WO2002051871A2 - Anticorps anti-cd28 - Google Patents

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WO2002051871A2
WO2002051871A2 PCT/FR2001/004203 FR0104203W WO02051871A2 WO 2002051871 A2 WO2002051871 A2 WO 2002051871A2 FR 0104203 W FR0104203 W FR 0104203W WO 02051871 A2 WO02051871 A2 WO 02051871A2
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Jean-Paul Soulillou
Geneviève LAFLAMME
Bernard Vanhove
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Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
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    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)

Definitions

  • the invention relates to antibodies directed against the CD28 lymphocyte receptor and to their fragments, and to their therapeutic uses, in particular within the framework of the regulation of T cell activation.
  • T cells Abnormal activation of T cells is involved in the pathogenesis of many autoimmune diseases, as well as in transplant rejection phenomena where it provokes the development of an immune response directed against the graft.
  • T lymphocytes Activation of T lymphocytes requires an activating signal, induced by recognition by T receptors (TCR) of the antigen associated with the major histocompatibility (MHC) class II complex and presented by the antigen presenting cells. (APCs).
  • TCR T receptors
  • MHC major histocompatibility
  • APCs antigen presenting cells.
  • B7 / CD28 / CTLA molecular system This system plays, for example, an essential role in the mechanisms of transplant rejection [WOODWARD et al. , Transplantation, 66, 14-20, (1998)].
  • the molecules B7.1 (CD80) and B7.2 (CD86) carried by the CPAgs can activate the CD28 receptor as well as the CTLA4 receptor for T lymphocytes.
  • Activation of CD28 delivers to the T lymphocyte a positive signal stimulating the cell; on the other hand, the activation of CTLA4 delivers a negative signal leading to a non-response (anergy) [FALLARINO et al. , J. Exp. Med., 188, 205-210, (1998)].
  • Resting T cells express a large amount of CD28, and very little CTLA4.
  • the CD28 / B7 interaction is favored, which activates the cell. It is only several hours after the initiation of activation, due to the increased expression membrane of CTLA4 whose affinity for B7 is 5 to 10 times greater than that of CD28, that the interaction B7 / CD28 shifts in favor of a B7 / CTLA4 interaction.
  • Anti-CD28 antibodies capable of preventing the binding of CD28 with B7 are known. However, they have the disadvantage, when used in their divalent native form, of causing dimerization and activation of CD28 by their binding with this receptor. However, monovalent fragments derived from these antibodies are capable of blocking without activating the CD28 receptor [DAMLE et al. , J. Immunol., 140, 1753-1761, (1988); NUNES et al. , Int. Immunol., 5, 311-315, (1993); PAGES et al. , J. Biol. Chem. , 271, 9403, (1996)].
  • Fab fragments derived from an anti-CD28 antibody could reverse the clinical symptoms of experimental autoimmune encephalitis induced in mice by the administration of myelin or the transfer of cells T of an affected animal.
  • Monovalent fragments, Fab or scFv, derived from an anti-CD28 antibody can potentially be used to prevent activation of T lymphocytes by means of a specific blocking of the CD28 / B7 interaction.
  • Fab fragments result from the action of papain on an immunoglobulin molecule, and each contain a light chain and the first half of a heavy chain; scFv fragments consist of variable portions of the heavy and light chains of an antibody, linked together via a flexible linker [CLACKSON et al. , Nature, 352, 624-628, (1991)], thus forming a single-chain protein.
  • the inventors have succeeded in selecting, from various antibodies recognizing the CD28 antigen, an antibody capable of blocking the CD28 / B7 interaction, and whose monovalent fragments have an affinity for the antigen sufficient to be usable, in vi tro or in vivo, to block the CD28 receptor without activation of this receptor.
  • CD28.3 This antibody, called CD28.3, is produced by the hybridoma deposited, under the terms of the Budapest Treaty, on November 28, 2000 with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Dondel Roux, 75724 PARIS CEDEX 15 ) under number 1-2582.
  • the present invention relates to a protein capable of binding specifically to the lymphocyte receptor.
  • CD28 and block the CD28 / B7 interaction characterized in that it comprises at least the CDRs of the heavy chain and of the light chain of the immunoglobulin CD28.3.
  • CDRs regions determining complementarity are the portions of variable regions of an immunoglobulin involved in the specificity of recognition of the antigen.
  • Proteins according to the invention thus include in particular: a) the antibody CD28.3 produced by the hybridoma
  • scFv fragments such as “diabodies” or “triabodies”, resulting from the association of 2 or 3 scFv fragments;
  • - proteins associating at least one antibody fragment comprising the CDRs of the antibody CD28.3, with a molecule making it possible to prolong its plasma half-life during its administration in vivo; it is possible, for example, to combine said antibody fragment with a water-soluble polypeptide of sufficient molecular mass so that the molecular mass of the fusion polypeptide thus obtained is greater than the renal filtration threshold.
  • a polypeptide will be chosen which, unlike the Fc fragments, cannot associate in dimers, and which does not have its own effector activity capable of causing untimely side effects.
  • Polypeptides having these properties can advantageously be obtained from water-soluble serum proteins, namely in particular serum albumin, haptoglobulin, ITIH2 (inter-alpha inhibitor (globulin), polypeptide H2), transferrin, CBG ( corticosteroid binding protein), antitrypsin ⁇ 1, ITIH4 (inter-alpha inhibitor (globulin), H4 polypeptide), AACT (alpha-1-antichymotrypsin), TBG (thyroxine binding globulin), fibrinogen and prothrombin, to prepare fusion proteins with scFv fragments derived from anti-CD28 antibodies. It is also possible to conjugate a protein according to the invention with a polyol, for example polyethylene glycol, as described for example in US Patent 4,179,337.
  • a polyol for example polyethylene glycol
  • FIG. 1 represents a scFv fragment derived from the antibody CD28.3.
  • the CDR sequences of the CD28.3 antibody are framed in the sequence shown in Figure 1.
  • nucleotide sequence coding for this scFv fragment is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 1 and the corresponding peptide sequence is represented under the number SEQ ID NO: 2.
  • Fv, Fab, or Fab ′ 2 fragments in accordance with the invention can be obtained by conventional enzymatic digestion techniques, from the antibody CD28.3.
  • a plasmid containing a polynucleotide encoding a scFv fragment of CD 28.3, fused to a polynucleotide coding for amino acids 53 to 425 of the antitrypsin ⁇ l was deposited, according to the terms of the Budapest Treaty, on December 11, 2001 with the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms, 25 rue du Dondel Roux, 75724 PARIS CEDEX 15), under the number I-2762.
  • Proteins according to the invention such as chimeric or recombinant antibodies, scFv fragments and their derivatives, etc. can be obtained by conventional techniques of genetic engineering, such as those described by SAMBROOK et al. , [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)].
  • Polynucleotides encoding the variable regions of the anti-CD28.3 antibody can for example be obtained by cloning of said variable regions from a cDNA library of the CD28.3 hybridoma, or from the plasmid CNCM I- 2762. They can also be prepared totally or partially, by synthesis of nucleic acids, from the nucleotide sequences of said variable regions.
  • the present invention also relates to any nucleic acid molecule encoding a protein in accordance with the invention comprising the CDRs of the antibody CD28.3, as well as any recombinant vector, in particular any expression vector, comprising said molecule nucleic acid.
  • the present invention also relates to any cell expressing a protein in accordance with the invention comprising the CDRs of the antibody CD28.3.
  • Nucleic acid molecules in accordance with the invention can advantageously comprise, in addition to a sequence coding for a protein in accordance with the invention, a sequence coding for a signal peptide allowing the secretion of said protein; they can also comprise one or more sequence (s) encoding one or more marker peptide (s) allowing the detection and / or facilitating the purification of said protein.
