PROCESO PARA PREPARAR ORGANOALUMINOSILICATOS Y SU USO EN ALIMENTOS
BALANCEADOS PARA ANIMALES.
D E S C R I P C I Ó N
Campo de la invención:
Esta invención se refiere en general a alimentos balanceados mejorados que evitan los efectos tóxicos de las micotoxinas en animales y más específicamente, se refiere a un proceso para preparar organoaluminosilicatos, a una formulación de un alimento balanceado que incluye esos organoaluminosilicatos y al uso de organoaluminosilicatos para reducir o eliminar los efectos nocivos de las micotoxinas en animales.
Antecedentes de la invención.
Las micotoxinas son compuestos químicos de bajo peso molecular, producidos por hongos, que tienen efectos patológicos tanto en humanos como en animales. Existen cientos de micotoxinas que son producidas por diversos hongos que contaminan granos y alimentos ya sea en el campo o en los silos de almacenamiento, En el campo el hongo que afecta comúnmente a los granos es Fusarium sp que produce las toxinas Zearalenona, Fumonisina y Tricotecenos (Vomitoxina, Toxina T2, DAS) entre otras. El hongo Aspergíllus sp se desarrolla principalmente durante el almacenamiento y produce las muy conocidas Aflatoxinas, pero también puede producir Esterigmatocistina, Ácido Ciclopiazónico y Ocratoxina A dependiendo de la especie que se desarrolle. Las micotoxinas llegan a afectar sistemas específicos del organismo pero generalmente dañan el hígado o los riñones por lo que alteran los procesos metabólicos del animal produciendo condiciones adversas que llevan a efectos como hígado pálido, agrandado y friable, inflamación de riñones, lesiones orales, disminución de la respuesta inmunológica, mala absorción de nutrientes, reducción del crecimiento, disminución de la pigmentación, reducción de la postura en aves, alteración de la fertilidad, vulvas inflamadas, etcétera, El grado del daño depende de la micotoxina involucrada, del nivel de contaminación del alimento y del tiempo en que se ha consumido el alimento. En caso de micotoxicosis el diagnóstico resulta complicado ya que por lo regular no se presenta una
micotoxina sola y la intoxicación es, con algunas excepciones, casi siempre del tipo crónica por lo que no se presenta un cuadro clínico definido.
Las Aflatoxinas son un grupo de metabolitos tóxicos producidas por Aspergillus flavus y por Aspergillus parasiticus, aunque existen varios compuestos relacionados con las Aflatoxinas, sólo cuatro de ellos, Aflatoxinas, B1, B2, G1 y G2 se encuentran de manera natural en los granos y alimentos. De estos compuestos la Aflatoxina B1 , es la de mayor preocupación ya que es la más tóxica y está asociada con el cáncer de hígado. Afecta a todas las especies animales y la patología se presenta con hígado graso, pálido, descolorido, inflamado y friable. La afectación del hígado ocasiona una disminución en la síntesis de las enzimas digestivas por lo que se produce un síndrome de mala absorción, que ocasiona una disminución en la ganancia de peso y en la producción de huevo o leche. Las aflatoxinas también afectan los procesos de coagulación de la sangre, los mecanismos de transporte de lípidos y la pigmentación, además de causar inmunosupresión lo que favorece la susceptibilidad del animal a enfermedades.
La Zearalenona es una micotoxina producida principalmente por el hongo Fusaríum graminearum en granos y alimentos, Es una lactona del ácido resorcílico y a pesar de su diferencia estructural con los estrógenos, como el Estradiol, ella y varios de sus derivados presentan actividad estrogénica (Diekman y Green 1992, Krska 1999). Al parecer la Zearalenona sufre un doblez en su estructura que permite que el grupo hidroxilo se oriente adecuadamente para facilitar el enlace con los receptores de los estrógenos. Existe una familia de compuestos relacionados con la Zearalenona, que son derivados de su estructura original. Aunque estos compuestos presentan baja toxicidad, es decir su ingestión no causa daños severos, sus efectos estrogénicos y anabólicos causan problemas de reproducción en todas las especies animales, de las cuales el cerdo es el animal mas afectado. En el caso de la porcicultura la presencia de grano contaminado con Zearalenona es un problema de repercusiones económicas muy severas por el impacto que tiene en la reproducción. La patología se presenta con inflamación y tumefacción de la vulva en las cerdas (vulvovaginitis), engrosamiento de las mamas, aumento de la matriz, preñez ficticia, abortos, disminución de la viabilidad del feto y disminución de la camada, trastorno general de la fertilidad, y en el caso de los machos se presenta atrofia testicular y afeminamiento (Diekman y Green 1992). En aves se ha reportado una disminución de la postura por el consumo de alimento contaminado con Zearalenona (Branton et al 1989) y posiblemente esta micotoxina esté involucrada con el
síndrome de hígado graso pues se ha reportado un aumento del peso del hígado por Zearalenona (Chi et al 1980).
