JP3414397B2 - Ｉｃａｍｓ免疫グロブリン定常領域の可溶性融合蛋白 - Google Patents
Ｉｃａｍｓ免疫グロブリン定常領域の可溶性融合蛋白Info
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Description
【発明の詳細な説明】
発明の技術分野
本発明は、CD11a/CD18に対して結合特異性を有する領
域と、免疫グロブリン定常領域に該当する領域とを有す
る可溶性融合分子、例えば、ICAM−２の細胞外CD11a/Cd
18結合領域と、IgGの定常領域とを含む組換え分子に関
する。本発明の分子は、さらに、Ｔ細胞の応答および活
性に影響を与える方法にも利用される。
域と、免疫グロブリン定常領域に該当する領域とを有す
る可溶性融合分子、例えば、ICAM−２の細胞外CD11a/Cd
18結合領域と、IgGの定常領域とを含む組換え分子に関
する。本発明の分子は、さらに、Ｔ細胞の応答および活
性に影響を与える方法にも利用される。
発明の背景
Ｔ細胞表面のCD3/TCR（Ｔ細胞抗原受容体）複合体
は、抗原提示細胞（APC）表面に発現されている自己の
主要組織適合（MHC）分子の関係から非自己抗原（Ag）
を認識するだけでなく、Ｔ細胞の活性化を開始させるシ
グナルのトランス誘導に関与する（H.Cleversら、（198
8）Ann.Rev.Immuno.６:629）。APC上のCD3/TCRとAg/MHC
との間の相互作用は、Ｔ細胞の活性化を開始させるため
に必須であるが、通常は十分ではなく、さらに付加的な
細胞表面分子（これは、活性化Ｔ細胞の様々な機能の最
適発現のために粘着および／またはシグナルのトランス
誘導を仲介する）の参加を必要とする（H.Cleversら、
（1988）Ann.Rev.Immuno.６:629;T.A.Springer（1990）
Nature 346:425;G.Moller（1990）Immunol.Rev.114:1−
217）。
は、抗原提示細胞（APC）表面に発現されている自己の
主要組織適合（MHC）分子の関係から非自己抗原（Ag）
を認識するだけでなく、Ｔ細胞の活性化を開始させるシ
グナルのトランス誘導に関与する（H.Cleversら、（198
8）Ann.Rev.Immuno.６:629）。APC上のCD3/TCRとAg/MHC
との間の相互作用は、Ｔ細胞の活性化を開始させるため
に必須であるが、通常は十分ではなく、さらに付加的な
細胞表面分子（これは、活性化Ｔ細胞の様々な機能の最
適発現のために粘着および／またはシグナルのトランス
誘導を仲介する）の参加を必要とする（H.Cleversら、
（1988）Ann.Rev.Immuno.６:629;T.A.Springer（1990）
Nature 346:425;G.Moller（1990）Immunol.Rev.114:1−
217）。
全ての成熟白血球の表面に発現される白血球粘着分子
LFA−１（CD11a/CD18）は、そのリガンドである、細胞
間粘着分子−１（ICAM−1/CD54）との相互作用によっ
て、免疫応答および炎症時に、他の体細胞との広範囲の
相互作用を仲介する（T.A.Springer（1990）Nature 34
6:425;G.Moller（1990）Immunol.Rev.114:217;T.K.Kish
imotoら、（1989）Adv.Immunol.46:149;S.D.Marlinら、
（1987）Cell 51:813;M.W.Makgobaら、（1988）Nature
331:86;D.E.Stauntonら、（1988）Cell 52:925;D.Simmo
nsら、（1988）Nature 331:624;D.E.Stauntonら、（199
0）Cell 61:243;A.W.Boydら、（1988）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 85:3095;G.Doughertyら、（1988）Eur.J.Immun
ol.18:35;D.M.Altmannら、（1989）Nature 338:512）。
ICAM−１は構成成分として幾つかの組織で発現され、さ
らに、炎症時に他の組織で誘発される（M.L.Dustinら、
（1986）J.Immunol.137:245）。ICAM−１は、休止Ｔ細
胞のCD3/TCR仲介活性化の間、LFA−１との粘着相互作用
を介して重要な補助的刺激（costimulatory）シグナル
を提供する（G.A.Van Seventerら、（1990）J.Immunol.
144:4579）。最近、LFA−１のためのまた別のリガンド
である、ICAM−２が同定され、これは、LFA−1+細胞のI
CAM−１非依存性粘着を仲介することができる（D.E.Sta
untonら、（1989）Nature 339:61;N.L.Dustinら、（198
9）Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54:753）。IC
AM−２の発現は制限されており、前炎症刺激による上昇
調節は容易ではない（A.R.De Fougerollesら、（1991）
J.Exp.Med.174:253;P.Nortamoら、（1991）J.Immunol.1
46:2530）。本発明では、可溶性の組換えICAM−１およ
びICAM−２免疫グロブリン融合蛋白を作り出し、種々の
免疫応答を引き起こす細胞相互作用におけるこれら分子
の役割の分析および比較を行った。本発明は、その相同
体ICAM−１同様、ICAM−２は、CD4+T細胞のTCR仲介活性
化時に、重要な補助的刺激シグナルを提供することがで
きる。LFA−1:ICAM−２相互作用によって仲介されるこ
の補助的刺激粘着は、ICAM−1-またはICAM−1lowICAM−
2+APCによるＴ細胞活性化の開始のための重要な経路を
提供するかもしれない。
LFA−１（CD11a/CD18）は、そのリガンドである、細胞
間粘着分子−１（ICAM−1/CD54）との相互作用によっ
て、免疫応答および炎症時に、他の体細胞との広範囲の
相互作用を仲介する（T.A.Springer（1990）Nature 34
6:425;G.Moller（1990）Immunol.Rev.114:217;T.K.Kish
imotoら、（1989）Adv.Immunol.46:149;S.D.Marlinら、
（1987）Cell 51:813;M.W.Makgobaら、（1988）Nature
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nsら、（1988）Nature 331:624;D.E.Stauntonら、（199
0）Cell 61:243;A.W.Boydら、（1988）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 85:3095;G.Doughertyら、（1988）Eur.J.Immun
ol.18:35;D.M.Altmannら、（1989）Nature 338:512）。
ICAM−１は構成成分として幾つかの組織で発現され、さ
らに、炎症時に他の組織で誘発される（M.L.Dustinら、
（1986）J.Immunol.137:245）。ICAM−１は、休止Ｔ細
胞のCD3/TCR仲介活性化の間、LFA−１との粘着相互作用
を介して重要な補助的刺激（costimulatory）シグナル
を提供する（G.A.Van Seventerら、（1990）J.Immunol.
144:4579）。最近、LFA−１のためのまた別のリガンド
である、ICAM−２が同定され、これは、LFA−1+細胞のI
CAM−１非依存性粘着を仲介することができる（D.E.Sta
untonら、（1989）Nature 339:61;N.L.Dustinら、（198
9）Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54:753）。IC
AM−２の発現は制限されており、前炎症刺激による上昇
調節は容易ではない（A.R.De Fougerollesら、（1991）
J.Exp.Med.174:253;P.Nortamoら、（1991）J.Immunol.1
46:2530）。本発明では、可溶性の組換えICAM−１およ
びICAM−２免疫グロブリン融合蛋白を作り出し、種々の
免疫応答を引き起こす細胞相互作用におけるこれら分子
の役割の分析および比較を行った。本発明は、その相同
体ICAM−１同様、ICAM−２は、CD4+T細胞のTCR仲介活性
化時に、重要な補助的刺激シグナルを提供することがで
きる。LFA−1:ICAM−２相互作用によって仲介されるこ
の補助的刺激粘着は、ICAM−1-またはICAM−1lowICAM−
2+APCによるＴ細胞活性化の開始のための重要な経路を
提供するかもしれない。
発明の要旨
本発明は可溶性融合分子および使用方法に関する。こ
れらの融合分子は、CD11a/CD18に対して結合特異性を有
する領域を含む。この領域は、実質的に免疫グロブリン
の定常領域に該当する第二の領域に機能しうるように連
結、または結合させられる。CD11a/CD18に結合特異性を
有する幾つかの粘着分子が知られている。これらの分子
の多くは、細胞膜結合性で、したがって不溶性であっ
て、ICAM−１およびICAM−２を含む。
れらの融合分子は、CD11a/CD18に対して結合特異性を有
する領域を含む。この領域は、実質的に免疫グロブリン
の定常領域に該当する第二の領域に機能しうるように連
結、または結合させられる。CD11a/CD18に結合特異性を
有する幾つかの粘着分子が知られている。これらの分子
の多くは、細胞膜結合性で、したがって不溶性であっ
て、ICAM−１およびICAM−２を含む。
本発明では、CD11a/CD18に対する結合特異性を保持し
ているこのような粘着分子の可溶性、細胞外部分を利用
する。この細胞外領域はIg定常領域、例えばIgGまたはI
gM定常領域に結合している。本発明の融合分子の一例
は、実質的にICAM−２の細胞外部分に該当する１つの領
域および、実質的にIgG定常領域部分に該当する第二の
領域を有する蛋白である。本発明の分子は、化学合成ま
たは組換え発現のいずれかによって製造できる。
ているこのような粘着分子の可溶性、細胞外部分を利用
する。この細胞外領域はIg定常領域、例えばIgGまたはI
gM定常領域に結合している。本発明の融合分子の一例
は、実質的にICAM−２の細胞外部分に該当する１つの領
域および、実質的にIgG定常領域部分に該当する第二の
領域を有する蛋白である。本発明の分子は、化学合成ま
たは組換え発現のいずれかによって製造できる。
組換え融合分子を利用する場合、それは標準的な遺伝
子クローニング技術によって製造できる。例えば、ICAM
−２およびIgG定常領域の特定の組換え融合分子は、ま
ずICAM−２の細胞外部分をコードするCD11a/CD18をIgG
発現ベクターでサブクローニングすることによって製造
することができる。続いてこのクローニングしたDNAを
転写し、さらに融合分子を発現させることができる。そ
の後、該発現蛋白を分離し、IgG定常領域に機能しうる
ように連結したICAM−２の細胞外部分を含む組換え融合
分子を得る。
子クローニング技術によって製造できる。例えば、ICAM
−２およびIgG定常領域の特定の組換え融合分子は、ま
ずICAM−２の細胞外部分をコードするCD11a/CD18をIgG
発現ベクターでサブクローニングすることによって製造
することができる。続いてこのクローニングしたDNAを
転写し、さらに融合分子を発現させることができる。そ
の後、該発現蛋白を分離し、IgG定常領域に機能しうる
ように連結したICAM−２の細胞外部分を含む組換え融合
分子を得る。
本発明の融合分子は、Ｔ細胞活性化のための補助的刺
激物質として、さらに、CD4+T細胞の増殖反応およびＴ
細胞によるIL−２の誘発を増加させる方法において利用
することができる。本発明の方法によれば、Ｔ細胞は、
そのＴ細胞に、Ｔ細胞上のCD3に結合することができる
リガンドと、補助的刺激に有効な量の本発明の融合分子
とを接触させることによって、活性化することができ
る。Ｔ細胞増殖およびIL−２誘発は、本発明では、細胞
増殖およびIL−２誘発にそれぞれ十分な時間、本発明の
融合分子と感受性Ｔ細胞を接触させることによって刺激
することができる。
激物質として、さらに、CD4+T細胞の増殖反応およびＴ
細胞によるIL−２の誘発を増加させる方法において利用
することができる。本発明の方法によれば、Ｔ細胞は、
そのＴ細胞に、Ｔ細胞上のCD3に結合することができる
リガンドと、補助的刺激に有効な量の本発明の融合分子
とを接触させることによって、活性化することができ
る。Ｔ細胞増殖およびIL−２誘発は、本発明では、細胞
増殖およびIL−２誘発にそれぞれ十分な時間、本発明の
融合分子と感受性Ｔ細胞を接触させることによって刺激
することができる。
図面の説明
図１は、可溶性ICAMRg融合遺伝子を示す。抗体エクソ
ン（ヒトIgG1）は黒四角で表され、イントロンは連結線
で表されている。Ｈ、CH2およびCH3は、それぞれIgG1の
蝶番部分（ヒンジ）である、CH2およびCH3は定常領域エ
クソンを表し、ICAM−１のＮ−末端シグナル配列（SS）
およびIg様ドメイン（D1−D5）は点刻を付した四角で示
されている。ICAM−２のＮ−末端SSおよびIg様ドメイン
（D1およびD2）は斜線入り四角で表されている。CD31の
Ｎ−末端SSおよびIg様（D1−D7）ドメインは白四角で示
されている。
ン（ヒトIgG1）は黒四角で表され、イントロンは連結線
で表されている。Ｈ、CH2およびCH3は、それぞれIgG1の
蝶番部分（ヒンジ）である、CH2およびCH3は定常領域エ
クソンを表し、ICAM−１のＮ−末端シグナル配列（SS）
およびIg様ドメイン（D1−D5）は点刻を付した四角で示
