PT101148B - Moleculas de fusao soluveis com especificidade de ligacao para as moleculas de adesao celulares - Google Patents
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Description
V DESCRIÇÃO U- "MOLÉCULAS DE FUSÃO SOLÚVEIS COM ESPECIFICIDADE DE LIGAÇÃO PARA AS MOLÉCULAS DE ADESÃO CELULARES"
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a moléculas de fusão solúveis que possuem uma região com especificidade de ligação para CD11a/CDl8 e uma região correspondente a uma região constante da imunoglobuiina, tais como as moléculas re combinantes que contêm uma região de ligação CD11a/CDl8 extra celular da MAIC-2 (molécula 2 de adesão intercelular) e uma região constante de uma IgG. As moléculas da presente invenção são ainda utilizadas em métodos para afectar as respostas das células T e a sua actividade.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
0 complexo CD3/RCT (receptor do antígeno das células T) à superfície das células T não só reconhece um an tígeno alienígena (Ag) no contexto das próprias moléculas de maior histocompatibilidade (MHC) expressas à superfície das células que exibem o antígeno (CEA) mas também participa na transdução do sinal para iniciar a activação das células T [Clevers H. et al. , ( 1988) Ann. Rev. Immuno. 6^: 629 3· Embora a interacção entre os complexos CD3/RCT e Ag/MHC nas CEA 2 seja essencial para iniciar a activação das células T, não é normalmente suficiente e necessita da participação de outras moléculas de superfície celular as quais medeia a ade são e/ou a transdução do sinal para a expressão óptima das diversas funções das células T activadas [Clervers H. et al. ( 1988) Ann. Rev. Immuno. £:629; Springer T.A. ( 1990) Nature 346:425 ; Moller C·. ( 1990) Immunol. Rev. 114:217]. A molécula de adesão leucocitária LFA (CD11a/CDl8)expressa na superfície de todos os leucócitos maduros media uma grande variedade de interacções com outras células somáticas durante a resposta imunitária e a inflamação por tornar interactiva com o seu ligando a molécula 1 de adesão intercelular (MAIC/CD54) [Springer T.A. (1990) Nature 346:425; Moller G. (1990); Moller G. (1990) Immunol. Rev. 114:217; Kishimoto T.K. et al. (1989)· Adv. Immunol. 46:149; Marlin S.D. et al. (1987 Cell 5J.:813; Mak goba M.W. et al. (1988) Nature 331 :86; Staunton D.E. et al. ( 1988) Cell 52:925; Simmons, D. et al. , (1988) Nature 331:624; Staunton D. E. et al., (1990) Cell H:243; Boyd A.W. et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:3Q95 ; Dougherty, G. et al. , ( 1988) Eur. J. Immunol, _1_8:35; Altmann D.M. et al., (1989) Nature 338:512]. A MAIC-1 é constitutivamente ex_ pressa em alguns tecidos e induzida noutros durante a inflamação [Dustin M.L. et al. (1986) J. Immunol. 137:245]· A MAIC- 3 -1 proporciona um importante sinal co-estimuiador através da sua interacção aderente com a LFA-1 durante a activação das células T em repouso mediada pelo complexo CD3/RCT [Van Se-venter G.A. et al. ( 1990) J. Immunol. 144:4579 ] · Recentemente, foi identificado outro ligando para a LFA-1, designado por MAIC-2 que pode mediar a aderência de células LFA-I+, independente da MAIC-1 [Staunton D.E. et al. (1989) Nature 339:61 : Dustin M.L. et ai., ( 1989) Coid Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 5_4:753]· A expressão da MAIC-2 é restrita e não é facilmente bem regulada com extímulos pró-inflamatório [De Fougerolies A.R. et al., (1991) J. Exp. Med. 174:253; Nortamo, P. et al., (1991) J. Immunol. 146:2530] .
Na presente invenção foram criadas proteínas de fusão de imunoglobulina das MAIC-1 e MAIC-2 recombi-nantes solúveis para se analisar e comparar as funções dessas moléculas nas interacções celulares subjacentes a diversas respostas imunitárias. A presente invenção demonstra que, tal como a sua homóloga MAIC-1 , a MAIC-2 pode proporcionar um importante sinal co-estimolador durante a activação das céiu las CD4 estimulada por RCT. A adesão co-estimuladora mediada pela interacção LFA-1: MAIC-2 pode eventualmente proporcionar um caminho crítico para a iniciação da activação das células T com MAIC-1 ou MAIC-1escassas ou MAIC-2+ das CEA.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a moléculas u
Ué fusão solúveis e a métouos para a sua utilização. Essas moléculas de fusão contêm a região que possui uma especificidade de ligação a CD11a/CDl8 . Esta região stá funcionalmente ligada ou unida a uma segunda região que corresponde pratica mente a uma região constante da imunogiobulina. São conhecidas diversas moléculas de adesão que possuem uma especifici uade de ligação a CD11a/CDl8. A maior parte dessas molélas está associada à membrana celular e consequentemente essas mo léculas são insolúveis e abrangem as MAIC-1 e MAIC-2.
Na presente invenção utiliza-se a porção so lúvel extracelular de uma dessas moléculas de adesb que mantém a especificidade de ligação a CD11a/CDl8. Esta região extracelular está ligada a uma região constante da Ig tal como uma região constante da IgG ou da IgM. como exemplo da molécula de fusão da presente invenção refere-se uma proteína que possui uma região que corresponde praticamente a uma porção extracelular da MAIC-2 e uma segunda região que corresponde praticamente a uma porção de uma região constante da IgG. As moléculas da presente invenção podem ser produzidas por sínt£ se química ou por expressão recombinante.
No caso de se utilizar uma molécula de fusão recombinante, é possível produzi-la por técnicas normalizadas de clonagem de genes. Por exemplo, é possível produzir uma molécula de fusão recombinante específica da ftAIC-2 e da região constante da IgG efectuando primeiro a subclonagem de 5 um ADNC que codifica uma porção extraceiuiar daMAIC-2 no interior de um vector de expressão da IgG. 0 ADN cionado pode ser depois transcrito e a molécula de fusão expressa. A seguir isola-se a proteína expressa proporcionando uma moié cuia de fusão recombinante que contém uma porção extraceiuiar da MAIC-2 funcionalmente ligada a uma região constante da IgG.
