WO2002005944A1 - Procede d'encapsulation sous forme de micro-capsules de fines particules solides - Google Patents

Procede d'encapsulation sous forme de micro-capsules de fines particules solides Download PDF

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WO2002005944A1
WO2002005944A1 PCT/FR2001/002350 FR0102350W WO0205944A1 WO 2002005944 A1 WO2002005944 A1 WO 2002005944A1 FR 0102350 W FR0102350 W FR 0102350W WO 0205944 A1 WO0205944 A1 WO 0205944A1
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Michel Perrut
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Separex
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J13/00—Colloid chemistry, e.g. the production of colloidal materials or their solutions, not otherwise provided for; Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/02—Making microcapsules or microballoons
    • B01J13/04—Making microcapsules or microballoons by physical processes, e.g. drying, spraying
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1682—Processes
    • A61K9/1694—Processes resulting in granules or microspheres of the matrix type containing more than 5% of excipient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5089—Processes

Definitions

  • the present invention relates to an encapsulation process in the form of microcapsules of fine solid particles such as in particular proteins. It also relates to the micro-capsules obtained according to such a process.
  • microcapsules when their diameter is less than approximately 100 ⁇ m, when the active agent must be protected from the environment during its conservation and / or its use. Such microcapsules are thus used in reprographic inks, in many cosmetic and dermatological preparations, and in certain pharmaceutical products.
  • the pharmaceutical industry but also the cosmetics industry, requires new dosage forms in order to improve the service rendered by certain molecules of therapeutic or dermatological interest.
  • it is looking for ways to achieve effective protection of certain molecules which would be destroyed as soon as they are absorbed by the digestive enzymes, or which would not be stable when stored in the presence oxygen or air humidity, or light.
  • Micro-capsules respond well to this need.
  • micro-spheres or micro-capsules the core of which consists of an active agent formed of proteins of therapeutic interest within an excipient, due to the large fragility of these proteins.
  • proteins are complex and fragile buildings whose biological activity is closely linked to their three-dimensional conformation which can be easily affected by the environment of the molecule, which has the effect of causing destruction generally irreversible of its biological activity.
  • Such fragility is particularly great for many proteins of high therapeutic interest whose production is beginning to be implemented according to new biotechnologies, but whose therapeutic implementation is proving to be extremely delicate.
  • the object of the present invention is precisely to describe a process for obtaining microcapsules with heart-shell structure or with matrix structure otherwise called microspheres, and more particularly of microcapsules making it possible in particular to include proteins in the within an excipient.
  • SAS supercritical, or the anti-solvent process called either SAS, SEDS, PCA or ASES, which consists in spraying a solution of a product to be atomized in an organic or aqueous solvent in a stream of fluid in supercritical state .
  • ASES high pressure
  • the anti-solvent process inevitably involves the use of at least one organic solvent or co-solvent. This results in a certain number of drawbacks and in particular significant problems of recovery of the solvent and purification of the microcapsules obtained. This process also has a major drawback, namely that of not being usable for carrying out the encapsulation of fragile bio-molecules, such as in particular proteins, insofar as most of these are irreversibly denatured on contact. of an organic solvent.
  • Another method consists in carrying out the coacervation of the coating agent initially dissolved in an organic solvent within which the particles to be coated are kept in dispersion, said coacervation being caused by an effect anti-solvent caused by the dissolution of a supercritical fluid or a liquefied gas in said organic solvent.
  • the capsules obtained are recovered after complete extraction of the organic solvent by a stream of supercritical fluid or liquefied gas, then decompression of the container in which the encapsulation was carried out. This process therefore also has the drawback of requiring the use of an organic solvent within which the particles of active agent will be dispersed.
  • patent application WO-98/15348 describes the application of the previous concept to the manufacture of microcapsules consisting of particles of an active agent encapsulated in a polymer, using a supercritical fluid which, by dissolving in the polymer, liquefies it at a temperature below the melting temperature of the polymer and allows the setting suspension of the particles of the active agent within this saturated liquid phase itself in supercritical fluid, which suspension is then expanded at atmospheric pressure with the formation of microcapsules due to the solidification of the polymer around the particles of active agent .
  • this process uses carbon dioxide at supercritical pressure and that the temperature for processing the mixture in the first container is generally close to the melting or glass transition temperature of the polymer. It is easily understood that such a method cannot be used to encapsulate fragile particles such as in particular proteins.
  • the object of the present invention is to provide a method for making microcapsules made up of particles of an active agent with a diameter generally less than 20 ⁇ m, and often less than 10 ⁇ m, dispersed within a coating agent, these microcapsules having an adjustable mean diameter which is preferably between a value minimum equal to 2 to 3 times the average diameter of the encapsulated particles and a maximum value equal to approximately 200 ⁇ m, and allowing in particular to include proteins within an excipient.
  • the present invention thus has for an object method for encapsulation 1 in the form of microcapsules of fine solid particles, characterized in that it comprises the steps of:
  • the present invention is particularly intended for encapsulating very fine solid particles with a size of less than 20 ⁇ m and most often less than 10 ⁇ m in order to obtain microcapsules intended for preparations for therapeutic use in human or veterinary pharmacy , cosmetic or phytosanitary.
  • an aqueous or organic solvent can be added to the coating agent.
  • the gaseous fluid can entrain the solvent and the total elimination of this can be obtained by means of a “stripping” of the microcapsules by a fluid brought to a supercritical pressure.
  • the particles can be suspended at a temperature of the order of 50 ° C to 60 ° C and at a pressure of the order of 5 Mpa to 6 Mpa and the pressure during collection will be close of atmospheric pressure.
  • the present invention also relates to the microcapsules obtained according to the process of the invention.
  • the particles may consist of an active agent of food, pharmaceutical, cosmetic, agrochemical or veterinary interest. These particles may in particular consist of a protein associated or not with a stabilizing agent.
  • This invention is advantageous in that it makes it possible to use a wide range of coating agents and not only polymers, and, even more surprisingly, that the fluid can be dissolved in quantity significant in the suspension of active agent dispersed in the coating agent at a pressure significantly lower than its critical pressure.
  • Figure 1 is a schematic view showing the principle of implementation of the method according to the invention.
  • Figure 2 is a curve showing the release kinetics of an active agent enclosed in a coating agent when the microcapsule is placed in water. It represents, as a function of time, the percentage of active agent which has dissolved in water relative to its quantity present in the particles.
  • FIG. 1 a device for implementing the method according to the invention.
  • This device comprises an enclosure 1, the bottom 2 of which is conical and inside which is mounted for rotation about a vertical axis, a stirrer 3.