  • Expression vectors according to the invention comprise at least one nucleic acid sequence encoding a protein according to the invention, associated with transcription and translation control elements active in the chosen host cell.
  • Vectors which can be used for the construction of expression vectors in accordance with the invention are known in themselves, and will be chosen in particular according to the host cell which it is desired to use.
  • Host cells which can be used in the context of the present invention can be prokaryotic or eukaryotic cells.
  • yeast cells such as Saccharomyces
  • insect cells such as Drosophila or Spodoptera cells
  • mammalian cells such as HeLa cells, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc.
  • the construction of expression vectors in accordance with the invention, and the transformation of host cells can be carried out by conventional techniques of molecular biology.
  • the subject of the invention is also a method for producing a protein in accordance with the invention, characterized in that it comprises the cultivation of at least one cell in accordance with the invention, and the recovery of said protein from said culture. If the protein is secreted, it can be recovered directly from the culture medium; otherwise, the cells will be lysed beforehand.
  • the protein can then be purified from the culture medium or from the cell lysate, by conventional procedures, known in themselves to those skilled in the art, for example by fractional precipitation, in particular precipitation with ammonium sulfate, electrophoresis, gel filtration, affinity chromatography, etc.
  • the proteins according to the invention can be used in vi tro to study the proliferative response or the differentiation of T lymphocytes responding to antigenic, viral, allogenic or xenogenic stimulation. It can also be used in vi tro to induce the differentiation of T lymphocytes taken from a patient, for example the induction of tolerance towards an antigen or an alloantigen, intended to be subsequently re-administered in vivo.
  • They can also be used for obtaining drugs, or diagnostic reagents.
  • Proteins according to the invention divalent, that is to say having 2 sites for binding to the CD28 receptor, and therefore capable of inducing the dimerization of this receptor, can be used in all cases where it is desired to activate this receptor CD28, that is to say to increase the response of a T lymphocyte towards an antigen.
  • Proteins according to the invention monovalent, that is to say having a single binding site to the CD28 receptor, can be used in all cases where it is desired to selectively block this receptor without activating it, in order to induce a immunosuppression.
  • a protein according to the invention comprising a monovalent fragment derived from an anti-CD28 antibody can in particular be used for obtaining an immunosuppressive drug, selectively blocking the T cell activation phenomena involving the CD28 receptor, and not having the drawbacks of known immunosuppressants, such as cyclosporine.
  • T-immunosuppression by selective blocking of CD28 by a protein in accordance with the invention has applications in all pathologies dependent on T lymphocytes.
  • T-cell-mediated autoimmune diseases such as type I diabetes, or multiple sclerosis
  • type IV hypersensitivity which is involved in allergic phenomena as well as in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases following infection by a pathogen (especially leprosy, tuberculosis, leishmaniasis, listerosis, etc.).
  • EXAMPLE 1 CHOICE OF ANTIBODY PRODUCING MONOVALENT FRAGMENTS PROPERTIES OF MONOVALENT Fab FRAGMENTS FROM CD28.3.
  • 1) Binding of the Fab fragments to Jurkat CD28 + T cells 100,000 Jurkat CD28 + cells in 100 ⁇ l are incubated in PBS-BSA l% -NaN3 0.1% at 4 ° C for 30 minutes with increasing concentrations of anti-antibody -CD28 or of their Fab fragments. After washing, the cells are similarly incubated with an anti-mouse IgG goat antibody conjugated to FITC, washed, and analyzed by cytofluorometry. The results are illustrated in Figure 2:
  • X-axis concentration of antibodies or Fab fragments
  • Y-axis Average fluorescence intensity (IMF) -O-:
  • FI Fab fragments of the antibody CD28.1 -M-:
  • F2 Fab fragments of CD28.2 - ⁇ - antibody:
  • F3 Fab fragments of CD28.3 -x- antibody:
  • F5 Fab fragments of CD28.5 -O- antibody:
  • Fab only those from CD28.3 are capable of binding significantly to Jurkat CD28 + cells at concentrations below 10 ⁇ g / ml 2) Effect of Fab fragments on the adhesion of Jurkat CD28 + T cells to murine L cells transfected expressing the molecule B7-1. :
  • responder CD4 + T cells were mixed with irradiated isogenic PBMCs, in the presence of 50 ng / ml of toxic shock syndrome toxin-1 (TSST-1) which specifically stimulates V ⁇ 2 + T cells, ie absence of antibodies, either in the presence of anti-B7-1 (1 ⁇ g / ml), anti-B7-2 (0.5 ⁇ g / ml), CTLA4Ig (10 ⁇ g / ml), or fragments Fab from " " CD28.3 (10 ⁇ g / ml).
  • TSST-1 toxic shock syndrome toxin-1
  • the proliferative response in these cultures is evaluated after 1, 3, 6, and 8 days, by incorporation of ( 3 H) thymidine for a period of 16 hours.
  • a mixed lymphocyte reaction (PBMC originating from a donor A / irradiated PBMC originating from a donor B) was carried out, in the presence of Fab fragments from CD28.3.
  • 10 5 mononuclear cells from the peripheral blood of a donor are mixed with 10 5 allogeneic mononuclear cells irradiated at 35 Gy, and cultured for 5 days in the presence or absence of 10 ⁇ g / ml of Fab derived from the CD28 antibody. 3.
  • RNA of the responder cells was extracted, and the quantity of cytokine mRNA was evaluated by quantitative measurement of the number of transcripts, compared to the quantity of HPRT, using a TaqMan (Perkin Helmer). We observe in the presence of Fab fragments from
  • Jurkatt T cells were incubated in culture medium with 100 ⁇ g / ml of CD28.3 antibody, at 37 ° C. or at 0 ° C. At different times, the cells were washed with cold PBS buffer containing 0.1% bovine serum albumin, and NaN3, in order to block the membrane motility. The Bound antibodies were revealed with a secondary goat anti-mouse antibody, labeled with fluorescein. The cells were mounted in MOVIOL and analyzed by confocal microscopy. It is thus observed that the whole CD28.3 antibodies binding to Jurkatt T cells are captured and disappear from the cell surface at 37 ° C., but not at 0 ° C. On the contrary, the Fab fragments remain attached to the surface of the cell.
  • Figure 1 shows the nucleotide sequence and the polypeptide sequence deduced from a scFv fragment derived from the antibody CD28.3.
  • the portions of this sequence corresponding to the variable fragment of the heavy chain and the light chain are represented in capital letters.
  • the sequence corresponding to the variable fragment of the light chain is also underlined.
  • the linker sequence is shown in lowercase letters.
  • the sequences of the heavy chain and light chain CDRs are boxed.
  • the nucleotide sequence coding for this scFv fragment is also represented in the annexed sequence list, under the number SEQ ID NO: ° l.
  • the cDNA encoding this scFv fragment was inserted into the vector pIG6 (Biochemisches Institut, Universitât Zurich).
  • This vector notably comprises an ampicillin resistance marker, and an expression cassette which comprises an inducible lac promoter, under the control of which are placed: a sequence encoding an ompA signal peptide, a sequence encoding a sequence marker peptide (code 1 letter) DYKD, a sequence encoding a c-myc marker peptide, and a sequence encoding a polyhistidine-5 marker.
  • the cDNA encoding the scFv fragment described above was introduced between the EcoRI and EcoRV sites of pIG6, downstream of the sequence encoding the DYKD peptide and upstream of the sequence encoding the c-myc marker.
  • the construction obtained is called pIg6-28.3.
  • the vector pIg6-28.3 was used to transform E. coli JM83 cells.
  • the cells are cultured at 25 ° C., up to an OD550 of 0.5.
  • the scFv fragment is produced in a soluble form in the periplasm. It appears after electrophoresis and Western transfer, in the form of a band at around 30 kDa.
