一ナル抗体 [ザィメッド （Z yme d L a b o r a t o r i e s) 社製] とを、 順次反応させた。 反応後、 市販のウェスタンブロッテイング検出システム
(EC Lゥエスタンブロッティング検出システム；アマシャムフアルマシアバイ ォテク社製） を用いて、 目的タンパク質の発現を確認した。
プラスミド pCEPd E2— MDTS 9 Cy s 2— F LAGでトランスフエク シヨンした細胞由来の血清培養の培養上清では、 プラスミド p CEPd E2— M DTS 9Cy s 2 EZQ— F LAG又はプラスミド p CEP d E2— F LAGで トランスフエクションした細胞由来の各血清培養の培養上清で検出されない約 2 50 KD aのバンドが検出された。 この結果は、 MDTS9短長タンパク質 （M DTS 9Cy s 2) が 2—マクログロブリンと複合体を形成したことを示して おり、 従って、 MDTS 9短長タンパク質 （MDTS 9Cy s 2) にプロテア一 ゼ活性があることが確認された。
実施例 5 ： MDTS 9遺伝子の組織発現分布の確認
市販の c D N Aパネル [C I o n t e c h社製の M u 1 t i p I e T i s s u e c D N A (MT C™) P a n e lの内、 H uma n MTC P a n e l I (カタ口グ番号： K 1 420-1 ) , H uma n MTC P a n e l II
(カタ口グ番号： K1421— 1 ) 、 H uma n F e t a l TC P a n e l (カタログ番号： K 1 425— 1 ) 、 及び H uma n T umo r MTC P a n e l (カタログ番号： K 1 422— 1 ) ] を用いて、 MDTS 9遺伝子 の組織発現分布を以下の手順で解析した。
すなわち、 配列番号 1 5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配 列番号 1 6で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせをプ ライマーとし、 前記 c DN Aパネルを錶型として、 DN Aポリメラーゼ （T a K a Ra LA T a q τ M ； 宝酒造社製） を用いて P C Rを行なった。 前記 P C R では、 最初に 94°C (2分間） で熱変性を行なった後、 98°C (10秒間） と 6 8°C (1分 30秒間） とからなるサイクルを 44回繰り返した。 続いて、 反応液 のァガロースゲル電気泳動を行ない、 MDTS 9遺伝子の mRN Aに由来する約 1. 1 k b pの DN A断片を検出した。 その結果、 MDTS 9遺伝子の mRN A ば、 腎臓に発現していることが判明した。
実施例 6 : TGF— による MDTS9遺伝子の発現誘導
(1 ) 錶型 c DN Aの調製
6穴プレート （旭テクノグラス社製） に正常ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞 [ク ロネテクス （C I o n e t i c s) 社製] を 5 x 1 05個となるように撒き、 腎 上皮細胞培地キット （クロネテクス社製） で 1日間培養した。 無血清の腎上皮細 胞培地に変換し、 更に 1日間培養した後、 TG.F— ) S 1 (シグマ社製） を終濃度 1 0 n g/m I となるように添加した無血清の腎上皮細胞培地に交換し、 24時 間培養した。 なお、 対照群は、 TGF— 1を添加していない無血清の腎上皮細 胞培地に交換し、 24時間培養した。
各処理群から、 それぞれ、 市販の総 RN A精製試薬 （ I SOGEN ； 日本ジー ン社製） を用いて総 RN Aを調製した。 得られた総 RN Aを DNァーゼ （日本ジ —ン社製） を用いて、 37°Cで 90分間反応させた。 DNァーゼ処理した総 RN AO. 5 gをスーパースクリプト■ ファーストストランドシステム （RT— P CR用） （G I BCO— BR L社製） を用いて c D N Aに変換した。
(2) 定量 P CRによる MDTS 9遺伝子の mRN Aの定量
正常ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞での発現変動解析は、 前記実施例 6 (1 ) で 調製した c DN Aを錶型として、 シークェンスディテクター （P r i sm770 0 S e q u e n c e D e t e c t o r ；アプライドバイオシステムズ社製） を用いて行なった。 なお、 プライマーセットとしては、 配列番号 1 7で表される 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、 配列番号 1 8で表される塩基配列から なるオリゴヌクレオチドとの組み合わせを使用した。 また、 PCRは、 市販の P し R試 G r e e n PCR c o r e r e a g e n t ；ァプラ イド 'バイオシステムズ社製） を用い、 95°C (1 0分間） の初期変性反応を実 施した後、 94°C (1 5秒間） と 60°C (30秒間） と 72°C (60秒間） とか らなるサイクル反応を 40回繰り返すことにより実施した。 