As moléculas de fusão da presente inveção podem ser utilizadas como agentes co-estimuladores para a activação das células T e em métodos para aumentar a resposta proliferativa das células T CD4+ e a indução da IL-2 pelas cé lulas T. As células T podem ser activadas segundo o método da presente invenção fazendo contactar as células cora um ligando susceptível de ligar as CD3 às células T e com uma quantidade eficaz co-estimuladora de uma molécula de fusão da presente invenção. A proliferação das células T e a indução da IL-2 é estimulada na presente invenção fazendo contactar céiu las T susceptíveis com uma molécula de fusão da presente invenção durante um intervalo de tempo suficiente para induzir o crescimento celular e para permitir a indução da IL-2, res oectivamente.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIGURA 1 ilustra genes de fusão da Gr MAIC solúvel. Os exãos de anticorpos (IgG1 humana) são representados pelos rectângulos negros e os intrãos são repre- - w- sentados pelas linhas de ligação. Os símbolos H, e CH^ repre sentam respectivamente a bifurcação da IgG1 e os exãos das regiões constantes e CH^, estando a sequência do sinal (SS) do terminal N da MAIC-1 e os domínios semelhantes a Ig (D1-D5) representados por rectângulos a ponteado. A SS de terminal N da MAIC-2 e os domínios semelhantes a Ig (Dl e D2) são representados por rectângulos a tracejado. A SS do terini nal N da CD31 e os domínios semelhantes a Ig (d1-D7) são re_ presentados por rectângulos simples. λ, /Τ';· Â,FIGURA 2/ilustra a capacidade das Gr das Cd7, MAIC-1 ou MAIC-2"co-imobilizadas com o anti-RCT-1 para estimularem a proliferação das células T CD+. Preparou-se uma cultura de 50 000 células T CD4+ com Gr CD7j Gr MAIC--1,5 ou Gr MAIC-2 imobilizadas (100 ng/cavidade) e alternativamente com anti-CDIÇ ou Acm anti-RCT-1 (50 ng/cavidade) num volume final de 0,2 ml de meio completo por microtitula- ' ção. Mediu-se a incorporação de 3H-TdR nessas culturas ao quarto dia. A FIGURA 3 ilustra a cinética do efeito co--estimulador das Gr MAIC-1 e MAIC-2. Preparou-se uma cultura de 50 000 células T CD4+ em repouso com Acm anti-RCT-1 (50 ng/cavidade) co-imobilizado can 3r ELAM-1 (como controlo)
Gr MAIC-1 e Gr MAIC-2 na proporção de 100 ng/cavidade.Procedeu-se à medição das respostas proliferativas nessas culturas nos manentes indiesdes. 8 8
A FIGURA 4 ilustra a dependencia dos efeitos co-estimuiadores das GR MAIC-1 e MAIC-2 em relação à concentração. Procedeu-se à co-imobilização das Gr MAIC-1,2 MAIC-1,4 ou MAIC-2 para vários valores de concentração conjuntamente com Acm anti-RCT-1 (50 ng/cavidade) antes da adi_ ção de 50 000 células T CDH^em repouso/cavidaue. As respos tas proliferativas nestas culturas foram medidas no 42 dia. A FIGURA 5 ilustra a comparação das activ_i daues co-estimuladoras de várias Gr MAIC. Procedeu-se à co-imobilização do Acm anti-RCT-1 (50 ng/cavidade) com as Gr CD7, CD31, MAEL-1, MAIC-1,2, MAIC-1,4, MAIC-2 ou MAIC-2:CD31 na proporção de 100 ng/cavidade antes da adição de 50 000 células T CD4+ em repouso/cavidade. Procedeu-se à medição das respostas proliferativas nessas culturas no 42 dia. A FIGURA 6 ilustra o facto de a Gr MAIC-2 também poder co-estimular a proliferação das células T CD4+ activadas pelo Ag. Procedeu-se à co-imobilização do Acm anti-RCT-1 na proporçãode 50 ng/cavidade na ausência ou na presença de Gr MAIC-1,4 ou Gr MAIC-2 na proporção de 100 ng/ /cavidade de um conjunto de cavidades com culturas microti-tulaslas. Adicionou-se a essas cavidades das culturas 50 000 células T CD4+ em repouso provenientes de culturas com exotoxinas estafilocócitos distintas e procedeu-se às correspondentes medições das respostas proliferativas no 3-dia. 9 9
A FIGURA 7 ilustra a indução de CD25/IL--2R X sobre a superfície de células T CDU+ por co-estimu-lação com diversas Gr MAIC. Preparou-se uma cultura de células T CDH+-CD25 em repouso conjuntamente com anti-RCT-1 (50 ng/cavidaue) co-imobilizado com as Gr ELAM-1 (utilizada com controlo), MAIC-1,2, MAIC-1,4 ou MAIC-2 (100 ng/cavi-dade) . Decorridas 60 horas procedeu-se à colheita das células T a partir dessas culturas sendo submetidas a exame para verificação da sua expressão das CD25 por análise de imunofluorescência directa. A FIGURA 8 ilustra o facto de o efeito co--estimulador da MAIC-2 implicar a participação do complexo CD11a/CDl8 (LFA-1) sobre as células T. Procedeu-se à prepa ração de uma cultura de 50 000 células T CD4+ com anti--RCT-1 co-imobilizado com as Gr MAIC-1,4 ou MAIC-2 na presen ça de Acm (anticorpo monoclonal) solúvel (10 jag/ml) reactivo com CD 11 a, CD18, CD19 ou MAIC-1. As respostas proliferati_ vas nessas culturas foram medidas no 42 dia.
DESCRIÇÃO DOS ASPECTOS PREFERENCIAIS A activação das células T exige frequentemente a simultaneidade dos sinais fornecidos pela ligação do RCT e dos sinais resultantes das interacções co-estimuladoras entre algumas moléculas acessórias da superfície das células T e os seus respectivos ligandos nas CEA. 0 complexo LFA-1 10 10 das nas células T modula a activação das células T por interac-ção com os seus ligandos MAIC-1 e/ou MAIC-2 na superfície das CEA. Foi já demonstrada a capacidade co-estimuiadora da MAIC-1 . Aqui utiliza-se uma proteína de fusão da imunoglobu-lina MAIC-2 (globulina receptora, Gr) para se demonstrar o efeito co-estimuiador da iMAIC-2 durante a activação das células T CD4+. Quando co-imobilizada com o Acm anti-RCT-1, a GR MAIC-2 induziu uma vigorosa resposta proliferativa das cé lulas T CD4+. Este efeito co-estimulador da MAIC-2 dependeu da sua co-imobilização com o Acm dirigido ao complexo CD3/ /RCT mas não dirigido às CD2 ou CD28. Tanto as células T CD4+ em repouso com as actividaues pelo antígeno responderem aos efeitos co-estimuladores da MAIC-2. A adição de Acra dirigido às moléculas CD11a ou CD18 quase inibiu completamen te as-respostas à Gr MAIC-2. Estes resultados são consistentes com a função do complexo LFA-1 como receptor da MA'I‘C;-2 e como mediador dos seus efeitos co-estimuladores. A estimulação das células T com anti-RCT-1 e MAI.C,— 2 co-imobiliza-dos tem como resultado a indução do receptor da IL-2 (CD25) e o Acm anti-Tac (CD25) inibiu esta resposta sugerindo a contribuição da IL-2 sintetizada endogenamente durante esta estimulação. Estes resultados demonstram que tal como sucedia com a sua homóloga MAIC-1, a MAIC-2 também exerce um forte efeito co-estimulador durante a activação das células T mediada peio RCT. Os efeitos co-estimuladores gerados pela interacção LFA-1:MAIC-2 podem ser críticos durante o início da activação das células T pelas MAIC-1escassos -11- CEA.
Para se descrever mais claramente a presente invenção e os seus diversos aspectos, introduz-se as definições a seguir descritas. 0 termo "transfecção" , tal como é utilizado na presente memória descritiva, significa a aquisição de novos marcadores genéticos pela incorporação nas células euca-rióticas do ADN adicionado. 0 termo "transformação" tal como é utilizado na presente memória descritiva, significa a aquisição de novos marcadores genéticos pela incorporação nas células pro-carióticas do ADN adicionado. A expressão "vector de clonagem", tal como é utilizado na presente memória descritiva, significa qualquer plasmido ou vírus no qual é eventualmente possível inserir um ADN estranho para ser clonado. e utilizado na circular autó- 0 termo "plasmido", tal como presente memória descritiva, significa um ADN nomo extracromossómico anto-replicativo. A expressão "quadro de leitura aberta" (QLA), tal como é utilizada na presente memória descritiva, signi- 12 fica uma sequência de ADN com potencialidade para ser traduzida numa proteína. 0 termo "gene (cistrão)" tal como é utilizado na presente memória descritiva, significa o segmento dg,. ADN que codifica a sequência de uma cadeia peptídica; pode incorporar regiões que precedem e que se seguem à região de codificação (líder e seguidora) e bem assim as sequências intervenientes (intrãos) entre os segmentos de codificação individuais (exãos). 0 termo "expressão" tal como é utilizado na presente memória descritiva, significa um processo a que foi submetido um gene estrutural para proporcionar um pép-tido ou uma proteína. Ê uma combinação de transcrição e de tradução. 0 termo "clone", tal como é utilizado na presente memória descritiva, refere-se a qualquer número de células ou moléculas idênticas descendentes de uma única célula ou molécula progenitora. A expressão "par de-bases" (pb), tal como é utilizada na presente memória descritiva, significa uma asso ciação de adenina (A) com timina (T), ou de citosina (C) com guanina (G) numa hélice dupla de ADN. A expressão "vector de expressão", tai como é utilizada na presente memória descritiva, significa qualquer plasmido ou vírus em que é eventualmente possível inse rir e/ou expressar um ADN estranho. Como vectores de expres são ilustrativos refere-se os vectores que expressam a proteína CD8-IgG 1 [Aruffo et ai., ( 1990) Cell 6j_: 1303-1313] e os vectores que expressam as proteínas CDM-IgGl e CD4-IgM [Zattlmeissl et al. , ( 1990) DNA Cell Biol. 9:3^7-3531- A expressão "reacção em cadeia da polime-rase" (RCP), tal como é utilizada na presente memória descritiva, significa a amplificação das moléculas de ADN pela utilização sucessiva de uma ADN-polimerase termicamente está vei para copiar a cadeia de ADN, separando as cadeias supie mentares por aquecimento, adicionando precursores e repetindo o processo cerca de 30 vezes para produzir aproximada-mente 10^ cópias do ADN. Utilizando-se a técnica da RCP é possível amplificar quantidades diminutas de ADN para produzir ADN suficiente para utilização em diversos procedimentos . 0 termo "sintético", tal como é utilizado na presente memória descritiva, refere-se a uma molécula peo tídica que foi obtida por meios químicos, isto é, sintetizada quimicamente, em vez de ter sido preparada por meios biológicos tais como as técnicas de engenharia genética. A expressão "quantidade eficaz", tai como 14
é utilizada na presente memória descritiva significa uma quantidade suficiente para proporcionar de modo benéfico o resultado desejado. 0 termo "corresponder” nas suas diversas formas gramaticais, tal como é utilizado na presente memória descritiva e nas reivindicações anexas reiativamente às sequências peptídicas ou proteicas, significa a sequência des_ crita até mais ou menos dez resíduos de aminoácidos em qual quer dos terminais amino e carboxi ou em ambos e contendo apenas substituições conservativas nos resíduos de amino ácidos particulares existentes ao longo da sequência peptí-dica e/ou proteica. A expressão "substituição conservativa",tal como é utilizada na presente memória descritiva, significa que um resíduo de aminoácido foi substituído por outro res_í duo biologicamente idêntico. Como exemplos de substituições conservativas referem-se as substituições de um resíduo hidrofóbico tal como lie, Vai, Leu, ou Met por outro, ou as substituições de resíduo polar por outro tais como as substituições entre Arg e Lys, entre Glu e Asp ou entre Gin e Asn, e semelhantes.
