KR20020092915A

KR20020092915A - 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법

Info

Publication number: KR20020092915A
Application number: KR1020027004030A
Authority: KR
Inventors: 히에이유코; 카사오카케이스케; 이시다유지
Original assignee: 니뽄 다바코 산교 가부시키가이샤
Priority date: 2000-08-03
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2002-12-12
Also published as: US7960611B2; ES2277592T3; EP1306440A4; US20110209251A1; CA2386125A1; CN1377420A; WO2002012520A1; AU6317900A; PT1306440E; KR100807434B1; CN1268752C; US20110030100A1; DE60032184D1; CA2386125C; US9840714B2; AU785287B2; EP1306440A1; DK1306440T3; EP1306440B1; DE60032184T2

Abstract

종래의 아그로박테리움법에 의한 유전자도입방법보다도 높은 효율로 조직을 손상시키지 않고 간편하게 유전자도입을 행할 수 있고, 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법이 개시되어 있다. 본 발명의 방법에서는 식물세포 또는 식물조직을 원심처리하는 것을 수반하므로써, 아그로박테리움속 세균을 통하여 행해지는 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시킨다.

Description

식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법{METHOD OF IMPROVING GENE TRANSFER EFFICIENCY INTO PLANT CELLS}

아그로박테리움에 의한 형질전환법은 일반적으로 효율이 높고, 도입되는 유전자의 복제수가 적으며, T-DNA라는 특정의 영역을 단편화시키지 않고 도입할 수 있고, 단시간의 배양에 의해 형질전환체를 얻을 수 있기 때문에 배양변이가 적은 등, 많은 우수한 특징을 갖고 있다. 이 때문에, 여러가지의 식물종에서 가장 유용한 형질전환의 수법으로서 널리 사용되고 있다.

이와 같이, 아그로박테리움법은 상당히 우수한 식물의 형질전환 방법이지만, 형질전환의 성부(成否) 및 효율은 식물종, 유전자형 및 사용하는 식물조직에 의존하여 크게 다른 것이 실상이다(Potrykus 등, 1988(참고문헌(33)). 즉, 형질전환에 성공하지 못하고 있는 식물종 이외에, 극히 일부의 품종만의 형질전환이 가능한 식물종도 많다. 또한, 이용가능한 조직이 한정되어 있어 대량의 재료를 취급할 수 없는 식물종도 있다. 유전자전환에 의하여 실용적인 품종을 산출하는 데에는 다수의 형질전환식물을 산출하는 것에 더하여, 목적으로 하는 형질을 갖는 계통을 선택할필요가 있다. 그러나, 이 목적에 맞는, 다수의 형질전환체를 용이하게 얻을 수 있는 작물의 종류는 현재로서는 일부에 한정되어 있다. 따라서, 이와 같은 문제점을 해결할 수 있는 개량수법의 개발이 강하게 요망되고 있다.

아그로박테리움을 통한 형질전환방법 자체는 식물종에 따라 공시재료나 배양에 사용되는 배지의 조성 등을 다르게 하는 것과, 재료로 되는 조직에 아그로박테리움의 현탁액을 접촉시키고, 공존배양 후에 형질전환세포의 선택을 행하고, 형질전환식물을 산출하는 조작에서는 거의 공통으로 되어 있다. 재료로 되는 식물조직에 대해서는 통상, 필요에 따른 멸균처리를 행하거나 그 이외에 특별한 처리를 실시하지 않고 아그로박테리움의 감염이 행해진다(Rogers 등, 1988(참고문헌(34)), Visser 1991(참고문헌(38)), McCormick 1991(참고문헌(29)), Lindsey 등, 1991(참고문헌(28)). 따라서, 형질전환계의 개량은 아그로박테리움의 균계, 벡터구성, 배지조성, 선택마커유전자나 프로모터의 종류, 공시조직의 종류 등을 중심으로 연구가 행해지고 있었다.

이에 반해서, 아그로박테리움을 접종하기 전의 식물조직을 유전자도입이 일어나기 쉬운 생리적 상태로 변환시키는 것을 고려하는 방법에 관한 연구는 거의 행해지고 있지 않다. 어느 간편한 처리에 의해, 그와 같은 생리적 상태로 변환할 수 있으면 상당히 이용가치가 높고, 유전자도입효율의 향상에 더하여, 종래 곤란하였던 식물종이나 유전자형의 형질전환을 가능하게 하는 현저한 효과도 기대된다. 지금까지의 식물조직으로의 전처리에 관한 연구예로서는 파티클 간(Bidney 등, 1992(참고문헌(5))) 및 초음파(Trick 등, 1997(참고문헌(37)))처리를 들 수 있다. 어느것도 물리적으로 조직을 손상시키므로써 박테리아의 식물조직내로의 침입을 촉진하고, 감염대상으로 되는 식물세포를 증가시키는 것을 목적으로 하고 있다. 그러나, 이것은 종래부터 널리 행해지고 있는 리프디스크법(Horsch 등, 1985(참고문헌(17)))을 발전시킨 것에 불과하고, 신규한 연구방향에 기인한 처리법은 아니다. 또, 효과의 정도나 범용성은 명확하지 않고, 일반적인 수법으로서 사용되고 있지 않은 것이 현재의 실정이다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래의 아그로박테리움법에 의한 유전자도입방법보다도 높은 효율로, 조직을 손상시키지 않고, 간편하게 유전자도입을 행할 수 있으며, 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 예의 연구 결과, 아그로박테리움속 세균을 사용한 유전자도입방법에 있어서, 유전자도입에 제공되는 식물세포 또는 식물조직을 원심처리하므로써, 유전자도입효율을 유의하게 향상시킬 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 식물세포 또는 식물조직을 원심처리하는 것을 수반하고, 아그로박테리움속 세포를 통하여 행해지는 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법을 제공한다.

본 발명에 의해, 종래의 아그로박테리움법에 의한 유전자도입방법보다도 높은 효율로, 조직을 손상시키지 않고 간편하게 유전자도입을 행할 수 있으며, 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법이 제공되었다. 본 발명의 방법은 단자엽식물에 대해서도, 쌍자엽식물에 대해서도 적용 가능하다.

본 발명은 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 방법에 바람직하게 사용할 수 있는 슈퍼바이너리벡터의 예인 pTOK233의 구축방법을 나타내는 도면이다.