されている。ICAM−２のＮ−末端SSおよびIg様ドメイン
（D1およびD2）は斜線入り四角で表されている。CD31の
Ｎ−末端SSおよびIg様（D1−D7）ドメインは白四角で示
されている。
図２は、抗TCR−１で同時固定したCD7、ICAM−１また
はICAM−2RgのCD4+T細胞の増殖刺激能を表す。５万個の
休止CD4+T細胞を、固定したCD7Rg、ICAM−1.5RgまたはI
CAM−2Rg（100ng/ウェル）および、抗CD19または抗TCR
−1mAb（50ng/ウェル）のいずれかとともに、マイクロ
タイター当たり最終容量0.2mlの完全培地中で培養し
た。これら培養における3H−TdRの取り込みを４日目に
測定した。
はICAM−2RgのCD4+T細胞の増殖刺激能を表す。５万個の
休止CD4+T細胞を、固定したCD7Rg、ICAM−1.5RgまたはI
CAM−2Rg（100ng/ウェル）および、抗CD19または抗TCR
−1mAb（50ng/ウェル）のいずれかとともに、マイクロ
タイター当たり最終容量0.2mlの完全培地中で培養し
た。これら培養における3H−TdRの取り込みを４日目に
測定した。
図３は、ICAM−１およびICAM−2Rgの補助的刺激効果
の動態を表している。５万個の休止CD4+T細胞を、100ng
/ウェルのELAM−1Rg（コントロール）、ICAM−1Rgまた
はICAM−2Rgのともに固定した抗TCR−1mAbと培養した。
こららの培養における増殖反応を表示した時間で測定し
た。
の動態を表している。５万個の休止CD4+T細胞を、100ng
/ウェルのELAM−1Rg（コントロール）、ICAM−1Rgまた
はICAM−2Rgのともに固定した抗TCR−1mAbと培養した。
こららの培養における増殖反応を表示した時間で測定し
た。
図４は、ICAM−１およびICAM−2Rgの補助的刺激効果
の濃度依存性を表す。種々の濃度のICAM−1.2、ICAM−
1.4またはICAM−2Rgを、ウェル当たり５万個の休止CD4+
T細胞を加える前に、抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）とと
ともに固定した。これらの培養の増殖反応を４日目に測
定した。
の濃度依存性を表す。種々の濃度のICAM−1.2、ICAM−
1.4またはICAM−2Rgを、ウェル当たり５万個の休止CD4+
T細胞を加える前に、抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）とと
ともに固定した。これらの培養の増殖反応を４日目に測
定した。
図５は、種々のICAMRgの補助的刺激活性の比較を示
す。抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）を、ウェル当たり５万
個の休止CD4+T細胞を加える前に、100ng/ウェルのCD7R
g、CD31、ELAM−１、ICAM−1.2、ICAM−1.4、ICAM−２
またはICAM−2:CD31Rgとともに固定した。これらの培養
を増殖反応を４日目に測定した。
す。抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）を、ウェル当たり５万
個の休止CD4+T細胞を加える前に、100ng/ウェルのCD7R
g、CD31、ELAM−１、ICAM−1.2、ICAM−1.4、ICAM−２
またはICAM−2:CD31Rgとともに固定した。これらの培養
を増殖反応を４日目に測定した。
図６は、ICAM−2Rgはまた、Ag活性化CD4+T細胞の増殖
を補助的に刺激できることを示している。マイクロタイ
ター培養ウェルで抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）を、100n
g/ウェルのICAM−1.4RgまたはICAM−２のいずれかとと
もに、または、非存在下で固定した。５万個の休止CD4+
T細胞（異なる葡萄球菌性外毒素で刺激した培養に由
来）をこれらの培養ウェルに加え、その増殖反応を３日
目に測定した。
を補助的に刺激できることを示している。マイクロタイ
ター培養ウェルで抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）を、100n
g/ウェルのICAM−1.4RgまたはICAM−２のいずれかとと
もに、または、非存在下で固定した。５万個の休止CD4+
T細胞（異なる葡萄球菌性外毒素で刺激した培養に由
来）をこれらの培養ウェルに加え、その増殖反応を３日
目に測定した。
図７は、ICAMRgとの補助的刺激によるCD4+T細胞表面
のCD25/IL−2Rαの誘導を示す。休止CD25−CD+T細胞
を、ELAM−１とともに（コントロール）、またはICAM−
1.2、ICAM−1.4、ICAM−2Rg（100ng/ウェル）とともに
固定した抗TCR−１（50ng/ウェル）と培養した。60時間
後、これらの培養からＴ細胞を採集し、直接免疫蛍光分
析によってCD25の発現について調べた。
のCD25/IL−2Rαの誘導を示す。休止CD25−CD+T細胞
を、ELAM−１とともに（コントロール）、またはICAM−
1.2、ICAM−1.4、ICAM−2Rg（100ng/ウェル）とともに
固定した抗TCR−１（50ng/ウェル）と培養した。60時間
後、これらの培養からＴ細胞を採集し、直接免疫蛍光分
析によってCD25の発現について調べた。
図８は、ICAM−２の補助的刺激効果は、Ｔ細胞上のCD
11a/CD18（LAF−１）複合体の参入を必要とするという
ことを表している。５万個のCD4+T細胞を、CD11a、CD11
a、CD18、CD19またはICAM−１と反応する可溶性mAb（10
μg/ml）の存在下で、ICAM−1.4またはICAM−2Rgととも
に固定した抗TCR−１と培養した。これらの培養におけ
る増殖反応を４日目に測定した。
11a/CD18（LAF−１）複合体の参入を必要とするという
ことを表している。５万個のCD4+T細胞を、CD11a、CD11
a、CD18、CD19またはICAM−１と反応する可溶性mAb（10
μg/ml）の存在下で、ICAM−1.4またはICAM−2Rgととも
に固定した抗TCR−１と培養した。これらの培養におけ
る増殖反応を４日目に測定した。
好ましい具体例の説明
Ｔ細胞の活性化は、しばしば、TCRの結合によっても
たらされるシグナルと、特定のＴ細胞表面の付属分子と
APC上のそれらに対応するリガンドとの間の補助的刺激
相互反応の結果生じるシグナルの両方を必要とする。Ｔ
細胞上のLFA−１は、APCのそのリガンドICAM−１および
／またはICAM−２との相互反応によって、Ｔ細胞の活性
化を調節する。ICAM−１の補助的刺激能はすでに実証さ
れた。ここでは、可溶性ICAM−２免疫グロブリン融合蛋
白（レセプターグロブリン、Rg）を、CD4+T細胞活性化
時のICAM−２の補助的刺激効果を証明するために用い
る。抗TCR−1mAbとともに固定されたとき、ICAM−2Rg
は、CD4+T細胞の激しい増殖反応を誘発した。ICAM−２
のこの補助的刺激効果は、CD3/TCR複合体に対するmAbと
の同時固定化に依存し、CD2またはCD28に対するmAbとの
同時固定化には左右されなかった。休止細胞も抗原初期
化（antigen−primed）CD4+T細胞と同様、ICAM−２の補
助的刺激効果に反応した。CD11aまたはCD18分子に対す
るmAbの添加は、ICAM−2Rgに対する反応を殆ど完全に抑
制した。これらの結果は、ICAM−２の補助的刺激効果の
ためのレセプターとして、さらに仲介物質としてのLFA
−１複合体の役割と一致する。同時固定化した抗TCR−
１とICAM−２とを有するＴ細胞の刺激はIL−２レセプタ
ー（CD25）の誘発をもたらし、抗Tac（CD25）mAbはこの
反応を抑制するが、このことは、この刺激の間に内因的
に合成されたIL−２の寄与を示唆している。これらの結
果は、その相同物であるICAM−１、ICAM−２もまた、Ｔ
細胞のTCR仲介活性化時の強力な補助的刺激効果を発揮
することを示している。LFA−1:ICAM−２相互作用によ
って発生する補助的刺激効果は、ICAM−1lowAPCによる
Ｔ細胞活性化の開始時に非常に重要であるかもしれな
い。
たらされるシグナルと、特定のＴ細胞表面の付属分子と
APC上のそれらに対応するリガンドとの間の補助的刺激
相互反応の結果生じるシグナルの両方を必要とする。Ｔ
細胞上のLFA−１は、APCのそのリガンドICAM−１および
／またはICAM−２との相互反応によって、Ｔ細胞の活性
化を調節する。ICAM−１の補助的刺激能はすでに実証さ
れた。ここでは、可溶性ICAM−２免疫グロブリン融合蛋
白（レセプターグロブリン、Rg）を、CD4+T細胞活性化
時のICAM−２の補助的刺激効果を証明するために用い
る。抗TCR−1mAbとともに固定されたとき、ICAM−2Rg
は、CD4+T細胞の激しい増殖反応を誘発した。ICAM−２
のこの補助的刺激効果は、CD3/TCR複合体に対するmAbと
の同時固定化に依存し、CD2またはCD28に対するmAbとの
同時固定化には左右されなかった。休止細胞も抗原初期
化（antigen−primed）CD4+T細胞と同様、ICAM−２の補
助的刺激効果に反応した。CD11aまたはCD18分子に対す
るmAbの添加は、ICAM−2Rgに対する反応を殆ど完全に抑
制した。これらの結果は、ICAM−２の補助的刺激効果の
ためのレセプターとして、さらに仲介物質としてのLFA
−１複合体の役割と一致する。同時固定化した抗TCR−
１とICAM−２とを有するＴ細胞の刺激はIL−２レセプタ
ー（CD25）の誘発をもたらし、抗Tac（CD25）mAbはこの
反応を抑制するが、このことは、この刺激の間に内因的
に合成されたIL−２の寄与を示唆している。これらの結
果は、その相同物であるICAM−１、ICAM−２もまた、Ｔ
細胞のTCR仲介活性化時の強力な補助的刺激効果を発揮
することを示している。LFA−1:ICAM−２相互作用によ
って発生する補助的刺激効果は、ICAM−1lowAPCによる
Ｔ細胞活性化の開始時に非常に重要であるかもしれな
い。
本発明およびその具体例をより明瞭に説明するため
に、以下の定義を含める。
に、以下の定義を含める。
“トランスフェクション”とは、本明細書で用いられ
ているように、添加されたDNAの真核細胞への取り込み
によって、新しい遺伝子マーカーが獲得されることであ
る。
ているように、添加されたDNAの真核細胞への取り込み
によって、新しい遺伝子マーカーが獲得されることであ
る。
“形質転換”とは、本明細書で用いられているよう
に、添加されたDNAの原核細胞への取り込みによって、
新しい遺伝子マーカーが獲得されることである。
に、添加されたDNAの原核細胞への取り込みによって、
新しい遺伝子マーカーが獲得されることである。
“クローニングベクター”とは、本明細書で用いられ
ているように、外来DNAがクローニングのためにその中
に挿入されているプラスミドまたはウイルスである。
ているように、外来DNAがクローニングのためにその中
に挿入されているプラスミドまたはウイルスである。
“プラスミド”とは、本明細書で用いられているよう
に、自律的自己増殖性の外来染色体性環状DNAである。
に、自律的自己増殖性の外来染色体性環状DNAである。
“開放読み枠”（ORF）とは、本明細書で用いられて
いるように、蛋白に（潜在的に）翻訳可能なDNA配列で
ある。
いるように、蛋白に（潜在的に）翻訳可能なDNA配列で
ある。
“遺伝子（シストロン）”とは、本明細書で用いられ
ているように、ペプチド鎖配列をコードするDNAセグメ
ントであるが、それは、該コード領域の前後の領域（リ
ーダーおよびトレイラー）の他にも、個々のコードセグ
メント（エクソン）間の介在配列（イントロン）も含む
ことができる。
ているように、ペプチド鎖配列をコードするDNAセグメ
ントであるが、それは、該コード領域の前後の領域（リ
ーダーおよびトレイラー）の他にも、個々のコードセグ
メント（エクソン）間の介在配列（イントロン）も含む
ことができる。
“発現”とは、本明細書で用いられているように、ペ
プチドまたは蛋白の産生のために構造遺伝子が受ける過
程である。それは転写と翻訳の組み合わせである。
プチドまたは蛋白の産生のために構造遺伝子が受ける過
程である。それは転写と翻訳の組み合わせである。
本明細書で用いられているように、“クローン”とい
う用語は、単一の先祖細胞または分子をもつ同一細胞ま
たは分子をいう。
う用語は、単一の先祖細胞または分子をもつ同一細胞ま
たは分子をいう。
本明細書で用いられているように、“塩基対”（bp）
という用語は、DNA二重螺旋におけるアデニン（Ａ）と
チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）
の組み合わせ関係である。
という用語は、DNA二重螺旋におけるアデニン（Ａ）と
チミン（Ｔ）、またはシトシン（Ｃ）とグアニン（Ｇ）
の組み合わせ関係である。
本明細書で用いられているように、“発現ベクター”
という用語は、外来DNAがその中に挿入されおよび／ま
たは発現されるプラスミドまたはウイルスである。発現
ベクターの実例は、CD8−IgG1蛋白を発現するもの（Aru
ffoら、（1990）Cell 61:1303−1313）およびCD4−IgG1
およびCD4−IgM蛋白を発現するもの（Zattlmeisslら、
（1990）DNA Cell Biol.９:347−353）を含む。
という用語は、外来DNAがその中に挿入されおよび／ま
たは発現されるプラスミドまたはウイルスである。発現
ベクターの実例は、CD8−IgG1蛋白を発現するもの（Aru
ffoら、（1990）Cell 61:1303−1313）およびCD4−IgG1
およびCD4−IgM蛋白を発現するもの（Zattlmeisslら、
（1990）DNA Cell Biol.９:347−353）を含む。
