WO2002046235A1 - Anticorps monoclonal humain dirige contre le virus influenza ou un fragment de celui-ci - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un anticorps monoclonal humain caractérisé en ce qu'il présente des propriétés neutralisantes vis-à-vis du virus Influenza et plus particulièrement des souches A et B quelle que soit la nature des souches saisonnières, ou un fragment de celui-ci. L'invention concerne aussi les hybridomes le produisant, les compositions le contenant et leur utilisation en thérapeutique préventive et/ou curative ou en diagnostic.
Description
ANTICORPS MONOCLONAL HUMAIN DIRIGÉ CONTRE LE VIRUS INFLUENZA OU UN FRAGMENT DE CELUI-CI.
La présente invention concerne des anticorps monoclonaux humains dirigés contre les virus Influenza responsables de la grippe chez l'homme ou des fragments de ceux-ci. L'invention concerne aussi la préparation de ces anticorps, les hybridomes les produisant et les compositions les contenant ainsi que leur utilisation en diagnostic ou en thérapeutique préventive et/ou curative.
Le virus Influenza est un virus de la famille des orthomyxoviridae dont la définition officielle des souches datant d'octobre 1971 décrit l'identité de la souche et la nature des antigènes de surface en mentionnant l'espèce animale d'origine.
La grippe représente une maladie saisonnière infectieuse, respiratoire d'origine virale décrite par Thompson en 1852 et par Creighton en 1891.
Les anticorps monoclonaux dirigés contre un déterminant antigênique sont produits par un grand nombre de laboratoires depuis l'introduction de la technique de fusion cellulaire entre une cellule myélomateuse et une cellule lymphoïde d'un animal immunisé. Le premier modèle d' hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux développé par Kôhler et Milstein (1975, Nature, vol. 256, page 495) fut un modèle murin.
Les anticorps monoclonaux produits par des hybridomes présentent l'intérêt d'être spécifiques des virus de la grippe. Ces anticorps sont utiles pour la thérapeutique curative et/ou préventive et le diagnostic.
Les anticorps monoclonaux selon l'invention sont remarquables en ce qu'ils sont 100% humains et sont préparés sans phase intermédiaire d'un anticorps d'une espèce animale non humaine et en ce qu'ils sont actifs sur les virus de la grippe. L'invention couvre les anticorps monoclonaux dont les parties variables des chaînes lourdes et légères sont véritablement humaines et les parties constantes sont d'une des différentes classes d' immunoglobulines humaines ou de toute autre substance ou produit. Ainsi, les anticorps monoclonaux représentent une nouvelle classe thérapeutique dans le traitement de cette infection virale.
Des anticorps monoclonaux humains dirigés contre le virus Influenza ont déjà été décrits, (Ostberg, L. et al. Hybrydoma, vol 2, n° 4, pages 361-367), mais il s'agit des anticorps de classe IgG dont leur spécificité est restreinte à une seule souche du virus Influenza. En particulier, les auteurs décrivent un anticorps monoclonal humain de classe IgGl neutralisant vis-à-vis de la souche AH3 du virus Influenza.
La présente invention concerne cependant des nouveaux anticorps monoclonaux humains présentant des propriétés neutralisantes vis-à-vis du virus Influenza et plus particulièrement des souches A et B quelle que soit la nature des souches saisonnières. L'absence de spécificité étroite pour les différentes souches de virus des anticorps de l'invention est particulièrement intéressante sur le plan thérapeutique car ces anticorps sont capables d'être actifs sur différentes souches de virus. L'invention concerne aussi un fragment d'un tel anticorps et plus particulièrement les fragments Fab et leurs associations.
L'anticorps monoclonal humain de l'invention appartient à la classe des IgM, IgD, IgE ou IgA humaines et a été obtenu directement sans passer par des étapes de chimérisation ou d'humanisation. L'anticorps de l'invention peut être aussi modifié, quelle que soit sa classe, en anticorps d'une autre classe d' immunoglobuline par exemple par des techniques décrites de biologie moléculaire (Lewis et al . , 1992, Hum. Antibodies Hybridomas, vol. 3, pages 146-52 ; Lewis et al . , 1993, J. Immunol . , vol. 151, pages 2829-38 ; Hall et al . , 1994, Cancer Res . , vol. 54, pages 5178-85 ; Shepherd et Dean, « Monoclonal antibodies », Oxford university press, 2000, 479 pages) .