  • the enclosure 1 is provided with an inlet 5 and a lower axial outlet 7 which is in communication with a nozzle spray 9 arranged in the upper part of a collecting container 11.
  • this collecting container will be of the cyclonic type and will comprise, for this purpose, a cylindrical tube 12 creating an upper annular zone in which the gas flow charged with particles will be allowed to tangentially.
  • the collecting container 11 comprises an extraction orifice 13 disposed in the bottom thereof through which the microspheres produced will be extracted.
  • the method according to the invention is implemented as described below.
  • the enclosure 1 contains a light phase consisting essentially of the fluid at subcritical pressure within which the coating agent and the active agent are almost insoluble, and a heterogeneous heavy phase which consists of a suspension of the active agent particles within the coating agent saturated with fluid.
  • This heavy phase is extracted through the orifice 7 and admitted, through the spray nozzle 9, into the collecting container 11, which is maintained at a pressure close to atmospheric pressure, which subjects this heavy phase to a abrupt decompression which allows the spray into fine droplets which are strongly cooled by the degassing of the fluid brought back at low pressure, so that they solidify in the form of microcapsules.
  • Such an implementation can advantageously be carried out periodically.
  • the coating agent can be placed in the liquid phase at a temperature below the degradation temperature of the active agent, it is possible, in another particularly advantageous embodiment of the invention, to suspend the the active agent in a coating agent which has been previously melted.
  • the suspension thus produced and the fluid at subcritical pressure are introduced continuously into the enclosure 1 and the heavy phase obtained is drawn off to bring it continuously within the enclosure 1, while maintaining constant the amount of heavy phase present in it.
  • a small amount of organic solvent is used to put the coating agent in the liquid phase at a temperature below its melting temperature, either at atmospheric pressure or when it is saturated with fluid at subcritical pressure.
  • Such an embodiment is particularly advantageous when the active agent is very sensitive to temperature, which is particularly the case for proteins.
  • organic solvents preferably very volatile, non or not very toxic, such as ethanol, n-propanol, isopropanol, acetone or ethyl acetate.
  • other alcohols such as methanol, ketones or esters, or even light hydrocarbons or halocarbons having between 3 and 8 carbon atoms.
  • microcapsules thus obtained contain very low contents of residual solvent, in particular for the reason that the gaseous phase resulting from the decompression of the heavy phase entails almost all of this solvent, and all the more so as 'it has a greater volatility.
  • this organic solvent content must be reduced to minute levels, it will be possible without particular difficulty, to extract the residual solvent by subjecting the microcapsules to a brief treatment (so-called “stripping” extraction) by a stream of fluid brought to supercritical pressure, taking care however to maintain the temperature of this fluid below the melting temperature of the coating agent at the pressure considered.
  • a brief treatment so-called “stripping” extraction
  • the equipment used to carry out the examples presented below is of pilot size. It used carbon dioxide as a subcritical pressure fluid, with an operating pressure of 8 MPa and a range of temperature ranging from 0 ° C to 150 "C.
  • the pressure vessel 1 had a total volume of 4 liters, and was fitted with an anchor-type agitator 3 driven by an electric motor with variable speed between 100 and 800 revolutions per
  • This enclosure 1 consisted of a container terminated by a conical bottom with an angle of 45 ° and a diameter of 0.10 m, with a double jacket traversed by a heat-transfer fluid making it possible to maintain the temperature of the assembly at the desired value.
  • the collecting container 11 consisted of a cylindrical cyclone with a diameter of 0.20 m and a height of 1 m, the atomizing nozzle had an orifice with a diameter of 300 ⁇ m and was placed at the top of the container with a tangential orientation inducing a movement of rotation with the gas flow generated in the annular space included between the external wall of the cyclone and the internal cylinder 12 with a diameter of 0.16 m and 0.40 m high.
  • EXAMPLE 1 In the equipment thus described, very fine particles of L-ascorbic acid, which were obtained by an anti-solvent process, and whose mean diameter by mass is 2.3 ⁇ m, are encapsulated in an agent of lipid texture conventionally used in the food industry, consisting of hydrogenated vegetable oil, and marketed by the cios Industrielle des Oléagineux under the code GV 60, the fusion of which takes place at atmospheric pressure between 58 ° and 61 ° C.
  • an agent of lipid texture conventionally used in the food industry, consisting of hydrogenated vegetable oil, and marketed by the cios Industrielle des Oléagineux under the code GV 60, the fusion of which takes place at atmospheric pressure between 58 ° and 61 ° C.
  • the suspension is produced at atmospheric pressure at 62 ° C by stirring 2 kg of a mixture comprising 1,800 kg GV60 and 0.200 kg of L-ascorbic acid for 15 minutes in enclosure 1, the jacket of which is traversed by water at 60 ° C. and the agitator is rotated at 200 revolutions per minute. Carbon dioxide is then introduced at 60 ° C until the pressure is stabilized at 6 MPa. After 20 minutes of stirring, to achieve perfect balancing, the enclosure 1 is placed in communication with the nozzle 9 and the heavy phase present in the enclosure 1 is sprayed into the collecting container 11. During this phase, the pressure is maintained by the arrival of fluid in one enclosure and one stirring is also maintained. After 10 • inutes, 0.320 kg of white powder is collected, the analysis of the characteristics of which leads to the following results: - Particle size distribution between 5 ⁇ m and 19 ⁇ m with an average mass diameter of 12 ⁇ m;
  • composition of the particles obtained after dissolution of the coating agent in heptane and of the vitamin in water, by HPLC on a C18 silica column with UV detection (254nm): 9.5% mass of L acid - ascorbic.
  • Example 1 The test carried out in example 1 is reproduced under slightly different conditions. This time the temperature in enclosure 1 is maintained at 50 ° C only, so that this temperature is insufficient to obtain a liquid phase even in the presence of the fluid at 6 Mpa. 0.360 kg of pure ethanol was therefore added, prior to its introduction, to the coating agent and 2.160 kg of this mixture is introduced into enclosure 1. All the other parameters were kept equal, moreover, to those used in Example 1, and 0.338 kg of powder was obtained, the analysis of the characteristics of which led to results very close to those obtained on the powder described in Example 1:
  • Average composition of the particles obtained by HPLC 9.7% by mass of L-ascorbic acid.
