WO2001098495A1 - Nouvelle proteine et son adn - Google Patents

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WO2001098495A1
WO2001098495A1 PCT/JP2001/005263 JP0105263W WO0198495A1 WO 2001098495 A1 WO2001098495 A1 WO 2001098495A1 JP 0105263 W JP0105263 W JP 0105263W WO 0198495 A1 WO0198495 A1 WO 0198495A1
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WO
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protein
salt
present
receptor
partial peptide
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Application number
PCT/JP2001/005263
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Inventor
Tomofumi Kurokawa
Takao Yamada
Shigeto Morimoto
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel protein “phosphatonin” having phosphodiuretic activity and / or hypophosphatemia-inducing activity, and its DNA.
  • Phosphorus plays an important role in cellular metabolism and is essential for the storage and transport of nucleic acids, adenosine triphosphate (ATP), phospholipids, cell membranes, intermediate metabolites, and cellular energy. Bone calcification is also closely related to the concentration of phosphorus and potassium in blood, and the loss of homeostasis of these components can have a significant effect on bone strength.
  • ATP adenosine triphosphate
  • the concentration of phosphorus in the blood is subtly balanced by absorption from the small intestine, release from the bone, excretion from the kidney, and intracellular and extracellular shifts.
  • Phosphorus is excreted passively by glomerular filtration in the kidney, while the sodium-dependent phosphorus (Na + _Pi) transporter present in the brush border membrane of the renal proximal tubule actively resorbs phosphorus. And greatly contributes to maintaining blood phosphorus levels.
  • Vitamin D contributes to 1, 25-dihydroxy-bi evening Min D (l, 25 (OH) 2 D) and turned with calcification maintenance and bone phosphorus concentration in the blood of the liver and metabolized by kidney active . Lack of vitamin D results in rickets in growing children and osteomalacia in adults. Hereditary rickets caused by causes other than vitamin D deficiency include familial hypophosphatemic vitamin D-resistant rickets (Xl inked.
  • hypophosphatemia XLH
  • hypophosphatemic rickets with autosomal dominant inheritance.
  • ADHR autosomal dominant hypophosphatemic rickets
  • ft hypophosphatemic rickets with calciuria HHRH
  • PHEX phosphate regulating gene with homologies to endopeptidase, on the X chromosome
  • the PHEX gene product is a single transmembrane glycoprotein consisting of 794 amino acid residues and has high homology to zinc meta-mouth endopeptidase.
  • osteomalacia a malignant steatosis .
  • This disease is caused by mesodermal tumors such as bone (benign osteoblastoma, ossifying mesenchymal tumor) and soft tissue (angioma, fibroma).
  • mesodermal tumors such as bone (benign osteoblastoma, ossifying mesenchymal tumor) and soft tissue (angioma, fibroma).
  • Phosphoremia osteomalacia; / positive (Tumor associated rickets and osteomalacia Favus MJ ed)
  • AMERICAN SOCIETY FOR BONE MINERAL RESEARCH 184-188, 1990 .
  • the present invention relates to a novel compound having phosphorus diuretic activity and Z or hypophosphatemia-inducing activity.
  • DNA, recombinant vector, transformant, method for producing the protein, drug containing the protein or DNA, method for screening antibody to the protein, receptor agonist antagonist, kit for screening, screening kit Provided are a receptor agonist / engonist obtained, a method for screening a compound or a salt thereof having an activity of inhibiting a proteinase that degrades the protein, a screening kit, and a compound obtained by the screening or a salt thereof.
  • the present inventors have succeeded in closing cDNA having a novel base sequence from cDNA library derived from OOH patient.
  • the present inventors have found that the protein encoded by the obtained cDNA is a novel protein having a phosphodiuretic activity and a Z or hypophosphatemic inducing activity, and based on these findings, As a result of repeated studies, the present invention has been completed.
  • a protein or a salt thereof having an amino acid sequence identical or substantially identical to the 17th to 52nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the transformant described in (11) is cultured to produce and accumulate the protein described in (1) or the partial peptide described in (7), and to collect the protein.
  • a method for screening for a receptor agonist or an amino gonist comprising using the protein described in (1) or the partial peptide described in (7) or a salt thereof,
  • the protein described in (1) or the partial peptide described in (7) containing the protein described in (1) or the partial peptide described in (7) or a salt thereof is used.
  • the partial peptide may include the protein described in (1) or the partial peptide described in (7) or a salt thereof and a test peptide. In the case of contacting the compound, the receptor or its partial peptide and
  • (30) Contains a receptor antenna gonist obtained by using the screening method described in any of (19) and (25) to (27) or the screening kit described in (20). Medicine,
  • Neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic vitamin! ) Resistance rickets (XLH), hypophosphatemic rickets showing autosomal dominant inheritance (ADHR), hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH), vitamins! ) Refractory sickness, osteomalacia, osteoporosis, renal osteodystrophy, secondary hyperparathyroidism, Paget's disease, renal fungal syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, The medicament according to (30), which is an agent for preventing or treating cystic fibrous osteomyelitis and renal failure.
  • the cell stimulating activities mediated by the receptions evening one of cells containing e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, change in intracellular C a 2+ concentration, intracellular c AMP production, intracellular cGMP production, Ino DOO one Berlin acid production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, low pH - bottom etc.
  • Na + - transport activity 25-hydroxyvitamin D 3-1 Fei - hydroxylase over peptidase activity, 25-hydroxy (22)
  • the screening method according to (22) wherein activities such as vitamin D 3 -24-hydroxylase activity are measured and compared.
  • the protein described in (1) or the protein described in (7) obtained using the screening method described in (22) or (32) or the screening kit described in (23).
  • a medicament comprising a compound having a function of inhibiting a proteinase that degrades a partial peptide of (34)
  • the protein according to (1) which is obtained by using the screening method according to any of (34) to (35) or the screening kit according to (36). Or a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of the partial peptide or the salt thereof described in (7) and Recept Yuichi,
  • Neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic vitamin]] resistant rickets (XLH), autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR), Hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH), vitamin D resistant Disease, osteomalacia, osteoporosis, renal osteodystrophy, secondary parathyroid hyperplasia, Paget's disease, renal fungicidal syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, cystic fibrosis It is a prophylactic and therapeutic agent for osteomyelitis, renal failure, or hyperphosphatemia, arteriosclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal failure, etc. (38) And the like. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the phosphatonin protein of the present invention contained in the plasmid pCR-PHOS obtained in Example 1, and the amino acid sequence of the phosphatonin protein of the present invention deduced therefrom. (Continued in Figure 2).
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the phosphatonin protein of the present invention contained in the plasmid obtained in Example 1: pCR-PHOS, and the amino acid sequence of the phosphatonin protein of the present invention deduced therefrom. (Continued from Figure 1 and continued to Figure 3).
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the phosphatonin protein of the present invention contained in the plasmid pCR-PHOS obtained in Example 1, and the estimated amino acids of the phosphatonin protein of the present invention. The sequence is shown (continued in Figure 2 and continued in Figure 4).
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the phosphatonin protein of the present invention contained in the plasmid pCR-PHOS obtained in Example 1, and the amino acid sequence of the phosphatonin protein of the present invention deduced therefrom. (Continued from Figure 3).
  • FIG. 5 shows the degree of hydrophilicity / hydrophobicity of the phosphatonin protein of the present invention obtained in Example 1 estimated from the amino acid sequence of the protein by the Kyte Doo1 itt1e method.
  • FIG. 6 shows a plasmid construction diagram of plasmid pTCII-mPHOS-2 obtained in Example 2.
  • FIG. 7 shows the SDS of the phosphatonin protein of the present invention obtained in Example 3. 1 shows a polyacrylamide gel electrophoretogram.
  • FIG. 8 shows the results of HPLC analysis of the phosphatonin protein of the present invention obtained in Example 3.
  • FIG. 9 shows an N-terminal sequence analysis diagram of the phosphatonin protein of the present invention obtained in Example 3.
  • FIG. 10 shows an SDS polyacrylamide gel electrophoresis diagram of the phosphorylated Phosphaionin obtained in Example 3.
  • FIG. 11 shows a calibration curve in Phosphatonin ELISA.
  • FIG. 12 shows the amount of the phosphatonin protein of the present invention in human serum.
  • FIG. 13 shows a plasmid construction diagram of the plasmid pT-PH0SF-11 obtained in Example 6.
  • FIG. 14 shows an SDS polyacrylamide gel electrophoresis diagram of the phosphatonin protein of the present invention obtained in Example 7.
  • FIG. 15 shows the results of measuring the activity of the phosphatonin protein described in Example 8.
  • the protein of the present invention is a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and more preferably the 17th to 17th amino acids of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. It is a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the fifth amino acid sequence.
  • the protein of the present invention can be used, for example, in any cells of human warm-blooded animals (eg, guinea pig, rat, mouse, chicken, rabbit, pig, sheep, pigeon, poma, monkey, etc.) (eg, spleen cells, nerve cells, Glial cells, thyroid cells] 3 cells, bone marrow cells, mesangial cells, Langernon's cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macro Phage, ⁇ cells, ⁇ cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, osteocytes, osteoblasts, Osteoclasts, mammary gland cells, hepatocytes or stromal cells, or progenitor cells, stem cells or cancer cells of these cells,
  • Examples of the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence at positions 17 to 52 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 from position 17 Approximately 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, still more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more Examples include amino acid sequences having homology.
  • amino acid sequence substantially identical to SEQ ID NO: 1 examples include, for example, about 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequence has about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology.
  • the protein of the present invention containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence at positions 17 to 52 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, as described above, Has an amino acid sequence substantially the same as the 17th to 52nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 17 to the 5th to 25th amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • a protein having substantially the same activity as a protein containing is preferred.
  • the protein of the present invention containing an amino acid sequence substantially identical to SEQ ID NO: 1 has an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 as described above; A protein having substantially the same activity as the protein having the amino acid sequence represented by 1 is preferred.
  • substantially equivalent activities include: phosphorus diuretic activity, hypophosphatemia-inducing activity, Na + -Pi transport inhibitory activity in kidney cells, 25-hydroxyvitamin D 3-1 -hydroxylase inhibitory activity, 25- hydroxyvitamin D 3 - such as 24 hydroxylase one peptidase promoting activity.
  • substantially the same quality means that their activities are the same in nature.
  • Na + phosphate diuretic activity, hypophosphatemia-inducing activity, in kidney cells - transport inhibitory activity, 25-hydroxyvitamin D 3 -1 - arsenide hydroxylase inhibitory activity, 25-hydroxy vitamin D 3-24-hydroxylase-promoting activity And the like are preferable (eg, about 0.5 to 2 times), but the quantitative factors such as the degree of activity and the molecular weight of the protein may be different.
  • the protein of the present invention also includes (1) one or two or more amino acids in the 17th to 52nd amino acid sequences of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, 1 to 80, preferably 1 to 80); About 20 amino acids, more preferably about 1 to 9 amino acids, and even more preferably several (one or two) amino acids, and 2 an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 from the 17th to the 52nd.
  • SEQ ID NO: 1 for example, 1 to 80, preferably 1 to 80
  • 5 or more amino acids in the fifth amino acid sequence (for example, 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, more preferably several (1 or 2))
  • About 20 pieces, more preferably about 1 to 9 pieces, still more preferably a number ⁇ I (1 or 2 pieces) Amino acids) are called Mutin also included, such as a protein containing the amino acid sequence are substituted with other amino acids.
  • the protein of the present invention includes (1) one or two or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably An amino acid sequence in which about 1 to 9, more preferably several (1 or 2) amino acids have been deleted, 2) 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, 1 to 80) (Preferably about 1-20, more preferably about 1-9, and more preferably several (1 or 2)) amino acids to which amino acid is added; 3 represented by SEQ ID NO: 1.
  • Amino acid sequence One or more (for example, 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, and more preferably several (1 or 2) amino acids) And so-called mucins such as proteins containing an amino acid sequence in which is substituted with another amino acid.
  • the position of the deletion or substitution is not particularly limited.
  • the left end is the N-terminal (amino terminal) and the right end is the C-terminal (carboxyl terminal) according to the convention of peptide labeling.
  • the protein of the present invention including the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, has a C-terminal lipoxyl group (one COOH), carboxylate (—COO—), amide (—CONH 2 ) or It can be any of esters (-COOR).
  • the R of the ester group for example, methyl, Echiru, n- propyl, (E alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikurobe pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, C 6, such as ⁇ - naphthyl - 1 2 Ariru group, e.g., benzyl, a one-naphthoquinone Chiru C E _ 2 alkyl group such as phenylene Lou C Bok 2 alkyl or ⁇ - naphthylmethyl such phenethyl C 7 _ E 4 other Ararukiru groups, such as pivaloyl I Ruo carboxymethyl group which is generally used as an oral ester.
  • E alkyl groups such as isopropyl, n- butyl, Shikurobe pentyl, C 3, such as cyclohexyl - 8
  • the protein of the present invention When the protein of the present invention has a lipoxyl group (or lipoxylate) at a position other than the C-terminus, the protein of the present invention includes a carboxyl group amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • the protein of the present invention may be any of the above-mentioned proteins in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected by a protecting group (for example, an acyl group such as a formyl group or an acetyl group), Dalmidyl group formed by cleavage in vivo and oxidized by darminin, or a substituent on the side chain of an amino acid in the molecule (for example, —OH, —SH, amino group, imidazole group, A suitable protecting group (eg, formyl group, guanidino group, etc.) Examples include those protected with an acyl group such as a cetyl group, and complex proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bonded.
  • a protecting group for example, an acyl group such as a formyl group or an acetyl group
  • Dalmidyl group formed by cleavage in vivo and oxidized by darminin or a substituent on the side chain
  • the protein of the present invention includes, for example, a protein derived from a tumor of a human ⁇ HO patient having an amino acid sequence from the 17th to the 52nd of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: A protein derived from a tumor of a human OHO patient having the amino acid sequence represented by 1 is suitable.
  • the 17th to 52nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is a sequence obtained by removing the secretory signal sequence from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • Examples of the partial peptide of the protein of the present invention include the same activities as those of the protein of the present invention described above, for example, phosphorus diuretic activity, hypophosphatemia-inducing activity, Na + -Pi transport inhibitory activity in kidney cells, 25-hydroxy vitamin D 3 - 1 alpha-hydroxylase over peptidase inhibitory activity, may be any one as long as the peptide having etc. 25-hydroxyvitamin D 3-24-hydroxylase-promoting activity.
  • a partial peptide having the 17th to 52nd amino acid sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a partial peptide having the 17th to 330th amino acid sequence A partial peptide having an amino acid sequence from the 3rd to the 5th to the 25th is preferably used.
