WO2002020670A1 - Oxazinderivate - Google Patents

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WO2002020670A1
WO2002020670A1 PCT/EP2001/010236 EP0110236W WO0220670A1 WO 2002020670 A1 WO2002020670 A1 WO 2002020670A1 EP 0110236 W EP0110236 W EP 0110236W WO 0220670 A1 WO0220670 A1 WO 0220670A1
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WO
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oxazine derivative
oxazine
acid
examined
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PCT/EP2001/010236
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Inventor
Joachim Fries
Eloisa Lopez-Calle
Karl-Heinz Drexhage
Original Assignee
Evotec Oai Ag
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Priority to DE50105139T priority patent/DE50105139D1/de
Priority to EP01978341A priority patent/EP1317511B1/de
Priority to JP2002525681A priority patent/JP2004508448A/ja
Priority to AT01978341T priority patent/ATE287430T1/de
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Priority to US11/379,433 priority patent/US20060240455A1/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/34—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines condensed with carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
    • C09B19/00—Oxazine dyes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label

Definitions

  • the present invention relates to oxazine derivatives, processes for their preparation and their use as fluorescent dyes for marking biological and non-biological material in the red spectral range.
  • Oxazine-based dyes are widely used. They are often found in the textile industry for dyeing fabrics of various types.
  • EP-B-0 603 129 describes oxazine dyes, each of which has amino groups which are substituted on the benzene rings and which may be substituted.
  • the poorly soluble salts of these basic oxazine dyes are suitable for dyeing or printing natural fibers and fully synthetic fibers.
  • a cationic oxazine dye which also has two exo-permanent amino groups which can be substituted.
  • the oxazine dyes which can be rendered hydrophobic by substitution of inorganic anions, are used in particular in the ink layer of an ink ribbon for thermal transfer printing.
  • oxazine dyes which are used as fluorescent markers in connection with biological molecules.
  • the absorption range of these conjugates is 645 - 700 nm and corresponds to the red spectral range.
  • the coupling-capable oxazine derivatives are at least tetracyclic systems in which at least one of the two exocyclic nitrogen is integrated into the ring structure. Due to the complex polycyclic backbone, however, the effort for the synthesis of these dyes is very high.
  • dyes are required which are characterized by a high fluorescence quantum yield, high water solubility, high solubility in organic solvents, high chemical stability, high photo stability and the ability to bind to biological and non-biological materials or molecules.
  • red-excitable fluorescent dyes which include the oxazine dyes
  • the object of the present invention is to provide fluorescent dyes which avoid the disadvantages of the known fluorescent dyes mentioned above and which have the positive properties mentioned. Furthermore, it is the object of the present invention to provide methods for producing these fluorescent dyes and a method for marking material or molecules using these dyes.
  • the task consists in particular of red-excitable fluorescence To provide dyes that are readily water-soluble, while maintaining the photochemical properties. Furthermore, the dye should be activated in such a way that it is capable of being linked to biological and non-biological materials or molecules, without there being any negative interaction with the materials or molecules to be labeled.
  • the invention relates in particular to oxazine derivatives of the general formula I.
  • At least one of the radicals R 1, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , Re, R, R 8 Rg or Rio comprises at least one reactive group for binding to a material to be investigated, or at least one reactive group in addition owns, or a salt thereof.
  • the subclaims relate to preferred embodiments of the oxazine derivatives according to the invention, production and labeling processes.
  • the radicals R 1 to R 1 can comprise the reactive group, i. H. for example, represent and / or contain them.
  • a substituent can represent the reactive group.
  • the oxazine derivative can have a reactive group if the radicals do not comprise a reactive group. This reactive group can e.g. B. bound to the non-reactive substituents.
  • the oxazine derivatives according to the invention can be present as a tri- or tetra- / pentazine cycle.
  • Ri with R 2 and / or Rg with Rio forms a saturated or unsaturated C4 bridge.
  • Ri with R 2 or Rg with Rio forms a saturated or unsaturated C4 bridge, which creates a further six-membered ring on the tricyclic, which if necessary is substituted.
  • R_ very particularly preferably forms an unsaturated C 4 bridge with R 2 .
  • the reactive group serves to activate the dye, i.e. H. to offer a position that creates a link to the material to be examined.
  • Reactive groups in the sense of the invention include activatable and activated groups.
  • the bond to the material to be examined can be covalent or non-covalent in nature, although covalent attachment is preferred. It is preferred that only one reactive group is present per dye molecule.
  • the activation can e.g. B. also done by light (photoactivation).
  • the reactive group can be any group that enables a link to the material to be examined. If the material to be examined is, for example, a protein, then various groups are available for the attachment to the dye. These include, for example, amines from lysine residues or thiols from free cystine or cysteine residues.
  • a link to the material to be examined is, for example, a protein
  • various groups are available for the attachment to the dye. These include, for example, amines from lysine residues or thiols from free cystine or cysteine residues.
  • An exemplary list of preferred reactive groups includes groups such as an acid ester, acid anhydride, acid halide, imide, imidyl ester, carboxyl, carbonamide, halocarbonamide, sulfonyl halide, isothiocyanate, phosphoramidite, amine, aryldiazo, azide, aryldiazo, aldehyde, ketone or ditone or ketone Derivative.
  • Particularly preferred reactive groups are an acid ester, acid anhydride, acid halide, imide, imidyl ester, carboxyl, carbonamide, halocarbonamide, sulfonyl halide, isothiocyanate, phosphoramidite, phosphoramidite, amine, azide, aryldiazo or the dithionicotin derivative.
  • Very particularly preferred reactive groups are an N-succinimidyl ester which is optionally substituted, maleimide, carboxyl, haloacetamide, isothiocyanate, phosphoramidite, aryldiazo, azide, sulfonyl chloride, sulfo-tetrafluorophenol ester or primary or secondary amine.
  • a preferred substituent is the sulfonic acid group.
  • the oxazine derivatives can also contain a linker compound.
  • This linker connection is connected between a reactive group and a non-bridge-forming radical R 1, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , R, R 8 , R9 or Rio.
  • a reactive group of a non-bridging radical is preferably connected to the linker compound.
  • At least one reactive group is preferably also bound to the linker compound even after the connection.
  • the linker connections are introduced when there is a need to change the reactive group in a simple way, ie to change the functionality.
  • the carboxylic acid or the N-succinimidyl ester can be converted into an amine by means of a linker compound.
  • linker compounds make it possible to vary the distance between the dye and the material to be examined.
  • solubility of the oxazine derivatives can be easily adapted to the particular solvent.
  • Suitable linker compounds include, for example, polyoxyalkyl units, aliphatic, cycloaliphatic or aromatic units. They can be branched or unbranched and optionally unsaturated units and heteroatoms, e.g. B. nitrogen.
  • polyoxyalkyl units mentioned are polymeric or oligomeric organic radicals which are linked to one another via oxygen bridges. These include, for example, polyethers, polyols, soluble carbohydrates, derivatives thereof or water-soluble polymers.
  • Linker compounds can be exemplified as follows (Y in the following examples means "reactive group”):
  • radicals and substituents alkyl, cycloalkyl, alkenyl, alkenoxy, alkylaryl, arylalkoxy, alkoxy, halocarbonamide and alkoxycarbonyl generally have 1 to 10, preferably 1 to 7, carbon atoms and can be straight-chain or branched. 1 to 4 carbon atoms are particularly preferred.
  • Aryl is preferably benzene rings.
  • R 3 , R 4 , R and R 8 are preferred alkyl radicals which are optionally substituted and comprise the reactive group.
  • Other non-electron withdrawing groups are also preferred in various embodiments. These derivatives show a particularly high fluorescence quantum yield.
  • Halogen, fluorine, chlorine, bromine or iodine are suitable.
  • Any anion suitable for charge neutralization and compatible with the cationic backbone can be used as the counter ion, which does not reduce the water solubility or the solubility in other solvents, such as DMSO, DMF or alcohols of the overall compound.
  • Halogenidions, BF 4 ⁇ or tetraphenyl borate are preferred. Chloride or bromide ions or tetraphenyl borate are particularly preferred.
  • X means OH, phosphoramidite, or an N-succinimidyl ester group, which is optionally substituted, which also includes salts thereof.
  • oxazine dyes according to the invention over the previously known UV dyes, such as coumarins or dyes which are excited with blue or green light, such as fluoresceins and rhodamines, are as follows:
  • organic solvents such as DMSO, DMF or alcohols
  • protein labeling is intended to show a further decisive advantage of the dyes according to the invention.
  • Conventional labeling methods in particular protein labeling methods, such as the reaction of an activated carboxylic acid with Lys residues of the protein or of maleimides with free thiol groups of the protein, always address several of these groups of the protein, so that the labeling reaction results in a statistical distribution the label comes on the protein, ie some protein molecules have no, others one, two, three or more labels.
  • highly sensitive fluorescence techniques such as.
  • any measurable detection marker for example radioactive detection markers etc.
