WO2001098533A2 - Artifizielle genetische markierung mit synthetischer dna - Google Patents

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WO2001098533A2
WO2001098533A2 PCT/EP2001/006198 EP0106198W WO0198533A2 WO 2001098533 A2 WO2001098533 A2 WO 2001098533A2 EP 0106198 W EP0106198 W EP 0106198W WO 0198533 A2 WO0198533 A2 WO 0198533A2
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sequences
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Hubert S. Bernauer
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Bernauer Hubert S
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Definitions

  • the present invention relates to a method for the (simultaneous) detection of one or more nucleic acid (s) introduced foreign into one or more organisms or into one or more cells, wherein the introduced nucleic acid (s) (an) artificial sequence (s) comprises / allow the identification of the introduced nucleic acid (s) and the selective multiplication / allow, including the examination of the organism (s) or the cell (s) for the presence of the artificial sequence (s), and identification if necessary the artificial sequence (s) by means of hybridization with a chip and / or sequencing.
  • the invention also relates to a method for the detection of a nucleic acid introduced foreign into an organism or a cell, the introduced nucleic acid comprising at least one artificial sequence which hybridizes with at least one universal primer under stringent hybridization conditions, which comprises the following steps: (a) amplification the region of the introduced nucleic acid which is (ai) between the at least one artificial sequence and a sequence in the introduced nucleic acid or (aii) between at least two artificial sequences, or the sequences defined in (ai) or (aii) by means of PCR or another amplification method using the at least one universal primer and a primer which hybridizes under stringent hybridization conditions with the sequence in the introduced nucleic acid, or using the at least one universal primer; and (b ') transferring the amplification product or the encoded translation product onto at least one chip on which there are arranged in an ordered pattern receptors which specifically bind the amplification product, a single strand thereof or the encoded translation product, and incubation under conditions which provide detect
  • DNA is a naturally occurring molecule that in nature serves as a linear data carrier.
  • a sequence of four nucleotides, including the bases adenine, guanine, cytosine and thymine, carries the genetic information encoding 20 amino acids in 64 different codon triplets.
  • the DNA also carries structural information at the level of the RNA and the colinear proteins. The type of interaction of the molecules with one another at the functional level is also already defined as information in the DNA.
  • Alien DNA can also be introduced into organisms using genetic engineering methods, which can then be stably inherited in the same way. Such organisms with additional functions are called transgenic or genetically modified organisms (GMOs).
  • GMOs transgenic or genetically modified organisms
  • Foreign DNA in transgenic organisms can consist of natural sequences that are isolated from organisms. Natural sequences are sequence sequences created by evolutionary processes. Artificial DNA sequences can be derived from natural sequences by manipulating the organism, for example by "in vitro" mutagenesis. The reference system also plays a role. A natural DNA sequence from one organism to another, alien organism that is not in this organism in terms of position and / or the sequence occurs, creates an artificial gene sequence in this modified system.
  • a change in the position of a DNA sequence within an organism and also within a species caused by genetic engineering methods is also artificial in a strict definition.
  • the immense number of possible combinations of the four nucleotides in different sequence variants gives rise to sequence spaces that are only partially realized by naturally occurring molecules in the organisms. The development of the genomes with their information content is therefore historical.
  • DNA sequences can therefore also be completely artificial sequence sequences. Artificial sequence sequences are not found in nature and are not the result of evolutionary processes. Up to a certain length, certain DNA sequence sequences also occur in various organisms from a purely statistical point of view.
  • Synthetic DNA can consist both of natural sequence sequences created by evolutionary processes, from these derived, artificially modified sequence variants created by human influence, as well as from completely artificial sequence sequences. Purely artificial DNA sequence sequences can only be produced synthetically, since there are no natural sources for them. Completely synthetic DNA of any information content, if it is stably introduced into organisms, can also be passed on stably and result in genetically modified or modified organisms.
  • Functional, artificial, synthetic sequence sequences can code for partially or completely artificial genes which contain, for example, functional RNAs (for example suppressor RNA or ribozymes), artificial epitopes, affinity-mediating sequences or enzymatic activities.
  • the expression of the function (eg epitope) in target cells could significantly facilitate the detection of the assigned artificial gene label.
  • a transgenic organism equipped with natural or artificial synthetic sequences can carry both functional transgenes as well as mere sequence markings, the information content of which does not have to flow into functional RNA molecules and protein.
  • a GMO is usually defined by the new gene function, which gives it a functional transgene in the cell (e.g. herbicide resistance).
  • An artificial genetic marker is a functionally neutral additional piece of DNA, the sequence of which does not play a biologically active role. It is nothing more than an artificial genetic marker, regardless of the type of detection reaction.
  • GMO genetically modified organism
  • the present invention relates to a method for the (simultaneous) detection of one or more nucleic acid (s) introduced externally into one or more organisms or into one or more cells, wherein the introduced nucleic acid (s) (an) artificial sequence (s) ) which comprise the detection of the identity of the introduced nucleic acid (s) and the selective multiplication, comprising the examination of the organism (s) or the cell (s) for the presence of the artificial sequence (s) and, if necessary, identification the artificial sequence (s), by means of hybridization with a chip and / or sequencing.
  • the fact that the term “simultaneous" is enclosed in parentheses means that simultaneity is an optional feature that is preferred at the same time.
  • the term "externally introduced nucleic acid which comprises an artificial sequence (s)” means that the nucleic acid consists exclusively of an artificial sequence or contains an artificial sequence (s) in addition to other sequences.
  • artificial sequence denotes sequences whose nucleotide sequence is not a naturally occurring nucleotide sequence. This term also includes naturally occurring sequences, the nucleotide sequence of which has been changed by molecular biological methods. It is of course also conceivable to combine artificial sequences with naturally occurring sequences for genetic labeling (see below).
  • a non-naturally occurring nucleotide sequence is a sequence that is not stored as such or as part of a longer sequence in any database.
  • the method according to the invention advantageously allows, by means of an informative, artificial genetic marking (1) organisms (for example bacterial strains, plant varieties or animals which can be propagated vegetatively or by cloning), (2) phenotypic features in the genome of organisms which have chromosomal regions correlate and (3) genetically engineered transgenic constructs to identify and identify quickly and easily. Products from transgenic organisms can also be identified if the transgenic constructs are genetically labeled accordingly.
  • the artificial sequence can be chosen such that it encodes an artificial epitope, that is to say which does not occur in nature, and which is expressed as part of the translation product of the transgene.
  • the translation product and, if appropriate, its origin can then be clearly identified by means of appropriate antibodies.
  • Such translation products can, of course, also be identified at the RNA level if the product of the transgenic organism is an RNA.
  • methods can be used for this, which are discussed in the present description in connection with the detection at the DNA level.
  • the method according to the invention thus makes it possible, by means of artificial genetic labeling and its central registration, to bring systematics and transparency into the diversity of organisms which have been changed as a result of breeding and organisms which have been modified by genetic engineering with different transgenic constructs. Legal questions such as copyright protection, but also questions of genetic engineering security can be answered here. It is therefore easy to detect, for example, transgenic material on the basis of a genetic label in food, in particular if this genetic label is already known to a surveillance authority.
  • Non-transgenic, stable varieties in plants e.g. varieties, varieties, selections that are vegetatively propagated or cloned, such as bulbs
  • various varieties in clonable animals and bacterial strains must be clearly identified by means of artificial genetic markings in order to make legal claims, if necessary ,
  • bioinformatics algorithms can also be used to select artificial sequences for genetic labeling that have as few natural occurrences as possible or are not known in nature.
  • Eukaryotes go through meiosis in sexual reproduction, which is
  • chromosomes are redistributed and mixed. But also within coupling groups (chromosomes) phenotypic inheritance
  • Character combinations after sexual processes play a role provided that the marker can be positioned at appropriate loci on the chromosomes and integrated stably, for example by "site directed in vivo mutagenesis".
  • GMOs with wild populations or processes of horizontal gene transfer can be determined. As a rule, however, you will be able to prove and prove the normal case with the method. There is usually no unwanted gene transfer between different species and transgenes, like other genes, are extremely stable and do not stray. In the case of genetic manipulation in modern plant breeding, however, it would be possible to use the method according to the invention to identify and avoid unwanted horizontal gene transfer and to eliminate corresponding transgenes.
  • a significant advantage of using artificial genetic markings over the classic proof of the identity of different transgenic gene constructs of different origins in GMOs is the independence of the proof of the type of construct.
  • Transgenic constructs can be identical or very similar in a wide variety of companies. In this case, it is difficult or impossible to get any information about the creator of the construct, even with a transparent company policy. But even with very different constructions, you may have no information about the exact configuration of the sequences involved. The commonly used generalized detection reaction for the transgenes may fail. In addition, it could be advantageous for companies to store all data for the construction of a transgene in a database and to ensure that the public can identify the transgene construct by means of an artificial genetic marking, but otherwise not to disclose the type of construct.
  • the identity of organisms can be clearly represented with the help of genetic markings. Quantitative detection methods could also offer the opportunity to show the relative abundance of organisms (e.g. mixtures of different fermentatively active bacteria in food technology).
  • the particular advantages of the artificial genetic labeling of tear genes lie in the direct access to the identification of a transgenic construct as Such through a clear possibility of assigning information to the construct, in the independence of the detection of the respective transgene construct, and in the possibility of the central and systematic recording and administration of transgenes.
  • the artificial sequence (s) are restriction endonuclease recognition sites, transcription promoter sequences and / or replication initiators (ORIs).
  • the presence of the artificial sequence (s) is examined by means of PCR, LCR or another amplification method.