La Ocratoxina A es producida principalmente por Aspergillus ochraceus o Penicillum viridicatum, causa intoxicaciones en los animales y la severidad de éstas depende del consumo de alimento contaminado. El síndrome más frecuente en cerdos y aves es aumento del tamaño del riñon, teniendo éste un color pálido, apareciendo quistes y focos miliares fibrosos, en los túbulos proximales se produce necrosis epitelial acompañada por cambios degenerativos del núcleo y engrosamiento de la membrana basal. Durante la intoxicación aguda, los animales están deprimidos, con anorexia, paresia, edema perineal en verracos, ascitis, hidrotórax, edemas subcutáneos y mesentéricos. En la intoxicación crónica disminuye el apetito y el crecimiento de los animales, aumenta el consumo de agua y aparece poliuria. Otros efectos producidos por la Ocratoxina A son la alteración de los procesos de coagulación sanguínea con aparición de coagulopatías y la disminución de los carotenoides séricos por lo que disminuye la pigmentación (Huff y Hamilton 1975). Se presenta también una disminución de la fuerza tensil del intestino grueso debida a una reducción del contenido en colágeno de la pared intestinal, lo que ocasiona que al manipular la canal en el rastro el intestino se rompa contaminando la cavidad abdominal con el contenido fecal.
Las Fumonisinas, son micotoxinas recientemente descubiertas, por lo cual su estudio no es tan extenso como el de otras micotoxinas. Son producidas por el hongo de Fusarium moniliforme. Algunas evidencias han sugerido que en cerdos puede causar edema pulmonar, otros signos clínicos encontrados son elevado nivel de colesterol en el suero, bajos niveles de lípidos en el hígado, lesiones pancreáticas y degeneración de la membrana intracelular. Estudios realizados en aves han reportado que los pesos del hígado, proventrículo y molleja aumentan, mientras que los del corazón y del bazo disminuyen. La fumonisina B1 es hepatotóxica y nefrotóxica en algunos animales entre los cuales se incluyen ratas, caballos, monos, conejos y cerdos. Esta toxina es identificada como la causante de leucoencefalomalacia equina (una enfermedad del cerebro que es fatal). Además se le relaciona con la alta incidencia de cáncer en el esófago en humanos.
Los Tricotecenos son un grupo muy amplio de micotoxinas que producen vómito, diarreas, irritación, hemorragias y necrosis en el tracto digestivo. La Toxina T2 y el Diacetoxiscirpenol (DAS) son las micotoxinas más potentes de este grupo y las lesiones orales
que causan son características. El Deoxinivalenol (DON) o Vomitoxina también pertenece a este grupo y su nombre se deriva del hecho que produce vómito y rechazo de alimento.
La mejor manera de enfrentar un problema de micotoxinas es la prevención, es decir se requiere tener un grano de buena calidad y evitar así que grano contaminado llegue a las instalaciones de almacenamiento. Además se debe tener un programa adecuado de manejo de granos para disminuir la posibilidad de que el grano y el alimento lleguen a contaminarse. Sin embargo muchas veces estas medidas de prevención son insuficientes y a esto se debe que la FAO (Bhat y Vasanthi 1999) estime que gran parte de los granos del mundo se encuentran contaminados con micotoxinas. Por consiguiente la industria ha buscado diversas formas para tratar el grano contaminado, entre ellas se puede mencionar el uso de amoniaco o formol, el lavado del grano con solución de carbonato de sodio o solución de monometilamina (Miller y Trenholm 1994). En el caso de las explotaciones pecuarias se han buscado diferentes alternativas para enfrentar problemas de mico-toxicosis. Estas alternativas van desde el retiro del alimento hasta modificaciones en la dieta, tales como un aumento de proteína o de aminoácidos específicos, aumento de grasas insaturadas, incremento de vitaminas (Hoehler y Marquardt 1996) y el uso de algunos antibióticos (Smith et al 1971) o antioxidantes. Se ha reportado que el uso de hasta 25% de alfalfa en la dieta de ratas ayudó a evitar el efecto de la Zearalenona sobre la ganancia de peso (James y Smith 1982). Sin embargo la aplicación de estos procesos en la industria pecuaria resulta poco práctico, por lo que el uso adsorbentes adicionados a la dieta se ha convertido en la alternativa mas viable.