L'invention concerne plus particulièrement un anticorps monoclonal de classe IgM Lambda ou Kappa présentant sensiblement le même poids moléculaire en électrophorèse sur gel de polyacrylamide que l'IgM humaine de référence : Sigma, Réf. 18260 et présentant une réaction positive avec un anticorps anti-IgM humaine.
Cet anticorps monoclonal est capable de protéger des souris contre l'infection par le virus Influenza H3N2 de la grippe (Solvay pharma) .
L'invention se rapporte également aux hybridomes capables de produire des anticorps monoclonaux selon l'invention. L'invention concerne tout particulièrement l'hybridome déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes à l'Institut Pasteur (Paris) sous le No. 1-2585, le 29 novembre 2000, ce dépôt ayant été réalisé dans le cadre du Traité de Budapest. L'invention se rapporte aussi à tout système
d' expression et donc de production fait à partir du matériel génétique des hybridomes de l'invention.
L'invention se rapporte également à un anticorps monoclonal comprenant un fragment d'un anticorps selon l'invention. De tels anticorps peuvent être préparés par des techniques connues de l'homme du métier pour associer des fragments d'anticorps différents.
L'invention concerne aussi un procédé de préparation d'un anticorps décrit ci -dessus. Un procédé préféré de préparation d'un anticorps selon l'invention est basé sur l'utilisation successive et combinée de diverses cytokines à des temps définis et d'un système activateur non spécifique.
Un procédé préféré de préparation d'anticorps monoclonaux humains dirigés contre le virus Influenza ou un fragment de ceux-ci ou un anticorps comprenant un tel fragment selon l'invention est préparé à partir de lymphocytes B. Ce procédé comprend les étapes suivantes : a) l'isolement de lymphocytes B à partir de sang humain, b) la différenciation desdits lymphocytes B en cellules plasmocytaires avec au moins un système activateur non spécifique et au moins une cytokine, c) l' immortalisation desdites cellules plasmocytaires par fusion cellulaire avec une lignée de fusion, d) la culture In vi tro des cellules fusionnées jusqu'à l'obtention d' hybridomes, e) la purification des anticorps monoclonaux produits par les hybridomes,
f) éventuellement le clivage desdits anticorps en fragments, et la purification d'un ou plusieurs desdits fragments, g) éventuellement l'association d'un ou plusieurs des fragments obtenu (s) à l'étape (f) avec des fragments d'autres anticorps.
On entend par « cellules plasmocytaires » à l'étape (b) des lymphocytes B modifiés produisant des immunoglobulines et aptes à être fusionnés avec une autre cellule pour donner un hybridome sécrétant des immunoglobulines. Ce' type de lymphocytes B modifiés est parfois appelé « lymphocytes B activés ». Avantageusement, l'étape (b) de differentiation des lymphocytes B comprend les étapes suivantes : i) le mélange d'une suspension de lymphocytes B avec de 0,01 à 1 % d'un système activateur non spécifique et de 1 à 8,5 ng/ml d'IL2, puis l'incubation du mélange pendant 24 heures à 11 jours à une température comprise entre 36,5 et 37,8°C, ii) la centrifugation de la suspension obtenue en (i) de 600 à 3500 rpm pendant 2 à 12 minutes, puis le retrait du surnageant et la remise en suspension du culot cellulaire, iii) le mélange de la suspension obtenue en
(ii) avec de 1 à 8,5 ng/ml d' IL2 et de 10 à 350 ng/ml d'ILlO, puis l'incubation du mélange pendant 48 heures à 15 jours à une température comprise entre 36,5 et 37,8°C.
Ainsi, à titre d'exemple préféré, l'étape (b) de différentiation des lymphocytes B comprend les étapes suivantes :
i) le mélange d'une suspension de lymphocytes B avec 0,04 % d'un système activateur non spécifique et 2,5 ng/ml d'IL2, puis l'incubation du mélange pendant 3 jours à une température de 37°C sous 5% de C0 , ii) la centrifugation de la suspension obtenue en (i) à 1300 rpm pendant 6 minutes, puis le retrait du surnageant et la remise en suspension du culot cellulaire, iii) le mélange de la suspension obtenu en (ii) avec 2,5 ng/ml d' IL2 et 100 ng/ml d'ILlO, puis l'incubation du mélange pendant 5 jours à une température de 37°C sous 5% de C02.
