WO2002000912A1 - Procede pour traitement avec une enzyme - Google Patents

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WO2002000912A1
WO2002000912A1 PCT/JP2001/002645 JP0102645W WO0200912A1 WO 2002000912 A1 WO2002000912 A1 WO 2002000912A1 JP 0102645 W JP0102645 W JP 0102645W WO 0200912 A1 WO0200912 A1 WO 0200912A1
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reaction
cellulose
cellulase
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Takashi Yamanobe
Kaoru Obuchi
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
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    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/02—Monosaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Definitions

  • the present invention relates to an enzyme treatment method, and more particularly, to an enzyme treatment method characterized in that an enzyme reaction is performed under pressure.
  • Cellulase includes (1) a cellopiohydrolase (avicelase) activity that hydrolyzes the solid and crystalline regions of cellulose into exo-type from the non-reducing end to produce cellobiose; Endoglucanase (CMCase) activity, which hydrolyzes into liposomes and produces various types of cell oligosaccharides, and (3) ⁇ -glucosidase activity, which degrades cellobiose-cellooligosaccharides to glucose. It contains three types of enzymatic activities, and the three types of activity degrade cell mouth into glucose via mouth bioose and mouth mouth oligosaccharides.
  • avicelase Endoglucanase
  • CMCase Endoglucanase
  • ⁇ -glucosidase activity which degrades cellobiose-cellooligosaccharides to glucose. It contains three types of enzymatic activities, and the three types of activity degrade cell mouth into glucose via
  • the conventional decomposition reaction of cellulose using cellulase is carried out under normal pressure at a temperature that does not impair the activity of the enzyme, and the reaction takes time.
  • an object of the present invention is to provide a method for efficiently performing enzymatic decomposition treatment of cellulose using cellulase in a short time.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, by performing enzymatic reactions of various enzymes, including enzymatic decomposition reaction of cellulose by cellulase, under pressure, the substrate can be efficiently used.
  • the inventors have found that an enzymatic reaction product can be obtained by conversion, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to the following inventions (1) to (14).
  • a method for treating an enzyme which comprises reacting cellulose with cellulose to obtain glucose as an enzyme reaction product, wherein the reaction is performed under pressure.
  • cellulase is a cellulase system produced by a bacterium belonging to the genus Acremonium.
  • an enzymatic reaction is carried out under pressure to cause an enzyme to act on a substrate to obtain an enzymatic reaction product
  • the enzymatic reaction is carried out at 0.2 to 1,000 MPa, preferably 10 to 500 MPa, Particularly preferably, the reaction is carried out under a pressure of 100 to 150 MPa.By pressurizing to a pressure in the above range, the enzyme is activated, the stability of the enzyme itself is improved, and the temperature is higher than a normal enzyme reaction temperature.
  • the pressure is higher than the above range, Element is deactivated, and reduced anti ⁇ rate, and when the pressure is lower than the above range, not improved reaction efficiency to a desired extent, which is not preferable.
  • the enzyme used in the present invention is typically, but not limited to, cellulase. Dalcoamylase, tannase, phytase, protease, chitinase
  • various oxidoreductases, transferases, isomerases, removal addition enzymes, and synthetic enzymes can be used in the same manner.
  • the origin of these enzymes may be derived from microorganisms, plants, or animals, and commercially available products may be used. May be used.
  • cellulase any enzyme generally known as cellulase can be used without particular limitation.
  • cellulase produced by bacteria of the genus cre / BOfl / TM, particularly Acremonium sp. can preferably be used.
  • Enzymes whose CMCase activity improves under pressure are, for example, Enzymes produced by the fungus.
  • the mixing ratio between the enzyme produced by the bacterium belonging to the genus ⁇ cre ra / TM and the enzyme whose CMCase activity is improved in a pressurized state in the enzyme composition is determined by the equivalent CMCase activity. For example, it is exemplified to be mixed so that the ratio becomes 7:50 to 50: 7.
  • the substrate on which the enzyme acts is not particularly limited as long as the enzyme catalyzes hydrolysis, oxidation-reduction, transfer, isomerization, removal addition, and synthesis to produce an enzyme reaction product.