  • the binding of scFv fragments present in the eluate from the NiNTA column to Jurkat CD28 + cells is comparable to that obtained with Fab fragments obtained from the CD28.3 antibody by papain digestion.
  • the vector pSec-28.3 was used to transfect Cos cells. The cells are grown at
  • the nucleotide sequence encoding the scFv fragment described in Example 2 was linked to the 5 ′ end of a portion of the human ⁇ 1-antitrypsin cDNA (GENBANK accession number K01396) corresponding to amino acids 53 to 425, via a hinge peptide, of sequence VAAPS.
  • the resulting sequence is represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 3, and the corresponding polypeptide under the number SEQ ID NO: 4.
  • Prokaryotic expression vector The vector pIG6 was used (Biochemisches).
  • This vector notably comprises an ampicillin lote resistance marker, and an expression cassette which comprises an inducible lac promoter, under the control of which are placed: a sequence encoding an ompA signal peptide, a sequence encoding a sequence marker peptide (code 1 letter) DYKD, a sequence encoding a c-myc marker peptide, and a sequence encoding a polyhistidine-5 marker.
  • Figure 1 shows schematically the construction obtained, called pIg6-Haat.
  • the vector pSECTagB (Invitrogen, De Schelp, Pays
  • This vector notably comprises an ampicillin resistance marker, a zeocin resistance marker, and an expression cassette which comprises a CMV promoter, under the control of which are placed: a sequence encoding an IgG Kappa light chain signal peptide, a sequence encoding a c-myc marker peptide, and a sequence encoding a polyhistidine-6 marker.
  • PSEC B Tag upstream of the sequence coding for the c-myc marker.
  • FIG. 2 shows schematically the construction obtained, called pSecHaat.
  • EXAMPLE 5 CONSTRUCTION OF EXPRESSION VECTORS INTEGRATING THE SEQUENCE ENCODING THE SCFv CD28.3 / ⁇ l- ANTITRYPSIN FUSION PROTEIN
  • the cDNA encoding the CD28.3 / ⁇ l-antitrypsin ScFv fusion protein described in Example 3 above was introduced between the EcoRI and Xhol sites of pIG6, downstream of the sequence encoding the DYKD peptide and upstream of the sequence encoding the c-myc marker.
  • Figure 3 shows schematically the construction obtained, called pIg6-28.3Haat.
  • CD28.3 / ⁇ 1-antitrypsin described in Example 3 above was introduced between the BamHI and Xhol sites of the vector PSEC B Tag, upstream of the sequence coding for the marker c-myc.
  • Figure 4 shows schematically the construction obtained, called pSec-28.3Haat.
  • This vector hosted in E. coli DH5 ⁇ , was deposited on December 11, 2001 with the CNCM, under the number 1-2762.
  • the vector pIg6-28.3Haat was used to transform E. coli JM83 cells.
  • the cells were cultured at 25 ° C 'to an OD 550 of 0.5.
  • the protein is produced in a soluble form in the periplasm. It appears after electrophoresis and Western transfer, in the form of a band at around 74 kDa. It can be purified from periplasmic extracts using an NI-NTA affinity chromatography matrix, and / or an anti-c-myc affinity chromatography matrix. It can also be purified from an anti- ⁇ l-antitrypsin affinity column.
  • eukaryotic cells In eukaryotic cells:
  • the vector pSec-28.3Haat was used to transfect CHO cells by lipofection.
  • the cells are cultured in the presence of 200 ⁇ g / ml of zeocin in MEM medium containing 10% fetal calf serum.
  • the protein is secreted into the culture medium.
  • the anti-CD28 activity of the scFv CD28.3 / ⁇ l-antitrypsin fusion protein obtained in Example 6 above is evaluated by its binding to the CD28 molecule, or to cells expressing CD28 on their membrane, and its absence of binding to cells which do not express CD28.
  • the immunosuppressive activity of the scFv CD28.3 / ⁇ l-antitrypsin fusion protein obtained in Example 6 above is evaluated by the inhibition of adhesion to B7, and the inhibition of the induced activation of the lymphocyte. T.
  • Biosensor measurement of CD28 binding parameters Recombinant human CD28 was immobilized on the biosensor detector (BIACORE). A fusion protein scFv CD28.3 / ⁇ l-antitrypsin obtained as described in Example 6 above was brought into contact with the detector. The connection parameters are: KA (1 / M) 2.86 e 9; KD (M): 3.49 e - 10. In comparison, these parameters measured for the Fab fragment of the CD28.3 antibody are: KA (1 / M): 9.69 e 8; KD (M): 1.03 e -9. The affinity for CD28 of the Fab fragment of the antibody CD28.3 and of the fusion protein are therefore comparable.
  • CD28 / B7-dependent adhesion test 4 x 10 5 human T cells (Jurkatt, CD28-positive) labeled with 51 Cr are incubated for 2 hours in a microtiter plate in which 10 5 adherent cells LTK " or LB7 + ( Murine fibroblasts transfected with human B7.1 [PAGES et al., J. Biol. Chem., 271, 9403 (1996)] were seeded 24 hours previously These incubations are carried out in the absence or in the presence of the fusion protein scFv CD28.3 / ⁇ l-antitrypsin, diluted to different concentrations in PBS buffer without Ca 2+ or Mg 2+ .
  • the adherent cells after washing are quantified by reading the residual radioactivity on the beta counter (PACKARD TOPCOUNT). of adhesion in the presence of the fusion protein scFv CD28.3 / ⁇ l- antitrypsin, inhibition directly dependent on the dose of fusion protein used.
  • peripheral blood mononuclear cells from a healthy donor are mixed with 10 5 peripheral blood mononuclear cells from another healthy allogeneic donor.
  • the proliferative response in these cultures is evaluated after 5 days by incorporation of ( 3 H) Thymidine for a period of 16 hours.
  • a significant inhibition of incorporation is observed in the presence of the fusion protein scFv CD28.3 / ⁇ l-antitrypsin, inhibition directly dependent on the dose of fusion protein used.

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Abstract

Anticorps dirigé contre le récepteur CD28, et capable de bloquer l'interaction CD28/B7, et protéines dérivées de cet anticorps, utilisables notamment pour bloquer l'activation CD28-dépendante des lymphocytes.

Description

ANTICORPS ANTI-CD28
L'invention est relative à des anticorps dirigés contre le récepteur lymphocytaire CD28 et à leurs fragments, et à leurs utilisations thérapeutiques, notamment dans le cadre de la régulation de l' activation des cellules T.
Une activation anormale des cellules T intervient dans la pathogenèse de nombreuses maladies autoimmunes, ainsi que dans les phénomènes de rejet de greffes où elle provoque le développement d'une réponse immune dirigée contre le greffon.
L' activation des lymphocytes T nécessite un signal activateur, induit par la reconnaissance par les récepteurs T (TCR) de l'antigène associé avec le complexe majeur d' histocompatibilite (CMH) de classe II et présenté par les cellules présentatrices de l'antigène (CPAg). Cette activation n'entraîne cependant la prolifération des cellules T et la sécrétion de cytokines immunomodulatrices spécifiques (telles que l' interleukine 2, l'interféron gamma ou l' interleukine 4), que si d'autres systèmes de- co-stimulation T sont également activés.
L' un des systèmes les plus importants de régulation de l' activation des lymphocytes T est le système moléculaire B7/CD28/CTLA . Ce système joue par exemple un rôle essentiel dans les mécanismes du rejet de greffe [WOODWARD et al . , Transplantation, 66, 14-20, (1998)]. Les molécules B7.1 (CD80) et B7.2 (CD86) portées par les CPAgs peuvent activer le récepteur CD28 ainsi que le récepteur CTLA4 des lymphocytes T. L' activation du CD28 délivre au lymphocyte T un signal positif stimulant la cellule ; en revanche, l' activation du CTLA4 délivre un signal négatif conduisant à une non-réponse (anergie) [FALLARINO et al . , J. Exp. Med., 188, 205-210, (1998)].