도 2는 본 발명의 방법에 바람직하게 사용할 수 있는 슈퍼바이너리벡터의 예인 pSB133의 유전자 지도를 나타내는 도면이다.

도 3은 아그로박테리움속 세균의 주요한 2종류의 벡터 시스템인 중간벡터 시스템과 바이너리벡터 시스템의 구축과정을 나타내는 모식도이다.

도 4는 아그로박테리움 튜메파시엔스의 강병원성균주 A281에 유래하는 2종류의 바이너리벡터 시스템을 나타내는 모식도이다.

또, 상기 각 도면중에서 하기의 부호는 하기의 의미를 나타낸다.

virB 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) A281에 포함되는 Ti 플라스미드 pTiBo542의 독성 영역중의 virB유전자

virC 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) A281에 포함되는 Ti 플라스미드 pTiBo542의 독성 영역중의 virC유전자

virG 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) A281에 포함되는 Ti 플라스미드 pTiBo542의 독성 영역중의 virG유전자

BL 아그로박테리움속 세균의 T-DNA의 왼쪽 경계(boarder) 서열

BR 아그로박테리움속 세균의 T-DNA의 오른쪽 경계 서열

TC 테트라사이클린 저항성유전자

SP 스펙티노마이신 저항성유전자

IG 인트론 GUS 유전자

HPT 하이그로마이신 저항성유전자

K 제한효소 KpnI 부위

H 제한효소 HindIII 부위

Ampr 암피실린 내성유전자

BAR bar유전자

Pnos 노파린합성 효소유전자의 프로모터

Tnos 노파린합성 효소유전자의 터미네이터

P35S CaMV 35S 프로모터

COS, cos 람다파지의 COS부위

ORI, ori ColE1의 복제개시점

NPT, NPTII 카나마이신 저항성유전자

Vir 아그로박테리움속 세균의 Ti 플라스미드의 전체 vir영역

S Vir 강병원성 아그로박테리움속 세균의 Ti 플라스미드 pTiBo542의 전체 vir영역

s vir* Ti 플라스미드 pTiBo542의 vir영역의 일부를 포함하는 단편

본 발명의 방법에서는 아그로박테리움속 세균을 통한 유전자도입방법에 있어서, 유전자를 도입하는 식물세포 또는 식물조직을 원심처리하는 것을 수반한다. 식물세포 또는 식물조직은 원심처리한 후, 통상의 중력하에서 아그로박테리움속 세포와 접촉시켜도 좋고, 원심처리하면서 아그로박테리움속 세포와 접촉시켜도 좋다. 식물세포 또는 식물조직을 원심처리한 후, 통상의 중력하에서 아그로박테리움속 세균과 접촉시키는 방법이 바람직하다.

원심처리조건은 사용하는 식물의 종류 등에 따라서 적당하게 선택되지만, 통상 100G∼25만G, 바람직하게는 500G∼20만G, 더욱 바람직하게는 1000G∼15만G 정도의 원심가속도 범위에서 행해진다. 또한, 원심처리의 시간은 원심가속도 및 사용하는 식물의 종류 등에 따라서 적당하게 선택되지만, 통상 1초간 이상 행하는 것이 바람직하다. 또, 원심시간의 상한은 특별히 없지만, 통상 10분간 정도로 목적을 달성할 수 있다. 또, 원심처리시간은 원심가속도가 큰 경우에는 극히 짧은 시간, 예컨대 1초 이하에서도 유전자도입효율을 유의하게 향상시킬 수 있다. 한편, 원심가속도가 작은 경우에는 원심처리를 길게 행하므로써 유전자도입효율을 유의하게 향상시킬 수 있다. 특히 바람직한 원심처리조건은 500G∼20만G, 특히 1000G∼150000G에서 1초간∼2시간 정도의 경우가 많지만, 그 식물세포 또는 식물조직에 있어서 적절한 원심처리조건은 통상의 실험에 의해 용이하게 설정할 수 있다.

본 발명의 방법은 아그로박테리움속 세균과 접촉시키는 식물세포 또는 식물조직으로서 원심처리한 것을 사용하거나, 또는 원심처리를 행하면서 아그로박테리움속 세균과 접촉시키는 것을 특징으로 한 것이고, 아그로박테리움속 세균을 사용한 유전자도입 또는 형질전환방법 자체로서는 주지의 방법을 그대로 적용할 수 있다.

아그로박테리움속 세균을 사용한 식물로의 유전자도입 또는 형질전환방법 자체는 이 분야에 있어서 주지이고, 널리 사용되고 있다.

토양세균 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)이 많은 쌍자엽식물에 근두암종병(crown gall disease)를 일으킨다는 것은 오래전부터 알려져 있고, 1970년대에는 Ti 플라스미드가 병원성에 관련되어 있으며, 더욱이 Ti 플라스미드의 일부인 T-DNA가 식물게놈에 통합된다는 것이 밝혀졌다. 그 후 이 T-DNA에는 암종의 유발에 필요한 호르몬(시토키닌과 옥신)의 합성에 관여하는 유전자가 존재하고, 세균유전자이면서 식물내에서 발현된다는 것이 명확하게 되었다. T-DNA의 절제와 식물로의 전달에는 Ti 플라스미드상의 독성(virulence) 영역(vir영역)에 존재하는 유전자군이 필요하고, 또한 T-DNA가 절제되기 위해서는 T-DNA의 양단에 존재하는 경계서열이 필요하고, 다른 아그로박테리움속 세균인 아그로박테리움 리조겐스(Agrobacterium rhizogenes)도 Ri플라스미드에 의한 동일한 시스템을 갖고 있다(도 3 및 도 4).

아그로박테리움의 감염에 의해 T-DNA가 식물게놈에 통합되므로, T-DNA상에 소망의 유전자를 삽입하면 이 유전자도 식물게놈에 통합된다는 것이 기대되었다. 그러나, Ti 플라스미드는 190kb 이상으로 거대하므로, 표준적인 유전자공학방법에서는 플라스미드상의 T-DNA상에 유전자를 삽입하는 것은 곤란하였다. 그 때문에,T-DNA상에 외래유전자를 삽입하기 위한 방법이 개발되었다.