Le système activateur non spécifique est choisi parmi un lipopolysaccharide ou toute substance susceptible d'avoir une action identique en tout ou partie, la pansorbine, la phytohémagglutinine, le muramyldipeptide utilisés seuls ou en association.
La lignée de fusion utilisée pour 1' immortalisation des cellules plasmocytaires à l'étape (c) est une lignée myélomateuse de rongeur, de préférence une lignée myélomateuse de rat et tout préférentiellement une lignée myélomateuse de rat de souche LOU.
Selon une forme de réalisation toute particulière du procédé de l'invention, la lignée de fusion utilisée pour l' immortalisation des cellules plasmocytaires à l'étape (c) est la lignée myélomateuse de rat LOU IR 983 F/ TEC déposée à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes à l'Institut Pasteur (Paris) sous le No. 1-2584, le 29 novembre 2000. Ce dépôt a été réalisé dans le cadre du Traité de Budapest .
Selon une première forme de mise en œuvre préférée du procédé de l'invention, l'étape (b) de différenciation des lymphocytes B en cellules plasmocytaires est effectuée en présence d'un antigène spécifique du virus Influenza.
Selon une seconde forme de mise en œuvre préférée du procédé de l'invention, à l'étape (a) les lymphocytes B sont isolés de sang d'un individu vacciné contre la grippe ou en convalescence d'une infection par le virus Influenza.
La spécificité des anticorps monoclonaux selon l'invention peut être évaluée : - par un test ELISA de spécificité vis-à-vis des souches du virus Influenza ;
- par un test d'inhibition d'hémagglutination avec les antigènes des souches du virus Influenza ;
- ou par un test In vivo sur un modèle animal de protection vis-à-vis des souches du virus Influenza.
Le test in vivo sur un modèle murin est avantageusement réalisé en administrant des anticorps monoclonaux selon l'invention à des souris infectées par le virus Influenza à des doses létales à 10 jours. L'administration des anticorps selon l'invention permet d'obtenir une survie des souris entre 80 et 100% après 10 jours comparativement à un placebo ne protégeant pas les souris qui meurent après 10 jours d'infection.
Les anticorps ou fragments d'anticorps selon l'invention peuvent être utilisés pour le diagnostic de la grippe ou pour le traitement curatif ou préventif d'infections par les souches du virus Influenza.
L'invention se rapporte encore à des compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci selon l'invention. Ainsi, l'invention a pour objet un kit de détection d'une infection par les souches du virus Influenza, comprenant au moins un anticorps monoclonal ou un fragment de celui-ci selon l'invention.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront de la description qui suit rapportant des exemples de préparation d'anticorps monoclonaux et leur propriété.
I- Isolement des lymphocytes B humains.
1) Matériel.
Tubes EDTA (CML, réf : T200QS)
Seringues 20 ml (Fisher Sci . , réf : A14669625)
Filtres Minisart 0,22 μM (CML, réf : 17597K) Plaques de culture 96 puits (Life Technologies, réf :
167008A)
Flacons de culture à bouchons ventilés (Fisher Sci., réf :
A12078050)
Pipettes stériles 10 ml (CML, réf : P1051 B) Tubes à centrifugation 50 ml (Fisher Sci., réf : A12832506)
Tubes centrifugeurs 15 ml (Fisher Sci., réf : A12832163)
Tubes 12 ml stériles ml (Fisher Sci., réf : A12926183)
Cellule à numération (CML, réf :KOVAS)
Bleu de trypan (Sigma, réf : T-8154) Milieu de culture DMEM (Biowhittaker, réf : M12914F)
Milieu de culture RPMI 1640 (Biowhittaker, réf : M12115F)
Sérum de veau fœtal (Labconsul, réf : P30-0702)
Sérum de cheval (Labconsul, réf : 17-905C)
L-glutamine 200 mM (Biowhittaker, réf : 17-905C)
Gentamicine 50 mg/ml (Life Technologies, réf : 15750-045)
NEAA 100X (Biowhittaker, réf : BE13-114E)
Pyruvate de sodium 100 mM (Biowhittaker, réf : 13-115E) 2-mercaptoéthanol (Sigma, réf. : M7522)
Milieu de séparation des lymphocytes (Biowhittaker, réf. :
MI 7829E)
Sang de mouton défibriné (Eurobio, réf. : 905705)
HBSS (Life Technology, réf. : 14025-050) PBS (Biowhittaker, réf. : MI 7512F)
AET : 2-Aminoethylisothiouroniumbromide (Sigma, réf. :
A5879)
Eau distillée
NaOH (Fisher Sci., réf : A43211977) IL2 : Interleukine 2 humaine recombinante (R et D, réf. :
202 IL050)
IL6 : Interleukine 6 humaine recombinante (R et D, réf. :
206 IL050)
IL10 : Interleukine 10 humaine recombinante (R et D, réf. : 217 IL025)
Pansorbine (France Biochem SA, réf. : 507851)
Milieu de fusion MEM REGA 3 (Life Technology, réf. : 19993-
013)
HEPES 1M (Life Technology, réf. : 15630-056) PEG : Polyéthylène glycol 4000 (Fisher Sci., réf :
A48691512)
DMSO : Diméthylsuifoxyde (Fisher Sci., réf : A43320281)
Aminoptérine 100X (Life Technology, réf. : 11362-019)
Supplément d' hypoxantine thymidine 50X (Life Technology, réf. : 41065-012)
2) Méthode, a) Première étape.