Les lymphocytes T au repos expriment une quantité importante de CD28, et très peu de CTLA4. Lors d'un premier contact cognitif entre une CPAg et un lymphocyte T, l'interaction CD28/B7 est privilégiée, ce qui active la cellule. Ce n'est que plusieurs heures après l'initiation de 1' activation, du fait de l'augmentation de l'expression membranaire de CTLA4 dont l'affinité pour B7 est 5 à 10 fois supérieure à celle du CD28, que l'interaction B7/CD28 se déplace au profit d'une interaction B7/CTLA4.
Actuellement, pour bloquer l' activation des lymphocytes T, notamment dans le cadre des transplantations d'organes, on utilise principalement la cyclosporine . Malgré l'efficacité de ce médicament, la protection qu'il confère n'est cependant pas absolue. En outre, il agit en bloquant toutes les voies d' activation cellulaires dépendantes du calcium, et possède donc une activité biologique qui n'est pas strictement spécifique de lymphocytes T et entraîne un nombre important d'effets secondaires. Il est donc souhaitable de développer de nouveaux immunosuppresseurs au mode d'action défini et de spécificité plus grande. II a été postulé que l'inhibition sélective du signal agoniste délivré à la cellule T par le CD28 en laissant intact le système antagoniste constitué par le couple CTLA4/B7, par l'intermédiaire d'un blocage spécifique de l'interaction CD28/B7 permettrait de prévenir l' activation des lymphocytes T. Un tel blocage spécifique de l'interaction CD28/B7 peut être obtenu à l'aide d'un anticorps dirigé contre CD28.
Des anticorps anti-CD28 capables d'empêcher la liaison de CD28 avec B7 sont connus. Ils présentent toutefois l'inconvénient, lorsqu'ils sont utilisés sous leur forme native divalente, d'entraîner la dimérisation et l' activation de CD28 par leur liaison avec ce récepteur. Cependant, des fragments monovalents issus de ces anticorps sont capables de bloquer sans l'activer le récepteur CD28 [DAMLE et al . , J. Immunol., 140, 1753-1761, (1988); NUNES et al . , Int. Immunol., 5, 311-315, (1993) ; PAGES et al . , J. Biol. Chem. , 271, 9403, (1996)].
Il a ainsi été rapporté [PERRIN et al . , J. Immunol. 163, 1704-1710, (1999)] que des fragments Fab issus d'un anticorps anti-CD28 pouvaient enrayer les symptômes cliniques de l'encéphalite expérimentale auto-immune induite chez la souris par l'administration de myéline ou le transfert de cellules T d'un animal atteint. Des fragments monovalents, Fab ou scFv, dérivés d'un anticorps anti-CD28 sont potentiellement utilisables pour prévenir l' activation des lymphocytes T par l'intermédiaire d'un blocage spécifique de l'interaction CD28/B7.
Les fragments Fab résultent de l'action de la papaine sur une molécule d' immunoglobuline, et contiennent chacun une chaîne légère et la première moitié d'une chaîne lourde ; les fragments scFv sont constitués des portions variables des chaînes lourdes et légères d'un anticorps, reliées entre elles par l'intermédiaire d'un lieur flexible [CLACKSON et al . , Nature, 352, 624-628, (1991)], formant ainsi une protéine simple-chaîne.
Ces fragments monovalents présentent fréquemment une affinité pour l'antigène moins importante que celle des anticorps natifs, ce qui peut limiter leurs possibilités d'utilisation dans des applications diagnostiques ou thérapeutiques .
Les Inventeurs sont parvenus à sélectionner, parmi différents anticorps reconnaissant l'antigène CD28, un anticorps capable de bloquer l'interaction CD28/B7, et dont les fragments monovalents présentent une affinité pour l'antigène suffisante pour être utilisables, in vi tro ou in vivo, pour bloquer le récepteur CD28 sans activation de ce récepteur.
Cet anticorps, dénommé CD28.3, est produit par l'hybridome déposé, selon les termes du traité de Budapest, le 28 novembre 2000 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15) sous le numéro 1-2582.
La présente invention a pour objet une protéine capable de se .lier spécifiquement au récepteur lymphocytaire
CD28 et de bloquer l'interaction CD28/B7, caractérisé en ce qu'elle comprend au moins les CDRs de la chaîne lourde et de la chaîne légère de l' immunoglobuline CD28.3.
Les CDRs (régions déterminant la complémentarité) sont les portions des régions variables d'une immunoglobuline impliquées dans la spécificité de reconnaissance de l' antigène .
Des protéines conformes à l'invention englobent ainsi notamment : a) l'anticorps CD28.3 produit par l'hybridome
CNCM 1-2582 ; b) les fragments Fv, Fab, Fab' 2 ou scFv de l'anticorps CD28.3 ; c) les anticorps chimériques ou humanisés obtenus à partir des régions variables de CD28.3 ; d) les fragments des anticorps b) ci-dessus comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, qu'il s'agisse de fragments monovalents, Fv, Fab, ou scFv, ou de fragments divalents Fab' 2 ; e) les protéines recombinantes comprenant un fragment b) ou d) et un polypeptide hétérologue. Il peut s'agir par exemple :
- de dérivés di- ou plurivalents de fragments scFv, tels que les « diabodies » ou « triabodies », résultant de l'association de 2 ou 3 fragments scFv;
- de protéines associant au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, avec au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs d'un anticorps de spécificité différente ; on citera à titre d'exemples, des immunoglobulines bi-spécifiques, des conjugués d'un fragment Fv ou Fab contenant les CDRs de CD28.3 avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente, des « diabodies bi-spécifiques » résultant de l'association d'un fragment scFv contenant les CDRs de CD28.3 avec un fragment Fv ou Fab d'un anticorps de spécificité différente.
- de protéines associant au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, avec une molécule dotée d'activité pharmacologique (par exemple une toxine) , ou de propriétés effectrices (par exemple un fragment Fc) .
- de protéines associant au moins un fragment d'anticorps comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, avec une molécule permettant de prolonger sa demi-vie plasmatique lors de son administration in vivo ; on peut par exemple associer ledit fragment d'anticorps avec un polypeptide hydrosoluble de masse moléculaire suffisante pour que la masse moléculaire du polypeptide de fusion ainsi obtenu soit supérieure au seuil de filtration rénale. Dans ce cas, on choisira un polypeptide qui contrairement aux fragments Fc, ne puisse pas s'associer en dimères, et qui ne possède pas d'activité effectrice propre susceptible d'entraîner des effets secondaires inopportuns. Des polypeptides possédant ces propriétés peuvent avantageusement être obtenus à partir de protéines sériques hydrosolubles, à savoir notamment l'albumine sérique, l' haptoglobuline, l'ITIH2 (inhibiteur inter-alpha (globuline) , polypeptide H2), la transferrine, le CBG (protéine liant les corticostéroïdes) , l'αl antitrypsine, l' ITIH4 (inhibiteur inter-alpha (globuline), polypeptide H4), l'AACT (alpha-1-antichymotrypsine) , le TBG (globuline liant la thyroxine) , le fibrinogène et la prothrombine, pour préparer des protéines de fusion avec des fragments scFv dérivés d'anticorps anti-CD28. On peut également conjuguer une protéine conforme à l'invention avec un polyol, par exemple le polyéthylène glycol, comme décrit par exemple dans le Brevet US 4,179,337.
Un exemple d'une protéine conforme à l'invention est illustré par la Figure 1, qui représente un fragment scFv dérivé de l'anticorps CD28.3. Les séquences des CDRs de l'anticorps CD28.3 sont encadrées dans la séquence représentée sur la Figure 1.
