WO2002012520A1 - Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales - Google Patents

Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales Download PDF

Info

Publication number
WO2002012520A1
WO2002012520A1 PCT/JP2000/005213 JP0005213W WO0212520A1 WO 2002012520 A1 WO2002012520 A1 WO 2002012520A1 JP 0005213 W JP0005213 W JP 0005213W WO 0212520 A1 WO0212520 A1 WO 0212520A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plant
agrobacterium
gene
centrifugation
tissue
Prior art date
Application number
PCT/JP2000/005213
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Yukoh Hiei
Keisuke Kasaoka
Yuji Ishida
Original Assignee
Japan Tobacco Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP15802599A external-priority patent/JP4424784B2/ja
Priority to JP15802599A priority Critical patent/JP4424784B2/ja
Priority to DE60032184T priority patent/DE60032184T2/de
Priority to CA2386125A priority patent/CA2386125C/en
Priority to ES00949976T priority patent/ES2277592T3/es
Priority to AU63179/00A priority patent/AU785287B2/en
Priority to PCT/JP2000/005213 priority patent/WO2002012520A1/ja
Priority to KR1020027004030A priority patent/KR100807434B1/ko
Application filed by Japan Tobacco Inc. filed Critical Japan Tobacco Inc.
Priority to EP00949976A priority patent/EP1306440B1/en
Priority to PT00949976T priority patent/PT1306440E/pt
Priority to DK00949976T priority patent/DK1306440T3/da
Priority to CNB008138141A priority patent/CN1268752C/zh
Publication of WO2002012520A1 publication Critical patent/WO2002012520A1/ja
Priority to US12/902,631 priority patent/US7960611B2/en
Priority to US13/099,917 priority patent/US9840714B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/04—Plant cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8206—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated
    • C12N15/8207—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by physical or chemical, i.e. non-biological, means, e.g. electroporation, PEG mediated by mechanical means, e.g. microinjection, particle bombardment, silicon whiskers

Definitions

  • the present invention relates to a method for improving the efficiency of gene transfer into plant cells.
  • Agrobacterium-based transformation methods are generally efficient, have a low copy number of the gene to be transferred, can be introduced without fragmenting a specific region called T-DNA, and can be used for short-term culture. It has many excellent features, such as the ability to obtain transformants due to low culture variation. For this reason, it is widely used as the most useful transformation tool for various plant species.
  • the agrobacterium method is a very excellent method for transforming plants, but the success and efficiency of transformation vary greatly depending on the plant species, genotype, and plant tissues used. (Potrykus et al. 1998 (reference (33))). In other words, there are plant species that have not been successfully transformed, and there are many plant species that can be transformed by only a small number of varieties. Some plant species have limited available tissues and cannot handle large amounts of material. In order to produce a practical variety by genetic recombination, it is necessary to produce a large number of transgenic plants and then select a line having the desired trait. However, the types of crops from which a large number of transformants can be easily obtained for this purpose are limited at present. Therefore, the development of an improved method that can solve such problems is strongly desired.
  • the transformation method itself via agrobacterium varies the composition of the test material and the culture medium used for cultivation depending on the plant species, but the suspension of agrobacterium is brought into contact with the tissue used as the material. It is almost common to perform the procedure of selecting transformed cells after co-cultivation and producing transformed plants.
  • the plant tissue used as the material is usually infected with agrobacterium by sterilization as necessary, but without any other special treatment (Rogers et al. 1988 (references). (34)), Visser 1991 (reference (38)), cCormick 1991 (reference (29)), Lindsey et al. 19 91 (references (28)). Therefore, research on the improvement of the transformation system has been focused on the Agrobacterium strain, vector composition, medium composition, types of selectable marker genes and promoters, and types of test tissues.
  • an object of the present invention is to provide a method for gene transfer into plant cells that can easily perform gene transfer without damaging the tissue with higher efficiency than the conventional gene transfer method using the agrobacterium method.
  • the aim is to provide a way to increase efficiency.
  • the inventors of the present invention have found that, in a gene transfer method using a bacterium belonging to the genus Agrobacterium, gene transfer efficiency is significantly improved by centrifuging a plant cell or plant tissue to be subjected to gene transfer. It was found that the present invention can be performed, and the present invention was completed.
  • the present invention provides a method for improving the efficiency of gene transfer into a plant cell via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium, which involves centrifuging a plant cell or a plant tissue.
  • the method is higher than the conventional gene transfer method using the agrobacterium method.
  • a method for improving the efficiency of gene transfer into plant cells in which gene transfer can be carried out efficiently and easily without damaging the tissue.
  • the method of the present invention is applicable to both monocotyledonous and dicotyledonous plants.
  • FIG. 1 is a diagram showing a method of constructing PT0K233, which is an example of a super binary vector that can be preferably used in the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a diagram showing a genetic map of pSB133, which is an example of a super binary vector that can be preferably used in the method of the present invention.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing a process of constructing an intermediate vector system and a binary vector system, which are two main types of vector systems of the genus Agrobacterium.
  • FIG. 4 is a schematic diagram showing two types of binary vector systems derived from the strongly pathogenic strain A281 of Agrobacterium ummefaciens.
  • virB The virB gene in the virulence region of Ti plasmid pTiBo542 contained in Agrobacterium tumefaciens A281
  • COS cos COS site of lambda phage
  • a method for introducing a gene via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium involves centrifuging a plant cell or a plant tissue into which the gene is to be introduced.
  • the plant cell or plant tissue may be subjected to centrifugation and then contacted with Agrobacterium under normal gravity, or may be contacted with Agrobacterium during centrifugation.
  • a preferred method is that a plant cell or plant tissue is centrifuged and then brought into contact with bacteria of the genus Agrobacterium under ordinary gravity.
  • the centrifugation conditions are appropriately selected depending on the type of the plant to be used, etc., and are usually from 100 G to 250,000 G, preferably from 500 G to 200,000 G, more preferably from about 100 OG to 150,000 G. It is performed in the centrifugal acceleration range.
  • the time for the centrifugation treatment is appropriately selected depending on the centrifugal acceleration speed, the type of the plant to be used, and the like. Although there is no particular upper limit on the centrifugation time, the purpose can usually be achieved in about 10 minutes.
  • the centrifugation time is extremely short when the centrifugal acceleration is large, and for example, the gene transfer efficiency can be significantly improved even if it is 1 second or less.
  • centrifugal acceleration when the centrifugal acceleration is small, the gene transfer efficiency can be significantly improved by performing the centrifugation for a long time.
  • Particularly preferred centrifugation conditions are 5 In most cases, it is about 1 second to 2 hours at 00G to 200,000G, especially 1 OOOG to 150,000G, but appropriate centrifugation conditions for the plant cells or plant tissues can be easily set by routine experiments. can do.
  • the method of the present invention is characterized in that a plant cell or a plant tissue to be contacted with a bacterium of the genus Agrobacterium is used by centrifugation, or the plant is contacted with a bacterium of the genus Agrobacterium while performing the centrifugation.
  • a method for gene introduction or transformation using a bacterium belonging to the genus Agrobacterium well-known methods can be applied as they are.
  • Methods for introducing or transforming a gene into a plant using a bacterium belonging to the genus Agrobacterium are well known in the art and widely used.
  • T-DNA Since T-DNA is integrated into the plant genome by infection with Agrobacterium, it was expected that when a desired gene was introduced into T-DNA, this gene would also be integrated into the plant genome. However, since the Ti plasmid is as large as 190 kb or more, it was difficult to insert the gene into T-DNA on the plasmid using standard genetic engineering techniques. Therefore, a method for introducing a foreign gene into T-DNA was developed.
  • the hormone-synthesizing gene was removed from the T-DNA of the neoplastic " ⁇ " plasmid Disarmed strains LBA4404 (Hoekema et al., 1983 (reference (12))), C58G1 (pGV3850) (Zambryski et al., 1983 (reference (40))), GV3Ti11SE (FraIey et al., 1985 (reference (9))) and others (Fig. 3).
  • LBA4404 Hoekema et al., 1983 (reference (12))
  • C58G1 pGV3850
  • GV3Ti11SE FraIey et al., 1985 (reference (9)
  • Fig. 3 two types of methods have been developed to introduce the desired gene into the T-DNA of the Ti plasmid of agrobacterium or the T-DNA having the desired gene into the agrobacterium.
  • an intermediate vector which is easy to genetically manipulate, can insert the desired gene, and can be replicated in Escherichia coli, into the T-DNA region of the disarm-type plasmid of Agrobacterium ⁇ .
  • This method is introduced by homologous recombination via the tri parental mating method (Ditta et al., 1980 (reference (8))) and is called an intermediate vector method (Fraley et al., 1985 ( Reference (9)); Fraley et al., 1983 (Reference (10)); Zambryski et al., 1983 (Reference (40)), JP-A-59-140885 (EP116718).