  • Methods for the detection of the artificial sequences are known to the person skilled in the art and include the PCR (polymerase chain reaction) technique, the DNA array technique and sequencing methods of DNA. But also detection methods such as "beach displacement" amplification, LCR (ligase chain reaction), RFLP (restriction fragment length polymorphism) or AFLP (amplified fragment length polymorphism) in connection with optical (e.g. fluorescence, chemiluminescence or bioluminescence), electrical or mass spectrometric Detection (MALDI-TOF) are suitable to detect the artificial sequences.
  • detection methods such as “beach displacement” amplification, LCR (ligase chain reaction), RFLP (restriction fragment length polymorphism) or AFLP (amplified fragment length polymorphism) in connection with optical (e.g. fluorescence, chemiluminescence or bioluminescence), electrical or mass spectrometric Detection (MALDI-TOF) are suitable to detect the
  • any DNA fragment can be reproduced, for example, by means of the PCR method to such an extent that it increases beyond the background of genomic DNA and can thus be analyzed.
  • linear amplification methods are also suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the artificial sequence includes a promoter, for example, "run off" transcripts can be generated after suitable linearization, the presence or information content of which can be directly detected or analyzed, for example by means of hybridization with a chip.
  • the detection of defined DNA fragments in naturally occurring DNAs depends on the location of various ideal sequence parameters in the natural base sequences (e.g. compatible PCR primer sequences, restriction sites (polymorphisms), LCA-compatible sequences etc.). This is different with artificial, freely definable sequences.
  • the choice of the PCR primer pairs necessary for the detection of any artificially generated DNA sequence has significantly greater degrees of freedom here than in natural sequences.
  • the base sequence of the primer sequences to be used is freely definable.
  • the combination of different primer sequences to form primer pairs for the detection reaction of the synthetic partially or completely artificial sequence between the primers is also freely definable and only has to meet functional requirements (e.g. compatibility of the primers in the PCR reaction).
  • the present invention relates to a method, preferably additionally with the technical features of the first embodiment described above, for the detection of a nucleic acid introduced foreign into an organism or a cell, wherein the introduced nucleic acid comprises at least one artificial sequence which is associated with at least one universal primer hybridized under stringent hybridization conditions, comprising the following steps: (a) amplification of the introduced nucleic acid region that is
  • Allow receptor to the amplification product, the single strand thereof or the encoded translation product
  • Amplification products to a concatemer and or
  • the detection of the nucleic acid introduced externally can only be carried out via the at least one artificial sequence or else include sequences in the introduced nucleic acid.
  • Nucleic acid over the at least one universal primer hybridizes to two artificial sequences or two regions of the artificial sequences or to one artificial sequence within the introduced nucleic acid and to another artificial sequence or to regions of the artificial sequences (FIG. 1B). The resulting
  • Amplification products can thus also sequences of the introduced
  • Nucleic acid and artificial sequences include or only from artificial
  • a universal primer can be used, which serves both as a 5 'and 3' primer, or two universal primers of different sequences, one primer as a 5 'primer and the other Primer serves as a 3 'primer.
  • the amplification products preferably consist exclusively of artificial sequences. From a length of 80 base pairs, sequences are created that have been statistically unique in their nucleotide sequence on Earth since their creation (Prof. Werner Arber, Nobel Prize winner). Thus, the artificial sequence (s) used according to the invention is / are preferably 80 base pairs or longer.
  • Primers which are suitable for carrying out the method according to the invention can consist exclusively of naturally occurring nucleotides (i.e. deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides), but can also include nucleotide analogs or modified nucleotides (mixed polymers). Modified nucleotides are known to the person skilled in the art and include, for example, 5,6-dihydrouridine, ribothymidine, inosine or 1-methylguanosine. In addition, the nucleotides of the primers need not be linked to one another via phosphodiester bonds, but can also be linked to one another via phosphothioate or methylphosphonate bonds.
  • PNA Peptide nucleic acids
  • PCR polymerase chain reaction
  • the term “universal primer” means that this or the artificial sequence or the region thereof to which this primer hybridizes is designed in such a way that it generally allows the detection of the nucleic acid introduced externally, regardless of the Type and function of the nucleic acid introduced. In other words, this primer is used to answer the question of whether, for example, a certain food contains transgenic material.
  • Stringent hybridization conditions are known in the art and will be able to be easily determined to be used in the primer or probe as a function of, for example, the length (see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2 nd edition (1989), CSH Press , Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY (1989) or Higgins and Harnes, Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press Oxford, Washington DC (1985)).
  • Persistent hybridization conditions are, for example, hybridization in 6 X SSC and 0.1% SDS at 65 ° C or in 50% formamide and 4 X SSC at 42 ° C and subsequent washing in 0.1 X SSC and 0.1% SDS at 65 ° C.
  • Non-stringent hybridization conditions are, for example, hybridization and subsequent washing in 4 X SSC and 1% SDS at 50 ° C.
  • the nucleic acid introduced contains at least one further artificial sequence which hybridizes with at least one special primer under stringent hybridization conditions, the at least one special primer with another primer and that under stringent hybridization conditions with another sequence in the introduced one Nucleic acid hybridizes, or with a further special primer, which hybridizes with another artificial sequence under stringent hybridization conditions, allows the amplification of a region of the introduced nucleic acid, which comprises the at least one artificial sequence.
  • the further artificial sequences to which the special primers hybridize are always arranged on the corresponding DNA strand on the ⁇ ′ side to the artificial sequences to which the universal primers hybridize.
  • the term “special primer” means that detection of an externally introduced one. Nucleic acid using these primers is specific for the type and / or function of the nucleic acid introduced. In other words, in contrast to the universal primer, which generally allows the detection of all transgenes labeled in this way, the special primer serves to either either a specific transgenic construct or a group of transgenic constructs, which, for example, from a certain company (originator) were produced.
  • the at least two sequences and / or the at least two further sequences are spatially separated from one another.
  • This embodiment advantageously makes it possible, for example by means of PCR, to amplify larger sequence sections in which more extensive information can be stored.
  • the data recorded in step (c) are stored in digitized form.
  • the storage takes place in one
  • This embodiment allows artificial genetic markings of cells and living beings to be recorded centrally for the purpose of transparency and monitoring, and genetic engineering data is available worldwide and in a uniform system
  • Legislators can ensure that transgenes are only legally permissible and that they can be subsequently constructed and marketed if they have been registered and their identity can be proven by a clear artificial genetic marking.
  • the ZKBS Central Commission for Biosafety in Germany
  • the nucleic acid introduced encodes a (poly) peptide.
  • polypeptide encompasses both polypeptides or proteins which have a length of approximately 50 to several hundred amino acids and peptides which have a length of approximately 5 to 50 amino acids.
  • the peptides are preferably artificial peptides, that is to say non-naturally occurring peptides which, for example, represent artificial epitopes.
  • the (poly) peptide is a fusion protein.
  • Nucleic acid a transgene or an artificial sequence.
  • the artificial sequence advantageously allows quick and simple detection of the presence of the transgene in a sample.
  • the artificial sequence can also serve the author to identify the transgene as a transgene that he has developed and produced.
  • the nucleic acid introduced consists exclusively of an artificial sequence, then, as also discussed above, it allows, for example, organisms and / or phenotypic features to be identified or detected in the genome of an organism.
  • the nucleic acid introduced is or contains a recognition code.
  • the recognition code can represent a combinatorial coding or contain an encrypted text, ie a text which is translated into a nucleic acid sequence.
  • the identification code is encrypted.
  • information in the sequence enclosed by primer pairs is only limited by the ability of the PCR reaction to deliver sufficient amplified material of appropriate length for the detection reaction. Usually one would assume about 50 bp to about 1000 bp coding capacity. However, one could imagine much longer sequences if necessary.
  • information can be stored in an artificial, synthetic DNA sequence, such as the name of the creator of the GMOs, the date of authorship, the variant of the artificially genetically labeled organism or the variant of the transgene, or both, the code of the copyright ( e.g. patent number) and / or references to the documentation of the organism, for example a website, database or a publication.
  • the author is assigned primer pairs for the amplification of the enclosed artificial sequence, whose identity only he knows.
  • primer pairs for these primer pairs, in a second stage he can now fill the DNA sequence between the primers with information that (a) only represents a recognition code (signature) or (b) carries information encoded directly in DNA or (c) information carries, which is additionally cryptographically encrypted, so that a Interested parties cannot read and identify the data even if they have the primers for amplifying the corresponding PCR fragment and know the primary code (b), with which alphanumeric characters can be converted into DNA-coded information.
  • signature recognition code
  • b carries information encoded directly in DNA
  • information carries which is additionally cryptographically encrypted
  • this company could have an interest in allowing third parties (e.g. the supervisory authority) to prove that the GMO is identified as being genetically modified. Further information, which concerns the exact identity of the transgenic organism, can only be collected if this proof is approved by them.
  • the company would provide a monitoring authority with the PCR primers for identification, with which the genetically labeling DNA fragment as such e.g. can be demonstrated using array technologies.
  • the surveillance authority thus represents the level of central recording, the task of which is to control and identify transgenic material.
  • the exact identity of the organism and further information about this organism would remain encrypted in the hands of the company, or would only be accessible via a central database register. That the author represents the level of decentralized recording. Using the additional information, he can check whether third parties are using his material.
  • the information density of array technologies is so large that a large number of centrally recorded, artificial genetic markings can be displayed on a carrier for the detection of the corresponding transgene constructs.
  • a coding sequence can then also be sequenced, decoded and, if necessary, decrypted to prove individual detailed information.
  • the encryption is cryptographic encryption.
  • the receptor is a protein, preferably a glycoprotein, a specifically binding RNA or a peptide, preferably an artificial peptide or an antibody, a derivative or fragment thereof.
  • Suitable antibodies can be polyclonal or monoclonal. Fragments or derivatives of antibodies and methods for their production are known to the person skilled in the art. Antibody fragments include, for example, F ab , F (ab . ) 2 , F v , F d or dAb fragments. Antibody derivatives include, for example, scFv.