  • the enzyme catalyzes hydrolysis, oxidation-reduction, transfer, isomerization, removal addition, and synthesis to produce an enzyme reaction product.
  • cellulose, starch, tannic acid, phytic acid, protein, chitin and the like corresponding to each of the above enzymes.
  • the substrate is cellulose
  • various natural celluloses such as trees, waste wood, paper, and straw can be used.
  • the shape and size of the substrate are not particularly limited, it is preferable to use a substrate processed into a powder, a sheet, or a granule in order to carry out the enzyme reaction efficiently.
  • the mixing ratio of the substrate and the enzyme can be arbitrarily selected in each enzyme reaction.
  • the CMCase activity equivalent to the substrate lg to be decomposed such as filter paper is 0.0005 to 10,000.
  • Enzymes on the order of International Units (IU) can be used.
  • the enzyme treatment according to the present invention can be carried out in a chemical reaction vessel that can withstand normal pressurization in any state such as a batch system, a semi-continuous system, and a continuous system.
  • a chemical reaction vessel that can withstand normal pressurization in any state such as a batch system, a semi-continuous system, and a continuous system.
  • a cellular preparation (trade name: Acremozyme) produced by Acremonium eel lulolyticus as an enzyme is used as an enzyme for FP saccharification activity.
  • the enzymatic degradation reaction of cellulose was performed by using water as a pressure medium in a stainless steel pressure vessel in a thermostatic bath using 0.0078 IU.
  • BR buffer 40 mM Britton-Robinson wide area buffer
  • O.lMPa 60 ° C for 1, 24, 48, 72 hours (normal pressure: The reaction was performed under pressure of Comparative Example 1) and 150 MPa (Example 1).
  • the results are shown in Table 1.
  • the numerical value at each reaction time in Table 1 represents the amount of reducing sugar produced (Mg / ml reaction solution), and the acceleration ratio (%) is the ratio of the amount of reducing sugar produced at 150MPa to the amount of reducing sugar produced at 0.1MPa. It was expressed by.
  • Example 2 An enzymatic decomposition reaction of cellulose was performed in the same manner as in Example 1 except that the reaction and the temperature were changed to 65 ° C. Table 2 shows the results.
  • a cellulase preparation (trade name: Acremozyme) produced by Acremonium ceu / oi / cus was used as an enzyme.
  • a cellulase preparation (product name: CellSoft Ultra) produced by the genus pergi i / s mixed with 0.0188IU as CMCase activity, and pressurized with water as a pressure medium in a stainless steel pressure vessel in a thermostatic bath
  • an enzymatic decomposition reaction of cellulose was performed.
  • Enzyme and substrate were added to 2 ml of 40 mM BR buffer (pH 4.5), and the mixture was added to IMPa (normal pressure: Comparative Example 3) and OMPa (Example 3) at 65 ° C for 1, 8, 24, and 48 hours. Each reaction was performed under pressure. The results are shown in Table 3.
  • Dalcoamylase (manufactured by Seikagaku Corporation) produced by Rhizopus niveus as an enzyme: lmg is dissolved in lml of 40mM B-R buffer (pH 4.5) to prepare an enzyme stock solution.
  • Soluble starch as a substrate was added to the BR buffer to a concentration of 5% (w / v), and dissolved by heating.
  • Table 4 shows the results.
  • the numerical value at each reaction temperature in Table 4 represents the amount of reducing sugar produced ( ⁇ g / ml reaction solution), and the acceleration ratio (%) is the ratio of the amount of reducing sugar produced at 150 MPa to the amount of reducing sugar produced at 0.1 MPa. did.
  • BR buffer 8.9 ml 2% tannic acid aqueous solution lml and the above enzyme stock solution 80 times diluted enzyme solution 100 ⁇ are mixed and mixed at 30 ° C and 55 ° C, O. lMPa (normal pressure: Comparative example 5) and 150MPa (Example 5)
  • the reaction was carried out under pressure and at PH 5.5 for 60 hours each.