La séquence nucléotidique codant pour ce fragment scFv est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1 et la séquence peptidique correspondante est représentée sous le numéro SEQ ID NO: 2.
Des fragments Fv, Fab, ou Fab' 2 conformes à l'invention peuvent être obtenus par les techniques classiques de digestion enzymatique, à partir de l'anticorps CD28.3.
Un plasmide contenant un polynucléotide codant pour un fragment scFv de CD 28.3, fusionné à un polynucléotide codant pour les acides aminés 53 à 425 de l'αl antitrypsine a été déposé, selon les termes du traité de Budapest, le 11 décembre 2001 auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15), sous le numéro I- 2762.
Des protéines conformes à l'invention telles que des anticorps chimériques ou recombinants, des fragments scFv et leurs dérivés, etc. peuvent être obtenues, par les techniques classiques du génie génétique, telles que celles décrites par SAMBROOK et al . , [MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)].
Des polynucléotides codant les régions variables de l'anticorps anti-CD28.3 peuvent par exemple être obtenus par clonage desdites régions variables à partir d'une banque d'ADNc de l'hybridome CD28.3, ou à partir du plasmide CNCM I- 2762. Ils peuvent également être préparés totalement ou partiellement, par synthèse d'acides nucléiques, à partir des séquences nucleotidiques desdites régions variables. On peut par exemple synthétiser des polynucléotides codant les CDRs de CD28.3, et les incorporer dans les régions de charpente (FR pour « frame ork régions ») d'un autre anticorps, notamment d'un anticorps d'origine humaine, par les techniques, connues en elles-mêmes, de greffe de CDRs, telles que celles décrites par ROUTLEDGE et al . , ["Reshaping antibodies for therapy", in PROTEIN ENGINEERING OF ANTIBODY MOLECULES FOR PROPHYLATIC AND THERAPEUTIC APPLICATIONS IN MAN, 13-44, Académie Titles, Nottingham, England (1993)] ou par ROGUSKA et al . , Protein Engineering, 9(10), 895-904, (1996) ] .
La présente invention a également pour objet toute molécule d'acide nucléique codant une protéine conforme à l'invention comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3, ainsi que tout vecteur recombinant, notamment tout vecteur d'expression, comprenant ladite molécule d'acide nucléique.
La présente invention a également pour objet toute cellule exprimant une protéine conforme à l'invention comprenant les CDRs de l'anticorps CD28.3. Ceci englobe notamment l'hybridome CNCM 1-2582, ainsi que les cellules- hôtes transformées par une molécule d'acide nucléique conforme à l'invention. Des molécules d'acide nucléique conformes à l'invention peuvent avantageusement comprendre, outre une séquence codant une protéine conforme à l'invention, une séquence codant un peptide signal permettant la sécrétion de ladite protéine ; elles peuvent aussi comprendre une ou plusieurs séquence (s) codant un ou plusieurs peptide (s) marqueur (s) permettant la détection et/ou facilitant la purification de ladite protéine.
Des vecteurs d'expression conformes à l'invention comprennent au moins une séquence d'acide nucléique codant une protéine conforme à l'invention, associée à des éléments de contrôle de la transcription et de la traduction actifs dans la cellule-hôte choisie. Des vecteurs utilisables pour la construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention sont connus en eux-mêmes, et seront choisis notamment en fonction de la cellule-hôte que l'on souhaite utiliser.
Des cellules-hôtes utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être des cellules procaryotes ou eucaryotes. Parmi les cellules eucaryotes utilisables, on citera en particulier des cellules végétales, des cellules de levure, telles que Saccharomyces, des cellules d'insecte, telles que les cellules de Drosophila , ou de Spodoptera et des cellules de mammifères telles que les cellules HeLa, CHO, 3T3, C127, BHK, COS, etc.. La construction de vecteurs d'expression conformes à l'invention, et la transformation des cellules- hôtes peut être effectuée par les techniques classiques de biologie moléculaire.
L'invention a également pour objet un procédé de production d'une protéine conforme à l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une cellule conforme à l'invention, et la récupération de ladite protéine à partir de ladite culture. Si la protéine est sécrétée, elle peut être récupérée directement à partir du milieu de culture ; sinon on procédera préalablement à la lyse des cellules.
La protéine peut ensuite être purifiée à partir du milieu de culture ou du lysat cellulaire, par des procédures classiques, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art, par exemple par précipitation fractionnée, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, électrophorèse, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, etc. Les protéines conformes à l'invention peuvent être utilisées in vi tro pour étudier la réponse proliférative ou la différentiation de lymphocytes T répondant à une stimulation antigénique, virale, allogénique ou xénogénique. Elle peut être également utilisée in vi tro pour induire la différenciation de lymphocytes T prélevés chez un patient, par exemple l'induction d'une tolérance vis-à-vis d'un antigène ou d'un alloantigène, destinés à être par la suite ré-administrés in vivo.
Elles peuvent également être utilisées pour l'obtention de médicaments, ou de réactifs de diagnostics.
Des protéines conformes à l'invention, divalentes, c'est à dire possédant 2 sites de liaison au récepteur CD28, et donc capables d'induire la dimérisation de ce récepteur, sont utilisables dans tous les cas où l'on souhaite activer ce récepteur CD28, c'est-à-dire augmenter la réponse d'un lymphocyte T vis à vis d'un antigène.
Des protéines conformes à l'invention, monovalentes, c'est à dire possédant un seul site de liaison au récepteur CD28, sont utilisables dans tous les cas où l'on souhaite bloquer sélectivement ce récepteur sans l'activer, afin d'induire une immunosuppression.
Une protéine conforme à l'invention, comprenant un fragment monovalent dérivé d'un anticorps anti-CD28 peut notamment être utilisée pour l'obtention d'un médicament immunosuppresseur, bloquant sélectivement les phénomènes d' activation des cellules T impliquant -le récepteur CD28, et ne présentant pas les inconvénients des immunosuppresseurs connus, tels que la cyclosporine. L' immunosuppression T par blocage sélectif du CD28 par une protéine conforme à l'invention possède des applications dans toutes les pathologies dépendantes des lymphocytes T. II s'agit essentiellement du rejet de greffe, de la maladie du greffon contre l'hôte, des maladies auto- immunes à médiation lymphocytaire T, telles que le diabète de type I, ou la sclérose en plaques, et de l'hypersensibilité de type IV, qui intervient dans les phénomènes allergiques ainsi que dans la pathogenèse de maladies inflammatoires chroniques suivant une infection par un agent pathogène (notamment lèpre, tuberculose, leishmaniose, listérose, etc. ) .
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs de préparation et d'utilisation d'anticorps conformes à l'invention. EXEMPLE 1 : CHOIX D'UN ANTICORPS PRODUISANT DES FRAGMENTS MONOVALENTS PROPRIETES DE FRAGMENTS MONOVALENTS Fab ISSUS DE CD28.3.
Certaines des propriétés de plusieurs anticorps anti-CD28 (CD28.1, CD28.2, CD28.3, CD28.4, CD28.5 et CD28.6) sont décrites dans la publication de NUNES et al . [Int. Immunol., 5, 311, (1993)]. Ces différents anticorps, qui ne sont pas accessibles au public, ont été fournis par le laboratoire de Daniel OLIVE (INSERM) . Les propriétés de liaison à l'antigène des fragments monovalents Fab de ces différents anticorps ont été comparées.