  • the other is called the binary vector method (Fig.
  • a binary vector is one in which T-DNA is integrated into a small plasmid that can be replicated in both agrobacterium and Escherichia coli, which is then introduced into an agrobacterium having a disarmed plasmid. Used.
  • the introduction of the binary vector into the agglomerator can be performed by a method such as an electroporation method or a three-way hybridization method.
  • the binary vector pBIN19 (Bevan, 1984 (Reference (4))), pBI121 (Jefferson, 1987 (Reference (19))), P GA482 (An et al., 1988 ( Reference (2)), Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • EHA101 Hood et a, 1986
  • EHA105 Hood et a, 1993
  • the other is 'super-binary' vector (Hiei et al., 1994 (reference (11)); Ishida et al., 1996 (reference (18)); Komari et al., 1999 (Ref. (26)), W094 / 00977, W095 / 06722) (Fig. 4).
  • vir region (virA, virB, virC !, virD , £ ⁇ Pi 6 (hereinafter these are sometimes referred to as "v i r fragment region”.)
  • v i r fragment region Oyo disarmed the Ti plasmid with It is a kind of binary vector system because it consists of a plasmid containing T-DNA and T-DNA.
  • the plasmid having the T-DNA that is, a fragment of the vir region obtained by substantially removing at least one vir fragment region from the Vir fragment region in the binary vector (preferably at least virB or A difference is that a superbinary vector incorporating a fragment containing virG, more preferably a fragment containing virB and virG, is used (Komari, 1990a (Reference (22))).
  • a superbinary vector incorporating a fragment containing virG, more preferably a fragment containing virB and virG is used (Komari, 1990a (Reference (22)).
  • homologous recombination via the three-way hybridization method can be used as an easy method (Komari et al.). al., 1996 (references (25)).
  • Agrobacterium tumefaciens for example, Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Hoekema et al., 1983 (Reference (12))) and EHA101 (Hood et al., 1986 (Ref. (15)) can be preferably used.
  • the present invention can be used for any vector system such as the above-mentioned intermediate vector, binary vector, strongly pathogenic binary vector, and super binary vector, and the effects of the present invention can be obtained.
  • a part of the whole is cut out and introduced into an agrobacterium as a part of a new plasmid. Further, naturally, according to the method of the present invention, even in the case of a wild-type Agrobacterium bacterium, the efficiency of introducing a wild-type T-DNA region into a plant can be increased, and the infection efficiency can be effectively improved.
  • the desired gene to be introduced into the plant can be inserted into a restriction enzyme site in the T-DNA region of the above-described plasmid by a conventional method, and is resistant to drugs such as kanamycin and paromomycin, which are simultaneously or separately incorporated into the plasmid.
  • drugs such as kanamycin and paromomycin, which are simultaneously or separately incorporated into the plasmid.
  • the target DNA can be introduced by using homologous recombination in the cells of the genus Agrobacterium by the three-way hybridization method.
  • Agrobacterium bacterium such as Agrobacterium tumefaciens
  • Agrobacterium tumefaciens can be carried out by a conventional method. Includes various methods, such as electroporation, electroinjection, and chemical processing such as PEG.
  • the gene to be introduced into the plant is basically located between the left and right border sequences of the T-DNA as in the conventional technology.
  • the plasmid is circular, the number of boundary sequences may be one, and if multiple genes are to be placed at different sites, there may be three or more boundary sequences.
  • Agrobacterium genus bacteria it may be arranged on a ⁇ or Ri plasmid, or may be arranged on another plasmid. Furthermore, it may be arranged on a plurality of types of plasmids.
  • the method for introducing a gene via a bacterium belonging to the genus Agrobacterium can be performed by simply contacting a plant cell or a plant tissue with the bacterium belonging to the genus Agrobacterium.
  • a suspension of a bacterium of the genus Agrobacterium having a cell concentration of about 10 6 to 10 11 cells Zm I is prepared, and a plant cell or plant tissue is immersed in the suspension for about 3 to 10 minutes. Thereafter, it can be performed by co-culturing on a solid medium for several days.
  • the cells or tissues to be subjected to gene transfer are not limited at all, and may be leaves, roots, stems, fruits, or any other site, or dedifferentiated cells such as callus. Embryos that have not been used may be used. Although the type of plant is not limited at all, angiosperms are preferred, and dicots or monocots may be used if they are angiosperms. As will be specifically shown in the following examples, the method of the present invention significantly improves the efficiency of gene transfer as compared with the conventional agrobacterium method.
  • LBA4404 (pBI121) (pBM21 is commercially available from Clonetech, USA, (Jefferson RA 1987 (Reference (19))), LBA4404
  • pSB133 LBA4404 (pT0K233) (Hiei et al., 1994 (Reference (11))) and LBA4404 (pSB133) ( Figure 2).
  • the construction of pSB133 was performed as follows. The 6.2 kb DNA fragment obtained by digesting pGA482 (An G et al., 1985 (Reference (3))) with the restriction enzyme Sal I was converted into pSB11 (Ko mari et al., 1996 (Reference (3)).
  • PSB133 was obtained by homologous recombination between pSB1 and pSB33 in Agrobacterium
  • the T-DNA region of PBI121 contains the nopaline synthase gene (nos).
  • nptll kanamycin resistance gene
  • GUS cauliflower mosaic virus
  • the T-DNA region of plG121Hm and pT0K233 is controlled by the nos promoter
  • the nptll gene, the hpt gene controlled by the 35S promoter, the 35S promoter contain the GUS gene mediated by the intron of the castor catalase gene
  • the T-DNA region of PSB133 is controlled by the nos promoter
  • Fig. 2 Incidentally, the P SB133 and PT0K2 33 transforming ability is high super-binary vector one (Komar i, T. et a)., A 199 9 (Reference (26))).
  • the rice immature embryo was placed in a tube containing sterilized water, and centrifuged at 760 G to 150,000 G using a micro high-speed centrifuge, a large high-speed centrifuge, or an ultra-high-speed centrifuge. After centrifugation, immature embryos were inoculated with Agrobacterium.
  • the method of inoculating immature embryos and co-culturing was according to Hiei et al. (1994) (reference (11)). That is, after centrifugation, the sterilized water inside the tube was removed, a suspension of agobacterium was added, and the mixture was stirred with a portex mixer for 5 to 30 seconds.
  • the bacterial suspension was prepared by scraping agrobacterium colonies cultured on AB medium (Chilton, -D eta, 1974 (Ref. (6)) for 3 to 10 days with a platinum loop, using modified AA Medium (AA major inorganic salts, AA amino acids and AA vitamins (Toriyama K.
  • the primary selection medium containing 250 mg / l carpenicillin and 250 mg / l cefotaxime, 200 mg / l paromomycin or 10-30 mg / l hygromycin, and light at 30 ° C. Cultivated for 1-2 weeks below.
  • the primary selection medium a medium obtained by adding 30 g / l D-sorbitol to 2N6K medium according to Hiei et al. (1994) (Reference (11)) was used (K medium). Also, according to Hiei et al. (1994) (reference (11)), 2N6 medium (inorganic salts and vitamins of N6 (Ghu C.
  • the callus formed on the primary selection medium was transplanted onto the secondary selection medium containing 250 mg / l cefotaxime and 250 mg / I carpenicillin, and containing 200 mg / l paromomycin or 80 mg / l hygromycin, and 30 ° C Cultures were performed for 1-2 weeks under light conditions.
  • 8 g / l agarose was used as a medium solidifying agent in the above-mentioned primary and secondary selection medium containing paromomycin. The incidence of resistant calli was investigated after the secondary selection.
  • Hiei et al. (1994 (ref. (11))) report that transformation can be performed with relatively high efficiency using rice callus as a material.
  • Aldemita RR et al. 1996 (reference (1)) reports a transformation example using a rice immature embryo.
  • the above-described centrifugal treatment method is very effective in performing these transformation techniques more efficiently and stably.
  • immature embryos are easily affected by the cultivation environment and it is not always easy to obtain immature embryo material suitable for transformation.However, centrifugation can maintain a stable and high transformation efficiency. is there.
  • Hiei et al. (1994 (ref. (11))) showed that a super-binary vector, a highly transformable vector, improves rice transformation efficiency.
  • Test strain LBA4404 / plG121Hm, centrifugation time: 60 minutes
  • Test bacteria system LBA4404 / P IG121Hm, 1) trace a high-speed centrifugal separator 2) of each large high-speed centrifugal machine rotation speed to, centrifugation for 60 minutes
  • Test bacterial system LBA4404 / plG121Hm, 1) micro high-speed centrifuge 2) large-scale high-speed centrifuge 60-minute centrifugation for each rotation speed
  • a corn immature embryo (approximately 1.2 mm in size, cultivar A188, obtained from the National Institute for Bioresources, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries) was aseptically removed and washed once with LS-inf liquid medium.
  • LS-inf liquid medium At a concentration of about 1 x 10 9 c fu / ml in LS-inf medium 2.0 ml containing Asetoshiringon immature embryos and 100 M in a centrifuge tube, Agrobacter i urn tumefac i ens LBA4404 (pSB131) (Ishida et al.
  • Table 13 shows the transient expression of the GUS gene in A188 immature embryos inoculated with LBA4404 (pSB131). All of the immature embryos showed the expression of the GUS gene, but many of the immature embryos subjected to centrifugation showed a wider range of expression than the control immature embryos. The increase in the gene transfer site due to the centrifugation was observed both when the centrifugation was performed with agrobacterium and when the agrobacterium was inoculated after the centrifugation. In addition, even when the centrifugal strength and the treatment time were changed, GUS gene expression was observed in a wider range than the control.
  • Test 1 centrifugation was performed in the presence of Agrobacterium. In Test 2, after centrifugation, inoculation of agrobacterium was performed.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