  • the enzyme was inactivated by heating in boiling water for 10 minutes. 4 ml of 80% ethanol was added to 1 ml of the reaction solution, the amount of decrease in absorbance at a wavelength of 310 dishes was measured, and the amount of the reaction product was calculated indirectly from the remaining amount of the substrate decomposed by the enzyme reaction.
  • Table 5 shows the results.
  • the numerical values at each reaction temperature in Table 5 represent the absorbance at a wavelength of 310 nm.
  • the acceleration ratio (%) was expressed as the ratio of the absorbance at OMPa to the absorbance at O. lMPa.
  • Table 6 shows the results.
  • the numerical values at each reaction temperature in Table 6 represent the amount of inorganic phosphoric acid (g / ml reaction solution), and the acceleration ratio (%) was represented by the ratio of the amount of inorganic phosphoric acid at 150 MPa to the amount of inorganic phosphoric acid at 0.1 MPa. .
  • Protease preparation “Protease N“ Amano ”” (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) derived from Bacillus subtilis) was dissolved as an enzyme in 10 ml of 40 mM B-R buffer (pH 7.0). And Suspension of Natroth [Nutrose; casein sodium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)] as a substrate is suspended in 40raM BR buffer (PH7.0) to a concentration of 1% (w / v) and Dissolved in
  • Table 7 shows the results.
  • the numerical value at each reaction temperature in Table 7 represents the absorbance at a wavelength of 280 dishes, and the acceleration ratio (%) was represented by the ratio of the absorbance at 150 MPa to the absorbance at 0.1 IMPa.
  • Example 7 0.15 3 5 0 .1 7 9 5 Comparative Example 7 0.1 .1 0 6 0 .0 8 0 0 Acceleration ratio (%) 1 38.8 .2 24.4 (Example 8 and Comparative Example 8)
  • chitinase manufactured by Sigma Chemical Co.
  • Streptomyces griseus was dissolved in 36 ml of 40 mM BR buffer (pH 6.0) to obtain an enzyme solution.
  • 20 mg of chitin was weighed into a 2 ml cuvette as a substrate.
  • Table 8 shows the results.