Los adsorbentes son aditivos que atrapan a las micotoxinas en el tracto gastrointestinal evitando que sean absorbidas por el animal. Desde hace varios años, se están utilizando los aluminosilicatos, arcillas y zeolitas como adsorbentes de micotoxinas (Phillips et al 1988, Kubena et al 1990) sin embargo éstos protegen en diversos grados contra el efecto de aflatoxinas pero no contra la toxicidad de la Ocratoxina A (Huff et al 1992) ni contra el efecto estrogénico de la Zearalenona. Por consiguiente una alternativa para enfrentar esta limitante es el uso de un organoaluminosilicato (Lara et al 1999, Lara et al 2000).
Los organoaluminosilicatos son una nueva clase de adsorbentes que presentan excelentes propiedades de adsorción de Zearalenona, de Ocratoxina A, Fumonisina B 1 , y en menor grado de Aflatoxinas y Tricotecenos. Estos adsorbentes se obtienen a través de la modificación de un aluminosilicato mediante la adición de una molécula orgánica que se
adhiere a la superficie. La molécula orgánica confiere al aluminosilicato propiedades organofílicas o no polares que lo hacen capaz de adsorber las toxinas que no adsorben los aluminosilicatos normales.
Hasta el momento no se han usado organoaluminosilicatos como aditivos en los alimentos para evitar los efectos tóxicos de las micotoxinas, ni tampoco se ha usado una combinación de un aluminosilicato con un organoaluminosilicato. Existen algunas patentes americanas que describen aluminosilicatos con diferentes tratamientos para adsorber micotoxinas. La patente USPTO 5149549 (septiembre 1992) presenta una montmorillonita sódica, la patente USPTO 5165946 (Noviembre 1992) describe la adición de algunas sales a un aluminosilicato para mejorar la capacidad de adsorción de micotoxinas, especificamente Aflatoxinas, la patente USPTO 5639492 (junio 1997) presenta el uso de arcillas activadas con ácido para evitar el efecto negativo de las micotoxinas y la patente USPTO 5963623 (agosto 1999) describe el uso de una atapulgita tratada térmicamente. Pero ninguna menciona ni la preparación ni el uso de un organoaluminosilicato en alimentos.
Objetos, usos y ventajas de la presente invención.
Un objeto de la presente invención, es proporcionar un proceso para preparar organoaluminosilicatos mediante la reacción de un aluminosilicato base de una capacidad de intercambio catiónico de ai menos 20 miliequivalentes/100g y un compuesto de la fórmula:
R1 R2 R3 R4 NA
En donde R1 y R3 son cadenas de 1 a 5 átomos de carbono, R4 es una cadena saturada o insaturada lineal o ramificada de 8 a 18 átomos de carbono que puede selectivamente tener un grupo aromático, R4 es un grupo areno con una cadena alifática de 1 a 18 átomos de carbono, N es nitrógeno y A es un anión inorgánico u orgánico.
Otro objeto de la invención es proporcionar un alimento balanceado para animales que evita los efectos nocivos de las micotoxinas.
Aún más, dentro de la invención, se reclama el uso de un organoaluminosilicato para eliminar o reducir substancialmente los efectos tóxicos de las micotoxinas.
Todavía, de acuerdo con la invención se reclama el uso de un organoaluminosiiicato mezclado con un aluminosilicato para agregar a un alimento contaminado con micotoxinas.
Finalmente, la invención se dirige también a un método para preparar un alimento balanceado para animales que evita los problemas de micotoxicosis en animales.
Por medio de la práctica de la invención se mejora la productividad de los anímales, ya sea por ganancia de peso, huevo o leche ya que se mejora substancialmente la salud de los animales, al provocarse la adsorción de las micotoxinas en el tracto gastrointestinal evitando que sean absorbidas por el animal. El organoaluminosilicato se adiciona al alimento contaminado ya sea en forma granular o en polvo, ya sea solo o en combinación con un aluminosilicato normal, para una mejor adsorción de las micotoxinas, que se eliminan conjuntamente a través de las heces.
Descripción detallada de la invención.
Los detalles característicos de esta novedosa invención se muestran claramente en la siguiente descripción y en los dibujos que se acompañan como una ilustración siguiendo los mismos signos de referencia.
La figura 1 presenta la adsorción de Zearalenona por el aluminosilicato base y por el aluminosilicato recubierto por el compuesto orgánico (organoaluminosilicato).
La figura 2, presenta la adsorción de Zearalenona por el organoaluminosilicato utilizado en dosis de 0.1 % en peso del alimento en función de la concentración de la micotoxina en el alimento.
La figura 3, presenta la Isoterma de adsorción de la Zearalenona en el organoaluminosilicato.