Le sang a été prélevé sur des volontaires vaccinés par un vaccin antigrippal ou en convalescence d'une infection grippale. Les prélèvements sont réalisés à 0, 8, 15 ou 21 jours après la vaccination.
Le sang humain provenant de tubes EDTA est dilué dans le même volume de PBS . Le sang dilué est déposé dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant le milieu de séparation des lymphocytes (1/3 de milieu pour 2/3 de sang) . Après une centrifugation à 3000 rpm sans frein pendant 20 min, l'anneau de lymphocytes est récupéré à l'interface à l'aide d'une pipette de 10 ml. La pipette est vidée dans un tube à centrifuger de 15 ml et du milieu de culture complet RPMI, milieu de culture RPMI contenant 1% de L-glutamine, 0,1% de gentamicine, 50μM de 2- mercaptoéthanol et 10% de sérum de veau fœtal, est ajouté qsp 15 ml. Après une centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de milieu de culture complet RPMI. Après une centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet RPMI de façon à avoir de 1 à 2.10e cellules par ml. La suspension cellulaire est mise dans des flacons de culture à raison de 10 ml par flacon de 50 ml. Les monocytes sont enlevés par adhérence en incubant les flacons à l'horizontale dans une étuve à 37°C et 5% de C02 pendant une nuit . Une solution à 0,4 g de AET, pH 9 ajusté avec
NaOH, est préparée pour 10 ml d'eau distillée. La solution est filtrée sur filtre 0,22 μm dans un tube de 10 ml.
Douze ml de sang de mouton défibriné sont mis dans un tube à centrifuger de 15 ml . Après une centrifugation à 2100 rpm pendant 10 min, le surnageant est enlevé et le culot de globules rouges est remis en suspension dans 10 ml de HBSS . Après une centrifugation à 2100 rpm pendant 10 min, le surnageant est enlevé. Deux ml de globules rouges et 8 ml de solution d'AET sont mélangés dans un tube à centrifuger de 15 ml . Après une incubation d'une heure à 37°C, 5 ml de PBS sont ajoutés. Le surnageant est enlevé après une centrifugation de 10 min à 1300 rpm. Deux ml du culot constitué de globules rouges et d'AET sont mis dans un tube à centrifuger de 50 ml contenant 48 ml de milieu complet RPMI. Une incubation est réalisée toute une nuit à 4°C. b) Deuxième étape .
La suspension cellulaire des flacons est récupérée. Un volume égal de suspension cellulaire et de solution à 4% de globules rouges de mouton- ET sont mis dans un tube de 50 ml. Un demi-volume de sérum de veau fœtal est ajouté. Le tout est mélangé doucement et centrifugé 5 min à 800 rpmi/min. Le mélange avec le surnageant est incubé 1 heure dans la glace. Le surnageant est enlevé et le culot est remis en suspension puis déposé dans un tube à centrifuger de 15 ml contenant le milieu de séparation des lymphocytes, 1/3 de milieu pour 2/3 de culot. Après une centrifugation à 3000 rpm sans frein pendant 20 min, l'anneau de lymphocytes est récupéré à l'interface à l'aide d'une pipette. La pipette est vidée dans un tube à centrifuger de 15 ml et du milieu de culture complet RPMI est ajouté qsp 15 ml. Après une centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 10 ml de milieu de culture complet RPMI. Après une
centrifugation à 1300 rpm avec frein pendant 6 min, le surnageant est enlevé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet RPMI et la suspension cellulaire est mise dans des flacons de culture à raison de 10 ml par flacon de 50 ml.