本明細書で用いられているように、“ポリメラーゼ・
チェーン・リアクション”（PCR）という用語は、耐熱
性DNAポリメラーゼの連続使用によるDNA分子の増幅を指
し、DNA鎖の複写、加熱による該相補鎖の分離、プライ
マーの添加さらにこの工程をおよそ30回繰り返し、およ
そ109コピーのDNAを製造する。PCR技術の使用によっ
て、微量のDNAを増幅することができ、種々の工程に使
用する十分量のDNAを製造できる。
チェーン・リアクション”（PCR）という用語は、耐熱
性DNAポリメラーゼの連続使用によるDNA分子の増幅を指
し、DNA鎖の複写、加熱による該相補鎖の分離、プライ
マーの添加さらにこの工程をおよそ30回繰り返し、およ
そ109コピーのDNAを製造する。PCR技術の使用によっ
て、微量のDNAを増幅することができ、種々の工程に使
用する十分量のDNAを製造できる。
本明細書で用いられているように、“合成”という用
語は、化学的手段によって構築されたペプチド分子を指
す。すなわち、生物学的手段、例えば遺伝子工学技術に
よるよりはむしろ化学的に合成されるものである。
語は、化学的手段によって構築されたペプチド分子を指
す。すなわち、生物学的手段、例えば遺伝子工学技術に
よるよりはむしろ化学的に合成されるものである。
本明細書で用いられているように、“有効量”という
用語は、所望の結果を有益にもたらすために十分な量を
意味する。
用語は、所望の結果を有益にもたらすために十分な量を
意味する。
“対応する”という用語は、ペプチドまたは蛋白配列
の関係で本明細書および請求の範囲において用いられて
いるように、そのアミノ末端またはカルボキシ末端の一
方または両方に10個までのアミノ酸残基の増減をもつ記
載の配列を指し、これは、該ペプチドおよび／または蛋
白配列の特定のアミノ酸残基において保存的置換のみを
含む。
の関係で本明細書および請求の範囲において用いられて
いるように、そのアミノ末端またはカルボキシ末端の一
方または両方に10個までのアミノ酸残基の増減をもつ記
載の配列を指し、これは、該ペプチドおよび／または蛋
白配列の特定のアミノ酸残基において保存的置換のみを
含む。
“保存的置換”という用語は、上記で用いられている
ように、１個のアミノ酸残基が別の、生物学的に同じよ
うな残基によって置換されていることを示す。保存的置
換の例は、１個の疎水性残基（例えばIle、Val、Leuま
たはMet）の別のものへの置換、または１個の極性残基
の別のものへの置換（例えばArgとLys間、CluとAsp間ま
たはClnとAsn間など）を含む。
ように、１個のアミノ酸残基が別の、生物学的に同じよ
うな残基によって置換されていることを示す。保存的置
換の例は、１個の疎水性残基（例えばIle、Val、Leuま
たはMet）の別のものへの置換、または１個の極性残基
の別のものへの置換（例えばArgとLys間、CluとAsp間ま
たはClnとAsn間など）を含む。
いくつかの例では、イオン性残基の反対荷電のイオン
性残基による置換、例えばLysによるAspの置換は、これ
らのイオン基は単に可溶性のための補助を提供すると考
えられるという点で、当該技術分野では保存的と考えら
れる。しかしながら一般に、ここで考察される置換は比
較的短い合成ペプチド上で生じるので、完全蛋白と比較
したとき、イオン性残基の反対荷電の別のイオン性残基
による置換は、非イオン性残基とイオン性残基および嵩
張る残基（例えばPhe、TyrまたはTrp）と嵩張らない残
基（例えばGly、IleおよびVal）による置換のように、
ここでは“ラジカル置換”であると考えられる。
性残基による置換、例えばLysによるAspの置換は、これ
らのイオン基は単に可溶性のための補助を提供すると考
えられるという点で、当該技術分野では保存的と考えら
れる。しかしながら一般に、ここで考察される置換は比
較的短い合成ペプチド上で生じるので、完全蛋白と比較
したとき、イオン性残基の反対荷電の別のイオン性残基
による置換は、非イオン性残基とイオン性残基および嵩
張る残基（例えばPhe、TyrまたはTrp）と嵩張らない残
基（例えばGly、IleおよびVal）による置換のように、
ここでは“ラジカル置換”であると考えられる。
“非イオン性”および“イオン性”残基という用語
は、生理学的pH値ではそれぞれ電荷を持たないアミノ酸
残基、または通常では電荷を有するアミノ酸残基を指す
ために、それらの通常の意味で本明細書で用いられる。
典型的な非イオン性残基はThrおよびGlnを含み、一方イ
オン性残基はArgおよびAspを含む 本明細書で用いられているように、“細胞性粘着分
子”という用語は、血管内皮細胞および／または顆粒球
によって認識され、さらにそれらに結合する特定の炎症
性細胞表面分子を指す。
は、生理学的pH値ではそれぞれ電荷を持たないアミノ酸
残基、または通常では電荷を有するアミノ酸残基を指す
ために、それらの通常の意味で本明細書で用いられる。
典型的な非イオン性残基はThrおよびGlnを含み、一方イ
オン性残基はArgおよびAspを含む 本明細書で用いられているように、“細胞性粘着分
子”という用語は、血管内皮細胞および／または顆粒球
によって認識され、さらにそれらに結合する特定の炎症
性細胞表面分子を指す。
本明細書で用いられているように、“IgG定常領域”
という用語は、IgGガンマ鎖またはそのフラグメントの
最初の107アミノ酸に対応する可変領域に隣接するIgG分
子のガンマ鎖のドメインを指す。ガンマ鎖の定常領域内
の４つのドメインは、CH1、Ｈ、CH2およびCH3と呼ばれ
る。CH1は可変領域に隣接し、アミノ酸残基114から223
を含む。Ｈ（ヒンジ；残基224−245）はCH1に隣接し、
２つの免疫グロブリン重鎖を共有結合で連結するジスル
フィド結合を形成するシステイン残基を含む。CH2はヒ
ンジに隣接し、アミノ酸残基246から361を含み、アミノ
酸残基362から496を含むCH3がこれに続く。
という用語は、IgGガンマ鎖またはそのフラグメントの
最初の107アミノ酸に対応する可変領域に隣接するIgG分
子のガンマ鎖のドメインを指す。ガンマ鎖の定常領域内
の４つのドメインは、CH1、Ｈ、CH2およびCH3と呼ばれ
る。CH1は可変領域に隣接し、アミノ酸残基114から223
を含む。Ｈ（ヒンジ；残基224−245）はCH1に隣接し、
２つの免疫グロブリン重鎖を共有結合で連結するジスル
フィド結合を形成するシステイン残基を含む。CH2はヒ
ンジに隣接し、アミノ酸残基246から361を含み、アミノ
酸残基362から496を含むCH3がこれに続く。
本明細書で用いられているように、“ライブラリー”
という用語は、問題の転写系から得られたクローニング
されたDNAフラグメントの無作為大集合物を指す。
という用語は、問題の転写系から得られたクローニング
されたDNAフラグメントの無作為大集合物を指す。
本明細書で用いられているように、“機能しうるよう
に連結された”という用語は、連結されたいずれの群も
記載されたように機能する能力が妨害されない結合を指
す。そのような結合は、合成的手段および／または組換
え手段によって形成することができる。好ましい具体例
では、ICAM−２細胞外領域は、免疫グロブリン分子の定
常部分（例えばIgG定常領域）に該ICAM−２領域がCD11a
/CD18に結合することができるような態様で、機能しう
るように連結される。
に連結された”という用語は、連結されたいずれの群も
記載されたように機能する能力が妨害されない結合を指
す。そのような結合は、合成的手段および／または組換
え手段によって形成することができる。好ましい具体例
では、ICAM−２細胞外領域は、免疫グロブリン分子の定
常部分（例えばIgG定常領域）に該ICAM−２領域がCD11a
/CD18に結合することができるような態様で、機能しう
るように連結される。
本明細書で用いられているように、“医薬的に許容で
きる担体”という用語は、患者への投与に適しており、
さらにそのような投与に際して毒性または望ましくない
影響を生じない化合物を指す。医薬的に許容できる担体
の典型的な例には、燐酸緩衝食塩水、リンゲル液、オイ
ル、ゲル、微小球体の他、リポソームがある。他の医薬
的に許容できる担体は、薬学分野では周知であり、本発
明に含まれる。
きる担体”という用語は、患者への投与に適しており、
さらにそのような投与に際して毒性または望ましくない
影響を生じない化合物を指す。医薬的に許容できる担体
の典型的な例には、燐酸緩衝食塩水、リンゲル液、オイ
ル、ゲル、微小球体の他、リポソームがある。他の医薬
的に許容できる担体は、薬学分野では周知であり、本発
明に含まれる。
本明細書で用いられているように、“実質的に”とい
う用語は、高度な類似性を指す。本発明の実質的に精製
されたペプチドは、およそ10％未満の外来性ペプチドを
含む調製物を指す。本発明の実質的に同じ配列は、参考
配列についておよそ10％未満の変動を有する。
う用語は、高度な類似性を指す。本発明の実質的に精製
されたペプチドは、およそ10％未満の外来性ペプチドを
含む調製物を指す。本発明の実質的に同じ配列は、参考
配列についておよそ10％未満の変動を有する。
本明細書で用いられているように、“クローニング”
という用語は、全く同一の再生を可能にする、原核もし
くは真核細胞または有機体のゲノム内へのDNA配列の挿
入を指す。そのようなクローニングは、異なるDNAを縦
に繋ぐことによって形成される組換えDNA分子の生成を
もたらす。
という用語は、全く同一の再生を可能にする、原核もし
くは真核細胞または有機体のゲノム内へのDNA配列の挿
入を指す。そのようなクローニングは、異なるDNAを縦
に繋ぐことによって形成される組換えDNA分子の生成を
もたらす。
本明細書で用いられているように、“サブクローニン
グ”という用語は、発現ベクターへのゲノムフラグメン
トcDNA配列の挿入を指す。
グ”という用語は、発現ベクターへのゲノムフラグメン
トcDNA配列の挿入を指す。
本明細書で用いられているように、“領域”という用
語は、それが分子に関連する場合は、分子の指定または
記載部分またはドメイン、例えば、粘着分子（例えばIC
AM−１またはICAM−２）の細胞外部分もしくは領域また
はIgG定常領域をいう。
語は、それが分子に関連する場合は、分子の指定または
記載部分またはドメイン、例えば、粘着分子（例えばIC
AM−１またはICAM−２）の細胞外部分もしくは領域また
はIgG定常領域をいう。
本明細書で用いられているように、“融合分子”とい
う用語は、２つまたはそれ以上の異なる分子の指定領域
および／または特徴を含む構築された分子を指す。本発
明では、融合分子は、粘着分子領域および免疫グロブリ
ン領域を含む。本発明では、これは、細胞粘着分子の結
合特異性を有する可溶性融合分子を生じる。融合分子は
合成または組換え法のいずれによっても製造できる。
う用語は、２つまたはそれ以上の異なる分子の指定領域
および／または特徴を含む構築された分子を指す。本発
明では、融合分子は、粘着分子領域および免疫グロブリ
ン領域を含む。本発明では、これは、細胞粘着分子の結
合特異性を有する可溶性融合分子を生じる。融合分子は
合成または組換え法のいずれによっても製造できる。
本明細書で用いられているように、“結合特異性”と
いう用語は、１つの分子の他の分子に対する選択的親和
性、例えば抗体の抗原への結合、レセプターのリガンド
への結合、および酵素の基質への結合を指す。特定物質
に結合するすべての分子は、その物質に対して結合特異
性を有すると考えられる。したがって、特定の抗原に結
合するすべての抗体は、その抗原に対して結合特異性を
有し、特定の細胞レセプターに結合するすべてのリガン
ドはそのレセプターに対して結合特異性を有している。
いう用語は、１つの分子の他の分子に対する選択的親和
性、例えば抗体の抗原への結合、レセプターのリガンド
への結合、および酵素の基質への結合を指す。特定物質
に結合するすべての分子は、その物質に対して結合特異
性を有すると考えられる。したがって、特定の抗原に結
合するすべての抗体は、その抗原に対して結合特異性を
有し、特定の細胞レセプターに結合するすべてのリガン
ドはそのレセプターに対して結合特異性を有している。
本発明は新規な可溶性融合分子および方法に関し、好
ましい具体例において、これは、ICAM−２はその相同体
ICAM−１と同様、Ｔ細胞活性化時に補助的刺激反レセプ
ター／リガンドとして機能できるということを明らかに
する。この発見は、ICAM−２を補助的刺激分子として機
能することができるIgスーパー遺伝子群のサブグループ
に含ませることを可能にする。このサブグループは、B
7、ICAM−１、LFA−３およびVCAM−１を含む（G.A.Van
Seventerら、（1990）J.Immunol.144:4579;N.K.Damle
ら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403;B.E.Bie
rerら、J.Exp.Med.168:1145;P.Moingeionら、（1989）N
ature 339:312;P.S.Linsleyら、（1991）J.Exp.Med.17
3:721）。これら分子の全て、および当業者に既知の他
の分子を、本発明の融合分子を形成するために用いるこ
とができる。ICAM−２との補助的刺激は、CD3/TCR複合
体を介してＴ細胞の補助的刺激に完全に依存しており、
さらに、同じ表面上に抗TCR−１およびICAM−２の両方
がともに固定される必要があることが示された。ICAM−
２の補助的刺激効果はICAM−１のそれに極めて類似して
いるが、これはおそらく、ICAM−１およびICAM−２は同
じ表面レセプター、LFA−１（CD11a/CD18）分子を共有
しているという事実によるものであろう（S.D.Marlin
ら、（1987）Cell 51:813;M＞W.Mkobaら、（1988）Natu
re 331:86;D.E.Stautonら、（1989）Nature 339:61;M.
