WO2002012553A2 - Verfahren zum nachweis von mutationen in nucleotidsequenzen - Google Patents

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WO2002012553A2
WO2002012553A2 PCT/EP2001/008127 EP0108127W WO0212553A2 WO 2002012553 A2 WO2002012553 A2 WO 2002012553A2 EP 0108127 W EP0108127 W EP 0108127W WO 0212553 A2 WO0212553 A2 WO 0212553A2
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WO
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muts
chip
protein
labeled
substrate
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PCT/EP2001/008127
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Andreas Kappel
Thomas Polakowski
Marc Pignot
Norbert Windhab
Heike Behrensdorf
Jochen Muth
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Nanogen Recognomics Gmbh
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Priority to CA002417861A priority patent/CA2417861A1/en
Priority to US10/343,859 priority patent/US20040110161A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method with which mutations can be detected in parallel in different nucleotide sequences, the method also permitting the determination of the transcription rate of mutated and non-mutated nucleotide sequences.
  • DNA sequences of most genes in the human organism are rewritten as protein sequences.
  • the activity of a protein is determined in different individuals or cell types by several factors: First, the transcription activity of the respective gene determines how many copies of the protein are present in a cell.
  • mutations can influence the activity of a protein. A reduced transcription rate or a repressing mutation lead to a decrease in protein activity (“loss-of-function"), while an increased transcription rate or one of the rarely occurring activating mutations lead to an increase in protein activity (“gain-of-function").
  • Other factors, such as translation regulation and post-translational modifications, can also influence the activity of proteins.
  • RNA detection such as.
  • Hybridization is also made possible in a very short time by electronic addressing.
  • Each of the usually 99 test electrodes of such a chip can be controlled individually; In contrast to other chip technologies, this allows the processing of several samples independently of one another.
  • the methods described are suitable for the detection of nucleotide sequences in a sample, but mutation detection with high sample throughput is not possible with the methods described there alone.
  • Point mutations single nucleotide polymorphisms, SNPs
  • SNPs single nucleotide polymorphisms
  • the resulting one Complex can either be detected directly (eg W09512688), indirectly (eg WO93 / 02216) or by a further enzymatic treatment (eg WO9529258), whereby the mutS protein can also be immobilized (WO9512689).
  • the DNA heteroduplices are generated by passive hybridization in a suitable buffer system (e.g. C. Bellanne-Chantelot et al., Mutation Research 382, 35-43, (1997)).
  • a suitable buffer system e.g. C. Bellanne-Chantelot et al., Mutation Research 382, 35-43, (1997).
  • the heteroduplices of several genes, but not of several individuals can be generated on an array by passive hybridization (WO9906591). Passive hybridization of several sequences leads to more or less pronounced cross hybridizations. This inevitably results in base mismatches, which are then bound by mutS without one of the sequences involved having a mutation. This creates a high background, mutations are "covered”. So far, this problem has only been partially solved by using single-strand binding protein (SSB)
  • SSB single-strand binding protein
  • Expression strength of genes is possible. This is particularly important for individual examinations, e.g. B. for target validation and patient screening, advantageous.
  • the invention is therefore based on the object of a method for the detection of
  • Such a method could surprisingly be provided in the form of an array, whereby a parallelization of the hybridization reaction becomes possible.
  • the object is achieved by a method for the detection of mutations in nucleotide sequences, in which single-stranded sample nucleotide sequences are hybridized with single-stranded reference nucleotide sequences, the single-stranded reference nucleotide sequences or single-stranded sample sequences being
  • Nucleotide sequences before or during the hybridization or heteroduplexes from reference and sample nucleotide sequences after or during the hybridization are fixed in a spatially resolved manner on a support and the incubation is carried out with a substrate which detects heteroduplex mismatches, the substrate binding being able to be detected.
  • a preferred method for detecting mutations in nucleotide sequences is
  • the nucleotide sequence to be examined for mutations, which is complementary to the known nucleotide sequence, is also on the chip is applied and a heteroduplex is produced by hybridization of the two sequences, c) the heteroduplex is then incubated with a substrate which detects mismatches, preferably a marked substrate, and d) the mismatches are detected by detecting the one attached to them
  • fixation of the single- or double-stranded nucleotide sequences and the hybridization can be electronically controlled, in particular electronically accelerated.
  • a particularly preferred embodiment of the claimed method is characterized by a spatially resolved, electronically accelerated hybridization, the hybridization conditions, such as. B. the applied current, the applied voltage or the duration of electronic addressing can be set individually at the respective location.
  • the base mismatch can then be detected simultaneously with or after the hybridization by adding a substrate that detects mismatches.
  • known and unknown point mutations as well as insertion and deletion mutations can be identified quickly and easily. If mismatches occur between the fixed nucleotide sequence and the nucleotide sequence to be investigated, these will e.g. B. by marked
  • Base mismatch-binding proteins or detected by electronic detection This makes it possible to read out the mismatches on the chip.
  • Detectable mismatches represent e.g. B. the SNPs.
  • the described method enables the parallel examination of several individuals for mutations on a chip.
  • nucleotide sequence is used in connection with the description of the detection method according to the invention not only for deoxyribonucleic acid, but also for RNA or chemically modified polynucleotides, cDNA also falling under the term deoxyribonucleic acid;
  • reference nucleotide sequence denotes a nucleotide sequence
  • Sequence preferably a DNA sequence, which is used as a comparison sequence
  • sample nucleotide sequence is a labeled nucleotide sequence, preferably a DNA sequence, which is to be checked for mutations;
  • a “nucleotide chip” is characterized by a zoned chip surface to which sample or preferably reference nucleotide sequences are applied;
  • Gene expression is the conversion of genetic information into RNA or protein.
  • Electronic addressing is carried out by applying an electrical field, preferably between 1.5 V and 2.5 V with an addressing time between 1 and 3 Minutes. Due to the electrical charge of the nucleotide sequences to be addressed, their migration is greatly accelerated by applying an electric field. Addressing can take place in a spatially resolved manner, addressing different zones of the chip surface one after the other. Different addressing and
  • Hybridization conditions can be set.
  • nucleotide sequence heteroduplexes consisting of a predetermined nucleotide sequence, the reference
  • Nucleotide sequence as well as the complementary nucleotide sequence from a physiological sample, the sample nucleotide sequence, generated on a chip surface. Mismatches that result indicate an SNP of the sample nucleotide sequence and can be detected by a substrate that binds to the defect. Base mismatch binding proteins are suitable for this.
  • Base mismatch binding proteins can e.g. B. mutS or mutY, preferably from E. coli, T. thermophilus or T.aquaticus, MSH 1 to 6, preferably from S.cerevisiae, S1 nuclease, T4 endonuclease, thymine cosylase, cleavase or fusion proteins containing a domain of these base mismatches binding proteins.
  • B. mutS or mutY preferably from E. coli, T. thermophilus or T.aquaticus
  • MSH 1 to 6 preferably from S.cerevisiae, S1 nuclease, T4 endonuclease, thymine cosylase, cleavase or fusion proteins containing a domain of these base mismatches binding proteins.
  • other proteins or substrates can also be used for this if they are able to specifically recognize and bind to a base mismatch in a nucleotide sequence duplex.
  • the reference nucleotide sequence can be used as a biotinylated oligonucleotide, which is either synthesized or produced by amplification with sequence-specific oligonucleotides, one of which is biotinylated at the 5 'end.
  • the reference nucleotide sequence is then converted into the single-stranded state by melting, preferably in a buffer solution with a low salt content, and applied to a predetermined position of a chip by electronic addressing.
  • Suitable chips are marketed, for example, by Nanogen (San Diego / USA).
  • the application of the reference nucleotide sequence can, for example, preferably by means of a Nanogen Molecular Biology Workstation using the parameters specified by the manufacturer. Unless stated otherwise, the chips or the Molecular Biology Workstation from Nanogen are used in accordance with the manual supplied, the use is also described in Radtkey et al., Nucl. Acids Res. 28, 2000, e17.
  • sample nucleotide sequence which is complementary to the sequence already applied to the chip, can now be applied to the chip prepared in this way.
  • dye-labeled oligonucleotides are synthesized or by amplification with sequence-specific oligonucleotides, one of which is at
  • the dye-labeled nucleotide of the sample nucleotide sequence is the complementary counter strand to the biotinylated strand of the reference nucleotide sequence.
  • the sample nucleotide sequence must also be melted beforehand, e.g. B. in a buffer solution with low salt content, converted into the single-stranded state and applied to the biotinylated reference nucleotide sequence by electronic addressing.
  • Hybridization results in a nucleotide sequence heteroduplex consisting of reference nucleotide sequence and sample nucleotide sequence.
  • the preparation of the heteroduplex can be done on an electronically addressable surface, e.g. B. with a Nanogen Molecular Biology
  • Successful hybridization can e.g. B. optically followed by detection of the dye coupled to the heteroduplex and thereby determined quantitatively.
  • sample nucleotide sequence can also be biotinylated and, as just described, electronically addressed. Hybridization in solution with subsequent electronic addressing is also possible, one of the two nucleotide sequences of the heteroduplex being biotinylated.
  • other molecular sequences can also be used to fix nucleotide sequences
  • mutS proteins from the mutS family are preferably used which recognize these mismatches with high specificity.
  • the mispairing substrate is preferably added in excess, and unbound substrate can be removed by washing.
  • the protein which recognizes mismatches can also contain polymeric markers (J. Biotechnol. 35, 165-189, 1994), metal markers, enzymatic or radioactive markings or quantum dots (Science Vol 281, 2016, Sep 25, 1998 ) contain.
  • the enzyme label can z. B. a direct enzyme coupling or
  • Chloramphenicol acetyl transferase, alkaline phosphatase, luciferase or peroxidase are particularly suitable for enzymatic labeling.
  • substrate marking with dyes which absorb or emit light in the range between 400 and 800 nm is preferred.
  • fluorescent dyes suitable for labeling are especially Cy TM 3, Cy TM 5 (from Amersham Pharmacia), Oregon Green 488, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Bodipy 558/568 , Bodipy 650/665, Bodipy 564/570 (e.g. from Mobitec, Germany), S 0535, S 0536 (e.g. from FEW, Germany), Dy-630-NHS, Dy-635 -NHS, EVOblue30-NHS (e.g.
  • labeled antibodies can also be used which directly against mutS or against a fused peptide domain, such as. B. MBP are directed. If a mutS protein labeled with dye, for example, is then incubated with the heteroduplex nucleotide sequence bound to the chip surface, the protein preferably binds to the positions of the chip where mismatches within the heteroduplex have occurred. The bound dye-labeled mutS proteins can then by optical sensors, for. B. using the
  • Nanogen Molecular Biology Workstation in connection with a suitable evaluation software can be determined quantitatively.
  • the binding of the mismatch-detecting substrate can also be established using electrical methods such as B. cyclovoltametry or impedance spectrometry
  • Microcantilever technology e.g. described in Science 288, 316-318, 2000
  • detection using acoustic methods as described e.g. in WO 9743631
  • gravimetric methods as described e.g. in WO 9743631
  • the method according to the invention is not only suitable for the detection of
  • Gene mutations may also indicate differences in the level of expression of the mRNA expressed in different cells or tissues.
  • the mRNA is converted into cDNA, the cDNA obtained being used for the measurement.
  • Detection is preferably carried out by dye which is coupled to the sample nucleotide sequence and is optically detected. Since the amount of dye at a given chip position correlates with the amount of mRNA or cDNA, the evaluation of the dye intensity of several chip positions allows differences in the level of expression different cells or tissues.
  • the expression level of a gene can be determined in parallel in different samples or different genes. The parallel detection of mutations and gene expression differences in the same sample is not only time-saving, but also less prone to errors because of the uniform treatment of the samples in both detection systems.
  • the substrate binding can also be detected by means of electrical methods. Impedance spectroscopy is particularly suitable for this, the change in the AC resistance at
  • Measuring location is determined, which depends on the bound amount of substrate.
  • a cyclic voltametric measurement of the voltage between an electron donor or acceptor bound to the nucleotide sequences and an electrically conductive surface is also conceivable, the electron flow being changed by the substrate binding.
  • the electronic addressing takes place on a chip surface which is covered with a permeation layer.
  • the permeation layer enables small ions to flow to the electrically conductive surface of the chip, thereby closing the circuit without the nucleotide sequences or the substrate coming into contact with the chip surface and being itself oxidized or reduced there.
  • Suitable permeation layers are preferably non-ionic polymeric or gel-like materials which have a high permeability to nucleotide sequences and the substrate used, so that there is good penetration of the permeation layer during electronic addressing with the nucleotide sequences or during incubation with the mismatching substrate. So z. B.
  • hydrogel coating Agarose coating of the electronically addressable chip is preferable.
  • the hydrogel chip offers the advantages of higher sensitivity and better discrimination between mismatched and perfectly paired DNA compared to the agarose chip. This is surprising in that it could not have been foreseen that the nature of the permeation layer would have such a great influence on the
  • the mismatch binding should take place at a salt concentration of 10 to 300 mM, preferably from 10 to 150 mM, and a salt concentration of 25 to 75 mM has been found to be particularly preferred.
  • the optimal salt concentrations for mismatch detection by other substrates can be analogous to that
  • Embodiment can be easily determined.
  • the measuring accuracy of the method is increased by adding non-specific binding sites blocking substances such as. B. BSA increased.
  • non-specific binding sites blocking substances such as. B. BSA increased.
  • the addition of SSB can have a positive effect on the measurement accuracy, provided that single-stranded nucleic acid fragments are bound by the substrate used to identify mismatches, as described, for example, in B. is the case with mutS. If mutS was used as the substrate, however, only a slight improvement in the measurement accuracy could be achieved.
  • Strand in which a cytosine residue has been mutated to thymine with an unmutated reference counter strand results in a GT mismatch that can be reliably detected with the help of the mutS protein from E. coli.
  • other mutations can also be detected using the method presented here, in particular those point mutations which lead to a G: G, C: T or A: A mismatch when the mutated DNA hybridizes with the unmutated counter strand. Insertions or deletions of one or two bases can also be detected by mutS.
  • the proportion of mutations that can be detected with the method described here can also be increased by hybridizing both strands of a DNA to be tested with the respective reference counter strand. This can be illustrated by the following example: A base exchange in which a guanine is replaced by cytosine, if it is not repaired, leads to the conversion of the original G: C base pair into a C: G base pair.
  • both strands of a nucleotide sequence can be electronically hybridized separately locally or a mixture of both single strands is fixed on a chip surface.
  • mutS from T.thermophilus has surprisingly proven to be particularly suitable.
  • the method can also be adapted to the respective requirements by combining individual mismatches of recognizing substrates.
  • the electronic addressing can e.g. B. on a chip on which the nucleotide sequences A, B, C, ..., N are already fixed at the locations a, b, c to n, with a mixture containing nucleotide sequences from the group A ' , B ⁇ C ⁇ ..., N ' take place.
  • the nucleotide sequences A / A " to N / N ' each represent a reference and sample nucleotide sequence pair.
  • Hybridization can e.g. B. by reversing the polarity of the electric field, the stringency of the hybridization conditions can be increased. This can be done in a location-specific manner and thus be individually adjustable for each location.
  • sample nucleotide sequences A, B, C, ..., N When nucleotide sequences A, B, C, ..., N are attached, the hybridization takes place one after the other site-specifically with the samples A ⁇ B ⁇ C ⁇ ..., N ⁇ so that the heteroduplicates AA 'are located at location a, BB at location b, Can form CC at location c to NN ' at location n.
  • the sample nucleotide sequences can also be attached to the chip surface and the successive electronically accelerated hybridization with the respective reference nucleotide sequences then takes place.
  • the hybridization of sample nucleotide sequences of different origins, e.g. B. from different patients, always with the same reference nucleotide sequence is preferably carried out with the method scheme described.
  • This embodiment of the method according to the invention is characterized by a high degree of reliability.
  • the design of the measurements as a successive method is only possible by using an electronically addressable surface.
  • the method according to the invention can thus be carried out in a highly parallelized manner on an electronically addressable surface; this enables a high sample throughput to be achieved.
  • Another advantage of the claimed methods is that not only can the existence of a mutation be detected qualitatively, but also a quantitative determination of the transcription of the mutated nucleic acid sequence is possible.
  • This is e.g. B. in the analysis of heterozygous genotypes of interest.
  • the first is a measure of the transcription rate of the mutated nucleotide sequence Approximation of the amount of bound, specifically mismatching substrate. Standardization is helpful, especially for the quantitative determination of mutated nucleotide sequences.
  • the reference or sample nucleotide sequence may be dye-labeled. It can be checked optically that the same amount of nucleotide sequences is fixed at the location of the standard measurement as at the location of the actual measurement.
  • a completely complementary nucleotide sequence is then added in excess at the location of the standard measurement, so that all fixed nucleotide sequences are hybridized free of mismatches.
  • additional additives such as BSA, SSB, detergents etc. are added. Recognizing after mismatching
  • a comparison value can then be determined that serves as the standard.
  • the mutated nucleotide sequence is also determined quantitatively in parallel with the addition of the mispairing substrate.
  • the difference between the standard value and the measurement value enables a quantitative statement to be made about the transcription rate of the mutated nucleotide sequence.
  • it makes sense to create a calibration curve with different concentrations of the mutated nucleotide sequence because e.g. B. the mutS binding to the heteroduplex does not increase linearly, but rather flattens with the number of base mismatches that occur.
  • One reason for this can be mass transfer effects at the measurement location.
  • the amount of DNA obtainable from it is generally limited. An excessive amplification would lead to the accumulation of mutated strands due to the error rate of the polymerase and thus to an increased background.
  • fluctuations in the DNA concentration between different patient samples can be expected when using patient DNA. These fluctuations could cause fluctuations in the mutS signal and, in extreme cases, could prevent detection of the mutation.
  • the method according to the invention in particular when using mutS as a substrate that detects mismatches, is also suitable for reliable and quantitative mutation detection even at low or fluctuating DNA concentrations. This is because relatively large fluctuations in the concentration of the DNA used do not lead to larger fluctuations in the mutS binding.
  • the method according to the invention shows a high degree of reliability in the detection of mutations, especially in the range of practically relevant DNA concentrations, as obtained when examining samples from patients. Furthermore, the claimed method surprisingly shows a high level of insensitivity to fluctuations in the amount of nucleotide sequences prepared. This makes it possible to compare different patient samples even if the individual samples do not have exactly the same DNA concentration.
  • the methods according to the invention are therefore suitable for the rapid and reliable detection of mutations.
  • a large number of samples can be examined in parallel. This improves the genotypic screening for previously unknown mutations. So are z. B. in the course of the Human Genome Project large amounts of sequence data about the human genome, from which electronically addressable chips can be constructed that can be tested against sample nucleotide sequences from different people. This means that a large number of mutations can be quickly identified, which do not necessarily have to be expressed phenotypically.
  • samples obtained from cells of a particular organism can be examined for the presence of a dominant or recessive inherited mutation.
  • the possibility of large sample throughput allows screening for mutations in certain genes in a large group of people, e.g. B. on newborns.
  • a disease disposition and the early treatment of inherited genetic defects such as. B. cystic fibrosis, Huntington's disease or sickle cell anemia, all of which are based on certain known mutations.
  • any drug intolerance or drug ineffectiveness such as. B. a tamoxifen resistance, can be examined in a patient with such a method, as long as the incompatibility is correlated with a known mutation, or just a correlation can be generated by the analysis.
  • kits contains an electronically addressable chip, reference nucleotide sequences which can be present in free form or already fixed to the chip surface and at least one substrate which specifically recognizes mismatches.
  • the added reference nucleotide sequences have to be adapted to the intended use of the assay.
  • MutS from E. coli is preferred as the substrate recognizing mismatches. But for special questions other substrates, such as. B. mutS from T.thermophilus for the detection of nucleotide insertions or deletions may be part of the kit.
  • the present invention furthermore relates to a process for the preparation of protein-labeled mismatch-detecting proteins, an ester, preferably a succinimidyl ester, of the dye in a low concentration, preferably between 1 ⁇ M and 100 ⁇ M under mild conditions with a protein mismatch-detecting, preferably mutY , MSH1 to MSH6, S1 -
  • Nuclease, T4 endonuclease, thyme glycolase or cleavase and particularly preferably with mutS is reacted with the exclusion of light. Furthermore, the use of a HEPES buffer consisting of 5 mM to 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), pH 7.5 to 8.5, 50 to 500 mM KCI, 1 to 15 mM MgCl 2 , 5 to 15% glycerol in distilled water have been found to be advantageous.
  • HEPES buffer consisting of 5 mM to 50 mM N-2-hydroxyethylpiperazine N'-2-ethanesulfonic acid (HEPES), pH 7.5 to 8.5, 50 to 500 mM KCI, 1 to 15 mM MgCl 2 , 5 to 15% glycerol in distilled water have been found to be advantageous.
  • HEPES buffer consisting of 5 mM to
  • mismatch-recognizing proteins can be marked directly with dyes, without the proteins being specific
  • Another subject of the present invention is thus proteins which recognize mismatches, preferably mutY, MSH1 to MSH6, S1 -nuclease, T4-endonuclease, thymic glycolase or cleavase and particularly preferably mutS, which are dye-labeled.
  • Dyes particularly suitable for marking are Cy TM 3, Cy TM 5, Oregon Green 488, Alexa Fluor 488, Alexa
  • the invention also relates to mismatches
  • Fusion proteins e.g. B. with an antibody binding epitope, such as. B. MBP, or with an enzymatic group, preferably with chloramphenicol acetyl transferase, alkaline phosphatase, luciferase or peroxidase, can be labeled.
  • the label can also be a luminescent or radioactive group.
  • Another object of the present invention is the use of mutS for a method for spatially resolved mutation detection in nucleotide sequences on a support, preferably on an electronically addressable surface.
  • the use of directly fluorescence-labeled mutS is particularly advantageous here.
  • Proteins of the mutS family which are known to be involved in the detection and repair of DNA damage in eukaryotes, bacteria and archeae play an important role (R. Fishel, Genes Dev. 12 (1998), 2096-2101). These proteins specifically bind to sections of DNA with base mismatches and initiate repair of the damage by recruiting enzymes.
  • mutations are detected by electronically accelerated hybridization of the reference DNA with the DNA to be tested in connection with new, dye-labeled mutS proteins.
  • a molecular biology workstation from Nanogen is used for this. Unless otherwise described in the exemplary embodiments, the measurements are carried out according to the manufacturer's instructions (manual for molecular biology
  • Base mismatches of the resulting heteroduplexes reflect a mutation of the test DNA compared to the reference DNA and can e.g. B. localized by a dye-labeled mutS protein.
  • the optical analysis of the chip then allows the assignment of a mutation to a gene fragment.
  • mutS from E.coli, T. thermophilus, T.aquaticus or the fusion protein MBP-mutS were used, as indicated in each case.
  • the dye-labeled mutS protein obtained was used in a further step for mutation detection in electronically addressed DNA heteroduplexes.
  • nucleotide sequences used to construct the nucleotide chips are shown in the following list, including the respective markings.
  • the DNA sequence encoding E. coli mutS was amplified by PCR and isolated by standard methods.
  • the ⁇ '-primer (SEQ. ID No. 1) introduces a BamHI interface immediately before the start codon, while the 3'-primer (SEQ. ID No. 2) generates a HindIII interface after the stop codon.
  • the PCR is known to the person skilled in the art and was carried out according to the following scheme:
  • the mutS-PCR product (SEQ. ID. No. 3) is purified using a 1% TAE agarose gel and the desired DNA is extracted from a cut out agarose gel.
  • the isolated DNA is quantified on a gel and cut with BamHI and Hindill.
  • 10 ⁇ l mutS-PCR product (about 2 ⁇ g) with 30 U BamHI (3 ⁇ l, NEB, Heidelberg), 30 U Hindill (3 ⁇ l, NEB, Heidelberg), 6 ⁇ l 10x
  • NEB2 buffer (NEB, Heidelberg), 0.6 ul 100 x BSA (NEB, Heidelberg) and 37.4 ul H 2 O combined and incubated at 37 ° C for 4 hours.
  • the enzymes are then inactivated at 70 ° C for 10 minutes.
  • the DNA is precipitated overnight at 4 ° C. after adding 6 ⁇ l Na acetate pH 4.9 and 165 ⁇ l ethanol. After washing the pellet in 70% ethanol, it is air dried.
  • the DNA is taken up in 30 ⁇ l TE (10 mM TrisHCI, 1 mM EDTA, pH8).
  • the E. coli expression plasmid pQE30 (SEQ. ID No. 4) (Qiagen, Hilden) is also cut with BamHI and HindIII.
  • 10 ⁇ l pQE30 with 30 U BamHI (3 ⁇ l, NEB, Heidelberg) 30 U Hindlll (3 ⁇ l, NEB, Heidelberg)
  • DNA is taken up in 30 ⁇ l TE (10 mM TrisHCI, 1 mM EDTA, pH8).
  • pQE30 and mutS are compared on an agarose gel and 100 ng plasmid (2 ⁇ l) and 150 ng (5 ⁇ l) mutS DNA in a 20 ⁇ l ligation mixture with 2 ⁇ l 10 ⁇ ligase buffer (Röche, Mannheim), 2 ⁇ l ligase (2 U,
  • a 5 ml LB (with 100 ⁇ g / ml ampicillin) overnight culture E.coli TOP10 with the plasmid pQE30-mutS is diluted so that in a subsequent 100 ml LB culture (100 ⁇ g / ml ampicillin) an OD595 of 0.05 arises.
  • the cells are incubated at 37 ° C. with shaking (240 rpm) until an OD595 of 0.25 is reached.
  • An IPTG concentration of 1 mM is then set in the culture and the cells are incubated for a further 4 hours.
  • the cells are harvested by centrifugation (5,000 xg for 10 minutes).
  • the cell pellet is taken up in 10 ml PBS buffer with 0.1 g lysozyme (Sigma, Deisendorf) and 250 U benzonase (Merck, Darmstadt) and incubated at 37 ° C. for 60 minutes.
  • the material with bound mutS protein is separated off on a mini column with a glass frit (Biorad, Kunststoff) and washed three times with buffer A (4 ml, 2 ml, 2 ml). The protein is then eluted with 2 x 2 ml buffer B (Qiagen).
  • the protocol developed by the company Pharmacia provides for optimal fluorescence labeling of the protein by incubating it with a large excess of fluorophore under relatively strongly basic conditions (0.1 M Na 2 CO 3 , pH 9.3).
  • fluorescent labeling of the thermostable mutS from Thermus aquaticus was initially carried out using Cy TM 3.
  • Cy TM 3 After gel permeation chromatography purification and subsequent SDS-PAGE analysis, a strongly fluorescent protein band could be detected, which clearly corresponds to a mutS protein labeled with Cy TM 3 due to its molecular weight (FIG. 3).
  • Lane 1 shows the mutS-Cy TM 3 (T.aquaticus), while lanes 2 to 4 represent the mutS-Cy TM 5 (E. coli).
  • Protein a refined and optimized labeling protocol must be established.
  • the labeling reaction was carried out in a mixture (500 ⁇ l) of E. coli mutS protein (50 ⁇ g, 1.05 ⁇ M) with increasing concentrations of Cy TM 5-succinimidyl ester (12 ⁇ M, 20 ⁇ M, 50 ⁇ M and 100 ⁇ M) performed in labeling buffer at room temperature for 30 minutes in the dark.
  • a NAP-5 gel filtration column (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) was used with 3 column volumes of elution buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM KCI, 10 mM MgCI 2 , 0, 1mM EDTA, 1mM dithiothreitol (DTT), 10% glycerin in distilled water) equilibrated.
  • the labeling reaction solution is mixed with elution buffer (500 ⁇ l), applied completely to the column and the differently fluorescence-labeled proteins are isolated by elution with elution buffer.
  • the fluorescent protein fractions were then examined in more detail by UV spectroscopy (FIG. 4) and SDS-PAGE by gel chromatography (FIG. 5).
  • the band-shift method was then used to check whether the mutS proteins conjugated with Cy TM 5 were functionally active, ie whether they were still specific could bind base mismatches.
  • heteroduplices were obtained by hybridizing the oligonucleotides "AT” (Seq. ID No. 6) or “GT” (Seq. ID No. 7) with the oligonucleotide "sense” (Seq. ID No. 11) for 5 minutes Heating to 95 ° C in 10 M Tris-HCl, 100 mM KCI, 5 mM MgCI 2 followed by slow cooling to room temperature.
  • the oligonucleotide "GT” faces this
  • Oligonucleotide "AT” a mutation. Using the T4 polynucleotide kinase (New England Biolabs, Frankfurt), according to the manufacturer, 10 pmol of the two heteroduplexes produced with the oligonucleotides "AT” and “GT” were radioactive with 150 ⁇ Ci - 32 P-ATP at the 5 'ends marked and purified on Sephadex G50 gel filtration columns (Pharmacia, Uppsala, Sweden) according to the manufacturer's instructions.
  • FIG. 6 shows Cy TM 5-conjugated E. coli mutS (lanes 4,9), which has no loss of activity compared to commercially available unlabeled protein (Gene Check, Fort Collins, USA, lanes 2, 7). The same applies to Cy TM 5-conjugated T. aquaticus mutS (Epicenter, Madison, USA, lanes 3, 8 unconjugated, lanes 5, 10 conjugated). Lanes 1 and 6 contain no protein. Conjugated and unconjugated proteins bound to the oligonucleotide with the
  • Lanes 1 and 6 contain no protein.
  • FIG. 8 shows E. coli lysates separated by SDS-PAGE from cultures transformed with pQE30-mutS, which were grown at different temperatures and overexpress mutS.
  • the formation of inclusion bodies should be avoided by low incubation temperatures (30 ° C or 25 ° C).
  • incubation temperatures (30 ° C or 25 ° C).
  • mutS protein there are only very small amounts of mutS protein.
  • a very large amount of mutS protein can be found in the insoluble fraction (inclusion bodies).
  • Figure 8 shows a Coomassie stained 10% SDS-PAGE from E. coli lysates. Lane 1: insoluble, Lane 2 soluble fraction of 25 ° C cultures. Lane 3: insoluble, lane 4 soluble fraction of 30 ° C cultures. Lane 5: insoluble, Lane 6 soluble fraction of 37 ° C cultures. All cultures transformed with pQE30-mutS were induced and grown for 3 hours at the indicated temperatures with 0.3 mM IPTG.
  • the DNA coding for mutS was inserted into the vector pMALc2x (NEB, Frankfurt, Seq. ID No. 8), from which the plasmid pMALc2x-mutS (Seq. ID. No. 9) resulted.
  • Another advantage of this fusion protein over the conventional mutS protein is the commercial availability of anti-MBP antibodies, which allow detection of the fusion protein. An anti-mutS antibody is currently not commercially available.
  • the fusion protein tested in this study consists of the 42 kDa maltose binding protein (MBP) and the 92 kDa mutS protein.
  • the DNA sequence coding for mutS from E. coli was amplified by PCR and isolated according to standard methods.
  • the 5 'primer BamHI (Seq. ID No. 52) introduces a BamHI interface before the start codon.
  • the nucleotide sequence immediately in front of the start codon is mutated so that the start codon function is lost. This is to prevent the
  • the 3 'primer HindIII rev (Seq. ID No. 2) introduces a HindIII interface after the stop codon.
  • the PCR is known to the person skilled in the art and was carried out according to the following scheme: 4 ⁇ l genomic DNA from E. coli (prepared according to the manufacturer with the
  • mutS-PCR product was then isolated using the PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Germany) and freed from salts, primers and proteins.
  • the isolated DNA is quantified on a gel and cut with BamHI and Hind ⁇ :
  • 41 ⁇ l mutS-PCR product (about 2 ⁇ g) with 20 U BamHI (2 ⁇ l, NEB, Frankfurt) are 20 U Hindlll (2 ul, NEB, Frankfurt), 5 ul 10x NEB2 buffer (NEB, Frankfurt) combined and incubated at 37 ° C overnight.
  • 10 ⁇ l of the vector pMALc2x (2 ⁇ g, from NEB, Frankfurt) are mixed with 20 U BamHI (2 ⁇ l,
  • the amounts of pMALc2x and mutS are compared on an agarose gel and 200 ng plasmid (3 ⁇ l) and 400 ng (14 ⁇ l) mutS DNA in a 20 ⁇ l ligation mixture with 2 ⁇ l 10x ligase buffer (Röche, Mannheim) and 1 ⁇ l of T4DNA ligase (2 U, Röche, Mannheim) combined and incubated for 3 h at room temperature.
  • the E.coli k12 strain "Goldstar" (Stratagene, La Jolla, San
  • CaCI 2 , 50 mM MgCl 2 was taken up and incubated with 100 ⁇ l of the thawed bacteria for 20 min on ice. After a 10-minute incubation at room temperature, the bacteria were mixed with 1 ml LB medium and shaken for one Incubated at 37 ° C for one hour. The mixture was then spread on LB agar plates with 100 ⁇ g / ml ampicillin and incubated at 37 ° C. overnight. Individual clones were isolated and grown in 3 ml LB medium with 100 ⁇ g / ml ampicillin at 37 ° C. overnight.
  • the MBP-mutS fusion protein was then purified by affinity chromatography on an amylose column and eluted in column buffer (see above) with 10mM maltose (described in: pMAL Protein Fusion and Purification System Handbook, NEB, Frankfurt). The protein concentration of the eluate was then determined using the Bradford Assay Kit (Biorad, Kunststoff). 2 ⁇ g of the eluate were
  • the MBP-mutS fusion protein was mixed 1: 1 (v / v) with glycerin and stored at -20 ° C. The activity of the proteins was verified using the "band-shift" method and surface plasmon resonance technology (see below).
  • 9A shows a Coomassie stained 5% -20% SDS-PAGE of E. coli lysates from pMALc2x-mutS transformed cells.
  • Lane 1, 2 Kloni.
  • Lane 3, 4 clone 4.
  • Lane 5.6 clone 5.
  • Lane 7.8 clone 6.
  • the cells were not lysed prior to lysis (Lanel, 3,5,7) or with 0.3mM IPTG (Lane 2, 4,6,8).
  • clones 1 and 6 a protein of the expected size of 140 kDa is formed (arrow).
  • 9B Western blot analysis of a 5% -20% SDS-PAGE of E. coli lysates from pMALc2x-mutS transformed cells.
  • Lane 1, 5 Kloni.
  • Lane 2 6: clone 4. Lane 3.7: clone 5. Lane 4.8: clone 6. The cells were not induced before lysis (Lanel -4) or with 0.3 mM IPTG (Lane 5-8). In clones 1 and 6, a protein of the expected size of 140 kDa is recognized by the anti-MBP antibody (arrow). Clones 4 and 5 recognize a protein the size of MBP (approximately 40 kDa).
  • Figure 9C Coomassie stained 5% -20% SDS-PAGE from purified MBP-mutS fusion proteins. MBP-mutS purified from affinity chromatography from 2 independent preparations was investigated by gel electrophoresis. Lane 1, marker. Lane 2:
  • mutS protein (either an MBP-fused or an unfused variant, commercially available E. coli protein from Genescan (Fort Collins, USA), or mutS obtained from T. aquaticus from Biozym, Hess. Oldendorf) were dissolved in 18 mL 20 mM HEPES pH 7.9, 5 mM MgCl 2 , 150 mM KCI, 10% (v / v) glycerol. 250 nmoles of Cy TM 5-succinimidyl ester were dissolved in 2 ml of the same buffer, mixed well with the dissolved protein and incubated for 30 minutes at room temperature. Then the reactions with 2mL 20mM HEPES pH7.9, 5mM MgCl 2 , 150mM KCI, 100mM adenosine triphosphate, 10mM
  • Dithiothreitol 10% (v / v) glycerin added.
  • the protein-containing solutions were 2x for 3 hours and 1x overnight against 2L 20 mM Tris pH7.6, 5mM MgC, 150mM KCI, 1mM DTT, 10% (v / v) glycerol in a dialysis bag with a cut-off of 10 kDa dialyzed at 4 ° C.
  • the protein was then mixed with 1 part by volume of glycerol and stored at ⁇ 20 ° C.
  • FIG. 10 shows the loading of the 100-position chip with DNA by electronic addressing.
  • the current strength per position fluctuated between 262 nA and 364 nA in rows 1-8, between 21 nA and 27 nA in rows 9 and 10, as a result of which less DNA was addressed at these positions (FIG. 10, left matrix, the two lower rows ).
  • the oligonucleotide Seq which was completely complementary to the oligonucleotide "sense" (Seq. Id No. 10) and labeled with Cy TM 3 at the 5 ' end. ID No.