우선, 종양성 Ti 플라스미드의 T-DNA로부터 호르몬합성 유전자가 제거된 디스암형의 균계(disarmed strains)인 LBA4404(Hoekema 등, 1983(참고문헌(12))), C58C1(pGV3850)(Zambryski 등, 1983(참고문헌(40))), GV3Ti11SE(Fraley 등, 1985(참고문헌(9))) 등이 제작되었다(도 3). 이것을 사용하므로써 소망의 유전자를 아그로박테리움의 Ti 플라스미드의 T-DNA내에, 또는 소망의 유전자를 갖는 T-DNA를 아그로박테리움에 도입하는 2종류의 방법이 개발되었다. 이중의 하나는 유전자조작이 용이하게 소망의 유전자의 삽입이 가능하고, 대장균에서 복제가 가능한 중간벡터를 아그로박테리움의 디스암형 Ti 플라스미드의 T-DNA영역중에 3계교잡법(triparental mating)(Ditta 등, 1980(참고문헌(8)))을 통하여 상동변환에 의해 도입하는 방법으로서, 중간벡터법이라 명명된다(Fraley 등, 1985(참고문헌(9)) ; Fraley 등, 1983(참고문헌(10)); Zambryski 등, 1983(참고문헌(40)), 일본국 특개소59-140885호(EP116718)). 또 하나는 바이너리벡터(binary vetcor)법이라 불리우는 것으로(도 3), 이는 T-DNA의 식물로의 통합에 vir영역이 필요하지만, 기능하기 위해서 동일한 플라스미드상에 존재할 필요는 없다는 결과(Hoekema 등, 1983)에 기초하고 있다. 이 vir영역에는 virA, virB, virC, virD, virE 및 virG가 존재하고 (식물바이오테크놀로지사전(엔터프라이즈주식회사발행(1989))), vir영역으로는 이 virA, virB, virC, virD, virE 및 virG의 전체를 포함한 것을 말한다. 따라서, 바이너리벡터는 T-DNA를 아그로박테리움과 대장균에서 복제가능한 작은 플라스미드에 통합시킨 것이고, 이것을 디스암형 Ti 플라스미드를 갖는 아그로박테리움에도입하여 사용한다. 아그로박테리움으로의 바이너리벡터의 도입에는 일렉트로포레이션법이나 3계교잡법 등의 방법에 의해 행할 수 있다. 바이너리벡터에는 pBIN19(Bevan, 1984(참고문헌(4))), pBl121(Jefferson, 1987(참고문헌(19)), pGA482(An 등, 1988(참고문헌(2)), 일본국 특개소60-70080호(EP120516)) 등이 있고, 이들을 기초로 하여 다수의 새로운 바이너리벡터가 구축되어, 형질전환에 사용되고 있다. 또한, Ri 플라스미드의 시스템에 있어서도, 동일한 벡터가 구축되어 형질전환에 이용되고 있다.

아그로박테리움 A281(Watson 등, 1975(참고문헌(39)))은 강병원성(super-virulent)의 균계이고, 그 숙주범위는 넓으며, 형질전환효율도 다른 균계보다 높다(Hood 등, 1987(참고문헌(13)) ; Komari, 1989(참고문헌(21))). 이 특성은 A281이 갖는 Ti 플라스미드의 pTiBo542에 의한 것이다(Hood 등, 1984(참고문헌(16)) ; Jin 등, 1987(참고문헌(20)) ; Korami 등, 1986(참고문헌(24))).

pTiBo542를 사용하여, 지금까지 2가지의 새로운 시스템이 개발되고 있다. 하나는 pTiBo542의 디스암형의 Ti 플라스미드를 갖는 균계 EHA101(Hood 등, 1986) 및 EHA105(Hood 등, 1993)를 사용한 것이고, 이들을 상술한 바이너리벡터 시스템에 적용하므로써, 형질전환능력이 높은 시스템으로 만들어, 여러가지의 식물의 형질전환에 이용되고 있다. 또 하나는 슈퍼바이너리벡터('super-binary' vector)(Hiei 등, 1994(참고문헌(11)) ; Ishida 등, 1996(참고문헌(18)) ; Komari 등, 1999(참고문헌(26)), WO94/00977호, WO95/06722호)시스템이다(도 4). 이 시스템은vir영역(virA, virB, virC, virD, virE 및 virG(이하, 이들을 각각 「vir단편영역)이라고도 한다))을 갖는 디스암형의 Ti 플라스미드 및 T-DNA를 갖는 플라스미드로 이루어진, 바이너리벡터 시스템의 일종이다. 그러나, T-DNA를 갖는 측의 플라스미드, 즉 바이너리벡터에 vir단편영역중 적어도 하나의 vir단편영역을 실질적으로 제외한 vir영역의 단편(이중 바람직하게는 적어도 virB 또는 virG를 포함하는 단편, 더욱 바람직하게는 virB 및 virG를 포함하는 단편)을 통합한(Komari, 1990a(참고문헌(22))) 슈퍼바이너리벡터를 사용한다는 점에서 다르다. 또, 슈퍼바이너리벡터를 갖는 아그로박테리움에, 소망의 유전자를 통합한 T-DNA영역을 도입하는데에는, 3계교잡법을 통한 상동변환이 용이한 수법으로서 이용될 수 있다(Komari 등, 1996(참고문헌(25))). 이 슈퍼바이너리벡터 시스템은 상술한 여러가지의 벡터 시스템과 비교하여, 많은 식물종으로 상당히 높은 형질전환효율을 가져온다는 것이 밝혀져 있다(Hiei 등, 1994(참고문헌(11)) ; Ishida 등, 1996(참고문헌(18)) ; Komari, 1990b(참고문헌(23)) ; Li 등, 1996(참고문헌(27)) ; Saito 등, 1992(참고문헌(35))).