  • the numerical value at each reaction temperature in Table 8 represents TOC (T0Cmg / ml reaction solution), and the acceleration ratio (%) was represented by the ratio of T0C at 150 MPa to T0C at 0.1 IMPa.
  • an enzyme treatment method capable of efficiently performing an enzyme reaction in a short time.
  • the enzyme is activated by pressurization, the stability of the enzyme itself is improved, and the reaction can be performed at a temperature higher than a normal enzyme reaction temperature.
  • the enzymatic degradation of licellulose according to the present invention makes it possible to effectively treat a large amount of cellulose waste, which is very useful in terms of environmental conservation and effective use of resources.

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Description

明 細書 酵素処理方法 技術分野
本発明は、 酵素処理方法に関し、 詳しくは、 加圧下に酵素反応を行うことを特徴と する、 酵素処理方法に関する。 背景技術
近年、 海洋 '湖沼 ·河川 '土壌などの環境汚染の改善、 及びそれと関連してバイオ マス資源などの環境保全エネルギーの開発が大きな関心となっている。 バイオマス資 源として、 もみがらや木材、 サトウキビなどの植物が利用されるが、 これらに存在す るセルロースゃリダニンが難分解性であるゆえ、 植物の利用を阻む原因となっており 、 これらを効率よく分解する手段が必要である。
セルロースを酵素により分解してダルコースを製造することは公知であリ、 このよ うな酵素は一般にセルラーゼと称されている。 セルラーゼには、 （1)セルロースの固 、結晶領域を非還元末端からェキソ型に加水分解しセロビオースを生成するセロピオ ヒドロラ一ゼ （アビセラ一ゼ） 活性、 （2)セルロースの非結晶領域をエンド型に加水 分解しセル口一ス分子の低分子化と各種のセ口オリゴ糖を生成するエンドグルカナ一 ゼ （CMCase) 活性、 （3)セロビオースゃセロオリゴ糖をグルコースに分解する^—グ ルコシダーゼ活性、 の 3種の酵素活性が含まれており、 この 3種の活性によりセル口 —スはセ口ビオースゃセ口オリゴ糖を経てグルコースにまで分解される。
従来のセルラ一ゼを使用したセルロースの分解反応は、 常圧下に酵素の活性を損な わない温度で行われるものであり、 反応に時間がかかる。 また酵素を安定な状態で作 用させることが困難であることから収率も劣り、 実用レベルに到達するものではなか つた。 発明の開示 上述したように、 環境保全と資源の有効活用の観点から、 セルロース廃棄物の効果 的な処理法や再資源ィヒ法の開発が望まれるところである。
従って、 本発明は、 セルラーゼを使用したセルロースの酵素分解処理を短時間で効 率良く行う方法を提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 セルラ一ゼによるセ ルロースの酵素分解反応をはじめ、 各種酵素による酵素反応を加圧下に行うことによ リ、 基質を効率よく変換して酵素反応生成物を得ることができることを見出し、 本発 明を完成させるに至った。
すなわち、 本発明は、 以下の（1)から（14)の発明に関する。
(1) 基質に酵素を作用させ、 酵素反応生成物を得る酵素反応において、 当該反応を 加圧下に行うことを特徴とする、 酵素処理方法。
(2) 酵素反応を、 0. 2〜l，000MPaの加圧下に行うことを特徴とする、 上記（1)の方法
(3) 酵素反応を、 常圧下での反応温度よりも高温で行うことを特徴とする、 上記（1) 又は (2)の方法。
(4) 酵素が、 セルラ一ゼ、 ダルコアミラーゼ、 タンナ一ゼ、 フイターゼ、 プロテア —ゼ、 及びキチナ一ゼからなる群から選択される、 上記（1)〜（3)いずれかの方法。
