WO2002016628A1 - Síntesis enzimática del antioxidante hidroxitirosol - Google Patents

Síntesis enzimática del antioxidante hidroxitirosol Download PDF

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WO2002016628A1
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tyrosol
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vitamin
antioxidant
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Juan Carlos Espin De Gea
Francisco Abraham De Tomas Barberan
María Cristina GARCIA VIGUERA
Federico Ferreres De Arce
Cristina Soler Rivas
Harry J. Wichers
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Consejo Superior De Investigaciones Cientificas
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    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • hydroxytyrosol stands out, which has been the subject of studies that have highlighted its many beneficial properties for health (Visioli and Galli, 1995, 1998; Nisioli et al., 1999; Arouma et al., 1998).
  • the overall effect granted by this compound coincides with the abundant consumption of olive oil, that is, protection against cardiovascular diseases and certain types of cancer.
  • the lower incidence of these pathologies is characteristic in regions with traditional Mediterranean diet, associated with the consumption of this oil.
  • the good bioavailability of hydroxytyrosol has been established, justifying that its inclusion in the diet contributes decisively to the beneficial effect mentioned above (Manna et al., 2000; Nisioli et al., 2000).
  • Hydroxytyrosol is not commercially available. No commercial house currently supplies it. Therefore, researchers have to chemically synthesize it, or extract it from olive oil itself or wastewater in the process of making this oil. There are several chemical synthesis protocols (Schópf et al., 1949; Baraldi et al., 1983; Bianco et al., 1988; Nerhe et al., '1992; Garc ⁇ a et al., 1996; Capasso et al., 1999). Obviously, the most recent are the most optimized methods, and are detailed below.
  • the protocol of Garc ⁇ a et al., (1996) consists in obtaining hydroxytyrosol by alkaline hydrolysis of oleuropein (an ester that contains hydroxytyrosol, and is found in olive oil and in a smaller quantity, in oil).
  • oleuropein an ester that contains hydroxytyrosol, and is found in olive oil and in a smaller quantity, in oil.
  • This method uses 6M sodium hydroxide, diethyl ether, 37% hydrochloric acid and activated carbon.
  • This process has several disadvantages: • Oleuropein is difficult to find commercially (it is not supplied by large commercial houses: Sigma, Aldrich, Fluka, Merck, Across, etc.). It is a relatively expensive reagent.
  • the protocol of Capasso et al. (1999) contemplates the use of 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid as a precursor. From this, with the use of lithium aluminum hydride in the tetrahydrofuran solvent, hydroxytyrosol is synthesized. Other reagents used are the solvent ethyl acetate, hydrochloric acid, sodium bicarbonate and sodium sulfate. The overall yield is usually 80%. However, it has serious drawbacks: • The precursor, 3,4-dihydroxyphenyl acetic acid, is priced at 4530 sts. per gram (Sigma-Aldrich). As will be seen later, this makes the process more expensive compared to the alternative method proposed herein.
  • This protocol also contemplates the use of toxic reagents and / or contaminates, some described in the previous protocol. Tetrahydroturane and ethyl acetate solvents are toxic, extremely flammable and irritating to the respiratory tract. In addition, they are pollutants of the environment.
  • Capasso et al. (1999) extract hydroxytyrosol from wastewater from the manufacture of olive oil.
  • the global protocol comprises 4 steps with extraction in ethyl acetate, sodium sulfate, two low pressure chromatographic steps with acetone / petroleum ether phases and finally another step using thin layer chromatography.
  • Patent search esp @ cenet (Spanish Patent and Trademark Office; worldwide search); www. European-patent-ofiice.org (European Patent Office); www.uspto.gov (United States Patent Office); patent.womplex.ibm.com (IBM Office on patents registered in the U.S.).
  • HPLC high resolution chromatography
  • the method proposed here synthesizes the antioxidant hydroxytyrosol from its commercial tyrosol precursor (1944 pts per gram, Aldrich), using the enzyme tyrosinase (commercial mushroom enzyme), in the presence of a reducer such as vitamin C (ascorbic acid) .