본 발명의 방법에 있어서는, 숙주로 되는 아그로박테리움속 세균으로서는 특별히 한정되지 않지만, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)(예컨대, 상술한Agrobacterium tumefaciensLBA4404(Hoekema 등, 1983(참고문헌(12))) 및 EHA101(Hood 등, 1986(참고문헌(15)))을 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명의 방법에 의하면, 아그로박테리움속 세균에 있어서 병원성(vir)영역의 유전자군의 발현에 근거한 유전자도입계이면, 특별히 한정되지 않고 유의한 효과를 얻을 수 있다. 따라서, 상술한 중간벡터, 바이너리벡터, 강병원성 바이너리벡터, 슈퍼바이너리벡터 등 어느 벡터 시스템에 대해서도 사용될 수 있고, 본 발명에 의한 효과를 얻을 수 있다. 이들 벡터류를 개변(改變)한 다른 벡터 시스템을 사용한 경우에 있어서도 동일하다(예컨대, 아그로박테리움속 세균의 vir영역의 일부 또는 전부를 절제하여 부가적으로 플라스미드내에 통합, vir영역의 일부 또는 전부를 절제하여 새로운 플라스미드의 일부로서 아그로박테리움에 도입하는 등). 또한, 당연하지만, 본 발명의 방법에 의하면, 야생형의 아그로박테리움속 세균에 있어서도, 식물로의 야생형 T-DNA영역의 도입효율을 높여서, 사실상 감염효율을 향상시킬 수 있다.

식물에 도입하고자 하는 소망의 유전자는 상기 플라스미드의 T-DNA영역중의 제한효소부위에 통상의 방법에 의해 통합할 수 있고, 당해 플라스미드에 동시에 또는 별도로 통합된 카나마이신, 할로모마이신 등의 약제에 대한 내성을 갖는 유전자 등의 적당한 선택마커에 근거하여 선택할 수 있다. 대형이고 다수의 제한부위를 갖는 것은, 통상의 서브크로닝의 수법에서는 소망의 DNA를 T-DNA영역내에 도입하는 것이 반드시 용이한 것이 아니다. 이와 같은 경우에는 3계교잡법에 의해, 아그로박테리움속 세균의 세포내에서의 상동변환을 이용하므로써 목적으로 하는 DNA를 도입할 수 있다.

또한, 플라스미드를 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 등의 아그로박테리움속 세균에 도입하는 조작은 종래법에 의해 행할수 있고, 예로서는 상기한 3계교잡법이나 일렉트로포레이션법, 일렉트로인정션법, PEG 등의 화학적인 처리에 의한 방법 등이 포함된다.

식물에 도입하고자 하는 유전자는 종래의 기술과 동일하게 기본적으로는 T-DNA의 좌우경계서열의 사이에 배치되는 것이다. 그러나, 플라스미드가 환상이므로, 경계서열의 수는 1이어도 좋고, 복수의 유전자를 다른 부위에 배치하도록 하는 경우에는 경계서열이 3개 이상이어도 좋다. 또한, 아그로박테리움속 세균중에서 Ti 또는 Ri 플라스미드상에 배치되어도 좋으며, 또한 다른 플라스미드상에 배치되어도 좋다. 더욱이 복수 종류의 플라스미드상에 배치되어도 좋다.

아그로박테리움속 세균을 통하여 유전자도입을 행하는 방법은 식물세포 또는 식물조직을 아그로박테리움속 세균과 단순히 접촉시키므로써 행할 수 있다. 예컨대 10⁶∼10¹¹세포/ml 정도의 세포농도의 아그로박테리움속 세균현탁액을 조제하고, 이 현탁액중에 식물세포 또는 식물조직을 3∼10분 정도 침지후, 고체배지상에서 수일간 공존배양하므로써 행할 수 있다.

유전자도입에 제공되는 세포 또는 조직은 어떠한 것으로 한정되는 것은 아니고, 잎, 뿌리, 줄기, 열매, 그 밖의 어느 부위이어도 좋고, 유합조직(callus)과 같이 탈분화한 것이어도 탈분화하지 않은 배(胚) 등이어도 좋다. 또한, 식물의 종류도 한정되지 않지만, 피자(被子)식물이 바람직하고, 피자식물 및 쌍자엽식물이어도, 단자엽식물이어도 좋다.

이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

하기 실시예에 있어서 구체적으로 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 종래의 아그로박테리움법에 비교하여, 유전자도입의 효율이 유의하게 향상한다.

실시예 1

(1) 아그로박테리움의 균계 및 플라스미드

아그로박테리움 및 그 벡터에는 LBA4404(pBl121)(pBl121은 미국 크론테크사로부터 시판, (Jefferson RA 1987(참고문헌(19))), LBA4404(plG121Hm)(Hiei, Y. 등, 1994(참고문헌(11)), LBA4404(pTOK233)(Hiei 등, 1994(참고문헌(11))) 및 LBA4404(pSB133)(도 2)를 사용하였다.

또, pSB133의 구축은 이하와 같이 행하였다. pGA482(An G 등, 1985(참고문헌(3)))를 제한효소 SalI로 소화하여 얻어진 6.2kb의 DNA단편을 pSB11(Komari 등, 1996(참고문헌(25))을 SalI로 소화하여 얻어지는 5.1kbp의 DNA단편과 결합하여 플라스미드를 제조하였다. 다음에, 이 플라스미드를 제한효소 EcoRI, BglII로 소화하여 8.6kb의 DNA단편을 얻었다. 이 DNA단편을 평활화처리하고, BglII링커(TaKaRa사제)를 삽입하여 플라스미드 pSB27을 얻었다. 이 pSB27을 제한효소 HindIII로 소화시키고, plG221(Ohta S 등, 1990(참고문헌(32))을 HindIII로 소화하므로써 얻어지는 3.1kb의 35S 프로모터 및 인트론개재 GUS유전자를 포함하는 단편을 삽입하여 pSB33을 얻었다. pSB33을 대장균 LE392주에 도입한 후, 3계 교잡법(Triparental mating)(Ditta G 등, 1980(참고문헌(8))에 의해, pSB1(Komari 등, 1996(참고문헌(25)))를 갖는 아그로박테리움 LBA4404주에 도입하였다. pSB133은 아그로박테리움내에서 pSB1과 pSB33의 사이의 상동변환에 의해 의해 얻어졌다. pBl121의 T-DNA영역에는 노파린합성효소유전자(nos)의 프로모터에 의해 억제되는카나마이신내성유전자(nptII), 카리프라우-모자이크 독성(CaMV)의 35S 프로모터에 의해 제어되는 GUS유전자를 갖는다. plG121Hm 및 pTOK233의 T-DNA영역에는 nos 프로모터에 의해 제어되는 nptII유전자, 35S 프로모터에 의해 제어되는 hpt유전자, 35S 프로모터에 의해 제어되는 피마자의 카탈라아제유전자의 인트론이 개재하는 GUS유전자를 갖는다. 또한 pSB133의 T-DNA영역에는 nos 프로모터에 의해 제어되는 nptII유전자, CaMV의 35S 프로모터로 제어되는 피마자의 카탈라아제유전자의 인트론이 개재하는 GUS유전자를 갖는다(도 2). 또, pSB133 및 pTOK233은 형질전환능력이 높은 슈퍼바이너리벡터(Komari, T. 등, 1999(참고문헌(26)))이다.