(5) 基質の形状を粉末状、 シート状、 又は粒状にすることを特徴とする、 上記（1)〜 (4)いずれかの方法。
(6) セルロースにセルラ一ゼを作用させ、 酵素反応生成物としてグルコースを得る 酵素反応において、 当該反応を加圧下に行うことを特徴とする、 酵素処理方法。
(7) セルラ一ゼが、 アクレモニゥム Ac画 niwi) 属の菌が生産するセルラーゼ系 であること特徴とする、 上記 (6)の方法。
(8) Ac remon i urn属の菌が Ac remon i im sp. Y- 94であることを特徴とする、 上記（7)の 方法。
(9) ^oreTBOfl/ ffl属の菌が生産するセルラ一ゼ系に、 さらにエンドグルカナ一ゼ （ CMCase) 活性が加圧状態で向上する酵素を混合した酵素組成物を使用することを特徴 とする、 上記 (7)の方法。 (10) CMCase活性が加圧状態で向上する酵素が、 ァスペルギルス < spergill ~) 属 の菌が生産する酵素であることを特徴とする、 上記 (9)の方法。
(11) 酵素組成物中の cre^w/™属の菌が生産する酵素と CMCase活性が加圧状態で向 上する酵素との混合比が CMCase活性当量として 7： 50〜50： 7であることを特徴とする、 上記 (9)の方法。
(12) セルロースとセルラ一ゼを 0. 2〜l，000MPaに加圧することを特徴とする、 上記 (6)〜（11)いずれかの方法。
(13) 粉末状、 シート状又は粒状のセルロースを使用することを特徴とする、 上記 (6)〜（ 12)いずれかの方法。
(14) セルロース lgに対して、 CMCase活性当量として 0. 0005〜10，000国際単位（110 のセルラーゼを使用することを特徴とする、 上記 (6)〜（13)いずれかの方法。 以下、 本発明を詳細に説明する。 本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特 許出願 2000- 192105号及び 2000- 281β76号の明細書及び/又は図面に記載される内容を 包含する。 本発明においては、 基質に酵素を作用させ、 酵素反応生成物を得る酵素反応を、 加 圧下に行う。 具体的には、 酵素反応を 0. 2〜l，000MPa、 好ましくは 10〜500MPa、 特に 好ましくは 100〜150MPaの加圧下に行う。 当該範囲の圧力に加圧することにより、 酵 素が活性ィ匕されるとともに、 酵素自体の安定性も向上し、 通常の酵素反応温度よりも 高温での反応が可能となる。 圧力が上記範囲よりも高い場合には、 酵素が失活し、 反 応効率が低下し、 また、 圧力が上記範囲よりも低い場合には、 所望の程度にまで反応 効率が向上せず、 好ましくない。
本発明において使用する酵素としては、 代表的にはセルラ一ゼを挙げることができ るがこれに限定されるわけではなく、 ダルコアミラーゼ、 タンナ一ゼ、 フイタ一ゼ、 プロテア一ゼ、 キチナ一ゼ等の加水分解酵素のほか、 各種の酸化還元酵素、 転移酵素 、 異性化酵素、 除去付加酵素、 合成酵素をも同様に使用することができる。 また、 こ れらの酵素の起源は、 微生物、 植物、 動物由来のいずれであってもよく、 市販品を利 用してもよい。
例えば、 セルラーゼを使用する場合、 一般にセルラ一ゼとして知られた酵素であれ ば特に制限なく使用できるが、 cre/BOfl/™属の菌が生産するセルラ一ゼ系、 特に Acremonium sp. Y-94が生産するセルラーゼ系が好適に使用できる。
また、 上記 rasiw/™属の菌が生産するセルラ一ゼ系に、 CMCase活性が加圧状態で 向上する酵素を混合した酵素組成物を使用すると、 セルロースの酵素分解反応の効率 がー段と向上するので好ましい。 CMCase活性が加圧状態で向上する酵素としては、 例 え
Figure imgf000005_0001
の菌が生産する酵素が挙げられる。
このような酵素混合物を使用する場合には、 酵素組成物中の ^cre ra/™属の菌が生 産する酵素と CMCase活性が加圧状態で向上する酵素との混合比を、 CMCase活性当量と して 7： 50〜50： 7になるように混合とすることが例示される。
本発明において、 酵素を作用させる基質としては、 酵素により加水分解、 酸化還元 、 転移、 異性化、 除去付加、 合成反応を触媒され、 酵素反応生成物を生じるものであ れば、 特に制限はない。 例えば、 上記各酵素に対応してセルロース、 デンプン、 タン ニン酸、 フィチン酸、 タンパク質、 キチン等を挙げることができる。
例えば、 基質がセルロースの場合は、 具体的には、 樹木、 廃木材、 紙、 麦わら等各 種の天然セルロース類を使用することができる。