L.Dustinら、（1989）Cold Spring Harbor Symp.Quant.
Biol.54:753）。
ましい具体例において、これは、ICAM−２はその相同体
ICAM−１と同様、Ｔ細胞活性化時に補助的刺激反レセプ
ター／リガンドとして機能できるということを明らかに
する。この発見は、ICAM−２を補助的刺激分子として機
能することができるIgスーパー遺伝子群のサブグループ
に含ませることを可能にする。このサブグループは、B
7、ICAM−１、LFA−３およびVCAM−１を含む（G.A.Van
Seventerら、（1990）J.Immunol.144:4579;N.K.Damle
ら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403;B.E.Bie
rerら、J.Exp.Med.168:1145;P.Moingeionら、（1989）N
ature 339:312;P.S.Linsleyら、（1991）J.Exp.Med.17
3:721）。これら分子の全て、および当業者に既知の他
の分子を、本発明の融合分子を形成するために用いるこ
とができる。ICAM−２との補助的刺激は、CD3/TCR複合
体を介してＴ細胞の補助的刺激に完全に依存しており、
さらに、同じ表面上に抗TCR−１およびICAM−２の両方
がともに固定される必要があることが示された。ICAM−
２の補助的刺激効果はICAM−１のそれに極めて類似して
いるが、これはおそらく、ICAM−１およびICAM−２は同
じ表面レセプター、LFA−１（CD11a/CD18）分子を共有
しているという事実によるものであろう（S.D.Marlin
ら、（1987）Cell 51:813;M＞W.Mkobaら、（1988）Natu
re 331:86;D.E.Stautonら、（1989）Nature 339:61;M.
L.Dustinら、（1989）Cold Spring Harbor Symp.Quant.
Biol.54:753）。
同じレセプター（LFA−１）を使用するにもかかわら
ず、ICAM−１およびICAM−２は、動態的には同じである
が、定量的には異なっている。ICAM−２で誘導される増
殖反応は、表面IL−2Rの発現の誘発、およびIL−２合成
におけるそれぞれの能力もまた反映している。ICAM−２
のそれと比較して、ICAM−１で認められた強力な補助的
刺激効果は、これら２つの分子のLFA−１との相互作用
の相対的結合性の違いによるかもしれない;ICAM−１はI
CAM−２よりLFA−１に対して強力な結合性を有している
（D.E.Stauntonら、（1989）Nature 339:61;M.L.Dustin
ら、（1989）Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54:
753;A.R.De Fougerollesら、（1991）J.Exp.Med.174:25
3）。ICAM−１の細胞外ドメインは５つのIg様ドメイン
から構成されており、一方、ICAM−２の細胞外ドメイン
はそのようなドメインを２つしかもたない（D.E.Staunt
onら、（1988）Cell 52:925;D.Simmonsら、（1988）Nat
ure 331:624;D.E.Stauntonら、（1989）Nature 339:6
1）。異なる抗ICAM−1mAbを用いた抑制実験によって、
ドメイン２の少しの分担があるがICAM−１上のLFA−１
相互作用部位はICAM−１分子の最初のドメインにマッピ
ングされた（図１のD1）（D.E.Stauntonら、（1990）Ce
ll 61:243）。ICAM−１およびICAM−２のＮ−末端側の
２つのドメイン（これはそれらのLFA−１との相互作用
に寄与する）は34％の相同性を示すが（D.E.Staunton
ら、（1989）Nature 339:61）、ICAM−１分子の３つの
付加ドメインの存在は、部分的には、ICAM−１の結合ド
メイン（D1およびD2）にさらに付加されるたわみ性を提
供し、したがってICAM−１のLFA−１に対するより強力
な結合性の説明になるかもしれない。
ず、ICAM−１およびICAM−２は、動態的には同じである
が、定量的には異なっている。ICAM−２で誘導される増
殖反応は、表面IL−2Rの発現の誘発、およびIL−２合成
におけるそれぞれの能力もまた反映している。ICAM−２
のそれと比較して、ICAM−１で認められた強力な補助的
刺激効果は、これら２つの分子のLFA−１との相互作用
の相対的結合性の違いによるかもしれない;ICAM−１はI
CAM−２よりLFA−１に対して強力な結合性を有している
（D.E.Stauntonら、（1989）Nature 339:61;M.L.Dustin
ら、（1989）Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.54:
753;A.R.De Fougerollesら、（1991）J.Exp.Med.174:25
3）。ICAM−１の細胞外ドメインは５つのIg様ドメイン
から構成されており、一方、ICAM−２の細胞外ドメイン
はそのようなドメインを２つしかもたない（D.E.Staunt
onら、（1988）Cell 52:925;D.Simmonsら、（1988）Nat
ure 331:624;D.E.Stauntonら、（1989）Nature 339:6
1）。異なる抗ICAM−1mAbを用いた抑制実験によって、
ドメイン２の少しの分担があるがICAM−１上のLFA−１
相互作用部位はICAM−１分子の最初のドメインにマッピ
ングされた（図１のD1）（D.E.Stauntonら、（1990）Ce
ll 61:243）。ICAM−１およびICAM−２のＮ−末端側の
２つのドメイン（これはそれらのLFA−１との相互作用
に寄与する）は34％の相同性を示すが（D.E.Staunton
ら、（1989）Nature 339:61）、ICAM−１分子の３つの
付加ドメインの存在は、部分的には、ICAM−１の結合ド
メイン（D1およびD2）にさらに付加されるたわみ性を提
供し、したがってICAM−１のLFA−１に対するより強力
な結合性の説明になるかもしれない。
ICAM−１の構造における付加的ドメインの存在が、IC
AM−２よりICAM−１をより強力な補助的刺激分子にする
という可能性は、ICAM−１のＮ−末端側の２つのドメイ
ンのみをもつICAM−1Rg分子（ICAM−1.2Rg）を遺伝子工
学的に作成することによって実験的に主張された。直接
比較したとき、ICAM−1.2RgはICAM−2Rgよりその補助的
刺激効果においてなお強力であった（図４）。これらの
データは、ICAM−１のＮ−末端側の２つのIg様ドメイン
がLFA−１との相互作用に重要であるという結論と一致
しさらにこれを支援する（D.E.Stauntonら、（1988）Ce
ll 52:925;D.E.Stauntonら、（1990）Cell 61:243）。
AM−２よりICAM−１をより強力な補助的刺激分子にする
という可能性は、ICAM−１のＮ−末端側の２つのドメイ
ンのみをもつICAM−1Rg分子（ICAM−1.2Rg）を遺伝子工
学的に作成することによって実験的に主張された。直接
比較したとき、ICAM−1.2RgはICAM−2Rgよりその補助的
刺激効果においてなお強力であった（図４）。これらの
データは、ICAM−１のＮ−末端側の２つのIg様ドメイン
がLFA−１との相互作用に重要であるという結論と一致
しさらにこれを支援する（D.E.Stauntonら、（1988）Ce
ll 52:925;D.E.Stauntonら、（1990）Cell 61:243）。
ICAM−２分子の大きさは、CD13分子からの５つの付加
的Ig様ドメインをそれに付与することによって増加し
た。ICAM−2:CD31Rgキメラ（これは、CD31の７つのIg様
ドメインのＮ−末端側の２つの入れ換えたICAM−２の細
胞外ドメインを含む）（P.J.Newmanら、（1990）Scienc
e 247:1219;D.Simmonsら、（1990）J.Exp.Med.171:214
7）は、Ｔ細胞の補助的刺激効果はICAM−2Rg分子より低
かった。総合すれば、これらの結果は、ICAM−１および
ICAM−２の補助的刺激におけるインビトロの違いは、そ
れぞれの分子のＮ−末端側の２つのIg様ドメインの一次
構造における相違に起因し、これら２つの分子の長さお
よび／またはたわみ性における相違によるものではない
ということを示している。異なるドメインをもつ精製IC
AM−1Rgは等しい補助的刺激性を有していることが認め
られたが（データは開示せず）、天然のICAM−１分子に
おける付加的なドメインの存在は、細胞外スペースにお
いてそのものをさらに突出させ、したがって、細胞の糖
部分による干渉を減少させるかもしれない（D.E.Staunt
onら、（1989）Nature 339:61;A.R.De Fougerollesら、
（1991）J.Exp.Med.174:253）。天然形のICAM−２分子
は、この利点をもたず、したがっておそらくこの理由の
ために、生理学的な意味合いでICAM−２仲介粘着は、IC
AM−１仲介粘着よりも弱いかも知れない（D.E.Staunton
ら、（1989）Nautre 339:61;A.R.De Fougerollesら、
（1991）J.Exp.Med.174:253）。
的Ig様ドメインをそれに付与することによって増加し
た。ICAM−2:CD31Rgキメラ（これは、CD31の７つのIg様
ドメインのＮ−末端側の２つの入れ換えたICAM−２の細
胞外ドメインを含む）（P.J.Newmanら、（1990）Scienc
e 247:1219;D.Simmonsら、（1990）J.Exp.Med.171:214
7）は、Ｔ細胞の補助的刺激効果はICAM−2Rg分子より低
かった。総合すれば、これらの結果は、ICAM−１および
ICAM−２の補助的刺激におけるインビトロの違いは、そ
れぞれの分子のＮ−末端側の２つのIg様ドメインの一次
構造における相違に起因し、これら２つの分子の長さお
よび／またはたわみ性における相違によるものではない
ということを示している。異なるドメインをもつ精製IC
AM−1Rgは等しい補助的刺激性を有していることが認め
られたが（データは開示せず）、天然のICAM−１分子に
おける付加的なドメインの存在は、細胞外スペースにお
いてそのものをさらに突出させ、したがって、細胞の糖
部分による干渉を減少させるかもしれない（D.E.Staunt
onら、（1989）Nature 339:61;A.R.De Fougerollesら、
（1991）J.Exp.Med.174:253）。天然形のICAM−２分子
は、この利点をもたず、したがっておそらくこの理由の
ために、生理学的な意味合いでICAM−２仲介粘着は、IC
AM−１仲介粘着よりも弱いかも知れない（D.E.Staunton
ら、（1989）Nautre 339:61;A.R.De Fougerollesら、
（1991）J.Exp.Med.174:253）。
Ｔ細胞上のICAM−１とLFA−１との間の相互作用の補
助的刺激効果は、抗CD3刺激系同様Ag刺激系で認められ
た（D.M.Altmannら、（1989）Nature 338:512;G.A.Van
Seventerら、（1990）J.Immunol.144:4579）。本発明
は、ICAM−２の補助的刺激効果は、ICAM−２とLFA−１
間の相互反応に依存するが、またCD3/TCR依存であるこ
とも示している。休止Ｔ細胞のLFA−１は、同定ICAM−
１（G.A.Van Seventerら、（1990）J.Immunol.144:457
9;M.L.Dustinら、（1989）Nature 314:619）または固定
ICAM−２に結合しない。PKCの活性物質、例えばPMA（こ
れはLFA−１のICAM−１に対する結合力を高める（G.A.V
an Seventerら、（1990）J.Immunol.144:457;M.L.Dusti
nら、（1989）Nature 341:619））は、Ｔ細胞のICAM−
１またはICAM−２依存性増殖を誘発しない。しかしなが
ら、Ｔ細胞上のCD3/TCR複合体の結合（これは細胞内遊
離Ca2+の移動同様PKCの活性化を引き起こす（A.Weiss
ら、（1986）Annu.Rev.Immunol.４:593））は、ICAMに
対するLFA−１の結合力を高めるだけでなく（G.A.Van S
eventerら、（1990）J.Immunol.144:457;M.L.Dustin
ら、（1989）Nature 341:619）。ICAMが発する補助的刺
激シグナルをＴ細胞が受容することを可能にする（G.A.