  • tyrosinase commercial mushroom enzyme
  • a reducer such as vitamin C (ascorbic acid)
  • reaction medium runs at neutral pH, at room temperature and in aqueous medium.
  • the yield can be 100%, it consists of one or more steps depending on the subsequent application of the product.
  • the protocol is modulble, being able to form the amount of antioxidant required, at any given time, from the same initial conditions.
  • the application itself of the protocol is like a "recipe", easy to use and does not require a special qualification for its implementation.
  • the enzyme is reusable (enzymes in their catalytic mechanism are not consumed). The speed of the reaction is linearly dependent on the amount of enzyme used. The reaction is not inhibited by high concentration of initial precursor (thiol) or formed product (hydroxytyrosol).
  • the antioxidant can be used alone (isolated with the use of preparative HPLC or TLC techniques) or directly, in combination with vitamin C (enhanced antioxidant action).
  • the process is capable of being applied continuously in a bio-reactor (already used by many industries), although its use is not essential.
  • the enzymatic synthesis process of the antioxidant hydroxytyrosol is based on the o-hydroxylase activity of the enzyme tyrosinase (also called polyphenol oxidase or PPO) (Esp ⁇ n et al., 2000b).
  • tyrosinase also called polyphenol oxidase or PPO
  • PPO polyphenol oxidase
  • This enzyme very abundant in Nature and found throughout the phylogenetic tree (bacteria, arthropods, birds, mammals, etc.) is commercially available (mushroom tyrosinase from Sigma, Fluka ).
  • PPO can catalyze the incorporation of a hydroxyl group (OH) in the "ortho" position to the monophenol thiol (attached scheme).
  • the sunflower lacks antioxidant activity.
  • vitamin C is added in re-.ction, which is capable of reducing o-quinone, instantly regenerating the hydroxytyrosol in the medium.
  • re-.ction which is capable of reducing o-quinone, instantly regenerating the hydroxytyrosol in the medium.
  • the enzymatic reaction takes place in a phosphate buffered medium (allowed as a food additive, code E-450) in aqueous medium, at neutral pH, and at room temperature.
  • the reaction medium is therefore composed of: tirasol, as a precursor; Mushroom tyrosinase (commercial) to catalyze the process and excess vitamin C. After an initial stirring, the reaction begins.
  • the reaction stops. To continue just add more sunflower (always taking care that the vitamin C / tyrosol ratio is greater than 1).
  • the enzyme is not "consumed” in the process as there is no inhibition due to excess substrate or product formation.
  • the speed of the reaction depends linearly on the concentration of enzyme used.
  • the reaction volume (to choose, 1 liter, 10, 100 liters 7) is filtered by a membrane with a pore diameter less than 5000 daltons, or it is dialyzed, also with a membrane with a pore diameter less than 5000 daltons.
  • the filtered volume will contain the low molecular weight components present in the medium (hydroxytyrosol, phosphate and vitamin C with or without sunflower, as we have used up).
  • the enzyme of molecular weight more than double the pore size, is retained in the filter, and can be reused again.
  • Hydroxytyrosol formation can also be carried out with this same methodology but using wastewater from olive oil manufacturing.
  • the antioxidant capacity of the global extract will be enriched with the net formation of o-diphenols from the monophenols present, one of which will be hydroxytyrosol (its monophenol, tirasol, is very abundant in these water).
  • Vitamin C (ascorbic acid)
  • the volume is filtered or dialyzed, and the enzyme can be reused for a new process (lowering it).
  • the filtered volume can be analyzed by HPLC to corroborate the hydroxytyrosol formed. This volume is lyophilized to obtain its corresponding powder that we keep in freezing.
  • the hydroxytyrosol can, by preparative HPLC or TLC, be purified, to selectively use it as an additive or to be commercially distributed.
  • HPLC HPLC process with a reverse phase column
  • methanol water
  • ascorbic acid exits at the front and hydroxytyrosol at approximately 7 minutes.
  • the collected volume is bubbled with nitrogen, lyophilized and frozen.
  • preparative TLC ascorbic acid remains at the point of application and hydroxytyrosol moves, clearly separating.