(2) 공시품종 및 조직

공시품종으로서 일본 벼품종의 콘히카리 및 아키노히카리를 사용하였다. 개화후 8∼14일째의 미숙종자의 이삭을 제거하고, 70% 에탄올로 수초동안, 트윈20을 포함하는 1% 차아염소산나트륨수용액으로 15분간 멸균처리를 행하였다. 멸균수로 수회 세정후, 길이 1.5∼2mm의 미숙배를 적출하여 공시조직으로 하였다.

(3) 원심처리

벼미숙배를 멸균수를 넣은 튜브중에 넣고, 미량고속원심기, 대형고속원심기 또는 초고속원심기를 사용하여 760G∼150,00G의 원심처리를 행하였다. 원심처리종료후, 미숙배에 아그로박테리움을 접종하였다.

(4) 접종 및 공존배양

미숙배로의 접종 및 공존배양의 방법은, Hiei 등(1994)(참고문헌(11))에 의하였다. 즉, 원심처리후, 튜브내부의 멸균수를 제거하고, 아그로박테리움의 현탁액을 가하여, 5∼30초간 볼텍스믹서로 교반하였다. 박테리아현탁액의 조제는 AB 배지(Chilton, M-D 등, 1974(참고문헌(6)))상에서 3∼10일간 배양한 아그로박테리움의 콜로니를 백금이로 베껴내어, 수정 AA 배지(AA 주요무기염류, AA 아미노산 및 AA 비타민류(Toriyama K. 등, 1985(참고문헌(36)), MS 미량염류(Murashige, T 등, 1962(참고문헌(30)), 1.0g/l 카자미노산, 100μM 아세토실린곤, 0.2M 자당, 0.2M 글루코오스)에 현탁하므로써 행하였다. 약 5분간 실온에서 정치한 후, 공존배양용의 배지에 놓았다. 공존배양용의 배지로서는 2N6-AS 배지(Hiei 등, 1994(참고문헌(11)))의 무기염류를 R2 배지(Ohira 등, 1973(참고문헌(31)))의 조성으로 변경하여 사용하였다. 다만, 주요무기염류(KNO₃, KH₂PO₄, CaCl₂2H₂O, MgSO₄7H₂O)에 관해서는 1/2의 농도로 배지에 첨가하였다. 또, 접종균밀도는 1 ×10⁸∼1 ×10⁹cfu/ml로 조정하였다. 공존배양은 3∼13일간 행하고, 일부의 미숙배에 관해서 X-Gluc를 처리하는 것에 의해 GUS 발현을 조사하였다(Hiei 등, 1994)(참고문헌(11)). 즉, 공존배양처리직후, 조직을 0.1% Triton X-100을 포함하는 0.1M 인산완충액(pH6.8)에 침지하고, 37℃에서 1시간 정치시켰다. 인산완충액으로 아그로박테리움을 제거한 후, 1.0mM 5-브로모-4-클로로-3-인돌린-β-D-글루크론산(X-gluc) 및 20% 메탄올을 포함하는 인산완충액을 첨가하였다. 37℃에서 24시간 처리한 후, 청색을 띠는 색을 나타내는 조직을 현미경하에서 관찰하였다.

(5) 형질전환세포의 선택

공존배양후, 미숙배 및 유합조직을 250mg/l 칼베니실린 및 250mg/l 세포탁심을 포함하고, 200mg/l 파로모마이신 또는 10∼30mg/l 하이그로마이신을 포함하는 1차 선택배지에 이식하고, 30℃ 명조건하에서 1∼2주간 배양하였다. 1차 선택배지에는 Hiei 등, (1994)(참고문헌(11))에 의한 2N6K 배지에 30g/l의 D-소르비톨을 첨가한 배지를 사용하였다(K배지). 또한, Hiei 등(1994)(참고문헌(11))에 의한 2N6 배지(N6의 무기염 및 비타민류(Chu C.C. 1978(참고문헌(7)), 1g/l 카자미노산, 2mg/l 2,4-D)의 (NH₄)₂SO₄를 232mg/l로 하여 AA 배지(Toriyama 등, 1985(참고문헌(36)))의 아미노산류를 첨가한 배지에 관해서도 시험에 제공하였다(N배지).

1차 선택배지상에 형성된 유합조직을 250mg/l 세포탁심 및 250mg/l 칼베니실린을 포함하고, 200mg/l 파로모마이신 또는 80mg/l 하이그로마이신을 포함한 2차 선택배지상에 이식하고, 30℃ 명조건하에서 1∼2주간의 배양을 행하였다. 2차 선택배지에는 Hiei 등(1994)(참고문헌(11))에 의한 N6-7 배지의 (NH₄)₂SO₄를 232mg/l로 하여 AA 배지(Toriyama 등, 1985(참고문헌(36)))의 아미노산류를 첨가한 배지를 사용하였다. 또, 파로모마이신을 함유하는 상기의 1차 및 2차 선택배지에는 배지고화제로 8g/l 아가로오스를 사용하였다. 내성유합조직의 출현율은 2차선택후에 조사하였다.

(6) 형질전환체의 재분화

미숙배의 배반(胚盤)부위로부터 얻어진 선택약제내성의 유합조직을 250mg/l 칼베니실린 및 250mg/l 세포탁심을 포함하고, 100mg/l 파로모마이신 또는 50mg/l 하이그로마이신을 포함한 재분화배지 N6S3 배지(Hiei 등, 1994(참고문헌(11)))상에놓았다.