Em alguns casos a substituição de um resíduo iónico por um outro resíduo iónico carregado com uma carga de sinal oposto tal como a substituição de Asp por Lys foi con- 15 15
siderada de tipo conservativo pelos especialistas na matéria na medida em que se admite que esses grupos iónicos têm apenas a função de proporcionar melhor solubilidade. Contudo, de uma forma gerai, uma vez que as substituições discutidas na presente memória descritiva são realizadas numa região relativamente curta do péptido de síntese, comparativamente com a totalidade da proteína, a substituição de um resíduo iónico por outro resíduo iónico de carga oposta é conside-J rada na presente memória descritiva como sendo uma "subs tituição radical" tal como sucede com.as substituições de resíduos não iónicos e iónicos e de resíduos de grande volu me tais como Phe, Tyr ou Trp e de resíduos de menor volume tais como Gly, Ile e Vai.
Os termos "resíduos não iónicos e iónicos" são utilizados na presente memória descritiva em conformidade com o see ..sentido habitual para designar respectiva-(· mente os resíduos de aminoácidos que não transportam nenhu ma carga ou que normalmente transportam uma carga respec-tivamente, para os valores fisiológicos do pH. Como exemplos de resíduos não iónicos refere-se os resíduos Thr e C-ln. ao passo que como exemplos de resíduos iónicos se refere os resíduos Arg e Asp. A expressão "molécula de adesão celular" utilizada na presente memória descritiva refere-se a moléculas inflamatórias específicas da superfície celular que 16 16
são reconhecidas pelo endotéiio vascular e/ou pelos granuló-citos e a eles se ligam. A expressão "região constante da IgG" utilizada na presente manxia descritiva refere-se aos domínios da cadeia gama (^ ) da molécula da IgG que estão adjacentes à região variável que corresponde aos primeiros 107 aminoácidos da ca ueia gama (γ) ou dos seus fragmentos. Os quatro domínios contidos na região constante da cadeia gama (γ ) são desig nados por CH^, H, CH^ e CH^. 0 domínio CH^ é adjacente á região variável e abrange os resíduos de aminoácidos 114 a 223- 0 domínio H (bifurcação; resíduos 224-245) é adjacente ao domínio CH^ e contém os resíduos de cisteína que formam as pontes de dissulfureto que ligam covalentemente as duas cadeias densas da imunoglobulina. O domínio CH2 é adjacente à bifurcação e abrange os resíduos de aminoácidos 246 a 361, seguindo-se o domínio CH^ o qual contém resíduos de aminoácidos 362 a 496. 0 termo "biblioteca", tal como é utilizado na presente memória descritiva, refere-se a uma grande colec ção aleatória de fragmentos de ADN clonados obtidos a partir de sistemas de transcrição com interesse. A expressão "funcionalmente ligado", tal como é utilizada na presente memória descritiva, refere-se a uma união que não interfere com a capacidade de qualquer dos 17 grupos ligados funcionar conforme descrito. Essas ligações podem ser formadas por meios de síntese e/ou recombinantes. De acordo com a variante preferencial liga-se funcionalmente uma região extracelular MAIC-2 a uma porção constante de uma molécula de imunoglobuiina tal como uma região constante da IgG de modo a permitir que a região MAIC-2 se ligue a CD 11a/CD18 . A expressão "veículo farmaceuticamente ace_i tável" , tal como é utilizada na presente memória descritiva, refere-se a um composto que é compatível com a administração a um paciente e não produz efeitos tóxicos ou indesejados pe rante essa adminsitração. Como exemplos ilustrativos de veicu los farmaceuticamente aceitáveis refere-se as soluções salinas tamponauas com fosfato, a solução de Ringer, os óleos os geles e as microsferas, e também os iipossomas. Existem outros veículos farmaceuticamente aceitáveis que são bem conhecidos no domínio farmacêutico e que consideram abrangidos pela presente invenção. 0 termo "praticamente" utilizado na presente memória descritiva significa um nível elevado de semelhança. A expressão "peptido praticamente purificado" na presente invenção significa uma preparação que possui menos de 10 % de péptiuos alienígenas presentes. Uma "sequência praticamente idêntica" da presente invenção possui uma variação inferior a cerca de 10 % relativamente à se- 18 18
auência da referência. 0 termo "clonagem" utilizado na presente memória descritiva e suas formas gramaticais refere-se à inserção de uma sequência de ADN no interior do genoma de uma célula procariótica ou eucariótica ou no interior de um organismo onde se pode reproduzir de forma idêntica. Essa clonagem origina a produção de moléculas de ADN recombinan-tes formadas pela união entre extremidades de diferentes ADN. 0 termo "subclonagem" utilizado na presente memória descritiva e as suas diversas formas gramaticais refere-se à inserção de uma sequência de um fragmento de ADNc genómico num vector de expressão. 0 termo "região" utilizado na presente me mória descritiva, quando associado a uma molécula, refere-se a qualquer porção ou domínio da molécula designada ou descrita tal como uma porção ou região extraceiular de uma mol£ cuia de adesão tal como a MAIC-1 ou a MAIC-2 ou uma região constante da IgG. A expressão "molécula de fusão", tal como é utilizado na presente memória descritiva, refere-se a".uma molécula construída que contém regiões e/ou características 19 designadas de duas ou mais moléculas diferentes. Na presen te invenção as moléculas de fusão contêm uma região de uma oiécula de adesão e uma região de uma imunoglobulina. Na pre sente invenção isto origina uma molécula de fusão solúvel que possui a especificidade de ligação de uma molécula de aue são celular. As moléculas de fusão podem ser preparadas even tualmente por métodos de síntese ou por métodos recombinan-tes . A expressão "especificidade de ligação", tal como é utilizada na presente memória descritiva, refere-se à afinidade selectiva de uma molécula para outra, tal como a ligação de anticorpos aos antígenos, dos receptores aos ligan dos e das enzimas aos substractos. Admite-se que todas as moléculas que se ligam com uma entidade particular possuam especificidade de ligação para essa entidade. Deste modo, os anticorpos que se ligam a um antígeno particular possuem~esp£ cificidade de ligação para esse antígeno e todos os ligandos que se ligam a um receptor celular específico possuem especificidade de ligação para esse receptor. A presente invenção revela novas moléculas de fusão solúveis e métodos que demonstram, de acordo com um aspecto preferencial, que a MAIC-2, tal como a sua homóloga MAIC-1, pode funcionar como um contra-receptor/ligando co--estimuiador durante a activação das células T. Esta observação permite que a MAIC-2 seja incluída num subgrupo dos mem 20 20
bros ua família uos supergenes Ig com capacidade para funcio narem com moléculas co-estimuladoras. Este subgrupo abrange as moléculas B7, MAIC-1 e VCAM-1 [Van Seventer G.A. et al. , ( 1990) J. Immunol. 144:4579; Damle N.K. et ai., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88_;6403; Bierer B.E. et ai., (J. Exp. Meu. 168:1145; Moingeion P. et al. (1989) Nature 339 : 312; Linsley P.S. et al., (1991) J. Exp. Med. ΓΠ:721]. Todas essas moléculas e ainda outras conhecidas pelos especialistas } na matéria podem eventualmente ser utilizada :para a formação de moléculas de fusão na presente invenção. As co-estimula-ções com a MAIC-2 demonstraram ser absolutamente dependentes da co-estimulações das células T através do complexo CD3/RCT e necessitam que tanto a anti-RCT-1 como a MAIC-2 s^ jam co-imobilizauas sobre a mesma superfície. 0 efeito co--estimulauor da MAIC-2 foi extraordinariamente semelhante ao efeito da MAIC-1, talvez devido ao facto de tanto a MAIC-1 como a MAIC-2 partilharem o mesmo receptor superficial, a () molécula LFA-1 (CD11a/CDl8) [Marlin S. D. et al. ( 1987)