なお、 内部標準としてヒト^アクチンの遺伝子発現量を算出するために、 前記 c DNAを錶型とし、 配列番号 1 9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオ チドと、 配列番号 20で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み 合わせをプライマーセットとし、 同条件の P CRを行なった。 また、 mRN A発 現量算出の標準曲線を得るために、 前記実施例 6 (1 ) で調製した TG F— ; 91 無刺激のヒト腎臓近位尿細管上皮細胞 c DN Aを錶型とし、 前記プライマーセッ ト （すなわち、 配列番号 1 7で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと 配列番号 1 8で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ、 あるいは、 配列番号 1 9で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと配列 番号 20で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとの組み合わせ） を用 いて同条件の PC Rを行なった。 一定量の総 RN A当たりの MDTS 9遺伝子の mRN Aの発現量を得るため、 各条件での MDTS 9遺伝子の m R N Aの発現量 は、 各条件での; δァクチン遺伝子発現量に対する割合で示した。 その結果、 MD TS 9遺伝子の mRN Αは、 TG F— ;8 1により、 約 8倍に遺伝子発現誘導され ることが判明した。
実施例 7 ： ラッ卜腎不全モデルにおける MDTS 9遺伝子の発現変動
(1 ) 錶型 c DNAの調製
c DNAの調製は、 ラット 5 6腎摘モデル （木村健ニ郎， 「腎と透析」 1 9 91臨時増刊号， 431— 439) の腎臓より調製した。 5Z6腎摘終了後、 1 週、 2週、 3週、 4週、 6週、 8週、 及び 1 0週に、 5 6腎摘ラット及び偽手 術ラットを各々 5匹ずつ解剖し、 腎臓を摘出し、 その後直ちに一 80°Cにて凍結 保存した。 これら各群の腎臓を液体窒素凍結下、 細胞破砕機 （クライオプレス C P— 1 00 ；マイクロテック 'ニチオン社製） を用いて破砕後、 総 RNA精製試 薬 （ I SOGEN ； 日本ジーン社製） を用いて総 RN Aを調製した。 抽出した総 RNAを DNァ一ゼ （二ツボンジーン社製） を用い、 37°Cで 90分間反応させ た。 DNァーゼ処理した総RNAO. 25〃 gをスーパ一スクリプト IIファース トストランドシステム （RT— PCR用） （G I B CO— B R L社製） にて c D N Aに変換した。
(2) 定量 PC Rによるラッ卜 MDTS 9カウンターパー卜の mRN Aの定量 ラット腎不全モデルにおける腎臓での発現変動解析は、 実施例 7 (1 ) で調製 した c DN Aを錶型にして、 シークェンスディテクター （P r i sm770 O S e q u e n c e D e t e c t o r ；アプライドバイオシステムズ社製） を用 いて行なった。 配列番号 23で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、 配列番号 24で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、 プライマー セットとして用いた。 PCRは、 市販の PC R試薬 [サイバーグリーン PC Rコ アリエージ工ント （SYBR G r e e n PCR c o r e r e a g e n t ) ；アプライドバイオシステムズ社製） ] を用い、 95°C (1 0分間） の初期 変性反応を実施した後、 94°C (1 5秒間） と 60°C (30秒間） と 72°C (6 0秒間） とからなるサイクル反応を 45回繰り返すことにより実施した。
また、 内部標準としてヒトグリセルアルデヒド 3—リン酸脱水素酵素 （G3 P DH) の遺伝子発現量を算出するため、 前記 c DN Aを錶型として、 配列番号 2 5で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、 配列番号 26で表される 塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとを、 プライマーセッ卜として同条件の P CRを行なった。 更に、 mRN A発現量算出に用いる標準曲線を得るために、 ラ ッドゲノム DNA (クロンテック社製） を錶型として、 前記プライマーセットを 用いて同条件の PC Rを行なった。 各群における一定量の総 RN A当たりのラッ ト MDTS 9遺伝子の mRN Aの発現量を比較するため、 各条件でのラッ MD T S 9遺伝子の m R N Aの発現量は、 各条件での G 3 P D H遺伝子発現量に対す る割合で示した。 その結果、 ラット MDTS 9遺伝子の mRN Aは、 5 6腎摘 モデルにおいて、 偽手術ラットに比べ、 術後 1週で約 5倍の遺伝子が発現してお リ、 尿タンパク質量が顕著に増加する術後 3週、 正常腎重量と比べ著明に腎重量 が増加し始める術後 6週、 更に病態が悪化する術後 8週で、 それぞれ、 約 2倍の 遺伝子が発現していることが判明した。