La figura 4, presenta la eficiencia de adsorción del organoaluminosilicato para las cinco micotoxinas.
La figura 5, presenta los pesos corporales al inicio y al final del experimento, ganancia de peso y pesos relativos de útero e hígado. Se presenta la medida +/- el error estándar para las 12 ratas de cada grupo.
La figura 6, presenta la Hiperqueratosis en tejidos de vagina y desarrollo folicular en ovarios de las ratas de los diferentes grupos. Escala: 1 ausente, 2 leve, 3 moderado y 4 severo.
La figura 7 presenta el ciclo estral de las ratas.
La figura 8, presenta los pesos corporales y pesos relativos del útero, hígado y riñones. Se presenta la media +/- el error estándar para las 10 ratas de cada grupo.
La figura 9, presenta la distribución de las ratas en su ciclo estral para los cuatro grupos de 10 ratas. También se presenta la actividad estrogénica correspondiente.
La figura 10 presenta la distribución de probabilidad del efecto estrogénico endógeno, mediante la distribución binomial.
La figura 11 , presenta el peso corporal de los pollos al final del experimento. Se presenta la media +/- el error estándar. No existe diferencia significativa entre los grupos 1 , 3 y 4 y
La figura 12, presenta la fertilidad de la granja en función de las semanas. Se indican las semanas en que se inició el problema de contaminación con Zearalenona y Ocratoxina A y en la que se empezó a utilizar el organoaluminosilicato.
La presente invención se fundamenta en el hecho de que la modificación de la superficie de los aluminosilicatos mediante un tratamiento dado puede ser utilizada para aumentar su capacidad de adsorción de micotoxinas. El tratamiento a seguir depende de lo que se pretende lograr, pero generalmente con él se manipulan dos características principales de la superficie que son el carácter hidrofílico y el carácter hidrofóbico u organofílico (Lara et al 1998). Si la superficie es hidrofílica se tiene una mejor interacción con moléculas polares y por el contrario, la interacción con compuestos no polares es mejor si la superficie es organofílica. Los aluminosilicatos no tratados y los tratados con procesos inorgánicos presentan propiedades hidrofílicas.
En esta invención la modificación de la superficie se realiza con un compuesto orgánico de tal forma que la superficie se transforme de hidrofílica a organofílica. El compuesto orgánico que se utiliza para la modificación de la superficie puede ocupar parte o todos ios sitios activos de dicha superficie del aluminosilicato, dejando varios grados de hidrofilia y de organofilia. Con este tratamiento se mejora la adsorción de las micotoxinas de baja o intermedia polaridad como son la Zearalenona y la Ocratoxina A y además se obtiene un adsorbente de baja inclusión en el alimento.
La selección del compuesto orgánico depende de la especificidad y eficiencia que se desee obtener en la adsorción de las micotoxinas, pero en general el compuesto orgánico utilizado es del tipo:
R1 R2 R3 R4 NA
donde R1 y R3 son cadenas de 1 a 5 átomos de carbono, R2 es una cadena saturada o insaturada lineal o ramificada de 8 a 18 átomos de carbono que puede tener o no un grupo aromático, R4 es un grupo areno con una cadena alifática de 1 a 18 átomos de carbono, N es nitrógeno y A es un anión inorgánico u orgánico. Con estas variables y conociendo las propiedades de la micotoxina que se desea adsorber se selecciona el compuesto orgánico específico.
El aluminosilicato utilizado puede ser un tectosilicato o un filosilicato o una mezcla de ambos, con la condición de que el material usado tenga una capacidad de intercambio catiónico de al menos 20 miliequivalentes por 100 gramos de material. El compuesto orgánico se utiliza en una proporción del 25% al 200% de la capacidad de intercambio catiónico del aluminosilicato utilizado. Este intervalo del compuesto orgánico permite obtener desde materiales parcialmente organofílicos hasta materiales completamente organofílicos. La reacción se lleva a cabo en medio acuoso con agitación a una temperatura entre 15 y 85°C y con un tiempo de 0.25 a 3 horas. El producto se separa mediante filtración, se seca a una temperatura entre 40 y 150 °C y se granula o se muele a mallas entre 100 y 325.
Mediante este procedimiento se pueden obtener materiales organofílicos y materiales que combinen fracciones no modificadas hidrofílicas con fracciones organofílicas.