  • Example 2 The test carried out in Example 2 is reproduced under almost identical conditions, with the difference that the organic solvent added to the coating agent is acetone and not ethanol. 0.360 kg of pure acetone was therefore added, prior to its introduction, to the coating agent, and 2.160 kg of this mixture was therefore introduced into enclosure 1. All the other parameters were kept equal to those elsewhere. used in Example 2, and 0.332 kg of powder were obtained, the analysis of the characteristics of which led to results very close to those obtained for the powders described in Examples 1 and 2:
  • Example 2 The test carried out in Example 2 is reproduced under the same conditions using another coating agent, namely a silicone wax of the AMS-C30 type from Dow Corning, commonly used as an excipient in cosmetic products.
  • the temperature in enclosure 1 is maintained at 50 ° C, and the pressure at 6 Mpa. 0.600 kg of pure ethanol was added before its introduction to the coating agent, and 2.400 kg of this mixture was therefore introduced into enclosure 1. All the other parameters were kept equal, moreover, to those used for Example 2, and 0.319 kg of powder were obtained, the analysis of the characteristics of which led to results very close to those obtained on the powder described in Example 1:
  • Example 1 The test carried out in Example 1 is reproduced under almost identical conditions except that the active agent consists of fine albumin particles obtained from egg, also called ovalbumin, with a particle size centered on 5 ⁇ m. 1.800 kg of GV60 coating agent and 0.180 kg of albumin were therefore introduced into enclosure 1. All the other parameters were maintained equal to those used in Example 1, in particular the temperature was maintained at 60 "C and the pressure at 6 MPa in the enclosure 1. 0.310 kg of powder was obtained, of which 1 • analysis of the characteristics led to results very close to those obtained on the powder described in Example 1:
  • Example 6 The test carried out in Example 5 is reproduced under almost identical conditions with the difference that the agent active consists of fine particles of a protein called lactase with a particle size centered on 6 ⁇ m. 1.800 kg of GV60 coating agent and 0.180 kg of lactase were therefore introduced into enclosure 1. All the other parameters were kept equal to those of Example 5, in particular the temperature was kept at 60 °. C and the pressure at 6MPa. 0.305 kg of powder was obtained, the analysis of the characteristics of which led to results very close to those obtained on the powder described in 1 •
  • Example 1 Example 1:
  • Measurements relating to the biological activity of the protein were carried out according to the protocol generally used for measuring the enzymatic activity of lactases:
  • the reaction implemented is the hydrolysis of 1 O-nitrophenyl-galactopyranoside (ONPG) in O-nitrophenol and D-galactose, the production of O-nitrophenol being followed by spectrophotometry at 420 nm.
  • the activity of the starting lactase was found to be equal to 542,000 units / gram (+ 15,000) and the activity of the lactase after encapsulation to 454,000 units / gram ( ⁇ 28,000), ie a loss of activity of about 16%.
  • Measurements relating to the dissolution of the protein in physiological saline were also carried out at 37 ° C. with monitoring of the concentration in water by UV spectrophotometry.
  • the release curve of the protein as a function of time is of the same type as that shown in FIG. 2, showing that the protein was effectively encapsulated within the coating agent without immediate release effect during contacting with the aqueous phase. On the contrary, there was a very regular progressive release of the protein for 8 hours.
  • Example 6 The test carried out in Example 6 is reproduced under almost identical conditions with the same active agent and the same excipient, the temperature being maintained at 50 ° C and the pressure at 6 Mpa in enclosure 1. But, as described in Example 2, there were introduced into enclosure 1 both 1,800 kg of coating agent GV60 and 0.420 kg of ethanol, as well as 0.180 kg of lactase. 0.320 kg of powder was obtained, the analysis of the characteristics of which leads to results very close to those obtained on the powder described in Example 1:

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'encapsulation sous forme de micro-capsules de fines particules solides. Ce procédé est caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à constituer une suspension de ces particules au sein d'un liquide constitué au moins d'un agent de revêtement en contact intime avec un fluide à une pression inférieure à sa pression critique, de façon à provoquer la saturation de ladite suspension en ce fluide, pulvériser la suspension ainsi saturée en fluide à travers des moyens de détente, et collecter les microcapsules dans le flux gazeux résultant de la décompression.

Description

PROCEDE D'ENCAPSULATION SOUS FORME DE MICRO-CAPSULES DE FINES PARTICULES SOLIDES
La présente invention concerne un procédé d'encapsulation sous forme de micro-capsules de fines particules solides telles que notamment des protéines. Elle concerne également les micro-capsules obtenues suivant un tel procédé.
On sait que de nombreuses industries utilisent des solides sous forme pulvérulente dont certains se présentent sous la forme de particules complexes, ou capsules, comprenant un « coeur » en une certaine matière, ou agent actif, et un revêtement ou « écorce » en une autre matière. On utilise ce genre de capsules, appelées aussi micro- capsules lorsque leur diamètre est inférieur à 100 μm environ, quand l'agent actif doit être protégé de 1 ' environnement lors de sa conservation et/ou de sa mise en oeuvre. De telles micro-capsules sont ainsi utilisées dans les encres de reprographie, dans de nombreuses préparations cosmétiques et dermatologiques, et dans certains produits pharmaceutiques.
L'industrie pharmaceutique, mais également l'industrie des cosmétiques, requiert en effet de nouvelles formes galéniques afin d'améliorer le service rendu par certaines molécules d'intérêt thérapeutique ou dermatologique. En particulier, elle recherche les moyens de réaliser une protection efficace de certaines molécules qui seraient détruites dès leur absorption par les enzymes digestifs, ou qui ne seraient pas stables à la conservation en présence de l'oxygène ou de l'humidité de l'air, ou de la lumière. Les micro-capsules répondent bien à ce besoin.
De même, il est parfois intéressant d'obtenir une dissolution lente au sein des tissus ou des fluides biologiques tels le sang ou la lymphe. Pour ce faire, il est nécessaire de disperser les particules d'agent actif au sein d'un revêtement adapté permettant une diffusion appropriée de cet agent actif à l'endroit souhaité. On utilisera alors préférentiellement un autre type de micro- capsules dites à structure matricielle, appelées parfois micro-sphères pour les distinguer du type précédent, constituées d'un mélange aussi homogène que possible des particules d'agent actif au sein de l'agent de revêtement ; idéalement, l'agent actif est littéralement dissous au sein de l'' agent de revêtement.
L ' intérêt de ces structures est tel que de nombreux procédés d'obtention ont été décrits et sont, pour certains, en exploitation industrielle. Toutefois, on notera qu'il est particulièrement difficile de fabriquer de telles micro-sphères ou micro-capsules dont le coeur est constitué d'un agent actif formé de protéines d'intérêt thérapeutique au sein d'un excipient, en raison de la grande fragilité de ces protéines.