(7) 재분화개체에 있어서 GUS 발현의 조사

25℃ 명조건하에서 4∼5주간의 재분화배양을 행하여 얻어진 각 약제내성의 재분화식물의 잎조각을, 상기와 같이 X-Gluc를 처리하므로써, GUS 발현을 조사하였다(Hiei 등, 1994(참고문헌(11)). 재분화개체는 500배의 Hyponex 수용액중에 이식하고, 25℃ 명조건하에서 약 2주간 육묘한 후, 온실내의 화분에 이식하였다.

(8) 결과

(ⅰ) 원심처리효과의 검사

미량고속원심기, 대형고속원심기 및 초고속원심기를 사용하여 벼의 미숙배로의 원심처리효과를 조사한 결과, 10KG∼100KG의 범위의 처리에서 유전자의 도입효율이 높아졌다(표 1, 2, 3, 6). 처리시간에 관해서는 10분간의 처리에서 명확한 효과가 확인되었다(표 4, 5). 또한, 콘히카리와 아키노히카리의 품종간에서의 GUS의 일과성 발현빈도에 다른 점은 확인되지 않았다. 또, 원심처리는 유전자도입효율의 향상뿐만 아니라 유합조직유도를 촉진하는 효과가 확인되었기 때문에, 다른 식물종을 포함하여, 배양에 있어서 유합조직의 유도 및 증식에 유용하다는 것이 시사되었다.

표 6의 결과로부터 초고속원심기를 사용한 250KG의 60분 처리에서는 아키노히카리 미숙배로부터의 유합조직 유도가 전부 확인되지 않았다. 그러나, 110KG의 60분 처리에서는 유합조직유도가 확인되고, GUS 발현도 높은 효율로 확인되었다. 동일하게 콘히카리에 관해서도 초고속원심기를 사용한 250KGㆍ60분 처리에서는 미숙배로부터의 유합조직유도가 확인되지 않았다. 이상의 결과로부터 벼미숙배에 있어서 원심처리의 효과의 범위는 5KG∼200KG이라고 여겨지고, 처리방법의 간편성을 고려하면 미량고속원심기 및 대형고속원심기를 사용하는 경우에는 20KG, 40KG 처리가 적당하다고 여겨진다. 또한 표 9, 10, 11의 결과로부터, 형질전환능력이 높게 되는 슈퍼바이너리벡터를 갖는 LBA4404(pSB133)만이 아니라, 통상의 바이너리벡터인 LBA4404(plG121Hm)에서도 20KGㆍ60분의 원심처리에 의해 미숙배를 사용한 형질전환이 가능하다는 것이 명확하게 되었다.

(ⅱ) 원심처리와 공존배양기간의 검토

표 7, 8의 결과로부터 공존배양기간이 3일에서 6일, 13일이 트랜젼트 분석에서 높은 GUS 발현효율을 나타내었다. 공존배양기간이 9일인 경우에 관해서도 별도의 실험에서 높은 GUS 발현이 확인되었다. 현재, 공존배양기간이 다른 각종 미숙배를 1차 선택배지상(10ppm 하이그로마이신, 200mp 파로모마이신)에서 배양하고 있지만, 9일, 13일 공존의 그룹에서는 3일, 6일의 공존그룹과 비교하여 약제내성 유합조직의 출현율이 낮은 경향이 있다.

(ⅲ) 원심처리에 의한 형질전환효율의 조사

현재, 상기에 의해 작출된 GUS 양성 형질전환체(표 4, 5)를 각각 순화하고, 재배를 계속하고 있다. 일부분의 계통에 관해서는 채종을 종료하여 임성(稔性)조사를 행하였다. 그 결과, 원심처리한 형질전환체는 처리하지 않은 형질전환체(콘히카리, 아키노히카리)와 비교하여, 형태 및 임성에 차이는 확인되지 않았다.

Hiei 등(1994(참고문헌(11)))은 벼의 유합조직을 재료로 하여 비교적 높은효율로 형질전환이 행해질 수 있다는 것을 보고하고 있다. 또한, Aldemita R R 등, 1996(참고문헌(1))은 벼의 미숙배를 사용한 형질전환예를 보고하고 있다. 이들의 형질전환수법을 보다 효율 좋고 안정하게 실시하기 위해서, 상술한 원심처리법은 상당히 유효하다. 특히, 미숙배는 재배환경에 좌우되기 쉬워 형질전환에 적당한 미숙배 재료를 항상 얻는 것은 용이하지 않지만, 원심처리를 실시하는 것에 의해 안정하고 높은 형질전환효율을 유지하는 것이 가능하다. Hiei 등(1994(참고문헌(11)))은 형질전환능력이 높은 벡터인 슈퍼바이너리벡터가 벼의 형질전환효율을 향상시키는 것을 나타내었다. 또한, Aldemita 등, 1996(참고문헌(1))에 의하면, 슈퍼바이너리벡터인 LBA4404(pTOK233)을 사용한 시험에 있어서만, 형질전환체를 얻고 있다. 본 연구에 있어서 원심처리법은 통상의 바이너리벡터를 사용한 경우에 있어서도, 슈퍼바이너리벡터에 필적하지만, 그 이상의 유전자도입효율을 얻을 수 있다. 또한, 슈퍼바이너리벡터와 원심처리법을 병용하므로써, 보다 한층 효율을 향상시키는 것이 가능하다. 더욱이, 원심처리법을 사용하므로써, 지금까지 전부 형질전환체를 얻을 수 없었던 품종에 있어서도 형질전환체를 얻을 수 있다고 추찰된다.