  • Hydroxytyrosol alone or in combination with vitamin C, can be used as a food additive in the production of juices (tomato, mainly), gazpachos and other cold soups, baby foods, prepared foods containing oil, etc. It can be used to stabilize other oils (sunflower, soy, etc.), margarines, butter. In these processes the effect is multiple:
  • the organoleptic characteristics (aroma, flavor) of food can be modulated. This additive will give the food a taste of olive oil, or it will boost it if the food already contains this oil.
  • the obvious advantage would be to have a product currently in high demand by many researchers around the world who are forced to synthesize and / or extract it themselves.

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Abstract

La reacción transcurre en un medio tamponado con fosfato en medio acuoso, a pH neutro, y a temperatura ambiente. El medio de reacción, se compone por tanto de: tirosol, como precursor; tirosinasa de champiñón (comercial) para catalizar el proceso y vitamina C en exceso. Tras una agitación inicial, la reacción comienza. Cuando la concentración de tirosol inicial se agote la reacción se para. Para que continúe basta con añadir más tirosol (siempre cuidando que la relación vitamina C/ tirosol sea mayor que 1). Cuando se obtenga la concentración de hidroxitirosol deseada, se filtra. La enzima, de peso molecular más del doble del tamaño de poro, queda retenida en el filtro, y puede ser de nuevo reutilizada. Este primer extracto muy enriquecido en antioxidante hidroxitirosol, con una alta capacidad antioxidante, (en este caso, en combinación con vitamina C), ya es susceptible de utilizarse como aditivo alimentario.

Description

1. TÍTULO.
Síntesis enzimática del antioxidante hidroxitirosol
2. SECTOR DE LA TÉCNICA. Sector: Tecnología de Alimentos. Químico-Farmacéutico.
Aplicación: Industria alimentaria (Adición de antioxidantes naturales en la elaboración de zumos, sopas, alimentos infantiles, etc.). Industrias químicas y farmacéuticas. Método de obtención de un compuesto no disponible comercialmente.
3. ESTADO DE LA TÉCNICA.
Existen evidencias sobre los beneficios que reporta la inclusión de aceite de oliva virgen en nuestra dieta. El efecto beneficioso repercute en una protección frente a las enfermedades cardiovasculares y ciertos tipos de cáncer (Assmann et al., 1997). Los responsables de este efecto son un adecuado perfil de ácidos grasos y unos compuestos minoritarios, en particular, los compuestos fenólicos. Estas sustancias inhiben la producción de radicales libres debido a sus propiedades antioxidantes, confiriendo al aceite estabilidad frente a la oxidación de lípidos. De ahí, que el aceite de oliva virgen presente una resistencia extraordinaria al enranciamíento así como una alta capacidad antiradical (Espín et al., 2000a). Entre estos compuestos fenólicos destaca el hidroxitirosol, el cual ha sido objeto de estudios donde se han destacado sus numerosas propiedades beneficiosas para la salud (Visioli y Galli, 1995, 1998; Nisioli et al., 1999; Arouma et al., 1998). El efecto global que otorga este compuesto coincide con el consumo abundante de aceite de oliva, es decir, la protección frente a las enfermedades cardiovasculares y cierto tipos de cáncer. La menor incidencia de estas patologías es característica en regiones con dieta Mediterránea tradicional, asociada al consumo de este aceite. Muy recientemente se ha establecido la buena biodisponibilidad del hidroxitirosol, justificando que su inclusión en la dieta contribuye decisivamente al efecto beneficioso antes comentado (Manna et al., 2000; Nisioli et al., 2000).
El hidroxitirosol no se encuentra comercialmente disponible. Ninguna casa comercial lo suministra actualmente. Por tanto, los investigadores tienen que sintetizarlo químicamente o bien, extraerlo a partir del propio aceite de oliva o de las aguas de desecho en el proceso de elaboración de este aceite. Existen varios protocolos de síntesis química (Schópf et al., 1949; Baraldi et al., 1983; Bianco et al, 1988; Nerhe et al.,' 1992; García et al., 1996; Capasso et al., 1999). Evidentemente, los más recientes son los métpdos más optimizados, y se detallan a continuación. El protocolo de García et al., (1996) consiste en la obtención del hidroxitirosol por hidrólisis alcalina de la oleuropeina (un éster que contiene hidroxitirosol, y que se encuentra en la oliva y en menor cantidad, en el aceite). Este método utiliza hidróxido sódico 6 M, dietil éter, ácido clorhídrico al 37% y carbón activo. Este proceso tiene varias desventajas: • La oleuropeina es difícil de encontrar comercialmente (no es suministrada por las grandes casas comerciales: Sigma, Aldrich, Fluka, Merck, Across, etc.). Es un reactivo relativamente caro.