明細書
植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
技術分野
本発明は、 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法に関する。
背景技術
ァグロパクテリゥムによる形質転換法は、 一般的に、 効率が高い、 導入される 遺伝子のコピー数が少ない、 T-DNAという特定の領域を断片化させることなく導 入できる、 短期間の培養によリ形質転換体を得ることができるため培養変異が少 ないなど、 多くの優れた特徴を持っている。 このため、 さまざまな植物種で最も 有用な形質転換の手段として広く用いられている。
このように、 ァグロパクテリゥム法は非常に優れた植物の形質転換方法である が、 形質転換の成否ならびに効率は、 植物種、 遺伝子型ならびに用いる植物組織 に依存して大きく異なるのが実状である （Potrykus et a l . 1998 (参考文献 (33) ) ) 。 すなわち、 形質転換に成功していない植物種があるほか、 ごく一部の品種の み形質転換が可能な植物種も多い。 また、 利用可能な組織が限定されており大量 の材料を取り扱うことができない植物種もある。 遺伝子組換えにより実用的な品 種を作出するには、 多数の形質転換植物を作出した上で、 目的とする形質を持つ た系統を選抜する必要がある。 しかしながら、 この目的に即し多数の形質転換体 を容易に得ることができる作物の種類は、 現状では一部に限定されている。 した がって、 このような問題点を解決することができる改良手法の開発が強く望まれ ている。
ァグロパクテリゥムを介する形質転換方法自体は、 植物種によリ供試材料や培 養に用いる培地の組成などを異にするものの、 材料となる組織にァグロバクテリ ゥムの懸濁液を接触させ、 共存培養の後に形質転換細胞の選抜を行い、 形質転換 植物を作出するどいう操作ではほぼ共通している。 材料となる植物組織には対し ては、 通常、 必要に応じ滅菌処理を行うがそれ以外に特別な処理を施すことなく ァグロパクテリゥムの感染が行われる （Rogers et a l . 1988 (参考文献 (34) )， V i sser 1991 (参考文献（38) )， cCorm i ck 1991 (参考文献（29) ) , L i ndsey et a l . 19 91 (参考文献 (28) ) ) 。 従って、 形質転換系の改良は、 ァグロバクテリウムの菌系、 ベクター構成、 培地組成、 選抜マーカー遺伝子やプロモーターの種類、 供試組織 の種類などを中心に研究が行われてきた。
これに対し、 ァグロパクテリゥムを接種する前の植物組織を、 遺伝子導入が生 じゃすい生理的状態に変換するという考え方に基づく研究は、 ほとんど行われて いない。 何らかの簡便な処理により、 そのような生理的状態に変換することがで きればたいへん利用価値が高く、 遺伝子導入効率の向上に加え、 従来困難であつ た植物種や遺伝子型の形質転換を可能にする顕著な効果も期待される。 これまで の植物組織への前処理に関する研究例としては、 パーティクルガン（B i dney et a l .， 1992 (参考文献 (5) ) )および超音波 (Tr i ck et a l .， 1997 (参考文献 (37) ) )処理 が上げられる。 どちらも物理的に組織を付傷することでパクテリァの植物組織内 への侵入を促し、 感染対象となる植物細胞を増加させることを目的としている。 しかしながら、 これは従来より広く行われているリーフディスク法（Horsch et a に， 1985 (参考文献 (17) ) )を発展させたものに過ぎず、 新規な考え方に基づく処 理法ではない。 なお、 効果の程度や汎用性は明らかでなく、 一般的な手法として 用いられていないのが現状である。
発明の開示
従って、 本発明の目的は、 従来のァグロパクテリゥム法による遺伝子導入方法 よリも高い効率で組織を付傷することなく簡便に遺伝子導入を行うことができる、 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法を提供することである。
本願発明者らは、 鋭意研究の結果、 ァグロパクテリゥム属細菌を用いた遺伝子 導入方法において、 遺伝子導入に供する植物細胞又は植物組織を遠心処理するこ とにより、 遺伝子導入効率を有意に向上させることができることを見出し本発明 を完成した。
すなわち、 本発明は、 植物細胞又は植物組織を遠心処理することを伴う、 ァグ ロバクテリウ厶属細菌を介して行われる植物細胞への遺伝子導入の効率を向上さ せる方法を提供する。
本発明によリ、 従来のァグロパクテリゥム法による遺伝子導入方法よリも高い 効率で、 組織を付傷することなく簡便に遺伝子導入を行うことができる、 植物細 胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法が提供された。 本発明の方法は、 単子 葉植物に対しても双子葉植物に対しても適用可能である。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の方法に好ましく用いることができるスーパーバイナリーべク ターの例である PT0K233の構築方法を示す図である。
図 2は、 本発明の方法に好ましく用いることができるスーパーバイナリ一べク ターの例である pSB133の遺伝子地図を示す図である。
図 3は、 ァグロパクテリゥ厶属細菌の主要な 2種類のベクターシステムである 中間ベクターシステムとバイナリーベクターシステムの構築過程を示す模式図で あ 。
図 4は、 ァグロパクテリゥ厶 ッメファシエンスの強病原性菌株 A281に由来 する 2種類のバイナリーベクターシステムを示す模式図である。
なお、 上記各図中、 下記の符号は下記の意味を表す。
virB Agrobacter ium tumefaciens A281に含まれる T iプラスミ卜 pTiBo542の ヴィルレンス領域中の virB遺伝子
virC Agrobacter ium tumefaciens A281に含まれる T iプラスミド ρΉΒο542の ヴィルレンス領域中の V i rG遺伝子
virG Agrobacter ium tumefaciens A281に含まれる T iプラスミド pTiBo542の ヴィルレンス領域中の virG遺伝子
BL ァグロパクテリゥム属細菌の T— D N Aの左ボーダー配列
BR ァグロパクテリゥム属細菌の T一 D N Aの右ボーダー配列
TC テトラサイクリン抵抗性遺伝子
SP スぺクチノマイシン抵抗性遺伝子
IG イントロン G US遺伝子
HPT ハイグロマイシン抵抗性遺伝子
K 制限酵素 K p η I部位
H 制限酵素 H i n d III 部位 Ampr アンピシリン耐性遺伝子
BAR bar遺伝子
Pnos ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター
Tnos ノパリン合成酵素遺伝子のターミネータ一
P35S GaMV 35Sプロモータ一
COS, cos ラムダファージの COS部位
ORI, ori ColE1の複製開始点
NPT, NPTII カナマイシン抵抗性遺伝子
Vir ァグロパクテリゥム属細菌の Tiプラスミドの全 vir領域
S Vir 強病原性ァグロバクテリゥ厶属細菌の Tiプラスミド PTiBo542の全 vir領 域
s vir* Tiプラスミド ΡΉΒο542の vir領域の一部を含む断片
発明を実施するための最良の形態
本発明の方法では、 ァグロパクテリゥム属細菌を介した遺伝子導入方法におい て、 遺伝子を導入する植物細胞又は植物組織を遠心処理することを伴う。 植物細 胞又は植物組織は、 遠心処理した後、 通常の重力下でァグロパクテリゥ厶属細菌 と接触させてもよいし、 遠心処理しながらァグロパクテリゥ厶属細菌と接触させ てもよい。 好ましくは、 植物細胞又は植物組織を遠心処理した後、 通常の重力下 でァグロパクテリゥム属細菌と接触させる方法である。
遠心処理条件は、 用いる植物の種類等に応じて適宜選択されるが、 通常、 1 0 0G~25万 G、 好ましくは 500G〜20万 G、 さらに好ましくは 1 O O OG 〜1 5万 G程度の遠心加速度範囲で行われる。 また、 遠心処理の時間は、 遠心加 速度及び用いる植物の種類等に応じて適宜選択されるが、 通常 1秒間以上行うこ とが好ましい。 なお、 遠心時間の上限は特にないが、 通常、 1 0分間程度で目的 を達成することができる。 なお、 遠心処理時間は、 遠心加速度が大きい場合には 極く短い時間、 例えば 1秒以下でも遺伝子導入効率を有意に向上させることがで きる。 一方、 遠心加速度が小さい場合には、 遠心処理を長く行うことにより遺伝 子導入効率を有意に向上させることができる。 特に好ましい遠心処理条件は、 5 00G〜20万G、 特には 1 OOOG〜1 50000Gで 1秒間〜 2時間程度の 場合が多いが、 その植物細胞又は植物組織にとっての適切な遠心処理条件は、 ル 一チンな実験により容易に設定することができる。
本発明の方法は、 ァグロパクテリゥム属細菌と接触させる植物細胞又は植物組 織として遠心処理したものを用いる、 又は遠心処理を行いながらァグロパクテリ ゥ厶属細菌と接触させることを特徴とするものであり、 ァグロパクテリゥ厶属細 菌を用いた遺伝子導入あるいは形質転換方法自体としては、 周知の方法をそのま ま適用することができる。
ァグロパクテリゥム属細菌を用いた植物への遺伝子導入あるいは形質転換方法 自体は、 この分野において周知であり、 広く用いられている。
土壌細菌ァグロパクテリゥ厶 （Agrobacterium tumefaciens) が多くの双子葉 植物に根頭癌腫病 （crown gall disease) を引き起こすことは古くから知られて おり、 1970年代には、 Τίプラスミドが病原性に関与すること、 さらに Τίプラス ミドの一部である T-DNAが植物ゲノムに組み込まれることが発見された。 その後 この T-DNAには癌腫の誘発に必要なホルモン （サイトカイニンとオーキシン） の 合成に関与する遺伝子が存在し、 細菌遺伝子であリながら植物中で発現すること が明らかにされた。 Τ - DNAの切り出しと植物への伝達には Tiプラスミド上のヴ ィルレンス領域 （vir領域） に存在する遺伝子群が必要であり、 また T- DNAが切 リ出されるためには T- DNAの両端に存在するボーダー配列が必要である。 他のァ グロバクテリゥム属細菌である Agrobacterium rhizogenesも Ri プラスミドによ る同様なシステムを有している （図 3及び図 4) 。
ァグロパクテリゥ厶の感染によって T-DNAが植物ゲノムに組み込まれるので、 T-DNA上に所望の遺伝子を揷入するとこの遺伝子も植物ゲノムに組み込まれるこ とが期待された。 しかしながら、 Tiプラスミドは 190kb以上と巨大であるため、 標準的な遺伝子工学手法ではプラスミド上の T-DNA上に遺伝子を挿入することは 困難であった。 そのため、 T-DNA上に外来遺伝子を揷入するための方法が開発さ れた。
まず、 腫瘍性の "Πプラスミドの T - DNAからホルモン合成遺伝子が除去された デイスアーム型の菌系 （disarmed strains) である LBA4404 (Hoekema et al. , 1 983 (参考文献（12)))、 C58G1 (pGV3850) (Zambryski et al. , 1983 (参考文献（40)) )、 GV3Ti11SE(FraIey et al., 1985 (参考文献 (9)))などが作製された (図 3) 。 これらを用いることにより、 所望の遺伝子をァグロバクテリゥムの Ti プラスミ ドの T- DNA中に、 あるいは所望の遺伝子を有する T-DNAをァグロバクテリゥムに 導入する 2種類の方法が開発された。 このうちの一つは、 遺伝子操作が容易で所 望の遺伝子の挿入が可能であり、 大腸菌で複製ができる中間ベクターを、 ァグロ バクテリウ厶のデイスアーム型 Ήプラスミドの T- DNA領域中に、 三系交雑法 （t ri parental mating) (Ditta et al. , 1980 (参考文献（8)))を介して相同組換えに より導入する方法であり、 中間ベクター法と呼ばれる（Fraley et al.， 1985(参 考文献（9)) ; Fraley et al. , 1983 (参考文献（10)) ; Zambryski et al. , 1983(参 考文献 (40))、 特開昭 59- 140885号 (EP116718) )。 もう一つは、 バイナリ一べク ター （binary vector) 法とよばれるもので （図 3) 、 T-DNAの植物への組み込 みに vir領域が必要であるが、 機能するために同じプラスミド上に存在する必要 はないという結果（Hoekema et al. , 1983)に基づいている。 この vir領域には v irA、 virB、 virG、 virD、 vi rE及び vi rGが存在し、 （植物バイオテクノロジー 事典 （ェンタブライズ株式会社発行 （1989) ) ) 、 vir領域とはこの virA、 virB、 virC virD、 virE及び virGの全てを含むものをいう。 したがって、 バイナリー ベクターは、 T-DNAをァグロバクテリゥムと大腸菌の両方で複製可能な小さなプ ラスミドに組み込んだものであり、 これをデイスアーム型 Ήプラスミドを有す るァグロバクテリゥムに導入して用いる。 ァグロパクテリゥムへのバイナリーべ クタ一の導入には、 エレクトロポレーシヨン法や三系交雑法などの方法により行 うことができる。 バイナリーベクターには、 pBIN19(Bevan, 1984 (参考文献（4) ) )、 pBI121 (Jefferson, 1987(参考文献（19)))、 PGA482(An et al., 1988 (参考文献（2 ))、 特開昭 60- 70080号 （EP120516) )などがあり、 これらをもとに数多くの新た なバイナリーベクタ一が構築され、 形質転換に用いられている。 また、 Ri ブラ スミドのシステムにおいても、 同様なベクターが構築され形質転換に用いられて いる。 ァグロパク亍リウム A281 (Watson et a I . , 1975 (参考文献 (39) ) )は、 強病原性 (super-virulent) の菌系であり、 その宿主範囲は広く、 形質転換効率も他の菌 系より高い（Hood et aに， 1987(参考文献 (13))； Komari, 1989 (参考文献 (21)))。 この特性は、 A281が有する Ti プラスミドの PTiBo542によるものである（Hood e t al. , 1984 (参考文献（16)) ; Jin et al. , 1987 (参考文献（20) ) ; Komari et al. , 1986 (参考文献 (24)))。