  • rows 1 to 4 The slight fluctuations in the values in rows 1 to 4 as well as 7 and 8 indicate an even hybridization of the double-stranded oligonucleotides AT and GT.
  • the comparably lower values of rows 9 and 10 reflect the smaller amounts of DNA in these rows due to lower addressing current strength (see above).
  • the low values in row 5 represent the background signal, since no fluorescence-labeled DNA was addressed to this row.
  • Row 6 contains only single-stranded DNA "sense" as a control.
  • Proteins clearly shows that the protein binds preferentially to the oligonucleotide GT (Table 2). Even with very small amounts of DNA (Table 2, rows 9 and 10) it is possible to discriminate between the perfectly pairing oligonucleotide (AT) and the base mismatching oligonucleotide (GT) with the dye-labeled protein, which is possible with larger amounts of DNA (rows 1 - 4 as well as 7 and 8, see Table 1). The low background values are also striking (Table 2, rows 5 and 6). To determine if other base mismatch binding proteins such as e.g. The mutS protein from T aquaticus can also be used for the rapid detection of mutations on electronically addressable chips, initially became a 100 position chip from the company
  • the low values in rows 5 and 6 represent the background signal, since no fluorescence-labeled DNA was addressed to these rows.
  • the subsequent fluorescence measurement of the Cy TM 5-labeled T aquaticus mutS protein clearly shows that this protein also binds preferentially to the oligonucleotide GT (Table 4) and is therefore suitable for detecting mutations on electronically addressable DNA chips.
  • Table 2 Determination of the fluorescence intensity of Cy TM 5-labeled E. coli mutS protein on an electronically addressed 100-position chip at 670 nm. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities and the DNA addressed to these positions (outer right column ).
  • Table 3 Determination of the fluorescence intensity of Cy 3 -labeled DNA on an electronically addressed 100 position chip at 575 nm. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities as well as the DNA addressed to these positions (outer right column) are given.
  • Table 4 Determination of the fluorescence intensity of Cy 5-labeled T. aquaticus mutS protein on an electronically addressed 100-position chip at 670 nm. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities and the DNA addressed to these positions (outer right column) are given ,
  • the binding conditions of the dye-labeled mutS protein were examined and optimized so that base mismatches on the surface of an electronically addressable chip can be recognized even better.
  • two electronically addressable chips from Nanogen were first created, the surface of which consist of an agarose layer with embedded therein
  • Streptavidin molecules exist, loaded with the biotinylated oligonucleotide "sense” (Seq. ID No. 10) and then with the Cy TM 3-labeled oligonucleotides "AT" (Seq. ID No. 12, counter strand for perfect base pairing) or GT (Seq ID No. 13, counter strand for GT base mismatch) hybridized.
  • the mutS was then bound to the DNA double strands thus obtained in two different ways
  • the oligonucleotides are first labeled with a Concentration of 100 nM dissolved in histidine buffer and incubated for 5 min at 95 ° C.
  • the oligonucleotide "sense" was electronically addressed to defined positions of the two agarose chips in the charger of the Nanogen workstation for 60 seconds at a voltage of 2.0 V, the hybridization with the second strand oligonucleotides "AT" or GT for 120 seconds 2.0 V. The same for both chips
  • Chip A One of the chips (hereinafter referred to as Chip A) was then filled with 0.5 ml
  • Histidine buffer 50 mM L-histidine (Sigma, Deisenhofen); This solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 ⁇ m and degassed by negative pressure.
  • Phosphate block buffer 50 mM NaPO 4 , pH 7.4 / 500 mM NaCI / 3%
  • Bovine serum albumin (BSA; from Serva, Heidelberg)
  • High salt buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 300 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/1 mM DTT
  • Table 5 Loading scheme for chips A and B; "AT”: perfect pairing, positions were addressed with sense and then hybridized with "AT”; GT: GT mismatch, positions were addressed with sense and then hybridized with GT; sense: single strand sense, positions were addressed with sense, but were not hybridized with any opposite strand; ss' ⁇ T “: single strand” AT “, positions were only loaded with” AT ", without biotinylated first strand.
  • Table 8 Statistical evaluation of the results of Chip A and Chip B. The mean values and standard deviations of the fluorescence intensities of all positions with the same loading were calculated.
  • Table 8 shows that the Eco // - MBP mutS under low salt conditions
  • Base mismatches or insertions / deletions on DNA chips can be used.
  • the following types of DNA double strands were generated on the various positions of an electronically addressable agarose chip from Nanogen by hybridization: - Completely complementary double strands
  • Double strands containing one of the eight possible base mismatches (AA, AG, CA, CC, CT, GG, GT, TT)
  • Double strands in which one strand contains an insertion of 1, 2 or 3 bases.
  • the binding of E.co//-mutS to the DNA double strands thus obtained was then tested.
  • the first and second strand oligonucleotides with a concentration of 100 nM were first dissolved in histidine buffer and denatured at 95 ° C. for 5 min.
  • the electronic addressing of the biotinylated Oligonucleotides "sense" (Seq. ID No. 10) on the individual positions of the agarose chip were carried out in the charger of the Nanogen workstation for 60 seconds at a voltage of 2.0 V.
  • the chip was removed from the charger, filled with 1 ml of block buffer and incubated for 60 min at room temperature to saturate unspecific protein binding sites. The chip was then incubated with 10 ⁇ l Cy TM 5-labeled Eco // mutS (concentration: 50 ng / ⁇ l) in 90 ⁇ l incubation buffer for 60 min at room temperature. After this incubation, the chip was hand-held
  • Histidine buffer 50 mM L-histidine; this solution was through a membrane of
  • Block buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3%
  • Incubation buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/1% BSA
  • Wash buffer 20mM Tris, pH 7.6 / 50mM KCI / 5mM MgCl 2 / 0.1% Tween-20 -. - Different base mismatches.
  • Neg. Positions not loaded with DNA.
  • SsDNA positions loaded only with the single strand "sense”. All other positions were first addressed with the oligonucleotide "sense" and then hybridized with the second strand specified in the table.
  • Table 11 Statistical evaluation of the results of the agarose chip with different base mismatches. The mean values and standard deviations of the fluorescence intensities of all positions with the same loading were calculated. In addition, the Quotient determined from the corresponding mean and the value obtained with perfectly paired DNA ("AT").
  • Table 11 shows that the mean values of the fluorescence intensities for all mismatches and insertions tested are above the value obtained with the perfectly paired double strand.
  • the GT mismatch is best bound by mutS; the fluorescence values measured at these positions are approximately 7 times higher than with the perfectly paired DNA.
  • TT was only weakly recognized by mutS.
  • insertions of one or two bases can also be detected with the method described here (FIG. 11).
  • the loading of the hydrogel chip was carried out according to the protocol described in the example "Detection of different base mismatches by mutS", but both the addressing of the first strand oligonucleotide "sense" was carried out on the Hydrogel chip as well as the hybridization with the different second strands carried out at a voltage of 2.1 V.
  • the loading scheme is given in Table 9.
  • the loaded hydrogel chip was saturated with BSA, incubated with Cy TM 5-labeled Eco // mutS and washed according to the protocol given in the section "Detection of different base mismatches by mutS".
  • the mutS protein bound to the individual positions was then determined by measuring the red fluorescence intensity was detected using the same device settings as for the measurement of the agarose chip ("high gain", integration time 256 ⁇ s).
  • the measured relative fluorescence intensities are given in Table 12; the results of the statistical evaluation of the measurement data are shown in Table 13 and in FIG. 12.
  • Table 13 Statistical evaluation of the results of the hydrogel chip with different mismatches. The mean values and standard deviations of the fluorescence intensities of all positions with the same loading were calculated. In addition, the quotient of the corresponding mean and the value obtained with perfectly paired DNA was determined for each mismatch.
  • Figure 12 shows the binding of Cy TM 5-labeled Eco // mutS to mismatched DNA double strands generated by hybridization on an electronically addressable hydrogel chip. The mean red fluorescence intensity is shown with standard deviation for the different
  • binding of the mutS proteins to various base mismatches was investigated using surface plasmon resonance technology. This was necessary to check whether all base mismatches were actually bound specifically by the proteins.
  • the surface plasmon resonance technology allows a more precise quantification of the binding events.
  • the "sense" (Seq. ID No. 11) biotinylated oligonucleotide at the 5 ' end and oligonucleotides partially complementary to this oligonucleotide (Seq. ID No. 12-22) (company Biospring, Frankfurt / Main) were synthesized.
  • oligonucleotides Hybridizes against the oligonucleotide "sense" to form fully paired double-stranded DNA (AT), double-stranded DNA with a base mismatch (AA, AC, AG, CC, CT, GG, GT, TT) or double-stranded DNA with an insertion of 1, 2 or 3 thymidine residues (Table 14).
  • oligonucleotides were taken up in buffer HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% (w / v) polysorbate 20, 5 mM MgCl 2 ) to a concentration of 2 pmol / ⁇ l.
  • the oligonucleotide "sense" was then with a
  • the oligonucleotides partially complementary to this oligonucleotide were applied under identical buffer conditions to the respective channels of the chip as in the example "Detection of point mutations by mutS on an electronically addressable hydrogel chip" in order to obtain the double-stranded DNA species shown in Table 14.
  • the chip surface was equilibrated with 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 50 mM KCI, 5 mM MgCI 2 , 0.01% Tween-20, 10% (v / v) glycerol.
  • the MutS-maltose binding protein fusion protein labeled with Cy TM 5 was taken up in the same buffer at a concentration of 0.1 ⁇ g / ⁇ l and applied to the chip at a flow rate of 5 ⁇ l / min.
  • the channels of the chip were then washed with 100 ⁇ l of the buffer 20 mM Tris-HCl pH 7.6, 50 mM KCI, 5 mM MgCl 2 , 0.01% Tween-20, 10% (v / v) glycerin rinsed, whereby non-specifically bound protein was washed away. After rinsing, the was -. double-stranded oligonucleotide bound protein amount (expressed as a resonance unit) determined (Table 14). It was shown that in addition to the CC base mismatch, in principle all base mismatches and insertions are better bound by the labeled fusion protein than the perfectly paired oligonucleotide "AT" (Table 14).
  • the fluorescent dye-labeled mutS protein that we have designed and produced is therefore able to do so To locate any possible mutation
  • the authors are not aware of any other fluorescent dye-labeled protein whose DNA-binding properties are retained after labeling, as is the case with the protein described here.
  • FIG. 13 shows an exemplary sensogram of mutS binding.
  • the change in mass over time (RU, resonance units) in the 4 channels of a Biacore SA chip is shown.
  • the biotinylated oligonucleotide "sense" was applied to channels 1-4 and hybridized with the respective counter-strands to create a perfectly paired double strand ("AT", channel 4) or DNA with the base mismatches GT (channel 1), CC (channel 3 ) or GG (channel 2).
  • Table 14 The binding of the MBP-mutS fusion protein to double-stranded oligonucleotides bound to the surface of Biacore TM SA chips with base mismatches (underlined bases) is shown.
  • AT Seq. ID No. 12
  • APC AT Seq. ID No. 25
  • AT Seq. ID No. 28
  • Brc AT Seq. ID No. 31
  • Met AT Seq. ID No. 34
  • MSH AT Seq. ID No. 37
  • p53 AT Seq. ID No. 40
  • Rb AT Seq. ID No. 43
  • GT for GT mismatch: GT (Seq. ID No. 13), APC GT (Seq. ID No. 26), with GT (Seq. ID No. 29), Brc GT (Seq. ID No. 32), Met GT (Seq. ID No. 35), MSH GT
  • the chips were removed from the charger, filled with 1 ml block buffer and more unsaturated for saturation Protein binding sites incubated for 60 min at room temperature. The chips were then incubated with 10 ⁇ l Cy TM 5-labeled Eco // mutS (concentration: 50 ng / ⁇ l) in 90 ⁇ l incubation buffer for 60 min at room temperature. After this incubation, the chips were washed by hand with 1 ml of incubation buffer, then inserted into the Nanogen reader and washed 70x with a 0.5 ml wash buffer at a temperature of 37 ° C. Finally, the Cy TM 5 and Cy TM 3 fluorescence intensities were measured on the individual positions of the chips in the Nanogen reader using the following device settings:
  • Histidine buffer 50 mM L-histidine; this solution was through a membrane of
  • Block buffer 20mM Tris, pH 7.6 / 50mM KCI / 5mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3% BSA
  • Incubation buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/1%
  • BSA Wash buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.1% Tween-20
  • the measured green fluorescence intensities are shown in Table 20 and the red fluorescence intensities in Table 21.
  • the green fluorescence intensities were lower overall than with the agarose chip.
  • the results of the statistical evaluation of the red fluorescence intensities are shown in Table 22 and in FIG. 15. The
  • Chip position 9/6 was not included in the evaluation due to the very low green fluorescence.
  • Table 15 Loading scheme of an agarose chip for the detection of the binding of Cy '5-labeled E. colimutS to GT base mismatches in different DNA double strands. Empty boxes do not symbolize positions loaded with DNA. All other positions were first addressed with the oligonucleotide mentioned in the top line and then hybridized with the second strand indicated in the bottom line.
  • Table 16 Measurement of the green fluorescence intensity of an agarose chip for checking the loading with Cy TM 3-labeled second-strand oligonucleotides. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 18 Statistical evaluation of the agarose chip with different, perfectly paired and GT mismatched DNA double strands. The mean values and standard deviations of the red fluorescence intensities of all positions with the same load were calculated. In addition, the quotient of the fluorescence after addition of the corresponding GT mismatching second strand and the fluorescence after addition of the completely complementary second strand was determined for each first strand. Positions 1/10, 2/4, 2/5, 2/6, 2/10 and 3/2 were not included in the evaluation due to their low green fluorescence.
  • Table 19 Loading diagram of a hydrogel chip for the detection of the binding of Cy 5-labeled E colimutS to GT base mismatches in different DNA double strands. Empty boxes do not symbolize positions loaded with DNA. All other positions were first addressed with the oligonucleotide mentioned in the top line and then hybridized with the second strand indicated in the bottom line.
  • Table 22 Statistical evaluation of the hydrogel chip with perfectly matched and GT mismatched DNA double strands. The mean values and standard deviations of the red fluorescence intensities of all positions with the same load were calculated. In addition, the quotient of the fluorescence after addition of the corresponding GT mismatching second strand and the fluorescence after addition of the completely complementary second strand was determined for each first strand. Position 9/6 was not included in the evaluation due to its low green fluorescence.
  • DNA or cDNA is isolated from a human or animal tissue, not all strands isolated have the same nucleotide sequence. This may be due to the fact that the donor organism for a mutation is heterozygous (i.e. the mutation is only present on one of the two homologous chromosomes in each cell) or that only a part of the cells in the tissue have a specific mutation. This situation occurs particularly often in tumors because tumor cells are genetically unstable. When such an inhomogeneous patient DNA is hybridized with a reference DNA, a mixture of mismatched and perfectly paired double strands will then form.
  • the first and second strand oligonucleotides were dissolved in histidine buffer (total concentration: 100 nM each) and denatured for 5 min at 95 ° C.
  • the electronic addressing of the biotinylated oligonucleotides "sense" or p53 se to the individual positions of the agarose chip from Nanogen took place in the charger of the Nanogen workstation for 60 seconds at a voltage of 2.0 V.
  • the hybridization with the various second-strand mixtures was carried out for 120 sec at 2.0 V.
  • the loading scheme is shown in Table 23. After loading, the chip was removed from the charger with 1 ml
  • Block buffer filled and incubated for saturation of non-specific protein binding sites for 60 min at room temperature.
  • the chip was then incubated with 10 ⁇ l Cy TM 5-labeled E.co//-mutS (concentration: 50 ng / ⁇ l) in 90 ⁇ l incubation buffer for 60 min at room temperature. After this incubation, the chip was washed by hand with 1 ml of incubation buffer, then inserted into the Nanogen reader and washed 70 times with 0.5 ml of washing buffer at a temperature of 37 ° C. Finally, the Cy TM 5 fluorescence intensities were measured on the individual positions of the chip in the Nanogen reader with the following device settings: high Sensitivity ("high gain”); 256 ⁇ s integration time. The measured relative fluorescence intensities are given in Table 24; the results of the statistical evaluation of the measurement data are shown in Table 25 and in FIGS. 16A and 16B.
  • Histidine buffer 50 mM L-histidine; this solution was through a membrane of
  • Block buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3%
  • Incubation buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20
  • Wash buffer 20mM Tris, pH 7.6 / 50mM KCI / 5mM MgCl 2 / 0.1% Tween-20
  • Table 23 Loading scheme of an agarose chip for the detection of the binding of Cy 5-labeled E colimutS to various mixtures of perfectly paired and GT-mismatched DNA double strands. Empty
  • Boxes do not symbolize positions loaded with DNA (negative controls). Boxes with bold letters indicate positions that were only loaded with a DNA strand (single strand controls). All other positions were first addressed with the biotinylated oligonucleotide mentioned in the top line and then hybridized with the second-strand mixture indicated in the second line. As an additional check, the positions marked with italics were loaded with a combination of first strand and a non-complementary second strand; hybridization should not occur here.
  • Table 24 Measurement of the red fluorescence intensity of an agarose chip for the detection of the binding of Cy 1M 5-labeled? .Co / z ' -nutS to various mixtures of perfectly matched and GT-mismatched DNA double strands. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Figure 16 shows the binding of Cy TM 5-labeled E.co//-mutS to various mixtures of perfectly paired and GT mismatched DNA double strands, which were generated by hybridization on an electronically addressable agarose chip. The mean red fluorescence intensity with standard deviation for the different double strands is shown in each case.
  • 16A shows the binding of mutS to those with the first strand “sense” and the complementary ones Oligonucleotides AT (perfect pairing) and GT (mismatching) double strands obtained.
  • 16B shows the binding of mutS to the double strands obtained with the oligonucleotide p53 se and the complementary counterstrands p53 AT (perfectly mating) and p53 GT (mismatching).
  • the tumor suppressor gene p53 plays an important role in the development of cancer (B. Vogelstein, K.W. Kinzler, Cell 70 (1992), 523-526); Accordingly, mutations in p53 can serve as a prognostic marker for the development of a tumor. Over 90% of all known mutations in p53 are in the
  • the numbering of the cell lines follows the identification by the DSMZ.
  • MCF-7 (DSMZ ACC 1 15) is an adenocarcinoma cell line derived from mammary gland epithelium; no mutations in p53 are known (Landers JE et al. Translational enhancement of mdm2 oncogene expression in human tumor cells containing a stabilized wild-type p53 protein. Cancer Res. 57: 3562-3568, 1997)
  • SW-480 (DSMZ ACC 313): established from a human colorectal adenocarcinoma, contains a G to A mutation in codon 273 of exon 8 of the p53 gene (Weiss J et al. Mutation and expression of the p53 gene in malignant melanoma cell lines. Int. J. Cancer 54: 693-699, 1993)
  • MOLT-4 human T-lymphoblast cell line, contains a G to A mutation in codon 248 of exon 7 of p53 (Rodrigues NR et al. P53 mutations in colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sei USA 87: 7555-7559, 1990)
  • DSMZ ACC 305 is a human embryonic transformed with adenovirus
  • Renal epithelial cell line for which no mutations in p53 exon 8 have been published.
  • cell line SW-480 and possibly cell line 293 contains a mutation in exon 8 of the p53 gene.
  • Exon 8 was amplified from the genomic DNA of the cell lines described by polymerase chain reaction (PCR).
  • the respective PCR products (length: 237 bp) were then hybridized on a hydrogel chip with a synthetic oligonucleotide (length: 73 bases), the sequence of which corresponded to the wild-type sequence of the region to be examined.
  • the chip was equipped with a single-strand-specific endonuclease (mung bean nuclease) and a Single strand binding protein treated. The binding of dye-labeled Eco / mutS to the different double strands was then investigated.
  • the amplification was carried out in a thermal cycler (GeneAmp PCR System 2400, Perkin Elmer, Langen, Germany) under the following conditions: initial denaturation: 95 ° C, 2 min
  • the PCR products were then purified using the QIAquick PCR Purification Kit from QIAGEN. This purification was carried out according to the manufacturer's instructions, but an additional washing step with 75% ethanol was carried out before the DNA was eluted. The DNA was finally eluted in 50 ul water.
  • QIAquick PCR Purification Kit from QIAGEN. This purification was carried out according to the manufacturer's instructions, but an additional washing step with 75% ethanol was carried out before the DNA was eluted. The DNA was finally eluted in 50 ul water.
  • the chip was removed from the charger, filled with equilibration buffer and the green fluorescence at the positions of the chip was measured in the Nanogen reader (device settings: medium gain, 256 ⁇ s integration time). The result of the measurement is shown in Table 2 ⁇ .
  • the chip was then coated with 1 ⁇ l of Mung Bean Nuclease (NEB, Frankfurt) + ⁇ 9 ⁇ l
  • Block buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3%
  • Incubation buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20
  • Wash buffer 20mM Tris, pH 7.6 / 50mM KCI / 5mM MgCl 2 / 0.1% Tween-20
  • Table 27 Loading diagram of a hydrogel chip for the detection of mutations in the exon ⁇ of the p53 gene in human cell lines. The individual positions were first addressed with the oligonucleotide mentioned in the upper line and then with the PCR product of the various cell lines (MCF-7, MOLT-4, SW-4 ⁇ O and 293) mentioned in the second line or with the oligonucleotides AT or GT hybridized. As a control, some positions were only loaded with first or second strand; empty boxes do not symbolize positions loaded with DNA.
  • Table 2 ⁇ Measurement of the green fluorescence intensity of the hydrogel chip before treatment with mung bean nuclease. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 29 Measurement of the green fluorescence intensity of the hydrogel chip after treatment with mung bean nuclease. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 30 Measurement of the red fluorescence intensity for the detection of the binding of Cy 5 -labeled E. coli mutS to double strands from a synthetic oligonucleotide and PCR products from different cell lines. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 31 Statistical expansion of the results of the hydrogel chip for the detection of mutations in exon ⁇ of the p53 gene in different cell lines. The mean values and standard deviations of the red fluorescence intensities of all positions with the same load were calculated.
  • FIG. 17 shows the binding of Cy TM 5-labeled Eco // mutS to double strands from a synthetic oligonucleotide and PCR products from different cell lines for the detection of mutations in exon 8 of the p53 gene. The mean red fluorescence intensity with standard deviation for the individual cell lines is shown in each case.
  • Oligonucleotide cExon ⁇ had been hybridized with the PCR product of the cell line SW-480: the fluorescence intensities were about 6.5 times higher than at the positions where the hybridization with the PCR products of the cell lines MCF-7, MOLT-4 or 293. With the method described here, it has thus been possible to detect the known base exchange mutation of the cell line SW-480 in codon 273 of the p53 gene. Under the chosen experimental conditions, this base exchange led to a GT mismatch, which was clearly recognized by the dye-labeled mutS. In contrast, in the case of cell line 293, for which there is no information about possible mutations in p53, very similar fluorescence intensities were measured as for line MCF-7, which contains no mutations in the p53 gene. This indicates that the cell line 293 also contains no base exchange in the area examined.
  • Protein is advantageous for the detection of mutations in genomic DNA, or whether these incubation steps can be omitted without loss of sensitivity.
  • four hydrogel chips were loaded with first and second strands according to the same scheme and then treated according to different incubation protocols.
  • the single-stranded, biotinylated PCR products are produced according to the following scheme: Genomic DNA from the MCF-7 cell line, which contains no mutation in the p53 gene, was used as the starting material for the PCR.
  • the amplification was carried out in a thermal cycler (GeneAmp PCR System 2400, Perkin Elmer, Langen, Germany) under the following conditions: initial denaturation (95 ° C, 2 min), followed by 31 amplification cycles (each 95 ° C, 30 sec - 62 ° C) , 30 sec - 72 ° C, 1 min) and final elongation (72 ° C, 10 min)
  • the PCR products were then purified using the QIAquick PCR Purification Kit from QIAGEN. This purification was carried out according to the manufacturer's instructions, but an additional washing step with 75% ethanol was carried out before the DNA was eluted.
  • QIAquick PCR Purification Kit from QIAGEN. This purification was carried out according to the manufacturer's instructions, but an additional washing step with 75% ethanol was carried out before the DNA was eluted.
  • DNA was finally eluted in 50 ul water.
  • the biotinylated single strands were isolated using magnetic, streptavidin-coated beads from DYNAL Biotech (Hamburg).
  • the PCR product was diluted with an equal volume of 2 ⁇ B&W buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 2 M NaCI), mixed with Dynabeads M-280 streptavidin and at 15 min
  • the “targets” were produced as described in the example “detection of mutations in genomic DNA” under “carrying out the polymerase chain reaction”.
  • SsPCR was diluted with an equal volume of 100 mM histidine buffer.
  • the biotinylated oligonucleotide cExon ⁇ (Seq. ID No. 47) and the oligonucleotides “APC se” (Seq. ID No. 24) used as positive and negative control, " APC AT “(Seq. ID No. 25) and” APC GT “(Seq. ID No. 26) were dissolved in a concentration of 100 nM in 50 mM histidine buffer. The cleaned as second strand
  • PCR products were mixed with an equal volume of 100 mM histidine buffer. All DNA strands were then denatured for 5 min at 95 ° C. The different first strands were electronically addressed to defined positions of the hydrogel chips in the charger of the Nanogen workstation for 60 seconds at a voltage of 2.1 V. The hybridization with the Cy TM 3-labeled
  • Chip A and B Two of the hydrogel chips (hereinafter referred to as chips A and B) were incubated with block buffer for 70 min at room temperature after loading. Chip B was then additionally incubated for 45 min with 22 ng / ⁇ l SSB (single-stranded DNA binding protein, USB Corporation, Cleveland, USA) in incubation buffer. Finally, both chips were incubated with 3 ⁇ l of Cy TM 5-labeled Eco // - MBP-mutS (concentration: 450 ng / ⁇ l) in 97 ⁇ l incubation buffer for 60 min at room temperature. The chips were then washed by hand with 1 ml of incubation buffer, inserted into the Nanogen reader and there 50x at a temperature of 37 ° C. with 0.25 ml each
  • Chips C and D were filled with equilibration buffer after loading and the green fluorescence measured on the positions of the chips in the Nanogen reader
  • the chips were then incubated for 45 min at 30 ° C. with 1 ⁇ l mung bean nuclease (NEB, Frankfurt) + 89 ⁇ l 1x mung bean nuclease buffer (NEB). After the nuclease digestion, the chips were washed with 20 ml equilibration buffer and then incubated with block buffer for 70 min at room temperature, after which chip D was additionally 45 min with 22 ng / ⁇ l SSB
  • Tween-20 Block buffer 20mM Tris, pH 7.6 / 50mM KCI / 5mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3% BSA
  • Incubation buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/1%
  • BSA Wash buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.1% Tween-20
  • Chip A without nuclease, without SSB
  • Chip B without nuclease, with SSB
  • Tables 35 and 36 The results of the green fluorescence measurement from Chip C (with nuclease, without SSB) before
  • Table 33 Measurement of green fluorescence from Chip A (without nuclease, without SSB). The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities after the incubation with mutS are indicated.
  • Table 34 Measurement of the red fluorescence of Chip A (without nuclease, without SSB) for the detection of the binding of Cy TM 5-labeled i? .Co / -MBP-mutS. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 36 Measurement of the red fluorescence from Chip B (without nuclease, with SSB) to detect the binding of Cy TM 5-labeled Ecoli-MEP-mutS. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 37 Measurement of the relative green fluorescence intensities of Chip C before the nuclease digestion.
  • Table 40 Measurement of the relative green fluorescence intensities of Chip D before the nuclease digestion.
  • Table 42 Measurement of the red fluorescence from Chip D (with nuclease, with SSB) for the detection of the binding of Cy 1M 5-labeled J E'.co / z-MBP-mutS. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 43 Statistical evaluation of the results of the hydrogel chips A-D. The mean values and standard deviations of the red fluorescence intensities of all positions with the same loading were calculated for each chip.
  • Chip B treated with SSB has already achieved a significant reduction in red background fluorescence and improved mutation detection.
  • Treatment with mung bean nuclease is very beneficial for the mutS-mediated detection of mutations in genomic DNA on electronically addressable microchips.
  • Incubation with SSB also has a positive effect on mutation detection.
  • Oligonucleotide as first strand (Fig. 18).
  • Oligonucleotides already single-stranded, so that no separation of the complementary strand is necessary.
  • the use of shorter oligonucleotides allows the position of a mutation that may be present to be more precisely restricted than when a longer PCR product is used as the first strand.
  • one or the other of the two protocols described here can prove to be particularly suitable for mutS-mediated detection of mutations in genomic DNA.
  • the first and second strand oligonucleotides were first dissolved in a concentration of 100 nM in histidine buffer and denatured for 5 min at 95 ° C.
  • the electronic addressing of the biotinylated oligonucleotide "sense" (Seq. ID
  • the chip was then incubated with 10 ⁇ l Cy TM 5-labeled Eco // mutS (concentration: 50 ng / ⁇ l) in 100 ⁇ l incubation buffer for 60 min at room temperature. After this incubation, the chip was washed manually with 10 ml wash buffer and then inserted into the Nanogen reader. There was washed 70x with 0.5 ml wash buffer at a temperature of 37 ° C.
  • mutS chip system is therefore suitable for the rapid optical detection of mutations.
  • Histidine buffer 50 mM L-histidine; this solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 ⁇ m and degassed under reduced pressure
  • Block buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3% BSA (Serva, Heidelberg)
  • Incubation buffer .20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5mM MgCl 2 / 0.01% Tween-20
  • Table 44 Loading scheme of a chip for the optical detection of the binding of Cy 5-labeled E colimutS to mismatches: all positions were first addressed with oligonucleotide "sense" (Seq. TJ) No.10), then the positions shown were Oligonucleotides "AT” (Seq. ID No. 12) and "GT” (Seq. ID No. 13) are addressed.
  • FIG. 20 shows the optical detection of mutations on electronically addressable DNA chips: FIG. 20A, the Cy TM 3 fluorescence shows an even loading of the chip with DNA, FIG. 20B, the Cy TM 5 fluorescence is in the positions with the Base mismatch (see Table 44) clearly visible and stands out well from the background.
  • Thermus aquaticus mutS I. Biswas and P. Hsieh, J. Biol. Chem 271, 5040-5048 (1996), obtained commercially from Biozym (Hess.-Oldendorf, Germany)
  • Thermus thermophilus HB8 mutS protein S. Takamatsu, R. Kato and S. Kuramitsu, Nucl. Acids Res. 24, 640-647 (1996), provided by Professor Kuramitsu, University of Osaka, Japan
  • the proteins were then placed on a 1 ml DEAE-Sepharose fast flow column (Pharmacia, Sweden), which was equilibrated with 10 ml of 10 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCI, 5 mM MgCI 2 , 10% glycerol, 0.1 mM PMSF.
  • Free dye active ester was removed by rinsing the column with 20 ml of 10 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCI, 5 mM MgCl 2 , 10% glycerol, 0.1 mM PMSF, and the protein was dissolved in 4 ml of 10 mM HEPES pH 7.9, 500 mM KCI , 5 mM MgCl 2 , 10% glycerol, 0.1 mM PMSF eluted. The intactness of the proteins after the purification was analyzed via SDS-PAGE.
  • the proteins were dialysed twice for at least 3 hours against 21 10 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCI, 5 mM MgCl 2 , 10% glycerol, 0.1 mM PMSF and stored in 25 ⁇ l aliquots at -80 ° C.
  • the protein concentrations of the different mutS proteins were first determined using the Bradford method. Depending on the protein concentration (0.1-1 mg / ml)
  • the marking efficiencies are within an order of magnitude.
  • Double strands containing one of the eight possible base mismatches (AA, AG, CA, CC, CT, GG, GT, TT),
  • Double strands in which one strand contains an insertion of 1, 2 or 3 bases.
  • the first and second strand oligonucleotides were first dissolved in a concentration of 100 nM in histidine buffer and denatured for 5 min at 95 ° C.
  • the electronic addressing of the biotinylated oligonucleotide "sense" (Seq. ID No. 10) to the individual positions of the hydrogel chip was carried out in the charger of the Nanogen workstation for 60 seconds at a voltage of 2.1 V.
  • the hybridization with the second strand oligonucleotides AT (Seq. ID No. 12), GT (Seq. ID No. 13), AA (Seq. ID No. 14), AG (Seq. ID No. 15), CA (Seq. ID No. 16), CC (Seq. ID No. 17),
  • CT (Seq. ID No. 18), GG (Seq. ID No. 19), TT (Seq. ID NOr. 20), ins + 1T (Seq. ID No. 21), ins + 2T (Seq. ID No . 22) and ins + 3T (Seq. ID No. 23) was carried out at 2.1 V for 120 sec.
  • the loading scheme is shown in Table 45; the name of each second-strand oligonucleotide indicates the mismatch or insertion ("ins") that occurs during hybridization.
  • the chips were removed from the charger, filled with 1 ml of block buffer and incubated for 60 min at room temperature to saturate unspecific protein binding sites.
  • the binding of E.co// ' mutS (ChipA), MBP-MutS (ChipB), Thermus aquaticus mutS (ChipC) and Thermus thermophilus mutS (ChipD) to the DNA double strands thus obtained was then tested.
  • the chips were incubated with 2-3 ⁇ g of the Cy TM 5-labeled mutS proteins in 100 ⁇ l incubation buffer for 60 min.
  • the chips with E.co//-mutS and MBP-MutS were incubated at room temperature, the chips with Thermus aquaticus mutS and Thermus thermophilus mutS at 37 ° C. After this incubation, the chips from
  • thermophilic proteins surprisingly bind particularly well to insertion mutations. They are therefore suitable for a detection system of only insertion / de! Etion mutations and G / T base mismatches.
  • both the E. coli mutS and the MBP MutS are suitable for the detection of a broad spectrum of base mismatches.
  • the E. coli protein also provides the strongest absolute signals.
  • the proteins from T. thermophilus and T. aquaticus preferentially bind to mismatches that result from insertions / deletions. This can be used to quickly detect this subtype of mutations.
  • Histidine buffer 50 mM L-histidine; this solution was filtered through a membrane with a pore size of 0.2 ⁇ m and degassed under reduced pressure
  • Block buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3% BSA (Serva, Heidelberg)
  • Incubation buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20
  • Wash buffer 20mM Tris, pH 7.6 / 50mM KCI / 5mM MgCl 2 / 0.1% Tween-20
  • Table 45 Loading scheme of chips for the detection of the binding of Cy 5-labeled mutS to different base mismatches. "Neg.”: Positions not loaded with DNA. "SsDNA”: only with the Single strand “sense” loaded positions. All other positions were first addressed with the oligonucleotide "sense” and then hybridized with the second strand specified in the table.
  • Table 46 Measurement of the red fluorescence from Chip A to detect the binding of Cy 5-labeled E. coli mutS to different base mismatches. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 48 Measurement of the red fluorescence from Chip C to detect the binding of Cy 5-labeled Thermus aquaticus mutS to different base mismatches. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 49 Measurement of the red fluorescence from Chip D to detect the binding of Cy 5-labeled Thermus thermophilus mutS to different base mismatches. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • mutS from E. coli, T. aquaticus, T. thermophilus and the MBP-mutS fusion protein were tested by means of biacore measurements.
  • the analyzes were carried out on a Biacore2000 SPR biosensor (Biacore AB) at 22 ° C. in a running buffer made of 20mM HEPES (pH7.4), 50mM KCI, 5mM MgCI 2 and 0.005% Tween20 (protein grade, Calbiochem).
  • the DNA oligonucleotides were immobilized on a streptavidin-coated surface of an SA sensor chip (Biacore AB) up to a surface density of 70 RU. An SA surface without DNA served as the control surface.
  • the proteins were diluted in the running buffer in order to obtain a series of concentrations of 8 different concentrations of the respective protein, which were successively carried out over the
  • the data evaluation was done with the help of the biaevaluation software version 3.1.
  • the signals from the control surface were subtracted from the signals from the individual surfaces and the curves were normalized to the start of injection.
  • the association and dissociation rate constants were determined either separately or via a global fit with a Langmuir 1: 1 binding model.
  • the affinities were determined either separately or via a global fit with a Langmuir 1: 1 binding model.
  • the binding of the GT mismatch for the four mutS variants (A: E. coli, B: T. thermophilus, C: T. aquatiqus, D: MBP-mutS) is shown by way of example in FIGS Association and dissociation constants are shown in FIG. 22.