  • Dye markers in particular fluorescent markers, are preferably used.
  • the oxazine derivatives according to the invention are very particularly preferably used.
  • the oxazine derivatives according to the invention can additionally have at least one affinity marker which enables simple purification by affinity chromatography.
  • the affinity marker can e.g. B. bound to the linker compound.
  • the oxazine derivatives have only one affinity marker.
  • any affinity marker can be used which is suitable for performing a clean separation in the subsequent affinity chromatography.
  • Affinity markers such as biotin, hexa-His or haptens can be mentioned here as examples.
  • a method for the targeted labeling of material to be examined using the affinity-labeled oxazine derivatives can be carried out as follows: a) providing a sample comprising a material to be examined; b) reaction of the material to be investigated with an oxazine derivative described above and containing an affinity marker, a labeled material to be investigated being formed which, as a mixture, has no, one or more oxazine derivatives as a label; and c) separation of the material to be examined into non, single or multiple labeled fractions by affinity chromatography.
  • the method for the targeted marking of material to be examined by means of affinity-marked detection markers can be carried out as follows:
  • the biotin unit represents any affinity marker, oxazine derivative III for any dye marker, in particular a dye according to the invention and the N-succinimidyl ester for any reactive group.
  • a suitable carrier material here monomeric avidin
  • the material to be examined can be bound covalently or non-covalently to the oxazine derivative, although it is preferably bound covalently.
  • the material to be examined is preferably a biological material Material, a chemical compound, in particular a biologically active substance and / or an active pharmaceutical ingredient, a synthetic or biological microparticle or a combination thereof.
  • the chemical compounds can comprise all synthetic compounds which are present as a single molecule or aggregate, for example as a small organic compound and also as an oligomer or polymer.
  • the chemical compounds are preferably biologically active substances and / or active pharmaceutical ingredients.
  • Synthetic microparticles ie in particular soluble and suspendable carrier materials, refer to any type of synthetic microparticles that can be dissolved or suspended in a liquid, in particular an aqueous solution.
  • the diameters d of the microparticles are equal to or smaller than 1 ⁇ m, preferably they are in the range of 1 nm ⁇ d ⁇ 1 ⁇ m, particularly preferably in the range of 10 nm ⁇ d ⁇ 500 nm, very particularly preferably in the range of 50 nm ⁇ d ⁇ 300 nm.
  • the synthetic microparticles include those made from organic polymers. For example, dendrimer-based polymers, preferably dendrimer-based polyethylene glycol, can be used.
  • all synthetic microparticles that are soluble or suspendable under the experimental conditions can be used, in particular glass particles with a defined pore size, cellulose, silica gel and other types of polystyrene particles, the latter optionally crosslinked with divinylbenzene and / or grafted with polyethylene glycol and / or functionalized with amino, hydroxy, carboxyl or halogen.
  • Further examples of possible synthetic microparticles include grafted copolymer, polyacrylamide, latex, dimethylacrylamide particles optionally grafted with N, N'-bis-acryloylethylenediamine and polymer-coated glass particles.
  • In the biological micropar particles are preferably vesicular particles or virus-like particles.
  • the biological material can be, for example, nucleotides, oligonucleotides, sugars, lipids, membranes, cells, cell components, DNA, RNA, peptides, proteins, antibodies, haptens or antigens.
  • the materials to be examined can be marked both in liquid and in connection with solid phases. Both the use of activated and activatable oxazine derivatives is possible.
  • the activatable oxazine derivatives e.g. the carboxy derivatives, in-situ with activation reagents such as e.g. Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOB).
  • activation reagents such as e.g. Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOB).
  • Such activation is preferably carried out in reactions on the solid phase.
  • the present invention also relates to a kit for marking a material to be examined as described above.
  • this kit comprises an oxazine derivative according to the general formula I.
  • Typical components are e.g. B. buffers, analysis vessels and instructions for carrying out the examinations.
  • the kit contains an oxazine derivative of the formula II, III, IV, V, VIII or IX, in particular in the form of an N-succinimidyl ester, which can optionally be substituted. Kits with oxazine derivatives of the formula II, III, IV or V are particularly preferred.
  • the material to be examined is preferably a biological material, a chemical compound, in particular a biologically active substance and / or an active pharmaceutical ingredient, a synthetic or biological microparticle or a combination of these.
  • the individual materials have already been described above.
  • the oxazine derivatives according to the invention are outstandingly suitable for chemical or biotechnical investigations. These include: the identification and characterization of biological material or chemical compounds, search for biologically active substances and / or active pharmaceutical ingredients, the identification of analytes in diagnostic and / or therapeutic procedures, genome analysis (e.g. SNP analyzes) or Cleaning and concentrating substrates.
  • the investigations mentioned are preferably carried out by means of laser light analysis and fluorescence detection.
  • the measuring methods used include practically all methods with which the oxazine derivative can be measured. These methods include spectrometry, multi-photon excitation, in particular two-photon excitation, laser scanning microscopy, near-field spectroscopy, photon distribution analyzes, in particular FIDA and 2-D-FIDA, fluorescence lifetime analysis and fluorescence polarization analysis.
  • the measurements are very particularly preferably carried out using a confocal microscope or other confocal optics.
  • the data are preferably evaluated by autocorrelation analysis and / or cross-correlation analysis.
  • oxazine derivatives according to the invention can also be used very well in FISH (fluorescence in situ hybridization) or PCR (polymerase chain reaction) processes.
  • the oxazine dyes according to the invention are easily accessible synthetically, which distinguishes them from the compounds of the prior art which are much more difficult to produce.
  • the dyes according to the invention in particular derivatives II, III, IV or V, all have a very compact molecular structure, so that the interaction with the material to be examined can be assessed as extremely low. In particular, the biological properties of biological material are not changed. The generally neutral total charge minimizes the electrostatic interaction between the dye and the labeled component.
  • the fluorescent dyes according to the invention have a high reactivity towards the materials to be examined, in particular amines, a high fluorescence quantum yield, high solvent resistance and pH resistance, high chemical stability and NIR excitability.
  • the dyes of the present invention are characterized by low excitation energy and thus low photo-destruction.
  • the special excitation and emission wavelengths of the dyes according to the invention enable the use of commercially available filter systems.
  • the low background fluorescence (autofluorescence) of chemical and biological materials with red excitation compared to high-energy excitation wavelengths is also advantageous.
  • the dyes according to the invention are therefore very good in the red spectral range used.
  • the high chemical stability is particularly important under conditions of solid phase synthesis.
  • the dyes according to the invention show a low adsorption or non-specific binding tendency and are very readily water-soluble. They are ideal for chemical and biotechnical investigations in aqueous solutions, DMSO, DMF or alcohols.
  • oxazine derivatives according to the invention can be prepared, for example, in the following way:
  • radicals R 1 to R 10 have the meanings already given above.
  • the reaction at a temperature in the range from 50 to 70 ° C, preferably 55 to 65 ° C, is carried out.
  • the 3-amino-phenol compound is dissolved in, for example, glacial acetic acid, after which the nitroso compound is added over a period of 10 minutes to 5 hours. After a deep blue solution has formed, the reaction will usually be complete.
  • the mixture is then purified, usually using column chromatography.
  • 5-CT 5-carboxyamidotryptamine
  • 50 ⁇ l of N, N-dimethylformamide a solution of 1.5 ⁇ mol of [(2-carboxy-ethyl) methylamino] - [ethyl- (3-sulfo- propyl) amino] - phenoxazin-5-ylium succinimidyl ester in 200 ⁇ l of N, N-dimethylformamide.
  • 250 ⁇ l of 0.15 M borate buffer pH 8.6 are added to this solution and the reaction solution is shaken for 3 hours at room temperature.
  • the solution is then evaporated to dryness and the crude product is purified by column chromatography (eluent: methanol / water gradient: 0% methanol to 100% methanol in 30 minutes; carrier: reversed phase C18).
  • Bovine IgG 10 nmol Bovine IgG are dissolved in 150 ⁇ l water. This solution is mixed with 15 ⁇ l 1 M sodium carbonate solution pH 9.3 and 331.4 ⁇ l 0.1 M sodium carbonate solution pH 9.3 and a solution of
  • N- ⁇ - (9-fluorenylmethoxycarbonyl) aminohexanoic acid were dissolved in 1200 ⁇ l of dichloromethane and 300 ⁇ l of N, N-dimethylformamide (DMF) and cooled to 0 ° C.
  • 500 ⁇ mol of N, N '-diisopropylcarbodiimide were dissolved in 80 ⁇ l of N, N-dimethylformamide and added to the solution of the amino acid.
  • the reaction solution was left to stand at 0 ° C. for 30 minutes and then the dichloromethane was removed in vacuo. The residue was taken up with 1000 ⁇ l of N, -dimethylformamide, a clear solution being obtained.
  • the resin was then washed six times with 2 ml of N, N-dimethylformamide and three times with 2 ml of dichloromethane and six times with 2 ml of t-butyl methyl ether, dried and weighed out to determine the loading.