ρΉΒο542を用いて、 これまでに 2つの新しいシステムが開発されている。 一 つは pTiBo542のデイスアーム型の Ti プラスミドを有する菌系 EHA101 (Hood et aに， 1986)および EHA105(Hood et aに， 1993)を用いたものであり、 これらを上 述のバイナリ一べクターシステムに適用することにより、 形質転換能力の高いシ ステムとして種々の植物の形質転換に利用されている。 もう一つは、 スーパーバ イナリーべクタ一 (' super-binary' vector) (Hiei et a I . , 1994 (参考文献（11) )； Ishida et al. , 1996 (参考文献（18)) ; Komari et al. , 1999 (参考文献（26))、 W094/00977号、 W095/06722号）システムである （図 4) 。 このシステムは、 vir 領域 （virA、 virB、 virC！、 virD、 £及ぴ 6 (以下、 これらをそれぞれ 「vir 断片領域」 ということもある。 ） ） を持つディスアーム型の Ti プラスミドおよ び T - DNAを有するプラスミドからなることから、 バイナリーベクターシステムの 一種である。 しかしながら、 T - DNAを有する側のプラスミド、 即ちバイナリーべ クタ一に V i r断片領域のうち、 少なくとも一つの vi r断片領域を実質的に取除い た vir領域の断片 （このうち好ましくは少なくとも virB又は virGを含む断片、 さらに好ましくは virB及び virGを含む断片） を組み込んだ（Komar i , 1990a (参 考文献 (22)))スーパーバイナリーベクタ一を用いる点で異なる。 なお、 スーパー バイナリーベクターを有するァグロパクテリゥムに、 所望の遺伝子を組み込んだ T - DNA領域を導入するには、 三系交雑法を介した相同組換えが容易な手法として 利用できる（Komari et al. , 1996 (参考文献 (25) ) )。 このスーパーバイナリーべ クタ一システムは、 上述の種々のベクターシステムと比べて、 多くの植物種で非 常に高い形質転換効率をもたらすことが明らかとなっている（Hiei et al., 1994 (参考文献（11)) ; Ishida et al., 1996 (參考文献（18)) ; Komari, 1990b (参考文 献 (23)) ; Li et al.， 1996 (参考文献 (27)) ; Saito et al., 1992 (参考文献 (35) ) 本発明の方法においては、 宿主となるァグロパクテリゥム属細菌としては、 特 に限; されなしヽが、 Agrobacter ium tumefaciens (例えば上述の Agrobacter ium tumefac i ens LBA4404 (Hoekema et a I .， 1983 (参考文献（12) ) )および EHA101 (Ho od et al. , 1986 (参考文献 (15))) を好ましく用いることができる。
本発明の方法によれば、 ァグロパクテリゥ厶属細菌における病原性 （vir) 領 域の遺伝子群の発現に基づく遺伝子導入系であれば、 特に限定されることなく有 意な効果を得ることができる。 したがって、 上述の中間ベクター、 バイナリーべ クタ一、 強病原性のバイナリーベクター、 スーパーバイナリーベクターなどいず れのベクターシステムに対しても用いることができ、 本発明による効果を得るこ とができる。 これらのベクター類を改変した異なるベクターシステムを用いた場 合においても同様である （例えば、 ァグロパクテリゥム属細菌の vie領域の一部 または全部を切り出し付加的にプラスミド中に組み込む、 vir領域の一部または 全部を切り出し新たなプラスミドの一部としてァグロパクテリゥムに導入するな ど） 。 また、 当然ではあるが本発明の方法によれば、 野生型のァグロバクテリウ ム属細菌においても、 植物へ野生型の T-DNA領域の導入効率を高め、 事実上感染 効率を向上することができる。
植物に導入しょうとする所望の遺伝子は、 上記プラスミドの T - DNA領域中の制 限酵素部位に常法により組み込むことができ、 当該プラスミドに同時に若しくは 別途組込んだカナマイシン、 パロモマイシン等の薬剤に対する耐性を有する遺伝 子等の適当な選択マーカーに基づいて選択することができる。 大型で多数の制限 部位を持つものは、 通常のサブクローニングの手法では所望の DNAを T- DNA領域 内に導入することが必ずしも容易でないことがある。 このような場合には、 三系 交雑法により、 ァグロパクテリゥム属細菌の細胞内での相同組換えを利用するこ とで目的の DNAを導入することができる。
また、 プラスミドを Agrobacter ium tumefaciens等のァグロバクテリウム属細 菌に導入する操作は従来法により行うことができ、 例としては、 上記した三系交 雑法やエレクトロポレーシヨン法、 エレクトロインジェクション法、 PEGなどの 化学的な処理による方法などが含まれる。
植物に導入しようとする遺伝子は、 従来の技術と同様に基本的には T-DNAの左 右境界配列の間に配置されるものである。 しかし、 プラスミドが環状であるため、 境界配列の数は 1つでもよく、 複数の遺伝子を異なる部位に配置しょうとする場 合には、 境界配列が 3個以上あってもよい。 また、 ァグロパクテリゥム属細菌中 で、 Ήまたは Riプラスミド上に配置されてもよく、 または他のプラスミド上に 配置されてもよい。 さらには、 複数の種類のプラスミド上に配置されてもよい。 ァグロパクテリゥム属細菌を介して遺伝子導入を行う方法は、 植物細胞又は植 物組織をァグロパクテリゥ厶属細菌と単に接触させることにより行うことができ る。 例えば、 1 06 ~1 011細胞 Zm I程度の細胞濃度のァグロパクテリゥム属 細菌懸濁液を調製し、 この懸濁液中に植物細胞又は植物組織を 3〜1 0分間程度 浸漬後、 固体培地上で数日間共存培養することにより行うことができる。
遺伝子導入に供される細胞又は組織は、 何ら限定されるものではなく、 葉、 根、 茎、 実、 その他いずれの部位であってもよいし、 カルスのような脱分化したもの でも脱分化していない胚等であってもよい。 また、 植物の種類も何ら限定されな いが、 被子植物が好ましく、 被子植物ならば双子葉植物でも単子葉植物でもよい。 下記実施例において具体的に示されるように、 本発明の方法によれば、 従来の ァグロパクテリゥム法に比較して、 遺伝子導入の効率が有意に向上する。
実施例 以下、 本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。 もっとも、 本発明は下 記実施例に限定されるものではない。
実施例 1
(1) ァグロバクテリウムの菌系およびプラスミド
ァグロパクテリゥムおよびそのベクターには、 LBA4404 (pBI121) (pBM21は 米国クローンテック社より市販、 (Jefferson RA 1987 (参考文献（19)))、 LBA4404
(plG121Hm) (Hiei, Y. et al. , 1994 (参考文献（11))、 LBA4404 (pT0K233) (Hiei et al. , 1994 (参考文献（11)) )および LBA4404(pSB133) (図 2) を用いた。 なお、 pSB133の構築は、 以下のように行った。 pGA482(An G et al. , 1985(参 考文献 (3)))を制限酵素 Sal Iで消化して得た 6.2 kbの DN A断片を、 pSB11 (Ko mari et al. , 1996 (参考文献（25) )を Sa 11で消化して得られる 5· 1 kbpの DNA 断片と結合してプラスミドを作製した。 次いで、 このプラスミドを制限酵素 Eco Rし Bgl IIで消化して 8.6 kbの DNA断片を得た。 この DNA断片を平滑化処 理し、 Bgl l l リンカ一 (TaKaRa社製）を挿入してプラスミド PSB27を得た。 この p SB27を制限酵素 Hindi IIで消化し、 plG221 (Ohta S et al. , 1990 (参考文献（32) )を Hind IIIで消化することで得られる 3.1 kbの 35Sプロモーター及びイント 口ン介在 GUS遺伝子を含む断片を挿入して pSB33を得た。 pSB33を大腸菌 LE392 株に導入した後、 Tri parental mat i ng法（D i tta G et aに， 1980 (参考文献（8) ) により、 pSB1 (Komar i et al. , 1996 (参考文献（25) ))を有するァグロバクテリウ ム LBA4404株に導入した。 pSB133はァグロバクテリゥム内で pSB1 と pSB33の間 の相同組換えにより得られた。 PBI121の T- DNA領域には、 ノパリン合成酵素遺 伝子 （nos) のプロモーターにより制御されるカナマイシン耐性遺伝子 （nptl l) 、 カリフラワーモザイクウィルス （GaMV) の 35Sプロモータ一により制御される G US遺伝子を有する。 plG121Hm及び pT0K233の T- DNA領域には、 nosプロモータ 一により制御される nptll遺伝子、 35Sプロモーターにより制御される hpt遺伝 子、 35Sプロモーターにヒマのカタラーゼ遺伝子のイントロンが介在する GUS遺 伝子を有する。 また、 PSB133の T- DNA領域には、 nosプロモーターにより制御さ れる nptll遺伝子、 GaMVの 35Sプロモーターに制御されヒマのカタラーゼ遺伝 子のイントロンが介在する GUS遺伝子を有する（図 2)。 なお、 PSB133及び pT0K2 33は形質転換能力が高いスーパーバイナリーベクタ一（Komar i， T. et a). , 199 9(参考文献 (26)))である。
(2) 供試品種および組織
供試品種として、 日本稲品種のコシヒカリおよび月の光を用いた。 開花後 8〜 14日目の未熟種子の穎を除去し、 70%エタノールで数秒、 ツイーン 20を含む 1 %次亜塩素酸ナ卜リゥム水溶液で 15分間滅菌処理を行った。 滅菌水で数回洗浄 後、 長さ 1.5〜2ιτητιの未熟胚を摘出し供試組織とした。 (3) 遠心処理
ィネ未熟胚を滅菌水入りのチューブの中に入れ、微量高速遠心機、大型高速遠心 機もしくは超高速遠心機を用いて、 760G〜150, 000Gの遠心処理を行った。遠心処 理終了後、 未熟胚にァグロバク亍リウムを接種した。
(4) 接種および共存培養
未熟胚への接種および共存培養の方法は、 Hiei et al. (1994) (参考文献（11 )) によった。 すなわち、 遠心処理後、 チューブ内部の滅菌水を除き、 ァグロバ クテリゥムの懸濁液を加え、 5〜30秒間ポルテックスミキサ一によリ攪拌した。 バクテリア懸濁液の調製は、 A B培地 （Chi lton, -D et aに， 1974(参考 文献（6))) 上で 3〜 1 0日間培養したァグロパクテリゥ厶のコロニーを 白金耳でかきとり、 修正 A A培地 （AA主要無機塩類、 A Aアミノ酸及 び A Aビタミン類 （Toriyama K. et a I . , 1985 (参考文献（36) )、 M S微 量塩類 （Murashige, T et al. , 1962 (参考文献（30) )、 1.0 g/l カザミ ノ酸、 100 μ Μァセ トシリンゴン、 0.2 Μ ショ糖、 0.2 Μ グルコース） に懸濁することにより行った。 約 5分間室温で静置した後、 共存培養用の堉 地に置床した。 共存培養用の培地としては、 2Ν6 - AS培地 (Hiei et al. 1994(参 考文献 (11)))の無機塩類を R2培地 (Ohira et al. 1973 (参考文献 (31)))の組成に 変更して用いた。 ただし、 主要無機塩類 (KN03I KH2P04， GaCI22H20, MgS047H20) については 1/2の濃度で培地に添加した。 なお、 接種菌密度は 1 X108 〜1 X109 cfu/ml に調整した。 共存培養は 3〜13日間行い、 一部の未熟胚について X- Glu cを処理することによる GUS発現を調査した （Hiei et a1.1994) (参考文献 (11 )) 。 すなわち、 共存培養処理直後、 組織を 0.1% Triton X- 100 を含む 0. 1 M リン酸緩衝液（PH6.8) に浸潰し、 3 7 °Cで 1 時間静置した。 リン酸 緩衝液でァグロパクテリゥムを除去した後、 1.0 mM 5—ブロモ一 4— クロ口一 3—インドリル一^一 D—グルクロン酸（X - glue)および 20% メ タノ一ルを含むリン酸緩衝液を添加した。 3 7°Cで 2 4時間処理した後、 青色の呈色を示す組織を顕微鏡下で観察した。
(5) 形質転換細胞の選抜 共存培養後、 未熟胚およびカルスを 250mg/l カルペニシリンおよび 250mg/l セフォタキシ厶を含み、 200mg/lパロモマイシンまたは 10〜30mg/lハイグロマ イシンを含む 1次選抜培地に移植し、 30°C明条件下で 1〜2週間培養した。 1次 選抜培地には、 Hiei et al. (1994) (参考文献（11)) による 2N6K培地に 30g/l の D -ソルビトールを添加した培地を用いた （K培地） 。 また、 Hiei et al. (199 4) (参考文献 (11))による 2N6培地 （N6 の無機塩およびビタミン類 （Ghu C.
C. 1978 (参考文献（7))) 、 1 g/l カザミノ酸、 2 mg/l 2， 4— D) の (NH4) 2S04を 232 mg/l とし AA培地 (Tor i yama et al. , 1985 (参考文献 (36) ) )の アミノ酸類を添加した培地についても試験に供した （N培地） 。