El aditivo objeto de esta invención es un adsorbente de baja inclusión que se adiciona a los alimentos contaminados con micotoxinas, especialmente Zearalenona, Ocratoxina A y Fumonisinas, a razón de 0.025% a 0.2% del peso del alimento. En el caso de estar el alimento contaminado con Aflatoxinas, el organoaluminosilicato puede ser complementado con un aluminosilicato en una proporción de 0.2% a 0.5% en peso de alimento. El uso de un organoaluminosilicato con un aluminosilicato permite tener una mayor cobertura contra las micotoxinas no polares y polares presentes en los granos y alimentos.
Enseguida, se presentan pruebas, a título de ejemplos no limitativos, que demuestran el aumento de adsorción de micotoxinas mediante el compuesto de la invención
Ejemplo l.
La siguiente prueba "in vitro" fue realizada para demostrar el aumento de adsorción de un aluminosilicato el cual se recubre con el compuesto orgánico descrito anteriormente. El aluminosilicato base fue modificado mediante el procedimiento de preparación presentado en la sección de descripción y la micotoxina utilizada fue la Zearalenona. La adsorción se lleva a cabo en una solución acida de pepsina para tratar de simular el jugo gástrico.
El ensayo de adsorción fue realizado utilizando una solución estándar de la micotoxina de interés (Zearalenona) con una concentración de alrededor de 200 ppm. De esta solución se toman 0.5 mL y se evaporan bajo gas inerte, se redisuelven en 0.5 mL de alcohol etílico y se adicionan 100 mg del adsorbente a evaluar. Una vez hecho lo anterior se adicionan como medio de contacto 10 mL de una solución de pepsina al 0.2 % en HCI 0.07 N (AOAC Internacional, 971.09) y el tubo se mantiene en agitación constante por 3 horas dentro de una estufa con temperatura controlada a 37 grados centígrados. Se deja enfriar, se centrifuga para separar las fases y se cuantifica la concentración de la micotoxina que permanece en solución por medio de Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC). La adsorción se cuantifica mediante la diferencia entre la concentración al inicio y al final del experimento y se reporta como porcentaje de adsorción respecto a la cantidad inicial. Se realiza este mismo procedimiento analítico utilizando solo los reactivos (testigo sin) y otro que incluya la Zearalenona (testigo con). Con el objetivo de saber si este método puede compararse con lo que realmente sucederá en el tracto gastrointestinal, se repitió el experimento utilizando jugo gástrico de cerdos en lugar de la solución de pepsina. La figura 1 , presenta los resultados obtenidos y en ella se puede observar que el tratamiento de superficie con la molécula orgánica aumenta considerablemente el porcentaje de adsorción de la Zearalenona en ambos medios de contacto con respecto al aluminosilicato no tratado.
Ejemplo 2.
La siguiente prueba "in vitro" fue realizada para conocer la adsorción de Zearalenona por el organoaluminosilicato a diferentes grados de contaminación de Zearalenona en el alimento. El ensayo de adsorción fue realizado como fue mencionado anteriormente solo que en esta ocasión la concentración de la Zearalenona varió de 5.5 a 23 ppm, para dar concentraciones equivalentes en el alimento de 2.8 ppm a 12 ppm. Un punto importante en esta evaluación fue la determinación de la solubilidad de la Zearalenona en el medio de
contacto ya que una falta de solubilidad puede llevar a resultados de adsorción mayores que los reales. Para esto se realizó el procedimiento de redisolución desde una concentración en solución de 5.5 ppm hasta 24 ppm y se evaluó la concentración experimental por HPLC. Se encontraron recuperaciones del 88% al 110%, por lo que se concluyó que, en el medio de contacto a utilizar (0.5 mi de etanol y 10 mi de solución acida de pepsina) la Zearalenona es soluble. La cantidad del organoaluminosilicato utilizado en la prueba fue de 20 mg, para dar un equivalente en el alimento de 1 kg/ton. Los resultados de la evaluación en porcentaje de adsorción se presentan en la figura 2, donde se observa que el organoaluminosilicato presenta adsorciones de 90% o mayores hasta concentraciones de Zearalenona de 12 ppm (12 000 ppb) en el alimento.
Desde un punto de vista de la termodinámica estos datos se pueden presentar mediante la isoterma de adsorción, que es la representación gráfica de la cantidad adsorbida por el organoaluminosilicato en función de la concentración al equilibrio. La isoterma presentada en la figura 3, permite estudiar el funcionamiento fisicoquímico del organoaluminosilicato. En este caso la forma lineal de la isoterma indica que el organoaluminosilicato funciona como una fase orgánica de partición. Esta fase es en composición y funcionamiento como un solvente orgánico, tal como el hexano o el octanol, con la diferencia de que ahora esta fase orgánica está fija en la superficie del aluminosilicato base. Por consiguiente, las micotoxinas pasan por un proceso de partición del medio donde se encuentran hacia el compuesto orgánico del organoaluminosilicato. En otras palabras, el compuesto orgánico del organoaluminosilicato funciona como un solvente inmiscible que extrae las micotoxinas del medio. La eficiencia y la especificidad de la extracción dependen de la molécula orgánica fija en la superficie del aluminosilicato, la cual es seleccionada de acuerdo a la sección de descripción.