5 mg de fragments Fab de chacun de ces anticorps ont été préparés par digestion à la papaïne (rapport molaire papaine/anticorps = 1/100) pendant 24 heures à 37°C, suivie d' inactivation de l'enzyme au iodoacétamide 0,03 M et de dialyse contre du PBS pour éliminer l' iodoacétamide. 1) Liaison des fragments Fab à des cellules T Jurkat CD28+ : 100 000 cellules Jurkat CD28+ en 100 μl sont incubées en PBS-BSA l%-NaN3 0,1% à 4°C pendant 30 minutes avec des concentrations croissantes d'anticorps anti-CD28 ou de leurs fragments Fab. Après lavage, les cellules sont incubées de manière similaire avec un anticorps de chèvre anti-IgG de souris conjugué à la FITC, lavées, et analysées en cytofluorométrie. Les résultats sont illustrés par la Figure 2 :
Légende de la Figure 2 : Axe des abscisses : concentration en anticorps ou fragments Fab Axe des ordonnées : Intensité moyenne de fluorescence (IMF) -O- : FI = Fragments Fab de l'anticorps CD28.1 -M- : F2 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.2 -Δ- : F3= Fragments Fab de l'anticorps CD28.3 -x- : F5 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.5 -O- : F6 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.6 ..#.. : Wl = anticorps entier CD28.1 ...... : 2 = anticorps entiers CD28.2
—O— : 3 = anticorps entiers CD28.3 — _— : W5 = anticorps entiers CD28.5 —*— : 6 = anticorps entiers CD28.6 —A— : Mara-1 = contrôle négatif (IgGl de souris). Ces résultats montrent que parmi les fragments
Fab, seuls ceux issus de CD28.3 sont capables de se lier de manière significative aux cellules Jurkat CD28+ à des concentrations inférieures à 10 μg/ml 2) Effet des fragments Fab sur l'adhésion des cellules T Jurkat CD28+ à des cellules L murines transfectees exprimant la molécule B7-1. :
4 x 105 cellules humaines T (Jurkatt, CD28- positives) marquées au 51Cr sont incubées pendant 2 heures dans une plaque de microtitration dans laquelle 105 cellules adhérentes LTK" ou LB7+ (fibroblastes murins transfectés avec B7.1 humain [PAGES et al . , J. Biol. Chem. , 271, 9403, (1996)] ont été ensemencées 24 heures auparavant. Ces incubations sont réalisées en présence des fragments Fab issus des anticorps CD28.1 à CD28.6, ou de l'anticorps CD28.3, dilués à différentes dilutions dans du tampon PBS sans Ca2+ ni Mg2+. Les cellules adhérentes après lavages sont quantifiées par lecture de la radioactivité résiduelle au compteur beta (PACKARD TOPCOUNT) .
Les résultats sont illustrés par la Figure 3 : Légende de la Figure 3 : Axe des abscisses : pourcentage de cellules adhérentes Axe des ordonnées : concentration en anticorps -*- : FI = Fragments Fab de l'anticorps CD28.1 -B- : F2 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.2 -A- : F3 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.3 -X- : F5 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.5 -*- : F6 = Fragments Fab de l'anticorps CD28.6 ..•.. : Anticorps entier CD28.3 O : Pas d'anticorps.
Ces résultats montrent que les fragments Fab issus de CD28.3 sont les plus efficaces pour inhiber les interactions CD28/B7. Ils inhibent l'adhésion à 90% à une concentration de 3 μg/ml, et avec une efficacité comparable à celle de l'anticorps CD28.3 entier, alors qu'à cette concentration, les fragments Fab issus des autres anticorps n'inhibent pas l'adhésion à plus de 50%.
3) Effet des fragments Fab sur la prolifération en réaction lymphocytaire mixte :
105 cellules mononucléées du sang périphérique sont mélangées avec 105 cellules mononucléées allogéniques irradiées à 35 Gy, en présence de concentrations variables des anticorps CD28.1 à CD28.6 ou des fragments Fab issus de ces anticorps. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 3 jours, par incorporation de (3H) thymidine pendant une durée de 16 heures. Les résultats sont illustrés par la Figure 4 :
Légende de la Figure 4 : Axe des abscisses : concentration en anticorps Axe des ordonnées : réponse proliférative (cpm) Niveau basai de prolifération = 6500 cpm. -*- : 28.1 = anticorps CD28.1 -M- : 28.2 = anticorps CD28.2 -A- : 28.3 = anticorps CD28.3 -x- : 28.5 = anticorps CD28.5 ..*.. : 28.6 = anticorps CD28.6
-•- :Fab.l = fragments Fab de l'anticorps CD28.1 .. + .. : Fab.2 ≈ fragments Fab de l'anticorps CD28.2 — _— : Fab.3 = fragments Fab de l'anticorps CD28.3 —r— : Fab.5 = fragment Fab de l'anticorps CD28.5 -O- : Fab.6 = fragment Fab de l'anticorps CD28.6.
Ces résultats montrent que les fragments Fab issus de CD28.3 ou de CD28.6 sont les plus efficaces pour inhiber la prolifération des cellules mononucléées. Les anticorps entiers CD28.1 à CD28.6, testés en parallèle, n'ont aucun effet inhibiteur ou bien stimulent la prolifération de par leur action stimulatrice sur le CD28.
Effet des fragments Fab issus de CD28.3 sur la prolifération induite par un super-antigène .
Pour cette expérimentation des cellules T CD4+ répondeuses ont été mélangées avec des PBMC isogéniques irradiées, en présence de 50 ng/ml de toxine-1 du syndrome de choc toxique (TSST-1) qui stimule spécifiquement les cellules T Vβ2+, soit en l'absence d'anticorps, soit en présence d'anti-B7-l (1 μg/ml) , d'anti-B7-2 (0,5 μg/ml), de CTLA4Ig (10 μg/ml), ou de fragments Fab issus de""CD28.3 (10 μg/ml).
La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 1, 3, 6, et 8 jours, par incorporation de (3H) thymidine pendant une durée de 16 heures.
Les résultats sont illustrés par la Figure 5 :
Légende de la Figure 5 :
Axe des abscisses : temps de culture
Axe des ordonnées : indice de prolifération = IP cpm réaction mixte lymphocytaire - cpm cellules stimulatrices irradiées seules IP = cpm cellules répondeuses non stimulées
-*- : Fab anti-CD28.3
-X- : anti B7-2
-m- : CTLA-4 Ig
.. *.. :anti-B7-l+2
-A- : anti-B7-l
-O- : pas d'anticorps TSST-1 induit une prolifération importante des cellules T CD4+. En présence d'anti-B7, de CTLA4Ig, ou des fragments Fab de CD28.3, on observe une inhibition de cette prolifération de 70% après 6 jours. Effet des fragments Fab issus de CD28.3 sur la production de cytokines .
Afin de déterminer si les fragments Fab issus de CD28.3 pouvaient induire une déviation immune in vi tro, une réaction lymphocytaire mixte (PBMC issues d'un donneur A/ PBMC irradiées issues d'un donneur B) a été effectuée, en présence de fragments Fab issus de CD28.3. 105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un donneur sont mélangées avec 105 cellules mononucléées allogéniques irradiées à 35 Gy, et cultivées pendant 5 jours en présence ou en l'absence de 10 μg/ml de Fab issus de l'anticorps CD28.3.
L'ARN des cellules répondeuses a été extrait, et la quantité d'ARNm de cytokines a été évaluée par mesure quantitative du nombre de transcrits, rapportée à la quantité d'HPRT, à l'aide d'un TaqMan (Perkin Helmer) . On observe en présence de fragments Fab issus de
CD28.3., une réduction de la production d' IFNγ et d'IL2, et une augmentation de la production d'ILlO. Cette déviation de la réponse immune suggère une orientation cers une réponse de type Th2. Ce résultat est inattendu dans la mesure où il a été rapporté que l'engagement de CTLA4 (qui est supposé intervenir lors du blocage de CD28 seul) conduit' à une réponse de type Thl.
Traitement in vitro de l'anticorps CD28.3 et des fragments Fab issus de celui-ci par les cellules T humaines. Une éventuelle internalisation des fragments Fab de l'anticorps CD28.3 dans les cellules T humaines a été recherchée, en comparaison avec l'anticorps entier CD28.3.