• Reproducido en el laboratorio, el rendimiento del proceso es variable (a veces se consiguen rendimientos del 80%, y otras veces, la cantidad de hidroxitirosol es despreciable). Por tanto, la reproducibilidad es muy limitada.
• El protocolo abarca casi 1 día de trabajo (preparación de reactivos, burbujeo en nitrógeno de 5 horas, aplicación de los distintos pasos y control final del proceso). El hidroxitirosol, cuando se obtiene, queda finalmente en una disolución de ácido clorhídrico 0.1 M.
• Además, contempla el uso de reactivos altamente tóxicos-infíamables- irritantes (hidróxído sódico, ácido clorhídirco, dietil éter), lo cual implica un extremo cuidado en la elaboración y el riesgo de presencia de trazas de estos compuestos en el hidroxitirosol final así sintetizado.
El protocolo de Capasso et al. (1999) contempla el uso del ácido 3,4- dihidroxifenil acético como precursor. A partir de éste, con el uso de hidruro de litio y aluminio en el disolvente tetrahidrofurano, se sintetiza el hidroxitirosol. Otros reactivos empleados son el disolvente acetato de etilo, ácido clorhídrico, bicarbonato sódico y sulfato sódico. El rendimiento global suele ser del 80%. Sin embargo, presenta serios inconvenientes: • El precursor, ácido 3,4-dihidroxifenil acético, tiene un precio de 4530 pts. por gramo (Sigma-Aldrich). Como se verá más adelante, esto encarece el proceso comparado con el método alternativo propuesto en esta memoria.
• Este protocolo también contempla el uso de reactivos tóxicos y/o contaminates, algunos descritos en el protocolo anterior. Los disolventes tetrahidroturano y acetato de etilo son tóxicos, extremadamente inflamables e irritantes de vías respiratorias. Además, son contaminantes del medio ambiente.
• El uso de estos reactivos implica un extremo cuidado en el proceso de elaboración así como la posibilidad de contaminación del hidroxitirosol así obtenido.
Existen varios protocolos basados en la extracción del hidroxitirosol directamente a partir del aceite de oliva, de las hojas del olivo o bien, a partir de aguas de desecho de la elaboración de este aceite (Ragazzi y Neronese, 1967; Capasso et al., 1992; 1994; 1999; Monetedoro et al., 1992; Chikamatsu et al., 1996; Capasso et al., 1996; Nisioli y Galli, 1998, 1999). Siguiendo el criterio anterior, pasamos a detallar los más recientes (más optimizados).
Capasso et al. (1999) extraen hidroxitirosol a partir de las aguas de desecho provenientes de la fabricación del aceite de oliva. El protocolo global comprende 4 pasos con extracción en acetato de etilo, sulfato sódico, dos pasos cromatográficos de baja presión con fases de acetona/éter de petróleo y por último otro paso usando cromatografía en capa fina.
• La desventaja fundamental, aparte del uso de compuestos tóxicos y/o contaminantes, es el rendimiento, de tan solo el 1.5% (a partir de 4.2 gramos de hidroxitirosol estimados en las aguas de desecho, se obtienen finalmente
65 mg). Estos autores reconocen que los protocolos para la extracción a partir de aguas de desecho son costosos y, por ahora, no muy viables con fines industriales. El protocolo usado por Nisioli et al (1999), también extrae hidroxitirosol a partir de las aguas de desecho. Este método esta pendiente de ser patentado. Νσ obstante, la publicación adelanta el resumen del protocolo mediante el cual se aisla hidroxitirosol en combinación con otro derivado, y con su precursor, el tirosol. Este método comprende 3 pasos cromatográficos en HPLC de fase reversa con el uso de etanol, acetato de etilo y hexano. Aunque no está descrito en su totalidad, las desventajas, a priori, son las mismas: uso de compuestos muy tóxicos, varios pasos lentos y un rendimiento que, aunque no especificado, cabe imaginar bajo.