  • the high specificity of the mutS protein from T thermophilus for + 1T (FIG. 23B), for + 2T (FIG. 25B), for + 3T (FIG. 27B) compared to the MBP mutS (E. coli)
  • FIGS. 23A, 25A, 27A Fusion protein (FIGS. 23A, 25A, 27A) is shown in FIGS. 23, 25, 27, the graphic representation of the determined constants gives FIG. 24 for the insertion + 1T, FIG. 26 for the insertion + 2T and FIG. 28 for the insertion + 3T again.
  • Fig. 21 A 2.5 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM 39 nM, 79 nM, 158 nM
  • Fig. 21B 3.5 nM, 7 nM, 14 nM, 27 nM, 55 nM, 110 nM, 219 nM, 438 nM
  • Fig. 21C 3.4 nM, 7 nM 14 nM 28 nM 55 nM, 1 10 nM 221 nM, 441 nM Fig. 21 D: 2.8 nM, 5.7 nM, 1 1 nM, 23 nm, 45 nm, 91 nm 182 nm 363 nm
  • 23A, 25A, 27A 5.7 nM, 1 1 nM, 23 nM, 45 nM 91 nM 182 nM, 363 nM, 726 nM Fig. 23B, 25B, 27B: 3.5 nM, 7 nM, 14 nM , 27 nM, 55 nM, 110 nM, 219 nM, 438 nM
  • the Au electrodes (CH-Instruments, Austin, USA) were cleaned by polishing the electrode surface with a 0.3 ⁇ m alumina suspension (LECO, St. Joseph, USA) and subsequent rinsing with Millipore water (10 M ⁇ cm) , The subsequent electrochemical cleaning of the electrodes was carried out in 0.2 M NaOH using cyclic voltammetry (potentiostat: EG&G PAR 273A, GB), the electrodes first 5 times between potentials of -0.5 and -1.8 V (against Ag / AgCI- Reference electrode (Metrohm GmbH & Co, Filderstadt, D) 3 M NaCI) and then cycled 3 times between -0.3 and 1.1 V (feed rate 50 mV sec " 1 ). A platinum rod serves as the counter electrode for cyclic voltammetry (Metrohm).
  • the 5 ' -SH-modified oligonucleotide hairpins (Interactiva, Ulm, D) (Seq. ID No. 50 and Seq. ID No. 51) are connected by incubating the cleaned Au electrodes with a 100 ⁇ M solution of the corresponding thiol -modified oligonucleotides in 0.9 M phosphate buffer (pH 6.6, Calbiochem; addition of 0.5 mM
  • Dithiothreitol (DTT, Sigma-Aldrich, Steinheim, D)) for 6.5 h.
  • the resulting oligonucleotide monolayers were characterized by blocking the diffusion-controlled Fe (II / III) redox reaction in aqueous K3 / K4Fe (CN) 6 solution (salts from Merck, Darmstadt, D) (20 mM in 20 mM phosphate buffer pH 7) checked using cyclic voltammetry (CV).
  • the gaps between the individual oligonucleotide molecules on the monolayer were filled by incubating the electrodes in a 1 mM solution of 6-mercaptohexanol (Aldrich, USA) in Millipore water (degassed) for 60-90 minutes
  • the electrodes were stored in 1 M phosphate buffer at 4 ° C. until the actual measurement.
  • the individual electrodes were in aqueous K3 / K4Fe (CN) 6 solution (Darmstadt, D) (20 mM in 20 mM Tris buffer, 100 mM KCI, 5 mM MgCI) in the frequency range from 100 MHz to 1 MHz to 100 MHz and before measure after incubation with MutS.
  • the Measured values are shown in the Bode diagram. The measurements were carried out on an IM 6e impedance measuring station from Zahner Messtechnik at room temperature.
  • Nucleic acid sequence: 5 ' -3 ' X amino modifier dT MutS substrate Seq. ID No. 50 ATT CGA TCG GGG CGG GGC GAG CTT TTX GCT CGC CTT
  • GCC CCG ATC GAA T Seq. ID No. 51 ATT CGA TCG GGG CGG GGC GAG CTT XTT GCT CGC CCC
  • Impedance spectroscopy was used for the electrochemical investigation. With this examination method, an AC voltage is applied to the system to be examined, the frequency of which varies and the AC resistance is measured in the process. In particular, computer-aided
  • FIG. 29A shows two measurements of the sequence Seq ID No. containing two GT mismatches. 50
  • Fig. 29B shows two measurements using Seq ID
  • This example is intended to show that the detection of mutations with fluorescent dye-labeled mutS from E. coli as a mispairing substrate works in a wide range of DNA concentrations.
  • the individual positions of a hydrogel chip were loaded with differently concentrated solutions of perfectly mating or GT mismatching first and second strand oligonucleotides and the binding of mutS to the respective positions was then determined.
  • the oligonucleotides used were each dissolved in several different concentrations (100 nM, 33 nM, 10 nM, 3.3 nM, 1 nM and 0.33 nM) in histidine buffer and denatured for 5 min at 95 ° C.
  • Oligonucleotides "sense" (Seq. ID No. 10) on the individual positions of a hydrogel chip were carried out in the charger of the Nanogen workstation for 60 seconds at a voltage of 2.1 V.
  • the loading scheme is shown in Table 52.
  • the chip was removed from the charger, filled with 1 ml of block buffer and incubated for 60 min at room temperature to saturate unspecific protein binding sites.
  • the chip was then incubated with 10 ⁇ l of Cy5-labeled E. co // mutS (concentration: 50 ng / ⁇ l) in 90 ⁇ l incubation buffer for 60 min at room temperature.
  • the chip was washed by hand with 1 ml of incubation buffer, then inserted into the Nanogen reader and washed 50 times with 250 ⁇ l of washing buffer at a temperature of 37 ° C.
  • the Cy TM 5 fluorescence intensity was measured on the individual positions of the chip in the Nanogen reader with the following device setting: high sensitivity ("high gain”); 256 ⁇ s integration time.
  • Histidine buffer 50 mM L-histidine, filtered through a 0.2 ⁇ m membrane and degassed
  • Block buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20/3%
  • Incubation buffer 20 mM Tris, pH 7.6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI 2 / 0.01% Tween-20
  • Wash buffer 20mM Tris, pH 7.6 / 50mM KCI / 5mM MgCl 2 / 0.1% Tween-20
  • Table 52 Loading diagram of a hydrogel chip with differently concentrated first and second strands. The individual positions were first loaded with the respective concentration of the biotinylated oligonucleotide "sense” and then hybridized with the second strand oligonucleotides "AT” or “GT” in the concentrations listed. As a control, some positions were only loaded with first or second strand ; Position 6/2 remained free as a reference electrode.
  • Table 53 Measurement of the red fluorescence intensity of the hydrogel chip loaded with differently concentrated OMgonucleotides for the detection of the binding of Cy5-labeled E. coli-matS. The positions of the chip with the associated relative fluorescence intensities are indicated.
  • Table 54 Statistical evaluation of the mutS binding on the hydrogel chip loaded with differently concentrated oligonucleotides. The mean values and standard deviations of the red fluorescence intensity of all positions with the same load were calculated.
  • the concentration of the "sense" oligonucleotide used as the first strand was 100 nM in each case; the oligonucleotides AT and GT used as the second strand were used in the concentrations indicated in the diagram.
  • the mean red fluorescence intensity after mutS binding is shown for the individual second strand concentrations ,
  • Figure 31 shows the first strand dilution series.
  • the “sense” oligonucleotide used as the first strand was used in the concentrations indicated in the diagram.
  • the concentration of the oligonucleotides AT and GT used as the second strand was 100 nM in each case.
  • the mean red fluorescence intensity after mutS binding is shown for the individual first strand concentrations
  • 32 shows the simultaneous dilution of first and second strand.
  • the "sense" oligonucleotide used as the first strand and the oligonucleotides AT and GT used as the second strand were diluted equally; the concentrations used are indicated in the diagram.
  • the middle red is shown for the individual oligonucleotide concentrations
  • the GT mismatch of mutS is more strongly bound by a factor of 7.5 than the perfect pairing (AT), and even when using 10 nM second-strand solutions, the GT mismatch is still a factor of 1, 7 recognized compared to the perfect pairing.
  • the concentration of the first-strand solution used is lowered at a constant second-strand concentration of 100 nM, the GT mismatch is bound even more strongly by mutS than the perfect pairing at a first-strand concentration of only 1 nM (Fig. 31).

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Mutationen parallel in verschiedenen Nucleotidsequenzen nachgewiesen werden können, wobei das Verfahren daneben die Bestimmung der Transkriptionsrate von mutierten und nicht mutierten Nucleotidsequenzen erlaubt. Das Verfahren umfasst die Verfahrensschritte der Hybridisierung einzelsträngiger Proben-Nucleotidsequenzen mit einzelsträngigen Referenz-Nucleotidsequenzen, Fixierung von einzelsträngigen Referenz-Nucleotidsequenzen oder einzelsträngigen Proben-Nucleotidsequenzen vor oder während der Hybridisierung oder von Heteroduplices aus Referenz- und Proben-Nucleotidsequenzen nach oder während der Hybridisierung auf einer elektronisch adressierbaren Oberfläche, Inkubation mit einem Heteroduplex-Fehlpaarungen erkennenden Substrat und Detektion der Substratbindungen.

Description

Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen
Beschreibung:
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren, mit dem Mutationen parallel in verschiedenen Nucleotidsequenzen nachgewiesen werden können, wobei das Verfahren daneben die Bestimmung der Transkriptionsrate von mutierten und nicht mutierten Nucleotidsequenzen erlaubt.
Es ist bekannt, dass die DNA-Sequenzen der meisten Gene des menschlichen Organismus in Proteinsequenzen umgeschrieben werden. Die Aktivität eines Proteins, beispielsweise eines Enzyms, wird dabei in unterschiedlichen Individuen oder Zelltypen durch mehrere Faktoren festgelegt: Zum einen bestimmt die Transkriptionsaktivität des jeweiligen Gens, wie viele Kopien des Proteins in einer Zelle vorhanden sind. Zum anderen können Mutationen die Aktivität eines Proteins beeinflussen. So führen eine verminderte Transkriptionsrate oder eine reprimierende Mutation zur Verringerung der Proteinaktivität ("loss-of-function"), während eine erhöhte Transkriptionsrate oder eine der selten auftretenden aktivierenden Mutationen zur Erhöhung der Proteinaktivität führen ("gain-of-function"). Weitere Faktoren, wie die Translationsregulation und posttranslationale Modifikationen, können die Aktivität von Proteinen darüber hinaus ebenfalls beeinflussen. Obwohl sich zwei Individuen oder Zelltypen auf der genomischen Ebene fast gleichen, bedingen diese Faktoren letztlich große Unterschiede im Hinblick auf Anatomie, Physiologie, Pathologie und die Reaktion auf pharmakologische Wirkstoffe. Da die meisten Krankheiten durch eine veränderte Proteinaktivität verursacht werden und da pharmazeutische Wirkstoffe die Aktivität bestimmter Proteine regulieren, eignet sich eine Untersuchung der Faktoren "Transkription" und "Mutation" ganz besonders für die klinische Diagnostik und auch für die Identifizierung von pharmakologischen Targets. So können Unterschiede im Expressionsniveau bestimmter Gene unterschiedliche Reaktionen auf Medikamente bei verschiedenen Patienten bedingen. Allerdings sind bisher nur wenige Gene wie das MDR-Gen (multi drug resistance gene) (S. Akayama et al., Hum. Cell 12, 95-102, 1999) dazu eingehender untersucht worden. Im Gegensatz dazu ist eine Reihe von Medikamenten bekannt, bei denen Mutationen in bestimmten Genen zu einer Medikamentenunverträglichkeit oder einem Therapieversagen führen (W. H. Anderson, New Horizons 7, 262-269, 1999). Vor der Therapie mit diesen Wirkstoffen sollten Patienten daher auf das
Vorhandensein der jeweiligen Mutation hin untersucht werden, um eine falsche Medikation zu verhindern. Dies ist heute jedoch nur in Einzelfällen möglich, da es selten gelingt, eine Medikamentenunverträglichkeit einem spezifischen Genotyp zuzuordnen. Dies liegt vor allem an dem Fehlen geeigneter Testverfahren, mit denen Genotypenanalysen im Hochdurchsatzverfahren in einer angemessenen Zeit möglich sind. Die Entwicklung derartiger Testverfahren wäre jedoch sehr wünschenswert, da z. B. allein in den USA jährlich ca. 100.000 Menschen durch Medikamentenunverträglichkeit sterben. Darüber hinaus könnten durch konsequente Nutzung derartiger Testverfahren Medikamente zugelassen werden, deren Fehlversagen bei einer Patientengruppe einer bestimmten Mutation zugeordnet werden kann. Dazu muss ein solches Testverfahren diese Patientengruppe zuverläßlich identifizieren, um die Verabreichung dieses Medikamentes an sie ausschließen zu können. Dazu müssten Kandidatengene vieler Patienten prospektiv auf eine mit der Medikamentenunverträglichkeit oder -Unwirksamkeit korrelierende Mutation hin untersucht werden. So könnte die Bestimmung von Mutationen und
Transkriptionsraten ein wichtiges Werkzeug bei der Entscheidung für oder gegen eine Therapie mit einem gegebenen Wirkstoff darstellen. Die Berücksichtigung oder Untersuchung genotypischer Besonderheiten von Individuen bei der Therapie oder Vorsorge wird als "Pharmacogenomics" bezeichnet und dürfte einen entscheidenden Teil zukünftiger medizinischer Aktivitäten ausmachen. Entscheidend dabei wird sein, dass Testverfahren etabliert werden können, die zum einen einen hohen Probendurchsatz in angemessener Zeit gewährleisten und zum anderen äußerst zuverlässige Testergebnisse liefern.
Bisher werden Veränderungen der Transkriptionsrate bestimmter Gene mit unterschiedlichen Methoden zum RNA-Nachweis wie z. B. Northern Blot, RNAse Protection, RT-PCR und high density filter arrays oder indirekt über Nachweismethoden für die gebildeten Proteine wie Western Blot, RIA oder ELISA bestimmt. All diese Verfahren haben sich zur Untersuchung von einzelnen Proben als geeignet erwiesen, erlauben aber keinen hohen Probendurchsatz.
Zur Erhöhung des Probendurchsatzes wurde eine neue Methode zur hochparallelen Analyse der Expressionsprofile multipler Gene, basierend auf der DNA- Chiptechnologie entwickelt (D. J. Lockhart und E. A. Winzeler, Nature 405, 827ff, 2000). Hierbei werden DNA-Sequenzen auf die Chipoberfläche aufgebracht, mit denen die mRNA oder cDNA aus einer biologischen Probe sequenzspezifisch hybridisieren und einfach nachgewiesen werden kann.
Um eine beschleunigte Hybridisierung von Nucleotidsequenzen und damit eine Verringerung der Meßzeiten zu erreichen, wurden bereits mehrere Verfahren von der Firma Nanogen (San Diego/USA) entwickelt und publiziert, welche es dem Anwender erlauben, durch elektronische Adressierung von DNA-Sequenzen benutzerdefinierte DNA-Chips herzustellen (R.G. Sosnowski et al., Proc. Natl. Acad.
Sei. USA, 94, 1 1 19-1 123, 1997) (US 6,068,818; US 6,051 ,380; US 6,017,696; US 5,965,452; US 5,849,486; US 5,632,957; US 5,605,662). Die gewöhnlich mit Biotin konjugierte DNA wird dabei durch ein elektrisches Feld auf eine Testelektrode bewegt und bindet dort mit hoher Affinität an Streptavidin, welches in der über der Elektrode befindlichen Permeationsschicht enthalten ist. Die anschließende
Hybridisierung wird ebenfalls durch elektronische Adressierung innerhalb kürzester Zeit ermöglicht. Jede einzelne der gewöhnlich 99 Testelektroden eines solchen Chips ist individuell ansteuerbar; dies erlaubt im Gegensatz zu anderen Chiptechnologien die voneinander unabhängige Prozessierung mehrerer Proben. Die beschriebenen Verfahren eignen sich zum Nachweis von Nucleotidsequenzen in einer Probe, ein Mutationsnachweis mit hohem Probendurchsatz ist allerdings mit den dort beschriebenen Verfahren alleine nicht möglich.
Bei der Entwicklung neuer Testverfahren zur Erkennung von Mutationen steht der Nachweis von Punktmutationen im Vordergrund. Punktmutationen (Single nucleotide polymorphisms, SNPs) stellen die häufigste Ursache der genetischen Variation innerhalb der menschlichen Population dar und treten mit einer Häufigkeit von 0,5 bis 10 pro 1.000 Basenpaare auf (A.J. Schafer und J.R. Hawkins, Nature Biotechnol, 16, 33-39, 1998). Die Korrelation von SNPs mit phänomenologischen Effekten bleibt allerdings schwierig. So konnten bislang, trotz des Auffindens vieler SNPs, nur wenige bestimmten Medikamentenunverträglichkeitsreaktionen zugeordnet werden (W. H. Anderson, New Horizons 7, 262-269, 1999). Ein bekanntes Beispiel ist eine Mutation in dem Faktor IX-Propeptid, die zu starken Blutungen bei der antikoagulanten Therapie mit Cumarin führt (J. Oldenburg et al., Brit. J. Hematol. 98 (1997), 240-244). Die im Verlauf des Human-Genomprojekts gewonnenen Sequenzdaten ermöglichen heute jedoch grundsätzlich eine schnelle Zuordnung eines identifizierten SNPs zu einer Medikamentenunverträglichkeit. Daher wurden verschiedene Methoden zum Nachweis bislang unbekannter SNPs entwickelt (DJ.
Fu et al., Nature Biotechnol. 1998, 16, 381-384; Fan et al., Mut. Res. 288 (1993), 85- 92; N.F. Cariello und T.R. Skopek, Mut. Res. 288 (1993), 103-1 12; P.M. Smooker und R.G. Cotton, Mut. Res. 288 (1993), 65-77). Diese Verfahren eignen sich jedoch weder für einen hohen Probendurchsatz noch weisen sie die für die klinische Diagnostik erforderliche Genauigkeit auf (E.P. Lessa und G. Applebaum, Mol. Ecol.
2 (1993), 1 19-129). Neben diesen chemischen oder physikalischen Verfahren wurden auch einige biologische Verfahren entwickelt (G.R. Taylor und J. Deeble, Genetic Analysis: Biomolecular engineering, 14 (1999), 181 -186). Viele dieser biologischen Verfahren nutzen die Eigenschaft von Proteinen der mutS-Familie, selektiv an mutationsbedingte Basenfehlpaarungen zu binden (P. Sachadyn et al.,
Nucl. Acids Res. 28 (2000) e36; A. Lishansky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91 (1994), 2674-2678; WO 99/06591 , US 6 033 681 , WO 99/41414, WO 99/39003 und WO 93/22462). Wegen ihrer Kompliziertheit haben sich diese Methoden allerdings bislang nicht in der Praxis durchsetzen können (G. R. Taylor und J. Deeble, Genetic Analysis: Biomolecular engineering, 14 (1999), 181-186). Bei den beschriebenen
Methoden, die z. T. bereits in den frühen 80er Jahren entwickelt wurden, werden Heteroduplices aus dem Strang einer DNA bekannter Sequenz sowie dem komplementären Strang mit unbekannter Sequenz erzeugt (z.B. A.LLu et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, p4639-4643, 1983). Weist die unbekannte Sequenz gegenüber der komplementären bekannten Sequenz eine Mutation auf, können die dadurch entstehenden Basenfehlpaarungen von Reparaturproteinen wie mutS gebunden werden, wodurch die Mutation nachgewiesen werden kann (S.S.Su und P. Modrich, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, p 5057-5061 , 1986). Der so entstandene Komplex kann entweder direkt (z.B. W09512688), indirekt (z.B. WO93/02216) oder durch eine weitere enzymatische Behandlung (z.B. WO9529258) nachgewiesen werden, wobei das mutS Protein auch immobilisiert vorliegen kann (WO9512689).
Bei allen bereits publizierten Methoden werden die DNA-Heteroduplices durch passive Hybridisierung in einem geeigneten Puffersystem erzeugt (z.B. C. Bellanne- Chantelot et al., Mutation Research 382, 35-43, (1997)). Um den Probendurchsatz zu erhöhen, können die Heteroduplices mehrerer Gene, jedoch nicht mehrerer Individuen, auf einem Array durch passive Hybridisierung erzeugt werden (WO9906591 ). Bei der passiven Hybridisierung mehrerer Sequenzen kommt es jedoch zu mehr oder minder ausgeprägten Kreuzhybridisierungen. Dabei entstehen unweigerlich Basenfehlpaarungen, die dann von mutS gebunden werden, ohne dass eine der beteiligten Sequenzen eine Mutation aufweist. Dadurch entsteht ein hoher Hintergrund, Mutationen werden "überdeckt". Dieses Problem wurde bislang nur teilweise durch die Verwendung von einzelstrangbindendem Protein (SSB) gelöst
(Gotoh et al., Genetic Analysis 14, 47-50 (1997)). Weiterhin ist es mit den herkömmlichen passiven Arrays nicht möglich, eine einzelne Gensequenz mehrerer Individuen parallel auf Mutationen zu überprüfen, wie es für pharmacogenomische Untersuchungen relevant wäre. Ein weiterer großer Nachteil der mutS Technologie in Verbindung mit passiven DNA Arrays ist außerdem die lange Dauer der
Hybridisierung von bis zu 14 Stunden (WO9906591 ).
Es sind somit keine Verfahren bekannt, die zur Identifikation von SNPs, insbesondere von unbekannten SNPs, bei hochparallelisiertem Probendurchsatz geeignet sind. Es ist insbesondere kein Verfahren bekannt, mit welchem unter
Verwendung der DNA-Chiptechnologie unbekannte SNPs schnell identifiziert werden können. Für eine routinemäßige Untersuchung von Probanden eines klinischen Versuchs und die damit verbundene Zuordnung eines Genotyps zu einer Medikamentenunverträglichkeit oder -Unwirksamkeit wäre ein solches Nachweissystem wegen seines hohen Probendurchsatzes aber gerade wünschenswert. Ein noch höherer Probendurchsatz ist bei der Medikation einer großen Gruppe von Patienten mit solchen Wirkstoffen erwünscht, bei denen es häufig zu Nebenwirkungen oder Therapieversagen kommt, wie z. B. bei der Brustkrebstherapie mit Antiöstrogenen.
Schließlich wäre ein Verfahren von Vorteil, mit dem die gleichzeitige Identifikation bislang unbekannter SNPs in einer DNA-Probe in Verbindung mit der Analyse der
Expressionsstärke von Genen möglich ist. Dies ist insbesondere für einzelne Untersuchungen, wie z. B. für die Targetvalidierung und das Patientenscreening, vorteilhaft.
Somit liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von
Mutationen in Nucleotidsequenzen bereitzustellen, das einen hohen Probendurchsatz in kurzer Zeit bei hoher Zuverlässigkeit erlaubt.
Ein solches Verfahren konnte überraschend in Form eines Arrays bereitgestellt werden, wobei eine Parallelisierung der Hybridisierungsreaktion möglich wird.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen gelöst, bei dem einzelsträngige Proben-Nucleotidsequenzen mit einzelstrangigen Referenz-Nucleotidsequenzen hybridisiert werden, wobei die einzelstrangigen Referenz-Nucleotidsequenzen oder einzelstrangigen Proben-
Nucleotidsequenzen vor oder während der Hybridisierung oder Heteroduplices aus Referenz- und Proben-Nucleotidsequenzen nach oder während der Hybridisierung ortsaufgelöst auf einem Träger fixiert werden und die Inkubation mit einem Heteroduplex-Fehlpaarungen erkennenden Substrat erfolgt, wobei die Substratbindung detektiert werden kann.
Bei einem bevorzugten Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen wird
a) eine definierte, einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotid-
Chip aufgetragen, b) die auf Mutationen zu untersuchende Nucleotidsequenz, die komplementär zur bekannten Nucleotidsequenz ist, wird ebenfalls auf den Chip aufgetragen und durch Hybridisierung beider Sequenzen wird eine Heteroduplex hergestellt, c) dann wird die Heteroduplex mit einem Fehlpaarungen erkennenden Substrat, bevorzugt einem markierten Substrat, inkubiert und d) die Fehlpaarungen werden durch Detektion des an ihnen angelagerten
Substrats nachgewiesen.
Als besonders zuverlässig und damit als besonders geeignet haben sich Verfahren erwiesen, bei denen nach der Hybridisierung etwaige auf dem Träger fixierte einzelsträngige Nucleotidsequenzen durch Zugabe einer Nuclease, bevorzugt einer
Mung Bean Nuclease oder S1 -Nuclease, abgebaut werden. Dies ist insbesondere überraschend, da z. B. die Zugabe von SSB als einzelsträngige Nucleinsäuren bindendes Protein nach der Hybridisierung nur geringen Einfluss auf die Bindung Fehlpaarungen erkennender Substrate besitzt.
Besonders geeignete Verfahren bezüglich der Steigerung des Probendurchsatzes konnten überraschend auf Basis einer elektronisch adressierbaren Oberfläche in Verbindung mit Fehlpaarungen erkennenden Substraten zur Verfügung gestellt werden, wobei mutationsspezifische Fehlpaarungen zuverlässig und wesentlich schneller aufgefunden werden können, als mit herkömmlichen passiven
Hybridisierungstechniken.
Dabei kann die Fixierung der einzel- oder doppelsträngigen Nucleotidsequenzen sowie die Hybridisierung elektronisch gesteuert, insbesondere elektronisch beschleunigt werden.
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform des beanspruchten Verfahrens zeichnet sich durch eine ortsaufgelöste, elektronisch beschleunigte Hybridisierung aus, wobei die Hybridisierungsbedingungen, wie z. B. die angelegte Stromstärke, die angelegte Spannung oder die Zeitdauer der elektronischen Adressierung, am jeweiligen Ort individuell eingestellt werden. Gleichzeitig mit oder nach der Hybridisierung kann dann der Nachweis der Basenfehlpaarung durch Zugabe eines Fehlpaarungen erkennden Substrates erfolgen. Mit diesen Verfahren können bekannte und unbekannte Punktmutationen sowie Insertions- und Deletionsmutationen schnell und unkompliziert identifiziert werden. Treten zwischen der fixierten Nucleotidsequenz und der zu untersuchenden Nucleotidsequenz Fehlpaarungen auf, so werden diese z. B. durch markierte
Basenfehlpaarungen-bindende Proteine oder durch eine elektronische Detektion erkannt. Damit ist ein Auslesen der Fehlpaarungen auf dem Chip möglich. Detektierbare Fehlpaarungen stellen z. B. die SNPs dar. Insbesondere wird mit den beschriebenen Verfahren die parallele Untersuchung mehrerer Induividuen auf Mutationen auf einem Chip möglich.
Zur weiteren Beschreibung der Erfindung werden folgende Begriffsdefinitionen eingeführt:
Der Ausdruck "Nucleotidsequenz" wird im Zusammenhang mit der Beschreibung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens nicht nur für Desoxyribonucleinsäure, sondern auch für RNA oder chemisch modifizierte Polynucleotide verwendet, wobei unter den Begriff der Desoxyribonucleinsäure auch cDNA fällt;
Der Ausdruck "Referenz-Nucleotidsequenz" bezeichnet eine Nucleotidsequenz-
Sequenz, bevorzugt eine DNA-Sequenz, die als Vergleichssequenz verwendet wird;
"Proben-Nucleotidsequenz" ist eine markierte Nucleotidsequenz, bevorzugt eine DNA-Sequenz, die auf Mutationen überprüft werden soll;
Ein "Nucleotid-Chip" ist durch eine in Zonen aufgeteilte Chip-Oberfläche gekennzeichnet, auf die jeweils Proben- oder bevorzugt Referenz- Nucleotidsequenzen aufgebracht werden;
"Genexpression" ist die Überführung der Erbinformation in RNA oder Protein.
Die elektronische Adressierung erfolgt durch Anlegen eines elektrischen Feldes, bevorzugt zwischen 1 ,5 V und 2,5 V bei einer Adressierungsdauer zwischen 1 bis 3 Minuten. Aufgrund der elektrischen Ladung der zu adressierenden Nucleotidsequenzen wird deren Wanderung durch Anlegen eines elektrischen Feldes stark beschleunigt. Die Adressierung kann dabei ortsaufgelöst erfolgen, dabei wird an unterschiedliche Zonen der Chipoberfläche nacheinander adressiert. Dabei können an den einzelnen Orten unterschiedliche Adressierungs- und
Hybridisierungsbedingungen eingestellt werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens werden zunächst mit Hilfe einer elektronischen Adressierung Nucleotidsequenz- Heteroduplices bestehend aus einer vorgegebenen Nucleotidsequenz, der Referenz-
Nucleotidsequenz, sowie der Komplementär-Nucleotidsequenz aus einer physiologischen Probe, der Proben-Nucleotidsequenz, auf einer Chipoberfläche erzeugt. Dabei entstehende Fehlpaarungen zeigen einen SNP der Proben- Nucleotidsequenz an und können durch ein Substrat nachgewiesen werden, das an der Fehlstelle bindet. Hierfür eignen sich Basenfehlpaarungen bindende Proteine.
Basenfehlpaarungen bindende Proteine können z. B. mutS oder mutY, bevorzugt aus E.coli, T. thermophilus oder T.aquaticus, MSH 1 bis 6, bevorzugt aus S.cerevisiae, S1 -Nuclease, T4-Endonuclease, Thyminglykosylase, Cleavase oder Fusionsproteine enthaltend eine Domäne dieser Basenfehlpaarungen-bindenden Proteine sein. Es sind jedoch auch andere Proteine oder Substrate hierfür einsetzbar, wenn sie in der Lage sind, eine Basenfehlpaarung in einem Nucleotidsequenz-Doppelstrang spezifisch zu erkennen und daran zu binden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann z. B. die Referenz-Nucleotidsequenz als biotinyliertes Oligonucleotid eingesetzt werden, das entweder synthetisiert oder durch eine Amplifikation mit sequenzspezifischen Oligonucleotiden, von denen eines am 5'-Ende biotinyliert ist, hergestellt wird. Danach wird die Referenz- Nucleotidsequenz durch Aufschmelzen, vorzugsweise in einer Pufferlösung mit niedrigem Salzgehalt, in den einzelstrangigen Zustand überführt und durch elektronische Adressierung auf eine vorgegebene Position eines Chips aufgebracht.
Geeignete Chips werden beispielsweise von der Firma Nanogen (San Diego/USA) in den Handel gebracht. Das Aufbringen der Referenz-Nucleotidsequenz kann beispielsweise mittels einer Nanogen Molecular Biology Workstation vorzugsweise unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Parameter erfolgen. Die Benutzung der Chips bzw. der Molecular Biology Workstation der Firma Nanogen erfolgt, soweit nicht anders angegeben, gemäß dem mitgelieferten Handbuch, weiterhin ist die Benutzung beschrieben in Radtkey et al., Nucl. Acids Res. 28, 2000, e17.
Auf den so vorbereiteten Chip kann nun die Proben-Nucleotidsequenz, welche komplementär zu der auf den Chip bereits aufgebrachten Sequenz ist, aufgetragen werden. Dazu werden farbstoffmarkierte Oligonucleotide synthetisiert oder durch eine Amplifikation mit sequenzspezifischen Oligonucleotiden, von denen eines am
5'-Ende farbstoffmarkiert ist, erzeugt. Dabei stellt das farbstoffmarkierte Nucleotid der Proben-Nucleotidsequenz den komplementären Gegenstrang zu dem biotinylierten Strang der Referenz-Nucleotidsequenz dar. Auch die Proben- Nucleotidsequenz muss vorher durch Aufschmelzen z. B. in einer Pufferlösung mit niedrigem Salzgehalt, in den einzelstrangigen Zustand überführt und durch elektronische Adressierung auf die biotinylierte Referenz-Nucleotidsequenz aufgebracht werden. Dadurch entsteht durch Hybridisierung eine Nucleotidsequenz- Heteroduplex bestehend aus Referenz-Nucleotidsequenz und Proben- Nucleotidsequenz. Auch die Herstellung der Heteroduplex kann auf einer elektronisch adressierbaren Oberfläche, z. B. mit einer Nanogen Molecular Biology
Workstation unter Verwendung der vom Hersteller angegebenen Parameter, erfolgen. Die erfolgreiche Hybridisierung kann z. B. durch Nachweis des an die Heteroduplex gekoppelten Farbstoffes optisch verfolgt und dabei quantitativ bestimmt werden.
Alternativ kann auch die Proben-Nucleotidsequenz biotinyliert und, wie eben beschrieben, elektronisch adressiert werden. Auch die Hybridisierung in Lösung mit anschließender elektronischer Adressierung ist möglich, wobei eine der beiden Nucleotidsequenzen der Heteroduplex biotinyliert ist. Neben der Derivatisierung mit Biotin können zur Fixierung von Nucleotidsequenzen auch andere molekulare
Gruppen verwendet werden, die auf einer elektronisch adressierbaren Oberfläche binden. So ist z. B. die Fixierung über eingeführte Thiolgruppen, Hydrazingruppen oder Aldehydgruppen ebenfalls möglich. Weist nun die Proben-Nucleotidsequenz eine Mutation gegenüber der Referenz- Nucleotidsequenz auf, so kommt es in der Heteroduplex zu einer Fehlpaarung. Zur Erkennung solcher Fehlpaarungen werden bevorzugt Proteine der mutS-Familie eingesetzt, die diese Fehlpaarungen mit hoher Spezifität erkennen. Besonders geeignet sind hierfür die Fehlpaarungen erkennenden mutS-Proteine aus E.coli und aus T. thermophilus, sowie mutS-Fusionsproteine, wie z. B. MBP-mutS. Das Fehlpaarungen erkennende Substrat wird bevorzugt im Überschuss zugegeben, wobei nicht gebundenes Substrat durch Waschen entfernt werden kann.
Das Fehlpaarungen erkennende Protein kann außer farbstofftragenden, lumineszierenden und fluoreszierenden Gruppen auch polymere Marker (J. Biotechnol. 35, 165-189, 1994), Metallmarker, enzymatische oder radioaktive Markierungen oder Quantum dots (Science Vol 281 , 2016, 25.Sep. 1998) enthalten. Die Enzymmarkierung kann dabei z. B. eine direkte Enzymkupplung oder ein
Enzymsubstrattransfer oder eine Enzym-Komplementation sein. Zur enzymatischen Markierung eignen sich vor allem die Chloramphenicol-Acetyltransferase, die alkalische Phosphatase, die Luciferase oder die Peroxydase.
Insbesondere die Substratmarkierung mit Farbstoffen, die im Bereich zwischen 400 und 800 nm Licht absorbieren oder emittieren ist bevorzugt. Unter den zur Markierung geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen sind vor allem Cy™3, Cy™5 (von Amersham Pharmacia), Oregon Green 488, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Bodipy 558/568, Bodipy 650/665, Bodipy 564/570 (z. B. von der Firma Mobitec, Deutschland), S 0535, S 0536 (z. B. von der Firma FEW, Deutschland), Dy-630-NHS, Dy-635-NHS, EVOblue30-NHS (z. B. von der Firma Dynomics, Deutschland), FAR-Blue, FAR-Fuchsia (z. B. von der Firma Medway, Schweiz), Atto 650 (von der Firma Atto Tech, Deutschland), FITC oder Texas Red zu bevorzugen. Neben den direkt markierten Substraten können auch markierte Antikörper verwendet werden, die direkt gegen mutS oder gegen eine fusionierte Peptiddomäne, wie z. B. MBP, gerichtet sind. Wird nun ein beispielsweise mit Farbstoff markiertes mutS-Protein mit der auf der Chipoberfläche gebundenen Heteroduplex-Nucleotidsequenz inkubiert, so bindet das Protein vorzugsweise an den Positionen des Chips, wo es zu Fehlpaarungen innerhalb der Heteroduplex gekommen ist. Die gebundenen farbstoffmarkierten mutS-Proteine können dann durch optische Sensoren, z. B. unter Verwendung der
Nanogen Molecular Biology Workstation in Verbindung mit einer geeigneten Auswertesoftware, quantitativ bestimmt werden.