Van Seventerら、（1990）J.Immunol.144:457）。LFA−
１のリガンドが活性化シグナルを発する分子メカニズム
は依然として殆ど理解されていないが、CD3/TCRおよびL
FA−１に対するmAbとの架橋は、抗CD3mAb単独よりも、
より長時間の細胞内遊離Ca2+の移動およびホスファチジ
ールイノシトールの加水分解を誘発する（M.C.Wacholtz
ら、（1989）J.Exp.Med.170:431;R.Pardiら、（1989）
J.Immunol.143:3157）。ここでは直接調べなかったが、
抗TCR−１とともに固定したとき、ICAMは、Ｔ細胞活性
化に必須の第二のメッセージの同様な延長生成を誘発す
るかもしれない。活性化に際して、CD18（LAF−１β）
は、セリンで迅速に燐酸化され、一方、CD11aのセリン
燐酸化は変化しないままである（T.A.Catilaら、（198
8）J.Immunol.140:4308）。より重要なことには、Agパ
ルスを行ったAPCによるＴ細胞の活性化に際して、LFA−
１複合体は、Ｔ細胞とAPC間の接触点にCD3/TCRとともに
集中し、これは、おそらくは生理的に関与する細胞体質
性成分タリンを介する該細胞体質の再構成を伴う（A.Ku
pferら、（1989）Annu.Rev.Immunol.７:309）。その通
りであるならば、ICAM−１とICAM−２の補助的刺激効果
における相違は、実際に、この活性化の過程を再び指令
するための細胞体質要素のLFA−１を介するICAMによる
異なる関与（A.Kupferら、（1989）Annu.Rev.Immunol.
７:309）によるかどうかを調べることは興味深いであろ
う（C.Van Noeselら、（1988）Nature 333:850）。
助的刺激効果は、抗CD3刺激系同様Ag刺激系で認められ
た（D.M.Altmannら、（1989）Nature 338:512;G.A.Van
Seventerら、（1990）J.Immunol.144:4579）。本発明
は、ICAM−２の補助的刺激効果は、ICAM−２とLFA−１
間の相互反応に依存するが、またCD3/TCR依存であるこ
とも示している。休止Ｔ細胞のLFA−１は、同定ICAM−
１（G.A.Van Seventerら、（1990）J.Immunol.144:457
9;M.L.Dustinら、（1989）Nature 314:619）または固定
ICAM−２に結合しない。PKCの活性物質、例えばPMA（こ
れはLFA−１のICAM−１に対する結合力を高める（G.A.V
an Seventerら、（1990）J.Immunol.144:457;M.L.Dusti
nら、（1989）Nature 341:619））は、Ｔ細胞のICAM−
１またはICAM−２依存性増殖を誘発しない。しかしなが
ら、Ｔ細胞上のCD3/TCR複合体の結合（これは細胞内遊
離Ca2+の移動同様PKCの活性化を引き起こす（A.Weiss
ら、（1986）Annu.Rev.Immunol.４:593））は、ICAMに
対するLFA−１の結合力を高めるだけでなく（G.A.Van S
eventerら、（1990）J.Immunol.144:457;M.L.Dustin
ら、（1989）Nature 341:619）。ICAMが発する補助的刺
激シグナルをＴ細胞が受容することを可能にする（G.A.
Van Seventerら、（1990）J.Immunol.144:457）。LFA−
１のリガンドが活性化シグナルを発する分子メカニズム
は依然として殆ど理解されていないが、CD3/TCRおよびL
FA−１に対するmAbとの架橋は、抗CD3mAb単独よりも、
より長時間の細胞内遊離Ca2+の移動およびホスファチジ
ールイノシトールの加水分解を誘発する（M.C.Wacholtz
ら、（1989）J.Exp.Med.170:431;R.Pardiら、（1989）
J.Immunol.143:3157）。ここでは直接調べなかったが、
抗TCR−１とともに固定したとき、ICAMは、Ｔ細胞活性
化に必須の第二のメッセージの同様な延長生成を誘発す
るかもしれない。活性化に際して、CD18（LAF−１β）
は、セリンで迅速に燐酸化され、一方、CD11aのセリン
燐酸化は変化しないままである（T.A.Catilaら、（198
8）J.Immunol.140:4308）。より重要なことには、Agパ
ルスを行ったAPCによるＴ細胞の活性化に際して、LFA−
１複合体は、Ｔ細胞とAPC間の接触点にCD3/TCRとともに
集中し、これは、おそらくは生理的に関与する細胞体質
性成分タリンを介する該細胞体質の再構成を伴う（A.Ku
pferら、（1989）Annu.Rev.Immunol.７:309）。その通
りであるならば、ICAM−１とICAM−２の補助的刺激効果
における相違は、実際に、この活性化の過程を再び指令
するための細胞体質要素のLFA−１を介するICAMによる
異なる関与（A.Kupferら、（1989）Annu.Rev.Immunol.
７:309）によるかどうかを調べることは興味深いであろ
う（C.Van Noeselら、（1988）Nature 333:850）。
ICAM−１のそれと異なり、ICAM−２の発現ははるかに
制限されており、さらに炎症性サイトカインによって調
節されないようである（D.E.Stauntonら、（1989）Natu
re 339:61;P.Nortamoら、（1991）J.Immunol.146:253
0）。ICAM−２は、専ら血管内皮細胞および樹枝状細胞
を含む間質細胞に存在する（D.E.Stauntonら、（1989）
Nature 339:61;A.R.De Fougerollesら、（1991）J.Exp.
Med.174:253;P.Nortamoら、（1991）J.Immunol.146:253
0）。
制限されており、さらに炎症性サイトカインによって調
節されないようである（D.E.Stauntonら、（1989）Natu
re 339:61;P.Nortamoら、（1991）J.Immunol.146:253
0）。ICAM−２は、専ら血管内皮細胞および樹枝状細胞
を含む間質細胞に存在する（D.E.Stauntonら、（1989）
Nature 339:61;A.R.De Fougerollesら、（1991）J.Exp.
Med.174:253;P.Nortamoら、（1991）J.Immunol.146:253
0）。
その補助的刺激効果を考えれば、ICAM−２は、ICAM−１
の発現が上昇するように調節しうる前に、ICAM−１また
はlowAPCによるＴ細胞の活性化を支援するかもしれな
い。血管内皮細胞上でICAM−２の強力な発現を与えるな
らば、ICAM−２の補助的刺激作用は、ある種の炎症反応
で病態発生において極めて重要であるかもしれない。例
えば、血管内皮細胞で発現されたICAM−２は、脈管内で
活性化されたＴ細胞の粘着／活性化を支援し、葡萄球菌
外毒素（スーパーAg）によって誘発される毒素ショック
症候群または癌治療中のIL−２の高用量投与による脈管
ショック症候群に付随する脈管内炎症の兆候を開始さ
せ、続いて悪化させるかもしれない（S.D.Resnick（199
0）J.Pediatr.116:321;N.K.Damleら、（1989）J.Immuno
l.142:2660）。したがって、ICAM−２依存性相互作用を
抑制することを目的とするいずれの治療態様も、脈管内
炎症疾患の治療に臨床的に有効であることが証明される
かもしれない。
の発現が上昇するように調節しうる前に、ICAM−１また
はlowAPCによるＴ細胞の活性化を支援するかもしれな
い。血管内皮細胞上でICAM−２の強力な発現を与えるな
らば、ICAM−２の補助的刺激作用は、ある種の炎症反応
で病態発生において極めて重要であるかもしれない。例
えば、血管内皮細胞で発現されたICAM−２は、脈管内で
活性化されたＴ細胞の粘着／活性化を支援し、葡萄球菌
外毒素（スーパーAg）によって誘発される毒素ショック
症候群または癌治療中のIL−２の高用量投与による脈管
ショック症候群に付随する脈管内炎症の兆候を開始さ
せ、続いて悪化させるかもしれない（S.D.Resnick（199
0）J.Pediatr.116:321;N.K.Damleら、（1989）J.Immuno
l.142:2660）。したがって、ICAM−２依存性相互作用を
抑制することを目的とするいずれの治療態様も、脈管内
炎症疾患の治療に臨床的に有効であることが証明される
かもしれない。
これまで本発明を一般的に述べてきたので、ここに例
示として提供する、ただし特に記載がない限り制限的で
あることを意図するものではないが、特定の具体例を参
考することによって、よりよい理解が得られよう。
示として提供する、ただし特に記載がない限り制限的で
あることを意図するものではないが、特定の具体例を参
考することによって、よりよい理解が得られよう。
実施例１
ICAMRgの構築および調製
Ｎ−末端側の２つまたは４つのIg様ドメイン、または
ICAM−１の複合細胞外ドメインをコードするICAM−1cDN
A配列を、この領域に隣接する配列に相補的な合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、鋳型のICAM−１分子をコード
するcDNAの1ngから、ポリメラーゼ・チェーン・リアク
ション（PCR）を25サイクルおこなって増幅した。（D.S
immonsら、（1988）Nature 331:624）。各サイクルは30
秒92℃、２分55℃から成り、酵素の販売元（米国バイオ
ケミカル）の推奨緩衝液を用いた。オリゴヌクレオチド
は、増幅DNAセグメントの5'および3'の先端に制限酵素
切断部位を創出することができるようにデザインし、Ig
G1発現ベクターへのその後の挿入を容易にした（N.K.Da
mleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）。
これら３つの構築物について、ICAM−１をコードする完
全な長さのcDNAクローンを含む発現ベクター内に配置さ
れた配列をコードする前進方向のプライマーは、以下の
配列を用いて合成した： 第二および第三のIg様ドメイン並びに第四および第五の
Ig様ドメインの連結部に位置する配列、並びにBAMHIを
その中に含む第五のIg様ドメインの末端に位置する配列
をコードする、以下の配列をもつ反対方向のプライマー
を合成した： このICAM−1PCR生成物を、制限酵素Mlu IおよびBamH I
で消化し、Mlu I−BamH I切断CD8IG1ベクター（N.K.Dam
leら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）に連
結し、ICAM−1.2RgおよびICAM−1.5Rg融合蛋白を得た。
ICAM−１の複合細胞外ドメインをコードするICAM−1cDN
A配列を、この領域に隣接する配列に相補的な合成オリ
ゴヌクレオチドを用いて、鋳型のICAM−１分子をコード
するcDNAの1ngから、ポリメラーゼ・チェーン・リアク
ション（PCR）を25サイクルおこなって増幅した。（D.S
immonsら、（1988）Nature 331:624）。各サイクルは30
秒92℃、２分55℃から成り、酵素の販売元（米国バイオ
ケミカル）の推奨緩衝液を用いた。オリゴヌクレオチド
は、増幅DNAセグメントの5'および3'の先端に制限酵素
切断部位を創出することができるようにデザインし、Ig
G1発現ベクターへのその後の挿入を容易にした（N.K.Da
mleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）。
これら３つの構築物について、ICAM−１をコードする完
全な長さのcDNAクローンを含む発現ベクター内に配置さ
れた配列をコードする前進方向のプライマーは、以下の
配列を用いて合成した： 第二および第三のIg様ドメイン並びに第四および第五の
Ig様ドメインの連結部に位置する配列、並びにBAMHIを
その中に含む第五のIg様ドメインの末端に位置する配列
をコードする、以下の配列をもつ反対方向のプライマー
を合成した： このICAM−1PCR生成物を、制限酵素Mlu IおよびBamH I
で消化し、Mlu I−BamH I切断CD8IG1ベクター（N.K.Dam
leら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）に連
結し、ICAM−1.2RgおよびICAM−1.5Rg融合蛋白を得た。
ICAM−２の細胞外ドメインをコードするICAM−2cDNA
配列（D.E.Stauntonら、（1989）Nature 339:61）は、C
DM8発現ベクター（B.Seed（1987）Nature 329:840）で
調製したMlu I直線化ヒト胎盤ライブラリー100ngからPC
Rによって増幅した。ICAM−２蛋白のＮ−末端シグナル
配列をコードする配列のすぐ上流に位置する配列に相補
的な前進方向の１つのプライマー（その配列は、5'CGC
GAA GCT TCT AGA GAG ATG TCC TCT TTC GGT−3'）を、I
CAM−２の細胞外および膜貫通ドメインの結合点に位置
する配列に相補的な２つの異なる逆方向プライマーを組
み合わせて用いた。この２つの逆方向プライマーは以下
の配列を有する： これらのオリゴヌクレオチドで調製されたPCR生成物
を、ICAM−2Rgを調製するためにはCD8IgG1発現ベクター
で（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
8:6403）、ICAM−2:CD31Rg融合蛋白を得るためにはCD31
のＮ−末端側の２つのIg様ドメイン（P.J.Newmanら、
（1990）Science 247:1219;D.Simmonsら、（1990）J.Ex
p.Med.171:2147）の代わりにCD31Rg構築物でそれぞれサ
ブクローニングした。CD7RgおよびELAM−1Rgの構築は既
に述べた（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 88:6403;G.Walzら、（1990）Science 250:1132）。
配列（D.E.Stauntonら、（1989）Nature 339:61）は、C
DM8発現ベクター（B.Seed（1987）Nature 329:840）で
調製したMlu I直線化ヒト胎盤ライブラリー100ngからPC
Rによって増幅した。ICAM−２蛋白のＮ−末端シグナル
配列をコードする配列のすぐ上流に位置する配列に相補
的な前進方向の１つのプライマー（その配列は、5'CGC
GAA GCT TCT AGA GAG ATG TCC TCT TTC GGT−3'）を、I
CAM−２の細胞外および膜貫通ドメインの結合点に位置
する配列に相補的な２つの異なる逆方向プライマーを組
み合わせて用いた。この２つの逆方向プライマーは以下
の配列を有する： これらのオリゴヌクレオチドで調製されたPCR生成物
を、ICAM−2Rgを調製するためにはCD8IgG1発現ベクター
で（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
8:6403）、ICAM−2:CD31Rg融合蛋白を得るためにはCD31
のＮ−末端側の２つのIg様ドメイン（P.J.Newmanら、
（1990）Science 247:1219;D.Simmonsら、（1990）J.Ex
p.Med.171:2147）の代わりにCD31Rg構築物でそれぞれサ
ブクローニングした。CD7RgおよびELAM−1Rgの構築は既
に述べた（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 88:6403;G.Walzら、（1990）Science 250:1132）。
得られた構築物を個々にCOS細胞にトランセクトし、
所望の融合蛋白を回収し、記載のように（N.K.Damle
ら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）トラン
セクトした細胞の上清から精製した。
所望の融合蛋白を回収し、記載のように（N.K.Damle
ら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）トラン
セクトした細胞の上清から精製した。
実施例２
モノクローン抗体
ハイブリドーマOKT3（抗CD3）、OKT3（抗CD4）、OKT8
（抗CD8）、OKM1（抗CD11b）、7G7/B6（抗CD25）、L243
（抗HLA−DR）および63D3（抗単球）をアメリカンタイ
プカルチャーコレクション（ロックビル、メリーラン
ド）から入手した。ハイブリドーマ分泌抗ICAM−1mAb84
H10はP.マンノーニー博士（Dr.P.Mannoni,Institut Pao
ri Calmettes,マルセイユ、フランス）から提供され
た。それぞれのモノクローン抗体（mAb）を含む腹水液
は、プリスタン初期化BALB/cマウスで作成した。Mab9.6
（抗CD2）、10.2（抗CD5）、G10−１（抗CD8）、60.1
（抗CD11b）、FC2（抗CD16）、60.3（抗CD18）、1F5
（抗CD20）、9.3（抗CD28）およびHB10a（抗HLA−DR）
はJ.A.レドベター博士（Dr.J.A.Ledbetter,ブリストル
メイヤーズスクイブ）から提供された。MabMHM23（抗CD
18）およびMHM24（抗CD11a）はA.マックミカエル博士
（Dr.A.McMichael,Nuffield Foundation,オスフォー
ド、英国）から提供された。Mab4G7（抗CD19）はE.G.エ
ングルマン博士（Dr.E.G.Engleman,スタンフォード大学
医学部、スタンフォード、カリフォルニア）から提供さ
れた。MabWT−31（抗TCR−１）は、W.タックス博士（D
r.W.Tax,University of Nijmegen,Nijmegen,スイス）か
ら提供され、またベクトンティッキングモノクローナル
センター（Becton Tickings Monoclonal center）（マ
ウンテンビュー、カリフォルニア）からも入手した。抗
Tac（CD25/IL−2Rα）mAbは、T.A.ワルドマン博士（Dr.