  • the antibody, the derivative or the fragment thereof binds double-stranded DNA in a sequence-specific manner.
  • the receptor is a single-stranded DNA.
  • the length of the single-stranded DNA can vary as long as it allows specific hybridization with the nucleic acids to be examined. That the single-stranded DNA can be an oligonucleotide approximately 12 to 30 nucleotides in length or a polynucleotide approximately 30 to several hundred nucleotides in length.
  • the term "specifically hybridize” means that under stringent hybridization conditions (see above) only nucleic acid molecules which have a complementary nucleotide sequence hybridize with one another.
  • steps (a), (b ") and (c") are carried out before steps (a), (b ") and (c"): (i) Cleavage of the nucleic acids which have been previously provided with a sequence tag with a restriction enzyme that doesn't cut in the day; (ii) isolation of the tagged fission products; (iii) halving the fission products and ligation of the halves with different ones
  • Suitable tags are affinity tags that allow the isolation of the cleavage products.
  • the restriction enzyme used in step (i) has a recognition sequence of preferably 7, 6 or 4 nucleotides.
  • the Velculescu et al. (Science 270 (1995), 484-487), the SAGE technique described is particularly suitable as a detection method for the method according to the invention, since it allows an efficient and simultaneous detection of a large number of transgenic constructs. Detection using chip technology, on the other hand, only allows qualitative or semi-quantitative detection of transgenes. Since SAGE technology allows quantitative detection, it is also particularly suitable as an additional detection method for relevant questions.
  • the method according to the invention not only allows qualitative detection of transgenes, i.e. the answer to the question of whether, and if so, which transgenes of which company are present in a sample, but also a quantitative proof, i.e. answering the question of how many transgenes from a company are present in a sample.
  • the transcription activity of the transgenes at the RNA level can also be analyzed by means of the sequence tag. For this, the RNA is reverse transcribed using a primer that hybridizes to the sequence tag. The RNA is then present in the concatemer according to its frequency.
  • the invention also relates to a sequencing station and suitable software which allow the method according to the invention to be carried out.
  • the nucleic acids introduced are double-stranded cDNAs, and the following step is carried out before step (i) carried out: Generation of double-stranded cDNA from mRNA of the organism or of the cell using a 3 ' ⁇ primer provided with a sequence tag.
  • linkers (v) cleavage of the ligation product from (iv) with a type II restriction enzyme which has the binding site in the linkers and cleaves in the cDNA so that a region of the cDNA remains connected to the linker; and (vi) head-to-tail ligation of the cDNA fragments.
  • the restriction enzyme used in step (ii) has a recognition sequence of preferably 7, 6 or 4 nucleotides.
  • the 3 'primer is an oligo-dT primer, a universal or a special primer.
  • these primers are also suitable for making statements about the transcription activity of the corresponding transgene.
  • the tag is biotin or
  • affinity-imparting agents which are polymerase-compatible are also suitable for carrying out the method according to the invention.
  • the above range comprises 8 to 20 nucleotides. In a most preferred embodiment, the above includes
  • the present invention relates to a chip as defined above.
  • the chip according to the invention is advantageously suitable for analyzing in one work step which one or hundreds of
  • Transgenic companies are included in a product. Because of the high
  • Nucleic acid. artificial sequence.
  • I ⁇ primer that hybridizes in the externally introduced nucleic acid.
  • ⁇ universal primer that hybridizes to the artificial sequence.
  • Figure 2 Schematic representation of how different primer pairs can be arranged around a genetic marker.
  • Pi and Pi ' are universal primers.
  • P 2 ... P n and P 2 '... P n ' are special primers.
  • the genetic marking should include the name of the author of the GMO, the date of the authorship, the name of the variant of the artificially genetically marked organism, the name of the variant of the transgene Patent application number and references to the documentation of the organism included.
  • the information to be encrypted and encoded is, for example:
  • This information is encrypted using a cryptographic method and then encoded in DNA using a quadruplet code:

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis einer oder mehrerer in einen oder mehrere Organismen oder in eine oder mehrere Zellen fremd eingeführten Nucleinsäure(n), wobei die eingeführten(n) Nucleinsäure(n) (eine) artifizielle Sequenz(en) umfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben, umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der Zelle(n) auf das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en), und gegebenenfalls Identifizierung der artifiziellen Sequenz(en) mittels Hybridisierung mit einem Chip und/oder Sequenzierung. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweis einer in einen Organismus oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsäure, wobei die eingeführte Nucleinsäure mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit mindestens einem universellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Schliesslich betrifft die Erfindung einen Chip, der die Durchführung der erfindungsgemässen Verfahren erlaubt.

Description

Artifizielle genetische Markierung mit synthetischer DNA
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis einer oder mehrerer in einen oder mehrere Organismen oder in eine oder mehrere Zellen fremd eingeführten Nucleinsäure(n), wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n) (eine) artifizielle Sequenz(en) umfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben, umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der Zelle(n) auf das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en), und gegebenenfalls Identifizierung der artifiziellen Sequenz(en) mittels Hybridisierung mit einem Chip und/oder Sequenzierung. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Nachweis einer in einen Organismus oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsaure, wobei die eingeführte Nucleinsaure mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit mindestens einem universellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Amplifikation des Bereichs der eingeführten Nucleinsaure, der sich (ai) zwischen der mindestens einen artifiziellen Sequenz und einer Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure oder (aii) zwischen mindestens zwei artifiziellen Sequenzen befindet, oder der in (ai) oder (aii) definierten Sequenzen mittels PCR oder einer anderen Amplifikationsmethode unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers und eines Primers, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure hybridisiert, oder unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers; und (b') Übertragung des Amplifikationsproduktes oder des codierten Translationsproduktes auf mindestens einen Chip, auf dem sich in einem geordneten Muster Rezeptoren befinden, die das Amplifikationsprodukt, einen Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt spezifisch binden, und Inkubation unter Bedingungen, die eine nachweisbare Bindung des Rezeptors an das Amplifikationsprodukt, den Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt erlauben; und (c') Nachweis, ob eine Bindung des Amplifikationsproduktes, des Einzelstrangs davon oder des codierten Translationsproduktes an den Rezeptor stattgefunden hat; und/oder (b") gegebenenfalls Spaltung der Amplifikationsprodukte mit einem im Bereich der Primerbindungsstelle spaltenden Restriktionsenzym und Ligation von ' Amplifikationsprodukten zu einem Concatemer; und/oder (c") Sequenzierung des Amplifikationsproduktes oder des Concatemers. Schließlich betrifft die Erfindung einen Chip, der die Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erlaubt.
DNA ist ein natürlich vorkommendes Molekül, das in der Natur als linearer Datenträger dient. Eine Sequenzabfolge von vier Nucleotiden, umfassend die Basen Adenin, Guanin, Cytosin und Thymin, trägt die genetische Information, die in 64 verschiedenen Codontripletts 20 Aminosäuren codiert. Neben der reinen Sequenzinformation trägt die DNA auch Strukturinformation auf der Ebene der RNA und der colinearer Proteine. Auch die Art der Wechselwirkung der Moleküle untereinander auf der Funktionsebene ist als Information in der DNA bereits festgelegt.
Der Informationsgehalt der DNA wird in Organismen durch einen komplexen enzymatischen Apparat streng konserviert und mit hoher Präzision von Generation zu Generation weitergetragen. Die Natur erhält somit die genetische Information über Jahrmillionen sehr stabil, aber sie räumt den Organismen aus Gründen der Evolution eine geringe Fehlerrate ein, die zu Sequenzdivergenzen in verschiedenen Arten führt.
Auch artfremde DNA kann durch gentechnische Methoden in Organismen eingebracht werden, die dann in gleicher Weise stabil vererbt werden kann. Solche gentechnisch mit zusätzlichen Funktionen ausgestattete Organismen nennt man transgene oder gentechnisch veränderte Organismen (GVO). Artfremde DNA in transgenen Organismen kann aus natürlichen Sequenzfolgen bestehen, die aus Organismen isoliert werden. Natürliche Sequenzen sind durch evolutionäre Prozesse entstandene Sequenzfolgen. Artifizielle DNA-Sequenzen können durch Manipulationen des Organismus aus natürlichen Sequenzen abgeleitet werden durch beispielsweise "in vitro"-Mutagenese. Auch das Bezugssystem spielt eine Rolle. Eine natürliche DNA-Sequenz aus dem einen Organismus, in einen anderen, artfremden Organismus gebracht, die so nicht in diesem Organismus bezüglich der Position und/oder der Sequenz vorkommt, erzeugt eine artifizielle Gensequenz in diesem veränderten System. Eine durch gentechnologische Methoden herbeigeführte Veränderung der Position einer DNA-Sequenzfolge innerhalb eines Organismus und auch innerhalb einer Art ist in strenger Definition auch artifiziell. Die immense Anzahl der Kombinationsmöglichkeiten der vier Nucleotide in verschiedenen Sequenzvarianten läßt Sequenzräume entstehen, die von natürlich vorkommenden Molekülen in den Organismen nur zu einem Bruchteil realisiert werden. Die Entwicklung der Genome mit ihrem Informationsgehalt ist daher historisch.
DNA-Sequenzen können daher auch vollständig artifizielle Sequenzfolgen sein. Artifizielle Sequenzfolgen findet man so in der Natur nicht und sind nicht durch evolutionäre Prozesse entstanden. Bis zu einer bestimmten Länge kommen bestimmte DNA-Sequenzfolgen aber auch rein statistisch gesehen in verschiedenen Organismen vor.