각종 원심처리와 공존배양후의 GUS 발현결과(공시균계 : LBA4404/pSB133)

각 품종	접종균 농도(cfu/ml)	처리 안함	원심가속도
각 품종	접종균 농도(cfu/ml)	처리 안함	760G	8,500G	19,100G
콘히카리	1×10⁸	3/10(+)	6/10(+)	7/10(++)	7/10(+++)
콘히카리	1×10⁹	2/10(+)	0/10(-)	4/10(++)	7/10(+++)
아키노히카리	1×10⁸	4/10(+)	3/10(+)	9/10(+++)	7/10(+++)
아키노히카리	1×10⁹	1/10(+)	6/10(++)	2/10(+)	7/10(+++)

원심처리시간 : 10분, 공존배양기간 : 3∼5일, GUS 양성미숙배 수/공시 미숙배 수

( ) 안은 배반에서 GUS 발현영역의 면적

- ; 없음, + : 소, ++ : 중, +++ : 대

콘히카리 미숙배로부터의 파로모마이신 내성유합조직의 출현율(공시균계 : LBA4404/pSB133)

각 선택배지	접종균 농도(cfu/ml)	처리 안함	원심가속도
각 선택배지	접종균 농도(cfu/ml)	처리 안함	760G	8,500G	19,100G
N배지	1×10⁸	4.8%(1/21)	0.0%(0/22)	15.0%(3/20)	31.8%(7/22)
N배지	1×10⁹	4.3%(1/23)	4.5%(1/22)	16.7%(3/18)	13.3%(2/15)
K배지	1×10⁸	0.0%(0/21)	0.0%(0/22)	14.3%(3/21)	18.2%(4/22)
K배지	1×10⁹	0.0%(0/23)	0.0%(0/21)	0.0%(0/19)	0.0%(0/22)

내성유합조직이 출현한 미숙배 수/공시 미숙배 수, 2차 선택종료시 조사

원심처리시간 : 10분, 공존배양기간 : 3∼5일

아키노히카리 미숙배로부터의 파로모마이신 내성유합조직의 출현율(공시균계 : LBA4404/pSB133)

각 선택배지	접종균 농도(cfu/ml)	처리 안함	원심가속도
각 선택배지	접종균 농도(cfu/ml)	처리 안함	760G	8,500G	19,100G
N배지	1×10⁸	0.0%(0/11)	0.0%(0/11)	30.0%(3/10)	36.4%(4/11)
N배지	1×10⁹	0.0%(0/11)	9.1%(1/11)	27.3%(3/11)	54.5%(6/11)
K배지	1×10⁸	0.0%(0/10)	0.0%(0/15)	9.1%(1/11)	9.1%(1/11)
K배지	1×10⁹	0.0%(0/11)	0.0%(0/11)	0.0%(0/11)	45.5%(5/11)

원심처리시간 : 10분, 공존배양기간 : 3∼5일

원심처리시간과 공존배양 후의 GUS 발현결과(품종 : 콘히카리)

균계 및플라스미드	처리 안함	원심처리시간
균계 및플라스미드	처리 안함	10분	30분	60분
LBA4404(pSB133)	9/10(+)	9/10(++)	10/10(++)	10/10(+++)
LBA4404(pTOK233)	9/10(+)	10/10(++)	10/10(++)	10/10(+++)

원심가속도 : 20,000G, 공시품종 : 콘히카리, GUS양성미숙배 수/공시 미숙배 수

배반영역에서 GUS 발현영역의 면적 + : 소, ++ : 중, +++ : 대

원심처리시간과 파로모마이신 내성유합조직의 출현율(품종 : 콘히카리)

각 선택배지	배양조건	처리 안함	원심처리시간
각 선택배지	배양조건	처리 안함	10분	30분	60분
N배지	명소(30℃)	0.0%(0/31)	34.3%(12/35)	35.0%(14/40)	53.3%(16/30)
N배지	암소(30℃)	0.0%(0/32)	54.1%(20/37)	34.2%(13/38)	58.6%(17/29)
K배지	명소(30℃)	0.0%(0/31)	20.0%(7/35)	38.5%(15/39)	40.0%(12/30)
K배지	암소(30℃)	0.0%(0/32)	48.6%(17/35)	41.0%(16/39)	33.3%(10/30)

원심가속도 : 20,000G, 공존배양기간 : 3∼5일, 2차 선택종료시 조사

내성유합조직이 출현한 미숙배 수/공시 미숙배 수

원심처리강도와 공존배양후의 GUS 발현(품종 : 아키노히카리)

각종 원심처리	공존배양기간	미숙배 수
		배반에서 GUS 발현빈도
		-	±	+	++
처리 안함	3일간6일간	60	42	06	02
20KG¹⁾	3일간6일간	00	00	22	88
40KG²⁾	3일간6일간	10	00	10	810
110KG³⁾	3일간6일간	10	00	52	48
250KG³⁾	3일간6일간	1010	00	00	00

공시균계 : LBA4404/plG121Hm, 원심처리시간 : 60분

1) 미량고속원심기 2) 대형고속원심기 3) 초고속원심기

배반부를 차지하는 GUS 발현영역의 비율

- : 없음, ±: <1/8, + : 1/8-1/4, ++ : >1/4

원심처리 및 공존배양기간과 공존배양후의 GUS 발현(품종 : 아키노히카리)

각종 원심처리	공존배양기간	미숙배 수
		배반에서 GUS 발현빈도
		-	±	+	++
처리 안함	3일간6일간13일간	500	465	122	023
20KG¹⁾	3일간6일간13일간	000	211	533	366
40KG²⁾	3일간6일간13일간	000	101	785	224

공시균계 : LBA4404/plG121Hm, 1) 미량고속원심기 2) 대형고속원심기

각각의 회전수에 대해서, 60분간의 원심처리

배반부를 차지하는 GUS 발현영역의 비율 - : 없음, ±: <1/8, + : 1/8-1/4, ++ : >1/4

원심처리 및 공존배양기간과 공존배양후의 GUS 발현(품종 : 콘히카리)

각종 원심처리	공존배양기간	미숙배 수
		배반에서 GUS 발현빈도
		-	±	+	++
처리 안함	3일간6일간13일간	731	316	002	001
20KG¹⁾	3일간6일간13일간	000	000	121	989
40KG²⁾	3일간6일간13일간	100	000	401	5109

각각의 회전수에 대해서, 60분간의 원심처리

LBA4404(pBl121)에 의한 형질전환결과(품종 : 아키노히카리)

각종 처리	공시미숙배 수	순화수	GUS양성수	형질전환효율
처리 안함	50	17	12	24.0(%)
원심처리	150	60	54	36.0(%)

원심처리 : 20KGㆍ60분 공존배양 5일간

LBA4404(plG121Hm)에 의한 형질전환결과(품종 : 아키노히카리)

각종 처리	공시미숙배 수	순화수	GUS양성수	형질전환효율
처리 안함	40	9	3	7.5(%)
원심처리	47	10	5	10.6(%)

원심처리 : 20KGㆍ60분 공존배양 5일간

LBA4404(pBl121)에 의한 형질전환결과(품종 : 콘히카리)