Ejemplo 3
Las siguientes pruebas "in vitro" se realizaron para conocer la eficacia del organoaluminosilicato para adsorber 5 de las micotoxinas mas conocidas: Zearalenona, Ocratoxina A, Fumonisina B1 , Toxina T2 y Aflatoxina B 1.
El procedimiento fue el mismo descrito en el ejemplo 1 , solo que al final de la adsorción se le adiciona un paso de desorción, el cual consiste en eliminar la fase liquida y repetir el procedimiento a partir de la adición de la solución de prueba. Se cuantifica la cantidad de
micotoxina que se desprende del absorbente y se determina la desorción. Al porcentaje de adsorción se le resta el porcentaje de desorción y se reporta como eficiencia. El medio de contacto fue una solución acida de pepsina excepto en el caso de la Toxina T2 que fue agua, ya que el ácido afectaba el procedimiento. La evaluación se hizo por triplicado y la figura 4 presenta la media de los resultados obtenidos para las 5 micotoxinas evaluadas. En esta tabla se observa que el organoaluminosilicato tiene una eficacia muy alta en la remoción de Zearalenona, Ocratoxina A y Fumonisina B1, pero es ligeramente menor en Toxina T2 y Aflatoxina B1. Con excepción de la Aflatoxina B1, donde la eficiencia de adsorción es menor, en las otras micotoxinas la eficiencia de adsorción del organoaluminosilicato es mayor que la adsorción de los aluminosilicatos no tratados orgánicamente.
Ejemplo 4.
Para evaluar la eficacia del organoaluminosilicato en la reducción del efecto estrogénico de la Zearalenona en animales, se llevó a cabo un experimento "in vivo" utilizando como modelo ratas prepúberes. Al usar ratas prepúberes se evitan los efectos estrogénicos endógenos. Para el experimento se utilizaron 48 ratas Wistar hembras al destete, las cuales después de ser pesadas se alojaron en jaulas individuales y se distribuyeron en 4 grupos de 12 ratas cada uno mediante un arreglo factorial 2X2. El grupo 1 fue el grupo control que consumió alimento libre de Zearalenona, el grupo 2 fue el grupo intoxicado con Zearalenona cuya concentración en el alimento fue de 20 ppm, el grupo 3 fue el grupo de desafío que consumió alimento contaminado con 20 ppm de Zearalenona y en el cual se utilizó el organoaluminosilicato a razón de 0.2 % en peso, el grupo 4 fue el de inocuidad donde se incluyo al alimento el organoaluminosilicato a razón 0.2% en peso. El tratamiento se mantuvo durante 11 días, siendo los animales alimentados individualmente con la misma cantidad diaria y a la misma hora. El agua se proporcionó a libre acceso. Al final de este periodo las ratas fueron pesadas y sacrificadas. Los úteros e hígados fueron separados y pesados. También se tomaron muestras de tejido de vagina y de ovario para su inspección a nivel histológico.
La figura 5, presenta los resultados macroscópicos de hígados y úteros, así como los pesos iniciales y finales de las ratas y la ganancia de peso. En la ganancia de peso no se observa una diferencia significativa entre los grupos, aunque los grupos 3 y 4, que consumieron el organoaluminosilicato presentaron una diferencia aritmética positiva en la ganancia de peso. Se observó que la Zearalenona ocasionó un ligero aumento en el peso relativo de los hígados
de los animales del grupo 2, que desapareció en el grupo 3 por el uso del organoaluminosilicato. En lo que respecta a los úteros, no se observó una diferencia significativa en el peso relativo.
Para estudiar el efecto estrogénico se examinó el tejido de la vagina de cada rata. La evaluación se realizó considerando el grado de hiperqueratosis observado en el tejido. También se observó el grado de desarrollo folicular en los ovarios. La escala que se utilizó para la comparación entre los grupos fue de 1 a 4, con 1 cuando la hiperqueratosis en el tejido de vagina o el desarrollo folicular estuvieron ausentes, 2 para leve, 3 para moderado y 4 cuando se observó una hiperqueratosis severa o un desarrollo folicular severo. La figura 6 presenta estos resultados.