Cell 5_1_:813; Mkgoba M.W. et ai., ( 1988) Nature 331 :86; Stauton D.E. et al., ( 1989) Nature 339 :61 ; Dustin M. tl. et al·, (1989)Coid Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 54:753]·
Apesar de utilizarem o mesmo receptor (LFA--1), as respostas induzidas pelas MAIC-1 e MAIC-2, embora semelhantes sob ponto de vista cinético, foram diferentes sob o ponto de vista quantitativo. As respostas prolifera- 21 tivas induzidas com a MAIC-2 também foram refiectiuas nas suas respectivas capacidades para induzirem a expressão do RIL-2 superficial e a síntese da IL-2. Os efeitos co-estimu ladores da MAIC-1 mais fortes observados comparativamente com os efeitos da MAIC-2 podem eventualmente ter sido devidos a diferenças da avidez relativa da interacção dessas duas moléculas com a LFA-1, possuindo a MAIC-1 uma avidez para a LFA-1 mais forte do que a MAIC-2 [Staunton D E. et al. ( 1989) Nature 339 :6l ; Dustin M.L. et al. ( 1989 ) Cold Spring Harbor Symp. Quant. 5_4_: 7 5 3 ; De Fougeroiles A.R. et al - (1991) J. Exp. Med. J_7_4:253l· 0 domínio extracelular da MAIC-1 é composto por cinco domínios de tipo Ig ao passo que o domínio extracelular da MAIC-2 possui apenas dois desses domínios [Staunton D. E. et al. , ( 1988) Cell 52:925, Simmons D. et al. (1988) Nature 331:624, Staunton D.E. et al., (1989) nature
339:61]. Estudos de inibição com distintos Acm anti-MAIC-1 permitiram cartografar o local da interacção da LFA-1 na MAIC--1 no primeiro domínio da molécula da MAIC-1 (Dl na FIGU RA 1) com alguma contribuição do domínio 2 [Staunton D.E. et al. , (199O) Cell 6j_:243], Embora os dois domínios do terminai N das MAIC-1 e MAIC-2 que mais contribuem para as suas inter-acções com a LFA-1 demonstrarem uma identidade de 34 % /Staun ton D.E. et al. (1989) Nature 339:61], a presença de mais três domínios na MAIC-1 pode proporcionar parciaimente alguma fie xibilidade adicional aos domínios de ligação da da MAIC-1 (Dl e D2) e consequentemente ser importante para a sua mais forte avidez para a FLA-1. 22 22
A possibilidade de que a presença de domínios adicionais na estrutura da MAIC-1 façam com que ela seja uma molécula co-estimuladora mais forte do que a MAIC--2 foi explorada por via experimentai preparando-se por técj nicas da engenharia genética uma molécula de Gr MAIC-1 que possuia apenas os dois domínios do terminal N mais contribu tivos das Gr MAIC-1 e MAIC-1,2. Por compacação directa, verificou-se que aGr MAIC-1 ,2 exibia um efeito co-estimulador ainda mais forte do que a Gr MAIC-2 (figura 4). Estes resul tados são consistentes e suportam melhor a conclusão de que os dois domínios de tipo Ig do terminal N mais contributi-vos da MAIC-1 são críticos no que diz respeito às suas in-teracções com a LFA-1 [Staunton, D. E. et ai., (1988) Ceil 52:925, Staunton D.E. et ai., ( 1990) Cell 61.:243].
Aumentou-se o tamanho da MAIC-2 dotando-a.com cinco domínios adicionais de tipo Ig provenientes da molécula CD13· A quimera Gr MAIC-2:CD31, que contém o domínio extra-celular da MAIC-2 que substitui os dois domínios do terminal N mais contributivos entre os sete domínios de tipo Ig da CD31 [Newman P.J. et ai. , ( 1990 ) Science 247:1219; Simmons D.L. et al., ( 1990) J. Exp. Meu. 171:2147] não foi nem mais nem menos eficiente na co-estimuiação das células T do que a molécula Gr MAIC-2. Conjuntamente,estes resultados indicam que as diferenças in vitro no que diz respeito aos efeitos co-estimuladores das MAIC-1 e MAIC-2 podem eventualmente ter as suas origens nas diferenças existentes nas estruturas primárias dos dois domínios de tipo Ig do terminal N mais contri - 23 butivos das respectivas moléculas e não em diferenças de comprimento e/ou flexibilidade das duas moléculas. Embora se tenha descoberto que as Gr MAIC-1 purificadas com domínios diferentes eram igualmente co-estimuladoras (resultados não apresentados), a presença de domínios adicionais na molécula MAIC-1 nativa pode eventuaimente projectá-la ainda mais no espaço extra-celular reduzindo consequentemente a interferên cia pelo glicocálice celular [Staunton D.E. (1989) Nature 339 ·· 61 ; De Fougerolles A.R. et ai. (1991) J. Exp. Med. 1 TH; 253]· A MAIC-2 na sua forma nativa pode eventualmente não possuir esta vantagem e talvez por esta razão, num contexto fisiológico, a adesão mediada pela MAIC-2 é mais fraca do que a adesão mediada pela MAIC-1 [Staunton D.E. (1989) 339: :61; De Fougerolles A.R. et al. (1991) J. Exp. Med. 17H:253]. 0 efeito co-estimulador da interacção entre a MAIC-1 e a LFA-1 sobre as células T foi observado em antí genos (Ag) estimulados e também em sistemas anti-CD3 estimulados [Altmann D.M. et al. , ( 1989) Nature 338_:512; Van Se-venter G.A. et al., (1990) J. Immunol, 744:4579]· A presente invenção demonstra que os efeitos co-estimuladores da MAIC-2, embora dependentes da interacção entre a MAIC-2 e a LFA-1,são também dependentes do complexo CD3/RCT. A LFA-1 sobre as células T em repouso não se liga à MAIC-1 imobilizada [Van Se venter G.A., et al. , ( 1990) J. Immunol.· 14'4«j*457; Dustin M. L. et al. , (1989) Nature 341:619] nem à MAIC-2. Os agonistas de PKC tais como PMA, os quais aumentam a avidez da LFA-1 para 24 24
a MAIC-1 [Van Seventer G.A. et ai., (1990) J. Immunol. 144; :457; Dustin M.L. et ai., ( 1989) Nature 341:619] não induzem a proliferação das células T dependentes das MAIC-1 ou MAIC-2. Todavia, a ligação do complexo CD3/RCT às células T que origina simultaneamente a activação de PKC e também a mo_ bilização do Ca^ livre intracelular [Weiss, A. et al., ( 1986) Annu. Rev. Immunol. _4:593l não só aumenta a videz da LFA-1 para as MAIC [Van Seventer G.A. et al., (1990) J. Im-munol. 144:457 ; Dustin M.L. et ai., ( 1989) Nature 341:619] masa também habilita as células T a receberem sinais co-est_i muladores fornecidos pelas MAIC [Van Seventer G.A. et al., (1990) J. Immunol. 144:457]· Embora os mecanismos moleculares pelos quais os ligandos da LFA-1 fornecem os seus sinais de activação continuem a ser muito mal compreendidos,a interligação com o Acm dirigido ao complexo CD3/RCT e â LFA--1 induz uma mobilização muito mais prolongada do CA^ livre intracelular e uma hidrólise do fosfaditil-inositol do que quando se utiliza apenas o Acm anti CD3 [Wacholtz, M.C. et al. (1989) J. Exp. Med. 170:431; Parai R. et al. (1989) J. Immunol. 143:3157 ] · Embora não seja directamente examinado na presente invenção, as MAIC quando imobilizadas com anti--RCT-1 podem eventualmente induzir uma 'geração prolongada semelhante de segundos mensageiros, 0 que é essencial para a activação das células T. Após a activação, a CD18 (LFA-l/3) é rapidamente fosforilada no resíduo de cerina ao passo que a fosforilação da cerina constitutiva da CD11a permanece inal terada [Catila T.A. et al . ( 19 8 8) J. Immunol. 140:4308 ]. 25
Mais importante ainda, após a activiuade das células T com CEA tornadas pulsatórias com o Ag, o complexo LFA-1 coloca liza-se com o complexo CD3/RCT no ponto focal do contacto en tre as células T e as CEA acompanhado pela reorganização do citoesqueleto, talvez por se apoderar fisicamente do componente talina do citoesqueleto [Kupfer A. et al., (1989)Annu. Rev. Immunol · Y_ : 309]· Sendo assim, seria interessante exa minar se a diferença nos efeitos co-estimuladores das MAIC-1 e MAIC-2 é reaimente devido ao facto de as MAIC se apoderarem de modo diferencial dos elementos do citoesqueleto atra vez do complexo LFA-1 [Kupfer A. et al., ( 1989) Annu. Rev. Immunol. ]_ : 309 ]· para reorientar os processos de activação [Van Noesel, C. et al., ( 1988) Nature 333 : 850].