II- Différenciation en cellules plasmocytaires. Sont ajoutés à la suspension cellulaire 0,04% de pansorbine et 2,5 ng/ml d' IL2. La suspension cellulaire est incubée pendant 3 jours dans une étuve à 37°C et 5% de C02 avant d'être centrifugée 6 min à 1300 rpm. Le surnageant est enlevé et le culot cellulaire est remis en suspension dans du milieu complet RPMI. La suspension cellulaire est mise dans des flacons de culture à raison de 10 ml par flacon de 50 ml. Sont ajoutés à la suspension cellulaire 2,5 ng/ml d'IL2 et 100 ng/ml d'ILlO. La suspension cellulaire est incubée pendant 5 jours dans une étuve à 37°C et 5% de C02.
III- Fusion cellulaire.
La suspension cellulaire est mise dans un tube à centrifuger de 15 ml et les cellules IR 983 F/ TEC dans un autre tube. Les tubes sont centrifugés pendant 6 min à 1200 rpm. Les surnageants sont enlevés et les cellules sont remises en suspension dans 10 ml de milieu MEM REGA 3 complet, milieu MEM REGA 3 contenant 1% d'HEPES et 0,1% de genta icine, à 37°C. Après une centrifugation à 1200 rpm pendant 6 min, les surnageants sont enlevés et les cellules sont remises en suspension dans 10 ml de milieu MEM REGA 3 complet à 37°C. Un comptage des deux types cellulaires est effectué. Les tubes sont centrifugés pendant 6 min à 1200 rpm. Les surnageants sont enlevés et les cellules sont remises en ' suspension dans 10 ml de milieu MEM REGA 3
complet à 37°C. Les cellules sont mélangées dans un tube à centrifuger de 50 ml suivant un rapport de 1 IR 983 F/ TEC pour une cellule plasmocytaire. Après une centrifugation à 1200 rpm pendant 6 min, les surnageants sont enlevés et le culot est remis en suspension dans la dernière goutte. Une solution de PEG est obtenue en chauffant à 50°C 5 g de PEG 4000 dans 7 ml de PBS et 1 ml de DMSO puis en filtrant la solution sur filtre 0,2 μM. Un ml de solution de PEG est ajouté au culot en 1 min 30 sec en agitant le tube. On laisse reposer 30 sec. Sont ajoutés 1 ml de MEM REGA 3 à 37°C en 1 min 30 sec en agitant le tube puis 20 ml de MEM REGA 3 à 37°C en 4 min en agitant le tube. Après une centrifugation à 1200 rpm pendant 6 min, les surnageants sont enlevés et le culot est remis en suspension dans du milieu complet DMEM avec 1% d' aminoptérine et 2% d' hypoxantine-thymidine de façon à avoir 1.106 cellules par ml. Le milieu complet DMEM contient 1% de L-glutamine, 1% de NEAA, 1% de pyruvate de sodium, 0,1% de gentamicine, 50 μM de 2-mercaptoethanol, 5% de sérum de veau fœtal et 5% de sérum de cheval. La suspension cellulaire est répartie sur des plaques de culture 96 puits contenant 100 μl de cellules péritonéales, la suspension est répartie à raison de 100 μl par puits. Les plaques sont incubées 7 jours dans une étuve à 37°C et 5% de C02.
IV- Entretien des plaques de fusion. Sept jours après la fusion, le milieu de culture des plaques est enlevé. Par puits, sont ajoutés 200 μl de milieu complet DMEM contenant 1% d' minoptérine et 1% d'hypoxanthine-thymidine. Les plaques sont incubées pendant 5 jours dans une étuve à 37°C et 5% de C02. Le milieu de culture des plaques est enlevé puis sont mis, par puits, 200 μl de milieu complet DMEM contenant 2% d'hypoxanthine-
thymidine. Après une incubation de 4 jours dans une étuve à 37°C et 5% de C02, le milieu de culture des plaques est enlevé puis sont mis, par puits, 200 μl de milieu complet DMEM contenant 2% d' hypoxanthine-thymidine et 2,5 ng/ml d'IL6. Après une incubation de 4 jours dans une étuve à 37°C et 5% de C02, le milieu de culture des plaques est enlevé puis sont mis, par puits, 200 μl de milieu complet DMEM contenant 2,5 ng/ml d'IL6. Les plaques sont mises à incuber dans une étuve à 37°C et 5% de C02, le milieu de culture est changé de la même manière jusqu'à l'apparition des clones .