En la figura 6 se observa que el grupo que consumió el alimento contaminado con
Zearalenona presentó una hiperqueratosis moderada, mientras que en los otros grupos estuvo casi ausente. Una observación similar se puede hacer en el desarrollo folicular, aunque en este caso la diferencia fue menor. Estos resultados muestran que el organoaluminosilicato evitó el efecto estrogénico de la Zearalenona en las ratas prepúberes.
Ejemplo 5.
En otro experimento se evaluó el organoaluminosilicato como tratamiento para evitar la toxicidad de la Zearalenona en ratas maduras.
El experimento fue realizado con 40 ratas Wistar hembras, las cuales se mantuvieron por 7 días con una alimentación libre de Zearalenona para su adaptación. Al final de este periodo, las ratas se distribuyeron en un arreglo factorial 2X2, formándose cuatro grupos de 10 ratas cada uno. Las ratas fueron pesadas al inicio y al final del periodo de alimentación con la micotoxina. La concentración de Zearalenona en el alimento fue fijada a 0 y 10 ppm. El organoaluminosilicato fue también adicionado al alimento a las dosis de 0 y 2 g/kg. El grupo 1 fue el control con ratas alimentadas con 0 ppm de Zearalenona y 0 g/kg. del adsorbente, el grupo contaminado con Zearalenona y sin organoaluminosilicato fue el 2, el grupo 3 fue
alimentado con Zearalenona y 2 g/kg. del adsorbente y finalmente el grupo 4 fue el de inocuidad con 2 g/kg. del organoaluminosilicato. Las ratas fueron alimentadas diariamente y el consumo de agua fue libre. El experimento se mantuvo por 6 días, después de los cuales las ratas fueron sacrificadas. El útero, el hígado y los riñones fueron separados para ser pesados y estudiados histológicamente.
La figura 8, presenta los resultados de peso corporal de las ratas al inicio y final del experimento y la ganancia de peso. También se presentan los pesos relativos al peso corporal final del útero, hígado y riñones. En esta tabla se observa que no se presentan diferencias macroscópicas en los animales para este nivel de contaminación con Zearalenona. Las ganancias de peso fueron del mismo orden de magnitud para los cuatro grupos. Esto implica que a este nivel de contaminación (10 ppm), la Zearalenona no afecta la ganancia de peso de las ratas. El peso del útero no se vio afectado, y esto debido principalmente a que las ratas utilizadas en este experimento fueron ratas maduras con un ciclo estral ya establecido. No se observó ningún efecto macroscópico ni microscópico considerable sobre hígado y riñones, lo cual era de esperarse ya que la Zearalenona es una toxina cuyo órgano blanco es el sistema reproductor.
El examen histológico de los tejidos mostró cambios en el sistema reproductor. La observación permitió ubicar a todas las ratas dentro de su ciclo estral. La figura 9 muestra los resultados. De esta tabla se puede observar que en las ratas del grupo 2 se presentó un efecto estrogénico alto en el 70% de ellas. Este efecto estrogénico se manifestó en una dilatación quistica de las glándulas endometriales del útero, en una mayor cantidad de folículos maduros en los ovarios y por la presencia de un epitelio queratinizado en la vagina. En los otros grupos el efecto no fue tan marcado, presentándose en el 20%, 30% y 20% para los grupos 1 , 3 y 4 respectivamente. Comparando el efecto estrogénico en el grupo 3 con el observado en los grupos control, 1 , e inocuidad, 4, se ve que estos tres grupos se comportan similarmente. Sólo en el grupo 2, que fue el grupo que consumió alimento contaminado con Zearalenona y sin adsorbente se observó un efecto que indujo a los animales a ubicarse cerca del estro y de presentar en el sistema reproductor características estrogénicas.
Es importante remarcar que la probabilidad de encontrar a la mayor parte de los animales cerca del estro es muy baja. Por consiguiente, el que el 70% de las ratas del grupo 2 se encontraran con características estrogénicas se debió a un agente exógeno, en este caso la
Zearalenona. Esto se corrobora estudiando el ciclo estral de la rata y aplicando una distribución binomial. El ciclo estral de la rata tiene una duración de 110 horas distribuidas como se indica en la figura 7.