Diferentemente do caso da MAIC-1, admite-se que a expressão da MAIC-2 seja muito mais restrita e que não seja modulada pelas citoquinas inflamatórias [Staun-ton D.E. et al., (1989) Nature 339-61: Nortamo P. et al., (1991) J. Immunol. 146:2530]· Mais importante ainda, a;MAIC-=2"encontrá-se presente predominantemente nas células endote liais vasculares e em algumas células intersticiais incluin do as células dendídricas [Staunton D. E. et al., (1989) Na ture 3 39:6 1 ; De Fougeroiles A.R. et al., (1991) J. Exp.Med. 174:253; Nortamo P. et al. , (1991) J. Immunol. 146 :2530] · À luz do seu efeito co-estimulador, a MAIC-2 pode eventualmente suportar a activação das células T pelas MAIC-1 ou CEA escassa antes de poder ser regulada a expressão da MAIC-1.
Tendo em consideração a maior expressão da MAIC-2 nas células endoteliais vasculares, o comportamento co-estimulador da MAIC-2 pode eventualmente ser significativo durante a pa-togénese de algumas respostas inflamatórias . Por exemplo, as MAIC-2 expressas nas células encoteliais vasculares podem eventualmente suportar a adesão/activação das células T activadas intravascularmente para dar início e subsequentemente exacerbar as manifestações inflamatórias intravasculares associadas com o síndroma do choque tóxico induzido pelas exotoxinas estafilocócitas (Super Ag) ou com o sindro ma do choque vascular associada à administração de doses elevadas de IL-2 durante a terapia do cancro [Resnick S. D. ( 1990) J. Pediatr. 116;321 ; Damie N.K. et al., J. Immunol. 142:2660 ] .
Deste modo, quaisquer modalidades terapêuticas orientadas no sentido da inibição das interacções dependentes da MAIC-2 podem eventualmente demonstrar ser cli nicamente vantajosas para os tratamentos de doenças inflamatórias intravasculares.
Após se ter descrito a presente invenção de uma forma genérica é possível conseguir-se uma melhor compreensão da mesma tomando como referência alguns exemplos específicos a seguir descritos apenas com fins ilustrativos , não se pretendendo com eles introduzir qualquer iimi tação salvo quando especificado de outro modo. 27 27
EXEMPLO 1
CONSTRUÇÃO E PREPARAÇÃO DA Gr MAIC
Procedeu-se à amplificação das sequên cias de ADNc MAIC-1 que codificam os dois ou quatro domínios mais constitutivos de tipo Ig do terminai N ou do domínio ex tracelular complexo da MAIC-1 , por reacção em cadeia da poli^ merase (RCP) com oligonucleotidos de síntese complementares j das sequências que flanqueiam esta região, a partir de 1 ng de um ANDc que codifica a molécula MAIC-1 [Simmons D.et al. ( 1988) Nature 331 :624 j, utilizando como matriz por cada 25 ciclos da RCP. Cada ciclo durou 30 segundos à temperatura de 92°C e 2 minutos à temperatura de 55°C utilizando-se a solu ção tampão de reacção recomendada pelo fornecedor da enzima (United States Biochemical) . Os oligonucleotidos foram conce bidos de modo a permitir a criação de locais de clivagem da enzima de restrição nas extremidades 5' e 3' dos segmentos | / de ADNc amplificados para facilitar a inserção subsequente no vector de expressão de IgGI [Damle N.K. et al., (1991) Proc. Natl. Sei. USA 8_8_: 640 31- Para estas tris construções efectuou-se a síntese de um precursor directo que codifica as sequências localizadas no vector de expressão que contém o clone ADNc de comprimento completo que codifica a proteí na MAIC-1 , possuindo esse precursor as seguincias seguintes : 5’GTA CGG GCC AGA TAT ACG CGT TGA CAT TGA TTA-3' . 28
Efectucu-se a síntese dos precursores inversos que codificam as sequências localizadas na junção dos segundo e terceiro comínios de tipo Ig, na junção dos 42 e 5S domínios de tipo Ig e na extremidade do 52 domínio de tipo Ig contendo uma BAMKI, com as sequências seguintes: 5'CCT AGG ATC CGG GGG AGT CGC TGG CAG GAC AAA GGT-3'; 5-CCT AGG ATC CGG GCC ATA CAG GAC ACG AAG CTC CCG-3 1 ; e 5-CCT AGG ATC CCC CTC ATA CCG GGG GGA GAC· CAC ATT CAC-3'·
Os produtos da RCT com a MAIC-1 foram digeridos com as enzimas de restrição Mlu I e BamHI e ligados ao vector CD8-IgGI cortado com MLu I-3amHI [Damle N. K. et al. , (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88_:6403l daí resultando a preparação das proteínas de fusão Gr MAIC-1,2 e Gr MAIC-1 ,5 . C\
As sequências de ADNc da MAIC-2 [Staun ton D.E. et al. , ( 1989) Nature 339:61 ] que codificam o domí^ nio extracelular da MAIC-2 foram amplificadas por RCP a par tir de 100 ng de uma biblioteca de ADNc da placenta humana linearizado com MLu I preparada no vector de expressão CDM8 [Seed B. (1987) Nature 329:840]. Utilizou-se um precursor directo complementar das sequências localizadas imediatamente a montante da sequência que codifica a sequência sinal do terminal M da proteína MAIC-2 com a sequência 5'CGC GAA GCT TCT AGA GAG ATG TCC TCT TTC CCT-3' em conjunto com dois - 29
& precursores inversos diferentes complementares das sequências localizadas na junção dos domínios extraceiulares e transmembranais da MAIC-2. Os dois precursores inversos dos suem as sequências seguintes: 5 ' -CCG CGG ATC CGC TGT CCG ACA AGG CTC ATA-3' e 5 ' -CGC TCG AGG ATC CTG C-CT GTC CGA CAC AGG CTC-3 ’ · f i
Os produtos da RCP preparados com estes oligonucleotidos foram subclonados no vector de expressão CD8-IgG1 [Damle N.K. et ai., (1991) Proc. Natl. Acau. Sei. USA 88_:6403 ] para a preparação da Gr MAIC-2 ou em vez dos dois domínios mais constitutivos da CD31 de tipo Ig do terminal N [Newman P. J. et al., (1990) Science 247:1219; Simmons D.L. et al. , ( 1990) J. Exp. Med. 171:21 47 3 numa-es-trutura Gr CD31 para proporcionar respectivamente as proteí_ nas de fusão Gr MAIC-2:CD31. As construções das Gr CD7 e Gr ELAM-1 foram descritas noutros trabalhos publicados [Damle N.E. et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 88:6403;Waiz G. et al., (1990) Science 250:1132]·
As estruturas resultantes foram individualmente transfectadas no interior de células COS e as proteínas de fusão desejadas foram recuperadas e purificadas a partir do sobrenadante das células transfectadas conforme descrito [Damle N.E. et ai·» (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. - 30 - 30
USA 88:6403]· EXEMPLO 2
ANTICORPOS MONOCLONAIS