  • the partial peptide of the present invention includes a peptide having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and substantially containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. Partial peptides having the same activity are preferred.
  • substantially equivalent activity e.g., phosphorus diuretic activity, hypophosphatemia-induced activity, Na + -Pi transport inhibitory activity in kidney cells, 25-hydroxyvitamin D 3 -1 a - hydroxylase inhibitory activity, 25-hydroxyvitamin D "24-hydroxylase-promoting activity, etc.
  • substantially equivalent activity e.g., phosphorus diuretic activity, hypophosphatemia-induced activity, Na + -Pi transport inhibitory activity in kidney cells, 25-hydroxyvitamin D 3 -1 a - hydroxylase inhibitory activity, 25-hydroxyvitamin D "24-hydroxylase-promoting activity, etc.
  • substantially equivalent activity e.g., phosphorus diuretic activity, hypophosphatemia-induced activity, Na + -Pi transport inhibitory activity in kidney cells, 25-hydroxyvitamin D 3 -1 a - hydroxylase inhibitory activity, 25-hydroxyvitamin D "24-hydroxylase-promoting activity, etc.
  • Substantially the same quality means that those activities are of the same nature in nature.
  • the partial peptides of the present invention also include those that are (antagonistic) inhibitory forms of the protein of the present invention, that is, those that have the activity of inhibiting the activity of the protein of the present invention.
  • the partial peptide of the present invention has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 in an amount of about 40% or more, preferably 60% or more, more preferably about 80% or more, and still more preferably about 90% or more. Most preferably, a partial peptide of a protein having a homology of about 95% or more is used.
  • amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (for example, 1 to 8) 0, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, and still more preferably several amino acids, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 has 1 or An amino acid sequence to which two or more (for example, 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, and still more preferably several) amino acids are added, represented by SEQ ID NO: 1 1 or 2 in the amino acid sequence
  • a protein containing an amino acid sequence in which the above amino acids are substituted (for example, 1 to 80, preferably about 1 to 20, more preferably about 1 to 9, and still more preferably several) with another amino acid Partial peptides are also included.
  • amino acid sequence A A partial peptide having homology of about 95% or more is used.
  • amino acids in amino acid sequence A for example, about 1 to 80, preferably about 1 to 20
  • Additional amino acid sequences, one or two or more of the amino acid sequence A (Example For example, a partial peptide containing an amino acid sequence in which 1 to 80 amino acids, preferably about 1 to 20 amino acids, more preferably about 1 to 9 amino acids, and still more preferably several amino acids) are substituted with another amino acid. Is also included.
  • partial peptide of the present invention may be any of the above partial peptides in which the amino group of the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group (for example, an acyl group such as a formyl group or an acetyl group).
  • a protecting group for example, an acyl group such as a formyl group or an acetyl group.
  • Daltamyl group formed by cleavage of the end side in vivo, pyroglutamine oxidation, substituent on the side chain of amino acid in the molecule for example, 100H, 1SH, amino group, imidazole group, indole group, guanidino group) group, etc.
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, those protected by Asechiru such C 6 Ashiru group such group
  • sugar chains are also conjugated peptides such as glycopeptides bound.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid) or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, Salts with co-octanoic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • the protein of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned human warm-blooded animal cells, tissue or plasma by a protein purification method known per se, or contains a DNA encoding the protein described below. It can also be produced by culturing a transformant. In addition, it can also be produced by the protein synthesis method described below or according to it.
  • a commercially available resin for protein synthesis can be usually used.
  • a resin include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4 -Hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenylhydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl) L-Fmoc aminoethyl) phenoxy resin and the like.
  • an amino acid having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target protein according to various known condensation methods.
  • protein is excised from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to convert the target protein, its partial peptide or their amide form. get.
  • the protected amino acids described above various activating reagents that can be used for protein synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • the sulfo imides include DCC, ⁇ , ⁇ ′-diisopropyl carbopimide, ⁇ -ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, H ⁇ B t, HOOB t), or may be pre-formed as a symmetric anhydride or HOB t ester or H ⁇ OB t ester.
  • Protected amino acids can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • solvents known to be usable for the protein condensation reaction For example, N, N-dimethylformamide, N-methylpyrrolidone, black form, trifluoroethanol, dimethyl sulfoxide, DMF, dimethyl sulfoxide, pyridine, black form, dioxane, methylene chloride, tetrahydrofuran, Acetonitrile, ethyl acetate, N-methylpyrrolidone or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for a protein bond formation reaction, and is usually appropriately selected from a range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the raw material include Z, Boc, Yuichiri Sharria Miloxyl Capillon, Isopolonyloxycarponyl, 4-Methoxybenziloxycarponyl, CI—Z, Br—Z, Adaman
  • chlorocarbyl, trifluoroacetyl, phthalyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the protecting group for the carbonyl group include alkyl esters (for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl and the like), benzyl Ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxy benzyl ester, benzene benzyl ester, benzhydryl ester, phenacin ester, benzyloxy carbonyl hydrazide, Yuichi Shari butoxy carbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like are used.
  • alkyl esters for example, methyl, ethyl, propyl, butyl, tertiary butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cycloocty
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • a group suitable for this esterification for example, a lower alkanol group such as an acetyl group, an arylo group such as a benzoyl group, a group derived from carbon such as a benzyloxycarponyl group, an ethoxycarponyl group, and the like are used.
  • Examples of a group suitable for etherification include a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, and a t-butyl group.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C l 2 one B z 1, 2-two Torobenjiru, B r- Z, evening, such as single-tertiary butyl used
  • B z 1, C l 2 one B z 1, 2-two Torobenjiru, B r- Z, evening, such as single-tertiary butyl used
  • protecting group for imidazole of histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Tos 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Activated carbonyl groups of the raw materials include, for example, corresponding anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt).
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichloromouth phenol, 2,4 -Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, ester with HOBt.
  • a method for removing (eliminating) a protecting group for example,? (1-Black Purification?-Catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as carbon, or anhydrous hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or Acid treatment with a mixed solution thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., reduction with sodium in liquid ammonia, and the like are also used. Generally, the reaction is carried out at a temperature of about 120 ° C.
  • Protection and protection of functional groups that should not be involved in the reaction of the raw materials, elimination of the protective groups, activation of the functional groups involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • Another method for obtaining an amide form of a protein is to first amidate and protect the a-hydroxyloxyl group of the carboxyl-terminal amino acid, and then attach a peptide (protein) chain to the amino group to the desired length. After the elongation, a protein in which only the N-terminal a-amino group protecting group was removed from the peptide chain and a protein in which only the C-terminal protecting group of lipoxyl group was removed were produced. Condensation in such a mixed solvent.
  • condensation reaction Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected protein obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude protein can be obtained. This crude protein is purified by various known purification means, and the main fraction is lyophilized to obtain an amide of the desired protein.
  • an a-carboxyl group of a carboxy-terminal amino acid is condensed with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then an ester of a desired protein is prepared in the same manner as the amide of a protein. You can get your body.
  • the partial peptide of the protein of the present invention or a salt thereof can be produced according to a peptide synthesis method known per se, or by cleaving the protein of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or amino acid capable of constituting the protein of the present invention is condensed with the remaining portion, and when the product has a protecting group, the protecting group is eliminated to produce the desired peptide. Can be. Examples of known condensation methods and elimination of protecting groups include the methods described in the following 1 to 5.
  • the protein of the invention can be purified and isolated.
  • the protein obtained by the above method is a free form, it can be converted to an appropriate salt by a known method, and when it is obtained by a salt, it can be converted to a free form by a known method. Can be.
  • the DNA encoding the protein of the present invention may be any DNA as long as it contains the above-described nucleotide sequence encoding the protein of the present invention. Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from the aforementioned cell-tissue, cDNA library derived from the aforementioned cell'tissue, and synthetic DNA.
  • the vector used for the library 1 may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a prepared mRNA fraction from the above-mentioned cells and tissues.
  • examples of the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include: (1) DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, (2) SEQ ID NO: : An activity equivalent to that of a protein having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, which hybridizes to a DNA having the nucleotide sequence represented by 2, for example, phosphorus diuretic activity, hypophosphatemia-inducing activity, Na + in kidney cells - Pi transport inhibitory activity, 25-hydroxy vitamin D 3 - 1 ⁇ - human hydroxylase inhibitory activity, 25-hydroxy vitamin D 3 - 24- hydroxylase promoting activity such as encoding a protein having D New alpha and the like are used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 include, for example, about 40% or more, preferably about 60% or more, more preferably 80% or more, more preferably the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the hybridization may be carried out according to a method known per se or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). Can be. When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be carried out under high stringency conditions.
  • High stringency conditions include, for example, sodium concentrations of about 19-4
  • 0 mM preferably about 19 to 2 O mM, and a temperature of about 50 to 70 ° C, preferably about 60 to 65 ° C.
  • the sodium concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • DNA ′ encoding the protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and the like are used. Further, as the DNA containing the DNA encoding the protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention, for example, DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA as long as it contains a base sequence encoding the above-described partial peptide of the present invention.
  • the DNA encoding the partial peptide includes, for example, the 49th to 15.7th, the 49th to 900th, and the 91st to 157th of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • DNA having the fifth base sequence is used.
  • the DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof may be cloned by PCR using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the DNA encoding the protein of the present invention by PCR.
  • Amplify the target DNA from the first place or use an appropriate vector Can be selected by hybridization with a DNA fragment having a part or the entire region of the protein of the present invention or labeled with a synthetic DNA.
  • Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA encoding the cloned protein of the present invention or its partial peptide can be used as it is, or digested with a restriction enzyme, or added with a linker, if desired.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon at the 5 'end and TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. These translation start codon and translation stop codon can also be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • An expression vector for a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof may be prepared by, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from the DNA encoding the protein of the present invention, and It can be produced by ligating downstream of a promoter in an expression vector.
  • Examples of the vector include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSH19, DSH15), pacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, For example, pcDNAI / Neo is used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoters when animal cells are used as hosts, SR promoters, SV40 promoters, LTR promoters, CMV promoters, HSV-TK promoters, etc. And so on.
  • CMV promoter SR promoter and the like.
  • the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, ⁇ PL promoter, lpp promoter, etc., and if the host is a Bacillus genus, SPOL promoter.
  • yeast such as 2 promoters and penP promoters, PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, and ADH promoter are preferred.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • the expression vector may contain, in addition to the above, an enhancer, a splicing signal, a polyA addition signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40 ori), if desired. Anything can be used.
  • the selection marker include a dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dh ⁇ r) gene (methotrexate (MTX) resistance) and an ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp) And neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo, G418 resistance) and the like.
  • dhfr gene is used as a selection marker using CHO (dhfr ⁇ ) cells, selection can be made even on a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host to the N-terminal side of the protein. If the host is a genus Escherichia, Pho A signal sequence, OmpA signal sequence, etc., if the host is a Bacillus genus, the amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc. In the case of yeast, MFa signal sequence, SUC2 signal sequence, etc.
  • the host is an animal cell, for example, insulin signal sequence, 0; interferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. Available for each.
  • a transformant can be produced by introducing a vector containing the DNA encoding the protein of the present invention thus constructed into cells.
  • Examples of the host include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, animal cells, and the like.
  • Escherichia examples include Escherichia coli Kl 2 ⁇ DH1 [Procedures of the national academy ⁇ ob ⁇ genetics ⁇ ob ⁇ the sae ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research], (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981)]: JA221 [Journal of Ob. Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)], ⁇ 101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (169)], C 600 [Genetics ( Genetics), Vol. 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, 95, 8). 7 (1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-1, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Scizosaccharomyces pombe NCYC 1913, NCYC 203.6, Pichia pasta Chis (Pichia pastoris) etc. are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a larva of night rob moth (Spodoptera frugiperdacell; Sf cell), MG1 cell derived from the midgut of Tricfioplusia ni, and High derived from egg of Trichoplusia ni Five TM cells, cells derived from Maraestra brassicae or cells derived from Estigmena acrea are used. When the virus is BmNPV, a silkworm-derived cell line (Bombyxmori N; BmN cell) or the like is used. Examples of the S ⁇ cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, JL et al. (in Vitro), 13, 213-217, (1977)).
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-1, COS-7, Vero cells, Chinese hamster cells CH ⁇ (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hams Yuichi cells CHO (hereinafter CHO (dh fr-) cell abbreviated), L cells, myeloma cells, human FL cells, 293 cells, C 127 cells, BALB 3T3 cells, S p-2/0 c CHO cells among these cells, etc. are used, CH_ ⁇ (Dh fr-) cells, 293 cells and the like are preferred.
  • Transformation of yeast is carried out, for example, according to the method described in Methods in Enzymology, Vol. 194, 182-187 (1991).
  • Transformation of animal cells can be performed, for example, according to the method described in Cell Engineering Separate Volume 8, New Cell Engineering Experiment Protocol, 263-267 (1995) (published by Shujunsha).
  • Methods for introducing an expression vector into cells include, for example, the calcium phosphate method [Graham FL and van der Eb AJ Virology 52, 456- 467 (1973)], DEAE—dextran method [Sompayrac LM and Danna KJ Prossings of the national academy of ob schengies 'ob' the usa (Pro atl. Acad Sci. USA) 78, 7575-7578, 1981), Lipofexion method [MaloneR.W. Et al. Prosessing's * ob-the-National-Academy-ob-science-of-the-uess. (Proc. Nail. Acad. Sci. USA) 86, 6077-6081, 1989], electroporation! : Nuemann E. et al. Empo Journal (EMBO J.) 1, 841-845 (1982)].
  • a method for stably expressing the protein of the present invention using animal cells there is a method of selecting, by clonal selection, cells in which the expression vector introduced into the animal cells is integrated into the chromosome. Specifically, transformants can be selected using the above selection marker as an index. Furthermore, a stable animal cell strain having a high expression ability of the protein of the present invention can be obtained by repeatedly performing clone selection on the animal cells obtained using the selection marker.
  • the MTX concentration is gradually increased, and culture is performed.
  • the DNA encoding the protein poor of the present invention together with the dh ir gene can be used in cells. It can also be amplified in situ to obtain higher expressing animal cell lines.
  • the above-mentioned transformant is cultured under conditions under which a DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be expressed, and the protein of the present invention or the partial peptide thereof is produced and accumulated, whereby the protein of the present invention, The partial peptide or a salt thereof can be produced.
  • a liquid medium is suitable as a medium to be used for cultivation.
  • Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are included.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • nitrogen sources include inorganic or organic substances such as ammonium salts, nitrates, corn liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and inorganic substances such as calcium chloride. Sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride and the like are used, respectively.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing the genus Escherichia include, for example, an M9 medium containing Darcos and force amino acids (Miller, Journal of Obex, Remenin in 'Moleculara Genetics (Journal) 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972], where necessary to add a drug such as 3; 8-indolylacrylic acid to make the promoter work more efficiently. Can be.
  • cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
  • the medium used is not Grace's Insect Medium (Grace, TC, Nature, 195, 788 (1962)).
  • Grace's Insect Medium those to which an additive such as activated 10% serum or the like is appropriately added are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM medium [Virology, Vol. 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association] 199, 519 (1967) )], And 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine; 73, 1 (1950)].
  • the pH is preferably about 6 to 8. Cultivation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 72 hours, and aeration and stirring are added as necessary.
  • DMEM medium containing dialysed fetal serum containing almost no thymidine.
  • the protein of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the supernatant is separated from the cells or cells by a method known per se, and the supernatant is collected.
  • the production can be carried out by appropriately combining known separation and purification methods.
  • These known separation and purification methods mainly include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight.
  • Method using difference in charge such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity or mouth chromatography, hydrophobic chromatography and reversed-phase high-performance liquid
  • a method using a difference in hydrophobicity such as mouth chromatography, a method using a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing, and the like are used.
  • the thus-obtained protein of the present invention is obtained in a free form, it can be converted to a salt by a method known per se or a method analogous thereto, and conversely, when the protein of the present invention is obtained in a salt, it is known. It can be converted to the free form or other salts by the method or a method analogous thereto.
  • the protein of the present invention produced by the recombinant can be arbitrarily modified or the polypeptide can be partially removed by applying an appropriate protein modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus produced protein of the present invention can be measured by an enzyme immunoassay using a specific antibody or the like.
  • An antibody against the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof is an antibody that can recognize the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof (hereinafter, may be abbreviated as the protein of the present invention).
  • Polyclonal antibodies and monoclonal antibodies are examples of polyclonal antibodies.
  • An antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention) can be produced by using the protein of the present invention as an antigen according to a method for producing an antibody or antiserum known per se.
  • the protein of the present invention is capable of producing an antibody upon administration to a warm-blooded animal. It is administered by itself or together with a carrier or diluent. Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Administration can usually be performed once every 2 to 6 weeks, for a total of about 2 to 10 times. Examples of the warm-blooded animal used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse is selected, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • an antigen for example, an individual with an antibody titer from a mouse is selected, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled protein described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation is performed in a known manner, for example,
  • fusion promoter examples include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • myeloma cells examples include NS-1, P3U1, SP 2/0, and AP-1, and P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is about 1: 1 to 20: 1, and PEG (preferably PEG 1000 to PEG6000) is used at a concentration of about 10 to 80%.
  • the cell fusion can be carried out efficiently by adding the mixture and incubating at 20 to 40 ° C., preferably 30 to 37 for 1 to 10 minutes.
  • Various methods can be used to screen the monoclonal antibody-producing hybridoma, for example, adding the hybridoma culture supernatant to a solid phase (eg, microplate) on which the protein antigen is adsorbed directly or together with a carrier. Then, an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme (anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A is added, and the monoclonal bound to the solid phase is added.
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-immunoglobulin antibody labeled with a radioactive substance or an enzyme anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is a mouse
  • protein A protein A
  • Detect antibodies Method, adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a protein labeled with a radioactive substance or an enzyme, and detecting the monoclonal antibody bound to the solid phase. Used.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a method known per se or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in a medium for animal cells supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine). As a selection and breeding medium, any medium can be used as long as the hybridoma can grow.
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • RPMI 1640 medium containing 1 to 20%, preferably 10 to 20% fetal bovine serum, GIT medium containing 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or no hybridoma culture medium Serum culture medium (SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) can be used.
  • the culture temperature is usually 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks.
  • the cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by methods known per se, for example, immunoglobulin separation and purification methods [eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE ), Ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method in which antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain antibodies.) Can be performed according to the following.
  • immunoglobulin separation and purification methods eg, salting-out method, alcohol precipitation method, isoelectric point precipitation method, electrophoresis method, ion exchanger (eg, DEAE ), Ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method in which antibodies are collected using an active adsorbent such as protein A or protein G, and the bond is dissociated to obtain antibodies.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, a complex of an immunizing antigen (protein antigen) and a carrier protein is formed, a warm-blooded animal is immunized in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody, and the polyclonal antibody-containing substance of the present invention is collected from the immunized animal. Then, the antibody can be produced by separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier-1 and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by crosslinking the carrier.
  • Any material may be cross-linked at any ratio if it can be efficiently used.
  • serum serum albumin, psiloglopurine, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of about 8 to 1 pptene.
  • a method of binding at a ratio of 0.1 to 20 and preferably about 1 to 5 is used.
  • Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • glutaraldehyde, carbodiimide, a maleimide active ester, an active ester reagent containing a thiol group or a dithioviridyl group, or the like is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal at a site where antibody production is possible or together with a carrier or diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration can usually be performed once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be preferably collected from blood, such as blood or ascites, of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the measurement of the polyclonal antibody titer in the antiserum can be performed in the same manner as the measurement of the antibody titer in the serum described above.
  • Antibody separation and purification can be performed according to the same method for immunoglobulin separation and purification as described above for the monoclonal antibody.
  • the antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to the DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention includes the nucleotide sequence of DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention.
  • Any antisense DNA can be used as long as it is an oligonucleotide or a derivative thereof having a nucleotide sequence complementary to a partial nucleotide sequence thereof and having an effect of suppressing the expression of the protein or the partial peptide. You may.
  • the complementary nucleotide sequence is, for example, about 4% of the entire nucleotide sequence or partial nucleotide sequence of DNA or mRNA encoding the protein or partial peptide of the present invention.
  • Base sequences having a homology of 0% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 80% or more, and still more preferably about 90% or more.
  • the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the protein of the present invention is about 40% or more, preferably Antisense DNAs having a homology of about 60% or more, more preferably about 80% or more, even more preferably about 90% or more are suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the protein of the present invention, a partial peptide thereof or a salt thereof includes, for example, a phosphorus diuretic activity, a hypophosphatemic-inducing activity, a Na + -Pi transport inhibitory activity in kidney cells, and 25-hydroxyvitamin D 3-1 -hydroxylase.
  • inhibitory activity, 25-hydroxy vitamin D 3 - 24 - has the effect of such hydroxylase promoting activity. Therefore, the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof can be used for various uses.
  • a protein of the present invention a partial peptide thereof, or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as the protein of the present invention), a DNA encoding the protein of the present invention (hereinafter abbreviated as a DNA of the present invention)
  • a DNA of the present invention a DNA encoding the protein of the present invention
  • the protein of the present invention and the DNA of the present invention include, for example, preventive and therapeutic agents for hyperphosphatemia, arterial sclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal failure, etc. It is useful as a medicine.
  • the protein of the present invention or the DNA of the present invention is used as the above-mentioned medicine, for example, if necessary, orally as a sugar-coated tablet, capsule, elixir, microcapsule or the like, or water Alternatively, it can be used parenterally in the form of an injectable preparation such as a sterile solution with other pharmaceutically acceptable liquids or a suspension.
  • an injectable preparation such as a sterile solution with other pharmaceutically acceptable liquids or a suspension.
  • the protein or DNA of the present invention It is manufactured by admixing with approved carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. in the unit dosage form generally required for the practice of the drug product. be able to.
  • the amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • the DNA of the present invention is used, the DNA is administered alone or after insertion into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, or an adenovirus associated virus vector. be able to. Additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc.
  • the above-mentioned type of material may further contain a liquid carrier such as oil and fat.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to standard pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending the active substance in vehicles such as water for injection, and naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. it can.
  • aqueous liquid for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.) and the like are used.
  • Agents for example, alcohols (eg, ethanol, etc.), polyalcohols (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), nonionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM , HCO-50, etc.) You may use together.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizing agent.
  • buffers eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene dalicol, etc.
  • Preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants eg, antioxidants and the like.
  • the adjusted injection solution is usually Filled in prills.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, birds, sheep, bush, horses, horses, Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, birds, sheep, bush, horses, horses, Cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the protein or DNA varies depending on the symptoms, but in the case of oral administration, generally, in an adult arteriosclerosis patient (as 60 kg), the amount of the active ingredient per day is generally about 60 kg. 0.1 mg to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg.
  • the single dose varies depending on the administration subject, target tissue, symptoms, administration method, etc.
  • the active ingredient is administered by intravenous injection in an amount of about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 2 Omg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. It is convenient. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • the DNA of the present invention can be used as a probe in humans or warm-blooded mammals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, pigs, pigs, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • An abnormality (gene abnormality) in DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof can be detected. Therefore, the DNA of the present invention is useful as an agent for genetic diagnosis of various diseases involving the protein of the present invention.
  • DNA or mRNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof is detected to be damaged, deficient, or reduced in protein expression, for example, hyperphosphatemia, arteriosclerosis, It can be diagnosed as a possible disease such as acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy or renal failure.
  • DNA encoding the protein of the present invention or a partial peptide thereof may be used. If increased mRNA or protein expression is detected, e.g., neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic vitamin D resistance Rickets (XLH), hypophosphatemia with autosomal dominant inheritance rickets (ADHR), hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH), vitamin D resistant rickets, bone softening Disease, osteoporosis, renal osteodystrophy, secondary hyperparathyroidism, Paget's disease, renal fungal syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, cystic fibrous osteomyelitis, renal failure Can be diagnosed as a possible disease.
  • neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic vitamin D resistance Rickets (XLH), hypophosphatemia with autosomal dominant inheritance rickets (ADHR), hypophosphatemic
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention can be performed, for example, by the known Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pages 874 to 879 (19). 1989), The Prossings of the National Academy 'ob Sciences of the USA
  • the present invention provides a method for quantifying the protein of the present invention in a test solution, which comprises measuring the activity of a labeling agent on an insolubilized carrier after a specific reaction.
  • one of the antibodies is the N-terminal of the protein of the present invention. It is preferable that the other antibody is an antibody that recognizes the C-terminal, and the other antibody reacts with the C-terminal of the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as a monoclonal antibody), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • a monoclonal antibody against the protein of the present invention
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2, Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and may be an antibody, an antigen, or an antibody-antigen complex corresponding to the amount of the antigen (eg, the amount of the protein) in the test solution. Any measurement method may be used as long as the amount is detected by chemical or physical means, and the amount is calculated from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen. For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method, and a sandwich method are preferably used, but in terms of sensitivity and specificity, a sandwich method described later is particularly preferable.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • a radioactive isotope for example, [1 2 5 I], [1 3 1 I], [3 H], and [1 4 C]
  • the enzyme large is stable and specific activity Preferred are, for example, / 3-galactosidase,] 3-darcosidase, alkaline phosphatase, oxidase, malate dehydrogenase, etc.
  • fluorescent substances include, for example, fluorescamine, For example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin, and the like are used as luminescent substances.
  • a biotin-avidin system can be used for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; polystyrene; polyacrylamide; Synthetic resin such as concrete or glass is used.
  • the test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody (primary reaction), and further reacted with the labeled monoclonal antibody (secondary reaction), and then the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured.
  • primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be the same as those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the labeling antibody does not necessarily need to be one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. You may.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different binding site to the protein of the present invention. That is, for example, when the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction recognizes the C-terminal of the protein of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, such as the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry method.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen, (F), and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated.
  • BZF separation Measure the amount of B, F labeling, and quantify the amount of antigen in the test solution. ''
  • a soluble antibody is used as the antibody
  • BZF separation is performed using polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a force using an immobilized antibody as the first antibody, or a first antibody.
  • a solid-phase method using a solid-phased antibody as the second antibody.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the antigen in the solution is allowed to react with an excessive amount of the labeled antibody, and then the immobilized antigen is added to bind the unreacted labeled antibody to the solid phase, and then the solid phase and the liquid phase are separated.
  • the amount of label in either phase is measured, and the amount of antigen in the test solution is determined.
  • the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is very small and only a small amount of sediment is obtained, a laser-Nef orifice utilizing laser scattering is preferably used.
  • the protein measurement system of the present invention may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the usual conditions and procedures in each method. For details of these general technical means, reference can be made to reviews and textbooks.
  • the protein and the like of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • concentration of the protein of the present invention when the concentration of the protein of the present invention is decreased, for example, hyperphosphatemia, arteriosclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, renal failure, etc. Diagnosis may be a disease.
  • the concentration of the protein of the present invention is increased, for example, neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic vitamin D-resistant rickets
  • XLH hypophosphatemic rickets with autosomal dominant inheritance (ADHR), hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH), vitamins!
  • Resistant rickets bone softening Disease, osteoporosis, renal osteodystrophy, secondary hyperparathyroidism, Paiet's disease, renal fungal syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, cystic fibrous osteomyelitis, renal failure Can be diagnosed as a possible disease.
  • those that can neutralize the activity of the protein of the present invention include, for example, neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemia, and vitamin D resistance.
  • Rickets (XLH) hypophosphatemic rickets with autosomal dominant inheritance (ADHR), hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH), biminmin D-resistant rickets, Osteomalacia, osteoporosis, renal osteodystrophy, secondary hyperparathyroidism, Paget's disease, renal fungal syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, cystic fibrosis It can be used as a medicine for preventing and treating diseases such as osteomyelitis and renal failure.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the protein of the present invention or the like present in a subject such as a body fluid or a tissue. Furthermore, it can be used to prepare an antibody column used for purifying the protein and the like of the present invention, and to detect the protein and the like of the present invention in each fraction at the time of purification. (4) Screening of drug candidate compounds
  • the protein of the present invention can specifically bind to a phosphatonin receptor (hereinafter abbreviated as receptor yuichi) present on renal tubular cells. And a ligand using the protein of the present invention and the receptor.
  • receptor yuichi phosphatonin receptor
  • the present invention provides a method for screening a receptor agonist or an angel gonist using the protein of the present invention.
  • the present invention provides
  • the amount of the protein of the present invention bound to a receptor or a cell containing the receptor Cell stimulating activity through the receptor in the containing cells (e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca2 + concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, such as a decrease in pH), Na + -Pi transport activity, 25-hydroxyvitamin D 3 -1 - hydrin Rokishiraze activity, etc. 25-hydroxyvitamin D 3 _24- hydroxylase activity Is measured and compared.
  • Cell stimulating activity through the receptor in the containing cells e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca2 + concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins,
  • the present invention provides
  • Receptor-mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorus oxidation, such as a decrease in pH
  • Na + -Pi transport activity 25-hydroxyvitamin D 3-1 Fei -.