本実施例によリ、 腎不全モデルでは、 M D T S 9の遺伝子が発現誘導されるこ とが明らかとなった。
荬施例 8 ： ヒト腎臓組織切片の免疫組織染色
(1 ) 抗ヒト MDTS 9抗体の作製
まず、 実験解説書 （岡田雅人及び宮崎香編， 「改訂タンパク質実験ノート」 上， 羊土社， p. 1 62— 1 79) ] に準じて、 プラスミド p G EX— 6 P— 1 (ァ マシャムフアルマシアバイオテク社製） を発現ベクターとして用い、 配列番号' 2 で表されるアミノ酸配列における第 280番〜第 41 0香のアミノ酸からなるぺ プチドと、 グルタチオン S—卜ランスフェラーゼ （GST) との融合タンパク質
(GST-MDTS 9 A) を、 大腸菌を用いて封入体画分に生産した。 続いて、 封入体画分について、 調製用 SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳動 （PAG E) を実施し、 ゲルから拡散法によって目的の GS T— MDTS 9 Aタンパク質 を抽出した （岡田雅人及び宮崎香編， 「改訂タンパク質実験ノート」 下， 羊土社, p. 48— 51 ) 。
得られた GST— MDTS 9Aタンパク質を、 ゥサギ （日本白色種） に 1 0〜 1 4日間隔で計 5回免疫した後、 抗血清を調製した。二の抗血清より、 まず I g G画分をプロテイン Gセファロ一ス F「カラム (アマシャムフアルマシアバイオ テク社製） でァフィ二ティー精製し、 続いて、 配列番号 2で表されるアミノ酸配 列における第 280番〜第 41 0番のアミノ酸からなるぺプチドと、 マンノース 結合タンパク質 （MBP) との融合タンパク質 （MBP— MDTS9A) を固定 したカラム （MB P— MDTS 9 Aカラム） でァフィ二亍ィ一精製を行ない、 抗 ヒト MDTS 9抗体とした。 プロテイン Gセファロ一ス F Fカラムでのァフィ二 ティー精製、 並びに CNB r活性化セファロ一ス F Fカラム （アマシャムフアル マシアバイオテク社製） への MB P— MDTS 9 Aの固定及び MBP— MDTS 9 Aカラムでのァフィ二ティー精製は、 添付説明書に従った。 また、 MBP— M DTS 9 Aの大腸菌での生産及び精製は、 pMAL— c 2 E (ニュー 'イングラ ンド 'バイオラボ社製） を発現ベクターとして用い、 同社の 「pMA L蛋白融合 及び精製システム」 の指示書に従った。
(2) ヒト腎臓での MDTS 9タンパク質の検出
スライドガラス上にホルマリン固定及びパラフィン包埋した組織切片に、 実施 例 8 (1 ) で調製した抗ヒト MDTS 9抗体を反応させた後、 市販の染色キット (ベクタスティン ABC— APキット， カタログ番号 A K— 5000 ；ベクター 社製） を用いて、 添付説明書に従い、 染色した。 その際、 二次抗体としてビォチ ン標識抗ゥサギ抗体 （カタログ番号 BA— 1 000 ； ベクタ一社製） 、 発色基質 としてアルカリフォスファターゼ基質キット I (カタログ番号 SK— 51 00 ； ベクター社製） を用いた。 その結果、 健常人及び糖尿病性腎症 （初期又は後期） 患者の腎臓において、 上皮細胞、 中でも特に糸球体上皮細胞 （p o d o c y t e s) での染色が認められた。
本実施例から、 MDTS 9タンパク質がヒト腎臓で発現していることが明らか である。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチドは、 TG F— ;8により誘導され、 細胞外マトリクスの代 謝に関与する、 腎臓に発現している新規プロテアーゼであるので、 本発明のポリ ぺプチドのプロテア一ゼ活性を阻害する物質は、 TG F— ^の生理作用のうち、 細胞外マトリクス成分の質的変化及び量的増加に係わる部分だけを抑制又は阻害 する可能性が高く、 長期投与が想定される慢性腎不全治療剤として有用である。 すなわち、 本発明のポリペプチドによれば、 慢性腎不全治療剤の簡便なスクリー ニング系を提供することができる。 また、 本発明のポリヌクレオチド、 発現べク ター、 細胞、 及び抗体は、 本発明のポリペプチドを製造するのに有用である。 配列表フリーテキスト