Os hibridoraas 0KT3 (anti-CD3), 0KT4 (anti-CD4 ) OKT8 (anti-CD8), 0KM1 (anti-CD11b), 7G7/B6 (anti-CD25), L243 (anti-HLA-DR) e 63D3 (anti-monocitos) foram obtidos na instituição "American Type Culture CoIIec-tion" , Rockviiie, MD. 0 hibriuoma que segrega o Acm 84H10 anti-MAIC-1 foi fornecido peio Doutor P. Mannoni, Institut Paoli Calmettes, Marselha, França. Os fluídos ascíticos contendo os correspondentes anticorpos monoclonais (Acm) des^ ses hibridomas foram gerados em murganhos da estirpe BALB/ /c estimulados com pristano. Os Acm 9,6 (anti-CD2), 10,2 (anti-CD5) , G10-1 (anti-CD8), 60,1 (anti-CD11b) , FC2r(anti -CD16), 60,3 (anti-CD18), 1F5 (anti-CD20), 9,3 (anti-CD28) e HB10a (anti-HLA-DR) foram fornecidos pelo Dr. J. A. Led-better (Bristol-Myers Squidb). Os Acm MHM23 (anti-CDl8) e MHM24 (anti-CD11a) foram fornecidos pelo Dr. A. McMichaei, Nuffieid Foundation, Oxford, Reino Unido. 0 Acm 4G7 (anti--CD19) foi fornecido pelo Dr. Ξ. G. Engleman, Stanford Uni-versity School of Medicine, Stanford, CA. 0 Acm WT-31 (Anti--TCR-1) foi fornecido peio Dr. W. Tax, University of Nij-megen, Nijmegen, The Netheriands, tendo sido obtido também em Becton Tickings Monoclonai Center, Mountain View. Ca. 0 - 31
Acra 2503 anti-Tac (CD25/IL-2R ^ ) foi fornecido peio Dr. T. A. Waidman, N1H, Bethesda, MD. 0 Acra 2503 açti-CD11a. 0 Acm BU15 anti-CD11c e o Acra BL5 anti-CDl8 foram obtidos era Amac, Inc. Westbrook, ME. Cada um dos Acm referidos antes é um anticorpo IgG. Os Acm marcados com FITC ou marcados cora PE dirigidos contra diversas moléculas superficiais lin foides foram obtidos em Amac ou Coulter Immunoiogy, Hialeah, FL. ISOLAMENTO DAS CÉLULAS T CD4
Procedeu-se à separação de células mo-nonucleares do sangue periférico de doadores saudáveis por centrifugação em gradiente de densidade segundo a técnica de Ficoll-Hypaque. Procedeu-se ao isolamento das células T CDA+ era repouso através de uma rigorosa selecção negativa imuno-magnética utilizando-se para o efeito um aparelho "Dyna-beads M-450" (Dynal Inc., Great Neck, NY) conforme descrito por Damle-N ,.E._ .et ai., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 88^:6403; Horgan K. et al. , (1991) In Current Protocols in Immunoiogy. J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Marguiies, E.M. Shevach e W. Strober. Euitors. pp. 7*4.1-7.4.6. Efec-tuo.u-se a selecção negativa utilizando-se para o efeito uma mistura de Acm contra HLA-DR (L243 ou H310a) em células 3, monocitos e células T activadas, 63D3 (raonocitos), CD19 32
W (4G7) ou CD20 (1F5) em células B, CD11b (0KM1 ou 60,1) em morúcitos e células NK, CD16 (FC2) em células MK e CD8 (0KT8 ou G10 — 1) em células T CD8+: A pureza das populações isola cias cie CD4+ foi maior do que 95 % sendo a avaliação efectua da uirecta ou indirectamente por análise de imunofluorescên cia utilizando-se para o efeito um separador celular activa do por fluorescência (EPICS V, Coulter, Hialeah, FL). Com as células T CD^ isoladas preparou-se uma nova suspensão com 100 U/ml de penicilina, estreptomicina na concentração de 100 yum/ml, L-glutaína 2 mM e 10 % de soro de bovino fetal Essas células T CD4+ foram incapazes de proliferar em resposta a concentrações mitogénicas de PHA (10 jig/ml) ou de anti-CD3(RCT solúvel (100 ng/ml) na ausência de células aces sérias . EXEMPLO 3 GERAÇAO DE CÉLULAS T CD4 EXCITADAS COM O Ag
Utilizando células mononucleares em repouso recentemente isoladas procedeu-se à sua estimulação com as exotoxinas estafilocócicas SEA , SEB, SEE ou TSST-1 (Toxin Tecralqgy, Inc., Sarascta, FL) (1 ycgM) durante 7 dias após o que se pro cedeu ao isolamento das células T CD4+ e à sua propagação na- presença de células B MHC+ de classe II irradiadas, na presença de exotoxina individual (1 ^ug/ml) e na presença de IL-2 (50 U/ml). Gerou-se células T CD4+ estimuladas com DRwo a partir de uma cultura de linfocitos mista (CLM) esti^ 33 mulada pela linha celular ARENT de células B DRw6+ irradiada sendo a sua propagação efectuada com células B da linha celular ARENT e com IL-2 conforme descrito por Damie N. K. et ai 91990,. Eur. J. Immunoi. 20_:1995. Antes de se estudar as suas respostas procedeu-se ao isolamento das células T CD4 + viáveis a partir das suas culturas de crescimento/manutenção por centrifugação em gradiente de densidade segundo a técnica de Ficoll-Hypaque, mantendo-se durante 12-16 horas em meio completo (MC) na ausência de qalauer estímulo. EXEMPLO 4
ENSAIOS DE PROLIFERAÇÃO
Procedeu-se ao revestimento prévio de placas de microtitulação de fundo redondo (Corning) durante 12-16 horas à temperatura de 4°C utilizando-se para o efeito uma mistura (cada componente na concentração de 10 yug/mi) de anticorpos Fc anti-IgG humanos e anti-IgG de murganho conjuga dos na cabra e purificados por afinidade (Tago, Burlingame, CA) (40 ^ii/cavidade em tampão de bicarboanto de sódio, pH 9,6) após o que os locais de ligação das proteínas adicionais fo ram bloqueadas durante 12-16 horas com albumina de soro de bovino a 2 % em meio RPMI 1640. As Gr MAIC-1 ou Gr MA-ÍC-2 (Fc de IgG humana) e o Acm anti-RCT (IgG de murganho) foram imobilizados nas cavidades de microtitulação anteriores durante 1 hora e depois procedeu-se à lavagem das placas duas vezes com MC conforme descrito por Damie N.K. et al., (1991) - 34 ' W-
Proc. Nati. Acaue. Sei. USA 88_:6403· Estas placas "armadas" com Gr MAIC e/ou anti-RCT-1 foram depois utilizadas para es timular células T CD4+. preparou-se uma cultura de 50 000 células CD4 + em 0,2 ml de MC nas placas de microtitulação "armadas" referidas antes durante 96 horas à temperatura de 37°C em atmosfera contendo 5 ? de CO^ e 95 % de ar normal. Proceueu-se à medição das respostas proiiferativas nessas cui turas geraimente no 42 dia através da pulsação em culturas em triplicado provenientes de ^H-TdR na dose de 1 yuCi/ca- -..ν' vidade (6,7 Ci/raM, New England Nuclear, Boston, MA) 16 horas antes de se proceder à colheita das células para a medição do marcador radioactivo no ADN recentemente sintetizado. Os resultados são expressos em cpm + D.P. (desvio padrão). EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE INTERLEUCINA-2 E ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO RECEPTOR DA INTERLEU- CINA- 2