V- Résultats des différentes fusions réalisées.
Les lymphocytes B (LcB) provenant de volontaires vaccinés par un vaccin anti-grippal et prélevés 0, 8, 15 ou 21 jours après la vaccination ont été fusionnés avec la lignée IR 983 F/ TEC suivant le protocole décrit ci-dessus. Les lymphocytes B d'un donneur X ont servi de contrôle. Les hybridomes obtenus sont testés pour la production d' immunoglobulines (Ig) humaines par la technique ELISA en utilisant des anticorps de rats anti-Ig G et anti-Ig M humaines. Le tableau 1 récapitule les résultats obtenus (nombre de clones et production d'Ig).
Tableau 1 : Résultats obtenus pour chaque fusion.
Les immunoglobulines sont récupérées à partir des surnageants de culture des 9 clones FAL 11 et du clone FAL 8. Elles sont purifiées par chromatographie d'affinité sur une colonne de Sépharose couplée à des anticorps anti- Ig humaines qui sont l'anticorps LO-hK-3 (anti-Ig humaines Kappa, réf : TEC 146, Technophar -France) et l'anticorps LO-hL-2 (anti-Ig humaines lambda, réf : TEC 147, Technopharm-France) . La concentration en immunoglobulines est évaluée par un test ELISA en comparaison avec un étalon (IgM humaine à 1 mg/ml, réf : 18260, Sigma) .
VII- Activité des anticorps . 1) Test ELISA de spécificité. i) Matériel .
- Antigènes viraux du virus Influenza : A/Sidney/5/97 (H3N2) -like lot : HVR 13-1, A/Beijing/262/95 (H1N1) -like lot : HXH 19-4, B/Beijing/184/93 (H3N2) -like lot : HHA 06-5,
Hémagglutinine Influenza (réf : 12149, Sigma)
- Anticorps monoclonaux LO-HK-3 lot : 5330 et LO-HL-2 lot : 4451 marqués à la péroxydase .
ii) Protocole.
Les antigènes dilués à une concentration de 5 à 10 μg/ml dans du tampon carbonate bicarbonate au pH de 9,5 sont répartis à raison de 100 μl par puits dans des plaques 96 puits. Ces plaques sont incubées une nuit à 4°C. Les plaques sont ensuite lavées 3 fois avec du
PBS contenant 2% de Tween 20. Les plaques sont saturées avec du PBS contenant 2% de Tween 20 et 5% de lait écrémé à raison de 200 μl par puits et incubées une heure à 37°C.
Les plaques sont ensuite lavées 3 fois avec du PBS contenant 2% de Tween 20.
Les échantillons d' immunoglobulines à différentes dilutions sont répartis dans les plaques à raison de 10 μl par puits. Ces plaques sont incubées 2 heures à 37°C. Les plaques sont ensuite lavées 6 fois avec du PBS contenant 2% de Tween 20.
Les anticorps couplés à la péroxydase sont dilués dans du PBS contenant 2% de Tween 20 (0,5 μl/ml) et déposés dans les plaques à raison de 100 μl par puits. Les plaques sont incubées une heure à 37°C. Les plaques sont lavées 6 fois avec du PBS contenant 2% de Tween 20. Une pastille d'OPD (0 Phénylenediamine, réf :
P8787, Sigma) est dissoute dans le tampon de révélation
(tampon citrate phosphate au pH de 5,5) avec du peroxyde d'oxygène. La solution est déposée sur les plaques à raison de 100 μl par puits. Les plaques sont incubées de 10 à 20 minutes à l'obscurité. La réaction enzymatique est arrêtée par l'ajout de 50 μl par puits de H2S0 à 2M. Les résultats sont lus à 490 nm au lecteur de plaques.
iii) Résultats . Des tests ELISA sont donc réalisés afin de tester la spécificité des immunoglobulines sur les antigènes viraux A(H3N2) , A(H1N1) et B des souches de l'hiver 1998/99 (Tableau 2) . Les tests se sont révélés positifs pour 2 clones FAL 11 (3D2 et 2C3) et pour le clone FAL 8 (1G4) .