  • hydroxylase Ichize activity 25-hydroxy shea vitamin D 3 _24- such hydroxylase activity was measured, compared And a method of screening for a receptor agonist or antagonist.
  • a compound that binds to a receptor and inhibits the binding of the protein of the present invention to a receptor can be selected as a receptor agonist or an antagonist.
  • a cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration
  • a cell stimulating activity eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration
  • Fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, pH decrease, etc.), Na + -Pi transport inhibitory activity, 25- hydroxyvitamin D 3 - 1 Fei - hydroxylase inhibitory activity, compounds having such 25-hydroxyvitamin D 3-24-hydroxylase-promoting activity Things and receptions evening can be selected as one Agonisuto while suppressing the cell-stimulating activity activity, Na + -Pi transport promoting activity, 25-hydroxyvitamin D 3 -1 a- hydroxylase promoting activity, 25- hydroxyvitamin D 3 - a compound having an effect such as 24-hydroxylase error peptidase inhibitory activity can be selected as a receptor Ann evening agonist.
  • the compounds comprising phosphorus diuretic activity and hypophosphatemia were selected among the test compounds in which the activity of inhibiting the binding between the protein of the present invention and the receptor was recognized.
  • Inducing activity, receptor-stimulating activity in cells containing the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, such as a decrease in pH
  • Na + in the kidney cells - Pi transport inhibitory activity 25 - hydroxyvitamin D 3 -1 alpha-hydroxylase inhibitory activity, 25-hydroxy vitamin D compounds having activity such as 3-24 hydroxylase Ichize promoting activity can be selected as the receptacle descriptor one Agonisuto, chromatic these activities
  • the free compounds can be selected as receptions evening one antagonist.
  • a phosphatonin receptor expressed in a renal proximal tubular cell of a human or a warm-blooded animal or the like is used.
  • receptors and the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to a protein purification method known per se, and cloned into a DNA encoding the receptor according to a genetic engineering technique known per se. After the targeting, the desired receptor can be obtained according to the above-described method for expressing the protein of the present invention.
  • partial peptide of the receptor a partial peptide obtained by appropriately cleaving the full-length receptor can be used.
  • the labeled protein of the present invention for example, [3 Eta], [125 1], 4 C], Ru can be used as the protein of the present invention labeled with a [35 S].
  • the cells containing the receptor used in the screening method of the present invention those similar to those listed as the host cells used for expressing the protein of the present invention described above can be used. CHO cells and the like are preferred.
  • Receptor-containing cells can be produced using DNA encoding the receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
  • CL 8 cell line (BONE, 18, 159-169, 1996)
  • OK cell line (American Journal of Ob physiology (AMER I CAN JOURNAL) OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227, 1987).
  • the cells can be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • the cell membrane fraction of the cells containing the receptor refers to a fraction containing a large amount of cell membrane obtained by crushing the cells and then using a method known per se.
  • the method for crushing cells is as follows: P 011 er—E 1 veh jem type homogenizer, crushing cells, crushing using a Waring blender or Polytron (Kinematica), sonication, French press Crushing by ejecting the cells from a thin nozzle while applying pressure by using the method.
  • a fractionation method using centrifugal force such as fractionation centrifugation or density gradient centrifugation, is mainly used.
  • the cell lysate is centrifuged at a low speed (500 rpm to 300 rpm) for a short time (usually about 1 minute to 10 minutes), and the supernatant is further spun at a high speed (150 rpm rpm).
  • the membrane fraction is rich in the expressed receptor or the protein of the present invention and a large amount of membrane components such as cell-derived phospholipids and membrane proteins.
  • Receptions evening one amount of cells and the cell membrane fraction of containing the receptor, 1 0 3 to 1 is preferably from 0 8 molecules per cell, 1 0 5-1 0 7 preferred that a molecule It is.
  • Test compounds include, for example, proteins, proteins, non-proteinaceous compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound. ,
  • the reaction between the protein of the present invention and receptor is usually performed at about 37 ° C. for several hours.
  • a cell containing the receptor of the present invention or a cell membrane fraction thereof, or a receptor or a partial peptide thereof is used.
  • a buffer suitable for screening may be a buffer that does not inhibit the binding of the protein of the present invention to Receptu, such as a phosphate buffer having a pH of about 4 to 10 (preferably, a pH of about 6 to 8) or a Tris-HCl buffer. Any may be used.
  • a surfactant such as CHAPS, Tween-80 TM (Kao-Atlas), digitonin, and deoxycholesterol can be added to the buffer.
  • proteases inhibitors such as PMSF, leptin, bacitracin, aprotinin, E-64 (manufactured by Yakuhin Protein Research Institute), and papstatin are added. You can do that too.
  • the cells are immobilized cells, the protein or the like of the present invention and the receptor of the present invention are immobilized in an incubator, that is, in a state where the cells are grown, or by using cells fixed with daltaraldehyde / paraformaldehyde. Can be combined.
  • a medium, Hanks' solution, or the like is used as the buffer. Then, a certain amount (for example, about 10000 c ⁇ ! To 1,000,000 cpm in the case of 2000 Ci / mmo1) of the receptor solution of 0.01 m1 to 10 m1 is labeled with the protein of the present invention or the like (for example, , was added the protein) of the present invention labeled with [125 1], coexist test compound 10_ 4 M ⁇ 10- 1D M simultaneously. To determine the amount of non-specific binding (NSB), a large excess of unlabeled protein of the invention is added. Prepare the reaction tube obtained above.
  • the reaction is carried out at 0 ° C to 50 ° (: preferably 4 ° C to 37 ° C for 20 minutes to 24 hours, preferably 30 minutes to 3 hours.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper and the like, and an appropriate amount of the same buffer is used. After washing, radioactivity remaining on the glass fiber filter paper (e.g., [125 1] the amount of) is measured using a liquid scintillation one Chillon counter or Akaunta one.
  • cell stimulating activity through receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP production
  • Intracellular cGMP production Intracellular cGMP production, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, PH decrease, etc.
  • Na + -Pi transport activity 25-Hydroxyvitamin D 3-1 H-Hydroxylase activity, 25-hydroxy-bi evening Min D 3 - can be measured according to the method analogous activity or its known method such as 24-hydroxylase activity.
  • cells containing the receptor are cultured in a multiwell plate or the like.
  • Substance used as an indicator of cell stimulating activity e.g., Arakidon acid release, acetylcholine release, change in intracellular C a 2 + concentration, intracellular cAMP P production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential change, intracellular
  • an inhibitor for the degrading enzyme may be added to perform the assay.
  • activities such as suppression of cAMP production, forskolin etc. increase the basic production of cells. It can be detected as a production inhibitory effect on the cells that have been set aside.
  • the measurement of a + - ⁇ transport activity can be carried out, for example, according to the method of Cole JA (Cole JA) (AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227 , 1987).
  • Measurement of 25-hydroxyvitamin D 3 -l ⁇ -hydroxylase activity and 25-hydroxyvitamin D 3 -24-hydroxylase activity can be measured, for example, by
  • Examples of cells used for these measurements include established cell lines such as the aforementioned CL8 cell line and ⁇ K cell line.
  • the test compound when the test compound is added, the cells containing the receptor are converted to cell stimulating activities via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, intracellular protein phosphorylation, decrease of PH etc.) rise, decrease of Na + -Pi transport activity, 25-hydroxyvitamin 0 3 -1 When the ⁇ -hydroxylase activity decreases, the 25-hydroxyvitamin D 3 -24-hydroxylase activity increases, etc., the test compound may be selected as a receptor agonist candidate compound. it can.
  • the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ Concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, fluctuation of cell membrane potential, intracellular protein phosphorylation, decrease of PH etc
  • the cells containing the receptor may have a cell stimulating activity through the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, inner cAMP production, intracellular c GMP product, Inoshito - Berlin acid production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, etc. drop in pH) reduction, Na + - Pi transport activity increases, 25-hydroxyvitamin D 3 _l alpha -. hydroxamate Shiraze increased activity, 25-hydroxy-bi evening Min D 3-24-hydroxylase if only to show the active low down, it is possible to select the test compound as a receptor antagonist candidate compound.
  • a cell stimulating activity through the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, inner cAMP production, intracellular c GMP product, Inoshito - Berlin acid production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, etc. drop in pH
  • the screening kit of the present invention comprises a protein of the present invention, preferably a cell containing a receptor-containing cell or a cell membrane fraction thereof. It is.
  • screening kit of the present invention examples include the following. [Screening reagent]
  • CHO cells containing the receptor for the protein of the present invention and the like were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured for 2 days at 37 :, 5% C 2 , and 95% air. thing.
  • Protein of the present invention its partial peptide or a salt thereof [3 H], C 1 5 IK [14 C], [35 S] those labeled with like.
  • the protein of the present invention a partial peptide thereof or a salt thereof is dissolved in PBS containing 0.1% ⁇ serum albumin (manufactured by Sigma) to a concentration of 0.1 ImM and stored at ⁇ 20.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a receptor agonist or an antagonist.
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound that inhibits the binding of the protein of the present invention to a receptor, and specifically, cell stimulation through the receptor.
  • Activity for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol monophosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, pH decrease, etc.
  • Na + -Pi transport inhibitory activity 25-hydroxyvitamin D 3-1 ⁇ -hydroxylase inhibitory activity, 25-hydroxyvitamin D 3 -24-hydroxylase promoting activity
  • a compound or a salt thereof (a so-called receptor agonist) or a cell stimulating activity via the receptor eg, arachidonic acid release, Cetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, generation of intracellular cAMP, generation of intracellular cGMP, production of inositol phosphate
  • the receptor agonist has all or a part of the biological activity of the protein of the present invention, it is useful as a safe and low-toxic drug according to the biological activity.
  • it is useful as a drug for preventing and treating diseases such as hyperphosphatemia, arteriosclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, and renal failure.
  • Recept Yuichi Angonist is useful as a safe and low toxic drug that suppresses the physiological activity of the protein of the present invention because it can suppress all or a part of the physiological activity.
  • neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic vitamin D resistant rickets (XLH), autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR), high Hypophosphatemic rickets with calciumuria (HHRH), vitamin D-resistant rickets, osteomalacia, osteoporosis, renal osteodystrophy, secondary hyperparathyroidism, Paget's disease, kidney
  • diseases such as Fancorn syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, cystic fibrous osteomyelitis, and renal failure.
  • the protein of the present invention or a salt thereof is cleaved by a proteinase present in a living body and inactivated. Therefore, by using the protein of the present invention and the proteinase that degrades the protein of the present invention, a compound having an activity of inhibiting the proteinase that degrades the protein of the present invention can be selected.
  • the compound having the activity of inhibiting the proteinase can promote the activity of the protein of the present invention independent of cell-to-cell contact by preventing inactivation of the protein of the present invention in a living body. It is expected to be used as a drug for the prevention and treatment of diseases such as hyperphosphatemia, arterial sclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy and renal failure.
  • diseases such as hyperphosphatemia, arterial sclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy and renal failure.
  • the present invention provides a method for screening a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades the protein of the present invention or a salt thereof, characterized by using the protein of the present invention. More specifically, the present invention provides
  • a book comprising incubating a proteinase and a test compound that degrades the protein of the present invention with the protein of the present invention and then contacting the protein with a receptor-containing cell.
  • a method for screening a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades the protein of the present invention or a salt thereof is provided.
  • the cell stimulating activity via the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration
  • Na + -Pi transport activity 25-hydroxyvitamin D 3- l monument - hydroxylase activity, 25-hydroxy vitamin D 3 -24 - by measuring the activity of such hydroxylase Ichize activity, than also characterized in that comparison.
  • the present invention provides
  • the present invention provides a method of screening for a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades a light protein or a salt thereof.
  • test compound to be promoted can be selected as a compound having an activity of inhibiting a proteinase that degrades the protein of the present invention or a salt thereof.
  • a phosphatonin receptor expressed in renal proximal tubular cells of a human or a warm-blooded animal is used.
  • the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to a known method for purifying a protein, and after cloning the DNA encoding the receptor according to a known genetic engineering technique, The desired receptor can also be obtained according to the method for expressing the protein of the invention.
  • a proteinase that degrades the protein of the present invention for example, zinc meth bepeptidase, a ⁇ ⁇ X gene product and the like are used.
  • the cells containing the receptor used in the screening method of the present invention those similar to those listed as the host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. , CH ⁇ cells and the like are preferred.
  • the cells containing the receptor can be produced using a DNA encoding the receptor by a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
  • CL 8 cell line BONE, 18, 159-169, 1996)
  • ⁇ K cell line American 'Journal of Ob' physiology (AERI CAN JOURNAL) OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227, 1987).
  • the cells can be immobilized with glutaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • As the cell membrane fraction of the cells containing the receptor the same as those described above can be used.
  • Test compounds include, for example, proteins, proteins, non-proteinaceous compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, and the like. Or a known compound.
  • the incubation of the proteinase with the protein of the present invention can be usually performed for several hours at about 37 ° C.
  • the reaction between the reaction mixture and the cells containing the receptor can usually be carried out at about 37 ° C. for several hours.
  • Receptor-mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuations, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular proteins, such as reduced p H), Na + - P i transport activity, 25-hydroxyvitamin D 3 -1 a - hydroxylase activity, 25 - hydroxyvitamin D 3-24-hydroxylase activity And the like can be measured in the same manner as described above.
  • Receptor-mediated cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuations, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular proteins, such as reduced p H
  • Na + - P i transport activity 25-hydroxyvitamin D 3 -1 a -
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention and a proteinase that degrades the protein of the present invention, and preferably further contains a cell containing a receptor.
  • screening kit of the present invention examples include the following. [Screening reagent]
  • CHO cells containing the receptor for the protein of the present invention and the like are subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 Z-wells, and are incubated at 37 ° C., 5% C 0 2 and 95% air at 2%. Cultured for days.
  • the protein of the present invention a partial peptide thereof or a salt thereof
  • Proteinase that degrades the protein of the present invention Proteinase that degrades the protein of the present invention
  • reaction mixture obtained in (1) and (2) above is cultured for several hours at about 37 ° C with cells containing a receptor for the protein of the present invention.
  • cell stimulating activity via the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, change in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, such as a decrease in PH
  • Na + HPi transport activity 25-hydroxy vitamin D 3 - 1 alpha-hydroxylase Ichize activity, 25-hydroxy vitamin D 3 _24- hydroxylases over Activity is measured according to the method described above.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound having an activity of inhibiting the proteinase of the present invention that degrades protein or a salt thereof.