1次選抜培地上に形成されたカルスを、 250mg/lセフオタキシ厶および 250mg/ I カルペニシリンを含み、 200mg/lパロモマイシンもしくは 80mg/lハイグロマ イシンを含む 2次選抜培地上に移植し、 30°C明条件下で 1〜2週間の培養を行つ た。 2次選抜培地には、 Hiei et al. (1994) (参考文献 (11)) による N6- 7培地 の（NH4) 2S04を 232 mg/l とし AA培地（Tor i yama et al., 1985 (参考文献（36) ) ) のアミノ酸類を添加した培地を使用した。 なお、'パロモマイシンを合有する上記 の 1次および 2次選抜培地には、 培地固化剤に 8g/lァガロースを使用した。 耐 性カルスの出現率は、 2次選抜後に調査した。
(6) 形質転換体の再分化
未熟胚の胚盤部位から得られた選抜薬剤耐性のカルスを、 250mg/lカルべニシ リンおよび 250mg/lセフォタキシムを含み、 100mg/lパロモマイシンまたは 50mg / 、ィグロマイシンを含む再分化培地 N6S3培地 (Hiei et al. 1994 (参考文献（ 11)) ) 上に置床した。
(7) 再分化個体における GUS発現の調査
25°C明条件下で 4〜5週間の再分化培養を行なって得られた各薬剤耐性の再分 化植物の葉片を、 上記のように X- Glueを処理することにより、 GUS発現を調査 した （Hiei et a1.1994 (参考文献（11)) ) 。 再分化個体は 500倍の Hyponex水 溶液中に移植し、 25°C明条件下で約 2週間育苗した後、 温室内のポットへ移植し た。 (8) 結果
( ί )遠心処理効果の検討
微量高速遠心機、大型高速遠心機および超高速遠心機を用いてィネの未熟胚へ の遠心処理効果を調べた結果、 10KGから 100KGの範囲の処理で遺伝子の導入効率 が高まった（表 1， 2， 3， 6)。処理時間については 10分間の処理で明らかな効果 が認められた（表 4, 5)。また、 コシヒカリと月の光の品種間での GUSの一過性発 現頻度に違いは認められなかった。 なお、 遠心処理は遺伝子導入効率の向上だけ でなくカルス誘導を促進する効果が認められたことから、 ほかの植物種を含めて、 培養におけるカルスの誘導および増殖に有用であることが示唆された。
表 6の結果から超高速遠心機を用いた 250KGの 60分処理では、 月の光未熟胚 からの力ルス誘導が全く認められなかった。 しかし、 1 10KGの 60分処理ではカル ス誘導が確認され、 GUS発現も高率で認められた。 同様にコシヒカリについても 超高速遠心機を用いた 250 KG ' 60分処理では、 未熟胚からのカルス誘導が認めら れなかった。 以上の結果から、イネ未熟胚における遠心処理の効果の範囲は 5KG 〜200KGと考えられ、処理方法の簡便性を考慮すると微量高速遠心機および大型 高速遠心機を使用する場合には、 20KG, 40KG処理が適当と考えられる。さらに表 9, 10, 1 1の結果から、 形質転換能力が高いとされるスーパーバイナリーベクター を有する LBA4404 (pSB133)のみならず、通常のバイナリーベクターである LBA4404 (p i G121 Hm)でも、 20KG .60分の遠心処理によリ未熟胚を用いた形質転換が可能で あることが明らかとなった。
( i i ) 遠心処理と共存培養期間の検討
表 - 7， 8の結果から共存培養期間が 3日より 6, 13日がトランジェントアツセ ィで高い GUS発現効率を示した。共存培養期間が 9曰についても別の実験で高い GUS発現が認められた。現在、共存培養期間が異なる各種未熟胚を一次選抜培地上 (10ppmハイグロマイシン， 200ppmパロモマイシン）で培養しているが、 9， 13日共 存の区では、 3， 6日の共存区と比較して薬剤耐性カルスの出現率が低い傾向にあ る。
( i i i ) 遠心処理による形質転換効率の調査 現在、上記によリ作出した GUS陽性の形質転換体 (表 4, 5)をそれぞれ順化し、栽 培を継続している。一部分の系統については、採種を終了し稔性調査を行った。そ の結果、遠心処理した形質転換体は無処理の形質転換体（コシヒカリ、月の光）と比 較し、形態および稔性に差は認められなかった。
Hiei et al. (1994 (参考文献（11)) ) は、 イネのカルスを材料として比較的 高い効率で形質転換が行うことができることを報告している。 また、 Aldemita R R et al. 1996(参考文献(1))は、 イネの未熟胚を用いた形質転換例を報告してい る。 これらの形質転換手法をより効率よく安定して実施するために、 上述した遠 心処理法は非常に有効である。 特に、 未熟胚は栽培環境に左右されやすく形質転 換に好適な未熟胚材料を常時得ることは容易ではないが、 遠心処理を施すことに より安定した高い形質転換効率を維持することが可能である。 Hiei et al. (199 4 (参考文献 (11)) ) は、 形質転換能力の高いベクターであるスーパ一バイナリ —ベクターがイネの形質転換効率を向上させることを示した。 また、 Aldemita e t al. , 1996 (参考文献（1))によれば、 スーパーバイナリーベクターの LBA4404(p T0K233)を用いた試験においてのみ、 形質転換体を得ている。 本研究における遠 心処理法は、 通常のバイナリーベクターを用いた場合においても、 スーパーバイ ナリ一べクターに匹敵するか、 それ以上の遺伝子導入効率を得ることができる。 また、 スーパーバイナリーベクターと遠心処理法を併用することにより、 よリー 層効率を向上させることが可能である。 さらに、 遠心処理法を用いることにより、 これまで全く形質転換体を得ることができなかった品種においても形質転換体を 得ることができるものと推察される。
表 1 各種遠心処理と共存培養後の GUS発現結果 （供試菌系： LBA4404/PSB133)
Figure imgf000015_0001
遠心処理時間： 10分、 共存培養期間： 3〜5日、 GUS陽性未熟胚数 /供試未熟胚数 ( ；)内は胚盤における GUS発現領域の面積 -：なし，+:小， ++:中， +++:大 表 2 コシヒカリ未熟胚からのパロモマイシン耐性カルスの出現率 （供試菌系
： LBA4404/pSB133)
Figure imgf000016_0001
耐性カルスの出現した未熟胚数ノ供試未熟胚数、 2次選抜終了時調査 遠心処理時間： 10分、 共存培養期間： 3〜5日
表 3 月の光未熟胚からのパロモマイシン耐性カルスの出現率（供試菌系： LBA44 04/pSB133)
Figure imgf000016_0002
耐性カルスの出現した未熟胚数 供試未熟胚数、 2次選抜終了時調査
遠心処理時間： 10分、 共存培養期間： 3〜5日
表 4 遠心処理時間と共存培養後の GUS発現結果 （品種：コシヒカリ）
Figure imgf000016_0003
遠心加速度： 20， 000G、 供試品種：コシヒカリ GUS陽性未熟胚数ノ供試未熟胚 胚盤領域における GUS発現領域の面積 +··小， ++ :中， +++:大 表 5 遠心処理時間とパロモマイシン耐性カルスの出現率 （品種：コシヒカリ）
Figure imgf000017_0001
遠心加速度： 20，000G、 共存培養期間： 3〜5日、 2次選抜終了時調査
耐性カルスの出現した未熟胚数 Z供試未熟胚数
表 6遠心処理強度と共存培養後の GUS発現 (品種：月の光）
Figure imgf000017_0002
供試菌系： LBA4404/plG121Hm、 遠心処理時間： 60分
1) 微量高速遠心機 2)大型高速遠心機 3)超高速遠心機
胚盤部に占める GUS発現領域の割合 -:なし， ±:<1/8， +:1/8-1/4, ++:>1/4 遠心処理および共存培養期間と共存培養後の GUS発現（品種：月の光）
Figure imgf000018_0001
供試菌系： LBA4404/PIG121Hm 、 1)微量高速遠心機 2)大型高速遠心機 それぞれの回転数に対し、 60分間の遠心処理
胚盤部に占める GUS発現領域の割合 -：なし，土： <1/8, +:1/8-1/4, ++:>1/4 表 8 遠心処理および共存培養期間と共存培養後の GUS発現 (品種：コシヒカリ）
Figure imgf000018_0002
供試菌系： LBA4404/plG121Hm 、 1)微量高速遠心機 2)大型高速遠心機 それぞれの回転数に対し、 60分間の遠心処理
胚盤部に占める GUS発現領域の割合 -：なし， ±:<1/8, +:1/8-1/4， ++:>1/4 表 9 LBA4404 (pB 1121 )による形質転換結果 （品種：月の光）
Figure imgf000018_0003
遠心処理： 20KG · 60分 共存培養 5日間 表 10 LBA4404(plG12lHm)による形質転換結果 （品種：月の光）
Figure imgf000019_0001
遠心処理： 20KG - 60分 共存培養 5日間
表 11 LBA4404 (pB 1121 )による形質転換結果 （品種： コシヒカリ）
Figure imgf000019_0002
遠心処理： 20KG - 60分 共存培養 5日間
表 12 LBA4404(pSB133)による形質転換結果 （品種： コシヒカリ）
Figure imgf000019_0003
遠心処理： 20KG ' 60分 共存培養 3日間
実施例 2
大きさ約 1.2 mmのトウモロコシ未熟胚 （品種 A188、 農林水産省生物資源研究 所より入手） を無菌的に取り出し、 LS-inf液体培地で一回洗浄した。 遠心管に 未熟胚と 100 Mのァセトシリンゴンを含む LS-inf培地 2.0 ml に約 1 x 109 c fu/mlの濃度で、 Agrobacter i urn tumefac i ens LBA4404 (pSB131) (Ishida et al. 1996 (参考文献（18))) を懸濁した液を加え、 40，000G, 4°Cで 30分間遠心処理し た。 対照の未熟胚は、 前記と同様の細菌懸濁液中で 30分間、 室温で静置した。 処理後、 緩やかに攪拌した後、 胚軸面が培地に接するように LS-AS培地に置床し た。 また、 遠心処理後の未熟胚への接種は、 以下の通り行った。 無菌的に取り出 した未熟胚を LS-inf液体培地で一回洗浄した後、 同液体培地を含む遠心管に移 し、 20 KGまたは 40 KGで 4°C、 1時間の遠心処理を行った。 対照は液体培地中 で 1時間、 室温で静置した。 処理後、 液体培地を除き、 約 1 X 109 cfu/mlの濃 度で LBA4404(pSB131)を懸濁した液を加え、 緩やかに攪拌した。 5分間室温で静 置した後、 胚軸面が培地に接するように 10 M AgN03を含む LS- AS培地に置床 した。 25°C、 暗黒下で 3日間共存培養した後、 一部の未熟胚を採取し、 実施例 1 と同様に X-glucにより GUS遺伝子のトランジェントな発現を調査した。 なお、 上記の培地および培養法は、 Ishida, Y.et al. 1996 (参考文献（18))に記載の方 法に従った。
LBA4404 (pSB131 )を接種した A188未熟胚での GUS遺伝子のトランジ: cントな発 現を表 1 3に示す。 いずれの未熟胚も GUS遺伝子の発現を示したが、 対照の未熟 胚に比べ、 遠心処理を行った未熟胚では、 より広い範囲での発現を示すものが多 く確認された。 遠心処理による遺伝子導入部位の増大は、 ァグロパクテリゥム菌 とともに遠心処理を行った場合、 遠心処理後ァグロバクテリゥム菌を接種した場 合の両方で認められた。 また、 遠心強度及び処理時間を変えた場合でも対照に比 ベよリ広い範囲での GUS遺伝子の発現が認められた。
以上の結果から、 遠心処理した未熟胚を選抜培地で培養すれば、 対照に比べよ リ高い効率で、 形質転換植物の得られる可能性が示された。 また、 従来のァグロ バクテリゥム法では形質転換できなかった A188以外のトウモロコシ品種 (Ishid a et al. 1996 (参考文献 (18)) ) についても遠心処理することにより形質転換植 物の得られる可能性が示唆された。
表 1 3 A188未熟胚での GUS遺伝子の卜ランジェン卜な発現
Figure imgf000020_0001
対照は 1 Gでの処理。
試験 1はァグロパクテリゥム菌共存下で遠心処理を行った。 試験 2は遠心処理後、 ァグロパクテリゥ厶菌の接種を行った。
参考文献
(1) Aldemita RR, Hodges TK (1996) Agrobacter ί um tumefaci ens-mediated tra nsformation of japonica and indica r ice varieties. Planta 199: 612-617
(2) An, G. , Evert, P. R. , Mitra, A. and Ha, S. B. (1988) Binary vectors. I n Gel in, S. B. and Schi Iperoort, R. A. (eds. ) , Plant Molecular Biology Ma nual A3. Kluwer Academic Press, Dordrecht, pp. 1-19.
(3) An, 6. , Watson, BD. , Stachel, S. , Gordon, MP. & Nester, EW. , (1985) New cloning vehicles for transformation of higher plants. EMBO J. , 4:277 -288.
(4) Bevan, M. (1984) Binary Agrobacter ium vectors for plant transformat i on. Nucleic Acids Res. , 12, 8711-8721.
(5) Bidney, D. , Scelonge, C. , Mart ich, J. , Burrus, M. , Sims, し.， and Huf fmanm G. (1992) Microproject i le bombardment of plant t issues increases t ransformat ion frequency by Agrobacter ium tumefaciens. Plant Moに Bioに， 18， 301-313.
(6) Chi I ton, M-D. , Currier, TC. Farrand, SK. Bend ich, AJ. Gordon, MP. & Nester EW. (1974) Agrobacter i um tumefaciens DNA and PS8 bacteriophage DN A not detected in crown gal I turners . Proc. Natl. Acad. Sci . USA, 71 :3b/ 2-3676