  • the determined loading of the resin was 0.8 mmol / g resin.
  • the 9-fluorenylmethoxycarbonyl protective group (FMOC) was first split off by means of two treatments for 5 or 15 minutes with a solution of 20% piperidine in N, -dimethylformamide.
  • the resin was then washed six times with 2 ml of N, N-dimethylformamide.
  • N, N-dimethylformamide washed.
  • the reaction was then carried out using 250 ⁇ mol of biotinoylaminohexanoyl-N-hydroxysuccinimidyl ester in 300 ⁇ l of N, N-dimethylformamide.
  • the reaction solution was filtered off with suction and the resin was washed six times with 2 ml of N, N-dimethylformamide and three times with 2 ml of dichloromethane and six times with 2 ml of t-butyl methyl ether and dried.

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Abstract

Es werden Oxazinderivate beschrieben, mit denen ein breites Spektrum von zu untersuchendem Material markiert und mittels Fluoreszenztechniken identifiziert werden kann.

Description

Oxazinderivate
Die vorliegende Erfindung betrifft Oxazinderivate, Verfahren zur ihrer Herstellung und ihre Anwendung als Fluoreszenzfarbstoffe zur Markierung von biologischem und nicht-biologischem Material im roten Spektralbereich.
Farbstoffe auf Oxazinbasis sind weit verbreitet. Man findet sie oftmals im Bereich der Textilindustrie zum Färben von Stoffen verschiedener Art. So beschreibt die EP-B-0 603 129 Oxazinfarbstoffe, die jeweils an den Benzolringen exoständige Aminogruppen, die substituiert sein können, aufweisen. Die schwer löslichen Salze dieser basischen Oxazinfarbstoffe eignen sich zum Färben oder zum Bedrucken von natürlichen Fasern und voll synthetischen Fasern.
Aus der US-A-5656759 ist ein kationischer Oxazinfarbstoff bekannt, der ebenfalls zwei exoständige Aminogruppen, die substituiert sein können, aufweist. Die Oxazinfarbstoffe, die durch Substitution anorganischer Anionen hydrophob gemacht werden können, werden insbesondere in der Farbschicht eines Farbbandes für den Thermotransferdruck verwendet.
Aus der EP-A-0 747 447 sind Oxazinfarbstoffe bekannt, die als Fluoreszenzmarker in Verbindung mit biologischen Molekülen verwendet werden. Der Absorptionsbereich dieser Konjugate liegt bei 645 - 700 nm und entspricht dem roten Spektralbereich. Die kupplungsfähigen Oxazinderivate sind mindestens tetrazyklische Systeme, in denen mindestens einer der beiden exozyklischen Stickstoffe in die Ringstruktur integriert ist. Auf Grund des komplexen polyzyklischen Grundgerüsts ist allerdings der Aufwand zur Synthese dieser Farbstoffe sehr hoch.
Insbesondere für das Hochdurchsatzscreening mit konfokaler Fluoreszenzspektroskopie werden Farbstoffe benötigt, die sich durch eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, hohe Wasserlöslichkeit, hohe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, hohe chemische Stabilität, hohe Fotostabilität sowie die Fähigkeit, an biologische und nicht-biologische Materialien bzw. Moleküle zu binden, auszeichnen.
Durch den kostengünstigen Zugang zu rotemittierenden Laser- Lichtquellen sowie die geringe Hintergrundfluoreszenz (Autofluoreszenz) von biologischem Material bei roter Anregung gegenüber energiereicheren Anregungswellenlängen kommt dem Einsatz von rot-anregbaren Fluoreszenzfarbstoffen, zu denen unter anderem auch die Oxazin-Farbstoffe zählen, steigende Bedeutung zu.
Durch herkömmliche Markierungsverfahren, insbesondere Proteinmarkierungsverfahren beispielsweise unter Verwendung von fluo- reszenten Detektionsmarkern werden immer mehrere reaktive Gruppen dieser Moleküle angesprochen, so dass es durch die Markierungsreaktion zu einer statistischen Markierung kommt, d.h. einige Proteine besitzen keine, andere eine, zwei oder mehr Markierungen. In hochempfindlichen Analysetechniken kommt es durch die heterogene Analytmischung zu unerwünschten heterogenen Signalverteilungen, die die Messergebnisse verfälschen oder gar unbrauchbar machen. Darüber hinaus kommt es beispielsweise innerhalb von mehrfach markierten Proteinen durch die Wechselwirkung zwischen den einzelnen Markierungen zu einer Abschwächung des Signals.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, Fluoreszenzfarbstoffe zur Verfügung zu stellen, die die vorstehend genannten Nachteile der bekannten Fluoreszenzfarbstoffe vermeiden und die genannten positiven Eigenschaften aufweisen. Des Weiteren ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Herstellung dieser Fluoreszenzfarbstoffe und ein Verfahren zur Markierung von Material bzw. Molekülen unter Verwendung dieser Farbstoffe zur Verfügung zu stellen. Die Aufgabe besteht insbesondere darin, rotanregbare Fluoreszenz- farbstoffe zur Verfügung zu stellen, die gut wasserlöslich sind, wobei die photochemischen Eigenschaften erhalten bleiben. Des weiteren soll der Farbstoff in der Weise aktiviert sein, dass er zur Anknüpfung an biologische und nichtbiologische Materialien bzw. Moleküle befähigt ist, ohne dass es zu einer negativen Wechselwirkung mit den zu markierenden Materialien bzw. Molekülen kommt.
Die Lösung (der Aufgabe erfolgt erfindungsgemäß durch Stoffe und Verfahren mit den Merkmalen der Ansprüche 1, 31 oder 34.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Oxazinderivate der allgemeinen Formel I
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worin
(a) die Reste Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R, R8, R9 und Rio voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alke- nyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Al- koxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, A- cyl, Acyloxy, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sul- fonyl, Sulfonylhalogenid, Säureester, Säureanhydrid, Säure- halogenid, Imid, Imidylester, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Azid, Dithionicotin-Derivat oder Amin bedeuten und gegebenenfalls substituiert sind, (b) Ri mit R2 und/oder Rg mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C3- oder C4-Brücke bilden kann/können, die gegebenenfalls substituiert ist/sind;
(c) die Substituenten unabhängig voneinander Alkyl, Cyclo- alkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Ary- lalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbo- namid, Sulfonyl, Sulfonylhalogenid, Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, I id, Imidylester, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Azid, Dithionicotin-Derivat oder Amin bedeuten können; und
(d) mindestens einer der Reste Ri, R2, R3, R4, R5, Re, R, R8 Rg oder Rio mindestens eine reaktive Gruppe für die Bindung an ein zu untersuchendes Material umfasst, oder mindestens eine reaktive Gruppe zusätzlich besitzt, oder ein Salz davon.
Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Oxazinderivate, Herstellungs- und Markierungsverfahren.
Im erfindungsgemäßen Sinne können die Reste Ri bis Rio die reaktive Gruppe umfassen, d. h. beispielsweise darstellen und/oder diese enthalten. Beispielsweise kann ein Substituent die reaktive Gruppe darstellen. Zusätzlich kann das Oxazinde- rivat eine reaktive Gruppe besitzen, wenn die Reste keine reaktive Gruppe umfassen. Diese reaktive Gruppe kann z. B. an die nicht-reaktiven Substituenten gebunden sein.
Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate können als Tri- bzw. Tet- ra-/Pentazyklus vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform bildet Ri mit R2 und/oder Rg mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C4-Brücke. Insbesondere bildet Ri mit R2 oder Rg mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C4-Brücke, womit ein weiterer Sechsring am Trizyklus entsteht, der gegebenenfalls substituiert ist. Ganz besonders bevorzugt bildet R_ mit R2 eine ungesättigte C4-Brücke.
Die reaktive Gruppe dient dazu, den Farbstoff zu aktivieren, d. h. eine Stelle anzubieten, die eine Bindung zu dem zu untersuchenden Material schafft. Reaktive Gruppen im Sinne der Erfindung umfassen aktivierbare und aktivierte Gruppen. Die Bindung zum zu untersuchenden Material kann kovalenter oder nicht-kovalenter Natur sein, wobei allerdings die kovalente Anknüpfung bevorzugt ist. Bevorzugt ist, dass nur eine reaktive Gruppe pro Farbstoffmolekül vorhanden ist. Die Aktivierung kann z. B. auch durch Licht erfolgen (Photoaktivierung).
Die reaktive Gruppe kann jede Gruppe sein, die zu einer Verknüpfung mit dem zu untersuchenden Material befähigt. Wenn das zu untersuchende Material beispielsweise ein Protein ist, dann bieten sich verschiedene Gruppen für die Anknüpfung an den Farbstoff an. Dazu zählen beispielsweise Amine aus Lysinresten oder Thiole aus freien Cystin- oder Cysteinresten. Zur Markierung von Oligonukleotiden mit den erfindungsgemäßen Oxazinde- rivaten bereits während der Synthese des Oligonukleotides erfolgt vorzugsweise die Verwendung eines erfindungsgemäßen Oxa- zinderivates mit einer Phosphoramiditgruppe als reaktive Gruppe. Die besondere hohe Basenstabilität dieser Oxazinderivate ermöglicht die einfache und schnelle Verwendung in solchen Synthesereaktionen.