Alternativ kann die Bindung des Fehlpaarungen erkennenden Substrates auch über elektrische Verfahren wie z. B. die Cyclovoltametrie oder die Impedanzspektrometrie
(z. B. beschrieben in WO 9734140) erfolgen. Diese elektrischen Methoden zur Auslesung eines Nucleotidchips zeichnen sich insbesondere dadurch aus, dass keine markierten Fehlpaarungen erkennenden Substrate verwendet werden müssen. Die elektrischen Detektionsverfahren eignen sich auch zur Detektion der Heteroduplexbildung. So kann es von Vorteil sein, elektrische und optische
Methoden zur Verfolgung einzelner Verfahrensschritte miteinander zu kombinieren. Alternative Verfahren zur Detektion eines Fehlpaarungen erkennenden Substrates sind die Messung der Oberflächenplasmonresonanz (z. B. in J. Pharm. Biomed. Anal. 22(6), 1037-1045, 2000), die Cantilever (z. B. beschrieben in Nature 1995 Jun 15, 375(6532), 532 oder in Biophysical Journal, 1999 Jun, 76(6), 2922-33) oder
Microcantilever-Technik (z. B. beschrieben in Science 288, 316-318, 2000) oder die Detektion mit akustischen Methoden (wie z. B. beschrieben in WO 9743631 ) oder durch gravimetrische Methoden.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich nicht nur zum Nachweis von
Genmutationen, sondern kann auch Unterschiede im Expressionsniveau der in verschiedenen Zellen oder Geweben exprimierten mRNA anzeigen. Dazu wird in einer bevorzugten Ausführungsform die mRNA in cDNA überführt, wobei die erhaltene cDNA zur Messung herangezogen wird. Der Nachweis erfolgt bevorzugt durch an die Proben-Nucleotidsequenz gekoppelten Farbstoff, der optisch nachgewiesen wird. Da die Menge des Farbstoffes an einer gegebenen Chipposition mit der Menge der mRNA oder cDNA korreliert, erlaubt die Auswertung der Farbstoffintensität von mehreren Chippositionen Unterschiede im Expressionsniveau verschiedener Zellen oder Gewebe festzustellen. Dabei kann das Expressionsniveau eines Gens in unterschiedlichen Proben oder unterschiedlicher Gene parallel bestimmt werden. Der parallele Nachweis von Mutationen und Genexpressionsunterschieden in derselben Probe ist nicht nur zeitsparend, sondern wegen der gleichmäßigen Behandlung der Proben in beiden Nachweissystemen auch weniger fehleranfällig.
Die Möglichkeit der Bestimmung der Genexpression und der gleichzeitige parallele Nachweis von Mutationen integriert in einem Verfahren stellt einen weiteren wichtigen Vorteil des vorliegenden Verfahrens dar.
Neben der optischen Auslesung von z. B. spezifisch an Fehlpaarungen gebundenem fluoreszenzmarkiertem mutS, kann die Substratbindung auch mittels elektrischer Verfahren detektiert werden. Dazu eignet sich insbesondere die Impedanzspektroskopie, wobei die Änderung des Wechselstromwiderstandes am
Messort bestimmt wird, der von der gebundenen Substratmenge abhängt. Aber auch eine cyclovoltametrische Messung der Spannung zwischen einem, an den Nucleotidsequenzen gebundenen Elektronendonor oder -akzeptor und einer elektrisch leitfähigen Oberfläche ist denkbar, wobei der Elektronenfluss durch die Substratbindung verändert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens findet die elektronische Adressierung auf einer Chipoberfläche statt, die mit einer Permeationsschicht belegt ist. Die Permeationsschicht ermöglicht den Fluss kleiner Ionen zur elektrischleitfähigen Oberfläche des Chips, wodurch der Stromkreis geschlossen wird, ohne dass die Nucleotidsequenzen oder das Substrat in Kontakt mit der Chipoberfläche kommen und dort selbst oxidiert oder reduziert werden. Als Permeationsschicht eignen sich bevorzugt nicht-ionische polymere oder gelartige Materialien, die eine hohe Durchlässigkeit für Nucleotidsequenzen und das verwendet Substrat besitzen, so dass eine gute Penetration der Permeationsschicht bei der elektronischen Adressierung mit den Nucleotidsequenzen oder bei der Inkubation mit dem Fehlpaarungen erkennenden Substrat erfolgt. So ist z. B. bei der Verwendung von mutS als Substrat die Verwendung einer Hydrogelbeschichtung der Agarosebeschichtung des elektronisch adressierbaren Chips vorzuziehen. So bietet der Hydrogelchip gegenüber dem Agarosechip die Vorteile einer höheren Sensitivität und einer besseren Diskriminierung zwischen fehlgepaarter und perfekt gepaarter DNA. Dies ist insofern überraschend, dass nicht vorherzusehen war, dass die Beschaffenheit der Permeationsschicht einen derart großen Einfluss auf die
Sensitivität des Nachweises hat.
Weiterhin haben sich Niedrigsalzbedingungen bei der Durchführung des Verfahrens als vorteilhaft erwiesen. Überraschenderweise leidet unter den Niedrigsalzbedingungen die Fähigkeit des Substrates mutS an Basenfehlpaarungen zu binden nicht. Bezogen auf die Verwendung von mutS als Substrat sollte die Fehlpaarungsbindung bei einer Salzkonzentration von 10 bis 300 mM, bevorzugt von 10 bis 150 mM, erfolgen, als besonders bevorzugt hat sich eine Salzkonzentration von 25 bis 75 mM herausgestellt. Die optimalen Salzkonzentrationen für die Fehlpaarungserkennung durch andere Substrate können, analog dem
Ausführungsbeispiel, leicht ermittelt werden.
Weiterhin kann die Penetration der Permeationsschicht durch das Fehlpaarungen erkennende Substrat durch die Zugabe von Detergentien, wie z. B. Tween-20, gesteigert werden. Überraschend verliert mutS auch seine Fähigkeit zur
Fehlpaarungsbindung unter Detergentienzusatz nicht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Messgenauigkeit des Verfahrens durch Zugabe von unspezifische Bindungsstellen blockierenden Substanzen wie z. B. BSA erhöht. Darüber hinaus kann sich der Zusatz von SSB positiv auf die Messgenauigkeit auswirken, sofern einzelsträngige Nucleinsäurefragmente von dem verwendeten Fehlpaarungen erkennenden Substrat gebunden werden, wie es z. B. bei mutS der Fall ist. Im Falle der Verwendung von mutS als Substrat konnte allerdings nur eine geringe Verbesserung der Messgenauigkeit erreicht werden.
Um so überraschender ist, dass ein Abbau einzelsträngiger Nucleotidsequenzen nach der elektronischen Hybridisierung und vor der Zugabe des Fehlpaarungen erkennenden Substrates eine erhebliche Steigerung der Messgenauigkeit zur Folge hat. Dieser Effekt ist sowohl bei elektronisch adressierbaren Chips als auch bei einer Verfahrensausgestaltung mit passiver Hybridisierung auf einer Arrayoberfläche nutzbar. Der Abbau einzelsträngiger Nucleotidsequenzen kann dabei enzymatisch durch Nucleasen, wie z. B. die Mung Bean Nuclease oder die S1 -Nuclease erfolgen.
Durch die Einführung eines solchen Nucleaseverdaus in den Assay wird die Zuverläßigkeit der Messung erheblich gesteigert.
Ein Problem beim parallelen Nachweis unterschiedlicher Mutationen, den Fehlpaarungen AA, AG, AC, GG, GT, CT, CC, TT und den Fehlpaarungen aufgrund der Deletion oder Insertion einzelner Nucleotide, ist, dass die Fehlpaarungen erkennenden Substrate die Mutationen unterschiedlich gut erkennen. So erkennt z. B. mutS die Fehlpaarungen GT, GG und AA besser als die Fehlpaarungen TT, CC und AC.
Dazu ist zu bemerken, dass ein bedeutender Mechanismus, der zur Entstehung von Basenaustauschmutationen führt, die Desaminierung von 5-Methylcytosin ist. Etwa 3-5% aller Cytosinreste in Säugern sind methyliert (diese Modifikation trägt zur Inaktivierung von Genen bei), und bei der spontanen Desaminierung eines solchen Methylcytosins entsteht die Base Thymin. Obwohl es spezielle Reparaturenzyme gibt, die die im DNA-Doppelstrang entstehende GT-Fehlpaarung erkennen und reparieren, bleibt die Mutation doch in einigen Fällen unerkannt und führt dann beim nächsten DNA-Replikationszyklus zu einer Umwandlung des ursprünglichen CG- Basenpaars in ein TA-Basenpaar. Die Bedeutung dieses Mechanismus wird dadurch verdeutlicht, daß fast ein Drittel (31 ,7%) aller Punktmutationen, die man bei genetisch bedingten Erkrankungen des Menschen gefunden hat, durch Desaminierung von 5-Methylcytosin entstanden sind (Ramsahoye et al., Blood Reviews (1996) 10, 249-261 ). Mit der hier beschriebenen Methode kann gerade diese sehr häufig auftretende Basenaustauschmutation besonders gut nachgewiesen werden. Ein besonderer Vorteil von mutS als Substrat ist, dass alle Fehlpaarungen, die mutS weniger gut erkennt, in deren korrespondierende Fehlpaarungen überführt werden können, die mutS besonders gut erkennt.
Hybridisiert man z. B. auf einem elektronisch adressierbaren Chip einen DNA-
Strang, in dem ein Cytosinrest zu Thymin mutiert ist, mit einem unmutierten Referenz-Gegenstrang, so entsteht eine GT-Fehlpaarung, die mit Hilfe des mutS- Proteins aus E. coli zuverlässig detektierbar ist. Daneben können jedoch auch andere Mutationen mit der hier vorgestellten Methode nachgewiesen werden, insbesondere solche Punktmutationen, die bei Hybridisierung der mutierten DNA mit dem unmutierten Gegenstrang zu einer G:G-, C:T- oder A:A-Fehlpaarung führen. Insertionen oder Deletionen von ein oder zwei Basen können durch mutS ebenfalls detektiert werden. Der Anteil an Mutationen, die mit der hier beschriebenen Methode entdeckt werden können, läßt sich zudem steigern, indem beide Stränge einer zu testenden DNA mit dem jeweiligen Referenz-Gegenstrang hybridisiert werden. Dies läßt sich durch folgendes Beispiel verdeutlichen: Ein Basenaustausch, bei dem ein Guanin durch Cytosin ersetzt wird, führt, sofern er nicht repariert wird, zur Umwandlung des ursprünglichen G:C-Basenpaars in ein C:G-Basenpaar.
Referenz-DNA (Wildtyp): Strang (a) 5'-...ATGTA...-3'
Gegenstrang (b) 3'-...TACAT...-5' zu testende DNA (mutiert): Strang (amuι) 5'-...ATCTA...-3'
Gegenstrang (bmut) 3'-...TAGAT...-5'
Wird nun der Strang (amut) der zu testenden DNA mit dem Gegenstrang (b) der Referenz-DNA hybridisiert, so entsteht eine CC-Fehlpaarung, die von mutS nur schwach gebunden wird. Bei der Hybridisierung des mutierten Gegenstranges (bmut) mit dem Referenzstrang (a) bildet sich dagegen die korrespondierende GG-
Fehlpaarung, die mit mutS deutlich besser nachgewiesen werden kann. Ähnliches gilt für Punktmutationen, bei denen ein Adenin durch Thymin ersetzt wurde. Hybridisiert man beide Stränge einer solchen mutierten DNA mit den jeweils komplementären, unmutierten Referenzsträngen, so erhält man einerseits eine TT- Fehlpaarung, die von mutS nur schwach gebunden wird, und andererseits eine korrespondierende AA-Fehlpaarung, die von mutS besser erkannt wird. Entsprechend kann eine AC-Fehlpaarung durch die korrespondierende TG- Fehlpaarung ersetzt werden.
Bei der Nutzung korrespondierender Basenfehlpaarungen können entweder beide Stränge einer Nucleotidsequenz örtlich getrennt elektronisch hybridisiert werden oder eine Mischung beider Einzelstränge wird auf einer Chipoberfläche fixiert.
Für den Nachweis von Insertionen oder Deletionen einzelner Nucleotide, bevorzugt von ein bis drei Nucleotiden, hat sich überraschend mutS aus T.thermophilus als besonders geeignet erwiesen. Somit kann auch durch Kombination einzelner Fehlpaarungen erkennender Substrate das Verfahren an die jeweiligen Anforderungen angepasst werden.
Die elektronische Adressierung kann z. B. auf einem Chip, an dem an den Orten a, b, c bis n bereits die Nucleotidsequenzen A, B, C, ..., N fixiert sind, mit einer Mischung enthaltend Nucleotidsequenzen aus der Gruppe A', B\ C\ ..., N' erfolgen. Hierbei stellen die Nucleotidsequenzen A/A" bis N/N' jeweils ein Referenz- und Proben-Nucleotidsequenzpaar dar. Nach der elektronisch beschleunigten
Hybridisierung kann z. B. durch Umpolen des elektrischen Feldes die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen erhöht werden. Dies kann ortsaufgelöst und damit für jeden Ort individuell einstellbar erfolgen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die elektronische
Adressierung auf der Chipoberfläche gesteuert-sukzessiv. Werden auf einem elektronisch adressierbaren Chip gleiche oder unterschiedliche Referenz- Nucleotidsequenzen örtlich aufgelöst fixiert, erfolgt die elektronisch beschleunigte Hybridisierung ortsspezifisch sukzessive mit der jeweiligen zu testenden Proben- Nucleotidsequenz. Sind z. B. an den Orten a, b, c, ..., n unterschiedliche Referenz-
Nucleotidsequenzen A, B, C, ..., N befestigt, erfolgt die Hybridisierung nacheinander ortsspezifisch mit den Proben A\ B\ C\ ..., N\ so dass sich die Heteroduplices AA' am Ort a, BB am Ort b, CC am Ort c bis NN' am Ort n ausbilden können. Alternativ können natürlich auch die Proben-Nucleotidsequenzen auf der Chipoberfläche befestigt werden und es erfolgt dann die sukzessive elektronisch beschleunigte Hybridisierung mit den jeweiligen Referenz-Nucleotidsequenzen. Auch die Hybridisierung von Proben-Nucleotidsequenzen unterschiedlicher Herkunft, z. B. aus unterschiedlichen Patienten, mit immer der gleichen Referenz-Nucleotidsequenz wird bevorzugt mit dem beschriebenen Verfahrensschema durchgeführt. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich durch ein hohes Mass an Zuverlässigkeit aus. Die Ausgestaltung der Messungen als sukzessives Verfahren wird allerdings nur durch Nutzung einer elektronisch adressierbaren Oberfläche möglich. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren auf einer elektronisch adressierbaren Oberfläche hoch parallelisiert durchgeführt werden; dadurch kann ein hoher Probendurchsatz erreicht werden. Auch hier besteht die Möglichkeit, durch Umpolen des elektrischen Feldes die Hybridisierungsbedingungen zu variieren. Passive Hybridisierungsverfahren eignen sich aufgrund der langen Dauer des Hybridisierungsprozesses, der in der Regel mehrere Stunden beträgt, und der zu hohen Ungenauigkeit der Hybridisierung, nicht für ein solches Vorgehen.
Ein solches Verfahren ist nicht nur erheblich zuverlässiger als die aus dem Stand der Technik bekannten passiven Hybridisierungstechniken zur Auffindung von
Mutationen, sondern ist auch noch erheblich schneller. So ist mit dem zuletzt beschriebenen Verfahren ein Chip mit einer 10 x 10 Arrayoberf lache, auf dem 100 parallele Messungen ortsaufgelöst durchgeführt werden können, in 4 bis 8 Stunden ausgelesen. Bei einem passiven Verfahren müssten 100 unterschiedliche Hybridisierungsansätze durchgeführt werden von denen jeder einzelne ca. 14
Stunden dauern würde (wie z. B. in WO 99/06591 beschrieben). Ein solches Verfahren ist daher kaum praktikabel.
Ein weiterer Vorteil der beanspruchten Verfahren liegt darin, dass nicht nur das Vorliegen einer Mutation qualitativ nachgewiesen werden kann, sondern dass auch eine quantitative Bestimmung der Transkription der mutierten Nucleinsäuresequenz möglich ist. Dies ist z. B. bei der Analyse heterozygoter Genotypen von Interesse. Ein Maß für die Transkriptionsrate der mutierten Nucleotidsequenz ist dabei in erster Näherung die Menge an gebundenem, spezifisch Fehlpaarungen erkennendem Substrat. Eine Standardisierung ist, insbesondere bei der quantitativen Bestimmung von mutierten Nucleotidsequenzen hilfreich. Dazu kann z. B. die Referenz- oder Proben-Nucleotidsequenz farbstoffmarkiert sein. So kann optisch geprüft werden, dass am Ort der Standardmessung die gleiche Menge an Nucleotidsequenzen fixiert ist wie am Ort der eigentlichen Messung. Dann wird am Ort der Standardmessung im Überschuß eine vollständig komplementäre Nucleotidsequenz zugegeben, so dass alle fixierten Nucleotidsequenzen fehlpaarungsfrei hybridisiert vorliegen. Je nach Verfahrensausgestaltung werden weitere Zusatzstoffe, wie BSA, SSB, Detergentien usw. zugesetzt. Nach Zugabe des Fehlpaarungen erkennenden
Substrates kann dann ein Vergleichswert bestimmt werden, der als Standard dient. Die quantitative Bestimmung der mutierten Nucleotidsequenz erfolgt parallel ebenfalls unter Zugabe des Fehlpaarungen erkennden Substrates. Die Differenz zwischen Standardwert und Messwert ermöglicht eine quantitative Aussage über die Transkriptionsrate der mutierten Nucleotidsequenz. Um die quantitative Bestimmung weiter zu präzisieren, ist es sinnvoll eine Eichkurve mit unterschiedlichen Konzentrationen der mutierten Nucleotidsequenz zu erstellen, da z. B. die mutS Bindung an die Heteroduplex nicht linear, sondern leicht abflachend mit der Anzahl der auftretenden Basenfehlpaarungen ansteigt. Ein Grund dafür können Massentransfereffekte am Messort sein.
Daraus ergibt sich ein weiterer Vorteil des vorliegenden Verfahrens. Da bei geringen Häufigkeiten von Fehlpaarungen die Substratbindung schnell ansteigt, ist die Messung sehr sensitv, bei einer großen Anzahl an vorliegenden Fehlpaarungen steigt die Substratbindung langsamer an, wodurch ein großer Messbereich erreicht wird. So werden bevorzugt Lösungen der einzelnen Nucleotidsequenzen mit einer Konzentration von 100 pM bis 100 μM, bevorzugt von 1 nM bis 1 μM, für die elektronische Adressierung eingesetzt. In diesem Bereich kann eine quantitative Bestimmung der gebildeten Fehlpaarungen tragenden Heteroduplices problemlos erfolgen.
Soll die hier beschriebene Methode mit aus Patientenproben amplifizierter DNA durchgeführt werden, so ist die daraus erhältliche DNA-Menge in der Regel begrenzt. Eine zu starke Amplifikation würde nämlich aufgrund der Fehlerrate der Polymerase zur Anhäufung von mutierten Strängen und so zu einem erhöhten Hintergrund führen. Darüber hinaus sind bei der Verwendung von Patienten-DNA Schwankungen in der DNA-Konzentration zwischen verschiedenen Patientenproben zu erwarten. Diese Schwankungen könnten Schwankungen des mutS-Signals bedingen und könnten im Extremfall eine Detektion der Mutation verhindern. Überraschend hat sich gezeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren, insbesondere bei der Verwendung von mutS als Fehlpaarungen erkennendes Substrat, auch bei geringen bzw. schwankenden DNA-Konzentrationen für eine zuverlässige und quantitative Mutationserkennung geeignet ist. Dies liegt daran, dass relativ große Schwankungen in der Konzentration der eingesetzten DNA nicht zu größeren Schwankungen in der mutS-Bindung führen. Weiterhin zeigt das erfindungsgemäße Verfahren eine hohe Zuverlässigkeit beim Nachweis von Mutationen vor allem im Bereich praktisch relevanter DNA-Konzentrationen, wie sie bei der Untersuchung von Proben aus Patienten erhalten werden. Weiterhin zeigt das beanspruchte Verfahren überraschend eine hohe Unanfälligkeit gegenüber Schwankungen in der präparierten Nucleotidsequenz-Menge. Somit ist ein Vergleich unterschiedlicher Patientenproben auch dann möglich, wenn die einzelnen Proben nicht exakt die gleiche DNA-Konzentration aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich folglich zum schnellen und zuverlässigen Nachweis von Mutationen. So kann eine große Anzahl von Proben parallel untersucht werden. Damit wird das genotypische Screening nach bisher unbekannten Mutationen verbessert. So liegen z. B. im Zuge des Human Genome Project große Sequenzdatenmengen über das menschliche Genom vor, von denen ausgehend elektronisch adressierbare Chips konstruiert werden können, die gegen Proben-Nucleotidsequenzen aus unterschiedlichen Personen getestet werden können. Dadurch können schnell eine Vielzahl von Mutationen ermittelt werden, die sich nicht unbedingt phänotypisch äußern müssen.
Analog können Proben, die aus Zellen eines bestimmten Organismus gewonnen wurden, auf das Vorliegen einer dominant oder rezessiv vererbten Mutation hin untersucht werden. Die Möglichkeit des großen Probendurchsatzes erlaubt dabei das Screening auf Mutationen in bestimmten Genen in einem großen Personenkreis, z. B. an Neugeborenen. Dadurch wird die Früherkennung einer Krankheitsdisposition und die frühzeitige Behandlung vererbter genetischer Defekte, wie z. B. der Cystischen Fibröse, Chorea Huntington oder der Sichelzellenanämie, die alle auf bestimmten bekannten Mutationen beruhen, erleichtert. Entsprechend kann auch eine etwaige Medikamentenunverträglichkeit oder eine Medikamentenunwirksamkeit, wie z. B. eine Tamoxifen-Resistenz, bei einem Patienten mit einem solchen Verfahren untersucht werden, solange die Unverträglichkeit mit einer bekannten Mutation in Korrelation steht, oder eben durch die Analyse eine Korrelation erzeugt werden kann.
Aufgrund der hohen Verfahrensgeschwindigkeit und aufgrund des erreichbaren großen Parallelisierungsgrades können viele unterschiedliche Proben von Patienten, die an einer Erbkrankheit leiden, mit hohem Probendurchsatz untersucht werden. Dadurch wird die Korrelation zwischen einem Krankheitsbild und bestimmten
Mutationen erleichtert. Darüber hinaus ist das Screening auf Mutationen, die im Laufe der Lebensdauer erworben wurden und mit bestimmten Krankheiten korreliert werden können, effizienter möglich. So kann z. B. der Nachweis einer Mutation in der DNA-bindenden Domäne des Anti-Oncogens p53 (Exon 8) in unterschiedlichen Tumorproben problemlos und schnell erfolgen.
Weiter soll darauf hingewiesen werden, dass über die Wahl der Referenz- Nucleotidsequenzen viele unterschiedliche Assays entwickelt werden können, die mit den beanspruchten Verfahren schnell und zuverlässig durchgeführt werden können. So können z. B. einzelne Exone eines Gens unabhängig voneinander als
Referenz-Nucleotidsequenz dienen. Dadurch kann nicht nur nachgewiesen werden, dass eine Mutation vorliegt, sondern auch wo eine solche Mutation liegt. Durch die Wahl geeigneter Genfragmente als Referenz-Nucleotidsequenzen kann die Mutationsortbestimmung sogar punktgenau erfolgen, wenn Fragmente benutzt werden, die um jeweils ein Nucleotid auf Basis der zu untersuchenden
Gesamtsequenz verschoben sind. Insbesondere die getrennte Verwendung einzelne Proteindomänen codierender Genbereiche bietet vielfältige Möglichkeiten unterschiedliche Fragestellungen zu beantworten. So können inzwischen häufig einzelnen Proteindomänen bestimmte biologische Funktionen innerhalb eines Proteins, wie z. B. eine enzymatische Aktivität, eine regulatorisch wirkende Bindungsstelle oder die Fähigkeit zur Einlagerung in eine Zellmembran, zugeordnet werden. Werden die einzelnen, diese Domänen codierenden Nucleinsäureabschnitte getrennt auf der Chipoberfläche fixiert, kann eine Mutation direkt mit der Änderung einer bestimmten Proteineigenschaft korreliert werden. Insbesondere für die Untersuchung von Stoffwechselwegen, an denen mehrere Proteine beteiligt sind, eignet sich dieses Vorgehen.
Neben dem erfindungsgemäßen Verfahren ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Assaypaket in Form eines Kits. Ein solcher Kit enthält einen elektronisch adressierbaren Chip, Referenz-Nucleotidsequenzen, die in freier Form oder bereits an die Chipoberfläche fixiert vorliegen können und mindestens ein spezifisch Fehlpaarungen erkennendes Substrat. Die beigegebenen Referenz- Nucleotidsequenzen sind dem Verwendungszweck des Assays jeweils anzupassen.
Als Fehlpaarungen erkennendes Substrat ist mutS aus E.coli bevorzugt. Aber für spezielle Fragestellungen können weitere Substrate, wie z. B. mutS aus T.thermophilus für den Nachweis von Nucleotidinsertionen oder -deletionen Bestandteil des Kits sein.
Direkt farbstoffmarkierte Fehlpaarungen erkennende Proteine, insbesondere markiertes mutS, wurden bisher nicht beschrieben. Ein solches direkt markiertes Substrat konnte überraschend ohne Verlust der Bindungsspezifität hergestellt werden.
Folglich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von farbstoffmarkierten Fehlpaarungen erkennenden Proteinen, wobei ein Ester, bevorzugt ein Succinimidylester, des Farbstoffs in geringer Konzentration, bevorzugt zwischen 1 μM und 100 μM unter milden Bedingungen mit einem Fehlpaarungen erkennenden Protein, bevorzugt mutY, MSH1 bis MSH6, S1 -
Nuclease, T4-Endonuclease, Thyminglykolase oder Cleavase und besonders bevorzugt mit mutS, unter Lichtausschluss umgesetzt wird. Weiterhin hat sich die Verwendung eines HEPES-Puffers aus 5 mM bis 50 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin- N'-2-Ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,5 bis 8,5, 50 bis 500 mM KCI, 1 bis 15 mM MgCI2, 5 bis 15% Glycerin in destilliertem Wasser als vorteilhaft erwiesen.
Mit Hilfe dieses Verfahrens können Fehlpaarungen erkennende Proteine direkt mit Farbstoffen markiert werden, ohne dass die Proteine ihre spezifische
Bindungsaktivität verlieren. Damit sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung Fehlpaarungen erkennende Proteine, bevorzugt mutY, MSH1 bis MSH6, S1 -Nuclease, T4-Endonuclease, Thyminglykolase oder Cleavase und besonders bevorzugt mutS, die farbstoffmarkiert sind. Besonders zur Markierung geeignete Farbstoffe sind dabei Cy™3, Cy™5, Oregon Green 488, Alexa Fluor 488, Alexa
Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Bodipy 558/568, Bodipy 650/665, Bodipy 564/570, S 0535, S 0536, Dy-630-NHS, Dy-635-NHS, EVOblue30-NHS, FAR-Blue, FAR-Fuchsia, Atto 650, FITC oder Texas Red.
Ebenso Gegenstand der Erfindung sind Fehlpaarungen erkennende
Fusionsproteine, die z. B. mit einem Antikörper bindenden Epitop, wie z. B. MBP, oder mit einer enzymatischen Gruppe, bevorzugt mit Chloramphenicol- Acetyltransferase, alkalische Phosphatase, Luciferase oder Peroxidase, markiert sein können. Die Markierung kann aber auch eine lumineszierende oder radioaktive Gruppe sein.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von mutS für ein Verfahren zum ortsaufgelösten Mutationsnachweis in Nucleotidsequenzen auf einem Träger, bevorzugt auf einer elektronisch adressierbaren Oberfläche. Insbesondere die Verwendung von direkt fluoreszenzmarkiertem mutS ist hierbei von Vorteil.
Ausführungsbeispiele:
Allgemeines:
Als Basenfehlpaarungs-bindende Proteine werden Proteine der mutS-Familie genutzt, von denen bekannt ist, dass sie bei der Erkennung und Reparatur von Schäden der DNA in Eukaryoten, Bakterien und Archeae eine wichtige Rolle spielen (R. Fishel, Genes Dev. 12 (1998), 2096-2101). Diese Proteine binden spezifisch an Abschnitte der DNA mit Basenfehlpaarungen und leiten durch Rekrutierung von Enzymen die Reparatur des Schadens ein.
Wegen ihrer besonderen Bindungseigenschaften können diese Proteine zum Nachweis von Mutationen verwendet werden (G.R. Taylor und J. Deeble, Genetic Analysis: Biomolecular engineering, 14 (1999), 181 -186).
Der Nachweis von Mutationen erfolgt in den angegebenen Beispielen durch elektronisch beschleunigte Hybridisierung der Referenz-DNA mit der zu testenden DNA in Verbindung mit neuen, farbstoffmarkierten mutS-Proteinen. Dazu wird eine Molecular Biology Workstation der Firma Nanogen benutzt. Die Durchführung der Messungen erfolgt, soweit in den Ausführungsbeispielen nicht anderweitig beschrieben, nach Angaben des Herstellers (Handbuch zur Molecular Biology
Workstation der Firma Nanogen). Eine Beschreibung der Messverfahren findet sich z. B. auch in Radtkey et al., Nucl. Acids Res. 28, 2000, e17.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung des parallelen Mutationsnachweises und lässt folgendes erkennen:
(1 ) Fragmente der Gene A - E werden als einzelsträngige Referenz-DNA auf individuelle Positionen eines Nanogen™-Chips (Nanogen Inc., San Diego, USA) elektronisch adressiert und
(2) mit der farbstoffmarkierten Test-DNA elektronisch beschleunigt und ortsaufgelöst hybridisiert.
(3) Basenfehlpaarungen der resultierenden Heteroduplices reflektieren eine Mutation der Test-DNA gegenüber der Referenz-DNA und können z. B. durch ein farbstoffmarkiertes mutS-Protein lokalisiert werden. (4) Die optische Analyse des Chips erlaubt anschließend die Zuordnung einer Mutation zu einem Genfragment.
In den folgenden Beispielen wurde, wie jeweils angegeben, mutS aus E.coli, T. thermophilus, T.aquaticus oder das Fusionsprotein MBP-mutS verwendet.
Nach Überprüfung der funktioneilen Aktivität des markierten mutS-Proteins wurde in einem weiteren Schritt das erhaltene farbstoffmarkierte mutS-Protein zum Mutationsnachweis in elektronisch adressierten DNA-Heteroduplices verwendet.
Die zum Aufbau der Nucleotid-Chips verwendeten Nucleotidsequenzen sind in der folgenden Aufstellung inklusive der jeweiligen Markierungen dargestellt.
Figure imgf000026_0001
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Beispiel: Klonierung, Expression und Reinigung von E.coli mutS
Die DNA-Sequenz, die für mutS aus E.coli kodiert, wurde über PCR amplifiziert und nach Standardverfahren isoliert. Der δ'-Primer (SEQ. ID No. 1) führt eine BamHI Schnittstelle unmittelbar vor dem Start-Codon ein, während der 3'-Primer (SEQ. ID No. 2) eine Hindlll Schnittstelle nach dem Stop-Codon generiert. Die PCR ist dem Fachmann bekannt und wurde nach folgendem Schema durchgeführt:
Eine Zahnstocherspitze E.coli XL1 Blue (Stratagene, Amsterdam Zuidoost,
Niederlande) wird in einen 100 μl PCR-Ansatz mit 71 μl H2O und 10 μl 10 μM δ'- Primer, 10 μl 10 μM 3'-Primer, 10 μl 10x PCR-Puffer mit MgSO4 (Röche, Mannheim), 2 μl DMSO, 1 μl dNTP's (jeweils 25 μM) und 2 μl Pwo Polymerase (=10 U) gegeben. Die PCR läuft mit folgendem Programm: 94°C für 5 Minuten mit anschließend 30 Zyklen mit 0,5 Minuten 94°C, 0,5 Minuten 55°C und 2,5 Minuten 72°C. Am Ende der PCR schließt sich eine Inkubation von 7 Minuten bei 72°C an.
Das mutS-PCR-Produkt (SEQ. ID. No. 3) wird über ein 1 %-iges TAE Agarose Gel aufgereinigt und die gewünschte DNA wird aus einem ausgeschnittenen Agarose-
Block mit Hilfe des Gel Extraktion Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die isolierte DNA wird über ein Gel quantifiziert und mit BamHI und Hindill geschnitten. In einem 60 μl Ansatz werden 10 μl mutS-PCR-Produkt (etwa 2 μg) mit 30 U BamHI (3 μl, NEB, Heidelberg), 30 U Hindill (3 μl, NEB, Heidelberg), 6 μl 10x
NEB2-Puffer (NEB, Heidelberg), 0,6 μl 100 x BSA (NEB, Heidelberg) und 37,4 μl H2O vereint und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Enzyme werden anschließend bei 70°C für 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wird nach Zugabe von 6 μl Na-Acetat pH 4,9 und 165 μl Ethanol über Nacht bei 4°C gefällt. Nachdem das Pellet in 70%- igem Ethanol gewaschen wurde, wird es an der Luft getrocknet. Die DNA wird in 30 μl TE (10 mM TrisHCI, 1 mM EDTA, pH8) aufgenommen.
Das E.coli Expressionsplasmid pQE30 (SEQ. ID No. 4) (Qiagen, Hilden) wird ebenfalls mit BamHI und Hindlll geschnitten. In einem 60 μl Ansatz werden 10 μl pQE30 mit 30 U BamHI (3 μl, NEB, Heidelberg) 30 U Hindlll (3 μl, NEB, Heidelberg)
6 μl 10x NEB2-Puffer (NEB, Heidelberg), 0,6 μl 100 x BSA (NEB, Heidelberg) und 37,4 μl Wasser vereint und bei 37°C für 4 Stunden inkubiert. Die Enzyme werden anschließend bei 70°C für 10 Minuten inaktiviert. Die DNA wird nach Zugabe von 6 μl Na-Acetat pH 4,9 und 165 μl Ethanol über Nacht bei 4°C gefällt. Nachdem das Pellet mit 70%-igem Ethanol gewaschen wurde, wird es an der Luft getrocknet. Die
DNA wird in 30 μl TE (10 mM TrisHCI, 1 mM EDTA, pH8) aufgenommen.
Die Mengen von pQE30 und mutS werden auf einem Agarose-Gel verglichen und es werden 100 ng Plasmid (2 μl) und 150 ng (5 μl) mutS DNA in einem 20 μl Ligationsansatz mit 2 μl 10x Ligase-Puffer (Röche, Mannheim), 2 μl Ligase (2 U,
Röche, Mannheim) und 9 μl H2O vereint und 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Der Ligationsansatz wird anschließend mittels CaC -Methode (Ausubel et al., Current protocols in molecular biology, Vol. 1 , ED Wiley and Sons, 2000) in E.coli TOP10 (Firma Stratagene, La Jolla, San Diego, USA) transformiert. Die Zellen werden auf Ampicillin-Resistenz hin selektiert und positive Klone werden mittels Minipräp- Analyse auf den Plasmidgehalt hin untersucht. Mit Klonen, bei denen das gewünschte Plasmid pQE30-mutS (SEQ. ID. No. 5) gefunden wurde, wurde eine Proteininduktion vorgenommen.
Eine 5 ml LB (mit 100 μg/ml Ampicillin) über Nacht Kultur E.coli TOP10 mit dem Plasmid pQE30-mutS wird so verdünnt, dass in einer darauf folgenden, 100 ml LB- Kultur (100 μg/ml Ampicillin) eine OD595 von 0,05 entsteht. Die Zellen werden bei 37°C unter Schütteln (240 rpm) so lange inkubiert, bis eine OD595 von 0,25 erreicht wird. Anschließend wird eine IPTG Konzentration von 1 mM in der Kultur eingestellt und die Zellen werden weitere 4 Stunden inkubiert. Die Zellen werden durch Zentrifugation (5.000 xg für 10 Minuten) geerntet. Das Zellpellet wird in 10 ml PBS- Puffer mit 0, 1 g Lysozym (Sigma, Deisendorf) und 250 U Benzonase (Merck, Darmstadt) aufgenommen und bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
Fig. 2 zeigt eine SDS-PAGE mit mutS (Pfeil) exprimierenden E.coli Stämmen nach Induktion (Bahn 1 und 2) und vor der Induktion (Bahn 3).