Synthetische DNA kann sowohl aus natürlichen, durch evolutionäre Prozesse entstandenen Sequenzfolgen, aus diesen abgeleiteten, durch menschlichen Einfluß entstandenen, artifiziell modifizierten Sequenzvarianten, sowie aus vollständig artifiziellen Sequenzfolgen bestehen. Rein artifizielle DNA-Sequenzfolgen können nur synthetisch hergestellt werden, da es keine natürlichen Quellen für sie gibt. Vollständig synthetische DNA beliebigen Informationsgehalts kann, wenn sie stabil in Organismen eingebracht wird, ebenso stabil weitervererbt werden und in genetisch veränderten bzw. modifizierten Organismen resultieren.
Funktionale, artifizielle, synthetische Sequenzfolgen können für teilweise oder vollständig artifizielle Gene codieren, die beispielsweise funktionale RNAs (z.B. Suppressor RNA oder Ribozyme), künstliche Epitope, affinitätsvermittelnde Sequenzen oder enzymatische Aktivitäten in sich tragen. Die Expression der Funktion (z.B. Epitop) in Zielzellen könnte den Nachweis der zugeordneten artifiziellen Genmarkierung wesentlich erleichtern. Somit kann ein mit natürlichen oder artifiziellen synthetischen Sequenzen ausgestatteter transgener Organismus sowohl funktionale Transgene in sich tragen, als auch bloße Sequenzmarkierungen, deren Informationsgehalt nicht in funktionstragende RNA-Moleküle und Protein fließen muß. Üblicherweise wird ein GVO durch die neue Genfunktion definiert, die ihm ein in der Zelle funktionsfähiges Transgen verleiht (z.B. Herbizidresistenz). Eine artifizielle genetische Markierung hingegen ist biologisch gesehen ein funktionsneutrales zusätzliches Stück DNA, dessen Sequenz keine biologisch aktive Rolle spielt. Sie ist nichts als eine artifizielle genetische Markierung, unabhängig von der Art der Nachweisreaktion.
Die Definition eines gentechnisch veränderten Organismus (GVO) ist unabhängig von der Funktion der genetischen Veränderung streng formal zu fassen. Ein solcher Organismus ist genetisch verändert aber nicht notwendigerweise transgen. Im Zeitalter der modernen Biotechnologie und Gentechnologie, in dem die- Herstellung von gentechnologisch veränderten Organismen unterschiedlichster Art immer mehr zur Routinearbeit wird, und in dem eine industrielle Verwertung des Nutzens dieser Organismen auf lange Sicht unumgänglich ist, besteht ein großer Bedarf, die hergestellten Organismen bzw. eingebrachten Vektoren mittels eines einfachen, schnellen und kostengünstigen Verfahrens eindeutig zu identifizieren bzw. nachzuweisen. Dies setzt eine entsprechende Markierung der Organismen bzw. Vektoren voraus.
Das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem war somit, Mittel und Wege zur Verfügung zu stellen, die diesen Bedarf befriedigen.
Dieses technische Problem wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis einer oder mehrerer in einen oder mehrere Organismen oder in eine oder mehrere Zellen fremd eingeführten Nucleinsäure(n), wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n) (eine) artifizielle Sequenz(en) umfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben, umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der Zelle(n) auf das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en) und gegebenenfalls Identifizierung der artifiziellen Sequenz(en), mittels Hybridisierung mit einem Chip und/oder Sequenzierung. Dadurch, daß der Begriff "gleichzeitigen" in Klammern gefaßt ist wird bedeutet, daß die Gleichzeitigkeit ein optionales Merkmal ist, das gleichzeitig bevorzugt ist. Der Begriff "fremd eingeführte Nucleinsaure, die (eine) artifizielle Sequenz(en) umfaßt" bedeutet, daß die Nucleinsaure ausschließlich aus einer artifiziellen Sequenz besteht, oder (eine) artifizielle Sequenz(en) zusätzlich zu weiteren Sequenzen enthält.
Der Begriff "artifizielle Sequenz" bezeichnet im Sinne der vorliegenden Erfindung Sequenzen, deren Nucleotidsequenz keine natürlich vorkommende Nucleotidsequenz ist. Dieser Begriff umfaßt also auch natürlich vorkommende Sequenzen, deren Nucleotidsequenz durch molekularbiologische Methoden verändert wurde. Es ist natürlich auch vorstellbar, für eine genetische Markierung artifizielle Sequenzen mit natürlich vorkommenden Sequenzen zu kombinieren (siehe unten).
Vorzugsweise ist eine nicht natürlich vorkommende Nucleotidsequenz eine Sequenz, die als solche oder als Teil einer längeren Sequenz in keiner Datenbank gespeichert ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, mittels einer informativen, artifiziellen genetischen Markierung (1 ) Organismen (z.B. Bakterienstämme, Pflanzensorten oder Tiere, die vegetativ oder durch Klonierung vermehrt werden können), (2) phänotypische Merkmale im Genom von Organismen, die mit chromosomalen Bereichen korrelieren und (3) gentechnologisch hergestellte transgene Konstrukte schnell und einfach nachzuweisen bzw. zu identifizieren. Darüber hinaus lassen sich auch Produkte aus transgenen Organismen identifizieren, wenn die transgenen Konstrukte entsprechend genetisch markiert sind. Beispielsweise kann die artifizielle Sequenz so gewählt werden, άaß> sie ein artifizielles, also in der Natur nicht vorkommendes Epitop codiert, das als Teil des Translationsproduktes des Transgens exprimiert wird. Mittels entsprechender Antikörper kann dann das Translationsprodukt und gegebenenfalls dessen Herkunft eindeutig identifiziert werden. Eine Identifikation solcher Translationsprodukte oder im Falle, daß das Produkt des transgenen Organismus eine RNA ist, kann natürlich auch auf RNA-Ebene erfolgen. Hierfür können im wesentlichen Methoden verwendet werden, die in der vorliegenden Beschreibung in Zusammenhang mit dem Nachweis auf DNA-Ebene diskutiert werden. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit, mittels artifizieller genetischer Markierung und deren zentraler Registrierung Systematik und Transparenz in die Vielfalt von züchtungsbedingt veränderten Organismen und gentechnologisch, mit verschiedenen transgenen Konstrukten veränderten Organismen zu bringen. Hier können rechtliche Fragen wie des Urheberschutzes, aber auch Fragen der gentechnologischen Sicherheit beantwortet werden. Somit ist es einfach, beispielsweise transgenes Material anhand einer genetischen Markierung in Lebensmitteln nachzuweisen, insbesondere, wenn diese genetische Markierung bereits einer Überwachungsbehörde bekannt ist.
Die artifizielle genetische Markierung von Organismen in Chromosomen und Episomen, sowie in Organellen mittels synthetischer DNA kann, wie gesagt, überall dort von Vorteil sein, wo man es mit rechtlichen Fragestellungen zu tun hat, die einen sehr genauen Nachweis der Herkunft und Identität von Organismen notwendig machen. Zum einen können in DNA verschlüsselte Urheberrechte uns sonstige Daten als. Markierungen z.B. bei bestimmten proprietären Rechtsansprüchen auf bestimmte transgen veränderte Organismen (GVO) von großer Bedeutung sein, wenn man wirtschaftliche Einbußen durch den Mißbrauch von Eigentumsrechten zu befürchten hat.
Nicht transgene, stabile Sorten bei Pflanzen, (z.B. Züchtungen, Sorten, Selektionen, die vegetativ vermehrt oder kloniert werden, wie etwa Blumenzwiebeln) sowie verschiedene Züchtungen bei klonierbaren Tieren und Bakterienstämme sind mittels artifiziellen genetischen Markierungen eindeutig zu identifizieren, um gegebenenfalls Rechtsansprüche geltend zu machen.
Beispielsweise bei Fermentationsprozessen in der Herstellung von Lebensmitteln oder in der Pharmaindustrie ist der Einsatz von genetisch artifiziell markierten Organismen möglich. Neben vereinfachten Methoden der Stammpfiege, beispielsweise bei der präzisen Identifikation fermentativ aktiver Bakterien definierter Eigenschaften ist es auch möglich, durch den Gebrauch von artifiziell genetisch markierten Bakterien oder Pilzstämmen, sich Informationen über die definierte Zusammensetzung von Mischpopulationen zu verschaffen.
In gleicher Weise ist es möglich, mittels artifizieller genetischer Markierung Zellpopulationen, die ex vivo zur genetischen Manipulation für Gentherapie und/oder Immuntherapie herangezogen werden, dauerhaft zu markieren und das Schicksal der Zellpopulationen im Organismus in vivo zu verfolgen.
Zur genetischen Differenzierung und Identifizierung von Organismen werden zum
Teil mit aufwendigen Verfahren genetische Unterschiede in der Genausstattung der verschiedenen Organismen analysiert. Mit artifiziellen genetischen Markierungen kann diese aufwendige Arbeit vermieden werden.
Mittels der Bioinformatik kann man zusätzlich Algorithmen anwenden, mit denen artifizielle Sequenzen zur genetischen Markierung selektiert werden, die möglichst kein natürliches Vorkommen haben bzw. in der Natur gar nicht bekannt sind.
Eukaryoten gehen bei der sexuellen Reproduktion durch die Meiose, wobei das
Erbgut insbesondere die Chromosomen neu verteilt und gemischt werden. Aber auch innerhalb von Kopplungsgruppen (Chromosomen) phänotypischer Vererbung wird
Material durch Crossover neu rekombiniert. Nur wenn genetische Marker sehr nahe bei einem Gen oder einer Gengruppe liegen, das/die phänotypischen Einflüsse auf die Eigenschaften des Organismus hat/haben, ist die
Rekombinationswahrscheinlichkeit des genetischen Austausches von Markem mit den verantwortlichen Genen gering genug, um die Sicherheit der Cosegregation von
Markern und Markiertem zu gewährleisten.