Preparou-se uma cultura de 50 000 células T CD4+ em repouso em placas de microtitulação de 96 cavidades previamente "armadas" com Gr MAIC-1 ou MAIC-2 (50 ng/cavidade), anti-RCT-1 (50 ng/ml) ou com ambos conforme ue£ crito antes. Procedeu-se á recolha dos sobrenadantes dessas culturas isentos de células decorridas 48 horas e efectuou--se a avaliação da actividade da interieucina-2 (IL-2) util_i zando-se para o efeito a linha celular CTL-L2 de células T 35 dependente da IL-2 conforme descrito por Giiiis S. et ai., ( 1978) J. Immunol. 120:2027 · Caicuiou-se a concentração de IL-2 para cada amostra por referência à IL-2 recombinante (Cetus Corporation, Eraeryvilie, CA) exprimindo-se o resulta do em unidades internacionais U/ml. Para a análise das células T CD4 + - CD25 (IL-2Ro< )+ procedeu-se à colheita das culturas decorrido o intervalo de tempo de 48-60 horas,pro cedeu-se à sua coloração com Acm anti-CD25 conjugado com fluoresceína (Amac) e realizou-se a análise num fluxocitóme ro (EPICS, Coulter) conforme descrito por Damle N.K. (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88; 6403. EXEMPLO 6 PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO DAS IMUNOGLOBULINAS MAIC-1 e MAIC-2
Preparou-se as proteínas de fusão de Ig MAIC-1 e MAIC-2 (globulinas receptoras, Gr) porfusão de um fragmento de ADNc que codifica uma parte ou toda a região extracelular dessas moléculas, com unrfragmento de ADN genó-mico que codifica uma região constante da IGG1 humana. Neste estudo foram utilizadas tris quiméras de Gr MAIC-1: a Gr MAIC-1,2, a Gr MAIC-1,4, e a Gr MAIC-1,5. Estas quiméras fo ram obtidas a partir de fragmentos de ADNc que codificam al ternativamente dois ou quatro dos domínios extracelulares mais constitutivos de tipo G do terminal N da MAIC-1 ou o - 36 -
-J domínio extraceiular completo da MAIC-1, respectivamente (FIGURA 1). Procedeu-se à preparação de duas proteínas de fusão MAIC-2 para este estudo: 1)- a Gr MAIC-2 que contém um fragmento de ADNc que codifica o domínio extraceiular com pleto de MAIC-2 fundida ao fragmento de ADN genómico que co difica a região constante da IgG1 humana e 2)- a Gr MAIC--2: CD31 na qual o fragmento de ADNc codifica dois domínios mais constitutivos de tipo Ig do terminal N de um gene de fusão Gr CD31 (PECAM) foi substituída por um fragmento de ADNc que codifica os dois domínios de tipo Ig da MAIC-2 para proporcionar a quimera MAIC-2:CD31 (FIGURA 1). Ás Gr CD7 e Gr ELAM-1 preparadas de modo idêntico [Damle N.E. et aí., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA. - 88:6403; Walz C-. et al. (1990) Science 250:1132] foram também utilizadas neste estudo como elementos de controlo.
Foi demonstrada a capacidade da MAIC-1 para co-estimular a proliferação das células T (14). Em estudos preliminares confirmou-se csefeitos co-estimuladores das Gr MAIC-1 e efectuou-se ainda a comparação das potências re: lativas das Gr MAIC-1 que comportam diversos domínios de tipo Ig do terminal N. Descobriu-se que as duas Gr MAIC--1,4 e Gr MAIC-1 ,5 são igualmente co-estimuladoras em ensaios de activação das células T. Deste modo, em todas as experiências subsequentes, salvo quando especificado de outro modo, utilizou-se a Gr MAIC-1,4 como MAIC-1. - 37 EXEMPLO 7 EFEITOS CO-ESTIMULADORES DA MAIC-2
Examinou-se a capacidade da Gr MAIC-2 para proporcionar sinais co-estimuladores para as células T CD4 + activadas através do complexo da RCT e efectuou-se a comparação com a capacidade idêntica da Gr MAIC-1. As Gr MAIC-1 e Gr MAIC-2 foram co-imobilizadas (100 ng/cavidade) com Acm anti-RCT-1 (50 ng/cavidade) em cavidades de microtitulação e depois adicionou-se a essas cavidades células T CD4 + recentemente isoladas. Verificou-se a resposta proliferativa dessas células T ao 42 dia conforme descrito no EXEMPLO 4. A FIGURA 2 mostra que as duas Gr MAIC-1 e Gr MAIC-2, quando individualmente co-imobilizadas com Acm anti-RCT-1, induzem a proliferação das células T CD4+. Pelo contrário, a imobilização do A.cm anti-RCT-1 e de qualquer das Gr MAIC deve ser de tipo co-imobilizado para suportar a activação das células T uma vez que nem a Gr MAIC-1 nem a Gr MAIC-2 em so lução suportam a proliferação das células T em conjunto com o Acm anti-RCT-1 imobilizado. Além disso, o Acm dirigido às moléculas CD2, CD5 ou CD28 da superfície das células T, quando co-imobilizado com qualquer das Gr MAIC foi incapaz de estimular as células T.
Quando a co-imobilização é feita com o Acm anti-RCT-1 , a resposta proliferativa induzida pela Gr MAIC-1 foi consistentemente mais forte do que a resposta que foi - 38
r' \ induzida peia Gr MAIC-2. A diferença quantitativa entre a proliferação das células T CD4 + induzida com as Gr MAIC-1 e Gr MAIC-2 pode ser eventuaimente devida a diferenças de tipo cinético dessas respostas. Em consequência procedeu-se ao exame da cinética de co-estimulação das Gr MAIC-1 e Gr MAIC--2 imobilizadas. Conforme se mostra na FIGURA 3, embora as duas respostas proiiferativas das células T CD4+ induzidas pela MAIC-1 e pela MAIC-2 fossem facilmente detectàdas quatro dias após o início da cultura, o pico da resposta com qualquer das MAIC foi sempre observado no 6^ dia de cultura. 0 prolongamento do período de cultura para além do 6s dia teve normalraente como consequência uma proliferação reduzida das células T.
Examinou-se a dependência da concentração dos efeitos co-estimuladores das Gr MAIC-2 e Gr MAIC-1 alter nativamente com 4 (gr MAIC-1,4) ou 2 (Gr MAIC-1,2) domínios de tipo Ig do terminal N. Conforme se mostra na FIGURA 4, ao.fazer-se a co-imobilização com Acm anti-RCT-1 (50 ng/cavi_ dade), as concentrações crescentes de cada uma das Gr MAIC (5-500 ng/cavidade) induziram proporcionalmente por parte das células T CD4+ uma resposta proliferativa acrescida. As di ferenças observadas entre as potências co-estimuiadoras relativas das Gr MAIC-1 e Gr MAIC-2 foi aparente para cada con centração testada. Tanto a Gr MAIC-1,2 como a Gr MAIC-1,4 induziram respostas proiiferativas das células T quantitativamente idênticas. Pelo contrário, a Gr MAIC-2 induziu sem pre respostas proiiferativas mais fracas das células T CD4+ 39
U do que a Gr MAIC-1.