  • a compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a compound that inhibits a proteinase that degrades the protein of the present invention and suppresses inactivation of the protein of the present invention by the proteinase. is there. Therefore, the compound is capable of stimulating cell stimulating activity through the receptor by the protein of the present invention independent of cell-cell contact (eg, arachidonic acid).
  • the protein of the present invention can specifically bind to a phosphatonin receptor (hereinafter abbreviated as a receptor) expressed in renal proximal tubule cells of humans or warm-blooded animals.
  • a receptor phosphatonin receptor
  • screening of a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after the protein of the present invention binds to the receptor can be performed. Can do it. That is, the present invention provides a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding of a protein of the present invention to a receptor, comprising using the protein of the present invention. provide.
  • the present invention provides
  • the cells after the protein of the present invention binds to the receptor It measures intracellular signal transduction and compares them. More specifically, the present invention provides
  • the binding between the protein of the present invention and the receptor is not inhibited, and the cell stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor (eg, arachidonic acid release, acetylcholine Release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, generation of intracellular cAMP, generation of intracellular cGMP, production of inositol phosphoric acid, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, decrease of pH, etc.
  • the compound of the present invention can be selected as a compound or a salt thereof that promotes intracellular signal transduction after binding to the receptor.
  • the compounds of the present invention are compounds that inhibit concentration fluctuations, intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuations, intracellular protein phosphorylation, pH reduction, etc.) Can be selected as a compound or a salt thereof that inhibits intracellular signal transduction after binding to a receptor.
  • the present screening method is a method for selecting a compound that does not affect the binding of the protein of the present invention to receptor and modulates (promotes or suppresses) intracellular signal transduction after receptor binding.
  • the test compounds used in this screening method include the receptor agonists described above.
  • a phosphatonin receptor expressed in renal proximal tubular cells of a human or a warm-blooded animal or the like is used.
  • the receptor for the protein of the present invention can be obtained according to a known method for purifying a protein, and the DNA encoding the receptor is cloned according to a known genetic engineering technique. Thereafter, the desired receptor can be obtained according to the protein expression method of the present invention described above. .
  • partial peptide of the receptor a partial peptide obtained by appropriately cleaving a full-length receptor can be used.
  • the cells containing the receptor used in the screening method of the present invention those similar to those listed as the host cells used for expressing the protein of the present invention can be used. CHO cells and the like are preferred.
  • the cells containing the receptor can be produced by using a DNA encoding a receptor according to a method known per se, for example, the above-described method for expressing the protein of the present invention.
  • CL8 cell line BONE, 18, 159-169, 1996)
  • OK cell line American Journal of Physiology 253, E221-E227, 1987).
  • the cell when a cell containing a receptor is used, the cell can be fixed with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method can be performed according to a method known per se.
  • As the cell membrane fraction of the cells containing the receptor the same as described above is used.
  • Test compounds include, for example, proteins, proteins, non-proteinaceous compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts And the like. These compounds may be novel compounds or known compounds.
  • the reaction between the protein of the present invention and cells containing the receptor can usually be performed at about 37 for several hours.
  • the cell stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor for example, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular
  • the measurement of cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, phosphorylation of intracellular protein, decrease in pH, etc. can be performed in the same manner as described above.
  • the protein-stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation.
  • the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation.
  • intracellular cAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, pH decrease, etc. are promoted, Or a salt thereof which promotes intracellular signal transduction.
  • the protein-stimulating activity of the protein of the present invention via the receptor eg, arachidonic acid release, acetylcholine release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP Production, inositol phosphate production, fluctuations in cell membrane potential, phosphorylation of intracellular proteins, decrease in pH, etc.
  • a compound or a salt thereof that promotes intracellular signal transduction after receptor binding of the test compound It can be selected as a compound.
  • the screening kit of the present invention contains the protein of the present invention, and preferably further contains a cell containing a receptor.
  • screening kit of the present invention examples include the following. [Screening reagent]
  • CHO cells containing the receptor for the protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 wells and cultured for 2 days at 37 ° C., 5% CO 2 and 95% air.
  • the protein of the present invention a partial peptide thereof or a salt thereof
  • Cell stimulating activity e.g., arachidonic acid release, acetylcholine release, intracellular Ca 2+ concentration fluctuation, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP generation, inositol phosphate production, cell membrane potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, pH Is measured according to the method described above.
  • the protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding to a receptor.
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof can be used as a cell stimulating activity through the receptor after binding of the protein of the present invention to the receptor (eg, arachidonic acid release, acetyl). Promotes choline release, fluctuation of intracellular Ca 2+ concentration, generation of intracellular cAMP, generation of intracellular cGMP, production of inositol phosphate, fluctuation of cell membrane potential, phosphorylation of intracellular protein, lowering of pH, etc.
  • a compound or a salt thereof, or a compound or a salt thereof that inhibits the cell stimulating activity e.g, arachidonic acid release, acetyl.
  • Compounds or salts thereof that promote intracellular signal transduction after binding of the protein and receptor of the present invention include, for example, hyperphosphatemia, arteriosclerosis, acute coronary syndromes, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetes It is useful as a safe and low-toxic drug such as an agent for preventing and treating diseases such as sexual nephropathy and renal failure.
  • Compounds or salts thereof that inhibit intracellular signal transduction after binding of the protein of the present invention to Recept receptor include, for example, neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic vitamin D resistance Sexual rickets (XLH), showing autosomal dominant inheritance Hypophosphatemic rickets (ADHR), hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH), vitamin D-resistant rickets, osteomalacia, osteoporosis, renal osteodystrophy, Safe and preventive and therapeutic agents for diseases such as secondary hyperparathyroidism, Paget's disease, Renal Fanco's syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, cystic fibrous osteomyelitis, and renal failure It is useful as a low toxic drug.
  • the antisense DNA capable of suppressing the expression of the DNA or the mRNA or the protein of the present invention, which complementarily binds to the DNA or the mRNA encoding the protein of the present invention, exhibits the above-mentioned action in vivo.
  • the function of the protein of the present invention or the DNA encoding the same can be suppressed. Therefore, the antisense DNA includes, for example, neoplastic hypophosphatemic osteoarthritis (0H0), familial hypophosphatemic vitamin!
  • Resistant rickets (XLH), hypophosphatemic rickets with autosomal dominant inheritance (ADHR), hypophosphatemic rickets with hypercalciuria (HHRH), vitamin D resistant rickets , Osteomalacia, osteoporosis, renal osteodysplasia, secondary hyperparathyroidism, Paget's disease, renal fungal syndrome, renal tubular acidosis, cystic fibrosis, cystic fibrous osteopathy, It can be used as a preventive and therapeutic agent for diseases such as renal failure.
  • the antisense DNA can be used as a therapeutic or prophylactic agent as described above, and can be carried out in the same manner as the aforementioned therapeutic or prophylactic agent for various diseases containing the protein or DNA of the present invention.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining the presence and expression of the DNA of the present invention in tissues and cells.
  • the present invention relates to a DNA encoding a novel protein “phosphatonin” having a phosphodiuretic activity and Z or hypophosphatemia-inducing activity (hereinafter referred to as “exogenous DNA of the present invention”). Or a mutant DNA thereof (sometimes abbreviated as an exogenous mutant DNA of the present invention).
  • the animal according to (2) wherein the rodent is a mouse or a rat; and (4) a recombinant vector containing the exogenous DNA of the present invention or a mutant DNA thereof and capable of being expressed in a mammal, and
  • An object of the present invention is to provide a drug for gene therapy containing the recombinant vector described in (4).
  • Non-human mammals having the exogenous DNA of the present invention or the mutant DNA thereof include unfertilized eggs, fertilized eggs, germ cells including spermatozoa and their progenitor cells, and the like.
  • the calcium phosphate method, the electric pulse method, the Lipofection method It can be produced by transferring the target exogenous DNA of the present invention by the method, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method or the like.
  • the exogenous DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, organs of living organisms, tissue cells, and the like, and can be used for cell culture, tissue culture, and the like.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing the cells with the above-mentioned germ cells by a cell fusion method known per se.
  • rodents with relatively short ontogenesis and biological cycles in terms of the creation of disease animal model systems, and easy propagation are particularly suitable for rodents, especially mice (eg, pure C57BLZ6 strain, DBA2 strain, etc., B6C 3F strain 1, BDF 1, B6D2F strain 1, BALB / c strain, ICR strain, etc.) or rat (eg, Wi star, SD etc.) Etc. are preferred.
  • mammals in a recombinant vector that can be expressed in mammals include humans and the like in addition to the above-mentioned non-human mammals.
  • the exogenous DNA of the present invention is not the DNA of the present invention originally possessed by a non-human mammal, but includes the DNA of the present invention once isolated and extracted from a mammal.
  • mutant DNA of the present invention examples include those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the base sequence of the original DNA of the present invention.
  • a mutation for example, mutation
  • DNA in which the substitution of DNA has occurred is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means a DNA that expresses an abnormal protein of the present invention, and for example, a DNA that expresses a protein that suppresses the function of a normal protein of the present invention is used.
  • the exogenous DNA of the present invention may be derived from a mammal of the same species or a different species as the target animal.
  • DNAs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • DNAs derived from various mammals eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • a DNA construct eg, a vector
  • various promoters capable of expressing the gene By injecting a DNA construct (eg, a vector) to which the human DNA of the present invention is bound downstream of various promoters capable of expressing the gene into a fertilized egg of a target mammal, for example, a mouse fertilized egg.
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be produced.
  • Examples of the expression vector for the protein of the present invention include plasmids derived from Escherichia coli, plasmids derived from Bacillus subtilis, plasmids derived from yeast, and bacterium such as ⁇ phage. Retroviruses such as lyophage, Moroni leukemia virus, and animal viruses such as vaccinia virus or baculovirus are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast is preferably used.
  • Examples of the promoter that regulates DNA expression include, for example, DNA promoters derived from viruses (eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), and various mammals.
  • viruses eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • various mammals eg, simian virus, cytomegalovirus, Moroni leukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.
  • Animal (human, egret, dog, cat, guinea pig, hamster, rat, mouse, etc.) and birds (chicken, etc.) sources include albumin, insulin II, perovrakin II, eras Lithropoietin, endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, daltathione S-transferase, platelet-derived growth factor, keratin K1, 10 and 14, collagen I and II, cyclic AMP-dependent protein "Ize ⁇ I subunit, dys Trophin, tartrate-resistant alkaline phosphatase, atrial natriuretic factor, endothelial receptor yu-tyrosine kinase (generally abbreviated as Tie 2), sodium-powered adenosine triphosphatase (Na, K-ATP) ase), neurofilament light chain, meta-oral thionein I and IIA, meta-oral proteinase 1
  • the above vector is a messenger of interest in DNA transgenic mammals. It preferably has a sequence that terminates the transcription of RNA (generally referred to as Minaichi Minaichi).
  • Minaichi Minaichi RNA
  • Simian virus SV 40 or the like is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of the eukaryotic DNA, etc. are placed 5 'upstream of the promoter overnight region, the promoter region and the translation region in order to further express the target DNA. It is also possible to ligate between 3 ′ downstream of the translation region or the translation region.
  • the normal translation region of the protein of the present invention is DNA derived from liver, kidney, thyroid cells, fibroblasts derived from various mammals (eg, egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, humans, etc.). Further, it can be obtained as a raw material from a commercially available genomic DNA library as a whole or a part of genomic DNA, or from a liver, kidney, thyroid cell, or fibroblast-derived RNA prepared by a known method as a raw material. In addition, foreign abnormal DNA can produce a translation region obtained by mutating the translation region of a normal protein obtained from the above-described cells or tissues by the point mutagenesis method.
  • the translation region can be prepared as a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal by a conventional DNA engineering technique in which the translation region is ligated downstream of the promoter and, if desired, upstream of the transcription termination site.
  • Transfer of the DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. Presence of the DNA of the present invention in germ cells of animals produced after DNA transfer indicates that all progeny of the produced animals will retain the DNA of the present invention in all of their germ cells and somatic cells. means.
  • the progeny of such animals that have inherited DNA have the DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred can be subcultured in a normal breeding environment as a DNA-bearing animal after confirming that the DNA is stably maintained by mating. .
  • DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage Metastasis is ensured to be present in excess in all germinal and somatic cells of the target mammal.
  • Excessive presence of the DNA of the present invention in the germinal cells of the animal after transfer of the DNA indicates that all of the offspring of the animal produced have the DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells. means.
  • the progeny of such animals that have inherited the DNA will have an excess of the DNA of the present invention in all of their germinal and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA of the present invention expresses the normal DNA of the present invention at a high level, and finally promotes the function of endogenous normal DNA, thereby finally obtaining the protein of the present invention. It may cause hyperfunction of the animal and can be used as a model animal of the disease. For example, using the normal DNA-transferred animal of the present invention to elucidate the pathological mechanism of the hyperactivity of the protein of the present invention and diseases associated with the protein of the present invention, and to examine a method for treating these diseases. And it is possible.
  • the mammal to which the exogenous normal DNA of the present invention has been transferred has an increased symptom of the released protein of the present invention, it can be used in screening tests for therapeutic drugs for diseases related to the protein of the present invention. Available.
  • a non-human mammal having the exogenous abnormal DNA of the present invention can be subcultured in a normal breeding environment as an animal having the DNA after confirming that the DNA stably retains by mating.
  • the target DNA can be incorporated into the above-mentioned plasmid and used as a raw material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by ordinary DNA engineering techniques. The transfer of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all germ cells and somatic cells of the target mammal. The presence of the abnormal DNA of the present invention in the germ cells of the produced animal after DNA transfer means that all the offspring of the produced animal have the abnormal DNA of the present invention in all of the germinal and somatic cells.
  • the progeny of this type of animal that has inherited DNA has the abnormal DNA of the present invention in all of its germinal and somatic cells. Introduced DNA into homologous chromosome By obtaining homozygous animals having both DNAs and mating the male and female animals, all the offspring can be bred and passaged so as to have the DNA.
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention has a high level of expression of the abnormal DNA of the present invention, and eventually impairs the function of the protein of the present invention by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It may be active refractory and can be used as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA-transferred animal of the present invention, it is possible to elucidate the pathological mechanism of the function-inactive refractory of the protein of the present invention and to examine a method for treating this disease.
  • the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention is useful for inhibiting the function of the normal protein by the abnormal protein of the present invention (dominant negative effect) in the inactive refractory disease of the protein of the present invention. It is a model for elucidating the problem.
  • the mammal having transferred the foreign abnormal DNA of the present invention since the mammal having transferred the foreign abnormal DNA of the present invention has an increased symptom of the released protein of the present invention, it is also used for a therapeutic drug screening test for a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention. It is possible.