また、 基質の形状やサイズも特に制限はないが、 酵素反応を効率良く行わせるため には、 粉末状、 シート状又は粒状に加工したものを使用することが好ましい。
基質と酵素の混合割合は、 各酵素反応において任意に選択することができるが、 例 えばセルロースの場合、 濾紙等の分解すべき基質 lgに対して、 CMCase活性当量として 0. 0005〜10，000国際単位 ( IU) 程度の酵素を使用することができる。
また、 本発明による酵素処理は、 通常の加圧に耐える化学反応容器中でバッチ式、 半連続式、 連続式等任意の状態で行うことができる。 - 発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例により本発明をさらに説明するが、 これらは本発明の範囲を何ら限定 するものではない。 (活性測定）
以下の実施例 （比較例） 1〜3では、 酵素活性の測定は、 酵素反応によってセル口一 スが、 pH4. 5、 50°C、 O. lMPa (常圧） の条件下で、 1分間に 1マイクロモルの還元糖 を遊離せしめる酵素量を 1国際単位 ( IU) と定め、 反応終了後加熱失活させた反応上 清液を一部採り、 一定倍率に希釈し、 酵素反応により遊離した'還元糖を Somogyi- Nelson法で定量することによって行った。
(実施例 1及び比較例 1 )
短冊状にカットした Whatman No. 1濾紙 （FP) 約 150mgを基質とし、 酵素としてァク レモニゥム ·セルロリテイクス (Acremonium eel lulolyticus) の生産するセルラ一 ゼ製剤 （商品名：アクレモザィム） を FP糖化活性として 0. 0078IU使用して、 恒温バス 中のステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することによリ、 セルロース の酵素分解反応を行った。
40mM Britton- Robinson広域緩衝液 （以下、 B-R bufferと略す） 2 ml (pH4. 5)に酵素 及び基質を添加し、 60°Cで 1、 24、 48、 72時間、 O. lMPa (常圧：比較例 1 ) と 150MPa (実施例 1 ) に加圧下、 それぞれ反応を行った。
その結果を表 1に示す。 表 1の各反応時間における数値は還元糖の生成量 ( M g/ml 反応液） を表し、 加速比率 （％) は O. lMPaにおける生成還元糖量に対する 150MPaにお ける生成還元糖量の比率で表した。
Figure imgf000006_0001
(実施例 2及び比較例 2、） 反応、温度を 65°Cとした他は、 実施例 1と同様にしてセルロースの酵素分解反応を行 つた。 結果を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000007_0001
(実施例 3及び比較例 3 )
短冊状にカットした Whatman No. 1濾紙 （FP) 約 150mgを基質とし、 酵素として Acremonium ce u/o i/cusの生産するセルラ一ゼ製剤 （商品名：アクレモザィム） を FP糖化活性として 0. 0078IU及び pergi i/s属の生産するセルラ一ゼ製剤 （商品名 ：セルソフトウルトラ） を CMCase活性として 0. 0188IUを混合使用して、 恒温バス中の ステンレス製耐圧容器内で水を圧力媒体として加圧することによリ、 セルロースの酵 素分解反応を行った。
40mM B-R buffer 2ml (pH4. 5)に酵素及び基質を添加し、 65°Cで 1、 8、 24、 48時間、 0. IMPa (常圧：比較例 3 ) と OMPa (実施例 3 ) に加圧下、 それぞれ反応を行った。 その結果を表 3に示す。
表 3
Figure imgf000007_0002
(実施例 4及び比較例 4)
酵素としてリゾプス .二べウス ( hizopus niveus) の生産するダルコアミラーゼ (生化学工業 （株） 製）：lmgを 40mMの B - R buffer(pH4. 5) lmlに溶解し、 酵素原液とし た。 基質として可溶性デンプンを 5 % (w/v)濃度となるように、 B- R bufferに加え、 加温して溶解した。
上記基質溶液 11. 88mlに、 上記酵素原液の 128倍希釈酵素液 120 ^ 1を加えて混合し、 45°C、 55°C；、 65°Cで、 0. IMPa (常圧：比較例 4 ) と 150MPa (実施例 4 ) に加圧下、 pH4. 5にてそれぞれ 24時間反応を行った。 反応終了後、 沸騰水中で酵素を 10分間加熱 失活させた。 反応上清液を適当な倍率に希釈し、 その lmlを用いて Somogyi-Ne lson法 で本上清液中の還元糖量 （反応生成物） を算出した。