T.A.Waldmann,NIH,ベセスダ、メリーランド）から提供
された。抗CD11amAb2503、抗CD11cmAbBU15および抗CD18
mAbBL5は、アマック社（Amac,Inc.,ウエストブルック、
メーン）から入手した。上記のmAbの各々は、IgG抗体で
ある。種々の類リンパ球表面分子に対するFITC標識また
はPE標識mAbは、アマックまたはコールターイムノロジ
ー（Coulter Immunology,ヒアリー、フロリダ）から入
手した。
（抗CD8）、OKM1（抗CD11b）、7G7/B6（抗CD25）、L243
（抗HLA−DR）および63D3（抗単球）をアメリカンタイ
プカルチャーコレクション（ロックビル、メリーラン
ド）から入手した。ハイブリドーマ分泌抗ICAM−1mAb84
H10はP.マンノーニー博士（Dr.P.Mannoni,Institut Pao
ri Calmettes,マルセイユ、フランス）から提供され
た。それぞれのモノクローン抗体（mAb）を含む腹水液
は、プリスタン初期化BALB/cマウスで作成した。Mab9.6
（抗CD2）、10.2（抗CD5）、G10−１（抗CD8）、60.1
（抗CD11b）、FC2（抗CD16）、60.3（抗CD18）、1F5
（抗CD20）、9.3（抗CD28）およびHB10a（抗HLA−DR）
はJ.A.レドベター博士（Dr.J.A.Ledbetter,ブリストル
メイヤーズスクイブ）から提供された。MabMHM23（抗CD
18）およびMHM24（抗CD11a）はA.マックミカエル博士
（Dr.A.McMichael,Nuffield Foundation,オスフォー
ド、英国）から提供された。Mab4G7（抗CD19）はE.G.エ
ングルマン博士（Dr.E.G.Engleman,スタンフォード大学
医学部、スタンフォード、カリフォルニア）から提供さ
れた。MabWT−31（抗TCR−１）は、W.タックス博士（D
r.W.Tax,University of Nijmegen,Nijmegen,スイス）か
ら提供され、またベクトンティッキングモノクローナル
センター（Becton Tickings Monoclonal center）（マ
ウンテンビュー、カリフォルニア）からも入手した。抗
Tac（CD25/IL−2Rα）mAbは、T.A.ワルドマン博士（Dr.
T.A.Waldmann,NIH,ベセスダ、メリーランド）から提供
された。抗CD11amAb2503、抗CD11cmAbBU15および抗CD18
mAbBL5は、アマック社（Amac,Inc.,ウエストブルック、
メーン）から入手した。上記のmAbの各々は、IgG抗体で
ある。種々の類リンパ球表面分子に対するFITC標識また
はPE標識mAbは、アマックまたはコールターイムノロジ
ー（Coulter Immunology,ヒアリー、フロリダ）から入
手した。
CD4+T細胞の分離
健常な供与者から末梢血単核球をコンレーハイパーク
密度勾配遠心によって分離した。休止CD4+T細胞を、記
載されたように（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 88:6403;K.Horganら、（1991）免疫学の今日
の手技（In Current Protocols in Immunology）、J.E.
Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach ＆
W.Strober編、7.4.1−7.4.6ページ）、ダイナビーズＭ
−450（Dynal Inc.,グレートネック、ニューヨーク）を
用いて厳密な免疫磁力陰性選別によって分離した。陰性
選別は、Ｂ細胞、単球および活性化Ｔ細胞のHLA−DR（L
243またはHB10a）に対するmAb、63D3（単球）に対するm
Ab、Ｂ細胞のCD19（4G7）またはCD20（1F5）に対するmA
b、単球およびNK細胞のCD11b（OKM1または60.1）に対す
るmAb、NK細胞のCD16（FC2）に対するmAb、およびCD8+T
細胞のCD8（OKT8またはG10−１）に対するmAbのカクテ
ルを用いて調製した。分離CD4+T細胞集団の純度は、蛍
光活性化細胞分類機（EPICS V,Coulter,ヒアリー、フロ
リダ）を用いて直接または間接免疫蛍光分析で測定した
とき＞95％であった。分離CD4+T細胞を100U/mlのペニシ
リン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのＬ−グル
タミンおよび10％のウシ胎児血清とともに再浮遊した。
これらのCD4+T細胞は、補助細胞の非存在下で、有糸分
裂濃度の（10μg/ml）PHAまたは可溶性抗CD3/TCR（100n
g/ml）に反応して増殖することができなかった。
密度勾配遠心によって分離した。休止CD4+T細胞を、記
載されたように（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 88:6403;K.Horganら、（1991）免疫学の今日
の手技（In Current Protocols in Immunology）、J.E.
Coligan,A.M.Kruisbeek,D.H.Margulies,E.M.Shevach ＆
W.Strober編、7.4.1−7.4.6ページ）、ダイナビーズＭ
−450（Dynal Inc.,グレートネック、ニューヨーク）を
用いて厳密な免疫磁力陰性選別によって分離した。陰性
選別は、Ｂ細胞、単球および活性化Ｔ細胞のHLA−DR（L
243またはHB10a）に対するmAb、63D3（単球）に対するm
Ab、Ｂ細胞のCD19（4G7）またはCD20（1F5）に対するmA
b、単球およびNK細胞のCD11b（OKM1または60.1）に対す
るmAb、NK細胞のCD16（FC2）に対するmAb、およびCD8+T
細胞のCD8（OKT8またはG10−１）に対するmAbのカクテ
ルを用いて調製した。分離CD4+T細胞集団の純度は、蛍
光活性化細胞分類機（EPICS V,Coulter,ヒアリー、フロ
リダ）を用いて直接または間接免疫蛍光分析で測定した
とき＞95％であった。分離CD4+T細胞を100U/mlのペニシ
リン、100μg/mlのストレプトマイシン、2mMのＬ−グル
タミンおよび10％のウシ胎児血清とともに再浮遊した。
これらのCD4+T細胞は、補助細胞の非存在下で、有糸分
裂濃度の（10μg/ml）PHAまたは可溶性抗CD3/TCR（100n
g/ml）に反応して増殖することができなかった。
実施例３
抗原初期化CD4+T細胞の生成
新たに分離した休止単核細胞を葡萄球菌の外毒素SE
A、SEB、SEEまたはTSST−１（１μg/ml）（Toxin Techn
ology,Inc.,サラソタ、フロリダ）で７日間刺激し、そ
の後、CD4+T細胞を分離し、照射クラスIIMHC+B細胞、個
々の外毒素（１μg/ml）およびIL−２（50U/ml）の存在
下で増殖させた。DRw6−初期化CD4+T細胞を、照射DRw6+
B細胞株ARENTによって刺激した混合リンパ球培養（ML
C）から作成し、記載されたように（N.K.Damleら、（19
90）Eur.J.Immunol.20:1995）,ARENTB細胞およびIL−２
を用いて増殖させた。それらの反応を調べる前に、フィ
コール−ハイパーク密度勾配遠心によってそれらの増殖
／維持培養からCD4+T生細胞を分離し、刺激物質の非存
在下で12−16時間完全培地中で維持した。
A、SEB、SEEまたはTSST−１（１μg/ml）（Toxin Techn
ology,Inc.,サラソタ、フロリダ）で７日間刺激し、そ
の後、CD4+T細胞を分離し、照射クラスIIMHC+B細胞、個
々の外毒素（１μg/ml）およびIL−２（50U/ml）の存在
下で増殖させた。DRw6−初期化CD4+T細胞を、照射DRw6+
B細胞株ARENTによって刺激した混合リンパ球培養（ML
C）から作成し、記載されたように（N.K.Damleら、（19
90）Eur.J.Immunol.20:1995）,ARENTB細胞およびIL−２
を用いて増殖させた。それらの反応を調べる前に、フィ
コール−ハイパーク密度勾配遠心によってそれらの増殖
／維持培養からCD4+T生細胞を分離し、刺激物質の非存
在下で12−16時間完全培地中で維持した。
実施例４
増殖アッセー
丸底のマイクロタイタープレート（コーニング）を、
アフィニティー精製ヤギ抗マウス抗体および抗ヒトIgGF
c抗体（Tago,バーリンガム、カリフォルニア）の混合物
（各々10ng/ml）で４℃で12−16時間予め被覆した（40
μl/ウェル、重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6）。その
後、付加的な蛋白結合部位を、RPMI640中の２％ウシ血
清アルブミンで12−16時間ブロックした。ICAM−1Rgま
たはICAM−2Rg（ヒトIgGFc）および抗TCR−１（マウスI
gG）mAbを、１時間上記のマイクロタイターのウェルに
固定化し、さらに、プレートを記載されたようにCMで２
度洗浄した（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 88:6403）。ICAMRgおよび／または抗TCR−１で
“被覆”（armed）したこれらのプレートを、続いてCD4
+T細胞を刺激するために用いた。0.2mlのCM中の５万個
のCD4+を上記の“被覆”マイクロタイタープレートで、
96時間37℃で５％CO2および95％大気下で培養した。新
たに合成されたDNAに放射能標識の測定のために、細胞
の採集16時間前に１μCi/ウェルの3H−TDr（6.7Ci/mM,
ニューイングランドニュークリアー、ボストン、マサチ
ューセッツ）で３培養づつパルス標識することによっ
て、これらの培養の増殖反応を通常４日目に測定した。
結果はcpm±SEMとして表した。
アフィニティー精製ヤギ抗マウス抗体および抗ヒトIgGF
c抗体（Tago,バーリンガム、カリフォルニア）の混合物
（各々10ng/ml）で４℃で12−16時間予め被覆した（40
μl/ウェル、重炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6）。その
後、付加的な蛋白結合部位を、RPMI640中の２％ウシ血
清アルブミンで12−16時間ブロックした。ICAM−1Rgま
たはICAM−2Rg（ヒトIgGFc）および抗TCR−１（マウスI
gG）mAbを、１時間上記のマイクロタイターのウェルに
固定化し、さらに、プレートを記載されたようにCMで２
度洗浄した（N.K.Damleら、（1991）Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 88:6403）。ICAMRgおよび／または抗TCR−１で
“被覆”（armed）したこれらのプレートを、続いてCD4
+T細胞を刺激するために用いた。0.2mlのCM中の５万個
のCD4+を上記の“被覆”マイクロタイタープレートで、
96時間37℃で５％CO2および95％大気下で培養した。新
たに合成されたDNAに放射能標識の測定のために、細胞
の採集16時間前に１μCi/ウェルの3H−TDr（6.7Ci/mM,
ニューイングランドニュークリアー、ボストン、マサチ
ューセッツ）で３培養づつパルス標識することによっ
て、これらの培養の増殖反応を通常４日目に測定した。
結果はcpm±SEMとして表した。
実施例５
インターロイキン−２の産生およびインターロイキン−
２レセプターの発現の分析 ５万個の休止CD4+T細胞を、ICAM−１もしくはICAM−1
Rg（50ng/ウェル）、抗TCR−１（50ng/ml）または上記
のように両方で予め“被覆”した96穴（ウェル）のマイ
クロタイタープレートで培養した。これらの培養から細
胞非含有上清を48時間後に集め、記載されたように（S.