Examinou-se as capacidades relativas das Gr MAIC-2 e Gr MAIC-2:CD31 para co-estimularem as células T CD4+. Construiu-se a quimera MAIC-2:CD31 para 7 domínios de tipo Ig substituindo dois dos sete domínios do terminal N mais constitutivos da Gr CD31 com dois domínios da MAIC-2 con forme se mostra na FIGURA 1. Tanto a Gr MAIC-2 como a Gr MAIC--2-.CD31 induziram quantitativamente respostas proliferativas idênticas das células T CD4+ conforme se mostra na FIGURA 5. 0 aumento de volume da MAIC-2 com domínios derivados da CD31 não melhorou a propriedade co-estimuladora da MAIC-2. Tanto a Gr MAIC-1,2 como. a Gr MAIC-1,4 foram ainda mais eficientes do que qualquer das Gr MAIC-2 ou Gr MAIC-2:CD31 na indução da proliferação das células T CD4+. A qualquer das Gr CD31 ou Gr ELAM-1 (ambas utilizadas como controlos negativos)fal tou a capacidade para co-estimularem as células T CD4+ em conjunto com o Acm anti-RCT. EXEMPLO 8
EFEITO CO-ESTIMULADOR DA Gr MAIC-2 SOBRE AS CÉLULAS T EXCITADAS COM ANTÍGENOS
Examinou-se a capacidade da Gr MAIC-2 para co-estimular as células T CD4+ que haviam sido activadas com antigenos. As células T CD4+ isoladas a partir de culturas estimuladas com exotoxinas estafilocócitas (super Ag) fica- 40
U ram em repouso durante unrperíodo de 12—16 horas em meio completo e depois proceueu-se ao seu exame para verificação da proliferação em resposta ao Acm anti-RCT-1 co-imobilizado com as Gr MAIC-1 ou Gr MAIC-2. Conforme se mostra na FIGURA 6, o anti-RCT-1 imobilizado induziu por si só a proliferação de células T CD4+ excitadas com o Ag. Todavia, a co-imobi-lização do anti-RCT-1 com qualquer das Gr MAIC aumentou ainda mais esta esta proliferação. 0 efeito co-estimulador superior da Gr MAIC-1 também foi evidente com células T excitadas com o Ag. Foram obtidos resultados idênticos utilizando-se linhas de células T CD4+ excitadas com Drw6. EXEMPLO 9 O EFEITO CO-ESTIMULADOR DAS Gr MAIC-1 E Gr MAIC-2 ENVOLVE 0 SISTEMA RECEPTOR IL2/IL2 significativamente superior
Examinou-se a capacidade da Gr MAIC-2 e do Acm anti-RCT-1 co-imobilizados para induzirem a expressão dos receptores da IL2 pelas células T CD4+: Preparou-se uma cultura de células T na presença de Gr MAIC-2 ou Acm anti-RCT--1 ou ambos imobilizados e decorrido um período de 60 horas verificou-se os seus níveis de expressão de CD25 (Ra'!IL-2) à superfície da célula, utilizando-se para o efeito um fluxoci-tómetro. Conforme se mostra na FIGURA 7, a ligação das células T CD4+ às Gr MAIC-1 ou Gr MAIC-2 e ao Acm anti-RCT-1 co-imobilizados induziu a expressão do RIL-2 sobre uma quan tiuade , em termos percentuais, de células T CD4+ do que aquelas que foram cultivadas com o Acm anti-RCT-1 imobilizado e a C-r ELAM-1 (maior do que 5 * de CD25+) foi sempre superior ao valor observado na indução com Gr MAIC-2 co-imobiiizada (125 % de CD25+). Além..dis-so, as células T CD4+ estimuladas com Acm anti-RCT-1 e alternativamente com as Gr MAIC-1 ou Gr MAIC-2 produziram sig . nificativamente mais IL-2 (2,5-6 U/mi com a Gr MAIC-1 e U/ /ml com a Gr MAIC-2) do que as células que foram incubadas em cavidades apenas com o Acm anti-RCT-1 imobilizado ou alternativamente com qualquer das Gr MAIC imobilizadas (> que 0,1 U/mi). Deste modo, a diferença nas potências co-estimolado ras relativas das Gr MAIC-1 e Gr MAIC-2 foi também aparente no que diz respeito à sua capacidade para induzir o RIL-2. 0
Acm anti-Tac (anti-CD25) inibiu significativamente a resposta proliferativa das células T CD4+ induzida por co-imobiliza-ção do Acm anti-RCT-1 e alternativamente qualquer das Gr MAIC--1 ou Gr-MAIC-2. Em conjunto, estes resultados mostram que as respostas proliferativas das células T CD4+ induzidas por co-imobilização do Acm anti-RCT-1 e alternativamente qual^ quer das Gr MAIC é pelo menos parcialmente mediado através do sistema autócrino IL-2/RIL-2. EXEMPLO 10
FUNÇÃO DO COMPLEXO CD11A/CD18 (LFA-1) DORANTE A CO-ESTIMULAÇÃO
COM AS Gr MAIC
Demonstrou-se que ambas as MAIC-1 e MAIC-2 42 42
se ligara ao complexo CD11a/CDl8 (LFA-1) à superfície de todos os leucócitos. Examinou-se a função da LFA-1 à superfície das células T durante os efeitos co-estimuladores das MAIC--1 e MAIC-2. Tanto a MAIC-1 como a MAIC-2 foram independente mente co-imobilizadas com Acm anti-RCT-1 em cavidades de cultura de microtitulação. As células T CD4+ foram cultivadas nessas cavidades na presença de Acm solúvel (10 ^g/ml) dirigido às CD 11 a, CD 11b , CD18, CD19 ou MAIC-1. 0 Acm diri- , gido a'qualquer das CD11a ou Cdl8 inibiu quase completamente a prolife- s. ,t + V ração das células T induzida com qualquer das MAIC nessas culturas (FIGURA 8). Pelo contrário, o Acm 84H10 anti-MAIC--1 inibiu as respostas das células T à Gr MAIC-1 imobilizada mas não à Gr MAIC-2. 0 Acm 4G7 anti-Cd19 utilizado como con trolo não inibiu os efeitos co-estimuladores de qualquer das Gr MAIC. Estes resultados demonstram que as interacções das MAIC com o complexo CD11a/CDl8 (LFA-1) à superfície das céiu ias T são críticas para a mediação dos efeitos co-estimulado res anteriormente referidos. í / A memória descritiva e os exemplos anteriores têm apenas como objectivo ilustrar a presente invenção sem constituírem qualquer limitação. Eventuaimente é possível realizar numerosas variações e modificações sem que haja afastamento do espírito e do âmbito da presente invenção.
Claims (12)
- u substancialmente correspondente a uma região constante da IgG.
- 6. - Molécula de fusão recombinante, caracterizada pelo facto de possuir uma primeira região, possuindo uma es pecificidade de ligação para CDlla/CD18, funcionalmente ligada a uma segunda região substancialmente correspondente a uma região constante da imunoglobulina.
- 7. - Molécula de fusão recombinante de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo facto de a primeira região corresponder substancialmente a uma porção extracelular da ICAM-2 e a segunda região corresponder substancialmente a uma região constante da IgG.
- 8. - Molécula de fusão recombinante de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de a molécula de fu são ser produzida por: (a) subclonagem de um ADNc que codifica uma porção extracelular da ICAM-2 no interior de um vec-tor de expressão da IgG; e (b) expressão e isolamento da molécula de fusão re combinante contendo uma porção extracelular da ICAM-2 funcionalmente ligada a uma região cons_ tante da IgG. w
- 9. - Método para activar as células T, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as células T com um ligando susceptível de se ligar as células CD3 ou ãs referidas células T e por se utilizar uma quantidade eficaz co-estimuladora de uma molécula de fusão solúvel para activar as células T, possuindo essa molécula de fusão solúvel uma primeira região, possuindo uma especificidade de ligaç.ao para CDlla/CD18, funcionalmente ligada a uma segunda região substancialmente correspondente a uma região constante da imunoglobulina.
- 10. - Método de acordo com a reivindicação 9, carac-terizada pelo facto de a molécula de fusão possuir uma primei_ ra região substancialmente correspondente a uma porção extra-celular da ICAM-2 e uma segunda região substancialmente correspondente a uma região constante da IgG.
- 11. - Método de acordo com a reivindicação 9, carac terizado pelo facto de a referida molécula de fusão ser produzida por expressão recombinante. 12. - . Método para aumentar a resposta proliferativa das células T CD4 , caracterizado pelo facto de se fazer contactar as referidas células T com uma molécula de fusão solúvel possuindo uma primeira região, possuindo uma especificida de de ligação para CDlla/CD18, funcionalmente ligada a uma 4 segunda região substancialmente correspondente a uma região constante de imunoglobulina.
- 13.- Método de acordo com a reivindicação 12, carac-terizado pelo facto de a molécula de fusão possuir uma primeira região substancialmente correspondente a uma porção extrace lular da ICAM-2 e uma segunda região substancialmente correspondente a uma região constante da IgG.
- 14. - Método de acordo com a reivindicação 12, carac terizado pelo facto de a referida molécula de fusão ser produ zida por expressão recombinante.
- 15. - Método para induzir a produção de IL-2 pelas células T, caracterizado pelo facto de se fazer contactar as células T com uma molécula de fusão solúvel possuindo uma pri^ meira região, possuindo uma especificidade de ligação para CDlla/CD18, funcionalmente ligada a uma segunda região substancialmente correspondente a uma região constante da imunoglo bulina durante um intervalo de tempo suficiente para a indução de IL-2 pelas referidas células T.
- 16.- Método de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de a molécula de fusão possuir uma pri meira região substancialmente correspondente a uma porçãoextracelular da ICAM-2 e uma segunda região substancialmente correspondente a uma região constante da IgG.
- 17.- Método de acordo com a reivindicação 15, ca-racterizado pelo facto de a referida molécula de fusão ser produzida por meios recombinantes.\
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