結果を表 4に示す。 表 4の各反応温度における数値は還元糖の生成量（ β g/ml反応 液） を表し、 加速比率 （％) は O. lMPaにおける生成還元糖量に対する 150MPaにおける 生成還元糖量の比率で表した。
表 4
Figure imgf000008_0001
(実施例 5及び比較例 5 )
酵素としてァスペルギルス 'オリゼ Aspergillus oryzae) の生産するタンナ一ゼ (和光純薬工業 （株） 製） 5nigを 40 の B- K buffer (pH5. 5) 5mlに溶解し、 酵素原液と した。 基質としてタンニン酸を 2 % (w/v)濃度となるように、 蒸留水に溶解した。
B-R buffer 8. 9ml 2 %タンニン酸水溶液 lmlおよび上記酵素原液の 80倍希釈酵素 液 100 μ ΐを混合し、 30°C、 55°Cで、 O. lMPa (常圧：比較例 5 ) と 150MPa (実施例 5 ) に加圧下、 PH5. 5にてそれぞれ 60時間反応を行った。 反応終了後、 酵素を沸騰水中で 10分間加熱失活させた。 反応液 lmlに 80%エタノール 4mlを加え、 波長 310皿における 吸光度の減少量を測定し、 酵素反応によって分解された基質残存量から間接的に反応 生成物の量を算出した。
結果を表 5に示す。 表 5の各反応温度における数値は波長 310nmにおける吸光度を 表し、 加速比率 （％) は O. lMPaにおける吸光度に対する OMPaにおける吸光度の比率 で表した。
表 5
Figure imgf000009_0001
(実施例 6及び比較例 6 )
酵素として小麦由来のフイタ一ゼ （Sigma Chemicals社製） 20mgを 50πιΜの酢酸緩衝 液 (ρΗ5. 15) 2mlに溶解し、 酵素原液とした。 基質として米由来のフィチン酸 12ナトリ ゥム塩 (Inositol exap osphoric acid dodecasodium salt) ¾: 2 % (w/v)濃度ごな るように、 上記緩衝液に加え溶解した。
上記基質溶液 9.9mlに、 上記酵素原液の 8倍希釈酵素液 100 1を加えて混合し、 55 °C、 65°Cで、 O. lMPa (常圧：比較例 6 ) と 150MPa (実施例 6 ) に加圧下、 pH5. 15にて それぞれ 24時間反応を行った。 反応終了後、 沸騰水中で 10分間酵素を加熱失活させた 。 酵素反応によって遊離した無機リンの定量は Fiske- Subbarrow法に準拠した。 すな わち、 上記反応液 lmlに蒸留水 6.6ml、 2. 5%モリブデン酸アンモニゥム lml、 3 N硫酸 lml、 ァミノナフト一ルスルホン酸（0.5gの 1， 2， 4ァミノナフト一ルスルホン酸に 15% 亜硫酸水素ナトリゥム 195mlと 20%亜硫酸ナトリゥム七水和物 5mlを加え溶解した） 0.4mlを加え、 混合後 30分間静置した後、 波長 750nmにおける吸光度を測定して無機リ ン酸量を算出した。
結果を表 6に示す。 表 6の各反応温度における数値は無機リン酸量 （ g/ml反応液 ) を表し、 加速比率 （％) は O. lMPaにおける無機リン酸量に対する 150MPaにおける無 機リン酸量の比率で表した。 表 6
Figure imgf000010_0001
(実施例 7及び比較例 7)
酵素としてバチルス ·ズブチリス Bacillus subtil is) 由来のプロテア一ゼ製剤 『プロテアーゼ N 「ァマノ」 』 （天野製薬 （株） 製） 10mgを 40mMの B - R buffer (pH7.0)lmlに溶解し、 酵素原液とした。 基質としてナトロ一ス [Nutrose；カゼインナ トリウム （和光純薬 （株） 製） ]を 1 %(w/v)濃度となるように、 40raMの B-R buffer (PH7.0)に懸濁し、 15分間熱湯中で溶解した。
上記基質溶液 9.9mlに、 上記酵素原液の 700倍希釈酵素液 lOO tlを加えて混合し、 55 。C、 70°Cで、 O.lMPa (常圧：比較例 7 ) と 150MPa (実施例 7) に加圧下、 pH7.0にて それぞれ 24時間反応を行った。 反応終了後、 5%三塩化酢酸 （TCA) 3mlを添加して酵 素を失活させた。 反応上清液について波長 280nmにおける吸光度を測定した。
結果を表 7に示す。 表 7の各反応温度における数値は波長 280皿における吸光度を 表し、 加速比率 （％) は 0. IMPaにおける吸光度に対する 150MPaにおける吸光度の比率 で表した。