Eine beispielhafte Aufzählung von bevorzugten reaktiven Gruppen umfasst Gruppierungen, wie ein Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Carboxyl, Carbo- namid, Halogencarbonamid, Sulfonylhalogenid, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Amin, Aryldiazo, Azid, Aryldiazo, Aldehyd, Keton oder Dithionicotin-Derivat . Besonders bevorzugte reaktive Gruppen sind ein Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sulfonylhalogenid, Isothiocya- nat, Phosphoramidit, Phosphoramidit, Amin, Azid, Aryldiazo o- der Dithionicotin-Derivat .
Ganz besonders bevorzugte reaktive Gruppen sind ein N- Succinimidylester, der ggf. substituiert ist, Maleimid, Carboxyl, Halogenacetamid, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Aryldiazo, Azid, Sulfonylchlorid, Sulfo-Tetrafluorphenolester oder primäres bzw. sekundäres Amin.
Für den Fall, dass der N-Succinimidylester substituiert ist, ist ein bevorzugter Substituent die Sulfonsäuregruppe.
Es hat sich erfindungsgemäß herausgestellt, dass die Oxazinderivate ebenfalls eine Linkerverbindung enthalten können. Diese Linkerverbindung ist zwischen reaktiver Gruppe und einem nicht-brückebildenden Rest Ri, R2, R3, R4, R5, R6, R, R8, R9 oder Rio geschaltet. Vorzugsweise erfolgt eine Verbindung einer reaktiven Gruppe eines nicht-brückebildenden Restes mit der Linkerverbindung. An die Linkerverbindung ist vorzugsweise auch nach der Verbindung noch mindestens eine reaktive Gruppe gebunden. Die Linkerverbindungen werden eingeführt, wenn ein Bedarf dahingehend besteht, die reaktive Gruppe auf einfachem Weg zu verändern, d. h. die Funktionalität zu ändern. Beispielsweise kann mittels einer Linkerverbindung die Carbonsäure oder der N-Succinimidylester in ein Amin umgewandelt werden. Zum anderen ermöglichen es die Linkerverbindungen, den Abstand zwischen Farbstoff und dem zu untersuchenden Material zu variieren. Mittels der Linkerverbindungen läßt sich auf einfachem Wege die Löslichkeit der Oxazinderivate an die jeweiligen Lösungsmittel anpassen. Zu geeigneten Linkerverbindungen zählen beispielsweise Polyo- xyalkyleinheiten, aliphatische, cykloaliphatische oder aromatische Einheiten. Sie können verzweigt oder unverzweigt sein und gegebenenfalls ungesättigte Einheiten und Heteroatome, z. B. Stickstoff, enthalten.
Die genannten Polyoxyalkyleinheiten sind polymere oder oligo- ere organische Reste, die über Sauerstoffbrücken miteinander verknüpft sind. Dazu zählen beispielsweise Polyether, Polyole, lösliche Carbohydrate, Derivate davon oder wasserlösliche Polymere.
Exemplarisch können Linkerverbindungen wie folgt dargestellt werden (Y bedeutet in den nachfolgenden Beispielen "reaktive Gruppe") :
-CH2-CH2-0-CH2-CH2-Y
-CH2-CH2-0-CH2-CH2-0-CH2-CH2-Y
-CH2-CH2-Y
—CH—CH—CH—Y
-CH2-CH2-CH2-CH2-Y
-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-Y
-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-Y
Figure imgf000008_0001
[ (CH2)n-0]m-(CH2)ι-Y
Figure imgf000008_0002
(sowie ortho- und meta-Substitution] Die Reste und Substituenten Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alke- noxy, Alkylaryl, Arylalkoxy, Alkoxy, Halogencarbonamid und Alkoxycarbonyl weisen in der Regel 1 bis 10, bevorzugt 1 bis 7 Kohlenstoffatome auf und können geradkettig oder verzweigt sein. Besonders bevorzugt sind 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Bei Aryl handelt es sich vorzugsweise um Benzolringe.
Bevorzugt sind R3, R4, R und R8 Alkylreste, die ggf. substituiert sind und die reaktive Gruppe umfassen. Andere nicht- elektronenziehende Reste sind ebenfalls in verschiedenen Ausführungsformen bevorzugt. Diese Derivate zeigen eine besonders hohe Fluoreszenzquantenausbeute.
Als Halogene kommen Fluor, Chlor, Brom oder Jod in Frage.
Als Gegenion kann jedes zur Ladungsneutralisierung geeignete und mit dem kationischen Grundgerüst kompatible Anion verwendet werden, das die Wasserlöslichkeit oder die Löslichkeit in anderen Lösungsmitteln, wie z.B. DMSO, DMF oder Alkoholen der Gesamtverbindung nicht herabsetzt. Bevorzugt sind Halogenidio- nen, BF4 ~ oder Tetraphenylborat . Besonders bevorzugt sind Chlorid- oder Bromidionen oder Tetraphenylborat.
Besonders bevorzugte Oxazinderivate sind spezielle Ausführungsformen, die durch die Formeln II bis V und VIII - IX wiedergegeben werden:
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000010_0001
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Figure imgf000011_0001
Figure imgf000011_0002
worin X OH, Phosphoramidit, oder eine N-Succinimidylester- gruppe, die ggf. substituiert ist, bedeutet, wobei ebenfalls Salze davon eingeschlossen sind.
Die Vorteile der erfindungsgemäßen Oxazinfarbstoffe gegenüber den bisher bekannten UV-Farbstoffen, wie Cumarine oder Farbstoffen, die mit blauem oder grünen Licht angeregt werden, wie Fluoresceine und Rhodamine, sind die folgenden:
- hohe Reaktivität gegenüber Aminen, so dass ein großer Bereich von zu untersuchenden Substanzen auf einfache Weise kovalent markiert werden kann;
- hohe Wasserlöslichkeit, was zu einer minimalen Adsorption und einer minimalen unspezifischen Bindung führt;
- hohe Löslichkeit in organischen Lösungsmitteln, wie bei beipielsweise DMSO, DMF oder Alkoholen;
- Anregung bei 630 bis 650 nm mittels kostengünstiger Laserdioden oder HeNe-Lasern;
- Emission mit einem Maximum im Bereich von 670 nm, wobei übliche Filteranordnungen verwendet werden können;
- hohe Fluoreszenzquantenausbeute, was klare und deutliche Fluoreszenzsignale hervorbringt; - Lösungsmittelstabilität und pH-Stabilität (pH 1-10), so dass sie für sehr viele Anwendungen geeignet sind;
- neutrale Gesamtladung, was dazu führt, dass kein elektrostatischer Einfluß auf das markierte Molekül stattfindet;
- chemische Stabilität und daher eine außerordentliche Eignung in der organischen Chemie (Lösung und Festphase) ; und
- NIR-Anregbarkeit, was zu einer geringen Hintergrundfluoreszenz (Autofluoreszenz) des zu untersuchenden Materials führt.
Die hohe Symmetrie der erfindungsgemäßen Oxazinderivate, insbesondere der Derivate II, III, IV und V, bewirkt eine besonders hohe Fluoreszenzquantenausbeute, hohe Lichtabsorption und scharfe Absorptionsbanden.
Am folgenden Beispiel der Proteinmarkierung soll ein weiterer entscheidender Vorteil der erfindungsgemäßen Farbstoffe gezeigt werden. Durch herkömmliche Markierungsverfahren, insbesondere Proteinmarkierungsverfahren, wie z.B. die Umsetzung einer aktivierten Carbonsäure mit Lys-Resten des Proteins bzw. von Maleimiden mit freien Thiol-Gruppen des Proteins werden immer mehrere dieser Gruppen des Proteins angesprochen, so dass es durch die Markierungsreaktion zu einer statistischen Verteilung der Markierung auf dem Protein kommt, d.h. einige Proteinmoleküle besitzen keinen, andere einen, zwei, drei oder mehrere Markierungen. Beispielsweise in hochempfindlichen Fluoreszenztechniken, wie z. B. FCS (Fluorescence Correlation Spectroscopy) und FIDA (Fluo- rescence Intensity Distribution Analysis) , kommt es durch diese heterogene Analytmischung auch zu heterogenen Signalverteilungen, die eine Auswertung der Daten erschwert. Darüber hinaus kommt es in Proteinen, die zwei, drei oder mehrere Label tragen, zu Farbstoff-Farbstoff-Wechselwirkungen, die das Fluoreszenzsignal drastisch abschwächen. Mit den erfindungsgemäßen Oxazinderivaten ist es allerdings möglich, ein einfach markiertes zu untersuchendes Material für die Analyse zur Verfügung zu stellen. Damit ist gewährleistet, dass keine heterogene Signalverteilungen und Farbstoff-Farbstoff-Wechselwirkungen auftreten. Dies führt zu einer erheblichen Verbesserung der Messergebnisse.