  • ⁇ ⁇ Isolation and purification of the mutant protein of the present invention and production of its antibody can be considered. Furthermore, using the DNA-transferred animal of the present invention, clinical symptoms of a disease related to the protein of the present invention, including a functionally inactive refractory disease of the protein of the present invention, are examined. In addition, a more detailed pathological finding in each organ of the disease model related to the protein of the present invention can be obtained, a new therapeutic method can be developed, and a secondary disease caused by the disease can be studied. And can contribute to treatment.
  • each organ can be taken out from the DNA-transferred animal of the present invention, and after minced, it is possible to obtain free DNA-transferred cells, culture them, or systematize the cultured cells using a protease such as trypsin. It is. Furthermore, it is possible to identify the protein-producing cells of the present invention, examine their relationship with hypophosphatemia, or examine their signal transduction mechanisms, and investigate their abnormalities. It is an effective research material for
  • the DNA-transferred animal of the present invention in order to use the DNA-transferred animal of the present invention to develop a therapeutic agent for a disease associated with the protein of the present invention, including the inactive refractory type of the protein of the present invention, the above-described test method and quantification It is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using a method or the like.
  • the present invention is possible to provide an effective and rapid screening method for the therapeutic agent for the disease by using a method or the like.
  • DNA transgenic animal or the exogenous DNA expression vector of the present invention it is possible to study and develop a method of treating a DNA associated with the protein of the present invention for DNA.
  • the present invention provides a non-human mammalian embryonic stem cell in which the DNA of the present invention has been inactivated, and a non-human mammal deficient in expression of the DNA of the present invention.
  • the embryonic stem cell according to (1) which is a cell having a 3-galactosidase gene derived from Escherichia coli,
  • the reporter gene is an E. coli-derived iS-galactosidase gene
  • a method for screening a compound or a salt thereof which promotes the promoter activity of the protein of the present invention which comprises administering a test compound to the animal according to the above (7) and detecting the expression of a reporter gene. I will provide a.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are artificially mutated to the DNA of the present invention possessed by the non-human mammal, thereby suppressing the expression ability of the DNA, Alternatively, by substantially eliminating the activity of the protein of the present invention in which the DNA is encoded, the DNA has substantially no ability to express the protein of the present invention (hereinafter referred to as the present invention).
  • Knockout DNA This refers to embryonic stem cells of non-human mammals (hereinafter abbreviated as ES cells).
  • non-human mammal the same one as described above is used.
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting a part or all of the DNA sequence and inserting or substituting another DNA sequence by a genetic technique.
  • the knockout DNA of the present invention may be prepared, for example, by shifting the codon reading frame or disrupting the function of the promoter or exon.
  • Non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention is inactivated include, for example, The DNA of the present invention possessed by the non-human mammal described above is isolated and its exon part is a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ ( ⁇ -galactosidase gene), cat ( Insertion of a reporter gene, such as the chloramphenicol acetyltransferase gene, disrupts exon function, or leaves the exon in the intertron between exons.
  • a drug resistance gene represented by a neomycin resistance gene, a hygromycin resistance gene, or lacZ ( ⁇ -galactosidase gene), cat
  • Insertion of a reporter gene such as the chloramphenicol acetyltransferase gene, disrupts exon function, or leaves the exon in the intertron between exons.
  • a DNA chain (hereinafter abbreviated as a targeting vector) is introduced into the chromosome of the animal by, for example, homologous recombination, and the obtained ES cells are probed with a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe.
  • the DNA sequence on the targeting vector and the DNA sequence of the targeting vector and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used for the production of the targeting vector were analyzed by PCR using the primer as a primer, and the knockout ES of the present invention was analyzed. It can be obtained by selecting cells.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, and the known methods of EV ans and Kaufma
  • mouse ES cells currently, 129 ES cells are generally used, but since the immunological background is not clear,
  • the number of eggs collected from C57BLZ6 mice and C57BLZ6 was reduced by crossing with DBAZ2.
  • a mouse established using an improved BDF1 mouse F1 of C57BLZ6 and DBAZ2 can also be used favorably.
  • BDF 1 mice have the advantage of high number of eggs collected and robust eggs, and also have C57BL / 6 mice as their background, so the ES cells obtained using these cells have created pathological model mice. At this time, it can be advantageously used in that the genetic background can be replaced by C57BL / 6 mice by backcrossing with C57BL / 6 mice.
  • blastocysts 3.5 days after fertilization are generally used, but in addition to these, blastocysts are collected at the 8-cell stage and cultured to blastocysts for efficient use. Early embryos can be obtained.
  • male ES cells are generally more convenient for producing a germline chimera. In addition, it reduces complicated culture labor. For this purpose, it is desirable to determine the gender as soon as possible.
  • a method of determining the sex of ES cells for example, a method of amplifying and detecting a gene in the sex-determining region on the Y chromosome by PCR can be mentioned.
  • the number of ES cells required for a karyotype analysis would have been about 10 6 , but only about 1 colony of ES cells (about 50 cells) would be required.
  • the primary selection of ES cells in the early stage can be performed by gender discrimination, and the early selection of male cells can greatly reduce the labor in the early stage of culture.
  • the secondary selection can be performed, for example, by confirming the number of chromosomes by the G-banding method.
  • the number of chromosomes in the obtained ES cells is desirably 100% of the normal number.
  • Embryonic stem cell lines obtained in this way usually have very good growth potential, but must be carefully subcultured because they tend to lose their ability to develop somatically.
  • a suitable feeder cell such as STO fibroblasts
  • a carbon dioxide incubator preferably 5% carbon dioxide, 95% air or 5% oxygen
  • LIF 1-10000 U / inl
  • 5% CO 2, 90% air at about 37 ° C
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, preferably Single cells are treated by about 0.1% trypsin / ImM EDTA
  • Such subculture is usually performed every 113 days. At this time, it is desirable to observe the cells, and if morphologically abnormal cells are found, discard the cultured cells.
  • ES cells can be cultured into various types of cells, such as parietal, visceral, and cardiac muscle, by monolayer culture up to high density or suspension culture until cell clumps are formed under appropriate conditions.
  • MJ Evans and MH Kaufman Nature 292, 154, 1981; GR Mart in Proceedings of National Academy of Sciences, Pro at l. Acad. Sci. Ci. Vol. 78, p. 7634, 1981; TC Doetschman et al., Journal 'Ob' Embriologi and Xperimental Morphology, Vol. 87, p. 27, 1985]
  • the cells deficient in expressing the DNA of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention are useful in in vitro studies on the cell biology of the protein of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from a normal animal by measuring the mRNA level of the animal using a known method and indirectly comparing the expression level. is there.
  • non-human mammal those similar to the aforementioned can be used.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be obtained, for example, by introducing the evening-targeting vector produced as described above into a mouse embryonic stem cell or a mouse egg cell, and introducing the targeting vector into the non-human mammal of the present invention.
  • the DNA of the present invention is obtained by causing homologous recombination of the DNA sequence in which the DNA is inactivated to replace the DNA of the present invention on the chromosome of mouse embryonic stem cells or mouse egg cells by gene homologous recombination. Can be knocked out.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be analyzed by Southern hybridization analysis using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe, or a DNA sequence on a evening-targeting vector, and a targeting vector. And the DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention derived from the mouse used in the above-mentioned method can be determined by PCR analysis using a primer as a primer.
  • a cell line in which the DNA of the present invention has been inactivated by gene homologous recombination is cloned, and the cells are cultured at an appropriate time, for example, at the 8-cell stage.
  • the chimeric embryo thus prepared is injected into an animal embryo or blastocyst, and is transplanted into the uterus of the pseudopregnant non-human mammal.
  • the produced animal is a chimeric animal composed of both a normal cell having the DNA locus of the present invention and a cell having the artificially mutated DNA locus of the present invention.
  • an individual composed of cells having the DNA locus of the present invention in which all tissues are artificially mutated, for example, coat color It can be obtained by sorting according to the judgment of the above.
  • the individuals obtained in this manner are usually individuals deficient in heterologous expression of the protein of the present invention, which are bred with individuals deficient in heteroexpression of the protein of the present invention. Can be obtained.
  • a transgenic non-human mammal having a chromosome into which a gettering vector has been introduced can be obtained by injecting a DNA solution into the egg cell nucleus by a microinjection method. Compared to these transgenic non-human mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homologous recombination of the gene.
  • the germline can be obtained and maintained according to a standard method. That is, by mating male and female animals having the inactivated DNA, homozygous animals having the inactivated DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygous animal can be efficiently obtained by rearing the mother animal in such a manner that one normal individual and a plurality of homozygous animals are obtained.
  • homozygous and heterozygous animals having the inactivated PNA are bred and subcultured.
  • the non-human mammalian embryonic stem cells in which the DNA of the present invention has been inactivated are extremely useful for producing a non-human mammal deficient in expressing the DNA of the present invention.
  • the mouse deficient in expression of the protein of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the protein of the present invention, it can serve as a model for a disease caused by inactivation of the biological activity of the protein of the present invention. Therefore, it is useful for investigating the causes of these diseases and examining treatment methods.
  • the structural gene of the protein of the present invention was replaced with a reporter gene.
  • the expression of the substance encoded by the reporter gene is traced to obtain the protein of the present invention.
  • the activity of the promoter can be detected. For example, when a part of the DNA region encoding the protein of the present invention is replaced with a monogalactosidase gene (1acZ) derived from Escherichia coli, a tissue expressing the protein of the present invention originally Instead of protein-galactosidase is expressed.
  • a reagent serving as a substrate for / 3-galactosidase such as 5-bromo-4-monocloth-13-indolyl-13-galactopyranoside (X-gal)
  • X-gal 5-bromo-4-monocloth-13-indolyl-13-galactopyranoside
  • the protein-deficient mouse of the present invention or a tissue section thereof is fixed with daltaraldehyde and the like, washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS), and then stained with X-ga1 at room temperature.
  • PBS Dulbecco's phosphate buffered saline
  • the iS-galactosidase reaction is stopped by washing the tissue sample with ImM EDTA / PBS solution, and the color is observed. Good. Further, mRNA encoding 1 ac Z may be detected according to a conventional method.
  • Such an animal deficient in expression of the protein of the present invention is extremely useful for screening for a substance that activates or inactivates the protein of the protein of the present invention. It can greatly contribute to investigating causes or developing therapeutic drugs.
  • bases, amino acids, and the like are represented by abbreviations based on the abbreviations by the IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids may have optical isomers, L-form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxylipo nucleic acid
  • cDNA Complementary deoxylipo nucleic acid A 'Adenine
  • mRNA liponucleic acid dATP Phosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate dCTP Deoxycytidine triphosphate ATP triphosphate
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • FIG 1 shows the amino acid sequence of the human-derived protein of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of a primer used for cloning DNA encoding the human-derived protein of the present invention.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of a primer used for cloning DNA encoding the protein of the present invention derived from human.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of a primer used for cloning the DNA encoding the human-derived protein of the present invention.
  • Example 1 shows a base sequence of O 1 igo (dT) 18 linker containing a Xho I site used in Example 1—primer.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of a primer used for cloning DNA encoding the human-derived protein of the present invention.
  • Cloning DNA encoding the human-derived protein of the present invention 1 shows the nucleotide sequence of the primer used.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a primer used for cloning DNA encoding the human-derived protein of the present invention.
  • the transformant Escherichia coli TOP 10 / pCR—PHOS obtained in Example 1 described below was used on May 29, 2000 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (NI BH) FERM BP-7172, and from May 11, 2000, the Fermentation Research Institute
  • the transformed Escherichia coli MM294 (DE 3) / pTC II—mPHOS—2 obtained in Example 2 described below was obtained from June 7, 2001 according to No. 6: Deposited No. FERM BP-7625 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary Depositary No. FERM BP-7625 and Deposit No. IFO 16646 As of May 31, 2001, Juso, Yodogawa-ku, Osaka, Japan Honmachi 2-17-85, deposited at the Institute of Fermentation (IFO).
  • Example 6 The transformed Escherichia coli JM109 / pT-PH0SF-ll obtained in Example 6 described below has been used since June 7, 2001, 1-1-11, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan Central 6th, independent The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) Deposit No. FERM BP-7626 and No. IFO 1664'7 at the Patent Organism Depositary Center No. 2 Jusohoncho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japan on May 31, 2001 17-85, deposited at the Institute of Fermentation (IFO).
  • AIST National Institute of Advanced Industrial Science and Technology
  • a cDNA library derived from an OHO patient tumor was prepared as follows. In other words, from the sinus oma tissue of an OHO patient, the phenol-clo mouth formy-samyl alcohol and LiC1 precipitation method (PLANT CELL PHYSIOLOGY 36, 85-93, 1995) The corresponding tota 1 RNA was obtained. About 480 g of total RNA extracted, et al., O 1 igotex (dT) 3 . Approximately 6 / xg of po 1 y (A) + RNA was obtained using I Super (Takara Shuzo Co., Ltd.).
  • the cDNA library was prepared according to the method of Gubler and Hoffman. Poly (A) + RNA (2.5 g), Oligo (dT) 18 containing Xho I site — linker primer
  • ⁇ phage vector was incorporated into ⁇ phage precursor protein using an in vitro packaging kit (STRATAGENE) to prepare a ⁇ phage library.
  • the library was measured using E. coli XL1 Blue MRF as a host.
  • the primary ⁇ phage library in Thailand is 1.0 x 10 6 ⁇ fu / m1.
  • the primary ⁇ phage library was amplified at 4 ° (overnight). Petri dishes (150 diameters) formed about 5 ⁇ 10 4 plaques per plate, and this was used for SM buffer. Dimethyl sulfoxide was added to the recovered SM buffer to a final concentration of 7%, and the mixture was stored at 180 ° C.
  • the amplified ⁇ phage library was 1.0 ⁇ 10 pf uZm was 1 or more.
  • the phosphatonin cDNA was cloned by PCR.
  • the ⁇ phage library derived from the OHO patient's tumor prepared above was designated as type I, and the primer was located on the 5 'side of the multicloning site of the host vector pBluescript SK (+/-) used for the cDNA library.
  • the PCR reaction is a system containing TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.), and a cycle of 95 ° C for 3 minutes, 95 ° C for 3 minutes using a GeneAmp PCR System (PE Applied Biosystems).
  • the test was performed under the following conditions: 45 seconds, 58 ° C, 45 seconds, 72 ° C, 3 minutes for 30 cycles, 72 ° C, 5 minutes for 1 cycle, and 4 ° C.
  • the obtained amplified fragment was subjected to 1% agarose gel electrophoresis to extract and purify the main band, and then introduced into pCR II-TOPO vector (Invitrogen) using TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen), followed by Introduced to TOP 10 shares.