각종 처리	공시미숙배 수	순화수	GUS양성수	형질전환효율
처리 안함	49	4	2	4.1(%)
원심처리	274	35	27	9.9(%)

원심처리 : 20KGㆍ60분 공존배양 5일간

LBA4404(pSB133)에 의한 형질전환결과(품종 : 콘히카리)

각종 처리	공시미숙배 수	순화수	GUS양성수	형질전환효율
처리 안함	63	0	-	0.0(%)
원심처리	281	30	23	8.2(%)

원심처리 : 20KGㆍ60분 공존배양 3일간

실시예 2

크기 약 1.2mm인 옥수수미숙배(품종 A188, 농림수산성 생물자원연구소로부터 입수)를 무균적으로 취출하고, LS-inf 액체배지로 1회 세정하였다. 원심관에 미숙배와 100μM의 아세토실린곤을 포함하는 LS-inf 배지 2.0ml에 약 1 ×10⁹cfu/ml의 농도로, 아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(pSB131)(Ishida 등, 1996(참고문헌(18))을 현탁한 액을 가하고, 40,000G, 4℃에서 30분간 원심처리하였다. 대조의 미숙배는 상기와 동일한 세균현탁액중에서 30분간, 실온에서 정치하였다. 처리후, 완만하게 교반한 후, 배축면이 배지에 접하도록 LS-AS 배지에 놓았다. 또한, 원심처리후의 미숙배로의 접종은 이하와 같이 행하였다. 무균적으로 취출한 미숙배를 LS-inf 액체배지로 1회 세정한 후, 동일한 액체배지를 포함하는 원심관에 옮기고, 20KG 또는 40KG으로 4℃, 1시간의 원심처리를 행하였다. 대조는 액체배지중에서 1시간, 실온에서 정치하였다. 처리후, 액체배지를 제거하고, 약 1 ×10⁹cfu/ml의 농도로 LBA4404(pSB131)을 현탁한 액을 가하여, 완만하게 교반하였다. 5분간 실온에서 정치한 후, 배축면이 배지에 접하도록 10μM AgNO₃를 포함하는 LS-AS 배지에 놓았다. 25℃, 암흑하에서 3일간 공존배양한 후, 일부의 미숙배를 채취하고, 실시예 1과 동일하게 X-gluc에 의해 GUS 유전자의 트랜젼트한 발현을 조사하였다. 또, 상기의 배지 및 배양법은 Ishida, Y. 등, 1996(참고문헌(18))에 기재한 방법에 따랐다.

LBA4404(pSB131)을 접종한 A188 미숙배에서의 GUS 유전자의 트랜젼트한 발현을 표 13에 나타낸다. 모든 미숙배가 GUS 유전자의 발현을 나타내었지만, 대조의 미숙배에 비하여 원심처리를 행한 미숙배에서는 보다 넓은 범위에서의 발현을 나타내는 것이 많이 확인되었다. 원심처리에 의한 유전자도입부위의 증대는 아그로박테리움균과 함께 원심처리를 행한 경우, 원심처리후 아그로박테리움균을 접종한 경우의 모든 경우에서 확인되었다. 또한, 원심강도 및 처리시간을 변경한 경우에서도 대조에 비하여 보다 넓은 범위에서의 GUS 유전자의 발현이 확인되었다.

이상의 결과로부터, 원심처리한 미숙배를 선택배지에서 배양하면, 대조에 비하여 보다 높은 효율로, 형질전환식물이 얻어질 가능성이 나타났다. 또한, 종래의아그로박테리움법에서는 형질전환이 불가능하였던 A188 이외의 옥수수품종(Ishida 등, 1996(참고문헌(18)))에 관해서도 원심처리하는 것에 의해 형질전환식물이 얻어질 가능성이 시사되었다.

A188 미숙배에서의 GUS 유전자의 트랜젼트한 발현

시험	처리	공시미숙배 수	GUS유전자의 발현
시험	KG min	공시미숙배 수	+++	++	+	-
1	40 30대조 30	2730	71	1017	1012	00
2	40 6020 60대조 60	202020	000	3101	171019	000

대조는 1G에서 처리.

시험 1은 아그로박테리움균 공존하에서 원심처리를 행하였다. 시험 2는 원심처리후, 아그로박테리움균의 접종을 행하였다.

참고문헌

Claims

식물세포 또는 식물조직을 원심처리하는 것을 포함하는, 아그로박테리움속 세균을 통하여 행해지는 식물세포로의 유전자도입의 효율을 향상시키는 방법.
제 1항에 있어서, 식물세포 또는 식물조직을 원심처리한 후, 유전자도입처리를 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 원심처리가 100G∼25만G의 원심가속도의 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3항에 있어서, 원심처리가 500G∼20만G의 원심가속도의 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 원심처리가 1000G∼15만G의 원심가속도의 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 원심처리가 1초간∼4시간의 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6항에 있어서, 원심처리가 5분간∼2시간의 범위에서 행해지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 식물의 작출방법.
제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항의 방법에 의해 작출되는 식물세포, 식물조직 또는 식물.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, 사용되는 식물세포 또는 식물조직이 피자식물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9항의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 피자식물의 작출방법.
제 10항 또는 제 11항의 방법에 의해 작출되는 피자식물세포, 피자식물조직 또는 피자식물.
제 10항에 있어서, 사용되는 식물세포 또는 식물조직이 단자엽식물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11항의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 단자엽식물의 작출방법.
제 13항 또는 제 14항의 방법에 의해 작출되는 단자엽식물세포, 단자엽식물조직 또는 단자엽식물.
제 13항에 있어서, 사용되는 식물세포 또는 식물조직이 벼과식물 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제 13항의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 벼과식물의 작출방법.
제 16항 또는 제 17항의 방법에 의해 작출되는 벼과 식물세포, 벼과 식물조직 또는 벼과식물.
제 16항에 있어서, 사용되는 식물세포 또는 식물조직이 벼 또는 옥수수인 것을 특징으로 하는 방법.
제 19항의 방법을 사용하는 것을 특징으로 하는 벼 또는 옥수수의 작출방법.
제 19항 또는 제 20항의 방법에 의해 작출되는 벼세포, 벼조직, 벼, 옥수수세포, 옥수수조직 또는 옥수수.