Se tiene una concentración elevada de estrógenos en Proestro y Estro, lo que corresponde a 24 horas. Por consiguiente si se utiliza una distribución binomial considerando el efecto estrogénico como éxito (24 horas) y el efecto no estrogénico como falla (86 h) se tiene una probabilidad de efecto estrogénico en la distribución de p = 24/110 = 0.218. Con este valor de p y el número de ratas por grupo, n = 10, se puede calcular la probabilidad de encontrar las ratas en proestro o estro usando la ecuación de distribución binomial:
P(χ) = (nχ)px(i -P)"-X
Así, la probabilidad de que de un grupo de 10 ratas 7 de ellas se encuentren en proestro o estro es de 0.0013, valor que es muy bajo. La figura 10, muestra una gráfica de la distribución de probabilidad del efecto estrogénico en las ratas donde se ve claramente que el número de animales con mayor probabilidad de un efecto estrogénico endógeno es de 2, pero de 0 a 4 se consideraría como posible. Por consiguiente en este experimento el adsorbente evitó el efecto estrogénico de la Zearalenona en ratas maduras. Las ratas que consumieron Zearalenona sin adsorbente tuvieron un efecto estrogénico exógeno que se salió de la normalidad. El uso del organoaluminosilicato en la dieta contaminada con Zearalenona evitó el efecto exógeno y solo se observaron los efectos estrogénicos normales de un ciclo estral. Los resultados de peso corporal del grupo 4 mostraron que el adsorbente es, además, inocuo cuando no hay contaminación con Zearalenona.
Ejemplo 6.
Para mostrar que el aditivo objeto de la presente invención es un adsorbente de baja inclusión se realizó un experimento comparativo con un aluminosilicato hidrofílico. El experimento se realizó en pollo de engorda contra Aflatoxinas utilizando las dosis altas de ambos adsorbentes, 0.2% del organoaluminosilicato y 0.5% del aluminosilicato.
Se utilizaron 48 pollos de engorda de 1 día de edad que se dividieron en 4 grupos, de 12 pollos cada uno, identificados como 1 control, 2 contaminado con Aflatoxinas, 3 contaminado con Aflatoxinas y 0.5% del aluminosilicato hidrofílico y 4 contaminado con Aflatoxinas y 0.2% del organoaluminosilicato. El alimento fue elaborado con base en sorgo- soya y se verificó que estuviera libre de contaminación natural de micotoxinas. El alimento para los grupos 2, 3 y 4 fue contaminado con Aflatoxina B1: 2,700 ppb (mg/t) ; Aflatoxina B2: 200 ppb; Aflatoxina Gl. 1,100 ppb; Aflatoxinas G2: 45 ppb; Acido Ciclopiazónico 450 ppb y Esterigmatocistina 10 ppb. Los pollos se mantuvieran con acceso libre de alimento y agua durante 23 días, después de los cuales fueron pesados y sacrificados para su estudio.
La figura 11 presenta los resultados en peso corporal al final del experimento. Se puede observar que el consumo de alimento contaminado con Aflatoxinas redujo el peso corporal con respecto al control y que el uso de ambos adsorbentes lo recuperó. Aunque el peso del grupo que consumió el aluminosilicato hidrofílico es el mayor aritméticamente, la diferencia con el grupo control y con el grupo del organoaluminosilicato no es significativa. Por consiguiente se observa que la protección que ofrece el 0.2% del organoaluminosilicato es adecuada, un 95% del peso del control, a pesar de que su eficiencia de adsorción para Aflatoxinas es menor que la de un aluminosilicato. Es claro que en el caso de una intoxicación con Aflatoxinas, la selección del adsorbente favorece a un aluminosilicato.
Ejemplo 7.
Con el objetivo de conocer la eficacia del producto en campo, se evaluó éste en un problema de baja fertilidad en una granja porcina. El alimento estaba contaminado con 300 ppb de Zearalenona y 10 ppb de Ocratoxina A, lo que produjo un problema severo de repeticiones y abortos. Considerando la gravedad del problema se decidió introducir el organoaluminosilicato a todo el alimento a razón de 0.2% en peso del alimento y estudiar el efecto en la fertilidad. Los datos se presentan de manera gráfica en la figura 12, donde se indican con líneas el inicio del problema y la respuesta con la introducción del organoaluminosilicato. La fertilidad en porcentaje está calculada como 1 menos la fracción de repeticiones sobre montas.
En la figura 12 se observa que la fertilidad disminuye bruscamente y presenta grandes fluctuaciones a partir de la semana 44, que es cuando inicia el problema. Se ve claramente que
hay semanas en que aparentemente se recupera la fertilidad pero en las siguientes vuelve a disminuir. Con la introducción del organoaluminosilicato, en la semana 4 del siguiente año, ya no se presentan las fluctuaciones y la fertilidad se mantiene alta. Antes del problema se tenia una fertilidad promedio de 94.4%, cuando se presentó el problema de grano contaminado la fertilidad disminuyó en promedio a 79.4% y cuando se usó el organoaluminosilicato la fertilidad llegó al 99.0%. Con este resultado se comprueba que el organoaluminosilicato evita los problemas que la Zearalenona ocasiona en la reproducción.
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