(7) Chu, G. C. , (1978) Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press P ek i ng, pp.43 - 50
(8) Ditta, 6. , Stanf ield, S. , Corbin, D. and He I inski, D. R. (1980) Broad host range DNA cloning system for Gram-negative bacteria: Construction of gene bank of Rh i zob i um me I i I ot i . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 7347 -7351.
(9) Fraley, R. T. , Rogers, S. G. , Horsch, R. B. , Eicholtz, D. A. and Fl ick, J. S. (1985) The SEV system: a new disarmed Ti pi asm id vector for plant t ransformat ion. Bio/technology, 3, 629-635.
(10) Fraley, R. T. , Rogers, S. G. , Horsch, R. B. , Sanders, P. ， Fl ick, 丄 S. , Adams, S. P. , Bittner, . L. , Brand, LA. , Fink, G. L , Fry, J. S. , Gallup pi, G. R. , Goldberg, S. B. , Hoffmann, N.し. and Woo, S. C. (1983) Expression of bacterial genes in plant eel Is. Proc Natl Acad Sci USA, 80， 4803-480 7. (11) Hiei, Y. , Ohta, S. , Komar i, T. and Kumash iro, T. (1994) Efficient t ransformat ion of rice (Oryza sat iva L. ) mediated by Agrobacter ium and se quence analysis of the boundaries of the T-DNA. The Plant Journal , 6, 27 1-282.
(12) Hoekema, A. , Hi rsch, P. R. , Hooykaas, P. J. J. and Schi Iperoort, R. A.
(1983) A binary plant vector strategy based on separation of vi r- and T- region of the Agrobacter i um tumefaciens Ti -pi asm id. Nature, 303, 179 - 180.
(13) Hood, E. E. , Fraley, R. T. and Chi I ton, M. -D. (1987) Virulence of Agr obacter ium tumefaciens strain A281 on legumes. Plant Phys i o 1 , 83, 529-53 4.
(14) Hood, E.E. , Gelvin, S. B. , Melchers, L. S. and Hoekema, A. (1993) New Agrobacter ium helper pi asm ids for gene transfer to plants. Transgenic es. , 2， 208—218.
(15) Hood, E. E. , Helmer, G. L. , Fraley, R. T, and Chi I ton, M. -D. (1986) Th e hypervi rulence of Agrobacter i um tumefaciens A281 is encoded in a regio n of pT i Bo542 outside of T-DNA. J. Bacter iol. , 168, 1291-1301.
(16) Hood, E. E. , Jen, G. , Kayes, し.， Kramer, J. , Fraley, R. T. and Ch i I to n, M. -D. (1984) Restriction endonuclease map of p「iBo542, a potential ι ι -pi asm id vector for genetic engineer ing of lants. Bio/technology, 2, 70 2-709.
(17) Horsch, R. B. , Fry, J. E. , Hoffmann, N. L.， Eichholtz, D.， Rpgers, S. G. and Fraley, R. T. (1985) A simple and general method for transferr i ng genes into plants. Science 227, 1229-1231.
(18) Ishida, Y. , Saito, H. , Ohta, S. , Hiei, Y. , Komar i, T. and Kumash iro, T. (1996) High efficiency transformation of maize (Zea mays L. ) mediate d by Agrobacter i um tumefaciens. Nature B i otechno 1 , 14, 745 - 750.
(19) Jefferson, R. A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: the GUS g ene fusion system. Plant Mo I. Biol. Rep. , 5, 387-405. (20) Jin, S.， Komari, T.， Gordon, M. P. and Nester, E. W. (1987) Genes res ponsible for the supervi rulence phenotype of Agrobacter ium tumefaciens A 281. J. BacterioL, 169， 4417-4425.
(21) Komari, T. (1989) Transformation of cal lus cultures of nine plant s pecies mediated by Agrobacter ium. Plant Sci. , 60, 223-229.
(22) Komari, T. (1990a) Genetic characterization of double-flowered toba cco plant obtained in a transformation experiment. Theor. Appl. Genet. , 80， 167-171.
(23) Komari， T. (1990b) Transformation of cultured eel Is of Chenopod i um quinoa by binary vectors that carry a fragment of DNA from the i rulence region of pTiBo542. Plant Cel l Reports, 9, 303—306.
(24) Komari, T. , Ha I per in, W. and Nester, E. W. (1986) Physical and f unct ional map of supervi rulent Agrobacter i um tumefaciens tumor- inducing pi as mid pTiBo542. J. BacterioL, 166, 88— 94.
(25) Komari, Τ·， Hiei, Y-， Saito, Y.， Murai, N. and Kumashiro, T. (1996) Vectors carrying two separate T一 DNAs for co— transformation of higher pi ants mediated by Agrobacter ium tumefaciens and segregation of transforma nts free from selection markers. Plant J, 10, 165-174.
(26) Komari, T. and Kubo, T. (1999) Methods of Genetic Transformation: A grobacter ium tumefaciens. In Vas i I , I.K. (ed. ) Molecular improvement of cereal crops. luwer Academic Publishers, Dordrecht, pp. 43-82.
(27) Li, H.— Q.， Sautter, G.， Potrykus, に and Puonti-Kaer las, J. (1996) Genetic transformation of cassava (Man i hot esculenta Crantz) . Nature Bio technoに， 14， 736—740.
(28) し indsey， ， Gallois， P. and Eady, C. (1991) Regeneration and trans format ion of sugarbeet by Agrobacter ium tumefaciens. Plant Tissue Cultur e Manual B7:1— 13. Kluwer Academic Publishers.
(29) McCormick, S. (1991) Transformation of tomato with Agrobacter ium tu mefaciens. Plant Tissue Culture Manual B6:1 - 9. Kluwer Academic Publ isher s.
(30) Murashige, T. and Skoog, F. (1962) Physiol. Plant 15:473-497.
(31) Ohira, K. , Oj ima, K. , Fuj iwara, A. (1973) Studies on the nutrition of rice cell culture に A simple, defined medium for rapid growth in sus pension culture. Plant Cell Physol. , 14:1113 - 1121.
(32) Ohta, S. , Mita, S. , Hattor i , T.， Namamura, K. (1990) Construction and express ion in tobacco of a ^-glucuronidase (GUS) reporter gene conta ining an intron within the coding sequence. Plant Ce ι I Physiol. 31: 805 - 813.
(33) Potrykus, に， Bi lang, R. , Futterer, J. , Sautter, C. and Schrott, M. (1998) Agricultural Biotecnology, NY:Mercel Dekker Inc. pp. 119一 159.
(34) Rogers, S. G. , Horsch, R. B. and Fraley, R. T. (1988) Gene transfer i n plants: Product ion of transformed lants using Ti pi asm id vectors. Met hod for Plant Molecular Biology, CA: Academic Press Inc. pp.423-436.
(35) Saito, Y. , Komar i , T. , Masuta, C. , Hayashi , Y. , Kumashi ro, T. and T akanami , Y. (1992) Cucumber mosaic vi rus— tolerant transgenic tomato plan ts expressing a satellite RNA. Theor. App I . Genet. , 83, 679-683.
(36) Tor iyama, K. and Hinata, K. (1985) Plant Sci. 41:179—183
(37) Trick, H.N. and Finer, J. J. (1997) SAAT: son i cat ion-assisted Agroba cter ium - mediated transformation. Transgenic Research 6 :329 - 336.
(38) Visser, .6. F. (1991) Regeneration and transformation of potato by Agrobacter ium tumefaciens. Plant Tissue Culture Manual B5: 1-9. Kluwer Ac adem i c Pub I ishers.
(39) Watson, B.， Currier, T. C. , Gordon, M. P. , Chi I ton, M. -D. and Nester, E. W. (1975) PI asm id required for virulence of Agrobacter i um tumefaciens. J Bacteriol, 123, 255—264.
(40) Zambryski , P. , Joos, H. , Genete I I o, C. , Leemans, J. , Van Montagu, M. and Sche 11 , J. (1983) Ti pi asm id vector for the introduction of DNA int o plant eel Is without alteration of their normal regeneration capacity. EMBO J, 2, 2143 - 2150.