Danach wurden 100 μl PMSF (100 mM in Isopropanol) (Sigma, Deisendorf) und 100 μl Triton X-100 (Sigma, Deisendorf) zugegeben. Nachdem die Zellen lysiert sind, wurden die Zellreste bei 10.000 xg für 10 Minuten abzentrifugiert. 2 ml Nickel-NTA- Agarose (Qiagen, Hilden) werden 3 x mit 10 ml Puffer 17 (Qiagen, Hilden) äquilibriert. Anschließend wird dem Lysat die äquilibrierte Nickel-NTA-Agarose zugegeben. Es folgt eine Inkubation bei 4°C für eine Stunde. Das Material mit gebundenem mutS-Protein wird über eine Minisäule mit Glasfritte abgetrennt (Biorad, München) und 3 x mit Puffer A gewaschen (4 ml, 2 ml, 2 ml). Anschließend wird das Protein mit 2 x 2 ml Puffer B (Qiagen) eluiert.
Beispiel: Farbstoffmarkierung und funktioneller Test von T.aquaticus mutS und E.coli mutS
a) Unspezifische Markierung von T.aquaticus mutS mit Cy™3 Die Farbstoffe Cy™3 und Cy™5 (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) werden aufgrund ihrer Fluoreszenzeigenschaften häufig zur Fluoreszenzmarkierung von Biomolekülen verwendet (Mujumdar, R.B. et al., Bioconjugate Chemistry 4 (1993) 105-111 ; Yu, H. et al., Nucleic, Acids Research 22 (1994) 3226-3232). Für die Konjugation wird dabei üblicherweise der entsprechende Succinimidylester über eine nukleophile Substitutionsreaktion an Proteinlysinreste unspezifisch kovalent geknüpft. Das von der Firma Pharmacia ausgearbeitete Protokoll (FluoroLink™ product specification protocol, Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, UK) sieht dabei für eine optimale Fluoreszenzmarkierung des Proteins dessen Inkubation mit einem großen Überschuss an Fluorophor unter relativ stark basischen Bedingungen vor (0,1 M Na2CO3, pH 9,3). So wurde zunächst in Anlehnung an dieses Protokoll eine Fluoreszenzmarkierung des thermostabilen mutS aus Thermus aquaticus mit Cy™3 vorgenommen. Nach gelpermeationschromatographischer Aufreinigung und anschließender SDS-PAGE Analyse konnte eine stark fluoreszierende Proteinbande nachgewiesen werden, die eindeutig aufgrund ihres Molekulargewichts einem mit Cy™3 markierten mutS-Protein entspricht (Fig. 3). Bahn 1 zeigt das mutS-Cy™3 (T.aquaticus), während die Bahnen 2 bis 4 das mutS- Cy™5 (E.coli) darstellen.
Der nachfolgende Aktivitätstest (Band-Shift-Assay) zeigte allerdings, dass das markierte Protein keinerlei Aktivität mehr besaß und daher nicht in der Lage war, ein G/T Fehlpaarung enthaltendes Oligomer zu binden (s. Fig. 7). Dieses Experiment zeigt, dass im Fall der Markierung des mutS-Proteins die vom Farbstoffhersteller vorgeschlagene Markierungsprozedur unpraktikabel ist und zum Erhalt von aktivem
Protein ein verfeinertes und optimiertes Markierungsprotokoll etabliert werden muss.
b) Unspezifische Markierung von E.coli mutS und T.aquaticus mutS mit Cy™5
Für die Fluoreszenzmarkierung des Proteins wurden vier Labelingansätze mit steigenden Konzentrationen an Labeling-Reagenz in Labeling-Puffer (20 mM N-2- Hydroxyethylpiperazin-N'-2-Ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,9, 150 mM KCI, 10 mM MgCI2, 0,1 mM N,N,N',N'-Ethylendiamintetraacetat (EDTA), 10% Glycerin in destilliertem Wasser) durchgeführt, um unterschiedliche Populationen an fluoreszenzmarkiertem mutS zu erhalten. Diese sich im Labelinggrad unterscheidenden Proteine wurden dann im Band-Shift-Assay auf ihre Aktivität hin untersucht.
Die Labeling-Reaktion wurde in einer Mischung (500 μl) aus E.coli mutS-Protein (50 μg, 1 ,05 μM) mit steigenden Konzentrationen an Cy™5-Succinimidylester (12 μM, 20 μM, 50 μM und 100 μM) in Labeling-Puffer bei Raumtemperatur für 30 Minuten im Dunkeln durchgeführt. Zur Reinigung des farbstoffmarkierten mutS-Proteins wurde eine NAP-5 Gelfiltrationssäule (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Schweden) mit 3 Säulenvolumina Elutions-Puffer (20 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM KCI, 10 mM MgCI2, 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 10% Glycerin in destilliertem Wasser) equilibriert. Die Labeling-Reaktionslösung wird mit Elutions-Puffer (500 μl) versetzt, komplett auf die Säule aufgetragen und die unterschiedlich fluoreszenzmarkierten Proteine durch Elution mit Elutions-Puffer isoliert. Die fluoreszierenden Proteinfraktionen wurden dann näher UV-spektroskopisch (Fig. 4) und SDS-PAGE gelchromatographisch (Fig. 5) untersucht.
Fig. 4 zeigt exemplarisch die UV-Spektren von verschiedenen Fraktionen der bei den Markierungsreaktionen erhaltenen mutS-Cy™5 (E.coli) Konjugate mit unterschiedlichem Fluoreszenzmarkierungsgrad (D/P-Ratio). Die Spektren 1 bis 4 zeigen folgende Fluoreszenzmarkierungsgrade: 1. D/P = 0,5 (20 μM Cy™5), 2. D/P = 1 ,0 (50 μM Cy™5), 3: D/P = 2,0 (100 μM Cy™5) und 4. D/P = 3,0 (100 μM Cy™5).
Fig. 5 zeigt exemplarisch die SDS-PAGE von verschiedenen mutS-Cy™5 (E.coli)
Fraktionen mit unterschiedlichem Fluoreszenzmarkierungsgrad (D/P Ratio). Die Bahnen 1 bis 7 zeigen folgende Fluoreszenzmarkierungsgrade: 1. D/P = 0,5 (20 μM Cy™5), 2. D/P = 0,5 (20 μM Cy™5), 3. D/P = 1 ,5 (50 μM Cy™5), 4. D/P = 1 ,0 (50 μM Cy™5), 5. D/P = 2,0 (100 μm Cy™5), 6. D/P = 3,0 (100 μM Cy™5), 7. D/P = 2,5 (100 μM Cy™5).
Anschließend wurde mit der Band-Shift-Methode überprüft, ob die mit Cy™5 konjugierten mutS-Proteine funktionell aktiv waren, d.h. ob sie noch spezifisch an Basenfehlpaarungen binden konnten. Dazu wurden Heteroduplices durch Hybridisierung der Oligonucleotide "AT" (Seq. ID No. 6) bzw. "GT" (Seq. ID No. 7) mit dem Oligonucleotid "sense" (Seq. ID No. 11), durch 5-minütiges Erhitzen auf 95°C in 10 M Tris-HCI, 100 mM KCI, 5 mM MgCI2 gefolgt vom langsamen Abkühlen auf Raumtemperatur, erzeugt. Das Oligonucleotid "GT" weist gegenüber dem
Oligonucleotid "AT" eine Mutation auf. Mit Hilfe der T4-Polynukleotidkinase (New England Biolabs, Frankfurt) wurden nach Angaben des Herstellers je 10 pmol der beiden mit den Oligonukleotiden "AT" und "GT" erzeugten Heteroduplices mit 150 μCi -32P-ATP an den 5'-Enden radioaktiv markiert und über Sephadex G50- Gelfiltrationssäulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) nach Angaben des Herstellers gereinigt. Für einen Band-Shift Ansatz wurden 17 fmol der jeweiligen Heteroduplex in 10 μl Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCI pH 7,6, 150 mM KCI, 10 mM MgCI2, 0,1 mM EDTA, 1 mM Dithiotreitol (DTT), 100 μg/ml BSA Fraktion VII, 15% Glycerin in destilliertem Wasser) aufgenommen und mit 10 μl der Cy™5-konjugierten mutS- Proteine bzw. 10 μl entsprechend 5,0 μg kommerziell erhältlicher mutS-Proteine für
20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurden unkonjugiertes E.coli mut S (Gene Check, Fort Collins, USA) und T.aquaticus mutS (Epicentre, Madison, USA) verwendet, und Cy™5-konjugiertes T.aquaticus mutS wurde nach der für E.coli mutS etablierten Vorschrift zum Vergleich präpariert. Nach der Inkubation wurden die Ansätze auf 6% Polyacrylamidgele aufgetragen und für 90 Minuten bei 25 mA getrennt. Gel- und Laufpuffersystem war dabei 45 M Tris-borat, 10 mM MgCb, 1 mM EDTA. Nach dem Lauf wurden die Gele getrocknet und durch Autoradiographie analysiert (Fig. 6).
Die Fig. 6 zeigt Cy™5-konjugiertes E.coli mutS (Bahnen 4,9), das gegenüber kommerziell erhältlichem unmarkiertem Protein (Gene Check, Fort Collins, USA, Bahnen 2, 7) keinen Aktivitätsverlust aufweist. Gleiches gilt für Cy™5-konjugiertes T.aquaticus mutS (Epicentre, Madison, USA, Bahnen 3, 8 unkonjugiert, Bahnen 5, 10 konjugiert). Die Bahnen 1 und 6 enthalten kein Protein. Konjugierte und unkonjugierte Proteine banden deutlich stärker an das Oligonukleotid mit der
Basenfehlpaarung (G/T) (Bahnen 6 bis 10) als an das Oligonukleotid ohne Fehlpaarung (A/T) (Bahnen 1 bis 5). Unter den hier verwendeten Konjugationsbedingungen zeigten weder E.coli mutS noch T.aquaticus mutS einen Aktivitätsverlust.
Im Gegensatz zu dem vorstehend genannten Konjugationsprotokoll führt die Konjugation von T.aquaticus -mutS mit Cy™3 unter Verwendung der vom Hersteller des Farbstoffs empfohlenen und z.B. für Antikörper geeigneten Bedingungen zu einem vollständigen Aktivitätsverlust des konjugierten Proteins (Fig. 7), so dass dieses Standardprotokoll hier nicht verwendet werden konnte.
Fig. 7 zeigt unkonjugiertes T.aquaticus mutS (Bahnen 2, 7 : 0,16 μg, Bahnen 5, 10 :
0,64 μg) und bindet im Gegensatz zu unter Standardbedingungen mit Cy™3- konjugiertem Protein (Bahnen 4, 9 : 0, 16 μg, Bahnen 5, 10 : 0,64 μg) an DNA, wobei die Basenfehlpaarung enthaltende DNA (Bahnen 6 bis 10) besser gebunden wird als die genau paarende DNA (Bahnen 1 bis 5). Die Bahnen 1 und 6 enthalten kein Protein.
Beispiel: Alternatives Verfahren zur Expression von aktivem mutS
Die Überexpression von mutS in E. coli TOP10 führte zur Bildung von nicht löslichem Protein. Dieses Problem - auch als Inclusion Body Bildung bezeichnet - tritt bei E. coli häufig auf. Fig. 8 zeigt über SDS-PAGE aufgetrennte E. coli Lysate von mit pQE30-mutS transformierten Kulturen, die bei verschiedenen Temperaturen angezogen wurden und mutS überexprimieren. Durch niedrige Inkubationstemperaturen (30°C bzw. 25°C) sollte die Bildung von Inclusion Bodies vermieden werden. Betrachtet man jedoch die lösliche Fraktion der Lysate, so befinden sich dort nur sehr geringe Mengen an mutS-Protein. Dagegen ist eine sehr große Menge an mutS Protein in der unlöslichen Fraktion (Inclusion Bodies) zu finden.
Da es sehr aufwendig ist aus Inclusion Bodies lösliches und damit funktionelles Protein zu isolieren, sollte ein anderes Expressionssystem gefunden werden, das mehr lösliches Protein generiert. Fig. 8 zeigt eine Coomassie gefärbte 10% SDS-PAGE von E. coli Lysaten. Spur 1 : unlösliche, Spur 2 lösliche Fraktion von 25°C Kulturen. Spur 3: unlösliche, Spur 4 lösliche Fraktion von 30°C Kulturen. Spur 5: unlösliche, Spur 6 lösliche Fraktion von 37°C Kulturen. Alle mit pQE30-mutS transformierten Kulturen wurden für 3h bei den angegebenen Temperaturen mit 0,3 mM IPTG induziert und angezogen.
Daher wurde in einem folgenden Schritt überprüft, ob eine Veränderung der Aminosäuresequenz des exprimierten Proteins dessen Löslichkeitseigenschaften verbessert. Zunächst wurde getestet, ob ein Fusionsprotein bestehend aus dem Maltose-bindenden Protein (MBP) aus E. coli sowie mutS aus E. coli bessere
Löslichkeitseigenschaften aufweist. Dazu wurde die für mutS kodierende DNA in den Vektor pMALc2x (NEB, Frankfurt, Seq. ID No. 8) eingefügt, woraus das Plasmid pMALc2x-mutS (Seq. ID. No. 9) resultiert. Ein weiterer Vorteil dieses Fusionsproteins gegenüber dem herkömmlichen mutS-Protein ist die kommerzielle Verfügbarkeit von anti-MBP-Antikörpern, die einen Nachweis des Fusionsproteins erlauben. Ein anti-mutS-Antikörper ist derzeit nicht kommerziell erhältlich.
Das in dieser Studie getestete Fusionsprotein besteht aus dem 42 kDa großen Maltose-bindenden Protein (MBP) und dem 92 kDa großen mutS Protein.
Die DNA Sequenz, die für mutS aus E. coli codiert, wurde dazu über PCR amplifiziert und nach Standardverfahren isoliert. Der 5' Primer BamHI (Seq. ID No. 52) führt eine BamHI Schnittstelle vor dem Start-Codon ein. Gleichzeitig wird die unmittelbar vor dem Startcodon befindliche Nukleotidsequenz so mutiert, daß die Startkodonfunktion verloren geht. Dadurch soll vermieden werden, dass die
Proteinbiosynthesemaschinerie an dem Startkodon die Bildung eines verkürzten Polypeptides initiiert. Der 3' Primer Hindlll rev (Seq. ID No. 2) führt eine HindlW Schnittstelle nach dem Stop-Codon ein. Die PCR ist dem Fachmann bekannt und wurde nach folgendem Schema durchgeführt: 4 μl genomische DNA aus E. coli (präpariert nach Angaben des Herstellers mit dem
Qiagen Genomic Tip System 20/G von Qiagen, Hilden) werden in einen 100 μl PCR- Ansatz mit 61 μl H2O, 10 μl 10μM 51 Primer, 10 μl 10 μM 3' Primer, 10 μl 10x PCR- Puffer mit MgSO4 (Röche, Mannheim), 2 μl DMSO, 1 μl dNTP's (25mM each) und 2 μl Pwo Polymerase (= 10 U) gegeben. Die PCR läuft mit folgendem Programm: 95°C für 5 min mit anschließend 30 Zyklen mit 0,5 min 95°C, 0,5 min 55°C und 2,5 min 72°C. Am Ende der PCR schließt sich eine Inkubation von 7 min bei 72°C an. Das mutS-PCR-Produkt wurde anschließend mit dem PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert und von Salzen, Primern und Proteinen befreit. Die isolierte DNA wird über ein Gel quantifiziert und mit BamHI und Hind\\\ geschnitten: In einem 50 μl Ansatz werden dazu 41 μl mutS-PCR-Produkt (etwa 2 μg) mit 20 U BamHI (2 μl, NEB, Frankfurt), 20 U Hindlll (2 μl, NEB, Frankfurt), 5 μl 10x NEB2- Puffer (NEB, Frankfurt) vereint und bei 37°C über Nacht inkubiert. Parallel dazu werden 10 μl des Vektors pMALc2x (2 μg, von NEB, Frankfurt) mit 20 U BamHI (2 μl,
NEB, Frankfurt), 20 U Hindlll (2 μl, NEB, Frankfurt), 5 μl 10x NEB2-Puffer (NEB, Frankfurt) und 31 μl Wasser vereint und bei 37°C über Nacht inkubiert. Anschließend werden die DNA-Fragmente über ein 1 % TBE Agarosegel gereinigt und mit Hilfe des QiaQuick Gel Extraction Kits (Qiagen, Hilden) von Agaroseresten befreit. Die DNA-Fragmente wurden in je 50μl Wasser aufgenommen.
Die Mengen von pMALc2x und mutS werden auf einem Agarose-Gel verglichen und es werden 200 ng Plasmid (3 μl) und 400 ng (14 μl) mutS DNA in einem 20 μl Ligationsansatz mit 2 μl 10x Ligase-Puffer (Röche, Mannheim) und 1 μl T4DNA Ligase (2 U, Röche, Mannheim) vereint und 3 h bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Transformation wurde der E.coli k12-Stamm „Goldstar" (Stratagene, La Jolla, San
Diego, USA) über Nacht bei 37°C und 200 RPM in LB Medium mit 100 μg/ml Ampicillin geschüttelt und angezogen. Am nächsten Morgen wurde 1 ml der Bakterienkultur in 200 ml frisches Medium überimpft und bis zu einer optischen Dichte von 0.565 bei 595 nm bei 37°C und 200 RPM geschüttelt. Anschließend wurde die Kultur auf 4°C abgekühlt und bei 2500xg abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die pelletierten Bakterien wurden in 7.5 ml LB-Medium mit 10% (w/v) Polyethylenglycol-6000, 5% Dimethylsulfoxid, 10mM MgSO4, 10 mM MgCI2 (Promega, Madison, USA), pH 6.8 aufgenommen, für eine Stunde auf Eis inkubiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Zur Transformation wurden 10 μl des Ligationsansatzes in 100 μl 100 mM KCI, 30 mM
CaCI2, 50 mM MgCI2 aufgenommen und mit 100 μl der aufgetauten Bakterien für 20 min auf Eis inkubiert. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Bakterien mit 1 ml LB-Medium versetzt und unter Schütteln für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz auf LB-Agarplatten mit 100 μg/ml Ampicillin ausgestrichen und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Klone wurden isoliert und in 3 ml LB Medium mit 100 μg/ml Ampicillin über Nacht bei 37°C angezogen. Aus den Bakterien wurde die Plasmid-DNA unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep-Kits (Qiagen/Hilden) nach Angaben des Herstellers isoliert und gereinigt. Positive Klone werden mittels Minipräp-Analyse auf den Plasmidgehalt hin untersucht. Bei vier unabhängig voneinander isolierten Klonen, die das gewünschte Plasmid pMALc2x-mutS (Seq. ID. No. 9) tragen, wurde eine Proteininduktion vorgenommen. Eine 5 ml LB (mit 100 μg/ml Ampicillin) über Nacht Kultur E. coli Goldstar mit dem Plasmid pMALc2x-mutS wird 1 :50 verdünnt und bis zu einer ODs95=0.5 bei 37°C unter Schütteln (240 rpm) angezogen. Anschließend wird von jeder Kultur ein Aliquot mit Lämmli-Probenpuffer versetzt; in den Kulturen wird dann eine IPTG Konzentration von 0.3 mM in eingestellt und die Zellen werden weitere 2 h bei 37°C inkubiert. Die Kulturen werden anschließend mit Lämmli- Probenpuffer versetzt und zusammen mit den uninduzierten Proben über SDS-
PAGE aufgetrennt. Die Coomassie-Färbung der Gele weist die Expression eines etwa 140 kDa (42 kDa MBP + 93 kDa mutS) großen Proteins bei den Klonen 1 und 6 nach (Fig. 9A). Ein parallel aufgetrenntes, mit identischen Proben beladenes SDS- Gel wurde mit Hilfe der Western-Blot Methode unter Verwendung eines anti-MßP- Erstantikörpers analysiert (Reagenzien und Methodik dargestellt in: pMAL Protein
Fusion and Purification SystemHandbook, NEB, Frankfurt). Dabei konnte bei den Klonen 1 und 6 ein etwa 140 kDa großes Protein nachgewiesen werden (Fig. 9B), bei denen es sich somit um das MBP/mutS-Fusionsprotein handelt. Initiale Versuche zeigten jedoch, daß auch bei diesem Expressionssystem der Großteil des exprimierten mutS-Fusionsproteins in den unlöslichen Inclusion Bodies zu finden war, was möglicherweise an den hier verwendeten Zellen lag (Daten nicht gezeigt). Daher wurde das Plasmid pMALc2x-mutS aus dem Klon 2 mit Hilfe des Qiagen Midi- Prep Kits (Qiagen/Hilden) isoliert und wie oben beschrieben in kompetente E.coli C600 Zellen transformiert. Dieser Stamm neigt zur verminderten Inclusion Body Formierung. Ein frisch transformierter Klon wurde über Nacht in 100 ml LB-Medium mit 0.2% Glukose, 2mM MgCI2, 100 μg/ml Ampicillin bei 37°C angezogen. 50 ml dieser Kultur wurden durch Zentrifugation geerntet und in 3L desselben Mediums bei 37°C bis zu einer OD595=0.6 angezogen. Anschließend wurden die Zellen, nach Zugabe von IPTG ad. 0,3 mM unter Schütteln für 3 h bei 30°C inkubiert, durch Zentrifugation geerntet und in 100 ml Column-Puffer (20 mM HEPES pH 7.9, 150 mM KCI, 10 mM MgCI2, 0.1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, 0.2 mM PMSF) resuspendiert. Danach wurden die Zellen durch Ultraschallbehandlung lysiert, und Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 9000xg abgetrennt.
Das MBP-mutS Fusionsprotein wurde anschließend durch Affinitätschromatographie über eine Amylosesäule gereinigt und in Column-Puffer (s.o.) mit 10mM Maltose eluiert (beschrieben in: pMAL Protein Fusion and Purification System Handbook, NEB, Frankfurt). Danach wurde die Proteinkonzentration des Eluates mit dem Bradford Assay Kit (Biorad, München) bestimmt. 2μg des Eluats wurden über SDS-
PAGE analysiert. Dabei zeigte sich, daß das Fusionsprotein nur wenige kontaminierende Proteine enthält (Fig. 9C). Das MBP-mutS Fusionsprotein wurde 1 :1 (v/v) mit Glycerin versetzt und bei -20 °C gelagert. Die Aktivität der Proteine wurde mit Hilfe der „Band-Shift" -Methode sowie der Oberflächenplasmonresonanztechnologie (s.u.) verifiziert.
Fig. 9A zeigt ein Coomassie gefärbtes 5%-20% SDS-PAGE von E. coli Lysaten aus pMALc2x-mutS transformierten Zellen. Lane 1 , 2: Kloni . Lane 3, 4: Klon 4. Lane 5,6: Klon 5. Lane 7,8: Klon 6. Die Zellen wurden vor der Lyse nicht (Lanel , 3,5,7) oder mit 0,3mM IPTG (Lane 2,4,6,8) induziert. Bei den Klonen 1 und 6 wird ein Protein der erwarteten Größe von 140 kDa gebildet (Pfeil). Fig. 9B: Western Blot Analyse eines 5%-20% SDS-PAGE von E. coli Lysaten aus pMALc2x-mutS transformierten Zellen. Lane 1 , 5: Kloni . Lane 2, 6: Klon 4. Lane 3,7: Klon 5. Lane 4,8: Klon 6. Die Zellen wurden vor der Lyse nicht (Lanel -4) oder mit 0,3mM IPTG (Lane 5-8) induziert. Bei den Klonen 1 und 6 wird ein Protein der erwarteten Größe von 140 kDa durch den anti-MBP-Antikörper erkannt (Pfeil). Bei den Klonen 4 und 5 wird ein Protein der Größe von MBP (etwa 40 kDa) erkannt. Fig. 9C, Coomassie gefärbtes 5%-20% SDS-PAGE von gereinigten MBP-mutS-Fusionsproteinen. Affinitätschromatographisch gereinigtes MBP-mutS aus 2 unabhängigen Präparationen wurde gelelektrophoretisch untersucht. Lane 1 , Marker. Lane 2:
Präparation 1. Lane 3: Präparation 2. Beispiele: Weitere Labelingmethoden
2 mg mutS Protein (entweder eine MBP-fusionierte oder eine unfusionierte Variante, von der Firma Genescan (Fort Collins, USA), kommerziell erworbenes E.coli Protein, oder von der Firma Biozym, Hess. Oldendorf, bezogenes mutS aus T. aquaticus) wurden in 18 mL 20 mM HEPES pH 7.9, 5 mM MgCl2, 150 mM KCI, 10% (v/v) Glycerin gelöst. 250 nMol Cy™5-Succinimidylester wurden in 2mL des gleichen Puffers gelöst, mit dem gelösten Protein gut vermischt und für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Reaktionen mit 2mL 20 mM HEPES pH7.9, 5mM MgCI2, 150mM KCI, 100 mM Adenosintriphosphat, 10 mM
Dithiothreitol, 10% (v/v) Glycerin versetzt. Die proteinhaltigen Lösungen wurden 2x für 3 Stunden sowie 1x über Nacht gegen je 2L 20 mM Tris pH7.6, 5mM MgC , 150mM KCI, 1 mM DTT, 10% (v/v) Glycerin in einer Dialysetasche mit einem Cut-off von 10 kDa bei 4°C dialysiert. Danach wurde das Protein mit 1 Volumenteil Glycerin versetzt und bei -20°C gelagert.
Beispiel: Nachweis von Punktmutationen auf elektronisch adressierbaren DNA-Chips
Die funktioneilen farbstoffmarkierten E. coli und T aquaticus mutS-Proteine wurden nun zum Nachweis von Punktmutationen auf elektronisch adressierbaren DNA-
Chips verwendet. Dazu wurde zunächst eine 100 nM Lösung des am 5'-Ende biotinylierten Oligonukleotids "sense" (Seq. ID No. 10) auf alle Positionen der Reihen 1 -5 sowie 7-10 eines 100-Positionen DNA-Chips der Firma Nanogen (wie in Radtkey et al., Nucl. Acids Res. 28, 2000, e17; R.G. Sonowsky et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 11 19-1123; 1994 P.N. Gilles et al., Nature Biotechnol. 17, 365-370,
1999, beschrieben) für 60 s mit 2 V elektronisch adressiert (eine schematische Darstellung dazu ist in Fig. 10 wiedergegeben, die die Beladung des 100-Positionen Chips mit DNA durch elektronische Adressierung zeigt). Die Stromstärke pro Position schwankte in den Reihen 1 -8 zwischen 262 nA und 364 nA, in den Reihen 9 und 10 zwischen 21 nA und 27 nA, wodurch an diese Positionen weniger DNA adressiert wurde (Fig. 10 linke Matrix, die beiden unteren Zeilen). Anschließend wurde das zu dem Oligonukleotid "sense" (Seq. Id No. 10) vollständig komplementäre und am 5' -Ende mit Cy™3 markierte Oligonukleotid Seq. ID No. 6 unter den oben beschriebenen Bedingungen auf die Reihen 1 , 3, 7 und 9 des Chips auf gebracht, so dass an diesen Positionen vollständig gepaarte, mit „AT" bezeichnete Doppelstränge entstanden (Tabelle 1 und Fig. 10, rechte Matrix, dunkel schattiert). In einem weiteren Schritt wurde das Cy™3 markierte Oligonukleotid Seq. ID No. 7 wie oben beschrieben auf die Reihen 2, 4, 8 und 10 des Chips aufgebracht. Dieses Oligonukleotid bildet mit dem zuvor adressierten Oligonukleotid „sense" einen Doppelstrang mit einer einzelnen G/T Basenfehlpaarung, weswegen das resultierende doppelsträngige Oligonukleotid mit „GT" bezeichnet wird (Tabelle 1 , Fig. 10 rechte Matrix, hell schattiert). Die Reihe 5 (Tabelle 1 , Fig. 10) enthält demnach einzelsträngige "sense" DNA, die Reihe 6 (Tabelle 1 , Fig. 10) keine DNA.
Je 50 μl der oben beschriebenen Cy™5 markierten mutS-Proteine wurden über Sephadex G50 Spin-Columns (Pharmacia, Uppsala, Schweden) nach Angabe des Herstellers gereinigt und somit von unkonjugiertem Farbstoff vollständig befreit. Die Säulen wurden vorher mit 500 μl Puffer (20 mM Tris-HCI pH 7.6, 150 mM KCI, 10 mM MgCI2 0.1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol (DTT)) equilibiriert, das gereinigte Protein wurde auf die Chipoberfläche gegeben und für 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Cy™3-Fluoreszenzintensität auf der Chipoberfläche nach Angaben des Herstellers Nanogen gemessen (Tabelle 1 ). Die geringen Schwankungen der Werte in den Reihen 1 bis 4 sowie 7 und 8 deuten auf eine gleichmäßige Hybridisierung der doppelsträngigen Oligonukleotide AT und GT hin. Die im Vergleich dazu niedrigeren Werte der Reihen 9 und 10 reflektieren die in diesen Reihen kleineren DNA-Mengen aufgrund niedrigerer Adressierungsstromstärke (s. o.). Die niedrigen Werte in der Reihe 5 stellen das Hintergrundsignal dar, da an diese Reihe keine fluoreszenzmarkierte DNA adressiert wurde. Reihe 6 enthält als Kontrolle nur einzelsträngige DNA „sense".
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adressierten lOOPositionen Chip bei 575 nm. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten sowie die an diese Positionen adressierte DNA (äußere rechte Spalte).
Die anschließende Fluoreszenzmessung des Cy™5 -markierten E. coli mutS-
Proteins zeigt deutlich, dass das Protein bevorzugt an das Oligonukleotid GT bindet (Tabelle 2). Selbst bei sehr kleinen DNA-Mengen (Tabelle 2, Reihen 9 und 10) ist eine Diskriminierung zwischen dem perfekt paarenden Oligonukleotid (AT) und dem eine Basenfehlpaarung erzeugenden Oligonukleotid (GT) mit dem farbstoffmarkierten Protein möglich, die bei größeren DNA-Mengen (Reihen 1 - 4 sowie 7 und 8, vergleiche Tabelle 1 ) noch deutlicher wird. Auffällig sind weiterhin die niedrigen Hintergrundwerte (Tabelle 2, Reihe 5 und 6). Um zu ermitteln, ob andere Basenfehlpaarungen-bindende Proteine wie z.B. das mutS-Protein aus T aquaticus ebenfalls zum schnellen Nachweis von Mutationen auf elektronisch adressierbaren Chips verwendet werden können, wurde zunächst ein 100 Positionen-Chip der Firma
Nanogen genau wie oben beschrieben adressiert. Anschließend wurde Cy™5- markiertes T aquaticus mutS-Protein wie oben beschrieben über Sephadex G50 SpinColumns weiter aufgereinigt und für 20 min mit der Chipoberfläche inkubiert. Anschließend wurde die Fluoreszenzintensität der Cy™3 auf der Chipoberfläche nach Angaben des Herstellers Nanogen gemessen (Tabelle 3). Die geringen
Schwankungen der Werte in den Reihen 1 - 4 sowie 7 und 8 deuten wiederum auf eine gleichmäßige Hybridisierung der doppelsträngigen Oligonukleotide AT und GT hin. Die im Vergleich dazu niedrigeren Werte der Reihen 9 und 10 reflektieren wieder die in diesen Reihen kleineren DNA-Mengen wegen niedrigerer Adressierungsstromstärke (s. o.). Die niedrigen Werte in den Reihen 5 und 6 stellen das Hintergrundsignal dar, da an diese Reihen keine fluoreszenzmarkierte DNA adressiert wurde. Die anschließende Fluoreszenzmessung des Cy™5-markierten T aquaticus mutS-Proteins zeigt deutlich, dass auch dieses Protein bevorzugt an das Oligonukleotid GT bindet (Tabelle 4) und somit zum Nachweis von Mutationen auf elektronisch adressierbaren DNA-Chips geeignet ist.
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Tabelle 2: Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Cy™5markiertem E. coli mutS-Protein auf einem elektronisch adressierten 100-Positionen Chip bei 670 nm. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten sowie die an diese Positionen adressierte DNA (äußere rechte Spalte).
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Tabelle 3: Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Cy 3 -markierter DNA auf einem elektronisch adressierten 100 Positionen Chip bei 575 nm. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten sowie die an diese Positionen adressierte DNA (äußere rechte Spalte).
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Tabelle 4: Bestimmung der Fluoreszenzintensität von Cy 5markiertem T. aquaticus mutS-Protein auf einem elektronisch adressierten 100-Positionen Chip bei 670 nm. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten sowie die an diese Positionen adressierte DNA (äußere rechte Spalte).
Beispiel: Nachweis von Mutationen in DNA-Molekülen auf elektronisch adressierbaren Chips in Abhängigkeit von den Salzbedingungen.
Vergleich der Bindung von E. co//-mutS an Basenfehlpaarungen unter Hochsalz- und N iedrigsalz-Bedingungen:
Zur Verbesserung der Meßgenauigkeit wurden die Bindungsbedingungen des farbstoffmarkierten mutS-Proteins untersucht und optimiert, so dass Basenfehlpaarungen auf der Oberfläche eines elektronisch adressierbaren Chips noch besser erkannt werden. Dazu wurden zunächst zwei elektronisch adressierbare Chips der Firma Nanogen, deren Oberfläche aus einer Agaroseschicht mit darin eingebetteten
Streptavidinmolekülen besteht, mit dem biotinylierten Oligonukleotid „sense" (Seq. ID No. 10) beladen und dann mit den Cy™3-markierten Oligonukleotiden „AT" (Seq. ID No. 12, Gegenstrang für perfekte Basenpaarung) bzw. GT (Seq. ID No. 13, Gegenstrang für GT-Basenfehlpaarung) hybridisiert. Anschließend wurde die Bindung von mutS an die so erhaltenen DNA-Doppelstränge bei zwei verschiedenen
Salzkonzentrationen getestet. Dazu werden zunächst die Oligonukleotide mit einer Konzentration von 100 nM in Histidinpuffer gelöst und 5 min bei 95°C inkubiert. Die elektronische Adressierung des Oligonukleotids „sense" auf definierte Positionen der beiden Agarosechips erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec bei einer Spannung von 2,0 V, die Hybridisierung mit den Zweitstrang-Oligonukleotiden „AT" bzw. GT für 120 sec bei 2,0 V. Das für beide Chips identische
Beladungsschema ist in Tabelle 5 dargestellt. Nach der Beladung wurden die Chips aus dem Ladegerät entnommen, mit je 1 ml Phosphat-Blockpuffer gefüllt und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 45 min bei Raumtemperatur inkubiert. Einer der Chips (nachfolgend als Chip A bezeichnet) wurde anschließend mit 0,5 ml
Hochsalzpuffer gewaschen und mit einem Gemisch aus 20 μl Cy™5-markiertem E.co//-MBP-mutS (Konzentration: 0,45 μg/μl) + 79 μl Hochsalzpuffer + 1 μl 100x BSA (New England Biolabs, Frankfurt am Main) 20 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde der Chip von Hand bei Raumtemperatur mit 135 ml Hochsalzpuffer gewaschen. Der zweite Chip (Chip B) wurde nach dem gleichen Protokoll behandelt, jedoch unter
Verwendung von Niedrigsalzpuffer anstelle des Hochsalzpuffers. Schließlich wurden die Cy™5-Fluoreszenzintensitäten auf der Oberfläche beider Chips im Nanogen-Reader gemessen. Folgende Geräteeinstellungen wurden für die Messung verwendet: hohe Sensitivität („high gain"); 256 μs Integrationszeit. Die gemessenen Werte sind in Tabelle 6 (für Chip A) sowie Tabelle 7 (für Chip B) angegeben, die statistische Auswertung der Ergebnisse ist in Tabelle 8 dargestellt.
Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin (Sigma, Deisenhofen); diese Lösung wurde durch eine Membran der Porengröße 0,2 μm filtriert und durch Unterdruck entgast Phosphat-Blockpuffer: 50 mM NaPO4, pH 7,4 / 500 mM NaCI / 3%
Rinderserumalbumin (BSA; von Serva, Heidelberg)
Niedrigsalzpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20
/ 1 mM DTT
Hochsalzpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 300 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 1 mM DTT
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Tabelle 5: Beladungsschema für Chips A und B; „AT": perfekte Paarung, Positionen wurden mit sense adressiert und anschließend mit „AT" hybridisiert; GT: GT-Fehlpaarung, Positionen wurden mit sense adressiert und dann mit GT hybridisiert; sense: Einzelstrang sense, Positionen wurden mit sense adressiert, jedoch mit keinem Gegenstrang hybridisiert; ss'ΑT": Einzelstrang „AT", Positionen wurden nur mit „AT" beladen, ohne biotinylierten Erststrang.