Artifizielle genetische Markierung mit synthetischer DNA kann bei der Identifikation und dem Nachweis von phänotypischen Eigenschaften bei der Selektion geeigneter
Merkmalskombinationen nach sexuellen Prozessen eine Rolle spielen, sofern es gelingt, die Markierung an entsprechenden Loci auf den Chromosomen zu positionieren und stabil zu integrieren, beispielsweise durch "site directed in vivo mutagenesis".
Im Umweltrecht könnte die artifizielle genetische Markierung und deren Analyse zur
Kontrolle von GVOs bei der Identifikation der Herkunft und Art von transgenem
Material nachhaltig verbessert werden.
Insbesondere ist es mit solchen Verfahren möglich, ein Maximum an Transparenz über die Verbreitung von Transgenen zu schaffen.
Die genaue Identität und Herkunft eines Transgens und dessen Verbreitung könnte zur Risikoabschätzung im Falle des Nachweises eines vertikalen Gentransfer eines
GVO mit Wildpopulationen oder Prozesse des horizontalen Gentransfers ermittelt werden. In der Regel aber wird man mit der Methode aber gerade auch den Normalfall be- und nachweisen können. Normalerweise findet kein ungewollter Gentransfer zwischen verschiedenen Arten statt und Transgene, wie andere Gene auch, sind äußerst stabil und vagabundieren nicht. Bei der genetischen Manipulation in der modernen Pflanzenzüchtung könnte man jedoch mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens ungewollten horizontalen Gentransfer identifizieren, vermeiden und entsprechende Transgene eliminieren.
Bei der enzymatischen Fermentation können durch moderne molekulare Evolutionssysteme u.a. neue Gene für enzymatische Varianten mit verbesserten Eigenschaften entstehen. Markierte Stämme, die solche Gene in sich tragen, sind durch artifizielle genetische Markierung leicht von Kontaminanten zu unterscheiden. Beispielsweise könnten Transgene auf diese Art und Weise in DNA codierte Versionsnummern bzw. Update-Nummern tragen.
Ein deutlicher Vorteil der Verwendung artifizieller genetischer Markierungen gegenüber dem klassischen Nachweis der Identität verschiedener transgener Genkonstrukte unterschiedlicher Herkunft bei GVOs ist die Unabhängigkeit des Nachweises von der Art des Konstruktes. Transgene Konstrukte können bei verschiedensten Firmen identisch bzw. sehr ähnlich sein. In diesem Fall bekommt man keine oder nur schwer Informationen über den Urheber des Konstruktes auch bei transparenter Firmenpolitik. Aber auch bei sehr unterschiedlichen Konstrukten hat man u.U. keine Information über die genaue Konfiguration der beteiligten Sequenzen. Möglicherweise versagt dabei die üblicherweise verwendete generalisierte Nachweisreaktion für die Transgene. Darüber hinaus könnte es für Firmen von Vorteil sein, alle Daten für die Konstruktion eines Transgens in einer Datenbank zu hinterlegen und der Öffentlichkeit eine Identifikationsmöglichkeit des Transgenkonstruktes durch eine artifizielle genetische Markierung zu gewährleisten, ansonsten aber die Art des Konstruktes nicht offenzulegen.
Die Identität von Organismen ist mit Hilfe von genetischen Markierungen eindeutig darstellbar. Quantitative Nachweisverfahren könnten auch die Gelegenheit bieten, relative Häufigkeiten von Organismen darzustellen (z.B. Gemische verschiedener fermentativ aktiver Bakterien in der Lebensmitteltechnologie). Die besonderen Vorteile der artifiziellen genetischen Markierung von Tränsgenen liegen also in dem direkten Zugang zur Identifikation eines Transgenkonstrukts als solches durch eine eindeutige Möglichkeit der Zuordnung von Information zum Konstrukt, in der Unabhängigkeit des Nachweises vom jeweiligen Transgenkonstrukt, und in der Möglichkeit der zentralen und systematischen Erfassung und Verwaltung von Transgenen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind oder umfassen die artifizielle(n) Sequenz(en) Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen, Transkriptionspromotersequenzen und/oder Replikationsinitatoren (ORIs).
Es können jedoch auch andere cis-aktive Elemente zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en) mittels PCR, LCR oder einer anderen Amplifikationsmethode untersucht.
Methoden zum Nachweis der artifiziellen Sequenzen sind dem Fachmann bekannt und umfassen die PCR (Polymerasekettenreaktion)-Technik, die DNA-Arraytechnik und Sequenzierungsverfahren von DNA. Aber auch Nachweisverfahren wie beispielsweise die "Strand displacement" Amplifikation, LCR (Ligase chain reaction), RFLP (restriction fragment length polymorphism) oder AFLP (amplified fragment length polymorphism) in Verbindung mit optischer (z.B. Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Biolumineszenz), elektrischer oder massenspektrometrischer Detektion (MALDI-TOF) sind geeignet, die artifiziellen Sequenzen nachzuweisen.
Für den Nachweis einer artifiziellen genetischen Markierung von Organismen mit synthetischer DNA geht man davon aus, daß man z.B. mittels der PCR-Methode jedes beliebige DNA-Fragment soweit vervielfältigen kann, daß es über den Hintergrund genomischer DNA hinaus vermehrt und dadurch analysierbar wird. Jedoch eignen sich auch lineare Amplifikationsmethoden zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Umfaßt die artifizielle Sequenz beispielsweise einen Promotor, können gegebenenfalls nach geeigneter Linearisierung "run off"- Transkripte erzeugt werden, deren Vorhandensein bzw. Informationsgehalt beispielsweise mittels Hybridisierung mit einem Chip direkt nachgewiesen bzw. analysiert werden kann. Der Nachweis definierter DNA-Fragmente ist bei natürlich vorkommenden DNAs (z.B. genomischer DNA) von der Lokalisation verschiedener idealer Sequenzparameter in den natürlichen Basenabfolgen abhängig (z.B. kompatible PCR-Primersequenzen, Restriktionsschnittstellen (Polymorphismen), LCA- kompatible Sequenzen etc.). Bei artifiziellen, frei definierbaren Sequenzen ist dies anders.
Die Wahl der zum Nachweis einer beliebigen, künstlich erzeugten DNA-Sequenz notwendigen PCR-Primerpaare hat hier deutlich größere Freiheitsgrade, als in natürlichen Sequenzen. Die Basenfolge der zu verwendenden Primersequenzen ist frei definierbar. Die Kombination verschiedener Primersequenzen zu Primerpaaren für die Nachweisreaktion der zwischen den Primern liegenden synthetischen teilweise oder vollständig artifiziellen Sequenz ist ebenso frei definierbar und muß nur funktionale Erfordernisse (z.B. Kompatibilität der Primer in der PCR-Reaktion) erfüllen.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, vorzugsweise zusätzlich mit den technischen Merkmalen der vorstehend beschriebenen ersten Ausführungsform, zum Nachweis einer in einen Organismus oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsaure, wobei die eingeführte Nucleinsaure mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit mindestens einem universellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Amplifikation des Bereichs der eingeführten Nucleinsaure, der sich
(ai) zwischen der mindestens einen artifiziellen Sequenz und einer Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure oder (aii) zwischen mindestens zwei artifiziellen Sequenzen befindet, oder der in (ai) oder (aii) definierten Sequenzen mittels PCR oder einer anderen Amplifikationsmethode unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers und eines Primers, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure hybridisiert, oder unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers; und (b') Übertragung des Amplifikationsproduktes oder des codierten
Translationsproduktes auf mindestens einen Chip, auf dem sich in einem geordneten Muster Rezeptoren befinden, die das Amplifikationsprodukt, einen
Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt spezifisch binden, und Inkubation unter Bedingungen, die eine nachweisbare Bindung des
Rezeptors an das Amplifikationsprodukt, den Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt erlauben; und
(c') Nachweis, ob eine Bindung des Amplifikationsproduktes, des Einzelstrangs davon oder des codierten Translationsproduktes an den Rezeptor stattgefunden hat; und/oder
(b") gegebenenfalls Spaltung der Amplifikationsprodukte mit einem im Bereich der
Primerbindungsstelle spaltenden Restriktionsenzym und Ligation von
Amplifikationsprodukten zu einem Concatemer; und/oder
(c") Sequenzierung des Amplifikationsproduktes oder des Concatemers.
Der Nachweis der fremd eingeführten Nucleinsaure kann ausschließlich über die mindestens eine artifizielle Sequenz erfolgen oder aber Sequenzen in der eingeführten Nucleinsaure mit einbeziehen. Beispielsweise kann für die Amplifikation der universelle Primer, der mit der mindestens einen artifiziellen Sequenz oder einem
Teil davon hybridisiert, mit einem Primer kombiniert werden, der an eine andere artifizielle oder nicht artifizielle Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure hybridisiert
(Figur 1A). In diesem Fall würde die Amplifikation zu einem Amplifikationsprodukt führen, das sowohl Sequenzen der eingeführten Nucleinsaure als auch artifizielle
Sequenzen umfaßt. Alternativ dazu kann der Nachweis der fremd eingeführten
Nucleinsaure über den mindestens einen universellen Primer erfolgen. In diesem Fall hybridisiert der mindestens eine universelle Primer an zwei artifizielle Sequenzen oder zwei Bereiche der artifiziellen Sequenzen oder an eine artifizielle Sequenz innerhalb der eingeführten Nucleinsaure und an eine weitere artifizielle Sequenz oder an Bereiche der artifiziellen Sequenzen (Figur 1B). Die dabei entstehenden
Amplifikationsprodukte können somit ebenfalls Sequenzen der eingeführten
Nucleinsaure und artifizielle Sequenzen umfassen oder aber nur aus artifiziellen
Sequenzen bestehen. Für die Amplifikation kann ein universeller Primer verwendet werden, der sowohl als 5'- als auch 3'-Primer dient, oder aber zwei universelle Primer unterschiedlicher Sequenz, wobei der eine Primer als 5'-Primer und der andere Primer als 3'-Primer dient. Vorzugsweise bestehen die Amplifikationsprodukte ausschließlich aus artifiziellen Sequenzen. Ab einer Länge von 80 Basenpaaren entstehen Sequenzen, die statistisch in ihrer Nucleotidsequenz auf der Erde seit ihrer Entstehung einzigartig sind (Prof. Werner Arber, Nobelpreisträger). Somit ist/sind die erfindungsgemäß verwendeten artifizielle(n) Sequenz(en) vorzugsweise 80 Basenpaare oder länger.