Claims

請求の範囲
1. 植物細胞又は植物組織を遠心処理することを伴う、 ァグロパクテリゥム属 細菌を介して行われる植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法。
2. 植物細胞又は植物組織を遠心処理した後、 遺伝子導入処理を行う請求項 1 記載の方法。
3. 遠心処理が 1 0 OG〜 25万 Gの遠心加速度の範囲で行われる請求項 1又 は 2記載の方法。
4. 遠心処理が 50 OG〜 20万 Gの遠心加速度の範囲で行われる請求項 3記 載の方法。
5. 遠心処理が 1 000 G~ 1 5万 Gの遠心加速度の範囲で行われる請求項 4 記載の方法。
6. 遠心処理が 1秒間〜 4時間の範囲で行われる請求項 1ないし 5のいずれか 1項に記載の方法。
7. 遠心処理が 5分間〜 2時間の範囲で行われる請求項 6記載の方法。
8. 請求項 1ないし 7記載の方法を用いることを特徴とする植物の作出方法。
9. 請求項 1ないし 8記載の方法により作出される植物細胞、 植物組織又は植 物。
1 0. 用いる植物細胞又は植物組織が被子植物由来である請求項 1ないし 7の いずれか 1項に記載の方法。
1 1 . 請求項 9記載の方法を用いることを特徴とする被子植物の作出方法。
1 2. 請求項 1 0または: 1 1記載の方法により作出される被子植物細胞、 被子 植物組織又は被子植物。
1 3. 用いる植物細胞又は植物組織が単子葉植物由来である請求項 1 0記載の 方法。
1 4. 請求項 1 1記載の方法を用いることを特徴とする単子葉植物の作出方法。
1 5. 請求項 1 3または 1 4記載の方法により作出される単子葉植物細胞、 単 子葉植物組織又は単子葉植物。
1 6. 用いる植物細胞又は植物組織がイネ科植物由来である請求項 1 3記載の 方法。
1 7 . 請求項 1 3記載の方法を用いることを特徴とするイネ科植物の作出方法
1 8 . 請求項 1 6または 1 7記載の方法により作出されるイネ科植物細胞、 ィ ネ科植物組織又はィネ科植物。
1 9 . 用いる植物細胞又は植物組織がイネ又はトウモロコシである請求項 1 6 記載の方法。
2 0 . 請求項 1 9記載の方法を用いることを特徴とするイネ又はトウモロコシ の作出方法。
2 1 . 請求項 1 9または 2 0記載の方法により作出されるイネ細胞、 イネ組織、 イネ、 トウモロコシ細胞、 トウモロコシ組織又はトウモロコシ。
PCT/JP2000/005213 1999-06-04 2000-08-03 Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales WO2002012520A1 (fr)

Priority Applications (13)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP15802599A JP4424784B2 (ja) 1999-06-04 1999-06-04 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
CNB008138141A CN1268752C (zh) 2000-08-03 2000-08-03 提高植物细胞转基因效率的方法
EP00949976A EP1306440B1 (en) 2000-08-03 2000-08-03 Method of improving gene transfer efficiency into plant cells
ES00949976T ES2277592T3 (es) 2000-08-03 2000-08-03 Metodo para estimular la eficacia de introduccion de genes en celulas vegetales.
AU63179/00A AU785287B2 (en) 2000-08-03 2000-08-03 Method of improving gene transfer efficiency into plant cells
PCT/JP2000/005213 WO2002012520A1 (fr) 1999-06-04 2000-08-03 Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales
KR1020027004030A KR100807434B1 (ko) 2000-08-03 2000-08-03 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법
DE60032184T DE60032184T2 (de) 2000-08-03 2000-08-03 Verfahren zur verbesserung der gentransfer-effizienz in pflanzenzellen
CA2386125A CA2386125C (en) 2000-08-03 2000-08-03 Method of improving gene transfer efficiency into plant cells
PT00949976T PT1306440E (pt) 2000-08-03 2000-08-03 Método de melhoramento da eficiência da transferência de genes em células de plantas
DK00949976T DK1306440T3 (da) 2000-08-03 2000-08-03 Fremgangsmåde til forbedring af gentransfer-effektivitet ind i planteceller
US12/902,631 US7960611B2 (en) 2000-08-03 2010-10-12 Method for promoting efficiency of gene introduction into plant cells
US13/099,917 US9840714B2 (en) 1999-06-04 2011-05-03 Method for promoting efficiency of gene introduction into plant cells

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP15802599A JP4424784B2 (ja) 1999-06-04 1999-06-04 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
PCT/JP2000/005213 WO2002012520A1 (fr) 1999-06-04 2000-08-03 Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US10089696 A-371-Of-International 2000-08-03
US12/902,631 Continuation US7960611B2 (en) 1999-06-04 2010-10-12 Method for promoting efficiency of gene introduction into plant cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002012520A1 true WO2002012520A1 (fr) 2002-02-14

Family

ID=11736322

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2000/005213 WO2002012520A1 (fr) 1999-06-04 2000-08-03 Procede permettant d'ameliorer l'efficacite du transfert de genes dans des cellules vegetales

Country Status (11)