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markiertem E. co/z'-MBP-mutS an perfekt gepaarte bzw. GT-fehlgepaarte DNA-Doppelstränge unter Hochsalzbedingungen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen
Fluoreszenzintensitäten.
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Fluoreszenz ntensitäten.
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Tabelle 8: Statistische Auswertung der Ergebnisse von Chip A und Chip B. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung.
Aus Tabelle 8 geht hervor, daß das Eco//-MBP-mutS unter Niedrigsalz-Bedingungen
(50 mM KCI) stärker an GT-fehlgepaarte DNA-Doppelstränge bindet als an perfekt gepaarte Doppelstränge oder auch an einzelsträngige DNA. Bei der höheren Salzkonzentration (300 mM KCI) ließ sich dagegen nur eine gering bevorzugte Bindung des mutS-Proteins an fehlgepaarte DNA-Doppelstränge nachweisen. Dies ist insofern überraschend, da in der Literatur meist relativ hohe Salzkonzentrationen für die Bindung von mutS verwendet werden. Vermutlich kommt es jedoch bei den hier verwendeten Chips zu einer unspezifischen hydrophoben Interaktion zwischen dem Protein und der Agarosepermeationsschicht des Chips, die eine gute Penetration des Chips unter hohen Salzbedingungen verhindert. Aus diesem Grund wurden in allen folgenden Experimenten Puffer mit geringen Salzkonzentrationen verwendet.
Beispiel: Erkennung verschiedener Basenfehlpaarungen durch mutS
In diesem Experiment wird gezeigt, dass mutS-Protein auch zum Nachweis anderer
Basenfehlpaarungen oder Insertionen/Deletionen auf DNA-Chips eingesetzt werden kann. Dazu wurden auf den verschiedenen Positionen eines elektronisch adressierbaren Agarosechips der Firma Nanogen durch Hybridisierung folgende Arten von DNA-Doppelsträngen erzeugt: - vollständig komplementäre Doppelstränge
- Doppelstränge, die eine der acht möglichen Basenfehlpaarungen (AA, AG, CA, CC, CT, GG, GT, TT) enthalten
- Doppelstränge, bei denen ein Strang eine Insertion von 1 , 2 oder 3 Basen enthält.
Anschließend wurde die Bindung von E.co//-mutS an die so erhaltenen DNA- Doppelstränge getestet. Dazu wurden zunächst die Erst- und Zweitstrang- Oligonukleotide mit einer Konzentration von 100 nM in Histidinpuffer gelöst und 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung des biotinylierten Oligonukleotids „sense" (Seq. ID No. 10) auf die einzelnen Positionen des Agarosechips erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec bei einer Spannung von 2,0 V. Die Hybridisierung mit den Zweitstrang-Oligonukleotiden „AT" (Seq. ID No. 12), GT (Seq. ID No. 13), AA (Seq. ID No. 14), AG (Seq. ID No. 15), CA (Seq. ID No. 16), CC (Seq. ID No. 17), CT (Seq. ID No. 18), GG (Seq. ID No.
19), TT (Seq. ID No. 20), ins+1T (Seq. ID No. 21), ins+2T (Seq. ID No. 22) sowie ins+3T (Seq. ID No. 23) wurde für 120 sec bei 2,0 V durchgeführt. Das Beladungsschema ist in Tabelle 9 dargestellt; der Name jedes Zweitstrang- Oligonukleotides gibt die bei der Hybridisierung entstehende Fehlpaarung oder Insertion („ins") an.
Nach der Beladung wurde der Chip aus dem Ladegerät entnommen, mit 1 ml Blockpuffer gefüllt und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Chip mit 10 μl Cy™5- markiertem Eco//-mutS (Konzentration: 50 ng/μl) in 90 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde der Chip von Hand mit
1 ml Inkubationspuffer gewaschen, dann in den Nanogen-Reader eingesetzt und dort bei einer Temperatur von 37°C 70x mit je 0,5 ml Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Cy™5-Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen Positionen des Chips im Nanogen-Reader mit folgenden Geräteeinstellungen gemessen: hohe Sensitivität („high gain"); 256 μs Integrationszeit. Die gemessenen relativen
Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 10 angegeben; die Ergebnisse der statistischen Auswertung der Meßdaten sind in Tabelle 1 1 sowie in Fig. 11 dargestellt.
Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin; diese Lösung wurde durch eine Membran der
Porengröße 0,2 μm filtriert und durch Unterdruck entgast
Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 3%
BSA (Serva, Heidelberg)
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 1 % BSA
Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,1 % Tween-20
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- . - unterschiedüche Basenfehlpaarungen. „Neg.": nicht mit DNA beladene Positionen. „ssDNA": nur mit dem Einzelstrang „sense" beladene Positionen. Alle übrigen Positionen wurden zuerst mit dem Oligonukleotid „sense" adressiert und danach mit dem in der Tabelle angegebenen Zweitstrang hybridisiert.
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Tabelle 10 : Messung der roten Fluoreszenzintensität eines Agarosechips zum Nachweis der Bindung von
Cy 5-markiertemi?.co/.-mutS an DNA-Doppelstränge mit unterscliiedhchen Fehlpaarungen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
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Tabelle 11: Statistische Auswertung der Ergebnisse des Agarosechips mit unterschiedlichen Basenfehlpaarungen. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung. Zusätzlich wurde für jede Fehlpaarung der Quotient aus dem entsprechenden Mittelwert und dem mit perfekt gepaarter DNA („ AT") erhaltenen Wert ermittelt.
Fig. 11 zeigt die Bindung von Cy™5-markiertem Eco/V-mutS an fehlgepaarte DNA- Doppelstränge, die durch Hybridisierung auf einem elektronisch adressierbaren Agarosechip erzeugt wurden. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die verschiedenen Basenfehlpaarungen und Insertionen.
Aus Tabelle 11 geht hervor, daß die Mittelwerte der Fluoreszenzintensitäten bei allen getesteten Fehlpaarungen und Insertionen über dem mit dem perfekt gepaarten Doppelstrang erhaltenen Wert liegen. Am besten wird die GT-Fehlpaarung von mutS gebunden; die auf diesen Positionen gemessenen Fluoreszenzwerte sind etwa um den Faktor 7 höher als bei der perfekt gepaarten DNA. Die Fehlpaarungen CC und
TT wurden dagegen von mutS nur schwach erkannt. Zusätzlich zu den verschiedenen Basenfehlpaarungen können mit der hier beschriebenen Methode auch Insertionen von ein oder zwei Basen nachgewiesen werden (Fig. 11).
Beispiel: Nachweis von Punktmutationen durch mutS auf einem elektronisch adressierbaren Hydrogelchip
Das im vorigen Abschnitt beschriebene Experiment zur Erkennung verschiedener Punktmutationen durch mutS wurde mit einem anderen elektronisch adressierbaren Chiptyp der Firma Nanogen wiederholt, der anstelle der Agaroseschicht eine
Hydrogel-Matrix mit darin eingebetteten Streptavidinmolekülen enthielt. Um zu prüfen, welche Art von Chipoberfläche für die hier vorgestellte Methode zur Erkennung von Punktmutationen am besten geeignet ist, wurden dann die mit beiden Chiptypen erhaltenen Resultate miteinander verglichen.
Experimentelle Durchführung:
Die Beladung des Hydrogelchips erfolgte nach dem im Beispiel „Erkennung verschiedener Basenfehlpaarungen durch mutS" beschriebenen Protokoll, allerdings wurde sowohl die Adressierung des Erststrang-Oligonukleotides „sense" auf den Hydrogelchip als auch die Hybridisierung mit den verschiedenen Zweitsträngen bei einer Spannung von 2,1 V durchgeführt. Das Beladungsschema ist in Tabelle 9 angegeben.
Der beladene Hydrogelchip wurde nach dem im Abschnitt „Erkennung verschiedener Basenfehlpaarungen durch mutS" angegebenen Protokoll mit BSA abgesättigt, mit Cy™5-markiertem Eco//-mutS inkubiert und gewaschen. Das an die einzelnen Positionen gebundene mutS-Protein wurde dann durch Messung der roten Fluoreszenzintensität nachgewiesen. Hierfür wurden die gleichen Geräteeinstellungen verwendet wie für die Messung des Agarosechips („high gain", Integrationszeit 256 μs). Die gemessenen relativen Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 12 angegeben; die Ergebnisse der statistischen Auswertung der Meßdaten sind in Tabelle 13 sowie in Fig. 12 dargestellt.
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Tabelle 12: Messung der roten Fluoreszenzintensität eines Hydrogelchips zum Nachweis der Bindung von
Cy™5-markiertem£'.co/z-mutS an DNA-Doppelstränge mit unterschiedüchen Fehlpaarungen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
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Tabelle 13: Statistische Auswertung der Ergebnisse des Hydrogelchips mit unterschiedlichen Fehlpaarungen. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung. Zusätzlich wurde für jede Fehlpaarung der Quotient aus dem entsprechenden Mittelwert und dem mit perfekt gepaarter DNA erhaltenen Wert ermittelt.
Fig. 12 zeigt die Bindung von Cy™5-markiertem Eco//-mutS an fehlgepaarte DNA- Doppelstränge, die durch Hybridisierung auf einem elektronisch adressierbaren Hydrogelchip erzeugt wurden. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die verschiedenen
Basenfehlpaarungen und Insertionen.
Wie aus Tabelle 13 und Fig. 12 hervorgeht, ergibt sich bei Verwendung des Hydrogelchips ein ähnliches Bild wie mit dem Agarosechip: die Fehlpaarung GT wird am besten von dem E.co//-mutS erkannt, während DNA-Doppelstränge mit den
Fehlpaarungen CC und TT von dem Protein kaum stärker gebunden werden als perfekt gepaarte Doppelstränge. Insgesamt liegen die Quotienten zwischen den mit fehlgepaarter und mit perfekt gepaarter DNA erhaltenen Fluoreszenzwerten bei dem Hydrogelchip (Tabelle 13) jedoch etwas höher als bei dem Agarosechip (Tabelle 11 ). Mit dem Hydrogelchip ist daher eine bessere Unterscheidung zwischen mutierter und nicht mutierter DNA möglich. Darüber hinaus sind bei gleicher Einstellung des Meßgeräts auf höchste Empfindlichkeit („high gain") die absoluten Meßwerte bei dem Hydrogelchip um den Faktor 4-5 höher als bei dem Agarosechip, wodurch eine bessere Ausnutzung des Meßbereiches ermöglicht wird. Die mit der GT- Fehlpaarung erhaltene Fluoreszenzintensität liegt bei dem Hydrogelchip sogar im
Sättigungsbereich (>1049). Eine mögliche Erklärung für die höhere Fluoreszenz auf dem Hydrogelchip besteht darin, dass das relativ große mutS-Protein besser in die Poren der Hydrogelschicht eindringen kann als in die Agarosematrix. Zusammenfassend konnte durch den Vergleich zwischen dem Agarosechip und dem Hydrogelchip gezeigt werden, daß beide Chipsorten für den auf mutS basierenden
Mutationsnachweis geeignet sind. Allerdings bietet der Hydrogelchip gegenüber dem Agarosechip die Vorteile einer höheren Sensitivität und einer besseren Diskriminierung zwischen fehlgepaarter und perfekt gepaarter DNA. Vergleichsbeispiel: Basenfehlpaarungserkennung durch farbstoffmarkierte mutS- Proteine
Unter Verwendung der Oberflächenplasmonresonanztechnologie wurde die Bindung der mutS-Proteine an verschiedene Basenfehlpaarungen untersucht. Dies war nötig, um zu überprüfen, ob tatsächlich alle Basenfehlpaarungen spezifisch von den Proteinen gebunden werden. Im Gegensatz zu den bereits beschriebenen Band- Shift Assays erlaubt die Oberflächenplasmonresonanztechnologie eine genauere Quantifizierung der Bindungsereignisse. Dazu wurde das am 5 '-Ende biotinylierte Oligonukleotid „sense" (Seq. ID No. 11) sowie zu diesem Oligonukleotid teilkomplementäre Oligonukleotide synthetisiert (Seq. ID No. 12-22) (Firma Biospring, Frankfurt/Main). Werden diese Oligonukleotide gegen das Oligonucleotid "sense" hybridisiert, so entsteht vollständig gepaarte doppelsträngige DNA (AT), doppelsträngige DNA mit einer Basenfehlpaarung (AA, AC, AG, CC, CT, GG, GT, TT) oder doppelsträngige DNA mit einer Insertion von 1 , 2 oder 3 Thymidinresten (Tabelle 14).
Die Oligonukleotide wurden in Puffer HBS-EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCI, 3 mM EDTA, 0.005% (w/v) Polysorbat20, 5 mM MgCI2) zu einer Konzentration von 2 pmol/μl aufgenommen. Das Oligonukleotid „sense" wurde dann mit einer
Flußrate von 5 μl/min auf die mit Streptavidin beladenen Kanäle der Oberfläche eines Biacore SA-Chips bis zur Sättigung aufgebracht, wie beispielhaft in Fig. 13 gezeigt wird. Die diesem Oligonukleotid teilkomplementären Oligonukleotide wurden unter identischen Pufferbedingungen auf die jeweiligen Kanäle des Chips wie im Beispiel "Nachweis von Punktmutationen durch mutS auf einem elektronisch adressierbaren Hydrogelchip" aufgebracht, um die in Tabelle 14 dargestellten doppelsträngigen DNA-Spezies zu erhalten. Nach dem Erzeugen der doppelsträngigen Oligonukleotide wurde die Chipoberfläche mit 20 mM Tris-HCI pH 7.6, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 0.01 % Tween-20, 10% (v/v) Glycerin equilibriert. Das mit Cy™5 markierte mutS-Maltosebindungsprotein-Fusionsprotein wurde in demselben Puffer zu einer Konzentration von 0.1 μg/μl aufgenommen und mit einer Flussrate von 5 μl/min auf den Chip aufgetragen. Anschließend wurden die Kanäle des Chips mit 100μl des Puffers 20 mM Tris-HCI pH 7.6, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 0.01 % Tween-20, 10% (v/v) Glycerin gespült, wodurch unspezifisch gebundenes Protein weggespült wurde. Nach dem Spülen wurde die an das jeweilige -. doppelsträngige Oligonukleotid gebundene Proteinmenge (als Resonanzeinheit ausgedrückt) bestimmt (Tabelle 14). Dabei zeigte sich, dass außer der CC- Basenfehlpaarung prinzipiell alle Basenfehlpaarungen und Insertionen von dem markierten Fusionsprotein besser gebunden werden als das perfekt gepaarte Oligonukleotid „AT" (Tabelle 14). Somit ist das von uns konzipierte und hergestellte fluoreszenzfarbstoffmarkierte mutS-Protein in der Lage, jede mögliche Mutation zu lokalisieren. Den Autoren ist kein weiteres fluoreszenzfarbstoffmarkiertes Protein bekannt, dessen DNA-bindende Eigenschaften nach der Markierung erhalten bleiben, wie es bei dem hier beschriebenen Protein der Fall ist.
Fig. 13 zeigt ein exemplarisches Sensogramm der mutS-Bindung. Dargestellt ist die zeitliche Änderung der Masse (RU, Resonanzeinheiten) in den 4 Kanälen eines Biacore-SA Chips. Das biotinylierte Oligonukleotid „sense" wurde auf die Kanäle 1-4 aufgebracht und mit den jeweiligen Gegensträngen hybridisiert, um einen perfekt gepaarten Doppelstang („AT", Kanal 4) bzw. DNA mit den Basenfehlpaarungen GT (Kanal 1 ), CC (Kanal 3) oder GG (Kanal 2) zu erzeugen. Anschließend wurde das Protein aufgetragen (von t=4638 bis t=5239). Ungebundenes Protein wurde durch Waschen entfernt (von t=5378 bis bis t=6579). Von der nach dem Spülen gemessenen Resonanz (t=6579) wurde die Resonanz vor der Proteinbeladung (bei t=4502) abgezogen. Die Differenz entspricht der Masse des gebundenen mutS- Proteins.
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Tabelle 14: Gezeigt ist die Bindung des MBP-mutS-Fusionsproteins an doppelsträngige, auf die Oberfläche von Biacore™SA-Chips gebundene Oligonukleotide mit Basenfehlpaarungen (unterstrichene Basen).
Beispiel: Nachweis von GT-Fehlpaarungen in verschiedenen Oligonukleotiden
In der Literatur ist beschrieben, daß die Erkennung von Punktmutationen durch mutS nicht nur von der Art der entstandenen Basenfehlpaarung abhängt, sondern auch von der Nukleotidsequenz in der Umgebung der Fehlpaarung beeinflußt wird (M. Jones et al., Genetics 115 (1987), 505-610). Daher wurde getestet, ob es mit der hier beschriebenen Methode möglich ist, GT-Fehlpaarungen unabhängig vom jeweiligen Sequenzkontext zuverlässig nachzuweisen. Für dieses Experiment wurden acht verschiedene Erststrang-Oligonukleotide mit unterschiedlichen Basensequenzen auf definierte Positionen eines Agarose- sowie eines Hydrogelchips adressiert und mit den jeweils komplementären Gegensträngen für perfekte Paarung („AT") bzw. für GT-Fehlpaarung hybridisiert. Anschließend wurde die Bindung von E.co//-mutS an die verschiedenen Doppelstränge untersucht.
Experimentelle Durchführung: Alle Oligonukleotide wurden mit einer Konzentration von 100 nM in Histidinpuffer gelöst und 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung der biotinylierten Erststrang-Oligonukleotide „sense" (Seq. ID No. 10), APC se (Seq. ID No. 24), bei se (Seq. ID No. 27), Brc se (Seq. ID No. 30), Met se (Seq. ID No. 33), MSH se (Seq. ID No. 36), p53 se (Seq. ID No. 39) und Rb se
(Seq. ID No. 42) auf die einzelnen Positionen erfolgte im Ladegerät der Nanogen- Workstation für 60 sec bei einer Spannung von 2,0 V (für den Agarosechip) bzw. 2,1
V (für den Hydrogelchip). Die Hybridisierung mit den Cy™3-markierten Gegensträngen wurde für 120 sec bei 2,0 V (für den Agarosechip) bzw. 2,1 V (für den Hydrogelchip) durchgeführt. Das Beladungsschema für den Agarosechip ist in Tabelle 15, das Beladungsschema für den Hydrogelchip in Tabelle 19 dargestellt. Folgende Zweitstrang-Oligonukleotide wurden verwendet:
- für perfekte Paarung: AT (Seq. ID No. 12), APC AT (Seq. ID No. 25), bei AT (Seq. ID No. 28), Brc AT (Seq. ID No. 31), Met AT (Seq. ID No. 34), MSH AT (Seq. ID No. 37), p53 AT (Seq. ID No. 40), Rb AT (Seq. ID No. 43)
- für GT-Fehlpaarung: GT (Seq. ID No. 13), APC GT (Seq. ID No. 26), bei GT (Seq. ID No. 29), Brc GT (Seq. ID No. 32), Met GT (Seq. ID No. 35), MSH GT
(Seq. ID No. 38), p53 GT (Seq. ID No. 41), Rb GT (Seq. ID No. 44) Nach der Beladung wurden die Chips aus dem Ladegerät entnommen, mit 1 ml Blockpuffer gefüllt und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Chips mit 10 μl Cy™5- markiertem E co//-mutS (Konzentration: 50 ng/μl) in 90 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Chips von Hand mit 1 ml Inkubationspuffer gewaschen, dann in den Nanogen-Reader eingesetzt und dort bei einer Temperatur von 37°C 70x mit je 0,5 ml Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Cy™5- und Cy™3-Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen Positionen der Chips im Nanogen-Reader mit folgenden Geräteeinstellungen gemessen:
Rote Fluoreszenz (Cy™5): hohe Sensitivität („high gain"); 256 μs Integrationszeit Grüne Fluoreszenz (Cy™3): niedrige Sensitivität („low gain"); 256 μs Integrationszeit
Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin; diese Lösung wurde durch eine Membran der
Porengröße 0,2 μm filtriert und durch Unterdruck entgast Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 3% BSA
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 1 % BSA Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,1 % Tween-20
Für das auf einem Agarosechip durchgeführte Experiment sind die gemessenen grünen Fluoreszenzintensitäten in Tabelle 16 und die roten Fluoreszenzintensitäten in Tabelle 17 angegeben. Zusätzlich zu den Positionen des Chips, die als Negativkontrolle nicht mit DNA beladen worden waren, wiesen auch einzelne andere
Felder (Positionen 1/10, 2/4, 2/5, 2/6, 2/10 und 3/2) nur eine geringe grüne Fluoreszenz auf. Da auf diesen Positionen die Beladung mit dem Cy™3-markierten Zweitstrang vermutlich nicht funktioniert hat, wurden sie nicht in die weitere Auswertung einbezogen. Die Ergebnisse der statistischen Auswertung der roten Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 18 sowie in Fig. 14 dargestellt.
Für das auf einem Hydrogelchip durchgeführte Experiment sind die gemessenen grünen Fluoreszenzintensitäten in Tabelle 20 und die roten Fluoreszenzintensitäten in Tabelle 21 aufgeführt. Die grünen Fluoreszenzintensitäten lagen insgesamt niedriger als bei dem Agarosechip. Die Ergebnisse der statistischen Auswertung der roten Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 22 sowie in Fig. 15 dargestellt. Die
Chipposition 9/6 wurde aufgrund der sehr geringen grünen Fluoreszenz nicht in die Auswertung einbezogen.
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9 Metse Met se Metse MSHse MSHse MSHse Rbse Rbse Rbse MetAT MetAT MetAT MSHAT MSHAT MSHAT RbAT RbAT RbAT
10 Metse Met se Metse MSHse MSHse MSHse Rbse Rbse Rbse MetGT MetGT MetGT MSHGT MSHGT MSHGT RbGT RbGT RbGT
Tabelle 15: Beladungsschema eines Agarosechips zum Nachweis der Bindung von Cy ' 5-markiertem E.coli- mutS an GT-Basenfehlpaarungen in verschiedenen DNA-Doppelsträngen. Leere Kästchen symbolisieren nicht mit DNA beladene Positionen. Alle übrigen Positionen wurden zuerst mit dem in der oberen Zeile genannten Oligonukleotid adressiert und danach mit dem in der unteren Zeile angegebenen Zweitstrang hybridisiert.
Figure imgf000056_0001
Tabelle 16: Messung der grünen Fluoreszenzintensität eines Agarosechips zur Übe riifung der Beladung mit Cy™3 -markierten Zweitstrang-Oligonukleotiden. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000056_0002
Tabelle 17: Messung der roten Fluoreszenzintensität eines Agarosechips zum Nachweis der Bindung von
Cy 5-markiertem E.coli-mutS an GT-Basenfehlpaarungen in verschiedenen DNA-Doppelsträngen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000056_0003
Tabelle 18: Statistische Auswertung des Agarosechips mit unterscliiedhchen perfekt gepaarten und GT- fehlgepaarten DNA-Doppelsträngen. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der roten Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung. Zusätzüch wurde für jeden Erststrang der Quotient aus der Fluoreszenz nach Zugabe des entsprechenden GT-fehlpaarenden Zweitstranges und der Fluoreszenz nach Zugabe des vollständig komplementären Zweitstranges ermittelt. Die Positionen 1/10, 2/4, 2/5, 2/6, 2/10 und 3/2 wurden aufgrund ihrer geringen grünen Fluoreszenz nicht in die Auswertung eiribezogen.
Fig. 14 zeigt die Bindung von Cy™5-markiertem E.co/7-mutS an unterschiedliche perfekt gepaarte (AT) und GT-fehlgepaarte DNA-Doppelstränge, die durch Hybridisierung auf einem elektronisch adressierbaren Agarosechip erzeugt wurden. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die verschiedenen Doppelstränge.
Figure imgf000057_0001
Tabelle 19 : Beladungsschema eines Hydrogelchips zum Nachweis der Bindung von Cy 5-markiertem E coli- mutS an GT-Basenfehlpaarungen in verschiedenen DNA-Doppelsträngen. Leere Kästchen symbolisieren nicht mit DNA beladene Positionen. Alle übrigen Positionen wurden zuerst mit dem in der oberen Zeile genannten Oligonukleotid adressiert und danach mit dem in der unteren Zeile angegebenen Zweitstrang hybridisiert.
Figure imgf000057_0002
10 219.665 202.494 270.224 508.069 483.704 498.981 447.416 414.754 452.484 4.619
Tabelle 20: Messung der grünen Fluoreszenzintensität eines Hydrogelchips zur Überprüfung der Beladung mit
Cy 3 -markierten Zweitstrang-Oligonukleotiden. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000058_0001
Tabelle 21 : Messung der roten Fluoreszenzintensität eines Hydrogelchips zum Nachweis der Bindung von
Cy 5-markiertem E. co/z'-mutS an GT-Basenfehlpaarungen in verschiedenen DNA-Doppelsträngen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000058_0002
Tabelle 22: Statistische Auswertung des Hydrogelchips mit unterschiedüchen perfekt gepaarten und GT- fehlgepaarten DNA-Doppelsträngen. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der roten Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung. Zusätzlich wurde für jeden Erststrang der Quotient aus der Fluoreszenz nach Zugabe des entsprechenden GT-fehlpaarenden Zweitstranges und der Fluoreszenz nach Zugabe des vollständig komplementären Zweitstranges ermittelt. Die Position 9/6 wurde aufgrund ihrer geringen grünen Fluoreszenz nicht in die Auswertung einbezogen.
Fig. 15 zeigt die Bindung von Cy™5-markiertem E.co//-mutS an unterschiedliche perfekt gepaarte (AT) und GT-fehlgepaarte DNA-Doppelstränge, die durch Hybridisierung auf einem elektronisch adressierbaren Hydrogelchip erzeugt wurden. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die verschiedenen Doppelstränge.
Die Auswertung des Experimentes ergab, daß mit der hier beschriebenen Methode alle getesteten GT-Fehlpaarungen sowohl auf dem Agarosechip (Tabelle 18; Fig. 14) als auch auf dem Hydrogelchip (Tabelle 22; Fig. 15) nachgewiesen werden konnten: in allen Fällen trat eine stärkere Bindung des mutS-Proteins an die Fehlpaarung als an den jeweiligen perfekt gepaarten Doppelstrang auf. Ein zuverlässiger Nachweis von GT-Basenfehlpaarungen mit Hilfe von mutS ist demnach möglich, obwohl der Quotient zwischen den mit GT-fehlgepaarter und perfekt gepaarter DNA erhaltenen Meßwerten durchaus
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der benachbarten DNA- Sequenz beeinflußt wird.
Ein Vergleich zwischen den mit den beiden unterschiedlichen Chiptypen erhaltenen Resultaten (Tabelle 18 und Tabelle 22) zeigt auch diesmal, daß auf dem Hydrogelchip eine bessere Diskriminierung zwischen perfekt gepaarter und fehlgepaarter DNA erreicht wird als auf dem Agarosechip: für fünf der getesteten Sequenzen ergaben die Quotienten zwischen den Meßwerten bei fehlgepaarter und perfekt gepaarter DNA (GT/AT) auf dem Hydrogelchip höhere Werte. Bei den restlichen drei DNA-Sequenzen („sense", bei se und APC se) lag die für die GT- Fehlpaarung gemessene Fluoreszenz bei dem Hydrogelchip im Sättigungsbereich
(>1049), so daß in diesen Fällen für den Quotienten kein zuverlässiger Wert ermittelt werden konnte.
Beispiel: Erkennung von GT-Fehlpaarungen in einem Gemisch aus perfekt gepaarten und fehlgepaarten DNA-Doppelsträngen.
Isoliert man DNA bzw. cDNA aus einem menschlichen oder tierischen Gewebe, so weisen nicht immer alle isolierten Stränge die gleiche Nukleotidsequenz auf. Dies kann darin begründet sein, daß der Spenderorganismus für eine Mutation heterozygot ist (d.h., die Mutation ist in jeder Zelle nur auf einem der beiden homologen Chromosomen vorhanden), oder daß nur ein Teil der Zellen im Gewebe eine bestimmte Mutation aufweist. Diese Situation tritt vor allem in Tumoren häufig auf, da Tumorzellen genetisch instabil sind. Bei der Hybridisierung einer solchen inhomogenen Patienten-DNA mit einer Referenz-DNA wird sich dann ein Gemisch aus fehlgepaarten und perfekt gepaarten Doppelsträngen bilden.
In dem folgenden Experiment wurde getestet, wie hoch der Anteil an fehlgepaarter DNA in einem Gemisch sein muß, damit ein Nachweis der Mutation durch das mutS- Protein aus E. coli noch gewährleistet ist. Hierfür wurden die auf einen Agarosechip adressierten Erststrang-Oligonukleotide „sense" (Seq. ID No. 10) bzw. p53 se (Seq.
ID No. 39) jeweils mit unterschiedlichen Gemischen aus perfekt paarenden und GT- fehlpaarenden Zweitsträngen hybridisiert.
Für die Hybridisierung mit der Erststrang-DNA „sense" wurden folgende Gemische aus den Oligonukleotiden AT (Seq. ID No. 12) und GT (Seq. ID No. 13) als
Zweitstrang verwendet:
AT: Hybridisierung erfolgte mit 100 nM AT
GT: Hybridisierung erfolgte mit 100 nM GT
3%GT: Hybridisierung erfolgte mit einem Gemisch aus 3 nM GT + 97 nM AT 10%GT: Hybridisierung erfolgte mit einem Gemisch aus 10 nM GT + 90 nM AT
25%GT: Hybridisierung erfolgte mit einem Gemisch aus 25 nM GT + 75 nM AT
50%GT: Hybridisierung erfolgte mit einem Gemisch aus 50 nM GT + 50 nM AT
75%GT: Hybridisierung erfolgte mit einem Gemisch aus 75 nM GT + 25 nM AT
Für die Hybridisierung mit dem Erststrang p53 se wurden die entsprechenden Gemische aus den Oligonukleotiden p53 AT (Seq. ID No. 40) und p53 GT (Seq. ID
No. 41) eingesetzt.
Experimentelle Durchführung: Die Erst- und Zweitstrang-Oligonukleotide wurden in Histidinpuffer gelöst (Gesamtkonzentration: je 100 nM) und 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung der biotinylierten Oligonukleotide „sense" bzw. p53 se auf die einzelnen Positionen des Agarosechips der Firma Nanogen erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec bei einer Spannung von 2,0 V. Die Hybridisierung mit den verschiedenen Zweitstrang-Gemischen wurde für 120 sec bei 2,0 V durchgeführt. Das Beladungsschema ist in Tabelle 23 dargestellt. Nach der Beladung wurde der Chip aus dem Ladegerät entnommen, mit 1 ml
Blockpuffer gefüllt und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Chip mit 10 μl Cy™5- markiertem E.co//-mutS (Konzentration: 50 ng/μl) in 90 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde der Chip von Hand mit 1 ml Inkubationspuffer gewaschen, dann in den Nanogen-Reader eingesetzt und dort bei einer Temperatur von 37°C 70x mit je 0,5 ml Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Cy™5-Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen Positionen des Chips im Nanogen-Reader mit folgenden Geräteeinstellungen gemessen: hohe Sensitivität („high gain"); 256 μs Integrationszeit. Die gemessenen relativen Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 24 angegeben; die Ergebnisse der statistischen Auswertung der Meßdaten sind in Tabelle 25 sowie in den Fig. 16A und Fig. 16B dargestellt.
Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin; diese Lösung wurde durch eine Membran der
Porengröße 0,2 μm filtriert und entgast.
Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 3%
BSA
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01% Tween-20
/ 1 % BSA
Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,1 % Tween-20
Figure imgf000061_0001
Tabelle 23 : Beladungsschema eines Agarosechips zum Nachweis der Bindung von Cy 5-markiertem E coli- mutS an verschiedene Gemische aus perfekt gepaarten und GT-fehlgepaarten DNA-Doppelsträngen. Leere
Kästchen symbolisieren nicht mit DNA beladene Positionen (Negativkontrollen). Kästchen mit fetter Schrift kennzeichnen Positionen, die nur mit einem DNA-Strang beladen wurden (Einzelstrangkontrollen). Alle übrigen Positionen wurden zuerst mit dem in der oberen Zeile genannten, biotinylierten Oligonukleotid adressiert und danach mit dem in der zweiten Zeile angegebenen Zweitstrang-Gemisch hybridisiert. Als zusätzliche Kontrolle wurden die mit kursiver Schrift gekennzeichneten Positionen mit einer Kombination aus Erststrang und einem nicht komplementären Zweitstrang beladen; hier sollte es nicht zu einer Hybridisierung kommen.
Figure imgf000061_0002
Figure imgf000062_0001
Tabelle 24: Messung der roten Fluoreszenzintensität eines Agarosechips zum Nachweis der Bindung von Cy1M5-markiertem ?.co/z'-rnutS an verschiedene Gemische aus perfekt gepaarten und GT-fehlgepaarten DNA- Doppelsträngen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000062_0002
GT-fehlgepaarten DNA-Doppelsträngen. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der roten Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung.
Fig. 16 zeigt die Bindung von Cy™5-markiertem E.co//-mutS an verschiedene Gemische aus perfekt gepaarten und GT-fehlgepaarten DNA-Doppelsträngen, die durch Hybridisierung auf einem elektronisch adressierbaren Agarosechip erzeugt wurden. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die verschiedenen Doppelstränge. In Fig. 16A ist die Bindung von mutS an die mit dem Erststrang „sense" und den komplementären Oligonukleotiden AT (perfekt paarend) und GT (fehlpaarend) erhaltenen Doppelstränge dargestellt. Fig. 16B zeigt die Bindung von mutS an die mit dem Oligonukleotid p53 se und den komplementären Gegensträngen p53 AT (perfekt paarend) und p53 GT (fehlpaarend) erhaltenen Doppelstränge.
Für beide getesteten DNA-Sequenzen konnte übereinstimmend gezeigt werden, daß bereits ein DNA-Gemisch, das 90% perfekt gepaarte Doppelstränge und nur 10% GT-fehlgepaarte Stränge enthält, von mutS besser gebunden wird als eine zu 100% perfekt gepaarte DNA (Tabelle 25; Fig. 16). Im Falle der Erststrang-Sequenz p53 se lag die gemessene Cy™5-Fluoreszenz sogar schon bei einem Anteil von nur 3% fehlgepaarter DNA über dem mit der zu 100% perfekt gepaarten DNA erhaltenen Wert. Mit der hier beschriebenen Methode kann eine Mutation demnach auch dann noch nachgewiesen werden, wenn nur ein geringer Teil der zu testenden DNA- Stränge den entsprechenden Basenaustausch trägt.
Beispiel: Nachweis von Mutationen in genomischer DNA
Im folgenden Experiment wurde überprüft, ob der Nachweis von Mutationen in einem klinisch relevanten Gen mit Hilfe von mutS möglich ist, und ob PCR-Produkte von Genen aus Patientenproben mit Hilfe der vorliegenden Erfindung auf Mutationen untersucht werden können.
Das Tumorsupressorgen p53 spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Krebs (B. Vogelstein, K.W. Kinzler, Cell 70 (1992), 523-526); dementsprechend können Mutationen in p53 als prognostischer Marker für die Entwicklung eines Tumors dienen. Über 90% aller bekannten Mutationen in p53 befinden sich in dem
Bereich von Exon 5 bis Exon 9 des Gens (M. Hollstein, D. Sidransky, B. Vogelstein, CC Harris, Science 253, 49-53 (1991 )), der die DNA-bindende Domäne des Proteins kodiert. Es wurde nun geprüft, ob es möglich ist, Mutationen im Exon 8 des p53-Gens in humanen Zellinien mit Hilfe von farbstoffmarkiertem mutS auf elektronisch adressierbaren DNA-Mikrochips nachzuweisen. Dazu wurde genomische DNA der folgenden 4 humanen Tumorzellinien von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland, bezogen:
Die Nummerierung der Zellinien folgt der Kennzeichnung durch die DSMZ.
MCF-7 (DSMZ ACC 1 15) ist eine Adenocarzinomzellinie, hervorgegangen aus Brustdrüsenepithel; es sind keine Mutationen in p53 bekannt (Landers JE et al. Translational enhancement of mdm2 oncogene expression in human tumor cells containing a stabilized wild-type p53 protein. Cancer Res. 57: 3562-3568, 1997)
SW-480 (DSMZ ACC 313): etabliert aus einem humanen colorektalen Adenocarcinom, enthält eine G zu A -Mutation in Codon 273 des Exons 8 des p53- Gens (Weiss J et al. Mutation and expression of the p53 gene in malignant melanoma cell lines. Int. J. Cancer 54: 693-699, 1993)
MOLT-4 (DSMZ ACC 362): humane T-Lymphoblasten-Zelllinie, enthält eine G zu A- Mutation in Codon 248 des Exons 7 von p53 (Rodrigues NR et al. p53 mutations in colorectal cancer. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 7555-7559, 1990 )
293 (DSMZ ACC 305) ist eine mit Adenovirus transformierte humane embryonale
Nierenepithelzellinie, zu der keine Mutationen im p53 Exon 8 publiziert wurden.