Prinzipeil kann jeder messbare Detektionsmarker, beispielsweise auch radioaktive Detektionsmarker etc., eingesetzt werden. Bevorzugt werden Farbstoffmarker, insbesondere Fluoreszenzmar- ker, verwendet werden. Ganz besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Oxazinderivate eingesetzt.
Anstelle der einfach markierten Fraktionen des zu untersuchenden Materials, kann es beispielsweise auch bevorzugt sein, zweifach, dreifach etc. markierte Fraktionen zu isolieren.
Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate können zusätzlich mindestens einen Affinitätsmarker aufweisen, der eine einfache Reinigung durch Affinitätschromatographie ermöglicht. Der Äffinitätsmarker kann z. B. an die Linkerverbindung gebunden sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die Oxazinderivate nur einen Äffinitätsmarker auf. Im Prinzip kann jeder Äffinitätsmarker verwendet werden, der geeignet ist, in der nachfolgenden Affinitätschromatographie eine saubere Trennung durchzuführen. Als Beispiele können an dieser Stelle Affinitätsmarker, wie Biotin, Hexa-His oder Haptene genannt werden.
Ein Verfahren zur gezielten Markierung von zu untersuchendem Material mittels der affinitätsmarkierten Oxazinderivate kann wie folgt durchgeführt werden: a) Bereitstellen einer Probe, umfassend ein zu untersuchendes Material; b) Umsetzung des zu untersuchenden Materials mit einem o- ben beschriebenen, einen Äffinitätsmarker enthaltenden Oxa- zinderivat, wobei sich ein markiertes zu untersuchendes Material bildet, das als Mischung kein, ein oder mehrere Oxazinderivate als Markierung aufweist; und c) Auftrennung des zu untersuchenden Materials in nicht, einfach oder mehrfach markierte Fraktionen durch Affinitätschromatographie .
Das Verfahren zur gezielten Markierung von zu untersuchendem Material mittels affinitätsmarkierter Detektionsmarker kann wie folgt durchgeführt werden:
a) Bereitstellen einer Probe, umfassend ein zu untersuchendes Material; b) Umsetzung des zu untersuchenden Materials mit einem oben beschriebenen, einen Affinitätsmarker enthaltenden Detektionsmarker, wobei sich ein markiertes zu untersuchendes Material bildet, das als Mischung kein, ein oder mehrere Detektionsmarker als Markierung aufweist; und c) Auftrennung des zu untersuchenden Materais in nicht, einfach oder mehrfach markierte Fraktionen durch Affinitätschromatographie .
Nachfolgend wird beispielhaft eine derartige Affinitätsaufreinigung unter Verwendung der erfindungsgemäßen Oxazinderivate mit dem System Biotin/Avidin (Äffinitätsmarker/Trägermaterial) vorgestellt.
Durch den Einsatz des unten dargestellten affinitätsmarkierten erfindungsgemäßen Farbstoff-Reaktiv-Moleküls kann der oben beschriebene Nachteil der bekannten Markierungstechniken umgangen werden. Dabei steht die Biotin-Einheit stellvertretend für einen beliebigen Affinitätsmarker, Oxazinderivat III für einen beliebigen Farbstoffmarker, insbesondere einen erfindungsgemäßen Farbstoff und der N-Succinimidylester für eine beliebige reaktive Gruppe. Ein solches Molekül reagiert analog den herkömmlichen Markierungsverfahren mit dem Protein, was in einer heterogenenen Mischung wie oben beschrieben resultiert. Durch eine nachfolgende Affinitätsreinigung an einem geeigneten Trägermaterial (hier monomeres Avidin) werden unmarkierte Proteine aus der Probe entfernt. Durch nachfolgende vorsichtige Elu- tion können einfachmarkierte Proteine eluiert werden, während doppel- und höhermarkierte Proteine aufgrund der kooperativ verstärkten Bindung an das Trägermaterial gebunden bleiben. Somit kann ein homogener Analyt mit exakt einem erfindungsgemäßen Oxazinderivat pro Proteinmolekül erhalten werden.
Figure imgf000015_0001
Das zu untersuchende Material kann kovalent oder nicht- kovalent an das Oxazinderivat gebunden sein, wobei es allerdings bevorzugt kovalent gebunden ist. Bei dem zu untersuchenden Material handelt es sich vorzugsweise um ein biologisches Material, eine chemische Verbindung, insbesondere eine biologisch aktive Substanz und/oder einen pharmazeutischen Wirkstoff, einen synthetischen oder biologischen Mikropartikel o- der eine Kombination davon.
Die chemischen Verbindungen können alle synthetischen Verbindungen umfassen, die als ein einzelnes Molekül oder Aggregat, beispielsweise als kleine organische Verbindung und auch als Oligomer oder Polymer vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei den chemischen Verbindungen um biologisch aktive Substanzen und/oder pharmazeutische Wirkstoffe.
Synthetische Mikropartikel, d.h. insbesondere lösliche und suspendierbare Trägermaterialien, bezeichnen jede Art von synthetischen Mikropartikeln, die in einer Flüssigkeit, insbesondere einer wässrigen Lösung, gelöst oder suspendiert werden können. Die Durchmesser d der Mikropartikel sind gleich oder kleiner als 1 μm, bevorzugt liegen sie im Bereich von 1 nm < d < 1 μm, besonders bevorzugt im Bereich von 10 nm < d < 500 nm, ganz besonders bevorzugt im Bereich von 50 nm < d < 300 nm. Beispiele für die synthetischen Mikropartikel umfassen solche aus organischen Polymeren. Zum Beispiel können Polymere auf Dendrimer-Basis, bevorzugt Polyethylenglykol auf Dendrimer- Basis verwendet werden. Es können jedoch alle synthetischen Mikropartikel verwendet werden, die unter den experimentellen Bedingungen löslich oder suspendierbar sind, insbesondere Glaspartikel mit definierter Porengröße, Cellulose-, Silika- gel- und andere Typen von Polystyrolpartikeln, letztere gegebenenfalls vernetzt mit Divinylbenzol und/oder gepropft mit Polyethylenglykol und/oder funktionalisiert mit Amino, Hydro- xy, Carboxyl oder Halogen. Weitere Beispiele von möglichen synthetischen Mikropartikeln umfassen gepropfte Co-Polymer-, Polyacrylamid-, Latex-, gegebenenfalls mit N,N'-bis- Acryloylethylendiamin gepropfte Dimethylacrylamidpartikel und polymerüberzogene Glaspartikel. Bei den biologischen Mikropar- tikeln handelt es sich vorzugsweise um vesikuläre Partikel o- der virus-ähnliche Partikel.
Bei dem biologischen Material kann es sich beispielsweise um Nukleotide, Oligonukleotide, Zucker, Lipide, Membranen, Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, Peptide, Proteine, Antikörper, Haptene oder Antigene handeln.
Die Markierung von zu untersuchenden Materialien, insbesondere biologischem Material kann sowohl in flüssiger als auch in Verbindung mit festen Phasen erfolgen. Dabei ist sowohl die Verwendung von aktivierten als auch aktivierbaren Oxazinderivaten möglich. Beispielsweise erfolgt die Aktivierung der aktivierbaren Oxazinderivate, z.B. der Carboxyderivate, in-situ mit Aktivierungsreagenzien, wie z.B. Benzotriazol-1-yl-oxy- tris-pyrrolidino-phosphonium Hexafluorophosphat (PyBOB) . Vorzugsweise wird eine solche Aktivierung bei Reaktionen an der festen Phase durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zur Markierung eines, wie oben beschriebenen, zu untersuchenden Materials. Dieses Kit umfasst, neben üblichen Bestandteilen, ein Oxazinderivat nach der allgemeinen Formel I. Übliche Bestandteile sind z. B. Puffer, Analysegefäße und Instruktionen zur Durchführung der Untersuchungen. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Kit ein Oxazinderivat der Formel II, III, IV, V , VIII oder IX, insbesondere in Form eines N- Succinimidylesters, der ggf. substituiert sein kann. Besonders bevorzugt sind Kits mit Oxazinderivaten der Formel II, III, IV oder V.
Das zu untersuchende Material ist vorzugsweise ein biologisches Material, eine chemische Verbindung, insbesondere eine biologisch aktive Substanz und/oder ein pharmazeutischer Wirkstoff, ein synthetischer oder biologischer Mikropartikel oder eine Kombination davon. Die einzelnen Materialien sind bereits oben beschrieben worden.
Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate eignen sich hervorragend für chemische oder biotechnische Untersuchungen. Dazu zählen: die Identifizierung und Charakterisierung von biologischem Material oder chemischen Verbindungen, Suche nach biologisch aktiven Substanzen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen, die Identifizierung von Analyten in diagnostischen und/oder therapeutischen Verfahren, die Genomanalyse (z. B. SNP-Analysen) oder die Reinigung und Konzentrierung von Substraten.