Tras una búsqueda combinada de posibles patentes y artículos científicos relacionados con el hidroxitirosol, hasta la fecha, solo se ha encontrado una patente, en la que esta molécula sea protagonista. La patente es: "Hydroxytyrosol as melanin formation inhibitor and lipid peroxide formation inhibitor and its application to topical preparations and bath preparations"; patente japonesa Jpn. Patent: 8119825, 1996; pp. 1-10. Las fuentes consultadas (desde 1969 hasta ahora) son:
• Bases de datos: Food Science and Technology Abstract, Medline, Chemical Abstract (CAB) y Agrícola (disponibles para personal del CSIC en, www, cti. csic.es/sis_comu/bbdd) .
• Bases de datos: (Además de las anteriores), BA (Biological Abstracts) y CC (Current Contente), disponibles para el personal de ATO en Holanda.
• Búsqueda de patentes: esp@cenet (Oficina Española de Patentes y Marcas; búsqueda en todo el mundo); www. european-patent-ofiice.org (Oficina Europea de patentes); www.uspto.gov (Ofician de Patentes de Estados Unidos); patent.womplex.ibm.com (Oficina de IBM sobre patentes registradas en E.E.U.U.).
Por tanto cabe el destacar dos aspectos: 1) que no hay ningún método de síntesis alternativo al químico para obtener hidroxitirosol de una forma simple, "natural", no tóxica, sin riesgo en su obtención y, 2) no se ha propuesto al hidroxitirosol como aditivo alimentario para aprovechar sus extraordinarias propiedades beneficiosas. La falta de un método de obtención apropiado ha limitado su potencial aplicación posterior. 4. DESCRD?CIÓN DE LA INVENCIÓN.
4.1. Breve descripción de la invención.
De la lectura de la sección anterior se puede deducir que los principales inconvenientes de los protocolos hasta ahora utilizados para la obtención del hidroxitirosol son:
• Síntesis química, con el consiguiente empleo de reactivos altamente tóxicos y contaminantes. Los protocolos son lentos y requieren personal de alta cualificación para llevarlos a cabo.
• Además, uso de precursores relativamente caros (ácido 3,4-dihidroxifenil acético y oleuropeina), además del coste adicional del resto de reactivos
(disolventes, ácidos, bases, etc.).
• Uso imprescindible de aparatos de cromatografía de alta resolución (HPLC) para la purificación de los distintos pasos de los protocolos.
El método aquí propuesto, consigue sintetizar el antioxidante hidroxitirosol a partir de su precursor comercial tirosol (1944 pts por gramo, Aldrich), utilizando la enzima tirosinasa (enzima comercial de champiñón), en presencia de un reductor como la vitamina C (ácido ascórbico). Las ventajas que se aportan son las siguientes:
• El medio de reacción transcurre a pH neutro, a temperatura ambiente y en medio acuoso.
• No se usan disolventes orgánicos, ni ácidos o álcalis peligrosos como el hidróxido sódico o ácido clorhídrico, ni ninguna sustancia tóxica o contaminante.
• El rendimiento puede ser del 100%, consta de uno o más pasos según la posterior aplicación del producto. El protocolo es modul ble, pudiendo formar la cantidad de antioxidante requerido, en un momento dado, a partir de unas mismas condiciones iniciales.
• Una vez caracterizadas las condiciones óptimas del proceso, la aplicación en sí del protocolo es como una "receta", fácil de usar y que no exige una cualificación especial para su puesta en práctica. • La enzima es re-utílizable (las enzimas en su mecanismo catalítico no se consumen). La velocidad de la reacción es linealmente dependiente de la cantidad de enzima utilizada. La reacción no se inhibe por alta concentración de precursor inicial (tirasol) o producto formado (hidroxitirosol). El antioxidante se puede usar solo (aislado con el uso de técnicas HPLC o TLC preparativas) o directamente, en combinación con vitamina C (acción antioxidante potenciada).