Gillisら、（1978）J.Immunol.120:2027）、IL−２依存
Ｔ細胞株CTL−L2を用いてインターロイキン２（IL−
２）活性について分析した。各サンプルのIL−２濃度
は、組換えIL−２（シースタコーポレーション、エメリ
ービル、カリフォルニア）を参照して計測し、国際U/ml
で表した。CD25（IL−2Rα）+CD4+T細胞の分析のために
は、培養を48−60時間後に採集し、蛍光結合抗CD25mAb
（アマック）で染色し、記載のように（N.K.Damleら、
（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）、フローサ
イトメーター（EPICS、コールター）で分析した。
２レセプターの発現の分析 ５万個の休止CD4+T細胞を、ICAM−１もしくはICAM−1
Rg（50ng/ウェル）、抗TCR−１（50ng/ml）または上記
のように両方で予め“被覆”した96穴（ウェル）のマイ
クロタイタープレートで培養した。これらの培養から細
胞非含有上清を48時間後に集め、記載されたように（S.
Gillisら、（1978）J.Immunol.120:2027）、IL−２依存
Ｔ細胞株CTL−L2を用いてインターロイキン２（IL−
２）活性について分析した。各サンプルのIL−２濃度
は、組換えIL−２（シースタコーポレーション、エメリ
ービル、カリフォルニア）を参照して計測し、国際U/ml
で表した。CD25（IL−2Rα）+CD4+T細胞の分析のために
は、培養を48−60時間後に採集し、蛍光結合抗CD25mAb
（アマック）で染色し、記載のように（N.K.Damleら、
（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:6403）、フローサ
イトメーター（EPICS、コールター）で分析した。
実施例６
ICAM−１およびICAM−２免疫グロブリン融合蛋白の調製
ICAM−１およびICAM−2Ig融合蛋白（レセプターグロ
ブリン、Rg）を、これら分子の一部分または完全な細胞
外領域のいずれかをコードするcDNAフラグメントをヒト
IgG1の定常領域をコードするゲノムDNAフラグメントに
融合させることによって調製した。本実験には３つのIC
AM−1Rgキメラを用いた:ICAM−1.2Rg、ICAM−1.4Rgおよ
びICAM−1.5Rgである。これらは、ICAM−１のＮ−末端
側の２つまたは４つのIg様細胞外ドメイン、またはICAM
−１の完全な細胞外ドメインからそれぞれ由来している
（図１）。２つのICAM−２融合蛋白を本実験では用い
た:1）ヒトIgG1をコードするゲノムDNAフラグメントに
融合させたICAM−２の完全な細胞外ドメインをコードす
るcDNAフラグメントを含むICAM−2Rg、２）CD31（PECA
M）Rg融合遺伝子の２つのＮ−末端側のIg様ドメインを
コードするcDNAフラグメントが、ICAM−2:CD31キメラを
得るために、ICAM−２の２つのIg様ドメインをコードす
るcDNAフラグメントによって置き換えられているICAM−
2:CD31Rg（図１）。本実験では、同様に調製したCD7Rg
およびELAM−1Rg（N.E.Damleら、（1991）Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 88:6403;G.Walzら、（1990）Science 250:1
132）もまたコントロールとして用いた。
ブリン、Rg）を、これら分子の一部分または完全な細胞
外領域のいずれかをコードするcDNAフラグメントをヒト
IgG1の定常領域をコードするゲノムDNAフラグメントに
融合させることによって調製した。本実験には３つのIC
AM−1Rgキメラを用いた:ICAM−1.2Rg、ICAM−1.4Rgおよ
びICAM−1.5Rgである。これらは、ICAM−１のＮ−末端
側の２つまたは４つのIg様細胞外ドメイン、またはICAM
−１の完全な細胞外ドメインからそれぞれ由来している
（図１）。２つのICAM−２融合蛋白を本実験では用い
た:1）ヒトIgG1をコードするゲノムDNAフラグメントに
融合させたICAM−２の完全な細胞外ドメインをコードす
るcDNAフラグメントを含むICAM−2Rg、２）CD31（PECA
M）Rg融合遺伝子の２つのＮ−末端側のIg様ドメインを
コードするcDNAフラグメントが、ICAM−2:CD31キメラを
得るために、ICAM−２の２つのIg様ドメインをコードす
るcDNAフラグメントによって置き換えられているICAM−
2:CD31Rg（図１）。本実験では、同様に調製したCD7Rg
およびELAM−1Rg（N.E.Damleら、（1991）Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA 88:6403;G.Walzら、（1990）Science 250:1
132）もまたコントロールとして用いた。
Ｔ細胞増殖の補助的刺激のICAM−１の能力は、既に明
らかにされている（14）。予備実験では、ICAM−1Rgの
補助的刺激効果を確認し、さらに種々のＮ−末端Ig様ド
メインを有するICAM−1Rgの相対的強度を比較した。ICA
M−1.4RgおよびICAM−1.5Rgは両方とも、Ｔ細胞活性化
アッセーでは等しく補助的刺激性であることが分かっ
た。したがって、この後のすべての実験では、特に断り
がなければICAM−１としてICAM−1.4Rgを用いた。
らかにされている（14）。予備実験では、ICAM−1Rgの
補助的刺激効果を確認し、さらに種々のＮ−末端Ig様ド
メインを有するICAM−1Rgの相対的強度を比較した。ICA
M−1.4RgおよびICAM−1.5Rgは両方とも、Ｔ細胞活性化
アッセーでは等しく補助的刺激性であることが分かっ
た。したがって、この後のすべての実験では、特に断り
がなければICAM−１としてICAM−1.4Rgを用いた。
実施例７
ICAM−２の補助的刺激効果
TCR複合体を介して活性化されたCD4+T細胞に補助的刺
激シグナルを提供するICAM−２の能力を調べ、ICAM−1R
gのそれと比較した。ICAM−1RgまたはICAM−2Rg（100ng
/ウェル）を、マイクロタイターウェルに抗TCR−1mAb
（50ng/ウェル）とともに固定化し、続いて新たに分離
したCD4+T細胞をこれらのウェルに加えた。これらＴ細
胞の増殖反応を、実施例４に記載したように４日目にモ
ニターした。図２は、抗TCR−1mAbとともに個々に固定
されたとき、ICAM−1RgおよびICAM−2Rgは両方ともCD4+
T細胞の増殖を誘導することを示している。反応に、抗T
CR−1mAbといずれかのICAMRgとの同時固定化は、溶液中
のICAM−1RgもICAM−2Rgも、固定化抗TCR−1mAbと共同
してＴ細胞増殖を支援しないので、Ｔ細胞活性化を支援
するように同時に固定化する必要がある。さらに、Ｔ細
胞表面分子（CD2、CD5またはCD28）に対するmAbは、い
ずれかのICAMRgと同時固定化した場合は、Ｔ細胞を活性
化することができなかった。
激シグナルを提供するICAM−２の能力を調べ、ICAM−1R
gのそれと比較した。ICAM−1RgまたはICAM−2Rg（100ng
/ウェル）を、マイクロタイターウェルに抗TCR−1mAb
（50ng/ウェル）とともに固定化し、続いて新たに分離
したCD4+T細胞をこれらのウェルに加えた。これらＴ細
胞の増殖反応を、実施例４に記載したように４日目にモ
ニターした。図２は、抗TCR−1mAbとともに個々に固定
されたとき、ICAM−1RgおよびICAM−2Rgは両方ともCD4+
T細胞の増殖を誘導することを示している。反応に、抗T
CR−1mAbといずれかのICAMRgとの同時固定化は、溶液中
のICAM−1RgもICAM−2Rgも、固定化抗TCR−1mAbと共同
してＴ細胞増殖を支援しないので、Ｔ細胞活性化を支援
するように同時に固定化する必要がある。さらに、Ｔ細
胞表面分子（CD2、CD5またはCD28）に対するmAbは、い
ずれかのICAMRgと同時固定化した場合は、Ｔ細胞を活性
化することができなかった。
抗TCRmAbと同時固定化したとき、ICAM−1Rgによって
誘発された増殖反応は、ICAM−2Rgによって誘発された
それより常に強力であった。ICAM−1RgおよびICAM−2Rg
で誘発されるCD4+T細胞増殖の定量的な相違は、これら
反応の動態における相違によるものであった。したがっ
て、固定化ICAM−1RgおよびICAM−2Rgの補助的刺激の動
態を調べた。図３に示すように、ICAM−１誘発およびIC
AM−２誘発CD4+T細胞増殖反応は両方とも、培養開始後
４日目に容易に検出できたが、いずれのICAMによるピー
クの反応も培養６日目に常に認められた。培養期間を６
日以上に延長したとき、常にＴ細胞増殖の減少をもたら
した。
誘発された増殖反応は、ICAM−2Rgによって誘発された
それより常に強力であった。ICAM−1RgおよびICAM−2Rg
で誘発されるCD4+T細胞増殖の定量的な相違は、これら
反応の動態における相違によるものであった。したがっ
て、固定化ICAM−1RgおよびICAM−2Rgの補助的刺激の動
態を調べた。図３に示すように、ICAM−１誘発およびIC
AM−２誘発CD4+T細胞増殖反応は両方とも、培養開始後
４日目に容易に検出できたが、いずれのICAMによるピー
クの反応も培養６日目に常に認められた。培養期間を６
日以上に延長したとき、常にＴ細胞増殖の減少をもたら
した。
ICAM−2Rgおよび、４つ（ICAM−1.4Rg）または２つ
（ICAM−1.2Rg）のＮ−末端側Ig様ドメインをもつICAM
−1Rgの補助的刺激効果の濃度依存性を調べた。図４に
示すように、抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）をそれぞれの
ICAMRgの濃度を増加させながら（５−500ng/ウェル）同
時固定化したとき、CD4+T細胞による正比例的な増殖反
応の増加が誘発された。ICAM−1RgとICAM−2Rgの補助的
刺激の相対的強度間に認められた相違は、調べた各濃度
で明白であった。ICAM−1.2RgおよびICAM−1.4Rgは両方
とも量的に同じＴ細胞増殖反応を誘発した。反対に、IC
AM−2Rgは、常にそのICAM−１対応物よりも弱いCD4+T細
胞増殖反応を誘発した。
（ICAM−1.2Rg）のＮ−末端側Ig様ドメインをもつICAM
−1Rgの補助的刺激効果の濃度依存性を調べた。図４に
示すように、抗TCR−1mAb（50ng/ウェル）をそれぞれの
ICAMRgの濃度を増加させながら（５−500ng/ウェル）同
時固定化したとき、CD4+T細胞による正比例的な増殖反
応の増加が誘発された。ICAM−1RgとICAM−2Rgの補助的
刺激の相対的強度間に認められた相違は、調べた各濃度
で明白であった。ICAM−1.2RgおよびICAM−1.4Rgは両方
とも量的に同じＴ細胞増殖反応を誘発した。反対に、IC
AM−2Rgは、常にそのICAM−１対応物よりも弱いCD4+T細
胞増殖反応を誘発した。
CD4+T細胞を補助的刺激するICAM−2RgおよびICAM−2:
CD31Rgの相対的能力を調べた。７つのIg様ドメインをも
つICAM−2:CD31キメラを、CD31Rgの７つのＮ−末端側ド
メインのうちの２つをICAM−２の２つのドメインで置き
換えることによって、図１に示したように構築した。図
５に示したように、ICAM−2RgもICAM−2:CD31Rgも量的
に等しいCD4+T細胞の増殖反応を誘発した。CD31由来ド
メインをもつICAM−２分子の大きさの増加は、ICAM−２
の補助的刺激特性を強化しなかった。ICAM−1.2Rgおよ
びICAM−1.4Rgの両方とも、ICAM−2RgまたはICAM−2:CD
31Rgのいずれよりも、CD4+T細胞の増殖誘発においてよ
り効果があった。CD31RgまたはELAM−1Rg（両方とも陰
性コントロールとして使用）のいずれも、抗TCRmAbと共
同して補助的刺激されたCD4+T細胞に対する能力を欠い
ていた。
CD31Rgの相対的能力を調べた。７つのIg様ドメインをも
つICAM−2:CD31キメラを、CD31Rgの７つのＮ−末端側ド
メインのうちの２つをICAM−２の２つのドメインで置き
換えることによって、図１に示したように構築した。図
５に示したように、ICAM−2RgもICAM−2:CD31Rgも量的
に等しいCD4+T細胞の増殖反応を誘発した。CD31由来ド
メインをもつICAM−２分子の大きさの増加は、ICAM−２
の補助的刺激特性を強化しなかった。ICAM−1.2Rgおよ
びICAM−1.4Rgの両方とも、ICAM−2RgまたはICAM−2:CD
31Rgのいずれよりも、CD4+T細胞の増殖誘発においてよ
り効果があった。CD31RgまたはELAM−1Rg（両方とも陰
性コントロールとして使用）のいずれも、抗TCRmAbと共
同して補助的刺激されたCD4+T細胞に対する能力を欠い
ていた。
実施例８
抗原初期化Ｔ細胞に対するICAM−2Rgの補助的刺激効果
抗原で刺激したCD4+T細胞を補助的刺激するICAM−2Rg