En effet, on sait que la dénaturation des protéines est irréversible lorsqu'elles sont portées à une température trop élevée, ou lorsqu'elles sont mises en contact soit avec un, milieu organique, soit avec un milieu aqueux dont le pH est hors de leur zone de stabilité, soit avec certains fluides portés à haute pression comme le dioxyde de carbone. On sait, en effet, qu'à la différence des produits chimiques ou biologiques classiques, les protéines sont des édifices complexes et fragiles dont 1 ' activité biologique est étroitement liée à leur conformation tridimensionelle qui peut être facilement affectée par l'environnement de la molécule, ce qui a pour effet d'entraîner une destruction généralement irréversible de son activité biologique. Une telle fragilité est particulièrement grande pour de nombreuses protéines de haut intérêt thérapeutique dont la production commence à être mise en oeuvre selon les nouvelles biotechnologies, mais dont la mise en oeuvre thérapeutique s ' avère extrêmement dé1icate.
L'objet de la présente invention est précisément de décrire un procédé d'obtention de micro-capsules à structure coeur-écorce ou à structure matricielle autrement nommées micro-sphères, et plus particulièrement de micro- capules permettant notamment d'inclure des protéines au sein d'un excipient.
On sait par ailleurs d'après de nombreuses publications scientifiques et brevets, que l'on peut obtenir des micro-sphères ou des micro-particules complexes et très fines (d'une granulométrie généralement comprise entre 1 et lOμm, et des nano-particules d'une granulométrie généralement comprise entre 0,1 et lμm) constituées de mélanges de différentes morphologies d'un agent actif et d'un excipient en utilisant des procédés mettant en oeuvre des fluides supercritiques tels que notamment le dioxyde de carbone. On connaît ainsi le procédé dénommé « RESS » consistant à détendre très rapidement à basse pression une solution d'un produit à atomiser dans un fluide supercritique, ou le procédé anti-solvant dénommé soit SAS, soit SEDS, soit PCA, soit ASES, qui consiste à pulvériser une solution d'un produit à atomiser dans un solvant organique ou aqueux au sein d'un courant de fluide en état supercritique. Ces procédés permettent d'obtenir une poudre formée de particules très fines dispersées au sein d'un courant gazeux à faible pression (procédé RESS) ou à pression élevée (procédé SAS).
En raison de son principe même le procédé anti- solvant implique, de façon incontournable, l'utilisation d'au moins un solvant ou co-solvant organique. Il en résulte un certain nombre d' inconvénients et notamment des problèmes importants de récupération du solvant et de purification des micro-capsules obtenues. Ce procédé présente également un inconvénient majeur, à savoir celui de n'être pas utilisable pour réaliser 1 ' encapsulâ ion de bio-molécules fragiles, telles que notamment les protéines, dans la mesure où la plupart de celles-ci sont irréversiblement dénaturées au contact d'un solvant organique.
Un autre procédé, décrit dans le brevet FR-2 753 639, consiste à réaliser la coacervation de 1 ' agent de revêtement initialement dissous dans un solvant organique au sein duquel sont maintenues en dispersion les particules à revêtir, ladite coacervation étant provoquée par un effet anti-solvant causé par la dissolution d'un fluide supercritique ou d'un gaz liquéfié dans ledit solvant organique. La récupération des capsules obtenues est effectuée après extraction complète du solvant organique par un courant de fluide supercritique ou de gaz liquéfié, puis décompression du récipient dans lequel a été effectuée 1 'encapsulation. Ce procédé présente donc également l'inconvénient de nécessiter la mise en oeuvre d'un solvant organique au sein duquel les particules d'agent actif seront dispersées.
On connaît par le brevet européen EP-A-0 744 99 un procédé développé selon un concept dénommé PGSS (en anglais « Particle from gas-saturated solutions ») et qui consiste à dissoudre un fluide compressible dans une substance à pulvériser jusqu'à la formation d'une solution saturée en fluide, puis à décomprimer cette solution de telle façon que, d'une part elle soit pulvérisée en fines gouttelettes, et, d'autre part, le refroidissement résultant de cette décompression induise une solidification de la substance initiale sous forme de fines particules solides. Ce procédé décrit également la production de micro-sphères constituées d'un mélange homogène de deux ou plusieurs composés qui sont initialement mélangés sous forme d'une solution homogène. On comprend qu'un tel procédé ne peut être utilisé pour la micro-encapsulation de produits tels que les protéines dans la mesure où il impose que ces protéines mélangées à leurs agents de stabilisation soient mises en solution au sein de l'excipient liquéfié.
De façon très voisine, la demande de brevet WO- 98/15348 décrit l'application du concept précédent à la fabrication de micro-capsules constituées de particules d'un agent actif encapsulées dans un polymère, en utilisant un fluide supercritique qui, en se dissolvant dans le polymère, le liquéfie à une température inférieure à la température de fusion du polymère et permet la mise en suspension des particules de 1 ' agent actif au sein de cette phase liquide saturée elle-même en fluide supercritique, laquelle suspension est ensuite détendue à pression atmosphérique avec formation de micro-capsules du fait de la solidification du polymère autour des particules d'agent actif.
On connaît également par le brevet US-A-5.399.597 un procédé de production de peinture en poudre selon lequel on réalise, dans un premier récipient agité mécaniquement, un mélange comprenant un polymère, un agent de reticulation et éventuellement d'autres composants entrant dans la composition habituelle d'une peinture (pigments, charges) avec du dioxyde de carbone à l'état supercritique, ce mélange étant porté à une température et une pression adéquates afin que l'on obtienne après détente partielle ou totale de ce mélange dans un second récipient maintenu à une pression nettement inférieure à celle du premier, une poudre solide constituée d'un mélange intime des différents constituants solides initiaux. Ces particules ont donc une structure voisine de celle des micro-sphères définies ci- dessus. On notera que ce procédé utilise du dioxyde de carbone à pression supercritique et que la température de mise en oeuvre du mélange dans le premier récipient est généralement voisine de la température de fusion ou de transition vitreuse du polymère. On comprend aisément qu'un tel procédé ne peut être utilisé pour réaliser 1 ' encapsulation de particules fragiles telles que notamment des protéines.
La présente invention a pour but de proposer un procédé permettant d'élaborer des micro-capsules constituées de particules d'un agent actif d'un diamètre généralement inférieur à 20 μm, et souvent inférieur à 10 μm, dispersées au sein d'un agent de revêtement, ces microcapsules ayant un diamètre moyen ajustable qui est compris de préférence entre une valeur minimale égale à 2 à 3 fois le diamètre moyen des particules encapsulées et une valeur maximale égale à 200 μm environ, et permettant notamment d'inclure des protéines au sein d'un excipient.