• El gasto total (cálculo estimado) en la producción de hidroxitirosol puede situarse, como máximo, en torno a las 5000 pts por gramo. El proceso estandarizado, y reutilizando la enzima, se abarataría aún más.
• El proceso es susceptible de ser aplicado de forma continua en un bio-reactor (ya utilizado por muchas industrias), aunque no es imprescindible su uso.
• El método aquí descrito podría ser utilizado por alguna casa comercial química y/o farmacéutica para la obtención y posterior venta de este compuesto, para investigación.
4.1. Descripción detallada de la invención.
El proceso de síntesis enzimática del antioxidante hidroxitirosol se basa en la actividad o-hidroxilasa de la enzima tirosinasa (también llamada polifenol oxidasa o PPO) (Espín et al., 2000b). Esta enzima, muy abundante en la Naturaleza y que se encuentra en todo el árbol filogenético (bacterias, artrópodos, aves, mamíferos, etc.) se encuentra comercialmente disponible (tirosinasa de champiñón de Sigma, Fluka...). PPO puede catalizar la incorporación de un grupo hidroxilo (OH) en posición "orto" al monofenol tirasol (esquema adjunto). El tirasol carece de actividad antioxidante. Sin embargo, la inclusión de un grupo -OH en posición "o to" provoca un cambio dramático en la molécula (Rice-Evans, et al., 1996), otorgándole una alta capacidad antioxidánte y el resto de efectos beneficiosos (Visioíi y Gaíli, 1995, 1998; Nisioli et al., 1998; Arbuma et al., 1998). Esta misma enzima también es capaz de catalizar la oxidación del nuevo compuesto formado, el hidroxitirosol, para generar la correspondiente o-quinona, de color amarillo, que posteriormente evoluciona para formar melaninas. Para evitar esta oxidación posterior, no deseada, se añade en efhíedio de re-.cción vitamina C, la cual es capaz de reducir la o-quinona, regenerando instai-táneamente el hidroxitirosol en el medio. De esta manera, creamos un ciclo infinito mientras exista cantidad suficiente de vitamina C para bloquear el proceso de oxidación, donde el efecto neto es la acumulación del hidroxitirosol. La reacción enzimática transcurre en un medio tamponado con fosfato (permitido como aditivo alimentario, código E-450) en medio acuoso, a pH neutro, y a temperatura ambiente. El medio de reacción, se compone por tanto de: tirasol, como precursor; tirosinasa de champiñón (comercial) para catalizar el proceso y vitamina C en exceso. Tras una agitación inicial, la reacción comienza. Cuando la concentración de tirasol inicial se agote la reacción se para. Para que continúe basta con añadir más tirasol (siempre cuidando que la relación vitamina C/tirosol sea mayor que 1). La enzima no se "consume" en el proceso pues no existe inhibición por exceso de substrato ni por formación de producto. La velocidad de la reacción depende linealmente de la concentración de enzima utilizada. Cuando se obtenga la concentración de hidroxítirosol deseada, (que se puede calcular con antelación en un tiempo determinado, de ahí que sea un proceso modulable) el volumen de reacción (a elegir, 1 litro, 10, 100 litros...) se filtra por una membrana con diámetro de poro inferior a 5000 daltons, o bien se dializa, también con membrana de diámetro de poro inferior a 5000 daltons. De esta manera, el volumen filtrado contendrá los componentes de bajo peso molecular presentes en el medio (hidroxitirosol, fosfato y vitamina C con o sin tirasol, según lo hayamos agotado). La enzima, de peso molecular más del doble del tamaño de poro, queda retenida en el filtro, y puede ser de nuevo reutilizada. Este primer extracto muy enriquecido en antioxidante hidroxitirosol, con una alta capacidad antioxidante (Espín et al., 2000a), (en este caso, en combinación con vitamina C), ya es susςeptible de utilizarse como aditivo alimentario. No hay que olvidar que la vitamina C es un aditivo (E-300) ampliamente utilizado por la industria alimentaria; y el hidroxitirosol, como se ha comentado anteriormente, es uno de los compuestos fenólicos más importante del aceite de oliva virgen, responsable directo de sus efectos beneficiosos, de su sabor y aroma y de la resistencia al enranciamiento de este aceite. Así, se presume interesante su uso como aditivo alimentario. Además, nos consta que varios grupos de investigación extranjeros (fundamentalmente italianos) están actualmente buscando un método que les permita la síntesis rápida y no contaminante como la aquí descrita. Este primer extracto, no obstante, se puede fácilmente purificar aislando selectivamente el hidroxitirosol, mediante un solo paso de cromatografía por HPLC preparativa de fase reversa, con una fase móvil de metanol: agua. También se puede purificar con cromatrografía preparativa en capa fina TLC. El compuesto así purificado sería interesante para la Industria Química y/o Farmacéutica.