Des cellules T Jurkatt ont été incubées en milieu de culture avec 100 μg/ml d'anticorps CD28.3, à ,37°C ou à 0°C. A différents temps, les cellules ont été lavées avec du tampon PBS froid contenant 0,1% de sérum-albumine bovine, et du NaN3, afin de bloquer la motilité membranaire. Les anticorps liés ont été révélés avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris, marqué à la fluorescéine. Les cellules ont été montées dans du MOVIOL et analysées par microscopie confocale. On observe ainsi que les anticorps CD28.3 entiers se liant aux cellules T Jurkatt sont capturés et disparaissent de la surface cellulaire à 37°C, mais pas à 0°C. Au contraire, les fragments Fab restent fixés en surface de la cellule. Ceci indique que la fixation des anticorps divalents CD28.3 entraîne la dimérisation de CD28, ce qui conduit à leur entrée dans la cellule, alors que les fragments monovalents Fab, qui n'induisent pas cette dimérisation, demeurent en surface. EXEMPLE 2 : PROPRIETES D'UN FRAGMENT scFv DERIVE DE L'ANTICORPS CD28.3.
La Figure 1 représente la séquence nucléotidique et la séquence polypeptidique déduite d'un fragment scFv dérivé de l'anticorps CD28.3. Les portions de cette séquence correspondant au fragment variable de la chaîne lourde et de la chaîne légère sont représentés en lettres capitales. La séquence correspondant au fragment variable de la chaîne légère est en outre souligné. La séquence du lieur est représentée en lettres minuscules. Les séquences des CDRs de la chaîne lourde et de la chaîne légère sont encadrées. La séquence nucléotidique codant ce fragment scFv est également représentée dans la liste de séquences en annexe, sous le numéro SEQ ID NO:°l.
L'ADNc codant ce fragment scFv a été inséré dans le vecteur pIG6 (Biochemisches Institut, Universitât Zurich) . Ce vecteur comprend notamment un marqueur de résistance à 1' ampicilline, et une cassette d'expression qui comprend un promoteur lac inductible, sous contrôle duquel sont placés : une séquence codant un peptide signal ompA, une séquence codant un peptide marqueur de séquence (code 1 lettre) DYKD, une séquence codant un peptide marqueur c-myc, et une séquence codant un marqueur polyhistidine-5. L'ADNc codant le fragment scFv décrit ci-dessus a été introduit entre les sites EcoRI et EcoRV de pIG6, en aval de la séquence codant le peptide DYKD et en amont de la séquence codant le marqueur c-myc. La construction obtenue est dénommée pIg6-28.3.
Production en cellules procaryotes
Le vecteur pIg6-28.3 a été utilisé pour transformer des cellules E. coli JM83. Les cellules sont cultivées à 25°C, jusqu'à une DO550 de 0,5. Après induction par l'IPTG, le fragment scFv est produit sous forme soluble dans le périplasme. Il apparaît après électrophorèse et transfert de Western, sous forme d'une bande à environ 30 kDa.
Il est purifié à partir des extraits periplasmiques des bactéries, obtenus après choc osmotique en 50 mM Tris-Ci, et ultracentrifugation du matériel insoluble, par chromarographie sur matrice de NI-NTA et échange d' ions sur DEAE-sépharose.
La liaison des fragments scFv présents dans l'éluat de la colonne de NiNTA à des cellules Jurkat CD28+ est comparable à celle obtenue avec des fragments Fab obtenus à partir de l'anticorps CD28.3 par digestion à la papaïne.
Production en cellules eucaryotes
Le vecteur pSec-28.3 a été utilisé pour transfecter des cellules Cos. Les cellules sont cultivées à
37 °C pendant 3 jours. Le fragment scFv est produit sous forme soluble dans le surnageant. Ce surnageant inhibite la réaction mixte lymphocytaire :105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un donneur sain sont mélangées avec 105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un autre donneur sain allogénique. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 5 jours par incorporation de (3H) Thymidine pendant une durée de 16 heures. On observe une inhibition importante de l'incorporation dépendant de la dilution du surnageant utilisée. Un surnageant contrôle ne présente pas d'activité inhibitrice de la prolifération. EXEMPLE 3 : OBTENTION D'UNE PROTEINE DE FUSION COMPRENANT UN FRAGMENT scFv DE CD28.3.
La séquence nucléotidique codant le fragment scFv décrit à l'Exemple 2 a été liée à l'extrémité 5' d'une portion de l'ADNc de l' αl-antitrypsine humaine (numéro d'accès GENBANK K01396) correspondant aux acides aminés 53 à 425, par l'intermédiaire d'un peptide charnière, de séquence VAAPS. La séquence résultante est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 3, et le polypeptide correspondant sous le numéro SEQ ID NO: 4.
EXEMPLE 4 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION COMPRENANT LA SEQUENCE CODANT POUR L'α-1 ANTITRYPSINE ET PERMETTANT L'INTRODUCTION D'UNE SEQUENCE CODANT UN FRAGMENT scFv
Vecteur d' expression procaryote : Le vecteur pIG6 a été utilisé (Biochemisches
Institut, Universitât Zurich) . Ce vecteur comprend notamment un marqueur de résistance à luote ampicilline, et une cassette d'expression qui comprend un promoteur lac inductible, sous contrôle duquel sont placés : une séquence codant un peptide signal ompA, une séquence codant un peptide marqueur de séquence (code 1 lettre) DYKD, une séquence codant un peptide marqueur c-myc, et une séquence codant un marqueur polyhistidine-5.
L'ADNc codant un fragment d' αl-antitrypsine humaine correspondant aux acides aminés 53 à 425, a été introduit entre les sites EcoRI et EcoRV de pIG6, en aval de la séquence codant le peptide DYKD et en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.
La Figure 1 schématise la construction obtenue, dénommée pIg6-Haat.
Vecteur d' expression eucaryote :
Le vecteur pSECTagB (Invitrogen, De Schelp, Pays
Bas) a été utilisé. Ce vecteur comprend notamment un marqueur de résistance à l' ampicilline, un marqueur de résistance à la zéocine, et une cassette d'expression qui comprend un promoteur CMV, sous contrôle duquel sont placés : une séquence codant un peptide signal de la chaîne légère IgG Kappa, une séquence codant un peptide marqueur c-myc, et une séquence codant un marqueur polyhistidine-6.
L'ADNc codant un fragment d' αl-antitrypsine humaine correspondant aux acides aminés 53 à 425, a été introduit entre les sites BamHI et EcoRI du vecteur
PSEC B Tag, en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.
La Figure 2 schématise la construction obtenue, dénommée pSecHaat . EXEMPLE 5 : CONSTRUCTION DE VECTEURS D'EXPRESSION INTEGRANT LA SEQUENCE CODANT LA PROTEINE DE FUSION scFv CD28.3/αl- ANTITRYPSINE
Vecteur d' expression procaryote :
L'ADNc codant la protéine de fusion ScFv CD28.3/αl-antitrypsine décrite à l'exemple 3 ci-dessus a été introduit entre les sites EcoRI et Xhol de pIG6, en aval de la séquence codant le peptide DYKD et en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.
La Figure 3 schématise la construction obtenue, dénommée pIg6-28.3Haat .
Vecteur d' expression eucaryote :
L'ADNc codant la protéine de fusion ScFv
CD28.3/αl-antitrypsine décrite à l'exemple 3 ci-dessus a été introduit entre les sites BamHI et Xhol du vecteur PSEC B Tag, en amont de la séquence codant le marqueur c-myc.
La Figure 4 schématise la construction obtenue, dénommée pSec-28.3Haat .
Ce vecteur, hébergé dans E. coli DH5α, a été déposé le 11 décembre 2001 auprès de la CNCM, sous le numéro 1-2762.