  • pCR II-TOPO vector Invitrogen
  • TOPO TA Cloning Kit Invitrogen
  • the nucleotide sequence of the cDNA fragment was determined by I (PE Applied Biosystems).
  • the obtained plasmid DNA contained in clone # 1 was obtained from Phosphatonin Val (1st) to Asp (430th as described in Raw PSN International Patent Application Publication No. WO 99/60017). ) Had a 1713 base sequence containing a base sequence essentially identical to the 1290 base sequence coding for, and encoded a phosphatonin protein consisting of 525 amino acids.
  • the insert sequence of plasmid DNA retained by clone # 1 is the phosphatodin gene sequence described in International Patent Application Publication No. WO 99/60017 of Raw PSN, and the plasmid retained by another clone obtained at the same time. It differs from the DNA insert sequence by several bases. Therefore, in order to determine the true phosphatonin gene sequence, PCR was carried out using Pyrobest DNA po1ymerase, which has higher amplification accuracy (ide1ity).
  • the ⁇ phage library derived from the tumor of the OHO patient prepared as described above was made into a cyclized type, and as a primer, the synthetic oligo DNA of SEQ ID NO: 6 starting from the 5 ′ side of the start codon ATG in the clone ⁇ was used as the forward primer.
  • the synthetic oligo DNA of SEQ ID NO: 5 was used as a reverse primer.
  • thermocycler GeneAmp PCR System, PE Applied Biosystems
  • the PCR reaction was performed using a thermocycler (GeneAmp PCR System, PE Applied Biosystems) under the conditions of 98 cycles, 10 seconds, 56 ° C, 45 seconds, 72 ° C, 3 minutes, 30 cycles, and 4 ° C. Done.
  • the obtained amplified fragment was subjected to 1% agarose gel electrophoresis to extract and purify the main band, and then pCR-B1unt vector-1 (Invitrogen) using the ZeroBlunt PCR Cloning Kit (Invitrogen). ) And introduced into E. coli TOP10 strain.
  • Plasmid DNA is extracted from the resulting transformant, and PCR is performed using Big Dye-Mine TM -Yuichi Cycle Sequence Ready Reaction Kit (PE Applied Biosystems), and the AB IPRISM TM 377 DNA sequencer ( PE Applied Biosystems) to determine the nucleotide sequence of the cDNA fragment.
  • a transformant containing plasmid pCR-PHOS carrying DNA encoding the phosphatonin protein of the present invention: Escherichiacoli TOP 1 OZpCR-PHOS (clone # 9) was obtained.
  • the plasmid DNA contained in the obtained TOP 1 OZp CR—PHOS contains 1575 nucleotides including the 1575 nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 and 1662 nucleotides represented by SEQ ID NO: 3 It had a nucleotide sequence and encoded a phosphatonin protein consisting of 525 amino acids represented by SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1-4).
  • the molecular weight of the protein portion (including the signal peptide) of the protein of the present invention deduced from the amino acid sequence was 58.4 kDa.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 is obtained by converting Asp (430th) to Vas1 (first) of phosphatonin described in the International Patent Application for Raw PSN (WO 99 / NO 60017). Contains a nucleotide sequence essentially identical to the 1290 nucleotide sequence to be encoded, and contains a novel 285 nucleotide sequence in its 5 'region encoding a 95 amino acid sequence consisting of the starting Met Was. In the common sequence between the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 and the nucleotide sequence of phosphatonin described in International Patent Application Publication No. WO 99Z60017 for Raw PSN, only the 293th base is different.
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence represented by Me t 1 - region excluding the A 1 a 16 hydrophilic is very high, and secretion since it does not contain a transmembrane region, the protein of the present invention extracellularly It was expected that the protein would be This is consistent with phosphatodin being a humoral factor.
  • the protein of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 has a sugar chain binding site at As n 477 —Thr 48Q , A sn 478 — Ar g 481 and a glycosaminodalican binding site at Ser 256 -G 1 y 259 , respectively.
  • the protein of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 had an RGD sequence (Ar g247 — Asp249 ) related to cell adhesion.
  • the presence of the RGD sequence is also known in collagen, vitronectin, fibrinogen, von Willebrand factor, and the like, and it is expected that this site also contributes to the interaction with cells in the protein of the present invention. .
  • the protein of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 has many phosphorylation sites by protein kinase (3, zein kinase II, cAMP-dependent protein kinase, and tyrosine kinase) (Table 1) These were considered to play some role in the biological activities of the protein of the present invention and its partial peptide, and the protein of the present invention represented by SEQ ID NO: 1 is composed of collagen, vitronectin, fibronectin, It had many myristoylation sites characteristic of phosphorylated glycoproteins such as osteobontin and dentin-sialophosphoprotein (DSSP) (Table 1) . The C-terminal region of the protein of the present invention was asparagine.
  • Phosphatonin is that thought to be cleaved by PHEX gene product, SEQ ID NO: 1 amino acid sequence represented by the amino acid sequence conform to the substrate specificity of the zinc metallopeptidase opening end base Puchida peptidase (A 1 a 327 — Ser 333 ; ADAV DVS), it was predicted that this site (Va 1 330 — As p 331 ) would be cleaved by the PHEX gene product.
  • Example 2 Expression of recombinant Phosphatonin in Escherichia coli
  • a plasmid for expression of mature phosphatonin excluding the signal sequence (Met 1 -Ala 16 ) was constructed and E. coli expression was attempted.
  • CTCTCGTCGACATCAACTCACA-3 'SEQ ID NO: 9 PCR using pyrobest DM polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) with plasmid pCR—PHOS-9 (Example 1) for animal cell expression (98 ° CX45 seconds, 56 °) CX 45 seconds, 72 ° C X 3 minutes, 30 cycles).
  • the obtained PCR product was purified by 1% agarose gel electrophoresis, ligated with pCR Blant vector (Invitrogen), and transformed into TOP10 competent cells.
  • Plasmid DNA pCR-mPHOS was prepared from 12 positive strains obtained by colony PCR, and 3 strains containing the insert in the reverse direction were selected by digestion with SacI.
  • pTCII-mPHOS-2 was transfected into competent cells for expression of an E. coli strain ( ⁇ 294 ⁇ 3) having a T7 RNA polymerase gene (under the control of a lac promoter), and E. coli MM294 (DE 3) / pTC II— mPHOS-2 was obtained.
  • This transformant was placed in a 2 liter flask containing 1 liter of LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% sodium chloride) containing 1 OiigZml of tetracycline at 37 ° C. The cells were cultured with shaking for 8 hours. The obtained culture solution was added to the main fermentation medium (1.6 g) containing 5 g of Zm1 tetracycline.
  • the culture was centrifuged to obtain about 300 g of wet cells, which were stored frozen at 180 ° C.
  • the expression level of Phosphatonin in this cell was estimated to be about 15 mg / g wet cell (300 mg / L) based on the 60 Kd band of Phosphatonin obtained by subjecting the cell extract to SDS-PAGE.
  • these cells were sequentially sonicated in 20 mM EDTA (pH 6) and 20 raM Tris-HC1 / 8M Urea (pH 8) to obtain matured cells.
  • the supernatant was concentrated with an ultrafiltration membrane (regenerated cellulose membrane fractionation molecular weight 1 OK (k dalton), membrane area 0.1 lm 2 x 2) (Zaritrius Co., Ltd.), and replaced with 5 OmM MESZNaOH. Centrifugation (6000 rpm, 20 minutes) was performed to obtain 100 OmL of the supernatant. 50-mL of the supernatant was adsorbed to SP-Toyopearl 550C (5 cm IDX, 20 cmL, 40 OmL) (Tosoichi Co., Ltd.) equilibrated with 50 mM MES / NaOH (pH 6.0).
  • SP-Toyopearl 550C 5 cm IDX, 20 cmL, 40 OmL
  • the analysis was performed using about 10 g.
  • the N-terminal amino acid sequence was determined using a gas phase protein sequencer (Applied Biosystem Model 492). As a result, the obtained N-terminal amino acid sequence of Phosphatonin coincided with the N-terminal amino acid sequence of Phosphatonin deduced from the base sequence, except that the N-terminal of the obtained Phosphatonin was a mixture of those not added with the Met adduct (FIG. 9). As shown in Example 1, Phosphatonin has a motif that is susceptible to phosphorylation modification, and thus phosphorylation was performed with casein kinase II. Foregoing purification Phosphatonin 7.
  • the reaction mixture was cooled on ice and concentrated with an ultrafiltration membrane (Vivaspin, 20 molecular weight cut-off, 1 OK (k dalton)) (Zaritrius Co., Ltd.).
  • the concentrate was applied to Superde X 200 (10 mm IDX 30 mmL, 13 m) (Amersham Pharmacia Co., Ltd.) equilibrated with PB3, and eluted at a flow rate of 0.5 mL / min. Was pooled.
  • Phosphatonin obtained in Example 3 was emulsified with Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant, and immunized by subcutaneous injection of lmg every 2 weeks into rabbits of the Kb1: JW strain, and reared for 10 weeks. At the 10th week, whole blood was collected from the carotid artery, and about 70 mL of antiserum was obtained by centrifugation. Then, a preservative (0.05% sodium azide) was added and stored at 4 ° C.
  • Phosphatonin 3 mg purified in Example 3 was coupled to NHS-Hitra (ImL 10) (Amersham Pharmacia Co., Ltd.) to prepare a Phosphatonin NHS Hi trap antigen column.
  • the coupling yield was 95%.
  • Protein AS eparose FF (16 mm IDX 5 OmmL, 50 zm 1 OmL) prepared by diluting 6 mL of the aforementioned antiserum twice with MAP SII binding buffer (Japan Bio-Rad Inc.) and pre-equilibrating with the same buffer ) (Amersham Pharmacia Co., Ltd.), washed with protein A MAP SII binding buffer, and eluted IgG fraction with Protein A MAPS II Eluution Buffer (Nippon Bio-Rad Co., Ltd.) did. The obtained fraction was neutralized with 1 M Tris / HC 1 (pH 8.0) and dialyzed against PBS at 4 ° C overnight.
  • the dialysate is adsorbed to a Phosphatonin NHS Hitrap antigen column (ImL) equilibrated with 0.1 M TrisZHCl ( ⁇ 8.0), washed with the same buffer, and then washed with 0.5 M NaC 10 0.1 M Tr
  • the non-adsorbed fraction was removed with is / HCl (pH 8.0), and the low titer antibody was removed with 0.5 M NaC 10.1 M acetate buffer (pH 4.5).
  • the high titer antibody was eluted with 1M Glycine / HCl (pH 2.7), and the eluted fraction was immediately neutralized with 1M Tris / HC1.
  • the eluted fractions were collected and dialyzed against PBS to purify 16 mg of anti-Phosphatonin antibody.
  • the ELISA system was set up using the antibody obtained in Example 4. This ELISA system was implemented under the San Deutsch Law. Prior to setting up the system, 3 mg of the antibody obtained in Example 4 was used to prepare a biotinylated antibody using EZ-LinkSu1fo-NHS-LC Piotile Reagent Kit (Pierce Co., Ltd.). . 2.7 mg of biotinylated antibody was obtained, and the amount of biotin added was 7.5 biotins per antibody molecule.
  • the ELISA was performed using a 96-well microwell plate (MaxiSoap Nunc Co., Ltd.). First, the anti-Phosphatonin antibody obtained in Example 4 was diluted to a concentration of 5 gZmL in 5 OmM sodium carbonate buffer (pH 9.6), added to each well at 100, and left overnight at 4 ° C. Adsorbed. Then, wash the plate 4 times with 200 ⁇ l of 10 mM phosphate buffer ImM EDTA 0.05% (V / V) Tween 20 (pH 7.4) washing solution.
  • Block Ace (Dainippon Pharmaceutical) was diluted with PBS. Next, the washing operation was performed as described above, and the recombinant type diluted with 10% Block Ace-PBS 0.1% (V / V) Tween 20 was used.
  • Phosphatonin CHO cell culture supernatant (described in Example 7) ⁇ ⁇ Add 100 LZ well of a sample solution such as human serum or the standard solution prepared by diluting Phosphatonin to 0.25 to 2 ng / mL with E. coli prepared in Example 2. After that, the plate was allowed to bind to the antibody on the plate at room temperature for 2 hours. After the above washing procedure, add 100 L / well of biotinylated anti-Phosphatonin antibody diluted to a concentration of 3 gZmL with 10% Block Ace-PB S O.1% (V / V) Tween 20 and add at room temperature. Time coupled.
  • the detection limit was 0.1 ngZmL, and the measurement range was 0.1 to 3 ng / mL '( Figure 11). Particularly when measuring cell supernatants of CHO cells expressing high concentrations of CHO cells, a system with a wide detection range is required, and 2 gZmL of alkaline phosphatase-labeled strebutavidin (Pierce Co., Ltd.) was used as the enzyme in the above examples.
  • the substrate used was Blue Phos (KPL).
  • the detection limit was 0.5 ngZmL, and the measurement range was 0.5 to 30 ngZmL.
  • Example 6 Secretory Expression of Recombinant Phosphatonin in CHO Cell Line Plasmid (pCR-PHOS-9) containing phosphatonin full-length cDNA was transformed into type I, and a forward primer (5′-
  • Plasmid DNA was obtained from two positive strains obtained by colony PCR and subjected to insert check and DNA sequence analysis by digestion with Sac I (Takara Shuzo), and plasmids containing the correct insert in the forward direction (pT-PH0SF- 11) was obtained ( Figure 13).
  • Phohsphatonin- FLAG expression plasmid (pT- PH0SF- 11) after one location cleaved with restriction enzymes AHDL (Biolabs, Inc.) was introduced into CH0-K1 cells using the elect port Poreshiyon method (lxl0 7 Cells, Plasmid 10ug / 800ul PBS , 0, 4cmCuvet te, 960uF-0.25kV (BIO-RAD 3 ⁇ 4;)).
  • Phosphatonin a recombinant form of CH0 cells, inhibits the resorption of phosphorus in kidney by normal human proximal tubular epithelial cells (RPTEC, This was performed using RPTEC 37 ° with REGM (BioWhi Uaker Co.) in 24-well plates (2xl0 4 / well) C, were cultured for 3 days at 53 ⁇ 4 C0 2, substituted medium in RBGM (BioWhit taker Co.) containing 0.1% BSA and, ⁇ were cultured 37 ° C, 5% C0 2 De.
  • REGM BioWhi Uaker Co.