表 7 反応温度 （'C) 5 5 7 0
実施例 7 0. 1 5 3 5 0. 1 7 9 5 比較例 7 0. 1 1 0 6 0. 0 8 0 0 加速比率 （％) 1 3 8. 8 2 24. 4 (実施例 8及び比較例 8 )
酵素としてストレプトマイセス ·グリセウス Streptomyces griseus 由来のキチ ナ一ゼ （Sigma Chemical社製） 5mgを 40mMの B- R buffer (pH6. 0) 36mlに溶解し、 酵素 溶液とした。 基質として 2ml容量のキュベットに 20mgのキチンを秤量した。
20mgのキチンを含む 2ml容量のキュベットに 2mlの上記酵素溶液を加 て混合し、 30 °C、 60°Cで、 O. lMPa (常圧：比較例 8 ) と 150MPa (実施例 8 ) に加圧下、 pH6. 0にて それぞれ 24時間反応を行った。 反応終了後、 沸騰水中で 10分間酵素を加熱失活させた 。 反応上清液を適当に希釈し、 T0Cアナライザ一 （Total Organi c Carbon analyzer) ¾1里し 7こ。
結果を表 8に示す。 表 8の各反応温度における数値は TOC(T0Cmg/ml反応液） を表し 、 加速比率 （％) は 0. IMPaにおける T0Cに対する 150MPaにおける T0Cの比率で表した。
表 8
Figure imgf000011_0001
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願は、 そのまま参考として本明 細書に取リ入れるものとする。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 酵素反応を短時間に効率的に行うことのできる酵素処理方法が提 供される。 本発明方法においては、 加圧によって酵素が活性ィヒされるとともに、 酵素 自体の安定性も向上し、 通常の酵素反応温度よりも高温での反応が可能となる。 本発 明方法によリセルロースの酵素分解を行うと、 大量に発生するセルロース廃棄物を効 果的に処理することができ、 環境保全と資源の有効活用の面で非常に有用である。

Claims

請求 の範 囲
1. 基質に酵素を作用させ、 酵素反応生成物を得る酵素反応において、 当該反応を加 圧下に行うことを特徴とする、 酵素処理方法。
2. 酵素反応を、 0.2〜l，OOOMPaの加圧下に行うことを特徴とする、 請求項 1に記載 の方法。
3. 酵素反応を、 常圧下での反応温度よりも高温で行うことを特徴とする、 請求項 1 又は 2に記載の方法。
4. 酵素が、 セ>レラ一ゼ、 グルコアミラーゼ、 タンナ一ゼ、 フイタ一ゼ、 プロテア一 ゼ、 及びキチナ一ゼからなる群から選択される、 請求項 1〜3のいずれかに記 載の方法。
5. 基質の形状を粉末状、 シート状、 又は粒状とすることを特徴とする、 請求項 1〜 4のいずれかに記載の方法。
6. セルロースにセルラ一ゼを作用させ、 酵素反応生成物としてグルコースを得る酵 素反応において、 当該反応を加圧下に行うことを特徴とする、 酵素処理方法。
7. セルラ一ゼが、 属の菌が生産するセルラ ゼ系であること特徴とする 、 請求項 6に記載の方法。
8. Ac remon i 属の菌が Ac remon i um sp. Y-94であることを特徴とする請求項 7に記 載の方法。
9. Acremonium の菌が生産するセルラ一ゼ系に、 さらにエンドグルカナ一ゼ （
CMCase) 活性が加圧状態で向上する酵素を混合した酵素組成物を使用すること を特徴とする、 請求項 7に記載の方法。
1 0. CMGase活性がカ卩圧状態で向上する酵素が、 ^pe // ^属の菌が生産する酵素 であることを特徴とする、 請求項 9に記載の方法。
1 1. 酵素組成物中の^cre W3/™属の菌が生産する酵素と CMCase活性が加圧状態で向 上する酵素との混合比が CMCase活性当量として 7:50〜50:7であることを特徴と する、 請求項 9に記載の方法。
1 2. セルロースとセルラーゼを 0.2〜l，000MPaに加圧することを特徴とする、 請求 項 6〜11のいずれかに記載の方法。
1 3 . 粉末状、 シート状又は粒状のセルロースを使用することを特徴とする、 請求項 6〜 12のいずれかに記載の方法。
1 4. セルロース lgに対して、 じ1«^36活性当量として0.0005〜10，000国際単位 （HJ) のセルラ一ゼを使用することを特徴とする、 請求項 6〜13のいずれかに記載の 方法。
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