La formación de hidroxitirosol también se puede llevar a cabo con esta misma metodología pero utilizando las aguas de desecho de la fabricación del aceite de oliva. En este caso, se enriquecerá la capacidad antioxidante del extracto global con la formación neta de o-difenoles a partir de los monofenoles presentes, uno de los cuales será el hidroxitirosol (su monofenol, tirasol, es muy abundante en estas agua).
Figure imgf000010_0001
(ácido dehidroascórbico) Vitamina C (ácido ascórbico)
5. EJEMPLO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN.
Se puede partir de un volumen de 1 litro de medio de reacción. Evidentemente este proceso es escalable para la industria, aumentando volúmenes y concentraciones. En dispositivo discontinuo o continuo (bio-reactor), se tiene un volumen 1 litro de disolución acuosa tamponada con fosfato (por ejemplo, 25 mM de concentración), y que contiene una concentración inicial de tirosol determinada que queramos transformar en hidroxitirosol. Por ejemplo, queremos 1 gramo de hidroxitirosol. Por tanto, adicionamos 1 gramo de tirosol (1944 pts) al medio y 2 gramos de vitamina C (30 pts). Se homogeneiza (no hay problemas de solubilidad), y se añade tirosinasa comercial de champiñón (por ejemplo, 15 mg, 4950 ptas.). La reacción comienza. En estas condiciones se estima la formación de 1 gramo de hidroxitirosol en aproximadamente 5 horas. Si se añade el doble de enzima, se formarán en 2.5 horas. No hay que olvidar que la enzima es reutilizable, de manera que una vez formada una cantidad de hidroxitirosol que estimamos suficiente (se puede matemáticamente predecir, o bien controlar con un alícuota del medio de reacción y analizar por HPLC), se puede añadir más tirosol para seguir formando hidroxitirosol. Cuando consideremos que tenemos formado suficiente hidroxitirosol, el volumen se filtra o dializa, pudiendo re-usar la enzima para un nuevo proceso (abaratándolo). El volumen filtrado se puede analizar por HPLC para corroborar el hidroxitirosol formado. Este volumen se liofiliza para obtener su correspondiente polvo que mantenemos en congelación.
El hidroxitirosol puede, mediante HPLC o TLC preparativas, purificarse, para selectivamente usarlo a él como aditivo o bien para poder distribuirse comercialmente. En el proceso de HPLC con columna de fase reversa, con una fase móvil de metanol: agua, el ácido ascórbico sale en el frente y el hidroxitirosol aproximadamente a los 7 minutos. El volumen recolectado se burbujea con nitrógeno, se liofiliza y se congela. Con TLC preparativa, el ácido ascórbico permanece en el punto de aplicación y el hidroxitirosol se desplaza, separándose claramente. Utilizamos la misma fase metanol: agua. Como sabemos cuánto se desplaza (su Rf), rascamos la matriz y después eluimos con agua para solubilizar el hidroxitirosol. Burbujeamos en nitrógeno, liofilizamos y congelamos. De esta manera, inicialmente, la formación de un gramo de hidroxitirosoí cuesta, (cálculo aproximado), 9930 pts. Sin embargo, por cada gramo adicional, en el mismo proceso, que utilizará la misma enzima, costará 1944 de tirosol + 30 de vitamina C (1974pts). Por tanto, inicialmente 2 gramos costarán 8898 pts (4449 pts/gramo); 3 gramos iniciales 10872 pts (3624 pts/gramo); 10 gramos iniciales 24690 pts (2469 pts/gramo), y así sucesivamente. Al aumentar los gramos a transformar, con igual enzima, el proceso se hace más lento, por lo que se puede balancear el proceso, en la relación coste/tiempo.