Primer, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet sind, können ausschließlich aus natürlich vorkommenden Nucleotiden bestehen (d.h. Desoxyribonucleotide und/oder Ribonucleotide), aber auch Nucleotidanaloga bzw. modifizierte Nucleotide umfassen (Mischpolymere). Modifizierte Nucleotide sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise 5,6-Dihydrouridin, Ribothymidin, Inosin oder 1-Methylguanosin. Die Nucleotide der Primer müssen außerdem nicht über Phosphodiester-Bindungen miteinander verknüpft sein, sondern können auch über Phosphothioat- oder Methylphosphonat-Bindungen miteinander verknüpft sein. Als Primer können auch Peptid-Nucleinsäuren (PNA) verwendet werden. Der Einsatz solcher Primer kann der Optimierung von Hybridisierungsbedingungen, Stringenz, Hybridisierungskinetik, Spezifität, Selektivität, und Hybridisierungseffizienz dienen. Das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist dem Fachmann bekannt. Dem Fachmann ist somit klar, daß Primerpaare, die in der vorliegenden Beschreibung als PCR-Amplifikations-tauglich offenbart sind, aus einem Primer bestehen, der an einen DNA-Strang hybridisiert, und einem weiteren Primer, der an den komplementären DNA-Strang hybridisiert.
Der Begriff "universeller Primer" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß dieser bzw. die artifizielle Sequenz oder der Bereich davon, an den dieser Primer hybridisiert, so konzipiert ist, daß er generell den Nachweis der fremd eingeführten Nucleinsaure erlaubt und zwar unabhängig von der Art und Funktion der eingeführten Nucleinsaure. Mit anderen Worten, dieser Primer dient dazu, die Frage zu beantworten, ob beispielsweise in einem bestimmten Lebensmittel transgenes Material enthalten ist.
Stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Abhängigkeit von beispielsweise der Länge des zu verwendenden Primers oder der Sonde einfach bestimmt werden (siehe, z.B., Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2nd edition (1989), CSH Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989) oder Higgins and Harnes, Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach, IRL Press Oxford, Washington DC (1985)). Stingente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6 X SSC und 0,1% SDS bei 65°C oder in 50% Formamid und 4 X SSC bei 42°C und anschließendes Waschen in 0,1 X SSC und 0,1% SDS bei 65°C. Unstringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung und anschließendes Waschen in 4 X SSC und 1 % SDS bei 50°C.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die eingeführte Nucleinsaure mindestens eine weitere artifizielle Sequenz, die mit mindestens einem speziellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei der mindestens eine spezielle Primer mit einem weiteren Primer, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure hybridisiert, oder mit einem weiteren speziellen Primer, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren artifiziellen Sequenz hybridisiert, die Amplifikation eines Bereiches der eingeführten Nucleinsaure erlaubt, der die mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt. Somit, sind die weiteren artifiziellen Sequenzen, an die die speziellen Primer hybridisieren, auf dem entsprechenden DNA-Strang immer δ'-seitig zu den artifiziellen Sequenzen angeordnet, an die die universellen Primer hybridisieren. Der Begriff "spezielle Primer" bedeutet im Sinne der vorliegende Erfindung, daß ein Nachweis einer fremd eingeführten. Nucleinsaure mittels dieser Primer spezifisch für die Art und/oder Funktion der eingeführten Nucleinsaure ist. Mit anderen Worten, im Gegensatz zu dem universellen Primer, der generell den Nachweis aller auf diese Weise markierten Transgene erlaubt, dient der spezielle Primer dazu, entweder ein spezifisches transgenes Konstrukt oder eine Gruppe von transgenen Konstrukten, die beispielsweise von einer bestimmten Firma (Urheber) hergestellt wurden, nachzuweisen.
Beim Nachweis des Urheberrechts beispielsweise an einem Transgen und der Möglichkeit des Nachweises von verschiedenen Transgenen im Umweltrecht liegen unterschiedliche Bedürfnisse der Anwender der Methode zugrunde. Während spezielle, also individuelle urheberspezifische Primerpaare alle Transgenkonstrukte eines bestimmten Urhebers aus der Gesamtheit aller Urheber zu amplifizieren vermögen, ist der Zweck von universellen Primerpaaren der, allen Kontrollinstanzen bekannt zu sein, so daß unabhängig vom jeweiligen Urheber alle Transgenkonstrukte amplifiziert werden können. Spezielle Primerpaare können wenn gewünscht von den Urhebern geheim gehalten werden.
Verschiedene Primerpaare kann man um die jeweilige Markierung herumschachteln (Figur 2). Da mittels der universellen Primer die 5'-flankierenden speziellen Primersequenzen experimenteil ermittelt werden können, ist es in dieser Ausführungsform besonders wichtig, daß die Zuordnung zu individuellen Firmen nur den Kontrollbehörden bekannt ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die mindestens zwei Sequenzen und/oder die mindestens zwei weiteren Sequenzen räumlich voneinander getrennt.
Diese Ausführungsform ermöglicht es vorteilhafterweise, beispielsweise mittels PCR größere Sequenzabschnitte zu amplifizieren, in denen umfangreichere Informationen gespeichert werden können.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die in Schritt (c) erfaßten Daten in digitalisierter Form gespeichert.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Speicherung in einem
Zentralspeicher.
Diese Ausführungsform erlaubt es, artifizielle genetische Markierungen von Zellen und Lebewesen zum Zwecke der Transparenz und Überwachung zentral zu erfassen und gentechnologische Daten weltweit und in einem einheitlichen System zur
Markierung und Verwaltung von Transgenen zu speichern.
Durch die Speicherung aller verfügbarer Daten registrierter Transgene ermöglicht der
Zentralspeicher eine leichte Kontrolle über Bestand, Art und Urheber von
Transgenen. In einem "trust center" könnten alle Daten verwaltet werden.
Der Gesetzgeber kann dafür sorgen, daß Transgene nur dann rechtlich zulässig sind und folgend konstruiert und in den Verkehr gebracht werden dürfen, wenn sie registriert worden sind und deren Identität durch eine eindeutige artifizielle genetische Markierung beweisbar ist. Die Herkunft des Genkonstruktes (Urheber), die Art des Konstruktes (die verwendeten Gensequenzen), das Datum der Registrierung, der Organismus, in den das Genkonstrukt eingebracht wurden, etc., d.h. alle Daten das Transgen betreffend, müssen nachvollziehbar sein. Die ZKBS (=zentrale Kommission für biologische Sicherheit in Deutschland) könnte dem Gesetzgeber einen solchen Vorschlag unterbreiten, der dann auch europaweit und weltweit umgesetzt werden kann.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens codiert die eingeführte Nucleinsaure ein (Poly)peptid.
Der Begriff "(Poly)peptid" umfaßt im Sinne der vorliegenden Erfindung sowohl Polypeptide oder Proteine, die eine Länge von ungefähr 50 bis mehreren hundert Aminosäuren aufweisen, als auch Peptide, die eine Länge von ungefähr 5 bis 50 Aminosäuren aufweisen. Die Peptide sind vorzugsweise artifizielle Peptide, also nicht natürlich vorkommende Peptide, die beispielweise artifizielle Epitope darstellen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das (Poly)peptid ein Fusionsprotein.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist die eingeführte
Nucleinsaure ein Transgen oder eine artifizielle Sequenz.
Ist die eingeführte Nukleinsäure ein Transgen, so erlaubt, wie vorstehend diskutiert, die artifizielle Sequenz vorteilhafterweise einen schnellen und einfachen Nachweis des Vorhandenseins des Transgens in einer Probe. Darüber hinaus kann die artifizielle Sequenz auch dem Urheber dienen, das Transgen als ein von ihm entwickeltes und hergestelltes Transgen zu identifizieren.
Besteht die eingeführte Nukleinsäure ausschließlich aus einer artifiziellen Sequenz, so erlaubt sie, wie ebenfalls oben diskutiert, beispielsweise Organismen und/oder phänotypische Merkmale im Genom eines Organismus zu identifizieren bzw. nachzuweisen. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist oder enthält die eingeführte Nucleinsaure einen Erkennungscode. Der Erkennungscode kann eine kombinatorische Codierung darstellen oder einen chiffrierten Text enthalten, d.h. einen Text, der in eine Nucleinsäuresequenz übersetzt ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Erkennungscode verschlüsselt.
Eine genetische Markierung von Organismen mittels einer verschlüsselten Nachricht in DNA-Molekülen kann von einer autorisierten Person durch verschiedene Techniken oder Kombinationen aus diesen heutzutage leicht nachgewiesen und auch leicht dechiffriert werden, wenn der entsprechende Dechiffrierungs-schlüssel bekannt ist.