の能力を調べた。葡萄球菌外毒素（スーパーAg）で刺激
した培養から分離したCD4+T細胞を完全培地で12−16時
間休止させ、続いて、ICAM−１またはICAM−2Rgで同時
固定化した抗TCR−1mAbに対する反応における増殖を調
べた。図６に示したように、固定化抗TCR−１単独は抗
原初期化CD4+T細胞の増殖を誘発した。しかし、いずれ
かのICAMRgとともに抗TCR−１を固定したとき、この増
殖はさらに増加した。ICAM−1Rgの優れた補助的刺激効
果もまた、抗原初期化Ｔ細胞について明白であった。同
様な結果が、DRw6初期化CD4+T細胞株を用いて得られ
た。
の能力を調べた。葡萄球菌外毒素（スーパーAg）で刺激
した培養から分離したCD4+T細胞を完全培地で12−16時
間休止させ、続いて、ICAM−１またはICAM−2Rgで同時
固定化した抗TCR−1mAbに対する反応における増殖を調
べた。図６に示したように、固定化抗TCR−１単独は抗
原初期化CD4+T細胞の増殖を誘発した。しかし、いずれ
かのICAMRgとともに抗TCR−１を固定したとき、この増
殖はさらに増加した。ICAM−1Rgの優れた補助的刺激効
果もまた、抗原初期化Ｔ細胞について明白であった。同
様な結果が、DRw6初期化CD4+T細胞株を用いて得られ
た。
実施例９
ICAM−1RgおよびICAM−2Rgの補助的刺激効果はIL2/IL2
レセプター系を必要とする CD4+T細胞によるIL−２レセプターの発現を誘発する
同時固定化したICAM−2Rgおよび抗TCR−1mAbの能力を調
べた。固定化したICAM−2Rgもしくは抗TCR−1mAbまたは
両方の存在下でＴ細胞を培養し、60時間後CD25（IL−2R
a）の細胞表面発現のレベルを、フローサイトメトリー
でモニターした。図７で示したように、同時固定化ICAM
−1RgまたはICAM−2Rgおよび抗TDR−1mAbへのCD4+T細胞
の結合は、固定化抗TCR−1mAbとともに培養した場合よ
り、極めて高い％のCD4+T細胞にIL−2Rの発現を誘発
し、EAM−1Rg（＞５％CD25+）は、同時固定化ICAM−2Rg
で誘発した場合（〜25％CD25+）よりも常に高かった。
さらに、抗TCR−1mAbおよびICAM−1RgまたはICAM−2Rg
のいずれかで刺激したCD4+T細胞は、固定化抗TCR−1mAb
単独またはいずれかの固定化ICAMRgとともにウェル中で
インキュベートした場合（＞0.1U/ml）よりも、極めて
多いIL−２（ICAM−1Rgで2.5−6U/ml、ICAM−2Rgで1U/m
l）を産生した。したがって、ICAM−１およびICAM−2Rg
の相対的補助的刺激強度の相違は、またIL−2Rを誘発す
るその能力においても明白であった。mAb抗Tac（抗CD2
5）は、抗TCR−1mAbおよびICAM−1RgまたはICAM−2Rgの
いずれかを同時固定化することによって誘発されるCD4+
T細胞の増殖反応を顕著に抑制した。これらの結果は合
わせると、抗TCR−1mAbおよびいずれかのICAMRgの同時
固定化によって誘発されるCD4+T細胞の増殖反応は、少
なくとも部分的にはIL−2/1L−2Rオートクリン系を介し
て仲介されるということを示している。
レセプター系を必要とする CD4+T細胞によるIL−２レセプターの発現を誘発する
同時固定化したICAM−2Rgおよび抗TCR−1mAbの能力を調
べた。固定化したICAM−2Rgもしくは抗TCR−1mAbまたは
両方の存在下でＴ細胞を培養し、60時間後CD25（IL−2R
a）の細胞表面発現のレベルを、フローサイトメトリー
でモニターした。図７で示したように、同時固定化ICAM
−1RgまたはICAM−2Rgおよび抗TDR−1mAbへのCD4+T細胞
の結合は、固定化抗TCR−1mAbとともに培養した場合よ
り、極めて高い％のCD4+T細胞にIL−2Rの発現を誘発
し、EAM−1Rg（＞５％CD25+）は、同時固定化ICAM−2Rg
で誘発した場合（〜25％CD25+）よりも常に高かった。
さらに、抗TCR−1mAbおよびICAM−1RgまたはICAM−2Rg
のいずれかで刺激したCD4+T細胞は、固定化抗TCR−1mAb
単独またはいずれかの固定化ICAMRgとともにウェル中で
インキュベートした場合（＞0.1U/ml）よりも、極めて
多いIL−２（ICAM−1Rgで2.5−6U/ml、ICAM−2Rgで1U/m
l）を産生した。したがって、ICAM−１およびICAM−2Rg
の相対的補助的刺激強度の相違は、またIL−2Rを誘発す
るその能力においても明白であった。mAb抗Tac（抗CD2
5）は、抗TCR−1mAbおよびICAM−1RgまたはICAM−2Rgの
いずれかを同時固定化することによって誘発されるCD4+
T細胞の増殖反応を顕著に抑制した。これらの結果は合
わせると、抗TCR−1mAbおよびいずれかのICAMRgの同時
固定化によって誘発されるCD4+T細胞の増殖反応は、少
なくとも部分的にはIL−2/1L−2Rオートクリン系を介し
て仲介されるということを示している。
実施例10
ICAMRgの補助的刺激時のCD11a/CD18（LFA−１）の役割
ICAM−１およびICAM−２は両方とも、全ての白血球０
の表面上のCD11a/CD18（LFA−１）に結合することが示
された。ICAM−１およびICAM−２の補助的刺激効果の間
のＴ細胞表面におけるLFA−１の役割を調べた。ICAM−
１およびICAM−２の両方を、それぞれ別個に抗TCR−1mA
bとマイクロタイター培養ウェルに同時に固定化した。
これらのウェルで、CD11a、CD11c、CD18、CD19またはIC
AM−１に対する可溶性mAb（10μg/ml）の存在下でCD4+T
細胞を培養した。CD11aまたはCD18のいずれかに対するM
abは、これらの培養でいずれかのICAMで誘発したＴ細胞
増殖を殆ど完全に抑制した（図８）。反対に、抗ICAM−
1mAb84H10は、固定化ICAM−1Rgに対するＴ細胞を反応を
抑制したが、ICAM−2Rgに対しては抑制しなかった。コ
ントロールとして用いた抗CD19mAb4G7は、いずれのICAM
Rgの補助的刺激効果を抑制しなかった。これらの結果
は、ICAMとCD11a/CD18（LFA−１）複合体とのＴ細胞表
面上での相互作用は、上記の補助的刺激効果の仲介に非
常に重要であるということを明らかにしている。
の表面上のCD11a/CD18（LFA−１）に結合することが示
された。ICAM−１およびICAM−２の補助的刺激効果の間
のＴ細胞表面におけるLFA−１の役割を調べた。ICAM−
１およびICAM−２の両方を、それぞれ別個に抗TCR−1mA
bとマイクロタイター培養ウェルに同時に固定化した。
これらのウェルで、CD11a、CD11c、CD18、CD19またはIC
AM−１に対する可溶性mAb（10μg/ml）の存在下でCD4+T
細胞を培養した。CD11aまたはCD18のいずれかに対するM
abは、これらの培養でいずれかのICAMで誘発したＴ細胞
増殖を殆ど完全に抑制した（図８）。反対に、抗ICAM−
1mAb84H10は、固定化ICAM−1Rgに対するＴ細胞を反応を
抑制したが、ICAM−2Rgに対しては抑制しなかった。コ
ントロールとして用いた抗CD19mAb4G7は、いずれのICAM
Rgの補助的刺激効果を抑制しなかった。これらの結果
は、ICAMとCD11a/CD18（LFA−１）複合体とのＴ細胞表
面上での相互作用は、上記の補助的刺激効果の仲介に非
常に重要であるということを明らかにしている。
前出の記載および実施例は本発明の説明を目的とし、
制限的なものではない。本発明の範囲内で種々の変更お
よび修飾を達成することが可能である。
制限的なものではない。本発明の範囲内で種々の変更お
よび修飾を達成することが可能である。
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02
(72)発明者 ダームル ニティン
アメリカ合衆国 ワシントン州 98056
レントン サウスイースト シックス
ティース プレイス 11717
(56)参考文献 特開 平３−157397（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−61486（ＪＰ，Ａ)
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，65（1991），ｐ.
6015−6023
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，147（1991）,
ｐ．3788−3793
Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，16
（1986），ｐ．851−854
Ｎａｔｕｒｅ，331（1988），ｐ．84
−86
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅ
ｒ，21（1989），ｐ．243−248
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 19/00
A61K 38/00
A61P 37/02
C07K 14/725
C12N 15/09
C12P 21/02
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (17)
- 【請求項１】ICAM−２のCD11a/CD18に対する結合特異性
を有する第一の領域を含み、免疫グロブリン定常領域に
対応する第二の領域に、該第一の領域が機能しうるよう
に連結されていることを特徴とする可溶性融合分子。 - 【請求項２】前記第一の領域が、ICAM−２の細胞外部分
を含む、請求の範囲第１項に記載の可溶性融合分子。 - 【請求項３】前記第二の領域が、IgG定常領域に対応す
る、請求の範囲第１項に記載の融合分子。 - 【請求項４】組換え発現によって製造される、請求の範
囲第１項に記載の融合分子。 - 【請求項５】ICAM−２の細胞外部分を有する第一の領域
を含み、IgG定常領域に対応する第二の領域に、該第一
の領域が機能しうるように連結されている請求の範囲第
１項に記載の可溶性融合分子。 - 【請求項６】ICAM−２のCD11a/CD18に対する結合特異性
を有する第一の領域を含み、免疫グロブリン定常領域に
対応する第二の領域に、該第一の領域が機能しうるよう
に連結されていることを特徴とする組換え融合分子。 - 【請求項７】前記第一の領域が、ICAM−２の細胞外部分
を有し、前記第二の領域が、IgG定常領域に対応する、
請求の範囲第６項に記載の組換え融合分子。 - 【請求項８】該組換え融合分子が、以下の工程： （ａ）ICAM−２の細胞外部分をコードするcDNAをIgG発
現ベクターでサブクローニングする工程、及び （ｂ）IgG定常領域に、機能しうるように連結されたICA
M−２の細胞外部分を含む組換え融合分子を発現させ、
そして単離する工程、 によって製造される、請求の範囲第７項に記載の組換え
融合分子。 - 【請求項９】Ｔ細胞を活性化するための医薬組成物であ
って、該Ｔ細胞を補助的に刺激するのに有効な量の可溶
性融合分子を含有し、該可溶性融合分子が、ICAM−２の
CD11a/CD18に対する結合特異性を有する第一の領域を含
み、免疫グロブリン定常領域に対応する第二の領域に、
該第一の領域が機能しうるように連結されていることを
特徴とする組成物。 - 【請求項１０】該融合分子が、ICAM−２の細胞外部分に
対応する第一の領域と、IgG定常領域に対応する第二の
領域とを有する、請求の範囲第９項に記載の組成物。 - 【請求項１１】当該融合分子が組換え発現によって製造
される、請求の範囲第９項に記載の組成物。 - 【請求項１２】CD4+T細胞の増殖反応を増加させるため
の医薬組成物であって、補助的刺激性の可溶性融合分子
を含有し、該融合分子が、ICAM−２のCD11a/CD18に対す
る結合特異性を有する第一の領域を含み、IgG定常領域
に対応する第二の領域に、該第一の領域が機能しうるよ
うに連結されていることを特徴とする組成物。 - 【請求項１３】該融合分子が、ICAM−２の細胞外部分に
対応する第一の領域と、IgG定常領域に対応する第二の
領域とを有する、請求の範囲第12項に記載の組成物。 - 【請求項１４】該融合分子が組換え発現で製造される、
請求の範囲第12項に記載の組成物。 - 【請求項１５】Ｔ細胞によるIL−２の産生を誘発するた
めの医薬組成物であって、補助的刺激性の可溶性融合分
子を含み、該可溶性融合分子が、ICAM−２のCD11a/CD18
に対する結合特異性を有する第一の領域み、IgG定常領
域に対応する第二の領域に、該第１の領域が機能しうる
ように連結されていることを特徴とする組成物。 - 【請求項１６】該融合分子が、ICAM−２の細胞外部分に
対応する第一の領域と、IgG定常領域に対応する第二の
領域とを有する、請求の範囲第15項に記載の組成物。 - 【請求項１７】該融合分子が、組換え手段によって製造
される、請求の範囲第15項に記載の組成物。
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