Country Link
US (2) US7960611B2 (ja)
EP (1) EP1306440B1 (ja)
KR (1) KR100807434B1 (ja)
CN (1) CN1268752C (ja)
AU (1) AU785287B2 (ja)
CA (1) CA2386125C (ja)
DE (1) DE60032184T2 (ja)
DK (1) DK1306440T3 (ja)
ES (1) ES2277592T3 (ja)
PT (1) PT1306440E (ja)
WO (1) WO2002012520A1 (ja)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2085477A1 (en) 2003-08-13 2009-08-05 Japan Tobacco, Inc. A method for improving plant transformation efficiency by adding copper ion
WO2009122962A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
US7812222B2 (en) 2003-08-13 2010-10-12 Japan Tobacco Inc. Method of transducing gene into plant material
WO2011013764A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法
US8058514B2 (en) 2007-02-28 2011-11-15 Japan Tobacco Inc. Agrobacterium-mediated method for producing transformed plant without selection step
US8101820B2 (en) 2007-02-28 2012-01-24 Japan Tobacco Inc. Method for increasing transformation efficiency in plants, comprising coculture step for culturing plant tissue with coculture medium containing 3,6-dichloro-o-anisic acid
WO2012015039A1 (ja) 2010-07-29 2012-02-02 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法
WO2015085990A1 (de) 2013-12-15 2015-06-18 Kws Saat Ag Selektionsmarker-freies rhizobiaceae-vermitteltes verfahren zur herstellung einer transgenen pflanze der gattung triticum

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007069301A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Japan Tobacco Inc. 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法
CN102321667B (zh) * 2011-10-11 2013-03-06 西南大学 农杆菌介导大分子量t-dna转化的毒性辅助载体及其制备方法和应用
CN103278502B (zh) * 2013-04-23 2015-12-23 北京大北农科技集团股份有限公司 启动子活性的检测方法
KR102217467B1 (ko) 2020-11-05 2021-02-19 (주)지플러스생명과학 식물기반 바이오약품 제조를 위한 식물형질전환이 이루어진 기주식물의 재배방법
KR102285637B1 (ko) 2020-11-05 2021-08-04 (주)지플러스생명과학 식물기반 바이오의약품 제조를 위한 식물 형질 전환 방법

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10179174A (ja) * 1996-11-08 1998-07-07 Hokko Chem Ind Co Ltd 植物の形質転換方法および形質転換植物の作出方法
WO2000037663A2 (en) * 1998-12-23 2000-06-29 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Plant transformation process

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0320500B1 (en) 1983-01-13 2004-11-17 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Non-oncogenic ti plasmid vector system and recombinant DNA molecules for the introduction of expressible genes into plant cell genomes
NL8300699A (nl) * 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; werkwijze voor het produceren van agrobacterium tumefaciens bacterien; stabiele cointegraat plasmiden; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8300698A (nl) * 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
NL8401048A (nl) 1984-04-03 1985-11-01 Rijksuniversiteit Leiden En Pr Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van eenzaadlobbige planten.
DE3926390A1 (de) * 1989-08-10 1991-02-14 Bayer Ag Verwendung von lysozym genen in pflanzen zur resistenzerhoehung
AU643563B2 (en) * 1990-11-01 1993-11-18 Sapporo Breweries Limited Method for preparing transformed plant
JPH04330234A (ja) 1991-03-20 1992-11-18 Japan Tobacco Inc キュウリモザイクウィルス抵抗性トマト及びその作出方法
ATE398679T1 (de) * 1992-07-07 2008-07-15 Japan Tobacco Inc Verfahren zur transformation einer monokotyledon pflanze
US5712112A (en) * 1992-11-04 1998-01-27 National Science Council Of R.O.C. Gene expression system comprising the promoter region of the alpha-amylase genes
PT672752E (pt) 1993-09-03 2004-10-29 Japan Tobacco Inc Processo de transformacao de uma monocotiledonea com a utilizacao de um escutelode um embriao imaturo
PT687730E (pt) * 1993-12-08 2007-07-02 Japan Tobacco Inc Método de transformação de plantas e vector para esse fim
EP0737748A1 (en) * 1995-03-17 1996-10-16 Hoechst NOR-AM AgrEvo Inc. Efficient production of transgenic fertile homozygous plants from fresh microspores
JPH10117776A (ja) * 1996-10-22 1998-05-12 Japan Tobacco Inc インディカイネの形質転換方法
US5981840A (en) * 1997-01-24 1999-11-09 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Methods for agrobacterium-mediated transformation
CA2265570A1 (en) 1997-07-23 1999-02-04 Japan Tobacco Inc. Method for selecting transformed cells
EP1112347A4 (en) * 1998-09-09 2004-09-29 Northwest Plant Breeding Co METHOD FOR THE PRODUCTION OF DOUBLE HAPLOID PLANTS
JP2000342255A (ja) 1999-06-04 2000-12-12 Japan Tobacco Inc 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
JP3141084B2 (ja) 1999-07-21 2001-03-05 農林水産省農業生物資源研究所長 単子葉植物の超迅速形質転換法
WO2001025459A1 (fr) 1999-09-30 2001-04-12 Japan Tobacco Inc. Vecteurs de transformation de plantes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10179174A (ja) * 1996-11-08 1998-07-07 Hokko Chem Ind Co Ltd 植物の形質転換方法および形質転換植物の作出方法
WO2000037663A2 (en) * 1998-12-23 2000-06-29 The Samuel Roberts Noble Foundation, Inc. Plant transformation process

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HORSCH R.B. ET AL.: "A simple and general method for transferring genes into plants", SCIENCE, vol. 227, no. 4691, 8 March 1985 (1985-03-08), pages 1229 - 1231, XP002933143 *
See also references of EP1306440A4 *
TRICK H.N. ET AL.: "SAAT: sonication-assisted agrobacterium-mediated transformation", TRANSGENIC RESEARCH, vol. 6, no. 5, September 1997 (1997-09-01), pages 329 - 336, XP002933142 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7812222B2 (en) 2003-08-13 2010-10-12 Japan Tobacco Inc. Method of transducing gene into plant material
EP2085477A1 (en) 2003-08-13 2009-08-05 Japan Tobacco, Inc. A method for improving plant transformation efficiency by adding copper ion
US7709700B2 (en) 2003-08-13 2010-05-04 Japan Tobacco Inc. Method for improving plant transformation efficiency by adding copper ion
US8101820B2 (en) 2007-02-28 2012-01-24 Japan Tobacco Inc. Method for increasing transformation efficiency in plants, comprising coculture step for culturing plant tissue with coculture medium containing 3,6-dichloro-o-anisic acid
US8058514B2 (en) 2007-02-28 2011-11-15 Japan Tobacco Inc. Agrobacterium-mediated method for producing transformed plant without selection step
WO2009122962A1 (ja) 2008-03-31 2009-10-08 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
US8357836B2 (en) 2008-03-31 2013-01-22 Japan Tobacco Inc. Agrobacterium-mediated method for producing transformed maize or rice
WO2011013764A1 (ja) 2009-07-29 2011-02-03 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、コムギ属の植物へ遺伝子導入を行う方法、コムギ属の植物の形質転換植物の作成方法
US8884101B2 (en) 2009-07-29 2014-11-11 Japan Tobacco Inc. Method of gene introduction into Triticum plant using Agrobacterium, and a method of producing transformed Triticum plant
WO2012015039A1 (ja) 2010-07-29 2012-02-02 日本たばこ産業株式会社 アグロバクテリウム菌を用いた、オオムギ属植物へ遺伝子導入を行う方法およびオオムギ属植物の形質転換植物の作成方法
US9284567B2 (en) 2010-07-29 2016-03-15 Japan Tobacco Inc. Method for gene introduction into hordeum plant using agrobacterium, and method for production of transformed plant of hordeum plant
WO2015085990A1 (de) 2013-12-15 2015-06-18 Kws Saat Ag Selektionsmarker-freies rhizobiaceae-vermitteltes verfahren zur herstellung einer transgenen pflanze der gattung triticum
DE102013020605A1 (de) 2013-12-15 2015-06-18 Kws Saat Ag Selektionsmarker-freies rhizobiaceae-vermitteltes verfahren zur herstellung einer transgenen pflanze der gattung triticum

Also Published As

Publication number Publication date
EP1306440A1 (en) 2003-05-02
ES2277592T3 (es) 2007-07-16
US7960611B2 (en) 2011-06-14
CN1268752C (zh) 2006-08-09
US20110030100A1 (en) 2011-02-03
AU785287B2 (en) 2006-12-21
AU6317900A (en) 2002-02-18
CN1377420A (zh) 2002-10-30
DE60032184T2 (de) 2007-10-31
CA2386125A1 (en) 2002-02-14
DE60032184D1 (de) 2007-01-11
EP1306440A4 (en) 2004-07-14
DK1306440T3 (da) 2007-04-02
KR100807434B1 (ko) 2008-02-25
PT1306440E (pt) 2007-02-28
KR20020092915A (ko) 2002-12-12
US9840714B2 (en) 2017-12-12
CA2386125C (en) 2010-07-13
EP1306440B1 (en) 2006-11-29
US20110209251A1 (en) 2011-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3329819B2 (ja) 未熟胚の胚盤を用いた単子葉植物の形質転換方法
Schrammeijer et al. Meristem transformation of sunflower via Agrobacterium
US7960611B2 (en) Method for promoting efficiency of gene introduction into plant cells
Barampuram et al. Recent advances in plant transformation
Mayavan et al. Agrobacterium-mediated in planta genetic transformation of sugarcane setts
WO1994000977A1 (en) Method of transforming monocotyledon
WO2007069301A1 (ja) 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法
WO2009122962A1 (ja) アグロバクテリウム菌による形質転換植物の作成方法
AU2008221585B2 (en) Method of elevating transformation efficiency in plant by adding copper ion
JP2002541853A (ja) 植物の形質転換方法
Solleti et al. Additional virulence genes in conjunction with efficient selection scheme, and compatible culture regime enhance recovery of stable transgenic plants in cowpea via Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation
JP4532413B2 (ja) 植物材料への遺伝子導入を行う方法
US7902426B1 (en) Method of improving gene transfer efficiency into plant cells utilizing heat and centrifugation
JP4424784B2 (ja) 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
JP2000342255A (ja) 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
JP4428757B2 (ja) 植物細胞への遺伝子導入の効率を向上させる方法
Lindsey Transgenic plant research
JP5260963B2 (ja) 粉体を用いて形質転換効率を向上させる方法
JP2649287B2 (ja) 単子葉植物の形質転換方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CR CU CZ DE DK DM DZ EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020027004030

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2386125

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 008138141

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2000949976

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 63179/00

Country of ref document: AU

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 1020027004030

Country of ref document: KR

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2000949976

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2000949976

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 63179/00

Country of ref document: AU