In der von Primerpaaren eingeschlossenen Sequenz liegt ein beträchtliches Kodierungspotential für Information, das nur begrenzt ist durch das Leistungsvermögen der PCR-Reaktion, genügend amplifiziertes Material entsprechender Länge für die Nachweisreaktion zu liefern. Üblicherweise würde man ca. 50 bp bis ca. 1000 bp Kodierungskapazität annehmen. Man könnte sich aber bei Bedarf durchaus wesentlich längere Sequenzen vorstellen. Wie erwähnt kann in einer artifiziellen, synthetischen DNA-Sequenz Informationen gespeichert werden wie beispielsweise der Namen der/des Urhebers der GVOs, das Datum der Urheberschaft, die Variante des artifiziell genetisch markierten Organismus oder die Variante des Transgens oder beides, der Code der Urheberrechte (z.B. Patennummer) und/oder Verweise auf die Dokumentation des Organismus, beispielsweise eine Webseite, Datenbank oder eine Publikation. In der ersten Stufe eines zweistufigen Systems zur Verschlüsselung von Urheberdaten in einem DNA-Code zur artifiziellen genetischen Markierung von Organismen bekommt der Urheber der Sequenz Primerpaare zur Amplifikation der eingeschlossenen artifiziellen Sequenz zugeordnet, deren Identität nur er kennt. Für diese Primerpaare kann er nun in einer zweiten Stufe die zwischen den Primern liegende DNA-Sequenz mit Informationen füllen, die (a) nur einen Erkennungscode (Signatur) darstellt oder (b) eine direkt in DNA codierte Information trägt oder (c) eine Information trägt, die zusätzlich noch kryptographisch verschlüsselt ist, so daß ein Interessierter auch dann die Daten nicht lesen und identifizieren kann, wenn er die Primer zur Amplifikation des entsprechenden PCR-Fragmentes besitzt und den Primärcode (b) kennt, mit dem alphanumerische Zeichen in DNA-codierte Information umgesetzt werden kann.
Für eine Biotechnologiefirma könnte es durchaus interessant sein, die Daten eines Transgens oder eines Organismus für Dritte zunächst nicht detailliert identifizierbar zu machen. Die Überwachungsbehörde möchte aber möglichst einfach transgenes Material verschiedener Herkunft nachweisen können.
Diese Firma könnte aber ein Interesse daran haben, den Nachweis durch Dritte (z.B. die Überwachungsbehörde) zuzulassen, daß der GVO in seiner Eigenschaft genetisch verändert zu sein identifiziert wird. Weitergehende Informationen, die die genaue Identität des transgenen Organismus betreffen können aber nur dann erhoben werden, wenn dieser Nachweis durch sie genehmigt wird. Die Firma würde einer Überwachungsbehörde in diesem Fall die PCR-Primer zur Identifikation zur Verfügung stellen, mit der das genetisch markierende DNA-Fragment als solches z.B. mittels Arraytechnologien nachgewiesen werden kann. Die Überwachungsbehörde stellt somit die Ebene der zentralen Erfassung dar, deren Aufgabe es ist, transgenes Material zu kontrollieren und zu identifizieren. Die genaue Identität des Organismus aber und weitergehende Informationen über diesen Organismus würden weiter chiffriert in der Hand der Firma bleiben, oder wären nur zugänglich über ein zentrales Datenbankregister. D.h. der Urheber stellt die Ebene der dezentralen Erfassung dar. Mittels der weitergehenden Informationen kann er überprüfen, ob Dritte sein Material benutzen.
Die Informationsdichte von Arraytechnologien ist so groß, daß sehr viele zentral erfaßte, artifizielle genetische Markierungen auf einem Träger zum Nachweis der korrespondierenden Transgenkonstrukte abgebildet werden können. Zum Nachweis individueller detaillierter Informationen kann eine codierende Sequenz dann auch sequenziert, decodiert und gegebenenfalls dechiffriert werden.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die Verschlüsselung eine kryptographische Verschlüsselung. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Rezeptor ein Protein, vorzugsweise ein Glycoprotein, eine spezifisch bindende RNA oder ein Peptid, vorzugsweise ein artifizielles Peptid oder ein Antikörper, ein Derivat oder Fragment davon.
Geeignete Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein. Fragmente bzw. Derivate von Antikörpern sowie Verfahren zu deren Herstellung sind dem Fachmann bekannt. Antikörperfragmente umfassen beispielsweise Fab-, F(ab.)2-, Fv-, Fd- oder dAb- Fragmente. Antikörperderivate umfassen beispielsweise scFv.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform bindet der Antikörper, das Derivat oder das Fragment davon doppelsträngige DNA sequenzspezifisch.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Rezeptor eine Einzelstrang-DNA.
Die Länge der Einzelstrang-DNA kann variieren, solange sie eine spezifische Hybridisierung mit zu untersuchenden Nucleinsäuren erlaubt. D.h. die Einzelstrang- DNA kann ein Oligonucleotid mit einer Länge von ungefähr 12 bis 30 Nucleotiden oder ein Polynucleotid mit einer Länge von ungefähr 30 bis mehreren hundert Nucleotiden sein. Der Begriff "spezifisch hybridisieren" bedeutet dabei, daß unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe oben) nur Nucleinsäuremoleküle miteinander hybridisieren, die eine komplementäre Nucleotidsequenz aufweisen.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform befindet sich auf dem Chip in jeder Position des geordneten Musters ein Rezeptor mit einer anderen Bindungsspezifität. Es ist jedoch auch vorstellbar, daß sich an mehreren Positionen des Chips Rezeptoren mit der gleichen Bindungspezifität befinden.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vor den Schritten (a), (b") und (c") folgende Schritte durchgeführt: (i) Spaltung der eingeführten Nucleinsäuren, die zuvor mit einem Sequenz-Tag versehen wurden, mit einem Restriktionsenzym, das nicht im Tag schneidet; (ii) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte; (iii) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen
Linkern; (iv) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iii) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in den eingeführten
Nucleinsäuren spaltet, so daß ein Bereich der eingeführten Nucleinsäuren mit dem Linker verbunden bleibt; und (v) head-to-tail-Ligation der eingeführten Nucleinsäuren. Geeignete Tags sind Affinitäts-Tags, die die Isolierung der Spaltprodukte erlauben. Das in Schritt (i) verwendete Restriktionsenzym besitzt eine Erkennungssequenz von vorzugsweise 7, 6 oder 4 Nucleotiden.
Die von Velculescu et al. (Science 270 (1995), 484-487) beschriebene SAGE- Technik eignet sich besonders als Nachweismethode für das erfindungsgemäße Verfahren, da sie einen effizienten und gleichzeitigen Nachweis einer großen Anzahl von Transgenkonstrukten erlaubt. Der Nachweis mittels Chip-Technologie hingegen erlaubt nur einen qualitativen bzw. semiquantitativen Nachweis von Transgenen. Da die SAGE-Technologie einen quantitativen Nachweis erlaubt, ist sie bei entsprechenden Fragestellungen somit auch besonders als zusätzliche Nachweismethode geeignet.
In dieser Ausführungsform erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur einen qualitativen Nachweis von Transgenen, d.h. die Beantwortung der Frage, ob, und wenn ja, welche Transgene welcher Firma in einer Probe vorhanden sind, sondern auch einen quantitativen Nachweis, d.h. die Beantwortung der Frage, wieviele Transgene einer Firma in einer Probe vorhanden sind. Mittels des Sequenz-Tags kann auch die Transkriptionsaktivität der Transgene auf RNA-Ebene analysiert werden. Dazu wird die RNA mittels eines Primers, der an den Sequenz-Tag hybridisiert, revers transkribiert. Die RNA ist dann entsprechend ihrer Häufigkeit in dem Concatemer vorhanden.
Die Erfindung betrifft auch eine Sequenzierstation und geeignete Software, die die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erlauben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die eingeführten Nucleinsäuren Doppelstrang-cDNAs, und vor Schritt (i) wird folgender Schritt durchgeführt: Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder der Zelle unter Verwendung eines mit einem Sequenz-Tag versehenen 3'~Primers.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vor den Schritten (a), (b") und (c") folgende Schritte durchgeführt:
(i) Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder der
Zelle unter Verwendung eines mit einem Tag versehenen 3'-Primers; (ii) Spaltung der cDNA mit einem Restriktionsenzym, das nicht im Tag schneidet; (iii) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte; (iv) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen
Linkern; (v) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iv) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in der cDNA spaltet, so daß ein Bereich der cDNA mit dem Linker verbunden bleiben; und (vi) head-to-tail-Ligation der cDNA-Fragmente.
Das in Schritt (ii) verwendete Restriktionsenzym besitzt eine Erkennungssequenz von vorzugsweise 7, 6 oder 4 Nucleotiden.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform ist der 3'-Primer ein oligo- dT-Primer, ein universeller oder ein spezieller Primer.
Analog zu dem oben erwähnten Primer, der an den Sequenz-Tag bindet, eignen sich diese Primer auch dazu, Aussagen über die Transkriptionsaktivität des entsprechenden Transgens zu machen.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Tag Biotin oder
Digoxygenin.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens eignen sich jedoch auch andere affinitätsvermittelnde Agenzien, die Polymerase-kompatibel sind.
In einer zusätzlichen besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt der obengenannte Bereich 8 bis 20 Nucleotide. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform umfaßt der obengenannte
Bereich 9 bis 14 Nucleotide.
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen Chip wie vorstehend definiert.
Mittels der auf dem Chip befindlichen Rezeptoren, die jeweils spezifisch für ein
Unternehmen sind, eignet sich der erfindungsgemäße Chip vorteilhafterweise, in einem Arbeitsschritt zu analysieren, von welchem oder welchen von hunderten von
Unternehmen Transgene in einem Produkt enthalten sind. Aufgrund der hohen
Kapazität ist es vorstellbar, daß auf dem erfindungsgemäßen Chip alle weltweit existierenden Unternehmen, die in dieser Branche tätig sind, über ihren individuellen
Rezeptor repräsentiert sind.