Die genannten Untersuchungen werden bevorzugt mittels Laserlichtanalytik und Fluoreszenzdetektion durchgeführt. Die dabei angewandten Messverfahren schließen praktisch alle Verfahren ein, mit denen das Oxazinderivat gemessen werden kann. Zu diesen Verfahren zählen die Spektrometrie, Mehrphotonenanregung, insbesondere Zwei-Photonen-Anregung, Laser- Scanning-Mikroskopie, Nahfeldspektroskopie, Photonenverteilungsanalysen, insbesondere FIDA und 2-D-FIDA, Fluoreszenz- Lebensdauer-Analyse und Fluoreszenz-Polarisationsanalyse. Ganz besonders bevorzugt werden die Messungen unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops oder anderen konfokalen Optiken durchgeführt.
Die Auswertung der Daten erfolgt schließlich vorzugsweise durch Autokorrelationsanalyse und /oder Kreuzkorrelationsanalyse.
Bei der 2-D-FIDA und Kreuz-Korrelationsanalyse wird ein Messvolumen einer Probe mit zwei Wellenlängen simultan bestrahlt und die Information über eine zeitliche Koinzidenzanalyse von zwei Farbstoffspezies, wie die erfindungsgemäßen Oxazinderivate in Kombination mit grün anregbaren Fluoreszenzfarbstoffen, erhalten. Ähnlich ist der Einsatz in Fluoreszenz-Resonanz-Energie- Transfer-Experimenten (FRET) von großem Nutzen, wobei die erfindungsgemäßen Oxazinderivate mit einer Reihe von bekannten Xanthenen als Paar für den Energie-Transfer verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate können ebenfalls sehr gut in FISH- (Fluorescence-in-situ-hybridization) oder PCR- Verfahren (Polymerase-chain reaction) verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Oxazinfarbstoffe sind synthetisch einfach zugänglich, was sie von den wesentlich schwerer herstellbaren Verbindungen des Standes der Technik unterscheidet. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe, insbesondere die Derivate II, III, IV oder V, weisen alle eine sehr kompakte molekulare Struktur auf, so dass die Wechselwirkung mit dem zu untersuchenden Material als äußerst gering einzuschätzen ist. Insbesondere werden die biologischen Eigenschaften von biologischem Material nicht verändert. Die in der Regel neutrale Gesamtladung minimiert die elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Farbstoff und der markierten Komponente. Die erfindungsgemäßen Fluoreszenzfarbstoffe weisen eine hohe Reaktivität gegenüber den zu untersuchenden Materialien, insbesondere Ami- nen, eine hohe Fluoreszenzquantenausbeute, eine hohe Lösungsmittelbeständigkeit und pH-Beständigkeit, eine hohe chemische Stabilität und eine NIR-Anregbarkeit auf. Die Farbstoffe der vorliegenden Erfindung sind durch eine geringe Anregungsenergie und somit einer geringen Photozerstörung gekennzeichnet. Die besonderen Anregungs- und Emissionswellenlängen der erfindungsgemäßen Farbstoffe ermöglichen die Verwendung von kommerziell erhältlichen Filtersystemen. Vorteilhaft ist weiterhin die geringe Hintergrundfluoreszenz (Autofluoreszenz) von chemischen und biologischen Materialien bei roter Anregung gegenüber energiereicheren Anregungwellenlängen. Die erfindungsgemäßen Farbstoffe sind somit sehr gut im roten Spetralbereich einsetzbar. Die hohe chemische Stabilität ist insbesondere unter Bedingungen der Festphasensynthese von Bedeutung. Die er- fingungsgemäßen Farbstoffe zeigen eine geringe Adsorptionsoder unspezifische Bindungstendenz und sind sehr gut wasserlöslich. Sie sind somit ideal für chemische und biotechnische Untersuchungen in wässrigen Lösungen, DMSO, DMF oder Alkoholen verwendbar.
Die erfindungsgemäßen Oxazinderivate sind beispielsweise auf folgendem Wege darstellbar:
Ein 3-Aminophenol der Formel VI
Figure imgf000020_0001
(VI) wird mit einer Nitrosophenylverbindung der Formel VII
Figure imgf000020_0002
im sauren Medium bei mittlerer Hitze während eines Zeitraumes von 10 Minuten bis 5 Stunden umgesetzt. Die Reste Ri bis R10 haben die bereits oben angegebenen Bedeutungen.
Es hat sich herausgestellt, dass die Reaktion bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 70°C, vorzugsweise 55 bis 65°C, durchgeführt wird. Dazu wird die 3-Amino-Phenol-Verbindung in bspw. Eisessig gelöst, wonach innerhalb eines Zeitraumes im Bereich von 10 Minuten bis 5 Stunden die Nitrosoverbindung hinzugegeben wird. Nach Entstehen einer tiefblauen Lösung wird die Reaktion in der Regel beendet sein. Anschließend wird gereinigt, normalerweise über eine Säulenchromatographie.
Des Weiteren sind noch folgende Synthesemöglichkeiten eingeschlossen, in denen die Ausgangsverbindungen die nachfolgend gezeigten Strukturen aufweisen:
Figure imgf000021_0001
(a)
Figure imgf000021_0002
(b)
Figure imgf000022_0001
( c )
Die nachfolgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
Beispiele
Beispiel 1
Figure imgf000022_0002
0,1 mol 3-Diethylaminophenol wurde in 20 ml Eisessig gelöst und auf 60 °C erwärmt. Zu der Lösung wurde innerhalb von 30 Minuten 0,1 mol 3- (N-Methyl-N- (4-nitrosophenyl) -amino) - propionsäure in 10 ml Eisessig zugegeben. Die nun intensiv blaue Lösung wurde wurde 2 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Nach Abdestillation des Eisessigs wurde der Rückstand säulenchroma- tographisch gereinigt (Eluent: Ethanol/H20: 5/1; Träger: Si02) . Das bronzefarbene Produkt (2-Carboxy-ethyl) - methylamino) -diethylaminophenoxazin-5-ylium wurde in Wasser gelöst und mittels Natriumtetraphenylborat ausgefällt.
Beispiel 2
Figure imgf000023_0001
0,1 mol N- (3-Hydroxyphenyl) -N-methylamino-propionsäuremethyl- ester wurde in 50 ml Eisessig gelöst und auf 60 °C erwärmt. Zu dieser Lösung wurde innerhalb einer Stunde 0,1 mol 3-(N-ethyl- N- (4-nitroso-3-hydroxyphenyl) -amino) propan-sulfonsäure portionsweise zugegeben. Nach kurzer Zeit entstand eine tiefblaue Lösung. Nach dreistündiger Reaktionszeit wurde die Lösung eingeengt und säulenchromatgraphisch (Eluent: Ethanol; Träger: Si02) gereinigt. Das so erhaltene Produkt wurde in 1 N NaOH- Lösung aufgenommen und in der Siedehitze mehrere Stunden behandelt. Anschließend wurde die Lösung zur Trockne eingedampft und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Eluent: Etha- nol/H20: 10/1; Träger: Si02) separiert. Nach Umkristallisation aus Methanol wurden bronzefarbene Kristalle von [(2-Carboxy- ethyl) -methyl-amino]-[ethyl- (3-sulfo-propyl) -amino]-phenoxazin- 5-ylium erhalten. Beispiel 3
Figure imgf000024_0001
0,1 mol 3- (7-Sulfo-naphthylamino) -propionsäure und 0,1 mol 5- (Diethylamino) -2-nitroso-phenol wurden zusammen in 20 ml Eisessig 30 Minuten zum Rückfluss erhitzt. Beim Abkühlen der Reaktionslösung schieden sich grüne Kristalle von (2-Carboxy- ethylamino) -diethylamino-sulfobenzo[α]phenoxazin-7-ylium ab. Das Lösungsmittel wurde abgezogen und das Rohprodukt säulen- chromatographisch (Eluent: Ethanol/Wasser: 20/1; Träger: Si02) aufgereinigt. Umkristallisation erfolgte aus Eisessig.