Dem entsprechend enthält nur die Zellinie SW-480 und möglicherweise die Zellinie 293 eine Mutation im Exon 8 des p53-Gens.
Aus der genomischen DNA der beschriebenen Zelllinien wurde das Exon 8 durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert. Die jeweiligen PCR-Produkte (Länge: 237 bp) wurden dann auf einem Hydrogelchip mit einem synthetischen Oligonukleotid (Länge: 73 Basen) hybridisiert, dessen Sequenz der Wildtyp-Sequenz des zu untersuchenden Bereichs entsprach. Um eine Bindung von mutS an die überhängenden, einzelstrangigen Enden des PCR-Produkts und damit eine erhöhte unspezifische Hintergrundfluoreszenz zu verhindern, wurde der Chip mit einer Einzelstrang-spezifischen Endonuklease (Mung Bean Nuclease) und einem Einzelstrang-bindenden Protein behandelt. Anschließend wurde die Bindung von farbstoffmarkiertem Eco/-mutS an die verschiedenen Doppelstränge untersucht.
Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion: Ansatz pro Zelllinie: 84,2 μl H2O
10 μl 10x cloned Pfu DNA polymerase reaction buffer
(Stratagene, Amsterdam, NL) 0,8 μl dNTP (je 25 mM) 2 μl genomische DNA (150 ng/μl) 0,5 μl Primer Exonδfor (Seq. ID Nr. 45), 100 μM 0,5 μl Primer Exonδrev (Seq. ID Nr. 46), 100 μM, Cy3- markiert 2 μl Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (2,5U/μl,
Stratagene)
Die Amplifikation erfolgte in einem Thermocycler (GeneAmp PCR System 2400, Perkin Eimer, Langen, Deutschland) unter folgenden Bedingungen: initiale Denaturierung: 95°C, 2 min
31 Amplifikationszyklen, jeweils: 95°C, 30 sec - 62°C, 30 sec - 72°C, 1 min abschließende Elongation: 72°C, 10 min
Die PCR-Produkte wurden anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma QIAGEN gereinigt. Diese Aufreinigung erfolgte nach Angaben des Herstellers, vor der Elution der DNA wurde jedoch ein zusätzlicher Waschschritt mit 75%igem Ethanol durchgeführt. Die DNA wurde schließlich in 50 μl Wasser eluiert. Eine
Analyse der DNA auf einem 1 ,8%igen Agarosegel zeigte, daß für alle Zelllinien etwa die gleiche Menge an PCR-Produkt erhalten wurde.
Beladung des Chips: Das als Erststrang verwendete, biotinylierte Oligonukleotid cExonδ (Seq. ID No. 47) sowie die als Positiv- und Negativkontrolle verwendeten Oligonukleotide „sense", „AT" und „GT" wurden mit einer Konzentration von 100 nM in 50 mM Histidinpuffer gelöst. Die als Zweitstrang verwendeten, gereinigten PCR-Produkte wurden jeweils mit einem gleichen Volumen 100 mM Histidinpuffer gemischt. Alle DNA-Stränge wurden dann 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung des Erststranges cExonδ bzw. „sense" auf definierte Positionen eines Hydrogelchips erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec. bei einer Spannung von 2,1 V. Die Hybridisierung mit den Cy™3-markierten PCR-Produkten bzw. den Oligonukleotiden „AT" und „GT" wurde für 1 δ0 sec bei 2,1 V durchgeführt. Das Beladungsschema ist in Tabelle 27 dargestellt.
Nach der Beladung wurde der Chip aus dem Ladegerät entnommen, mit Equilibrierungspuffer gefüllt und die grüne Fluoreszenz auf den Positionen des Chips im Nanogen-Reader gemessen (Geräteeinstellungen: medium gain, 256 μs Integrationszeit). Das Ergebnis der Messung ist in Tabelle 2δ aufgeführt. Anschließend wurde der Chip mit 1 μl Mung Bean Nuclease (NEB, Frankfurt) + δ9 μl
1x Mung Bean Nuclease Buffer (NEB) für 45 min bei 30°C inkubiert. Nach dem Nucleaseverdau wurde der Chip mit 20 ml Equilibrierungspuffer gewaschen und erneut die grüne Fluoreszenz gemessen. Tabelle 29 zeigt das Resultat dieser Messung. Der Chip wurde dann bei Raumtemperatur 45 min mit Blockpuffer und anschließend 30 min mit einer Lösung von 22 ng/μl SSB (single-stranded DNA binding protein, USB Corporation, Cleveland, USA) in Inkubationspuffer inkubiert. Schließlich wurde der Chip mit 10 μl Cy™5-markiertem E co//-mutS (Konzentration: 50 ng/μl) in 90 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde der Chip von Hand mit 1 ml Inkubationspuffer gewaschen, in den Nanogen- Reader eingesetzt und dort bei einer Temperatur von 37°C 50x mit je 0,25 ml
Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Cy™5-Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen Positionen des Chips mit folgender Geräteeinstellung gemessen: hohe Sensitivität („high gain"); 256 μs Integrationszeit. Die gemessenen roten Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 30 angegeben; die Ergebnisse der statistischen Auswertung sind in Tabelle 31 sowie in Fig. 17 dargestellt.
Verwendete Puffer:
50 mM Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin (Sigma); diese Lösung wurde durch eine 0,2 μm-Membran filtriert und durch Unterdruck entgast
100 mM Histidinpuffer: 100 mM L-Histidin, durch eine 0,2 μm-Membran filtriert Equilibrierungspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 %
Tween-20
Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01% Tween-20 / 3%
BSA
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20
/ 1 % BSA
Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,1 % Tween-20
Figure imgf000067_0001
Tabelle 27: Beladungsschema eines Hydrogelchips zum Nachweis von Mutationen im Exon δ des p53-Gens in humanen Zelllinien. Die einzelnen Positionen wurden zuerst mit dem in der oberen Zeile genannten Oligonukleotid adressiert und anschließend mit dem in der zweiten Zeile genannten PCR-Produkt der verschiedenen Zelllinien (MCF-7, MOLT-4, SW-4δO und 293) bzw. mit den Oligonukleotiden AT oder GT hybridisiert. Einige Positionen wurden als Kontrolle nur mit Erst- oder Zweitstrang beladen; leere Kästchen symbolisieren nicht mit DNA beladene Positionen.
Figure imgf000067_0002
Tabelle 2δ: Messung der grünen Fluoreszenzintensität des Hydrogelchips vor Behandlung mit Mung Bean Nuclease. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000068_0001
Tabelle 29: Messung der grünen Fluoreszenzintensität des Hydrogelchips nach Behandlung mit Mung Bean Nuclease. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000068_0002
Tabelle 30: Messung der roten Fluoreszenzintensität zum Nachweis der Bindung von Cy 5 -markiertem E. coli- mutS an Doppelstränge aus einem synthetischen Oligonukleotid und PCR-Produkten verschiedener Zellinien. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000068_0003
Tabelle 31 : Statistische Ausweitung der Ergebnisse des Hydrogelchips zum Nachweis von Mutationen im Exon δ des p53-Gens in verschiedenen Zellinien. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der roten Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung. Fig. 17 zeigt die Bindung von Cy™5-markiertem Eco//-mutS an Doppelstränge aus einem synthetischen Oligonukleotid und PCR-Produkten verschiedener Zelllinien zum Nachweis von Mutationen im Exon 8 des p53-Gens. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die einzelnen Zelllinien.
Wie aus der Tabelle 28 hervorgeht, wiesen alle mit den verschiedenen PCR- Fragmenten hybridisierten Positionen eine ähnlich hohe grüne Fluoreszenz auf; es wurde also auf jeder dieser Positionen etwa die gleiche Menge an PCR-Produkt gebunden. Nach dem Nucleaseverdau (Tabelle 29) waren die grünen
Fluoreszenzintensitäten deutlich geringer als vor dem Verdau. Dies deutet darauf hin, daß der Abbau von einzelstrangigen DNA-Bereichen auf dem Chip gut funktioniert hat. Bei der Auswertung der roten Fluoreszenz (Tabelle 31 , Fig. 17) zeigte sich, daß das E.co//-mutS bevorzugt an diejenigen Positionen des Chips band, auf denen das
Oligonukleotid cExonδ mit dem PCR-Produkt der Zellinie SW-480 hybridisiert worden war: die Fluoreszenzintensitäten lagen hier etwa 6,5-fach höher als bei den Positionen, bei denen die Hybridisierung mit den PCR-Produkten der Zellinien MCF- 7, MOLT-4 oder 293 erfolgte. Mit der hier beschriebenen Methode ist es somit gelungen, die bekannte Basenaustauschmutation der Zellinie SW-480 im Codon 273 des p53-Gens nachzuweisen. Unter den gewählten Versuchsbedingungen führte dieser Basenaustausch zu einer GT-Fehlpaarung, die von dem farbstoffmarkierten mutS gut erkannt wurde. Im Falle der Zelllinie 293, für die keine Informationen über eventuelle Mutationen in p53 vorliegen, wurden dagegen sehr ähnliche Fluoreszenzintensitäten gemessen wie bei der Linie MCF-7, die keine Mutationen im p53-Gen enthält. Dies deutet darauf hin, daß auch die Zelllinie 293 keinen Basenaustausch in dem untersuchten Bereich enthält.
Zusammenfassend konnte durch dieses Experiment gezeigt werden, daß die hier beschriebene Methode gut dazu geeignet ist, in aus Patientenproben isolierter DNA Mutationen nachzuweisen. Damit wurde in der vorliegenden Erfindung erstmals ein für den parallelisierten Hochdurchsatznachweis von Mutationen geeignetes, auf DNA Chips basierendes System publiziert. Beispiel: Alternative Methode zum Nachweis von Mutationen in genomischer DNA
Anschließend wurde geprüft, ob die zuvor beschriebene Methode zum mutS- vermittelten Nachweis von Mutationen in genomischer DNA auch dann funktioniert, wenn als Erststrang („capture") biotinylierte PCR-Produkte anstelle von synthetischen Oligonukleotiden eingesetzt werden. Die Verwendung von PCR- Produkten als „capture" würde es erlauben, längere DNA-Fragmente auf Mutationen zu untersuchen. Hierbei ist allerdings zu beachten, daß PCR-Produkte im Gegensatz zu synthetischen Oligonukleotiden zunächst als Doppelstrang vorliegen. Würde man ein solches PCR-Produkt ohne weitere Aufreinigung auf einen Mikrochip adressieren, so würde sich sofort der komplementäre Gegenstrang an den biotinylierten „capture" - Strang anlagern und so die anschließende Hybridisierung mit der zu testenden DNA („target") behindern. Um dieses Problem zu vermeiden, wurde zunächst der als Erststrang verwendete, biotinylierte Strang von dem komplementären Gegenstrang abgetrennt.
Um beide Methoden zum Nachweis von Mutationen miteinander vergleichen zu können, wurden unterschiedliche Positionen von elektronisch adressierbaren Hydrogelchips zunächst mit dem einzelstrangigen, biotinylierten PCR-Produkt der Wildtyp-Zellinie MCF-7 oder mit dem synthetischen Oligonukleotid cExonδ als
Erststrang adressiert und anschließend mit den PCR-Produkten verschiedener Zellinien als „target" hybridisiert.
Parallel dazu sollte genauer getestet werden, ob die Behandlung der Chips mit Einzelstrang-spezifischer Endonuclease und mit SSB (Einzelstrang-bindendem
Protein) für die Erkennung von Mutationen in genomischer DNA vorteilhaft ist, oder ob diese Inkubationsschritte ohne Verlust der Sensitivität ausgelassen werden können. Um dies zu untersuchen, wurden vier Hydrogel-Chips nach dem gleichen Schema mit Erst- und Zweitsträngen beladen und anschließend nach unterschiedlichen Inkubationsprotokollen behandelt. Die Herstellung der einzelstrangigen, biotinylierten PCR-Produkte erfolgt nach folgendem Schema: Als Ausgangsmaterial für die PCR wurde genomische DNA der Zellinie MCF-7 verwendet, die keine Mutation im p53-Gen enthält.
PCR-Ansatz: 84,2 μl H2O
10 μl 10x cloned Pfu DNA polymerase reaction buffer
(Stratagene, Amsterdam, NL) 0,8 μl dNTP (je 25 mM)
2 μl genomische DNA der Zellinie MCF-7 (150 ng/μl) 0,5 μl Primer Exon8for_bio (Seq. ID Nr. 48), 100 μM, biotinyliert 0,5 μl Primer Exon8rev_b (Seq. ID Nr. 49), 100 μM 2 μl Pfu Turbo Hotstart DNA Polymerase (2,5U/μl,
Stratagene)
Die Amplifikation erfolgte in einem Thermocycler (GeneAmp PCR System 2400, Perkin Eimer, Langen, Deutschland) unter folgenden Bedingungen: initiale Denaturierung (95°C, 2 min), gefolgt von 31 Amplifikationszyklen (jeweils 95°C, 30 sec - 62°C, 30 sec - 72°C, 1 min) und abschließender Elongation (72°C, 10 min)
Zur Abtrennung überschüssiger biotinylierter Primer wurden die PCR-Produkte anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit der Firma QIAGEN gereinigt. Diese Aufreinigung erfolgte nach Angaben des Herstellers, vor der Elution der DNA wurde jedoch ein zusätzlicher Waschschritt mit 75%igem Ethanol durchgeführt. Die
DNA wurde schließlich in 50 μl Wasser eluiert. Die Isolierung der biotinylierten Einzelstränge erfolgte mit Hilfe von magnetischen, Streptavidin-beschichteten Beads der Firma DYNAL Biotech (Hamburg). Das PCR-Produkt wurde dazu mit einem gleichen Volumen an 2x B&W-Puffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M NaCI) verdünnt, mit Dynabeads M-280 Streptavidin gemischt und 15 min bei
Raumtemperatur unter vorsichtigem Schütteln inkubiert, um die Bindung der biotinylierten DNA-Stränge an das Streptavidin zu ermöglichen. Die Beads wurden dann in einem Magneten (DYNAL MPC-S) konzentriert, der Überstand verworfen und die Beads mit 1x B&W-Puffer gewaschen. Zur Abtrennung der nicht biotinylierten Gegenstränge wurden die Beads anschließend in 0,1 M NaOH suspendiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert, danach jeweils einmal mit 0,1 M NaOH, mit 1x B&W-Puffer sowie mit Wasser gewaschen. Um die biotinylierten Einzelstränge von dem Streptavidin zu lösen, wurden die Beads schließlich in 95% Formamid/10 mM EDTA, pH 8,0 suspendiert und 4 min bei 65°C inkubiert. Der Überstand mit den biotinylierten Einzelsträngen wurde noch heiß abgenommen und anschließend mit dem QIAquick PCR Purification Kit gereinigt.
Die Herstellung der „targets" erfolgte wie im Beispiel „Nachweis von Mutationen in genomischer DNA" unter „Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion" beschrieben.
Beladung der Hydrogel-Chips: Das einzelsträngige, biotinylierte PCR-Produkt
(„ssPCR") wurde mit einem gleichen Volumen 100 mM Histidinpuffer verdünnt. Das biotinylierte Oligonukleotid cExonδ (Seq. ID No. 47) sowie die als Positiv- und Negativkontrolle verwendeten Oligonukleotide „APC se" (Seq. ID No. 24), „APC AT" (Seq. ID No. 25) und „APC GT" (Seq. ID No. 26) wurden mit einer Konzentration von 100 nM in 50 mM Histidinpuffer gelöst. Die als Zweitstrang verwendeten, gereinigten
PCR-Produkte wurden jeweils mit einem gleichen Volumen 100 mM Histidinpuffer gemischt. Alle DNA-Stränge wurden dann 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung der unterschiedlichen Erststränge auf definierte Positionen der Hydrogelchips erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec. bei einer Spannung von 2,1 V. Die Hybridisierung mit den Cy™3-markierten
PCR-Produkten bzw. den Oligonukleotiden „APC AT" und „APC GT" wurde für 180 sec bei 2,1 V durchgeführt. Das für alle 4 Chips identische Beladungsschema ist in Tabelle 32 dargestellt.
Verwendete Puffer:
50 mM Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin, durch eine 0,2 μm-Membran filtriert und entgast
100 mM Histidinpuffer: 100 mM L-Histidin, durch eine 0,2 μm-Membran filtriert Weitere Behandlung der Chips:
Zwei der Hydrogelchips (nachfolgend als Chips A und B bezeichnet) wurden nach der Beladung 70 min bei Raumtemperatur mit Blockpuffer inkubiert. Chip B wurde anschließend zusätzlich 45 min mit 22 ng/μl SSB (single-stranded DNA binding protein, USB Corporation, Cleveland, USA) in Inkubationspuffer inkubiert. Schließlich wurden beide Chips mit je 3 μl Cy™5-markiertem Eco//-MBP-mutS (Konzentration: 450 ng/μl) in 97 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Chips von Hand mit 1 ml Inkubationspuffer gewaschen, in den Nanogen- Reader eingesetzt und dort bei einer Temperatur von 37°C 50x mit je 0,25 ml
Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen Positionen der Chips gemessen (Geräteeinstellung: „high gain", 256 μs Integrationszeit für rote Fluoreszenz; „medium gain", 256 μs für grüne Fluoreszenz) Chips C und D wurden nach der Beladung mit Equilibrierungspuffer gefüllt und die grüne Fluoreszenz auf den Positionen der Chips im Nanogen-Reader gemessen
(„medium gain", 256 μs Integrationszeit). Anschließend wurden die Chips mit 1 μl Mung Bean Nuclease (NEB, Frankfurt) + 89 μl 1x Mung Bean Nuclease Buffer (NEB) für 45 min bei 30°C inkubiert. Nach dem Nucleaseverdau wurden die Chips mit 20 ml Equilibrierungspuffer gewaschen und dann bei Raumtemperatur 70 min mit Blockpuffer inkubiert. Chip D wurde danach zusätzlich 45 min mit 22 ng/μl SSB
(single-stranded DNA binding protein) in Inkubationspuffer inkubiert. Schließlich wurden beide Chips mit je 3 μl Cy™5-markiertem E. co//-MBP-mutS (Konzentration: 450 ng/μl) in 97 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die Chips mit je 1 ml Inkubationspuffer gewaschen und im Nanogen-Reader bei einer Temperatur von 37°C 50x mit je 0,25 ml Waschpuffer gewaschen.
Schließlich wurden die Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen Positionen der Chips gemessen (rote Fluoreszenz: „high gain", 256 μs; grüne Fluoreszenz: „medium gain", 256 μs) Verwendete Puffer: Equilibrierungspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 %
Tween-20 Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 3% BSA
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2/ 0,01% Tween-20 / 1 % BSA Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0, 1 % Tween-20
Für Chip A (ohne Nuclease, ohne SSB) sind die gemessenen grünen und roten Fluoreszenzwerte in den Tabellen 33 und 34 aufgeführt, für Chip B (ohne Nuclease, mit SSB) in den Tabellen 35 und 36. Die Ergebnisse der grünen Fluoreszenzmessung von Chip C (mit Nuclease, ohne SSB) vor dem
Nucleaseverdau sind in Tabelle 37 aufgeführt, die grünen und roten Fluoreszenzwerte nach der mutS-Inkubation findet man in den Tabellen 38 und 39. Für Chip D (mit Nuclease, mit SSB) sind die grünen Fluoreszenzen vor der Nucleasebehandlung in Tabelle 40 angegeben und die Ergebnisse der grünen und roten Fluoreszenzmessung nach der mutS-Inkubation in den Tabellen 41 und 42.
Die Ergebnisse der statistischen Auswertung aller vier Chips sind in Tabelle 43 zusammengefaßt. In den Abbildungen Fig. 18 und Fig. 19 sind die Ergebnisse von Chip D zusätzlich in Form von Balkendiagrammen veranschaulicht.
Figure imgf000074_0001
Mutationen im Exon δ des p53-Gens. Die einzelnen Positionen der Hydrogelchips wurden zuerst mit den in der oberen Zeile genannten Oligonukleotiden cExonδ bzw. APC se oder mit dem biotinylierten, einzelstrangigen PCR-Produkt („ssPCR") adressiert. Anschheßend wurde mit dem in der zweiten Zeile genannten PCR-Produkt der verschiedenen Zellinien (MCF-7, MO T-4, SW-480 und 293) bzw. mit den OhgonuMeotiden APC AT oder APC GT hybridisiert. Einige Positionen wurden als Kontrolle nur mit Erst- oder Zweitstrang beladen; leere Kästchen symbolisieren nicht mit DNA beladene Positionen.
Figure imgf000075_0001
Tabelle 33 : Messung der grünen Fluoreszenz von Chip A (ohne Nuclease, ohne SSB). Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten nach der Inkubation mit mutS.
Figure imgf000075_0002
Tabelle 34: Messung der roten Fluoreszenz von Chip A (ohne Nuclease, ohne SSB) zum Nachweis der Bindung von Cy™5-markiertemi?.co/ -MBP-mutS. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000075_0003
Figure imgf000076_0001
Tabelle 36: Messung der roten Fluoreszenz von Chip B (ohne Nuclease, mit SSB) zum Nachweis der Bindung von Cy™5-markiertem Ecoli-MEP-mutS. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000076_0002
Tabelle 37: Messung der relativen grünen Fluoreszenzintensitäten von Chip C vor dem Nucleaseverdau.
Figure imgf000076_0003
Tabelle 3δ: Messung der relativen grünen Fluoreszenzintensitäten von Chip C (mit Nuclease, ohne SSB) nach der Inkubation mit mutS .
Figure imgf000076_0004
10 16.770 16.890 16.012 16.846 16.516 16.622 16.637 16.325 17.826 17.450
Tabelle 39: Messung der roten Fluoreszenz von Chip C (mit Nuclease, ohne SSB) zum Nachweis der Bindung von Cy™5-markiertem£'.co//'-MBP-mutS. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000077_0001
Tabelle 40: Messung der relativen grünen Fluoreszenzintensitäten von Chip D vor dem Nucleaseverdau.
Figure imgf000077_0002
Tabelle 41: Messung der relativen grünen Fluoreszenzintensitäten von Chip D (mit Nuclease, mit SSB) nach der Inkubation mit mutS.
Figure imgf000077_0003
Tabelle 42: Messung der roten Fluoreszenz von Chip D (mit Nuclease, mit SSB) zum Nachweis der Bindung von Cy1M5-markiertemJE'.co/z-MBP-mutS. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000077_0004
Figure imgf000078_0001
Tabelle 43: Statistische Auswertung der Ergebnisse der Hydrogelchips A-D. Berechnet wurden für jeden Chip jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der roten Fluoreszenzintensitäten aller Positionen mit gleicher Beladung.
Fig. 18 zeigt die Ergebnisse des Hydrogelchips D (mit Nuclease, mit SSB) bei Verwendung des synthetischen Oligonukleotids cExonδ als Erststrang. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die einzelnen Zellinien.
Fig. 19 zeigt die Ergebnisse des Hydrogelchips D (mit Nuclease, mit SSB) bei
Verwendung des einzelstrangigen PCR-Produkts „ssPCR" als Erststrang. Dargestellt ist jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität mit Standardabweichung für die einzelnen Zellinien.
Ein Vergleich zwischen den grünen Fluoreszenzintensitäten der Positionen, auf die das synthetische 73-mer Oligonukleotid als Erststrang adressiert worden war, und der mit einzelsträngigem PCR-Produkt beladenen Positionen zeigt, daß in beiden Fällen etwa gleich viel Cy™3-markierter Zweitstrang gebunden wurde. Insgesamt wiesen die mit dem PCR-Produkt der Zellinie MOLT-4 beladenen Positionen etwas niedrigere grüne Fluoreszenzen auf als Positionen, die mit PCR-Produkten der anderen Zellinien beladen wurden. Dies läßt sich darauf zurückführen, daß das für die Chipbeladung eingesetzte PCR- aterial der Zellinie MOLT-4 weniger DNA enthielt als die PCR-Produkte der übrigen Zellen. Die stark verringerten grünen Fluoreszenzwerte, die bei den Chips C und D nach der Behandlung mit Einzelstrang-spezifischer Nuclease gemessen wurden, deuten darauf hin, daß der
Abbau der überhängenden einzelstrangigen Enden gut funktioniert hat. Bei der Auswertung der roten Fluoreszenzwerte (Tabelle 43) zeigte sich, daß bei Chip A, der weder mit Nuclease noch mit Einzelstrang-DNA-bindendem Protein (SSB) behandelt worden war, die Mutation im Exon 8 des p53-Gens der Zellinie SW- 480 nur sehr schwach erkannt wurde. Bei dem mit SSB behandelten Chip B wurde bereits eine deutliche Reduzierung der roten Hintergrund-Fluoreszenz und eine verbesserte Mutationserkennung erreicht.
Im Vergleich dazu zeigten Chips C und D, die einer Behandlung mit Mung Bean Nuclease unterzogen worden waren, jedoch eine noch weitaus geringere Hintergrundfluoreszenz sowie eine bedeutend bessere Mutationserkennung: Hier wurden für die mutationstragende Zellinie SW-480 4- bis 5-fach höhere
Fluoreszenzen erhalten als für die Zellinien MCF-7, MOLT-4 und 293, die im Exon 8 von p53 die Wildtypsequenz aufweisen (Tabelle 43, Fig. 18 und 19). Die zusätzliche Behandlung mit SSB (Chip D) führte nochmals zu einer leichten Verbesserung der Ergebnisse (Tabelle 43). Zusammenfassend konnte durch dieses Experiment gezeigt werden, daß die
Behandlung mit Mung Bean Nuclease sehr vorteilhaft für den mutS-vermittelten Nachweis von Mutationen in genomischer DNA auf elektronisch adressierbaren Mikrochips ist. Darüber hinaus hat auch die Inkubation mit SSB einen positiven Effekt auf die Mutationserkennung.
Ein Vergleich der beiden hier beschriebenen Methoden zur mutS-vermittelten Mutationserkennung zeigt, daß beide Methoden sehr gut zur Detektion von Mutationen in genomischer DNA geeignet sind. Bei Verwendung des einzelstrangigen PCR-Produktes als „capture" (Fig. 19) wurde sogar ein etwas stärkeres mutS-Signal erhalten als bei Verwendung des kürzeren, synthetischen
Oligonukleotids als Erststrang (Fig. 18).
Der größte Vorteil bei der Verwendung von biotinylierten, einzelstrangigen PCR- Produkten als „captures" besteht darin, daß auf diese Weise längere DNA-Bereiche auf Mutationen getestet werden können als bei Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden. Darüber hinaus können nur mit dieser Methode Gene oder Exons von zwei Individuen direkt und ohne vorherige Sequenzierung miteinander verglichen werden, indem die DNA des einen Individuums als „capture" und die Sequenz des anderen Individuums als „target" eingesetzt wird. So wird beispielsweise ein direkter Vergleich von DNA-Sequenzen von Patienten mit einer bestimmten Erkrankung und gesunden Kontrollpersonen ermöglicht. Andererseits bietet jedoch auch die Verwendung von synthetischen Oligonukleotiden als Erststrang einige Vorteile: Solche Oligonukleotide können in größerer Menge und mit jeder beliebigen Sequenz hergestellt werden; außerdem sind synthetische
Oligonukleotide bereits einzelsträngig, so daß keine Abtrennung des komplementären Stranges notwendig ist. Darüber hinaus kann durch die Verwendung von kürzeren Oligonukleotiden die Position einer eventuell vorhandenen Mutation exakter eingegrenzt werden als bei der Verwendung eines längeren PCR-Produkts als Erststrang.
Je nachdem, wie die jeweilige Fragestellung aussieht, kann sich daher das eine oder andere der beiden hier beschriebenen Protokolle zum mutS-vermittelten Nachweis von Mutationen in genomischer DNA als besonders geeignet erweisen.
Beispiel: Optische Erkennung von Basenfehlpaarungen durch mutS
Dieses Experiment zeigt, wie gut sich der Nachweis von Mutationen durch das Cy™5-markierte E. coli mutS optisch verfolgen lässt. Dies ist wichtig im Hinblick auf den Einsatz der Technologie zum Nachweis von Mutationen in multiplen Genen oder Patienten. Eine gute Mustererkennung erleichtert hierbei den Nachweis von
Mutationen deutlich.
Zum Chip-basierten Nachweis von Mutationen wurden auf den verschiedenen Positionen eines elektronisch adressierbaren Hydrogelchips der Firma Nanogen durch Hybridisierung folgende Arten von DNA-Doppelsträngen erzeugt: - vollständig komplementäre Doppelstränge
- Doppelstränge, die die GT- Basenfehlpaarung enthalten
Dazu wurden zunächst die Erst- und Zweitstrang-Oligonukleotide mit einer Konzentration von 100 nM in Histidinpuffer gelöst und 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung des biotinylierten Oligonukleotids „sense" (Seq. ID
No. 10) auf die einzelnen Positionen des Hydrogelchips erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec bei einer Spannung von 2,1 V. Die Hybridisierung mit den Zweitstrang-Oligonukleotiden AT (Seq. ID No. 12) und GT (Seq. ID No. 13) wurde für 120 sec bei 2,1 V durchgeführt. Das Beladungsschema ist in Tabelle 44 dargestellt; der Name jedes Zweitstrang-Oligonukleotides gibt die bei der Hybridisierung entstehende Fehlpaarung an. Nach der Beladung wurde der Chip aus dem Ladegerät entnommen, mit 1 ml Blockpuffer gefüllt und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Chip mit 10 μl Cy™5- markiertem E co//-mutS (Konzentration: 50 ng/μl) in 100 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde der Chip manuell mit 10 ml Waschpuffer gewaschen und dann in den Nanogen-Reader eingesetzt. Dort wurde bei einer Temperatur von 37°C 70x mit je 0,5 ml Waschpuffer gewaschen.
Schließlich wurden die Cy™3 und Cy™5-Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen Positionen der Chips im Nanogen-Reader mit folgenden Geräteeinstellungen gemessen: hohe Sensitivität („high gain") für Cy™5, niedrige Sensitivität („low gain") für Cy™3; 256 μs Integrationszeit. Die optische Darstellung der Fluoreszenzintensitäten erfolgte automatisch nach der Messung auf der Nanogen
Workstation mit Hilfe des Programmes e-Lab.
In Fig. 20A ist gut zu erkennen, daß der Chip gleichmäßig mit DNA beladen wurde. Die Mutationen sind deutlich zu erkennen (Fig. 20B). Damit eignet sich das mutS Chipsystem für den schnellen optischen Nachweis von Mutationen.
Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin; diese Lösung wurde durch eine Membran der Porengröße 0,2 μm filtriert und durch Unterdruck entgast
Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 3% BSA (Serva, Heidelberg) Inkubationspuffer:.20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20
/ 1 % BSA Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0, 1 % Tween-20
Figure imgf000081_0001
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Tabelle 44: Beladungsschema eines Chips zum optischen Nachweis der Bindung von Cy 5-markiertem E coli- mutS an Fehlpaarungen: alle Positionen wurden zunächst mit Oligonucleotid „sense" (Seq. TJ) No.10) adressiert, anschheßend wurden auf die gezeigten Positionen die Oligonucleotide „AT" (Seq. ID No. 12) und "GT" (Seq. ID No. 13) adressiert.
Fig. 20 zeigt den optischen Nachweis von Mutationen auf elektronisch adressierbaren DNA-Chips: Fig. 20A, die Cy™3 Fluoreszenz zeigt eine gleichmäßige Beladung des Chips mit DNA, Fig. 20B, die Cy™5-Fluoreszenz ist auf den Positionen mit der Basenfehlpaarung (siehe Tabelle 44) deutlich zu sehen und hebt sich gut vom Hintergrund ab.
Beispiel: Erkennung von Basenfehlpaarungen durch verschiedene mutS Proteine
In diesem Experiment wurde geprüft, ob das im Rahmen dieser Anmeldung hergestellte MBP-MutS, das E. coli mutS (bezogen von Firma Gene Check, Fort
Collins, CO, USA), das Thermus aquaticus mutS (I. Biswas und P. Hsieh, J. Biol. Chem 271 , 5040-5048 (1996), kommerziell erhalten von Biozym (Hess.-Oldendorf, Deutschland)) und das Thermus thermophilus HB8 mutS Protein (S. Takamatsu, R. Kato und S. Kuramitsu, Nucl. Acids Res. 24, 640-647 (1996), von Professor Kuramitsu, Universität Osaka, Japan zur Verfügung gestellt) jeweils andere
Eigenschaften bezüglich der Erkennung der verschiedenen möglichen Basenfehlpaarungen und Insertionen in DNA-Molekülen haben. Wenn beispielsweise eines der Proteine präferentiell an eine Basenfehlpaarung bindet, würde die Bindung an eine unbekannte Sequenz die Natur der Basenfehlpaarung eingrenzen.
Um dies zu überprüfen wurde untersucht, ob verschiedene fluoreszenzfarbstoff- markierte mutS-Proteine bestimmte Basenfehlpaarungen oder Insertionen und Deletionen präferentiell binden. Dazu wurden je 1 mg der Proteine mit 125 nMol Cy™5-Succinimidylester in 10 ml 10 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10% Glycerin, 0.1 mM PMSF für 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurden die Proteine auf je eine 1 ml DEAE-Sepharose fast flow Säule (Pharmacia, Schweden) aufgetragen, die mit 10 ml 10 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10% Glycerin, 0.1 mM PMSF equilibriert wurde. Freier Farbstoffaktivester wurde durch Spülen der Säule mit 20 ml 10 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10% Glycerin, 0.1 mM PMSF entfernt, und das Protein wurde in 4 ml 10 mM HEPES pH 7.9, 500 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10% Glycerin, 0.1 mM PMSF eluiert. Die Intaktheit der Proteine nach der Reinigung wurde über SDS- PAGE analysiert. Nach der chromatographischen Reinigung wurden die Proteine zweimal für mindestens 3 Stunden gegen 21 10 mM HEPES pH 7.9, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10% Glycerin, 0.1 mM PMSF dialysiert und in 25μl-Aliquots bei -80°C gelagert.
Zur Bestimmung des Fluoreszenzmarkierungsgrades (D/P-Ratio) der unterschiedlichen Cy™5-markierten mutS-Proteine wurden zunächst die Proteinkonzentrationen der unterschiedlichen mutS-Proteine nach der Methode von Bradford bestimmt. Je nach Proteinkonzentration (0, 1 -1 mg/ml) wird die
Proteinlösung (1-10 μl) mit Wasser aufgefüllt (Gesamtvolumen = 100 μl) und mit Bradford-Reagenz (900 μl, BioRad) versetzt. Die Bildung des Protein-Farbstoff- Komplexes ist nach 15 min bei Raumtemperatur abgeschlossen. Nach Bestimmung der Absorption bei λ = 595 nm wird unter Zuhilfenahme der Eichgerade (bestimmt mit BSA) die Proteinkonzentration bestimmt.
Die resultierenden Werte sind in der folgenden Aufstellung für die einzelnen mutS- Spezies zusammengestellt:
Figure imgf000083_0001
Anschließend wurde UV-spektrometrisch die Konzentration an Cy™5-Farbstoff bestimmt. Hierzu wurde die Proteinlösung (50 μl) mit Puffer (950 μl, 10 mM HEPES pH 7,9, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2, 10 % Glycerin, 0,1 mM PMSF) versetzt und die Cy™5-Absorption bei λ = 650 nm vermessen. Die Konzentration an Cy™5-Farbstoff berechnet sich nun wie folgt: c(Cy™5) = (A65o)/250000 M-1cm-1 (Aß5o= Absorption bei 650 nm).
Der Fluoreszenzmarkierungsgrad (D/P-Ratio; D= Dye, P= Protein) berechnet sich nun wie folgt:
D/P = c(Cy™5)/c(mutS).
Die resultierenden Werte sind in der folgenden Aufstellung für die einzelnen mutS- Spezies zusammengestellt:
Figure imgf000084_0001
Die Markierungseffizienzen bewegen sich innerhalb einer Größenordnung.