Der Inhalt der zitierten Dokumente wird hiermit per Verweisung inkorporiert.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Schematische Darstellung der Möglichkeiten, wie artifizielle Sequenzen amplifiziert werden können. ' 3 = fremd eingeführte
Nucleinsaure. =artifizielle Sequenz. I~~ = Primer, der in der fremd eingeführten Nucleinsaure hybridisiert. ^ = universeller Primer, der an die artifizielle Sequenz hybridisiert.
Figur 2: Schematische Darstellung, wie verschiedene Primerpaare um eine genetische Markierung herum angeordnet sein können. Pi und Pi' sind universelle Primer. P2 ... Pn und P2' ... Pn' stellen spezielle Primer dar.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
BeispieM : Chiffrierung von Information mittels eines kryptographischen Verfahrens und anschließende Codierung mittels eines Quadruplettcodes in DNA
Die genetische Markierung soll den Namen des Urhebers des GVOs, das Datum der Urheberschaft, die Bezeichnung der Variante des artifiziell genetisch markierten Organismus, die Bezeichnung der Variante des Transgens, die Patentanmeldungsnummer und Verweise auf die Dokumentation des Organismus enthalten. Die zu chiffrierende und codierende Information ist also beispielsweise:
Xgen AG, 12. 02. 1995, Zea mays 1234, Konstrukt 123456/99, PCT/EP99/12345, www.Xgen-AG.com/transparency
Diese Information wird mittels eines kryptographischen Verfahrens chiffriert und anschließend mittels eines Quadruplettcodes in DNA codiert:
ATGATATTGCCGTCTGTGCAACGATGAAACCCAGGATTAGATGATCCAGATCAG
TGATFCATGATGATCCACCACAGTGGGTGAGTTACCCACAGATTATTAACCACC
CACATTGATGATGATTTTAAAGAGAGACATGAGAGAGACATCATGATCAGATGTT
GATGTCACCAGTGATGCAGACGCAGTGATGACGACGACTGATGACGATGGAAA
AGTAGATGACAGATGATCAGATGATGACACACGTAAAAAGATGAAAGTTTAGGA
CCCAGATGAGGGATGGAGTAGCCACATGAT ...
Auf dem Markt erhältliche Maiskörner lassen sich wie folgt auf Vorhandensein der artifiziellen genetischen Markierung untersuchen: Zwei Primer, die an die obigen unterstrichenen Sequenzen bzw. komplementären Sequenzen in gegenläufigem Sinne hybridisieren werden an aus den Maiskörnern isolierte DNA hybridisiert. Anschließend wird eine PCR durchgeführt. Die PCR-Bedingungen wie z.B. Hybridisierungs-Zeit und -Temperatur, Elongationszeit, etc. hängen von dem verwendeten Primer und dem zu amplifizierenden DNA-Fragment ab und können ohne weiteres vom Fachmann bestimmt werden (siehe Sambrook et al. und Ausubel et al., los. cit.). Die Amplifikationsprodukte werden aufgeschmolzen und die Einzelstränge werden auf einen Chip übertragen, der mit 6144 unterschiedlichen Einzelstrang-DNAs bestückt ist und zwar unter Bedingungen, die eine Hybridisierung erlauben. Diese Bedingungen hängen von den zu hybridisierenden DNA- Einzelsträngen ab und können ebenfalls vom Fachmann bestimmt werden (siehe Sambrook et al . und Ausubel et al., loc. cit.). Der Nachweis des Vorhandenseins obiger Sequenz in den Maiskörnern wird durch Bindung eines Peroxidase-markierten anti-ds DNA spezifischen monoklonalen Antikörper nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum (gleichzeitigen) Nachweis einer oder mehrerer in einen oder mehrere Organismen oder in eine oder mehrere Zellen fremd eingeführten Nucleinsäure(n), wobei die eingeführte(n) Nucleinsäure(n) (eine) artifizielle Sequenz(en) umfaßt/umfassen, die den Nachweis der Identität der eingeführten Nucleinsäure(n) und die selektive Vermehrung erlaubt/erlauben, umfassend die Untersuchung des Organismus/der Organismen oder der Zelle(n) auf das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en) und gegebenenfalls Identifizierung der artifiziellen Sequenz(en), mittels Hybridisierung mit einem Chip und/oder Sequenzierung.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die artifizielle(n) Sequenz(en) Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen, Transkriptionspromotersequenzen und/oder Replikationsinitiatoren (ORIs) sind oder umfassen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Vorhandensein der artifiziellen Sequenz(en) mittels PCR, LCR oder einer anderen Amplifikationsmethode untersucht wird.
4. Verfahren, vorzugsweise nach Anspruch 1 , zum Nachweis einer in einen Organismus oder eine Zelle fremd eingeführten Nucleinsaure, wobei die eingeführte Nucleinsaure mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt, die mit mindestens einem universellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, das die folgenden Schritte umfaßt: (a) Amplifikation des Bereichs der eingeführten Nucleinsaure, der sich
(ai) zwischen der mindestens einen artifiziellen Sequenz und einer
Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure oder (aii) zwischen mindestens zwei artifiziellen Sequenzen befindet, oder der in (ai) oder (aii) definierten Sequenzen mittels PCR oder einer anderen Amplifikationsmethode unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers und eines Primers, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit der Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure hybridisiert, oder unter Verwendung des mindestens einen universellen Primers; und
(b') Übertragung des Amplifikationsproduktes oder des codierten Translationsproduktes auf mindestens einen Chip, auf dem sich in einem geordneten Muster Rezeptoren befinden, die das Amplifikationsprodukt, einen Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt spezifisch binden, und Inkubation unter Bedingungen, die eine nachweisbare Bindung des Rezeptors an das Amplifikationsprodukt, den Einzelstrang davon oder das codierte Translationsprodukt erlauben; und
(c") Nachweis, ob eine Bindung des Amplifikationsproduktes, des Einzelstrangs davon oder des codierten Translationsproduktes an den Rezeptor stattgefunden hat; und/oder
(b") gegebenenfalls Spaltung der Amplifikationsprodukte mit einem im Bereich der Primerbindungsstelle spaltenden Restriktionsenzym und Ligation von Amplifikationsprodukten zu einem Concatemer; und/oder
(c") Sequenzierung des Amplifikationsproduktes oder des Concatemers.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die eingeführte Nucleinsaure mindestens eine weitere artifizielle Sequenz enthält, die mit mindestens einem speziellen Primer unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert, wobei der mindestens eine spezielle Primer mit einem weiteren Primer, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren Sequenz in der eingeführten Nucleinsaure hybridisiert, oder mit einem weiteren speziellen Primer, der unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer weiteren artifiziellen Sequenz hybridisiert, die Amplifikation eines Bereiches der eingeführten Nucleinsaure erlaubt, der die mindestens eine artifizielle Sequenz umfaßt.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die mindestens zwei Sequenzen und/oder die mindestens zwei weiteren Sequenzen räumlich voneinander getrennt sind.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die in Schritt (c) erfaßten Daten in digitalisierter Form gespeichert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Speicherung in einem Zentralspeicher erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die eingeführte Nucleinsaure ein (Poly)peptid codiert.
10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das (Poly)peptid ein Fusionsprotein ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei die eingeführte Nucleinsaure ein Transgen oder eine artifizielle Sequenz ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , wobei die eingeführte Nucleinsaure ein Erkennungscode ist oder enthält.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Erkennungscode verschlüsselt ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Verschlüsselung eine kryptographische Verschlüsselung ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei der Rezeptor ein Protein, vorzugsweise ein Glycoprotein, eine spezifisch bindende RNA oder ein Peptid, oder ein Antikörper, ein Derivat oder Fragment davon.
16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Antikörper, das Derivat oder das Fragment davon doppelsträngige DNA sequenzspezifisch bindet.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei der Rezeptor eine Einzelstrang-DNA ist.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 17, wobei sich auf dem Chip in jeder Position des geordneten Musters ein Rezeptor mit einer anderen Bindungsspezifität befindet.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei vor den Schritten (a), (b") und (c") folgende Schritte durchgeführt werden:
(i) Spaltung der eingeführten Nucleinsäuren, die zuvor mit einem Sequenz-Tag versehen wurden, mit einem Restriktionsenzym;
(ii) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte;
(iii) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen Linkern;
(iv) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iii) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in den eingeführten Nucleinsäuren spaltet, so daß ein Bereich der eingeführten Nucleinsäuren mit dem Linker verbunden bleibt; und
(v) head-to-tail-Ligation der eingeführten Nucleinsäuren.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die eingeführten Nucleinsäuren Doppelstrang-cDNAs sind, und vor Schritt (i) folgender Schritt durchgeführt wird: Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder der Zelle unter Verwendung eines mit einem Sequenz-Tag versehenen 3'- Primers.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, wobei vor den Schritten (a), (b") und (c") folgende Schritte durchgeführt werden:
(i) Generierung von Doppelstrang-cDNA aus mRNA des Organismus oder der Zelle unter Verwendung eines mit einem Tag versehenen 3'- Primers;
(ii) Spaltung der cDNA mit einem Restriktionsenzym;
(iii) Isolierung der mit dem Tag versehenen Spaltprodukte;
(iv) hälftige Teilung der Spaltprodukte und Ligation der Hälften mit verschiedenen Linkern; (v) Spaltung des Ligationsproduktes aus (iv) mit einem Typ II Restriktionsenzym, das die Bindungsstelle in den Linkern aufweist und in der cDNA spaltet, so daß ein Bereich der cDNA mit dem Linker verbunden bleiben; und
(vi) head-to-tail-Ligation der cDNA-Fragmente.
22. Verfahren nach Anspruch 20 oder 21 , wobei der 3'-Primer ein oligo-dT-Primer, ein universeller oder ein spezieller Primer ist.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei der Tag Biotin oder Digoxygenin ist.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, wobei der Bereich 8 bis 20 Nucleotide umfaßt.
25. Chip wie in einem der Ansprüche 1 oder 15 bis 18 definiert.
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