Beispiel 4
Figure imgf000025_0001
0,1 mol N- (4-Nitrosonaphtyl) -aminopropansulfonsäure und 0,1 mol N- (3-Hydroxyphenyl) -N-methylaminopropionsäuremethylester wurden zusammen in 20 ml Eisessig 30 Minuten zum "Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen der Reaktionslösung wurde die Lösung zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus Aceton umkristallisiert. Das erhaltene Produkt wurde in einem Gemisch aus 10 ml Wasser und 10 ml Aceton gelöst, mit 1 ml 1 N HCl-Lösung versetzt und 8 Stunden zum Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde das Lösungsmittelgemisch abgezogen und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Eluent: Ethanol/H0: 10/1; Träger Si02) separiert. Nach Umkristallisation aus Methanol wurden bronzefarbene Kristalle des (2-Carboxy-ethylamino) -ethyl- (3- sulfo-propyl) -amino-benzo[α]phenoxazin-7-ylium erhalten. Ausbeute: 10 % Beispiel 5
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000026_0002
2 μmol [ (2-Carboxy-ethyl) -methyl-amino]-[ethyl- (3-sulfo- propyl) -amino]-phenoxazin-5-ylium werden in 200 μl N,N- Dimethylformamid gelöst und eine Lösung von 10 μmol N- Hydroxysuccinimid in 100 μl N,N-Dimethylformamid sowie 2,4 μmol Diisopropylcarbodiimid zugegeben. Diese Lösung wird 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann zur Trockne eingeengt. Der Umsatz zu [ (2-Carboxy-ethyl) -methyl-amino]- [ethyl- (3-sulfo-propyl) -amino]-phenoxazin-5-ylium- succinimidylester ist > 90 %, daher ist eine weitere Aufreinigung nicht notwendig. Beispiel 6
N-Succinimidylester aus Bsp. 5
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000027_0002
1 μmol 5-Carboxyamidotryptamin (5-CT) wird in 50 μl N,N- Dimethylformamid gelöst und einer Lösung von 1,5 μmol [(2- Carboxy-ethyl) -methyl-amino]-[ethyl- (3-sulfo-propyl) -amino]- phenoxazin-5-ylium-succinimidylester in 200 μl N,N- Dimethylformamid zugegeben. Dieser Lösung werden 250 μl 0,15 M Borat-Puffer pH 8,6 zugesetzt und die Reaktionslösung 3 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt. Danach wird die Lösung zur Trockne eingeengt und das Rohprodukt säulenchromatographisch (Eluent: Methanol / Wasser Gradient: 0 % Methanol bis 100 % Methanol in 30 Minuten; Träger: Reversed Phase C18) aufgereinigt.
Figure imgf000028_0001
10 nmol Bovine IgG werden in 150 μl Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit 15 μl 1 M Natriumcarbonatlösung pH 9,3 und 331,4 μl 0,1 M Natriumcarbonatlösung pH 9,3 sowie einer Lösung von
50 nmol [ (2-Carboxy-ethyl) -methyl-amino]-[ethyl- (3-sulfo- propyl) -amino]-phenoxazin-5-ylium-succinimidylester in 3,6 μl N,N-Dimethylformamid versetzt und die Reaktionslösung 1 Stunde bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wird die Reaktion durch Zugabe von 50 μl 1,5 M Hydroxylaminlösung abgestoppt. Das Rohprodukt wird durch Ausschlusschromatographie (Eluent: PBS pH 7,4) aufgereinigt. Beispiel 8
Einführung eines Linkers in Oxazinderivat (III)
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000029_0002
1. 2,0 eq Boc-cadaverin
1,0 eq Oxazinderivat (III)
2,0 eq PyBOP
5,0 eq DIPEA
2. 20% TFA in DCM
2 μmol [ (2-Carboxy-ethyl) -methyl-amino]-[ethyl- (3-sulfo- propyl) -amino]-phenoxazin-5-ylium (Oxazinderivat III) werden in 200 μl N, -Dimethylformamid gelöst und eine Lösung von 4μmol mono-t-Butoxycarbonyl-1, 5-diaminopentan (Boc-cadaverin) in 50 μl N, -Dimethylformamid, eine Lösung von 4 μmol Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium Hexafluorophosphat (PyBOP) in 50 μl N,N-Dimethylformamid sowie 10 μmol N-Ethyl-diisopropyl-amin (DIPEA) zugegeben. Diese Lösung wird 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 300 μl einer Lösung von 20 % Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Lösung wird zur Trockne eingeengt und das Rohprodukt säulench- romatographisch über HPLC aufgereinigt .
Beispiel 9
Einführung eines Linkers in Oxazinderivat (III)
Figure imgf000030_0001
Figure imgf000030_0002
1. 2,0 eq Boc-CHA
1,0 eq Oxazinderivat (III)
1,0 eq PyBOP
4,0 eq DIPEA
2. 20% TFA in DCM
2 μmol [ (2-Carboxy-ethyl) -methyl-amino]-[ethyl- (3-sulfo- propyl) -amino]-phenoxazin-5-ylium (Oxazinderivat III) werden in 200 μl N, N-Dimethylformamid gelöst und eine Lösung von 4 μmol mono-t-Butoxycarbonyl-trans-1, 4-diaminocyclohexan (Boc-CHA) in 50 μl N, N-Dimethylformamid, eine Lösung von 2 μmol Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphonium Hexafluorophosphat (PyBOP) in 50 μl N, N-Dimethylformamid sowie 8 μmol N-Ethyl-diisopropyl-amin (DIPEA) zugegeben. Diese Lösung wird 16 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird mit 300 μl einer Lösung von 20 % Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (DCM) versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Lösung wird zur Trockne eingeengt und das Rohprodukt säulench- romatographisch über HPLC aufgereinigt .
Beispiel 10
Affinitätsmarkierung
1 'mmol N-ε- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) -aminohexansäure wurden in 1200 μl Dichlormethan und 300 μl N, N-Dimethylformamid (DMF) gelöst und auf 0°C abgekühlt. 500 μmol N,N' -Diisopropylcarbodiimid wurden in 80 μl N, N-Dimethylformamid gelöst und zur Lösung der Aminosäure hinzugegeben. Die Reaktionslösung wurde 30 Minuten bei 0°C stehengelassen und anschließend das Dichlormethan im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit 1000 μl N, -Dimethylformamid aufgenommen, wobei eine klare Lösung erhalten wurde. Diese Lösung wurde zu 100 μmol Wang Harz (Wang Resin) in einer 5 ml Spritze mit Fritte gegeben. Zu der Suspension wurden 10 μmol Dimethyla inopyridin in 25 μl N, N-Dimethylformamid gegeben, die Mischung wurde über Nacht stehengelassen.
Das Harz wurde anschließend sechsmal mit 2 ml N,N-Dimethyl- formamid und dreimal mit 2 ml Dichlormethan und sechsmal mit 2 ml t-Butylmethylether gewaschen, getrocknet und zur Bestimmung der Beladung ausgewogen. Die bestimmte Beladung des Harzes betrug 0.8 mmol/g Harz. Zur weiteren Beladung wurde zunächst die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppe (FMOC) mittels zweimaliger Behandlung für 5 bzw. 15 Minuten mit einer Lösung von 20 % Piperidin in N, -Dimethylformamid abgespalten. Das Harz wurde danach sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid gewaschen.
1 mmol N-α- (9-Fluorenylmethoxycarbonyl) -ε- (4-methyltrityl) -L- lysin, gelöst in 120 μl N, N-Dimethylformamid sowie 1 mmol
1- [Bis (dimethylamino) methyliumyl] -1H-1, 2, 3-triazolo [4,5- j]pyridin-3-oxid hexafluorophosphat gelöst in 120 μl N,N-Dimethylformamid wurden zusammen mit 2 mmol N,N-Diisopropylethylamin zum Harz gegeben. Die Reaktionslösung wurde nach 30 Minuten abgezogen und der Vorgang der Beladung unter identischen Bedingungen nochmals wiederholt. Nach sechsmaligem Waschen des Harzes mit je 2 ml N, N-Dimethylformamid wurde die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl Schutzgruppe mittels zweimaliger Behandlung für 5 bzw. 15 Minuten mit einer Lösung von 20 % Piperidin in N, N-Dimethylformamid abgespalten. Das Harz wurde danach wiederum sechsmal mit 2 ml
N,N-Dimethylformamid gewaschen. Anschließend erfolgte die Umsetzung mit 250 μmol Biotinoylaminohexanoyl-N-hydroxy- succinimidylester in 300 μl N, N-Dimethylformamid. Nach 10 stündiger Reaktion wurde die Reaktionslösung abgesaugt und das Harz sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid und dreimal mit 2 ml Dichlormethan und sechsmal mit 2 ml t-Butylmethylether gewaschen und getrocknet.
Zur Beladung mit dem Fluoreszenzfarbstoff (dye) wurden 10 μmol des Harzes abgenommen und in eine 5 ml Spritze überführt. Nachdem das Harz in 2 ml Dichlormethan vorgequollen wurde, erfolgte die Abspaltung der 4-Methyltrityl-Schutzgruppe (MTT) mittels fünfmaliger jeweils dreiminütiger Behandlung mit je 2 ml 30 % Hexafluorisopropanol (HFIP) in Dichlormethan. Danach wurde das Harz sechsmal mit 2 ml Dichlormethan und dreimal mit
2 ml N,N-Dimethylformamid gewaschen. Anschließend erfolgte die Umsetzung mit 25 μmol [ (2-Carboxy-ethyl) -methyl-amino] -ethyl-
(3-sulfo-propyl) -amino] -phenoxin-5-ylium-succinimidylester in 300 μl N, N-Dimethylformamid für drei Stunden bei Raumtemperatur. Nach erfolgter Reaktion wurde das Harz sechsmal mit 2 ml N, N-Dimethylformamid, sechsmal mit 2 ml Dichlormethan, sechs- mal mit 2 ml Methanol und sechsmal mit 2 ml t-Butylmethylether gewaschen und getrocknet. Das Produkt wurde nunmehr mittels einer Mischung von 95 % Trifluoressigsäure (TFA), 2,5 % Wasser und 2,5 % Triispropylsilan (TIS) vom Harz abgespalten. Nach zweistündiger Reaktionszeit wurde die Lösung vom Harz abfiltriert und im Vakuum eingeengt. Das als Rückstand verbleibende Rohprodukt wurde anschließend in Methanol aufgenommen und chromatographisch aufgereinigt .