Evidentemente, estos costes, aproximados, se verían dramáticamente abaratados si el protocolo es utilizado por una casa comercial química o farmacéutica la cual no tendría que comprar el resto de componentes de reacción sino que los obtendría ella misma.
El hidroxitirosol, solo o combinado con vitamina C, se puede usar como aditivo alimentario en la elaboración de zumos (tomate, principalmente), gazpachos y otras sopas frías, alimentos infantiles, alimentos preparados que contengan aceite, etc. Se puede usar para estabilizar otros aceites (girasol, soja, etc.), margarinas, mantequilla. En estos procesos el efecto es múltiple:
• Estabilización del alimento al cual se añade (evita oxidación y enranciamiento). • Incrementa la capacidad antioxidante del alimento con el consiguiente aumento de la calidad nutricional.
• Se pueden modular las características organolépticas (aroma, sabor) de los alimentos. Este aditivo conferirá al alimento sabor a aceite de oliva, o bien lo potenciará si el alimento ya contiene este aceite. Para la industria químico-farmacéutica la ventaja obvia sería la de disponer de un producto actualmente muy demandado por muchos investigadores de todo el mundo que se ven obligados a sintetizarlos y/o extraerlo ellos mismos.

Claims

EINVINDICACIONES.
1. Síntesis enzimática del antioxidante hidroxitirosol caracterizada por las siguientes etapas:
• La reacción enzimática transcurre en un medio tamponado con fosfato (permitido como aditivo alimentario, código E-450) en medio acuoso, a pH neutro, y a temperatura ambiente. El medio de reacción, se compone por tanto de: tirosol, como precursor; tirosinasa de champiñón (comercial) para catalizar el proceso y vitamina C en exceso.
• Tras una agitación inicial, la reacción comienza. Cuando la concentración de tirosol inicial se agote la reacción se para. Para que continúe basta con añadir más tirosol (siempre cuidando que la relación vitamina C/tirosol sea mayor que 1). La velocidad de la reacción depende linealmente de la concentración de enzima utilizada.
• Cuando se obtenga la concentración de hidroxitirosol deseada, (que se puede calcular con antelación en un tiempo determinado, de ahí que sea un proceso moduíable) el volumen de reacción (a elegir, 1 litro, 10, 100 litros...) se filtra por una membrana con diámetro de poro inferior a 5000 daltons, o bien se dializa, también con membrana de diámetro de poro inferior a 5000 daltons. De esta manera, el volumen filtrado contendrá los componentes de bajo peso molecular presentes en el medio (hidroxitirosol, fosfato y vitamina C con o sin tirosol, según lo hayamos agotado). La enzima, de peso molecular más del doble del tamaño de poro, queda retenida en el filtro, y puede ser de nuevo reutilizada.
• Este primer extracto muy enriquecido en antioxidante hidroxitirosol, con una alta capacidad antioxidante, (en este caso, en combinación con vitamina C), ya es susceptible de utilizarse como aditivo alimentario.
2. Síntesis según reivindicación 1 caracterizada porque el obtenido primer extracto se purifica aislando selectivamente el hidroxitirosol, mediante un solo paso de cromatografía por HPLC preparativa de fase reversa, con una fase móvil de metanol: agua.
3. Síntesis según reivindicación 1 caracterizado porque el primer extracto se purifica con cromatrografía preparativa en capa fina TLC.
4. Síntesis según reivindicación 1 caracterizado porque la formación de hidroxitirosol se lleva a cabo utilizando aguas de desecho de la fabricación del aceite de oliva, enriqueciendo la capacidad antioxidante del extracto global con la formación neta de o-difenoles a partir de los monofenoles presentes, uno de los cuales será el hidroxitirosol.
5. Uso del antioxidante hidroxitirisol obtenido según reivindicaciones anteriores como aditivo alimentario para incrementar la calidad organoléptica y nutricional de los alimentos.
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