EXEMPLE 6 : EXPRESSION ET PURIFICATION DES PROTEINES DE FUSION
En cellules procaryotes :
Le vecteur pIg6-28.3Haat a été utilisé pour transformer des cellules E. coli JM83. Les cellules sont cultivées à 25°C,' jusqu'à une DO550 de 0,5. Après induction par l'IPTG, la protéine est produite sous forme soluble dans le périplasme. Elle apparaît après électrophorèse et transfert de Western, sous forme d'une bande à environ 74 kDa. Elle peut être purifiée à partir des extraits periplasmiques en utilisant une matrice de chromatographie d'affinité NI-NTA, et/ou une matrice de chromatographie d'affinité anti-c-myc. Elle peut également être purifiée à partir d'une colonne d'affinité anti-αl-antitrypsine. En cellules eucaryotes :
Le vecteur pSec-28.3Haat a été utilisé pour transfecter des cellules CHO par lipofection. Les cellules sont cultivées en présence de 200 μg/ml de zéocine en milieu MEM contenant 10% de sérum de veau foetal. La protéine est sécrétée dans le milieu de culture.
Après séparation par électrophorèse, transfert de Western, et révélation par un anticorps anti-c-myc elle apparaît sous forme d'une bande à environ 80 kDa. EXEMPLE 7 : TESTS D'ACTIVITE D'UNE PROTEINE DE FUSION scFv /αl-ANTITRYPSINE
L'activité anti-CD28 de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine obtenue à l'exemple 6 ci-dessus est évaluée par sa liaison à la molécule CD28, ou à des cellules exprimant CD28 sur leur membrane, et son absence de liaison à des cellules qui n'expriment pas CD28.
L'activité immunosuppressive de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine obtenue à l'exemple 6 ci- dessus est évaluée par l'inhibition de l'adhésion à B7, et l'inhibition de l' activation induite du lymphocyte T.
Ces activités anti-CD28 et immunosuppressive ont été mesurées par les tests suivants : Activité anti CD28
Mesure au biosenseur des paramètres de liaison à CD28: Du CD28 humain recombinant a été immobilisé sur le détecteur du biosenseur (BIACORE) . Une protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine obtenue comme décrit à l'exemple 6 ci-dessus a été mise en contact avec le détecteur. Les paramètres de liaison sont : KA (1/M)2.86e9 ; KD (M) : 3.49e- 10. En comparaison, ces paramètres mesurés pour le fragment Fab de l'anticorps CD28.3 sont : KA (1/M) : 9.69e8 ; KD (M) : 1.03e-9. L'affinité pour CD28 du fragment Fab de l'anticorps CD28.3 et de la protéine de fusion sont donc comparables.
Test de reconnaissance spécifique de CD28 en cytofluorométrie : 105 cellules Jurkat (CD28+) et U937 (CD28-) sont incubées en PBS-BSA l%-NaN3 0,1% à 4°C pendant 1 heure avec des concentrations croissantes de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine. Après lavage, les cellules sont incubées avec un anticorps de lapin anti-alpha-1- antitrypsine, puis avec un anticorps de chèvre anti-lapin conjugué à la FITC, lavées, et analysées en cytofluorométrie . On observe une liaison dépendante de la dose sur les cellules Jurkat (CD28+) et pas de liaison sur les cellules U937 (CD28-) . Ceci montre la spécificité de la protéine de fusion pour la molécule CD28 et son absence de réactivité envers d'autres molécules exprimées par des cellules hématopoïétiques humaines. Activité immunosuppressive
Test d'adhésion CD28/B7-dépendant : 4 x 105 cellules humaines T (Jurkatt, CD28- positives) marquées au 51Cr sont incubées pendant 2 heures dans une plaque de microtitration dans laquelle 105 cellules adhérentes LTK" ou LB7+ (fibroblastes murins transfectés avec B7.1 humain [PAGES et al., J. Biol. Chem. , 271, 9403 (1996)] ont été ensemencées 24 heures auparavant. Ces incubations sont réalisées en absence ou en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine, diluée à différentes concentrations dans du tampon PBS sans Ca2+ ni Mg2+. Les cellules adhérentes après lavages sont quantifiées par lecture de la radioactivité résiduelle au compteur beta (PACKARD TOPCOUNT) . On observe une inhibition de l'adhésion en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl- antitrypsine, inhibition directement dépendante de la dose de protéine de fusion utilisée.
Inhibition de l' activation :
5 x 104 cellules T (polyclonales humaines, déplétées en cellules CDllb) sont stimulées avec 1 x 104 cellules d'hydridome OKT3 (anti-CD3) irradiées, ou avec des cellules B CD28" allogéniques (déplétées en cellules CD28+) en absence ou en présence de quantités variables de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 3 jours lorsque la stimulation est effectuée par des anti-CD3, ou après 7 jours lorsque la stimulation est effectuée par des cellules allogéniques, par incorporation de (3H) Thymidine pendant une durée de 16 heures. On observe une inhibition importante de l'incorporation en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine, inhibition directement dépendante de la dose de protéine de fusion utilisée.
Inhibition de la réaction mixte lymphocytaire :
105 cellules mononucléées du sang périphérique d'un donneur sain sont mélangées avec 105 cellules mononucléées du sang périphérique de un autre donneur sain allogénique. La réponse proliférative dans ces cultures est évaluée après 5 jours par incorporation de (3H) Thymidine pendant une durée de 16 heures. On observe une inhibition importante de l'incorporation en présence de la protéine de fusion scFv CD28.3/αl-antitrypsine, inhibition directement dépendante de la dose de protéine de fusion utilisée.

Claims

REVENDICATIONS
1) Protéine capable de se lier spécifiquement au récepteur lymphocytaire CD28 et de bloquer l'interaction CD28/B7, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins les CDRs de la chaîne lourde et de la chaîne légère de 1' immunoglobuline CD28.3, produite par l'hybridome CNCM 1-2582.
2) Protéine selon la revendication 1, choisie parmi : a) l'anticorps CD28.3 produit par l'hybridome
CNCM 1-2582 ; b) les fragments Fv, Fab, Fab' 2 ou scFv de l'anticorps CD28.3 ; c) les anticorps chimériques ou humanisés obtenus à partir des régions variables de CD28.3 ; d) les fragments Fv, Fab, Fab' 2 ou scFv, d'un anticorps b) ; e) les protéines recombinantes comprenant un fragment b) ou d) et un polypeptide hétérologue. 3) Molécule d'acide nucléique codant une protéine selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
4) Vecteur d'expression, comprenant une molécule d'acide nucléique selon la revendication 3.
5) Vecteur d'expression selon la revendication 4, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide CNCM 1-2762.
6) Cellule exprimant une protéine selon une quelconque des revendications 1 ou 2.
7) Cellule selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit de l'hybridome CNCM 1-2582. 8) Cellule selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule transformée par une molécule d'acide nucléique selon la revendication 3.
9) Procédé de préparation d'une protéine selon une quelconque des revendications 1 ou 2 , caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'au moins une cellule selon une quelconque des revendications 6 à 8, et la récupération de ladite protéine à partir de ladite culture. 10) Utilisation d'une protéine selon une quelconque des revendications 1 ou 2, pour l'obtention d'un médicament.
11) Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que ladite protéine possède un seul site de liaison au récepteur CD28, et en ce que ledit médicament est un immunosuppresseur, bloquant sélectivement l' activation des cellules T par l'intermédiaire du récepteur CD-28.
12) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que ledit médicament est destiné au traitement d'une pathologie choisie parmi le rejet de greffe, la maladie du greffon contre l'hôte, les maladies auto- immunes à médiation lymphocytaire T, les phénomènes allergiques, les maladies inflammatoires chroniques.
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