La présente invention a ainsi pour objet un procédé d1 encapsulation sous forme de micro-capsules de fines particules solides, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à :
- constituer, dans une enceinte, une suspension de ces particules au sein d'un liquide constitué au moins d'un agent de revêtement en contact intime avec un fluide à une pression inférieure à sa pression critique, de façon à provoquer la saturation de ladite suspension en ce fluide,
- pulvériser la suspension ainsi saturée en fluide à travers des moyens de détente, - collecter les micro-capsules dans le flux gazeux résultant de la décompression.
La présente invention est particulièrement destinée à encapsuler des particules solides très fines d'une taille inférieure à 20 μm et le plus souvent inférieure à 10 μm en vue d'obtenir des micro-capsules destinées à des préparations à usage thérapeutique en pharmacie humaine ou vétérinaire, cosmétique ou phytosanitaire.
Dans une variante de mise en oeuvre de 1 • invention lors de la première étape, un solvant aqueux ou organique peut être ajouté à l'agent de revêtement. Dans un tel mode de mise en oeuvre le fluide gazeux peut entraîner le solvant et 1 ' élimination totale de celui-ci pourra être obtenue au moyen d'un « strippage » des micro-capsules par un fluide porté à une pression supercritique. Suivant 1 ' invention on pourra assurer une alimentation en continu du fluide à pression sous-critique et de la suspension de 1 ' agent actif dans 1 ' agent de revêtement à l'intérieur d'une enceinte ainsi qu'un soutirage en continu des produits contenus dans cette enceinte qui sont admis dans une buse d' atomisation disposée dans un récipient collecteur maintenu à une pression voisine de la pression atmosphérique.
On pourra notamment utiliser, en tant qu'agent de revêtement, un lipide ou un mélange de lipides. Par ailleurs la mise en suspension des particules pourra être effectuée à une température de l'ordre de 50 °C à 60 °C et à une pression, de l'ordre de 5 Mpa à 6 Mpa et la pression lors de la collecte sera voisine de la pression atmosphérique . La présente invention a également pour objet les micro-capsules obtenues suivant le procédé de l'invention. Les particules pourront être constituées d'un agent actif d'intérêt alimentaire, pharmaceutique, cosmétique, agrochimique ou vétérinaire. Ces particules pourront notamment être constituées d'une protéine associée ou non à un agent de stabilisation.
Cette invention est intéressante en ce qu'elle permet d'utiliser une large gamme d'agents de revêtement et non seulement des polymères, et, de façon encore plus surprenante, que le fluide peut être dissous en quantité importante dans la suspension d'agent actif dispersé dans 1 ' agent de revêtement à une pression significativement inférieure à sa pression critique.
Il en résulte que, même dans ces conditions de pression sous-critiques, les températures de fusion des polymères et d'autres composés dans lesquels le fluide est soluble de façon importante comme la plupart des lipides, vont être significativement abaissées, permettant donc la mise en oeuvre du procédé selon 1 ' invention à des températures inférieures aux températures de dégradation de la plupart des agents actifs. Cette invention est particulièrement avantageuse lorsque l'on souhaite encapsuler des protéines dans un excipient.
De plus, à la différence de ce qui a été décrit dans le brevet EP-A-0 744 992, il est possible de pulvériser un mélange non homogène constitué de particules en suspension et non seulement une solution homogène, et ce, même lorsque la pression du fluide est inférieure à sa pression critique. Il en résulte que le procédé selon l'invention permet 1 ' obtention de micro-capsules dans des conditions beaucoup plus faciles et moins coûteuses à mettre en oeuvre dans un grand nombre d'applications faisant appel à une plus large variété d'agents actifs et d'agents de revêtement. Ces avantages sont tout particulièrement intéressants en ce qui concerne 1 ' encapsulation de protéines qui se présentent sous la forme d'une poudre, généralement obtenue par lyophilisation d'une solution de protéines en présence d'agents de stabilisation. Ces protéines, mélangées avec ces agents de stabilisation, ne peuvent en effet être mises en solution au sein de l'excipient liquéfié, comme l'exige le procédé décrit dans le brevet EP-A-0 744 992 précité. De plus, le procédé selon l'invention, outre qu'il permet d'utiliser une très large gamme d'excipients et non pas seulement un polymère, permet de mettre en contact la protéine avec un fluide à pression nettement inférieure à celle employée selon le procédé décrit dans la demande de brevet WO- 98/15348 précitée, diminuant ainsi considérablement le risque de dénaturation de la protéine, surtout lorsque le fluide utilisé est le dioxyde de carbone.
On décrira ci-après à titre d'exemples non limitatifs, diverses formes d'exécution de la présente invention, en référence au dessin annexé sur lequel :
La figure 1 est une vue schématique représentant le principe de mise en oeuvre du procédé suivant l'invention.
La figure 2 est une courbe montrant la cinétique de relargage d'un agent actif renfermé dans un agent de revêtement lorsque la micro-capsule est mise dans l'eau. Elle représente, en fonction du temps, le pourcentage d'agent actif qui s'est dissous dans l'eau par rapport à sa quantité présente dans les particules.
On a représenté sur la figure 1 un dispositif permettant de mettre en oeuvre le procédé suivant l'invention. Ce dispositif comprend une enceinte 1 dont le fond 2 est conique et à 1 ' intérieur de laquelle est monté à rotation, autour d'un axe vertical, un agitateur 3. L'enceinte 1 est pourvue d'une entrée 5 et d'une sortie axiale inférieure 7 qui est en communication avec une buse de pulvérisation 9 disposée en partie supérieure d'un récipient collecteur 11. Préférentiellement, ce récipient collecteur sera de type cyclonique et comportera, à cet effet, un tube cylindrique 12 créant une zone supérieure annulaire dans laquelle le flux gazeux chargé en particules sera admis de façon tangentielle. Le récipient collecteur 11 comporte un orifice d'extraction 13 disposé dans le fond de celui-ci par lequel les micro-sphères réalisées seront extraites. De façon générale le procédé suivant 1 ' invention est mis en oeuvre ainsi que décrit ci-après.
Les particules d'agent actif ainsi que l'agent de revêtement sont admis par l'orifice d'entrée 5 dans l'enceinte 1, puis un fluide à pression sous-critique est alors introduit dans 1 ' enceinte 1 à la température et à la pression désirée et 1 ' agitateur 3 est activé de façon à réaliser une suspension des particules d'agent actif au sein de 1 • agent de revêtement saturé en fluide . Après un laps de temps suffisant pour que l'équilibre soit atteint, 1 ' enceinte 1 contient une phase légère constituée essentiellement du fluide à pression sous-critique au sein duquel 1 ' agent de revêtement et 1 ' agent actif sont quasiment insolubles, et une phase lourde hétérogène qui est constituée d'une suspension des particules d'agent actif au sein de 1 ' agent de revêtement saturé en fluide.