On constate l'absence de spécificité étroite pour une des 3 souches de virus, ce qui rend effectivement ces anticorps particulièrement intéressants sur le plan
thérapeutique dans le sens où ces anticorps sont capables d'être actifs sur différentes souches de virus.
Tableau 2 : Résultat du Test ELISA de spécificité sur les différents clones .
- Souris : Des souris BALB/c femelles de 5 semaines sont groupées par lot de 6. Elles sont hébergées dans une enceinte autonome dans des cages recouvertes d'une cape filtrante.
- Virus : Le virus Influenza A souche Scotland [A/Scotland/74 (H3N2)] est adapté à la souris par passages pulmonaires successifs. Le stock viral est conservé en broyats pulmonaires à -80°C. La dilution en tampon PBS pour l'infection expérimentale est effectuée extemporanément .
Anticorps : Des immunoglobulines totales humaines (Ivlg) conservées à -80°C puis diluées à la concentration souhaitée extemporanément (500 μg/ 50 μl) sont utilisées comme contrôle. Les anticorps purifiés AB1, AB2, AB9 et AB10 conservés à 4°C sont ajustés à une concentration équivalente pour chaque anticorps (1 μg/ 50 μl) .
ii) Protocole.
Les souris sont anesthésiées légèrement suivant un protocole décrit dans les ouvrages spécialisés et reçoivent par voie intra-nasale 50 μl de suspension d'anticorps (AB1, AB2 , AB9, AB10 ou d'Ig totales humaines : Ivlg) ou de sérum physiologique (Témoins) . Le lendemain, après anesthesie, elles reçoivent 50 μl de la suspension virale létale en 10 jours.
Les souris sont surveillées chaque jour. L'efficacité de la protection est mesurée en survie/ létalité.
iii) Résultats .
Les résultats (Tableau 3) montrent : que les souris recevant le sérum physiologique sont mortes dès Jll ; - que les souris recevant des anticorps de type
Ig M lambda du lot AB2 sont toutes vivantes à J15 ;
- que les souris recevant des anticorps de type Ig M lambda du lot AB9 sont toutes mortes à Jll ;
- que 5 des 6 souris recevant des anticorps de type Ig M Kappa du lot AB1 sont mortes à J15 ;
- que les souris recevant les immunoglobulines totales à la dose de 500 μg sont toutes vivantes à J15.
Les résultats montrent que les anticorps monoclonaux IgM lambda sécrétés par le clone FAL 11 2C3 protègent les souris de l'infection mortelle par le virus A/Scotland/74 (H3N2) de la grippe à la dose de 1 μg dans 50 μl de PBS comparativement à des immunoglobulines humaines totales à la dose de 500 μg dans 50 μl de PBS qui protègent également les souris de l'infection respiratoire mortelle par le même virus de la grippe.
Claims
REVENDICATIONS
1) Anticorps monoclonal humain à l'exclusion des anticorps de classe IgG neutralisant vis-à-vis du virus Influenza et plus particulièrement des souches A et B quelle que soit la nature des souches saisonnières, ou un fragment de celui-ci.
2) Anticorps monoclonal humain selon la revendication 1 de classe IgM, IgD, IgE ou IgA neutralisant vis-à-vis du virus Influenza et plus particulièrement des souches A et B quelle que soit la nature des souches saisonnières, ou un fragment de celui-ci.
3) Anticorps monoclonal selon la revendication
1 ou 2, caractérisé en ce que qu'il appartient à la classe IgM Lambda ou Kappa, qu'il présente sensiblement le même poids moléculaire en électrophorèse sur gel de polyacrylamide que l'IgM humaine de référence : Sigma, Réf. 18260 et qu'il présente une réaction positive avec un anticorps anti-IgM humaine.
4) Anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il est capable de protéger des souris contre l'infection par le virus Influenza H3N2 de la grippe.
5) Hybridome produisant un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6) Hybridome selon la revendication 5 déposé à la Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes à l'Institut Pasteur (Paris) sous le No. 1-2585.
7) Anticorps monoclonal comprenant un fragment d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
8) Compositions pharmaceutiques comprenant à titre d'agent actif une quantité efficace d'au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un fragment de celui-ci ou encore un anticorps selon la revendication 7.
9) Kit de détection d'une infection par les souches du virus Influenza, comprenant au moins un anticorps monoclonal selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 ou un fragment de celui-ci ou encore un anticorps selon la revendication 7.
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