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000033_0002
i) 30 % HFIP in DCM ii) 5 eq dye, NHS
Figure imgf000034_0001
Figure imgf000034_0002

Claims

Patentansprüche
Oxazinderivat der allgemeinen Formel ( I]
Figure imgf000035_0001
(I)
worin:
(e) die Reste Ri, R2, R3, R , R5, Re, Rt , Re r R9 und Rio voneinander unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Al- kenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sulfonyl, Sulfonylha- logenid, Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Azid, Dithionicotin- Derivat oder Amin bedeuten und gegebenenfalls substituiert sind,
(f) Ri mit R2 und/oder Rg mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C3- oder C4-Brücke bilden kann/können, die gegebenenfalls substituiert ist/sind;
(g) die Substituenten unabhängig voneinander Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Alkenoxy, Aryl, Aryldiazo, Alkylaryl, Arylalkoxyl, Alkoxy, Alkoxycarbonyl, Hydroxy, Halogen, Cyan, Carbonyl, Acyl, Acyloxy, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sulfo¬ nyl, Sulfonylhalogenid, Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Azid, Dithionicotin-Derivat oder Amin bedeuten können; und (h) mindestens einer der Reste Rl r R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, Rg oder Rio mindestens eine reaktive Gruppe für die Bindung an ein zu untersuchendes Material umfasst, oder mindestens eine reaktive Gruppe zusätzlich besitzt, oder ein Salz davon.
2. Oxazinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Ri mit R2 und/oder R9 mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C4-Brücke bildet.
3. Oxazinderivat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Ri mit R2 oder Rg mit Rio eine gesättigte oder ungesättigte C4-Brücke bildet.
4. Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, dass R3, R4, R7 oder R8 eine reaktive Gruppe umfasst oder besitzt.
5. Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe ein Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sulfonylhalogenid, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Amin, Azid, Aryldiazo, Aldehyd, Keton oder Dithionicotin-Derivat ist.
6. Oxazinderivat nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe ein Säureester, Säureanhydrid, Säurehalogenid, Imid, Imidylester, Carboxyl, Carbonamid, Halogencarbonamid, Sulfonylhalogenid, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Amin, Azid, Aryldiazo oder Dithionicotin-Derivat ist.
7. Oxazinderivat nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe ein N-Succinimidylester, der ggf. substituiert ist, Malei id, Carboxyl, Halogenacetamid, Isothiocyanat, Phosphoramidit, Aryldiazo, Azid, Sulfonylchlorid, Sulfo-Tetrafluorphenolester oder primäres bzw. sekundäres Amin ist .
8. Oxazinderivat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der N-Succinimidylester mit einer Sulfonsäuregruppe substituiert ist.
9. Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen reaktiver Gruppe und einem nicht-brückebildenden Rest Ri, R2, R3, R , R5, Rε, R , Rβ , Rg oder Rio eine Linkerverbindung geschaltet ist.
10. Oxazinderivat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Linkerverbindungen um Polyoxyalkyleinhei- ten, aliphatische, cykloaliphatische oder aromatische Einheiten handelt, die gegebenenfalls substituiert sein können.
11. Oxazinderivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz davon ein Gegenion enthält, das aus einem Halo- genidion, einem BF4 ~-Ion oder Tetraphenylborat gewählt ist.
12. Oxazinderivat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Gegenion ein Chlorid- oder Bromidion oder Tetraphenylborat ist.
13. Oxazinderivat nach Anspruch 1, mit der Formel (II)
Figure imgf000037_0001
worin X OH, Phosphoramidit oder eine N-Succinimidylester- gruppe, die ggf. substituiert ist, bedeutet oder ein Salz davon.
14. Oxazinderivat nach Anspruch 1, mit der Formel (III)
Figure imgf000038_0001
worin X OH, Phosphoramidit oder eine N-Succinimidylester- gruppe, die ggf. substituiert ist, bedeutet oder ein Salz davon.
15. Oxazinderivat nach Anspruch 1, mit der Formel (IV)
Figure imgf000038_0002
worin X OH, Phosphoramidit oder eine N-Succinimidylester- gruppe, die ggf. substituiert ist, bedeutet oder ein Salz davon.
16. Oxazinderivat nach Anspruch 1, mit der Formel (V)
Figure imgf000039_0001
worin X OH, Phosphoramidit oder eine N-Succinimidylester- gruppe, die ggf. substituiert ist, bedeutet oder ein Salz davon.
17. Oxazinderivat nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Salz davon ein Gegenion enthält, das aus einem Halogenidion, einem BF4 ~-Ion oder Tetraphenylborat gewählt ist.
18. Oxazinderivat nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass das Gegenion ein Chlorid- oder Bromidion oder Tetraphenylborat ist.
19. Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate mindestens einen Affinitätsmarker aufweisen.
20. Oxazinderivat nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Derivate nur einen Affinitätsmarker aufweisen.
21. Oxazinderivat nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Affinitätsmarkern um Biotin, Hexa-His oder Haptene handelt.
22. Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
21, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktive Gruppe an ein zu untersuchendes Material gebunden ist.
23. Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis
22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem zu untersuchenden Material um i) ein biologisches Material, ii) eine chemische Verbindung, insbesondere eine biologisch aktive Substanz und/oder einen pharmazeutischen Wirkstoff, iii) einen synthetischen oder biologischen Mikropartikel oder iv) eine Kombination davon handelt.
24. Oxazinderivat nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den synthetischen Mikropartikeln um lösliche oder suspendierbare Trägermaterialien handelt.
25. Oxazinderivat nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den biologischen Mikropartikeln um vesikuläre oder virus-ähnliche Partikel handelt.
26. Oxazinderivat nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das biologische Material Nukleotide, Oligonukleotide, Zucker, Lipide, Membranen, Zellen, Zellbestandteile, DNA, RNA, Peptide, Proteine, Antikörper, Haptene oder Antigene umfasst.
27. Kit zur Markierung eines zu untersuchenden Materials, umfassend ein Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 26.
28. Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Oxazinderivat nach mindestens einem der Ansprüche 13 bis 18 umfasst.
29. Verwendung eines Kits nach Anspruch 27 oder 28 oder eines Oxazinderivates nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 26 in chemischen oder biotechnischen Anwendungen.
30. Verwendung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das Kit oder das Oxazinderivat i) zur Identifizierung und Charakterisierung von biologischem Material oder chemischen Verbindungen, ii) zur Suche nach biologisch aktiven Substanzen und/oder pharmazeutischen Wirkstoffen, iii) zur Identifizierung von Analyten in diagnostischen und/oder therapeutischen Verfahren, iv) zur Genomanalyse oder v) zur Reinigung und Konzentrierung von Substraten verwendet wird.
31. Verfahren zur Herstellung der Oxazinderivate nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 26, bei dem man eine Verbindung der Formel VI
Figure imgf000041_0001
im sauren Medium bei mittlerer Hitze während eines Zeitraumes von 10 Minuten bis 5 Stunden mit einer Verbindung der Formel VII
Figure imgf000042_0001
worin Ri bis Rio die in Anspruch 1 angegebenen Bedeutungen haben, umsetzt.
32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsverbindungen folgende Aminoverbindungen und Nitrosoverbindungen verwendet :
Figure imgf000042_0002
Figure imgf000042_0003
Figure imgf000043_0001
33. Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, dadurch gekennzeichnet, dass das Oxazinderivat durch Umsetzung mit N- Succinimid in Gegenwart von N, N-Dimethylformamid und Diisopropylcarbodiimid aktiviert wird.
34. Verfahren zur gezielten Markierung von zu untersuchendem Material, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Bereitstellung einer Probe umfassend ein zu untersuchendes Material; b) Umsetzung des zu untersuchenden Materials mit einem einen Affinitätsmarker enthaltenden Oxazinderivat gemäß mindestens einem der Ansprüche 19 bis 21, unter Bildung von markiertem zu untersuchendem Material, das als Mischung kein, ein oder mehrere Oxazinderivate als Markierung aufweist; c) Auftrennung des zu untersuchenden Materials in nicht, einfach oder mehrfach markierte Fraktionen durch Affinitätschromatographie .
35. Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, dass als Affinitätsmarker Biotin, Hexa-His oder Haptene verwendet werden.
36. Verfahren nach Anspruch 34 oder 35, dadurch gekennzeichnet, dass für die anschließende Untersuchung des Materials die Fraktion verwendet wird, die einfach markiert ist.
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