On extrait cette phase lourde par 1 ' orifice 7 et on l'admet, à travers la buse de pulvérisation 9, dans le récipient collecteur 11, qui est maintenu à une pression voisine de la pression atmosphérique, ce qui soumet cette phase lourde à une brusque décompression qui permet de la pulvériser en fines gouttelettes qui sont fortement refroidies par le dégazage du fluide ramené à basse pression, si bien qu'elles se solidifient sous la forme de micro-capsules. Une telle mise en oeuvre peut être avantageusement conduite de façon périodique.
Lorsque 1 ' agent, de revêtement peut être mis en phase liquide à une température inférieure à la température de dégradation de l'agent actif, on peut, dans un autre mode de mise en oeuvre particulièrement intéressant de l'invention, assurer la suspension de l'agent actif dans un agent de revêtement qui a été préalablement fondu. On introduit en continu dans 1 ' enceinte 1 la suspension ainsi réalisée et le fluide à pression sous-critique et l'on soutire la phase lourde obtenue pour l'amener, en continu, au sein de l'enceinte 1, tout en maintenant constante la quantité de phase lourde présente dans celle-ci.
Dans une variante intéressante de l'invention, on utilise une faible, quantité de solvant organique pour mettre en phase liquide 1 ' agent de revêtement à une température inférieure à sa température de fusion, soit à pression atmosphérique, soit lorsqu'il est saturé de fluide à pression sous-critique.
Un tel mode de mise en oeuvre est particulièrement intéressant lorsque 1 ' agent actif est très sensible à la température, ce qui est notamment le cas des protéines. Dans les applications pharmaceutiques ou cosmétiques, on utilisera préférentiellement des solvants organiques, de préférence très volatils, non ou peu toxiques, comme l'éthanol, le n-propanol, 1 ' isopropanol, l'acétone ou l'acétate d'éthyle. Dans d'autres applications, on pourra également utiliser d'autres alcools, comme le méthanol, les cétones ou les esters, ou encore des hydrocarbures légers ou des halocarbones ayant entre 3 et 8 atomes de carbone. On a vérifié que les micro-capsules ainsi obtenues contenaient des teneurs très faibles en solvant résiduel, notamment pour la raison que la phase gazeuse résultant de la décompression de la phase lourde entraîne la quasi totalité de ce solvant, et ce d'autant plus qu'il présente un plus grand caractère volatil.
Dans les cas où, pour certaines applications spécifiques, cette teneur en solvant organique doit être réduite à des niveaux infimes, on pourra sans difficulté particulière, extraire le solvant résiduel en soumettant les micro-capsules à un traitement bref (extraction dite « strippage ») par un courant de fluide porté à pression supercritique, en prenant bien soin toutefois de maintenir la température de ce fluide en-dessous de la température de fusion de l'agent de revêtement à la pression considérée. Des exemples de mise en oeuvre sont présentés ci-après afin d'illustrer de ' façon non limitative le procédé selon 1 'invention.
Dans tous les cas, on a utilisé le même équipement d' encapsulation de particules et de collecte des micro- capsules dont le schéma de principe est représenté sur la figure 1.
L'équipement utilisé pour réaliser les exemples présentés ci-après est d'une taille pilote. Il a utilisé le dioxyde de carbone comme fluide à pression sous-critique, avec une pression de service de 8 MPa et une gamme de température allant de 0°C à 150 "C. L'enceinte sous pression 1 avait un volume total de 4 litres, et était dotée d'un agitateur 3 de type ancre mû par un moteur électrique à vitesse variable entre 100 et 800 tours par minute. Cette enceinte 1 était constituée d'un récipient terminé par un fond conique d'un angle de 45° et d'un diamètre de 0,10 m, avec une double-enveloppe parcourue par un fluide caloporteur permettant de maintenir la température de l'ensemble à la valeur désirée. Le récipient collecteur 11 était constitué d'un cyclone cylindrique d'un diamètre de 0,20 m et d'une hauteur de 1 m, la buse d ' atomisation avait un orifice d'un diamètre de 300μm et était placée à la partie supérieure du récipient avec une orientation tangentielle induisant un mouvement de rotation au flux gazeux généré dans 1 ' espace annulaire compris entre la paroi extérieure du cyclone et le cylindre intérieur 12 d'un diamètre de 0,16 m et d'une hauteur de 0,40 m.
EXEMPLE 1 Dans l'équipement ainsi décrit, on encapsule des particules très fines d'acide L-ascorbique, qui ont été obtenues par un procédé anti-solvant, et dont le diamètre moyen en masse est de 2,3 μm, dans un agent de texture lipidique classiquement utilisé en industrie alimentaire, constitué d'huile végétale hydrogénée, et commercialisé par la Société Industrielle des Oléagineux sous le code GV 60 dont la fusion intervient à pression atmosphérique entre 58° et 61°C.
La suspension est réalisée à pression atmosphérique à 62 °C par agitation de 2 kg d'un mélange comprenant 1,800 kg de GV60 et 0,200 kg d'acide L-ascorbique pendant 15 minutes dans l'enceinte 1 dont la double enveloppe est parcourue par de l'eau à 60 °C et l'agitateur est mis en rotation à 200 tours par minute. On introduit alors du dioxyde de carbone à 60 °C jusqu'à ce que la pression soit stabilisée à 6 MPa. Après 20 minutes d'agitation, pour réaliser un parfait équilibrage, on met en communication l'enceinte 1 avec la buse 9 et la phase lourde présente dans 1 * enceinte 1 est pulvérisée dans le récipient collecteur 11. Pendant cette phase, la pression est maintenue par l'arrivée de fluide dans 1 ' enceinte et 1 ' agitation est également maintenue. Après 10 • inutes, il est collecté 0,320 kg de poudre blanche dont 1 ' analyse des caractéristiques conduit au résultats suivants : - Répartition granulométrique comprise entre 5 μm et 19 μm avec un diamètre moyen en masse de 12 μm ;
- Composition moyenne des particules, obtenue après dissolution de l'agent de revêtement dans l'heptane et de la vitamine dans l'eau, par HPLC sur colonne silice C18 avec détection UV (254nm) : 9,5% masse d'acide L- ascorbique .