Anschließend wurde überprüft, wie gut verschiedene Basenfehlpaarungen bzw. Insertionen von den 4 unterschiedlichen farbstoffmarkierten mutS Proteinen erkannt werden. Dazu wurden auf den verschiedenen Positionen von elektronisch adressierbaren Hydrogelchips der Firma Nanogen durch Hybridisierung folgende Arten von DNA-Doppelsträngen erzeugt:
- vollständig komplementäre Doppelstränge,
- Doppelstränge, die eine der acht möglichen Basenfehlpaarungen (AA, AG, CA, CC, CT, GG, GT, TT) enthalten,
- Doppelstränge, bei denen ein Strang eine Insertion von 1 , 2 oder 3 Basen enthält.
Dazu wurden zunächst die Erst- und Zweitstrang-Oligonukleotide mit einer Konzentration von 100 nM in Histidinpuffer gelöst und 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung des biotinylierten Oligonukleotids „sense" (Seq. ID No. 10) auf die einzelnen Positionen des Hydrogelchips erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec bei einer Spannung von 2,1 V. Die Hybridisierung mit den Zweitstrang-Oligonukleotiden AT (Seq. ID No. 12), GT (Seq. ID No. 13), AA (Seq. ID No. 14), AG (Seq. ID No. 15), CA (Seq. ID No. 16), CC (Seq. ID No. 17),
CT (Seq. ID No. 18), GG (Seq. ID No. 19), TT (Seq. ID NOr. 20), ins+1T (Seq. ID No. 21), ins+2T (Seq. ID No. 22) sowie ins+3T (Seq. ID No. 23) wurde für 120 sec bei 2,1 V durchgeführt. Das Beladungsschema ist in Tabelle 45 dargestellt; der Name jedes Zweitstrang-Oligonukleotides gibt die bei der Hybridisierung entstehende Fehlpaarung oder Insertion („ins") an.
Nach der Beladung wurden die Chips aus dem Ladegerät entnommen, mit 1 ml Blockpuffer gefüllt und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Bindung von E.co//'-mutS (ChipA), MBP-MutS (ChipB), Thermus aquaticus mutS (ChipC) und Thermus thermophilus mutS (ChipD) an die so erhaltenen DNA-Doppelstränge getestet. Dazu wurden die Chips mit je 2-3 μg der Cy™5-markierten mutS-Proteine in 100 μl Inkubationspuffer für 60 min inkubiert. Die Chips mit E.co//-mutS und MBP-MutS wurden bei Raumtemperatur, die Chips mit Thermus aquaticus mutS und Thermus thermophilus mutS bei 37°C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die Chips von
Hand mit 10 ml Inkubationspuffer gewaschen und in den Nanogen-Reader eingesetzt. Dort wurden die Chips bei einer Temperatur von 37°C (E.co//-mutS und MBP-MutS) bzw. 50°C (Thermus aquaticus mutS und Thermus thermophilus mutS) 70-80x mit je 0,25 ml Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurden die Cy™3 und Cy™5-Fluoreszenzintensitäten auf den einzelnen
Positionen der Chips im Nanogen-Reader mit folgenden Geräteeinstellungen gemessen: hohe Sensitivität („high gain") für Cy™5, niedrige Sensitivität („low gain") für Cy™3; 256 μs Integrationszeit. Die Werte der Cy™5 Fluoreszenzen der Chips A- D finden sich in den Tabellen 46-49. Es wurde darauf geachtet, dass die Cy™3 Fluoreszenzintensität homogen über die Chipoberfläche verteilt war. Die Mittelwerte der für die jeweiligen Basenfehlpaarungen spezifischen Cy™5-Fluoreszenzwerte sind in Tabelle 50 dargestellt. Um zu ermitteln wie gut die einzelnen Proteine die individuellen Fehlpaarungen im Vergleich zur perfekt gepaarten DNA ("AT") erkennen, wurde die dieser DNA zugeordnete Cy™5 Fluoreszenz willkürlich auf 1 gesetzt und daraus die anderen Fluoreszenzen errechnet (Tabelle 50 und 51).
Dabei zeigte sich, daß die beiden thermophilen Proteine überraschenderweise besonders gut an Insertionsmutationen binden. Damit eignen Sie sich für ein Nachweissystem von ausschließlich lnsertions-/De!etionsmutationen sowie G/T Basenfehlpaarungen.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, daß sich sowohl das E. coli mutS als auch das MBP-MutS für den Nachweis eines breiten Spektrums an Basenfehlpaarungen eignen. Das E. coli Protein liefert darüber hinaus die stärksten absoluten Signale. Interessanterweise binden die Proteine aus T. thermophilus und T. aquaticus präferentiell an Fehlpaarungen, die aus Insertionen/Deletionen resultieren. Dies kann zum schnellen Nachweis dieses Subtyps von Mutationen verwendet werden.
Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin; diese Lösung wurde durch eine Membran der Porengröße 0,2 μm filtriert und durch Unterdruck entgast
Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 3% BSA (Serva, Heidelberg)
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20
/ 1 % BSA
Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,1 % Tween-20
Figure imgf000086_0001
Tabelle 45: Beladungsschema von Chips zum Nachweis der Bindung von Cy 5-markiertem mutS an unterschiedliche Basenfehlpaarungen. „Neg.": nicht mit DNA beladene Positionen. „ssDNA": nur mit dem Einzelstrang „sense" beladene Positionen. Alle übrigen Positionen wurden zuerst mit dem Oligonukleotid „sense" adressiert und danach mit dem in der Tabelle angegebenen Zweitstrang hybridisiert.
Position 1 8 10
566.642 780.284 209.697 173.651 120.620 120.372 125.842 169.293 15.708 16.137
269.756 315.622 599.268 401.021 459.745 520.870 152.746 154.548 58.554 17.814
825.540 858.970 1.048.60 1.048.60 535.879 573.675 135.250 132.051 71.573 16.924
143.428 146.514 209.934 165.362 99.013 106.273 188.921 211.682 42.586 18.089
61.129 766.412 119.006 94.417 369.735 368.753 223.515 282.204 64.137 17.459
65.957 86.153 84.454 72.652 161.685 171.219 521.027 719.115 66.274 19.227
56.141 59.303 130.930 109.728 103.513 99.195 183.051 223.538 17.716 20.007
113.441 121.183 214.258 186.217 114.331 115.465 403.533 418.097 >1049 26.695
528.991 560.922 612.501 593.926 245.658 180.629 96.750 103.293 >1049 32.944
10 771.854 736.446 306.721 316.474 715.742 646.623 1.048.601.048.6025.376 22.368
Tabelle 46: Messung der roten Fluoreszenz von Chip A zum Nachweis der Bindung von Cy 5-markiertem E.coli -mutS an unterschiedliche Basenfehlpaarungen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000087_0001
zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000087_0002
Tabelle 48: Messung der roten Fluoreszenz von Chip C zum Nachweis der Bindung von Cy 5-markiertem Thermus aquaticus mutS an unterschiedhche Basenfehlpaarungen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000088_0001
Tabelle 49: Messung der roten Fluoreszenz von Chip D zum Nachweis der Bindung von Cy 5-markiertem Thermus thermophilus mutS an unterschiedliche Basenfehlpaarungen. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000088_0002
zwerte der einzelnen mutS Proteine. Gezeigt sind die Mittelwerte der Chips A-D
Figure imgf000088_0003
Tabelle 51: Relative Fluoreszenzwerte der Bindung unterschiedlicher mutS Proteine an die unterschiedlichen Basenfehlpaarungen. Die in Tabelle 50 angegebenen Werte wurden hier bezogen auf die perfekte Paarung „AT" (=1.00) dargestellt. Vergleichsbeispiel: Überprüfung der Erkennung von Basenfehlpaarungen durch verschiedene mutS Proteine mittels Biacore-Messung der DNA-Protein Interaktion.
Zur Überprüfung der DNA-Bindung von mutS aus unterschiedlichen Organismen wurde mutS aus E.coli, T. aquaticus, T. thermophilus and das MBP-mutS- Fusionsprotein mittels Biacore-Messungen getestet. Dazu wurden die Nucleotidsequenzen Seq. ID No. 11 bis 23 benutzt, um Heteroduplices herzustellen, wie sie auch auf den Chip wiedergegeben in Tabelle 45 aufgebracht wurden. Dann wurden die für die einzelnen Basenfehlpaarungen spezifischen K -Werte mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz bestimmt.
Die Analysen wurden durchgeführt auf einem Biacore2000 SPR-Biosensor (Biacore AB) bei 22°C in einem Laufpuffer aus 20mM HEPES (pH7.4), 50mM KCI, 5mM MgCI2 und 0.005% Tween20 (protein grade, Calbiochem). Die DNA Oligonukleotide wurden auf einer mit Streptavidin beschichteten Oberfläche eines SA-Sensor-Chips (Biacore AB) bis zu einer Oberflächendichte von 70 RU immobilisiert. Als Kontrolloberfläche diente eine SA-Oberfläche ohne DNA. Die Proteine wurden im Laufpuffer verdünnt, um eine Konzentrationsreihe aus 8 verschiedenen Konzentrationen des jeweiligen Proteins zu erhalten, die nacheinander über die
Sensor-Oberflächen geleitet wurden. Die Bindung des Proteins an die DNA wurde ebenso wie die Dissoziation jeweils 5min bei einer Flussrate von 10μl/min detektiert. Nach jedem Bindungsvorgang wurden die Oberflächen mit 2 aufeinander folgenden Injektionen von 0.1 % SDS (jeweils 0.5min, Flussrate 30 μl/min) regeneriert, bevor die nächste Konzentration des Proteins injiziert wurde.
Die Datenauswertung erfolgte mit Hilfe der Biaevaluation Software Version 3.1. Die Signale der Kontrolloberfläche wurden von den Signalen der einzelnen Oberflächen abgezogen und die Kurven auf den Injektionsstart normalisiert. Die Assoziationsund Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten wurden entweder separat oder über einen global fit mit einem Langmuir 1 :1 Bindungsmodell bestimmt. Die Affinitäten
(Ko-Werte) wurden aus der Formel
Figure imgf000089_0001
berechnet. Bei Kinetiken mit sehr schneller Gleichgewichtseinstellung wurden die Signale im Gleichgewicht (Req) gegen die Konzentration des Proteins aufgetragen und die Ko-Werte über einen hyperbolischen fit bestimmt.
Die ermittelten Resonanzwerte aus den Biacoremessungen stimmen mit den Ergebnissen des Chip-Versuches (Tabellen 50 und 51) ohne Ausnahme überein.
Beispielhaft ist die Bindung der GT-Fehlpaarung für die vier mutS Varianten (A: E.coli, B: T. thermophilus, C: T. aquatiqus, D: MBP-mutS) in Fig. 21A-D gezeigt, die graphische Darstellung der Assoziations- und Dissoziationskonstanten ist in Fig. 22 gezeigt. Die hohe Spezifität des mutS-Proteins aus T thermophilus für +1T (Fig. 23B), für +2T (Fig. 25B), für +3T (Fig. 27B) gegenüber dem MBP-mutS(E.coli)
Fusionsprotein (Fig. 23A, 25A, 27A) ist in Fig. 23, 25, 27 gezeigt, die graphische Darstellung der ermittelten Konstanten gibt Fig. 24 für die Insertion +1T, Fig. 26 für die Insertion +2T und Fig. 28 für die Insertion +3T wieder.
Die Messkurven wurden von unten nach oben bei folgenden mutS-Konzentrationen aufgenommen:
Fig. 21 A: 2,5 nM, 5 nM, 10 nM, 20 nM 39 nM, 79 nM, 158 nM Fig. 21B: 3,5 nM, 7 nM, 14 nM, 27 nM, 55 nM, 110 nM, 219 nM, 438 nM Fig. 21C: 3,4 nM, 7 nM 14 nM 28 nM 55 nM, 1 10 nM 221 nM, 441 nM Fig. 21 D: 2,8 nM, 5,7 nM, 1 1 nM, 23 nM, 45 nM, 91 nM 182 nM 363 nM
Fig. 23A, 25A, 27A: 5,7 nM, 1 1 nM, 23 nM , 45 nM 91 nM 182 nM, 363 nM, 726 nM Fig. 23B, 25B, 27B: 3,5 nM, 7 nM, 14 nM, 27 nM, 55 nM, 110 nM, 219 nM, 438 nM
Beispiel: Nachweis der MutS-Proteinbindung an ds-Oligonucleotid-Monoschichten mit Hilfe der Impedanzspektroskopie
1. Vorbehandlung der Goldelektroden
Die Reinigung der Au-Elektroden (CH-Instruments, Austin, USA) erfolgte durch Polieren der Elektrodenoberfläche mit einer 0,3μm-Tonerde-Suspension (LECO, St. Joseph, USA) und nachfolgendem Spülen mit Millipore-Wasser (10 MΩ cm). Die anschließende elektrochemische Reinigung der Elektroden erfolgte in 0,2 M NaOH mittels Cyclovoltametrie (Potentiostat: EG&G PAR 273A, GB), wobei die Elektroden zuerst 5 mal zwischen Potentialen von -0,5 und -1 ,8 V (gegen Ag/AgCI- Referenzelektrode (Metrohm GmbH & Co, Filderstadt, D) 3 M NaCI) und anschließend 3 mal zwischen -0,3 und 1 ,1 V (Vorschubgeschwindigkeit 50 mV sec" 1) zyklisiert wurden. Als Gegenelektrode bei der Cyclovoltametrie dient ein Platin- Stab (Metrohm).
2. Anbindung von 5'-SH-Oligonucleotiden an Goldoberflächen
Die Anbindung der 5'-SH-modifizierten Oligonucleotid-Hairpins (Interactiva, Ulm, D) (Seq. ID No. 50 und Seq. ID No. 51) erfolgt durch Inkubation der gereinigten Au- Elektroden mit einer 100 μM Lösung des entsprechenden Thiol-modifizierten Oligonucleotids in 0.9 M Phosphatpuffer (pH 6,6, Calbiochem; Zusatz von 0,5 mM
Dithiothreitol, (DTT, Sigma-Aldrich, Steinheim, D)) für 6.5 h. Die Charakterisierung der so entstandenenen Oligonucleotid-Monoschichten wurde durch die Blockierung der diffusionskontrollierten Fe(ll/lll)-Redoxreaktion in wäßriger K3/K4Fe(CN)6-Lόsung (Salze von Merck, Darmstadt, D) (20 mM in 20 mM Phosphatpuffer pH 7) mittels cyclischer Voltametrie (CV) überprüft.
3. Verfüllen der Monoschicht-Lücken mit 1 ,6-Mercaptohexanol
Das Verfüllen der Lücken zwischen den einzelnen Oligonucleotid-Molekülen auf der Monoschicht geschah durch Inkubation der Elektroden in einer 1 mM Lösung von 6- Mercaptohexanol (Aldrich, USA) in Millipore-Wasser (entgast) für 60-90 Minuten bei
Raumtemperatur. Die Elektroden wurden bis zur eigentlichen Messung in 1 M Phosphatpuffer bei 4 °C aufbewahrt.
4. Inkubation mit mutS-Protein Dazu wurden die einzelnen mit Hairpinoligonucleotiden belegten Elektroden mit ca.
20 μl 20 mM Tris-Puffer (100 mM KCI, 5 mM MgCI2, pH 7.6) für mehr als 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Vor dem Aufbringen wurden 1/5 des Puffervolumens durch mutS-Protein Konzentrat (0.5 mg/ml) ersetzt.
5. Elektrochemische Experimente
Die einzelnen Elektroden wurden in wäßriger K3/K4Fe(CN)6-Lösung (Darmstadt, D) (20 mM in 20 mM Tris-puffer 100 mM KCI, 5 mM MgCI) im Frequenzbereich von 100 mHz bis 1 MHz bis 100 mHz vor und nach Inkubation mit MutS vermessen. Die Messwerte sind in dem Bode-Diagramm dargestellt. Die Messungen wurden an einem Impedanzmessplatz IM 6e der Firma Zahner Messtechnik bei Raumtemperatur durchgeführt.
Nukleinsäuresequenz: 5'-3' X = Amino-Modifier-dT MutS-Substrat Seq. ID No. 50 ATT CGA TCG GGG CGG GGC GAG CTT TTX GCT CGC CTT
GCC CCG ATC GAA T Seq. ID No. 51 ATT CGA TCG GGG CGG GGC GAG CTT XTT GCT CGC CCC
GCC CCG ATC GAA T
Impedanzspektrospie
Zur elektrochemischen Unterschung wurde die Impedanzspektroskopie herangezogen. Bei dieser Untersuchungmethode wird an das zu untersuchende System eine Wechselspannung angelegt, deren Frequenz variiert und dabei der Wechselstromwiderstand gemessen. Insbesondere computerunterstützte
Messplätze, die die Handhabung und Bedienbarkeit der Untersuchung vereinfachen und die verminderten Kosten führten zu einer weiten Verbreitung der Messmethoden, um Oberflächen zu untersuchen. Vorteil dieses Verfahrens ist, dass sich zerstörungsfrei und labelfrei Messungen an den Proben durchführen lassen. Als Modellsystem für die Bindung von
Fehlpaarungen erkennenden Substraten wurde das mutationenerkennende Protein mutS aus E. coli verwendet, als duplexbildende Oligonucleotide wurden Seq. ID No 50 und 51 benutzt. Durch Einbringen eines Aminomodifier-Bausteins in den Hairpin- Loop wurde die Affinität von mutS an dieser Stelle zu binden selektiv unterdrückt. Die Ergebnisse der Messung sind in den Fig. 29A und 29B dargestellt. Die unterbrochenen Linien zeigen den Wechselstromwiderstand vor der Zugabe von mutS, die durchgezogenen Linen zeigen den Wechselstromwiderstand nach Zugabe von mutS (die Phasenkurven besitzen ein Minimum bei ca. 1000Hz). In Fig. 29A sind zwei Messungen der zwei GT-Fehlpaarungen enthaltenden Sequenz Seq ID No. 50 wiedergegeben, Fig. 29B zeigt zwei Messungen bei Verwendung von Seq ID
No. 51 , die diese beiden Basenfehlpaarungen nicht enthält. Im vorliegenden Beispiel zeigt die Abnahme der Impedanz im für die Messung interessanten Bereich von unter 100Hz eine erhöhte mutS-Bindung an. In Fig. 29A ist, wie erwartet, eine Erniedrigung der Impedanz durch die Bindung von mutS dargestellt, aus Fig. 29B ist keine bzw. nur eine sehr geringe Bindung von mutS erkennbar.
Beispiel: Einfluß der Konzentration der verwendeten Oligonukleotide auf den mutS- vermittelten Mutationsnachweis:
In diesem Beispiel soll gezeigt werden, dass die Detektion von Mutationen mit fluoreszenzfarbstoffmarkiertem mutS aus E.coli als Fehlpaarungen erkennendes Substrat in einem weiten DNA-Konzentrationsbereich funktioniert. Dazu wurden die einzelnen Positionen eines Hydrogelchips mit unterschiedlich konzentrierten Lösungen von perfekt paarenden oder GT-fehlpaarenden Erst- und Zweitstrang- Oligonukleotiden beladen und anschließend die Bindung von mutS an die jeweiligen Positionen ermittelt.
Experimentelle Durchführung:
Die verwendeten Oligonukleotide wurden jeweils in mehreren unterschiedlichen Konzentrationen (100 nM, 33 nM, 10 nM, 3,3 nM, 1 nM und 0,33 nM) in Histidinpuffer gelöst und 5 min bei 95°C denaturiert. Die elektronische Adressierung der unterschiedlich konzentrierten Lösungen des biotinylierten Erststrang-
Oligonukleotids „sense" (Seq. ID No. 10) auf die einzelnen Positionen eines Hydrogelchips erfolgte im Ladegerät der Nanogen-Workstation für 60 sec bei einer Spannung von 2,1 V. Die Hybridisierung mit den unterschiedlich konzentrierten Lösungen der Gegenstränge AT (Seq. ID No. 12) bzw. GT (Seq. ID No. 13) wurde für 120 sec bei 2,1 V durchgeführt. Das Beladungsschema ist in Tabelle 52 dargestellt.
Nach der Beladung wurde der Chip aus dem Ladegerät entnommen, mit 1 ml Blockpuffer gefüllt und zur Absättigung unspezifischer Proteinbindungsstellen 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde der Chip mit 10 μl Cy5- markiertem E. co//-mutS (Konzentration: 50 ng/μl) in 90 μl Inkubationspuffer 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach diesem Schritt wurde der Chip von Hand mit 1 ml Inkubationspuffer gewaschen, dann in den Nanogen-Reader eingesetzt und dort bei einer Temperatur von 37°C 50x mit je 250 μl Waschpuffer gewaschen. Schließlich wurde die Cy™5-Fluoreszenzintensität auf den einzelnen Positionen des Chips im Nanogen-Reader mit folgender Geräteeinstellung gemessen: hohe Sensitivität („high gain"); 256 μs Integrationszeit.
Histidinpuffer: 50 mM L-Histidin, durch eine 0,2 μm-Membran filtriert und entgast
Blockpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01 % Tween-20 / 3%
BSA
Inkubationspuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,01% Tween-20
/ 1 % BSA
Waschpuffer: 20 mM Tris, pH 7,6 / 50 mM KCI / 5 mM MgCI2 / 0,1 % Tween-20
Die gemessenen roten Fluoreszenzintensitäten sind in Tabelle 53 aufgeführt. Die Ergebnisse der statistischen Auswertung der Meßwerte sind in Tabelle 54 zusammengefaßt sowie in den Abbildungen Fig. 30 - 32 veranschaulicht.
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000095_0001
Tabelle 52: Beladungsschema eines Hydrogelchips mit unterschiedlich konzentrierten Erst- und Zweitsträngen. Die einzelnen Positionen wurden zuerst mit der jeweils angegebenen Konzentration des biotinylierten Oligonukleotids „sense" beladen und anschheßend mit den Zweitstrang-Oligonukleotiden „AT" bzw. „GT" in den aufgeführten Konzentrationen hybridisiert. Als Kontrolle wurden einige Positionen nur mit Erst- oder Zweitstrang beladen; Position 6/2 blieb als Referenzelektrode frei.
Figure imgf000095_0002
Tabelle 53 : Messung der roten Fluoreszenzintensität des mit unterschiedhch konzentrierten OMgonukleotiden beladenen Hydrogelchips zum Nachweis der Bindung von Cy5 -markiertem E.coli-matS. Angegeben sind die Positionen des Chips mit den zugehörigen relativen Fluoreszenzintensitäten.
Figure imgf000095_0003
Figure imgf000096_0001
Tabelle 54: Statistische Auswertung der mutS-Bindung an den mit unterschiedhch konzentrierten Oligonukleotiden beladenen Hydrogelchip. Berechnet wurden jeweils die Mittelwerte und Standardabweichungen der roten Fluoreszenzintensität aller Positionen mit gleicher Beladung.
Fig. 30 zeigt die Zweitstrang-Verdünnungsreihe. Die Konzentration des als Erststrang verwendeten Oligonukleotids „sense" betrug jeweils 100 nM; die als Zweitstrang verwendeten Oligonukleotide AT bzw. GT wurden in den im Diagramm angegeben Konzentrationen eingesetzt. Dargestellt ist für die einzelnen Zweitstrang- Konzentrationen jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität nach mutS-Bindung.
Fig. 31 zeigt die Erststrang-Verdünnungsreihe. Das als Erststrang verwendete Oligonukleotid „sense" wurde in den im Diagramm angegeben Konzentrationen eingesetzt. Die Konzentration der als Zweitstrang verwendeten Oligonukleotide AT bzw. GT betrug jeweils 100 nM. Dargestellt ist für die einzelnen Erststrang- Konzentrationen jeweils die mittlere rote Fluoreszenzintensität nach mutS-Bindung. Fig. 32 zeigt die gleichzeitige Verdünnung von Erst- und Zweitstrang. Das als Erststrang verwendete Oligonukleotid „sense" sowie die als Zweitstrang verwendeten Oligonukleotide AT bzw. GT wurden gleichermaßen verdünnt; die eingesetzten Konzentrationen sind im Diagramm angegeben. Dargestellt ist für die einzelnen Oligonukleotid-Konzentrationen jeweils die mittlere rote
Fluoreszenzintensität nach mutS-Bindung.
Aus Fig. 30 geht hervor, daß die Konzentration der verwendeten Zweitstrang- Oligonukleotide gegenüber der in den zuvor beschriebenen Experimenten eingesetzten Konzentration von 100 nM deutlich gesenkt werden kann: bei
Verwendung von 33 nM Zweitstrang-Lösungen wird die GT-Fehlpaarung von mutS um den Faktor 7,5 stärker gebunden als die perfekte Paarung (AT), und sogar bei Verwendung von 10 nM Zweitstrang-Lösungen wird die GT-Fehlpaarung noch mit einem Faktor von 1 ,7 gegenüber der perfekten Paarung erkannt. Wird dagegen bei konstanter Zweitstrang-Konzentration von 100 nM die Konzentration der verwendeten Erststrang-Lösung gesenkt, so wird die GT-Fehlpaarung sogar bei einer Erststrang-Konzentration von nur 1 nM noch um den Faktor 2,3 stärker von mutS gebunden als die perfekte Paarung (Fig. 31). Darüber hinaus wurde auch nach einer gleichzeitigen Senkung der Konzentration der Erststrang- und der Zweitstrang- DNA auf 33 nM noch eine deutliche mutS-vermittelte Erkennung der GT-
Fehlpaarung erreicht (Fig. 32).
Somit kann gezeigt werden, daß relativ große Schwankungen in der Konzentration der eingesetzten DNA nicht zu größeren Schwankungen in der mutS-Bindung führen. Dies demonstriert die hohe Zuverlässigkeit der hier beschriebenen Methode zum Nachweis von Mutationen vor allem im Bereich praktisch relevanter DNA- Konzentrationen, wie sie bei der Untersuchung von Proben aus Patienten erhalten werden. Weiterhin zeigt dieses Beispiel, dass ein Vergleich von verschiedenen Patientenproben auch dann möglich ist, wenn die einzelnen Proben nicht exakt die gleiche DNA-Konzentration aufweisen. Zusätzlich wurde durch das Experiment gezeigt, daß für den mutS-vermittelten Mutationsnachweis bereits sehr geringe Mengen an DNA ausreichend sind.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen umfassend die Verfahrensschritte Hybridisierung einzelsträngiger Proben- Nucleotidsequenzen mit einzelstrangigen Referenz-Nucleotidsequenzen, Fixierung von einzelstrangigen Referenz-Nucleotidsequenzen oder einzelstrangigen Proben-Nucleotidsequenzen vor oder während der Hybridisierung oder von Heteroduplices aus Referenz- und Proben- Nucleotidsequenzen nach oder während der Hybridisierung ortsaufgelöst auf einem Träger, Inkubation mit einem Heteroduplex-Fehlpaarungen erkennenden Substrat und Detektion der Substratbindungen.
2. Verfahren zum Nachweis von Mutationen in Nucleotidsequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) eine definierte, einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotid- Chip aufträgt,
b) die auf Mutationen zu untersuchende Nucleotidsequenz, die komplementär zur bekannten Nucleotidsequenz ist, ebenfalls auf den Chip aufträgt und durch Hybridisierung beider Sequenzen eine Heteroduplex herstellt,
c) die Heteroduplex mit einem Fehlpaarungen erkennenden markierten
Substrat inkubiert und
d) die Fehlpaarungen durch Detektion des an ihnen angelagerten, markierten Substrates nachweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die auf dem Träger fixierten einzelstrangigen Nucleotidsequenzen, die nicht hybridisiert vorliegen, durch Zugabe einer Nuclease abgebaut werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass als Nuclease die Mung Bean Nuclease oder S1 -Nuclease verwendet wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Träger eine elektronisch adressierbare Oberfläche verwendet wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Fixierung und/oder die Hybridisierung elektronisch beschleunigt erfolgt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine ortsaufgelöste, elektronisch beschleunigte Hybridisierung durchgeführt wird, wobei die Hybridisierungsbedingungen am jeweiligen Ort individuell eingestellt werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die individuelle
Einstellung der Hybridisierungsbedingungen durch die am jeweiligen Ort angelegte Stromstärke, die am jeweiligen Ort angelegte Spannung oder die Zeitdauer der elektronischen Adressierung erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass als elektronisch adressierbare Oberfläche ein Nucleotid-Chip verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass eine elektronisch adressierbare Oberfläche verwendet wird, die mit einer Permeationsschicht belegt ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Permationsschicht eine hohe Durchlässigkeit für Nucleotidsequenzen und die Heteroduplex-Fehlpaarungen erkennenden Substrate besitzt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass als Permeationsschicht eine Hydrogelschicht verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation mit dem Substrat unter Niedrigsalzbedingungen erfolgt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation mit dem Substrat bei einer Salzkonzentration zwischen 25 mM und 75 mM erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Inkubation mit dem Fehlpaarungen erkennenden Substrat BSA zugesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass vor Inkubation mit dem Fehlpaarungen erkennenden Substrat SSB zugesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fehlpaarungen erkennendes Substrat aus der Gruppe der Fehlpaarungen bindenden Proteine eingesetzt wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass als
Fehlpaarungen erkennendes Substrat ein Protein aus der Gruppe der mutS- Proteine, mutY-Proteine, MSH 1- bis 6-Proteine, S1 -Nuclease, T4- Endonuclease, Thyminglykosylase, Cleavase oder eine Mischung aus solchen Proteinen eingesetzt wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das
Fehlpaarungen bindende Protein das mutS-Protein aus E.coli, aus T thermophilus oder aus T aquaticus ist.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein markiertes Fehlpaarungen erkennendes Substrat eingesetzt wird.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass ein radioaktiv markiertes, lumineszierendes, farbstoffmarkiertes oder fluoreszenzmarkiertes Fehlpaarungen erkennendes Substrat oder ein mit Quantum Dots oder mit einem polymeren Marker oder Metallmarker versehenes Fehlpaarungen erkennendes Substrat verwendet wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete Substrat mit Cy™3, Cy™5, Oregon Green 488, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Bodipy 558/568, Bodipy 650/665, Bodipy 564/570, S 0535, S 0536, Dy-630-NHS, Dy-635-
NHS, EVOblue30-NHS, FAR-Blue, FAR-Fuchsia, Atto 650, FITC oder Texas Red markiert ist.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fehlpaarungen erkennendes Substrat-Fusionsprotein verwendet wird.
24. Verfahren nach Anspruch 23 dadurch gekennzeichnet, dass die fusionierte Domäne des verwendeten Substrat-Fusionsproteins ein Epitop für eine Antikörperbindung ist oder eine enzymatische Aktivität besitzt.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenz-Nucleotidsequenz und/oder die Proben-Nucleotidsequenz radioaktiv markiert, lumineszenzmarkiert, farbstoffmarkiert, fluoreszenzmarkiert, quantum-dots-markiert, polymermarkiert oder metallmarkiert sind.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass anstatt der Basenfehlpaarungen, die von dem Fehlpaarungen erkennenden Substrat schwach gebunden werden, deren korrespondierende Fehlpaarungen herangezogen werden.
27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass eine Mischung aus Heteroduplices mit zueinander korrespondierenden Fehlpaarungen mit einem Fehlpaarungen erkennenden Substrat inkubiert wird.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, dass bei Verwendung eines mutS-Proteins als Fehlpaarungen erkennendes Substrat anstatt der Fehlpaarung CC die Fehlpaarung GG, anstatt der Fehlpaarung TT die Fehlpaarung AA und/oder anstatt der Fehlpaarung AC die Fehlpaarung GT oder eine Mischung aus Heteroduplices tragend zueinander korrespondierende Fehlpaarungen aus dieser Gruppe für die
Substratbindung genutzt wird.
29. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion der Bindung des Fehlpaarungen erkennenden Substrates optisch, durch Fluoreszenzmessung des fluoreszenzmarkierten Substrates oder durch elektrische Auslesung oder durch Impedanzmessung oder durch Oberflächenplasmonresonanz-Messung oder durch gravimetrische Messung oder durch Cantilever oder Microcantilever oder durch akustische Methoden erfolgt.
30. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die erfolgreiche Hybridisierung der zu untersuchenden Nucleotidsequenzen durch einen Fluoreszenzfarbstoff oder durch elektronische Detektion oder durch Impedanzmessung oder durch Oberflächenplasmonresonanz-Messung oder gravimetrisch oder mit
Cantilever oder Microcantilever oder über akustische Methoden nachgewiesen wird.
31. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Proben-Nucleotidsequenzen und/oder die
Referenznucleotidsequenzen und/oder das Fehlpaarungen erkennende Substrat unterschiedlich markiert sind.
32. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fixierung der Nucleotidsequenzen auf der elektronisch adressierbaren Oberfläche, die Hybridisierung der Referenz- Nucleotidsequenzen mit den Proben-Nucleotidsequenzen und die Substratbindung gemessen wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 32, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an gebundenem Substrat quantitativ bestimmt wird.
34. Verfahren zum quantitativen Nachweis der Expression von mRNA in verschiedenen Zellen oder Geweben nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass man
a) eine bekannte einzelsträngige Nucleotidsequenz auf einen Nucleotid- Chip aufträgt,
b) aus verschiedenen Zellen oder Geweben gewonnene, markierte cDNA ebenfalls auf den Chip aufträgt und durch Hybridisierung beider Sequenzen eine Heteroduplex herstellt und
c) durch quantitative Messung der Markierung die Menge der mRNA bestimmt.
35. Verfahren nach Anspruch 33 oder 34, dadurch gekennzeichnet, dass man eine mit Farbstoff markierte cDNA einsetzt und die bei der Hybridisierung auftretende Färbung optisch quantitativ misst.
36. Verfahren zur Herstellung von mit Farbstoffen markierten, Fehlpaarungen erkennenden Proteinen, dadurch gekennzeichnet, dass man das Protein mit einem als Ester vorliegenden Farbstoff in einer wässrigen Lösung unter
Lichtausschluss inkubiert.
37. Verfahren nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass der Ester in einer Konzentration zwischen 1 μM und 100 μM eingesetzt wird.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 oder 37, dadurch gekennzeichnet, dass als Ester ein Farbstoff-Succinimidylester verwendet wird.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 38, dadurch gekennzeichnet, dass ein HEPES-Puffer aus 5 mM bis 50 mM N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- Ethansulfonsäure (HEPES), pH 7,5 bis 8,5, 50 bis 500 mM KCI, 1 bis 15 mM MgCI2, 5 bis 15% Glycerin in destilliertem Wasser verwendet wird.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass ein Fehlpaarungen bindendes Protein nach Anspruch 18 markiert wird.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 36 bis 40, dadurch gekennzeichnet, dass das Fehlpaarungen bindende Protein mit einem Farbstoff nach Anspruch 22 markiert wird.
42. Fehlpaarungen erkennendes Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es durch Kopplung mit einer nachweisbaren enzymatischen, antikörperbindenden, lumineszierenden, radioaktiven, farbstofftragenden oder fluoreszierenden Gruppe markiert ist.
43. Fehlpaarungen erkennendes Protein nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, dass es ein Protein aus der Gruppe mutS, mutY, MSH1 bis
MSH6, SI-Nuclease, T4-Endonuclease, Thyminglykosylase oder Cleavase ist.
44. Fehlpaarungen erkennendes Protein der Ansprüche 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einer enzymatischen Gruppe ausgewählt aus der Gruppe Chloramphenicol-Acetyltransferase, alkalische Phosphatase,
Luciferase oder Peroxidase markiert ist.
45. Fehlpaarungen erkennendes Protein der Ansprüche 42 oder 43, dadurch gekennzeichnet, dass es mit einem Fluoreszenzfarbstoff ausgewählt aus der Gruppe Cy™3, Cy™5, Oregon Green 488, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 647, Bodipy 558/568, Bodipy 650/665, Bodipy 564/570, S 0535, S 0536, Dy-630-NHS, Dy-635-NHS, EVOblue30-NHS, FAR-Blue, FAR-Fuchsia, Atto 650, FITC oder Texas Red markiert ist.
46. Verwendung von mutS für ein Verfahren zum ortsaufgelösten Mutationsnachweis in Nucleotidsequenzen auf einem Träger.
47. Verwendung von mutS für ein Verfahren zum Mutationsnachweis in
Nucleotidsequenzen auf einer elektronisch adressierbaren Oberfläche
48. Kit enthaltend einen elektrisch adressierbaren Chip, Referenz- Nucleotidsequenzen, eine einzelsträngige Nucleinsäuren abbauende Nuclease und mindestens ein spezifisch Fehlpaarungen erkennendes
Substrat.
49. Kit gemäß Anspruch 48 enthaltend einen Inkubationspuffer, einen Blockpuffer und einen Waschpuffer.
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