以下の配列表の数字見出しく 223〉には、 「A r t i f i c i a l S e q u e n c e」 の説明を記載する。 具体的には、 配列表の配列番号 3及び 4の配列 で表される各塩基配列は、 人工的に合成したリンカ一配列である。 また、 配列表 の配列番号 5〜 9及び 1 2~1 4の配列で表される各塩基配列は、 人工的に合成 したプライマ一配列である。 更に、 配列表の配列番号 21の配列で表されるアミ ノ酸配列は、 制限酵素 N o t I認識ヌクレオチド配列及び F LAGタグアミノ酸 配列をコードするヌクレオチド配列を含む D N Aの発現により得られるアミノ酸 配列である。 以上、 本発明を特定の態様に沿って説明したが、 当業者に自明の変形や改良は 本発明の範囲に含まれる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァ ミノ酸からなる配列、 （2) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番 〜第 750番のアミノ酸からなる配列において、 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、 置換、 及ぴ 又は挿入されたアミノ酸配列、 あるいは、 （3) 配列番号 2で表さ れるアミノ酸配列における第 1番〜第 1 224香のアミノ酸からなる配列におい て、 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び 又は挿入されたアミノ酸配列を 含み、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリペプチド。
2. 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のアミノ酸 からなる配列を含み、 しかも、 プロテア一ゼ活性を示すポリペプチド。
3. (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァ ミノ酸からなる配列において、 1〜1 0個のアミノ酸が欠失、 置換、 及び/又は 挿入されたアミノ酸配列、 あるいは、 （2) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列 における第 1番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列 おいて、 1〜 1 0個の アミノ酸が欠失、 置換、 及び/又は挿入されたアミノ酸配列からなり、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリべプチド。
4. (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァ ミノ酸からなる配列との相同性、 あるいは、 （2) 配列番号 2で表されるァミノ 酸配列における第 1 '番〜第 1 224番のアミノ酸からなる配列との相同性が、 9 0%以上であるアミノ酸配列を含み、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリぺプ チド。
5. (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァ ミノ酸からなる配列との相同性、 あるいは、 （2) 配列番号 2で表されるァミノ 酸配列における第 1番〜第 1 224香のアミノ酸からなる配列との相同性が、 9 0%以上であるアミノ酸配列からなり、 しかも、 プロテアーゼ活性を示すポリべ プチド。
6. (1 ) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における第 1番〜第 750番のァ ミノ酸からなる、 あるいは、 （3) 配列番号 2で表されるアミノ酸配列における 第 1番〜第 1 2 2 4番のアミノ酸からなるポリべプチド。
7 . 請求項 1〜 6のいずれか一項に記載のポリべプチドをコ一ドするポリヌクレ ォチド。
8 . 請求項 7に記載のポリヌクレオチドを含む発現べクタ一。
9 . 請求項 8に記載の発現べクターでトランスフエクションされた細胞。
1 0 . 請求項 1 ~ 6のいずれか一項に記載のポリべプチドに結合する抗体又はそ の断片。
1 1 . 請求項 9に記載の細胞を培養し、 請求項 1〜 6のいずれか一項に記載のポ リペプチドを回収することを含む、 請求項 1〜6のいずれか一項に記載のポリぺ プチドの製造方法。
1 2 . ( 1 ) 請求項 1〜6のいずれか一項に記載のポリペプチドと、 （2 ) α 2 一マクログロブリンと、 （3 ) 試験化合物とを接触させる工程、 及び
前記ポリペプチドと 2—マクログロブリンとが、 S D S及び 又は還元剤では 解離しない複合体を形成するか否かを分析する工程
を含む、 試験化合物が前記ポリべプチドのプロテアーゼ活性を阻害するか否かを 検出する方法。
1 3 . 請求項 1 2に記載の方法による検出工程、 及び
プロテアーゼ活性を阻害する物質を選択する工程
を含む、 請求項 1〜 6のいずれか一項に記載のポリべプチドのプロテアーゼ活性 を阻害する物質をスクリーニングする方法。
1 4 . 請求項 1 3に記載の方法により、 慢性腎不全治療用物質をスクリーニング する方法。
1 5 . 請求項 1 2に記載の方法による検出工程、 及び
製剤化工程
を含む、 慢性腎不全治療用医薬組成物の製造方法。
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