EXEMPLE 2
L ' essai réalisé, à 1 ' exemple 1 est reproduit dans des conditions légèrement différentes . Cette fois-ci la température dans l'enceinte 1 est maintenue à 50 °C seulement, si bien que cette température est insuffisante pour obtenir une phase liquide même en présence du fluide à 6 Mpa. On a donc ajouté, préalablement à son introduction, 0,360 kg d'éthanol pur à l'agent de revêtement et on a introduit 2,160 kg de ce mélange dans l'enceinte 1. Tous les autres paramètres ont été maintenus égaux par ailleurs à ceux utilisés à l'exemple 1, et l'on a obtenu 0,338 kg de poudre dont 1 ' analyse des caractéristiques a conduit à des résultats très voisins de ceux obtenus sur la poudre décrite à 1 ' exemple 1 :
- Répartition granulométrique comprise entre 12 μm et 38 μm avec un diamètre moyen en masse de 27 μm ;
Composition moyenne des particules obtenue par HPLC : 9,7% en masse d'acide L-ascorbique.
De plus, l'analyse par chromatographie en phase gazeuse de la teneur en éthanol des particules composant cette poudre conduit à une teneur de 0,4% en masse.
Des mesures relatives à la mise en solution de 1 ' acide L-ascorbique dans l'eau ont été conduites à 20 °C. La courbe présentée sur la figure 2 représente, en fonction du temps exprimé en heures, le pourcentage massique %m d'acide qui s ' est dissous dans 1 ' eau par rapport à la quantité totale d'acide présent dans les particules. On constate que 1 ' acide a été effectivement encapsulé au sein de 1 ' agent de revêtement sans effet de relargage immédiat lors de la mise en contact avec l'eau. Au contraire, on assiste à un relargage progressif très régulier de l'acide pendant 36 heures. Pour certaines utilisations des micro-capsules ainsi obtenues, il peut ' être important que le pourcentage d'éthanol restant soit infime. On effectue alors un « strippage » c ' est-à-dire un traitement d' extraction à l'aide d'un fluide à pression supercritique notamment constitué de dioxyde de carbone. Ainsi un échantillon constitué de 100 g de micro-capsules d'acide L-ascorbique obtenues suivant 1 ' exemple 2 a été disposé dans un autoclave de 0,5 litre au sein duquel on a fait percoler, pendant une heure, une masse de 5 kg de dioxyde de carbone pur en état supercritique à une pression de 10 MPa et à une température de 33 °C. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse a montré que la teneur en éthanol résiduel présent dans les micro-capsules est passée de 0,4% en masse à 0,02% en masse sans que pour autant la caractérisation des particules qui a été effectuée après traitement n'ait fait apparaître de modification de leur structure.
EXEMPLE 3
L'essai réalisé à l'exemple 2 est reproduit dans des conditions quasi identiques, à la différence que le solvant organique ajouté à l'agent de revêtement est de l'acétone et non de l' éthanol. On a donc ajouté, préalablement à son introduction, 0,360 kg d'acétone pure à l'agent de revêtement et on a donc introduit 2,160 kg de ce mélange dans l'enceinte 1. Tous les autres paramètres ont été maintenus égaux par ailleurs à ceux utilisés à l'exemple 2, et l'on a obtenu 0,332 kg de poudre dont l'analyse des caractéristiques a conduit à des résultats très voisins de ceux obtenus pour les poudres décrites aux exemples 1 et 2 :
- Répartition granulométrique comprise entre 11 μm et 29 μm avec un diamètre moyen en masse de 21 μm ;
- Composition moyenne des particules, obtenue par HPLC : 9,8% en masse d'acide L-ascorbique. L'analyse par chromatographie en phase gazeuse de la teneur en acétone des particules composant cette poudre a conduit à une teneur de 0,12 % en masse, soit 1200 ppm.
EXEMPLE 4
L'essai réalisé à l'exemple 2 est reproduit dans les mêmes conditions en utilisant un autre agent de revêtement, à savoir une cire silicone de type AMS-C30 de Dow Corning, couramment utilisée comme excipient dans les produits cosmétiques. La température dans l'enceinte 1 est maintenue à 50 °C, et la pression à 6 Mpa. On a ajouté préalablement à son introduction, 0,600 kg d'éthanol pur à l'agent de revêtement et on a donc introduit 2,400 kg de ce mélange dans l'enceinte 1. Tous les autres paramètres ont été maintenus égaux par ailleurs à ceux utilisés à l'exemple 2, et l'on a obtenu 0,319 kg de poudre dont l'analyse des caractéristiques a conduit à des résultats très voisins de ceux obtenus sur la poudre décrite à 1 ' exemple 1 :
- Répartition granulométrique comprise entre 25 μm et 42 μm avec un diamètre moyen en masse de 32 μm ;
- Composition moyenne des particules : 9,2 % en masse d ' acide L-ascorbique .
De plus , 1 ' analyse par chromatographie en phase gazeuse de la teneur en éthanol des particules composant cette poudre conduit à une teneur de 0,5% en masse.
EXEMPLE 5
L ' essai réalisé à 1 ' exemple 1 est reproduit dans des conditions quasi identiques sauf que 1 ' agent actif est constitué de particules fines d * albumine obtenues à partir d'oeuf appelée également ovalbumine, d'une granulométrie centrée sur 5 μm. On a donc introduit 1,800 kg d'agent de revêtement GV60 et 0,180 kg d'albumine dans l'enceinte 1. Tous les autres paramètres ont été maintenus égaux par ailleurs à ceux utilisés à l'exemple 1, en particulier la température a été maintenue à 60 "C et la pression à 6 MPa dans l'enceinte 1. On a obtenu 0,310 kg de poudre dont 1 • analyse des caractéristiques a conduit à des résultats très voisins de ceux obtenus sur la poudre décrite à 1 ' exemple 1 :
- Répartition granulométrique comprise entre 4 μm et 22 μm avec un diamètre moyen en masse de 10 μm ;
- Composition moyenne des particules obtenue après dissolution de l'excipient dans l'heptane et de la protéine dans du sérum physiologique par spectrophotometrie UV (280 nm) : 10,2% en masse d'albumine.
Des mesures relatives à la mise en solution de 1' albumine dans le sérum physiologique ont été conduites également à 37 °C avec suivi de la concentration dans l'eau par spectrophotometrie UV. La courbe de relargage de 1 ' albumine en fonction du temps est du même type que celle présentée sur la figure 2, montrant que l'albumine a été effectivement encapsulée au sein de 1 ' agent de revêtement sans effet de relargage immédiat lors de la mise en contact avec la phase aqueuse. Au contraire, on assiste à un relargage progressif très régulier de 1 • albumine pendant 48 heures.
EXEMPLE 6 L'essai réalisé à l'exemple 5 est reproduit dans des conditions quasi identiques à la différence que 1 ' agent actif est constitué de particules fines d'une protéine appelée lactase d'une granulométrie centrée sur 6 μm. On a donc introduit 1,800 kg d'agent de revêtement GV60 et 0,180 kg de lactase dans l'enceinte 1. Tous les autres paramètres ont été maintenus égaux par ailleurs à ceux de l'exemple 5 en particulier la température a été maintenue à 60 °C et la pression à 6MPa. On a obtenu 0,305 kg de poudre dont 1 ' analyse des caractéristiques a conduit à des résultats très voisins de ceux obtenus sur la poudre décrite à 1 • exemple 1 :
- Répartition granulométrique comprise entre 10 μm et 24 μm avec un diamètre moyen en masse de 18 μ ;
- Composition moyenne des particules obtenue après dissolution de l'excipient dans l'heptane et de la protéine dans du sérum physiologique par spectrophotometrie UV (280 nm) : 9,4% en masse de protéine.
Des mesures relatives à l'activité biologique de la protéine ont été conduites selon le protocole généralement utilisé pour la mesure de l'activité enzymatique des lactases : La réaction mise en oeuvre est l'hydrolyse de 1 'O-nitrophenyl-galactopyranoside (ONPG) en O-nitrophénol et D-galactose, la production de 1 ' O-nitrophénol étant suivie par spectrophotometrie à 420 nm. L'activité de la lactase de départ a été trouvée égale à 542000 unités/gramme (+ 15 000) et l'activité de la lactase après encapsulation à 454000 unités/grammes (± 28 000), soit une perte d'activité d'environ 16%.
Des mesures relatives à la mise en solution de la protéine dans le sérum physiologique ont été conduites également à 37 °C avec suivi de la concentration dans l'eau par spectrophotometrie UV. La courbe de relargage de la protéine en fonction du temps est du même type que celle représentée sur la figure 2, montrant que la protéine a été effectivement encapsulée au sein de 1 ' agent de revêtement sans effet de relargage immédiat lors de la mise en contact avec la phase aqueuse. Au contraire, on a assisté à un relargage progressif très régulier de la protéine pendant 8 heures .
EXEMPLE 7
L'essai réalisé à l'exemple 6 est reproduit dans des conditions quasi identiques avec le même agent actif et le même excipient, la température étant maintenue à 50 °C et la pression à 6 Mpa dans l'enceinte 1. Mais, comme décrit dans l'exemple 2, on a introduit dans l'enceinte 1 à la fois 1,800 kg d'agent de revêtement GV60 et 0,420 kg d'éthanol, ainsi que 0,180 kg de lactase. On a obtenu 0,320 kg de poudre dont 1 ' analyse des caractéristiques conduit à des résultats très voisins de ceux obtenus sur la poudre décrite à 1 ' exemple 1 :
- Répartition granulométrique comprise entre 28 μm et 62 μm avec un diamètre moyen en masse de 51 μm.
- Composition moyenne des particules obtenue après dissolution de l'excipient dans l'heptane et de la protéine dans du sérum physiologique par spectrophotometrie UV (280 nm) : 9,5% en masse de protéine.
Des mesures relatives à 1 ' activité biologique de la protéine ont été conduites selon le protocole décrit à l'exemple 6. L'activité de la lactase de départ a été trouvée égale à 590000 unités/gramme (+12000) et l'activité de la lactase après encapsulation à 588000 unités/gramme (+15000), soit une perte d'activité négligeable.
De plus, l'analyse par chromatographie en phase gazeuse de la teneur en éthanol des particules composant cette poudre conduit à une teneur de 0,5 % en masse.
La comparaison des résultats obtenus aux exemples 6 et 7 montre que la mise en oeuvre du procédé à pression sous- critique d ' une part n' entraîne pas de denaturation importante de la protéine, à la différence de ce qui est dit dans la littérature lorsque l'on utilise le dioxyde de carbone à pression supercritique et d'autre part que 1 ' éthanol ne contribue pas à la denaturation de la protéine.

Claims

REVENDICATIONS
1.- Procédé d' encapsulation sous forme de micro-capsules de fines particules solides, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à :
- constituer dans une enceinte (1) une suspension de ces particules au sein d'un liquide constitué au moins d'un agent de revêtement en contact intime avec un fluide à une pression inférieure à sa pression critique, de façon à provoquer la saturation de ladite suspension en ce fluide,
- pulvériser la suspension ainsi saturée en fluide à travers des moyens de détente,
- collecter les micro-capsules dans le flux gazeux résultant de la décompression. 2.- Procédé d» encapsulation suivant la revendication 1 caractérisé en ce que, lors de la première étape, un solvant aqueux ou organique est ajouté à l'agent de revêtement.
3.- Procédé suivant la revendication 2 caractérisé en ce que l'on fait entraîner le solvant par le fluide gazeux. .- Procédé suivant 1 ' une des revendications 2 ou 3 caractérisé en ce que 1 ' on effectue un « strippage » des micro-capsules par un fluide porté à une pression supercritique. 5.-Procédé suivant 1 'une des revendications précédentes caractérisé en ce que le fluide à pression sous critique est constitué de dioxyde de carbone.
6. - Procédé suivant 1 ' une des revendications précédentes caractérisé en ce que l'on assure une alimentation en continu du fluide à pression sous-critique et de la suspension de 1 ' agent actif dans 1 ' agent de revêtement à l'intérieur d'une enceinte (1) ainsi qu'un soutirage en continu des produits contenus dans cette enceinte qui sont admis dans une buse d' atomisation (9) disposée dans un récipient collecteur (11) maintenu à une pression voisine de la pression atmosphérique.
7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'on utilise, en tant qu'agent de revêtement, un lipide ou un mélange de lipides. 8.- Procédé suivant l'une des revendications précédentes caractérisé en ce que la mise en suspension des particules est effectuée à une température de l'ordre de 50°C à 60°C et à une pression, de l'ordre de 5 Mpa à 6 Mpa et la pression lors de la collecte est voisine de la pression atmosphérique.
9.- Micro-capsules obtenues suivant le procédé objet de 1 ' une des revendications 1 à 8 caractérisées en ce que les particules sont constituées d'un agent actif d'intérêt alimentaire, pharmaceutique, cosmétique, agrochimique ou vétérinaire.
10.- Micro-capsules obtenues suivant la revendication 9 caractérisées en ce que les particules sont constituées d'une protéine.
11.- Micro-capsules suivant la revendication 10 caractérisées en ce que les protéines sont associées à un agent de stabilisation.
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