  • Uptake buffer (10mMTris-HEPES (pH7.4) ' , 137mMNaCI, 0.1 mM KH 2 32 P0 4 (0.5mCi / raL), 2.8 mM CaCl 2, 1.2 mM MgCl 2, 5.4mM Cl) and 0.25mL added 37 ° C. After incubation for 5 minutes, the uptake buffer was removed, and the wells were washed three times with 1 mL of ice-cold stop buffer (14 mM Tris-HEPES (pH 7.4), 137 mM NaCl).
  • the cells were solubilized with 0.5 N NaOH 0.5 inL (10 mL was stored for protein concentration measurement), mixed with 3 ⁇ of liquid scintillation solution A, and radioactivity was measured with a liquid scintillation counter.
  • BCA Protein Assay Reagent PIERCE
  • the recombinant CHO cell Pfiosphatonin inhibited the uptake of phosphate by RPTEC.
  • Protein of the present invention its partial peptide or a salt thereof, phosphoric diuretic activity, hypophosphatemia-inducing activity, Na + in the kidney cells - transport inhibitory activity, 25-hydrate B ⁇ shea vitamin D 3 -l alpha-hydroxylase It has effects such as inhibitory activity and 25-hydroxyvitamin D 3 -2'4-hydroxylase promoting activity. Therefore, the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof, and the DNA of the present invention include, for example, hyperphosphatemia, arteriosclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, It is useful as a preventive and therapeutic agent for diseases such as renal failure.
  • the DNA of the present invention may be, for example, neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0 ⁇ 0), familial hypophosphatemic vitamin D-resistant rickets (XLH), or hypophosphatemic autosomal dominant inheritance. Rickets (ADHR), hypophosphatemic rickets with hypercalciuria
  • HHRH Vitamin D resistant rickets, osteomalacia, osteoporosis, renal osteodystrophy, secondary hyperparathyroidism, Paget's disease, renal Fanco syndrome, renal tubular acidosis, cystic Useful as a gene diagnostic agent for diseases such as fibrosis, cystic fibrous osteopathy, renal insufficiency hyperphosphatemia, arteriosclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, and renal failure is there.
  • diseases such as fibrosis, cystic fibrous osteopathy, renal insufficiency hyperphosphatemia, arteriosclerosis, acute coronary syndrome, heart failure, stroke, chronic glomerulonephritis, diabetic nephropathy, and renal failure is there.
  • Antibodies against the protein of the present invention, its partial peptide or their salts Since the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof can be specifically recognized, it can be used for quantification of the protein of the present invention in a test solution, particularly for quantification by a sandwich immunoassay. it can.
  • Antibodies capable of neutralizing the activity of the protein of the present invention, its partial peptide or a salt thereof include, for example, neoplastic hypophosphatemic osteomalacia (0H0), familial hypophosphatemic biology.
  • the protein of the present invention is used to screen for a receptor agonist Z antagonist, a compound having a proteinase inhibitory action, or a compound which promotes or inhibits intracellular signal transduction after binding to a receptor. It is useful as a reagent for performing

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Description

明 細 書 新規夕ンパク質およびその D N A 技術分野
本発明はリン利尿活性および/または低リン血症誘導活性を有する新規な タンパク質 「フォスファトニン （phosphatonin) 」 とその D NAに関する。 背景技術
リンは細胞の代謝において重要な役割を果たし、 核酸、 アデノシン三リン 酸 (ATP)、 リン脂質、 細胞膜、 中間代謝産物の構成成分として、 また細胞のェ ネルギ一の貯蔵、 輸送に必須である。 また骨の石灰化は血中のリンおよび力 ルシゥム濃度と密接に関係しており、 これらの成分の恒常性が崩れると骨の 強度に重大な影響が及ぶ。
血中のリン濃度は小腸からの吸収、 骨からの遊離、 腎臓からの排泄、.細胞 内外のシフ卜等により巧妙にバランスがとられている。 腎臓においてリンは 糸球体濾過により受動的に排泄されるが、 その一方で腎近位尿細管の刷子縁 膜に存在するナトリゥム依存性リン (Na+_Pi)輸送担体がリンを能動的に再吸 収し、 血中リン濃度の維持に大きく寄与している。
ビタミン Dは肝臓および腎臓で代謝され活性型の 1， 25-ジヒドロキシビ夕 ミン D (l, 25 (OH) 2D) となって血中リン濃度の維持および骨の石灰化に寄与 している。 ビタミン Dが欠如すると成長期の小児ではくる病、 成人では骨軟 化症となる。 ビタミン Dの欠如以外の原因によって起きる遺伝性くる病とし て、 家族性低リン血症性ビタミン D抵抗性くる病 （X-l inked.
hypophosphatemia; XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性くる病 . (autosomal dominant hypophosphatemic rickets； ADHR) 、 ftカルシウム尿 症を伴う低リン血症性くる病 (heredi tary hypophosphatemic rickets wi th hypercalciur ia; HHRH) などがある。 これらの疾患では原因遺伝子の変異に より過リン酸尿、 低リン血症を生じくる病、 骨軟化症をきたすが、 その機序 は単一でなく不明の点が多い。
1995年、 XLHの原因遺伝子として 22. 1に座位する遺伝子、
PHEX (phosphate regulating gene with homologies to endopeptidase, on the X chromosome) がクロ一ニングされた （ネイチヤー ·ジエネティック ス （NATURE GENETICS) 11， 130-136, 1995) 。 PHEX遺伝子産物は 794 アミノ酸残基より成る 1回膜貫通型の糖タンパク質で、 亜鉛メタ口エンドべ プチダーゼと高い相同性を有する。 XLHのモデルマウスとして知られる H y pマウスと正常マウスとの血管を人工的に結合させ、 液性因子が互いに自 由に連絡し得る状態 (parabiosis)を作ったところ、 正常マウスに低リン血症 を誘導できた（ジャーナル'ォブ'ポーン 'アンド ·ミネラル'リサ一チ（JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESEARCH) 4, 493-500, 1989) 。 また正常マウスの腎 臓を Hypマウスに移植しても Hypマウスにおける低リン血症は改善され なかった（ジャーナル 'ォブ ·クリ二カル ·ィンべスティゲーション（JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 89, 1453-1459, 1992) ) 。 これらの結果から H y pマウスの病因は腎臓以外の臓器で産生される液性リン利尿因子であると いう考えが提唱されるようになった。
XLHと非常に類似した症状を示す疾患として腫瘍性低リン血性骨軟化症 (oncogenic hypophosphatemic osteomalacia; 0H0) がめる。 本疾患は王に 骨 （良性骨芽細胞腫、 骨化性間葉腫） 、 軟部組織 （血管腫、 線維腫） などの 中胚葉性の腫瘍が原因となり、 腎から顕著にリンが漏出し低リン血症、 骨軟 化;/正をきたす (Tumor associated rickets and osteomalacia Favus MJ ed) アメリカン■ソサイァティー ·フォア ·ポ一ン'ミネラル 'リサーチ（AMERICAN SOCIETY FOR BONE MINERAL RESEARCH) ， 184-188, 1990) 。 本疾患の主たる 病因は XLHのそれとは異なると考えられている （カレント ·オピニオン · イン 'ネフロロジ一 'アンド 'ハイパーテンション （CURRENT OPINION IN NEPHROLOGY AND HYPERTENSION) 7, 367-376, 1998) 。 〇H〇は腫瘍の摘出に よりその症状が完全に消失すること、 OHO患者の腫瘍をヌードマウスに移 植または腫瘍抽出液をラットに持続投与することにより低リン血症が誘導さ れたこと （ジャーナル ·ォブ ·クリニカル ·エンドクリノロジー 'アンド · メタポリズム（ J OURNAL OF CLINICAL ENDOCR INOLOGY AND METABOLISM) 67, 46-53, 1988；ジャーナル ·ォブ ·ぺディアトリックス (JOURNAL OF PEDIATRICS) 91 , 56-60, 1977) などから、 O H Oの病因として腫瘍が過剰に分泌する液性リン 利尿因子の存在が示唆された。 近年この因子は 「フォスファトニン
(Phosphatonin) 」 と呼ばれ、 ヒトあるいは動物の培養腎臓細胞を用いた実 験系において腎近位尿細管の Na+- Pi輸送担体によるリン再吸収を抑制するこ とが示唆された （プロシーディングズ ·ォブ ·ァソシエーション ·ォブ ·ァ メリカン 'フイジシャンズ （PROCEEDINGS OF ASSOCIATION OF AMERICAN PHYSICIANS) 107, 1296-1305, 1995；ボーン (BONE) , 18, 159-169, 1996) 。
X L Hと〇H Oとの病態の類似性から、 〇H Oにおいて腫瘍が分泌してい るフォスファトニンは正常人でも血中に分泌されており P H E X遺伝子産物 により分解され上手く制御されているが、 X L Hでは P H E X遺伝子の欠陥 によりまた O H 0では腫瘍からフォスファト二ンが過剰分泌することにより 低リン血症がおきる、 といったメカニズムが想定できる。 従って OH O患者 の腫瘍が分泌する液性リン利尿因子を単離同定し、 その性状を明らかにする ことは O H Oと X L Hとの関係の解明だけでなく血中リン濃度制御異常に起 因するあらゆる疾患の解明に大きく寄与することが期待される。
最近 0 H O腫瘍細胞の初代培養上清からフォスファトニンを分離したとい う報告（二ュ一 ·イングランド ·ジャーナル ·ォブ ·メディシン（NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE) , 330, 1645-1649, 1994、 ポ一ン (BONE) , 18, 159-169, 1996) やフォスファトニン候補遺伝子をクローニングしたという報告 （ポー ン （B0NE) , 23, S653, 1998) が成された。 R o w e P . S . N. が報告し たフォスファトニンの遺伝子配列 （TO 99/60017) は開始のメチォニンを含む 5 '領域が欠失しており、 またその遺伝子組換え産物はフォスファトニンの生 理作用と反対の作用を示したことから明らかなようにフォスファトニンの完 全長遺伝子配列おょぴその遺伝子産物は未だ明らかとなっていない。 発明の開示
本発明は、 リン利尿活性および Zまたは低リン血症誘導活性を有する新規 なタンパク質， その部分ペプチドまたはその塩、 該タンパク質をコードする
D NA、 組換えベクター、 形質転換体、 該タンパク質の製造法、 該タンパク 質または D N Aを含有する医薬、 該タンパク質に対する抗体、 レセプターァ ゴニストノアンタゴニストのスクリーニング方法並びにスクリーニング用キ ット、該スクリーニングで得られるレセプターァゴニスト/アン夕ゴニスト、 該タンパク質を分解するプロティナーゼを阻害する作用を有する化合物また はその塩のスクリーニング方法並びにスクリーニング用キット、 および該ス クリーニングで得られる化合物またはその塩を提供することを目的とする。 リン利尿活性および Zまたは低リン血症誘導活性を有する新規な夕ンパク 質の単離は、 OHOや X L Hの発症メカニズムおよび腎臓におけるリン再吸 収メカニズムを明らかにし、 血中リン濃度制御異常に起因する種々の疾患の 予防や治療に役立つ新たな医薬品の開発につながる。
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 OH O患者由来 c D NAライブラ リ一から新規な塩基配列を有する c D N Aをクロ一エングすることに成功し た。 そして、 本発明者らは、 得られた c D N Aにコードされるタンパク質が リン利尿活性および Zまたは低リン血症誘導活性を有する新規なタンパク質 であることを見いだし、 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を完成するに至った。
· すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号:. 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目の アミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパ ク質またはその塩、
( 2 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目の アミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩、
( 3 ) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である第 （1 ) 項記載の タンパク質またはその塩、
( 4) 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質または その塩である第 （3) 項記載のタンパク質またはその塩、
(5) リン利尿活性および/または低リン血症誘導活性を有するタンパク質 である第 （1) 項〜 （4) 項記載のタンパク質またはその塩、
(6) ①腎におけるナトリウム依存性リン (Na+- Pi)輸送活性を抑制する活性、 ②腎における 25-ヒドロキシビタミン D3-lひ-ヒドロキシラーゼ活性を抑制す る活性および③腎における 25-ヒドロキシビタミン D3- 24-ヒドロキシラーゼ 活性を促進する活性から選ばれる少なくとも一つの活性を有するタンパク質 である第 （1) 項〜 （4) 項記載のタンパク質、
(7) 第 （1) 項記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩、
(8) 第 （1) 項記載のタンパク質をコードする塩基配列を有する DNAを 含有する DNA、 .
( 9 )配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する第（ 8 ) 項記載の DNA、
(10) 第 （8) 項記載の DNAを含有する組換えベクター、
(11) 第 （10) 項記載の組換えベクターを保持する形質転換体、
(12) 第 （11) 項記載の形質転換体を培養し、 第 （1) 項記載のタンパ ク質または第 （7) 項記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取 することを特徴とする第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載 の部分べプチドまたはその塩の製造方法、
(13) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有してなる医薬、
(14) 第 （8) 項記載の DNAを含有してなる医薬、
(15) 血中リン濃度の異常を調節、 改善し得る第 （13) 項または第 （1 4) 項記載の医薬、
(16) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩に対する抗体、
(17) 第 （16) 項記載の抗体を用いることを特徴とする第 （1) 項記載 のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩の定量方 法、 (18) 第 （17) 項記載の定量方法を用いることを特徴とする第 （1) 項 記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩が関 与する疾患の診断方法、
(19) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩を用いることを特徴とするレセプターァゴニストまたはアン 夕ゴニストのスクリーニング方法、
(20) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有するレセプターァゴニストまたはアン夕ゴニストのス クリ一ニング用キッ卜、
(21) 第 （19) 項記載のスクリーニング方法または第 （20) 項記載の スクリーニング用キットを用いて得られるレセプターァゴニストまたはアン 夕ゴニス卜、
(22) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩を用いることを特徴とする第 （1) 項記載のタンパク質また は第 （7) 項記載の部分ペプチドを分解するプロティナ一ゼを阻害する作用 を有する化合物またはその塩のスクリ一ニング方法、
(23) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有する第 （1) 項記載のタンパク質または第 （7) 項記 載の部分べプチドを分解するプロティナーゼを阻害する作用を有する化合物 またはその塩のスクリーニング用キット、 および
(24) 第 （22) 項記載のスクリーニング方法または第 （23) 項記載の スクリーニング用キットを用いて得られる第 （1) 項記載のタンパク質また は第 （7) 項記載の部分ペプチドを分解するプロティナ一ゼを阻害する作用 を有する化合物またはその塩等を提供する。
さらには、 本発明は、
(25) (i) レセプ夕一またはその部分ペプチドに、 第 （1) 項記載の夕 ンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩を接触させた 場合と、 （U) レセプターまたはその部分ペプチドに、 第 （1) 項記載の夕 ンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩および試験ィ匕 合物を接触させた場合において、 該レセプ夕一またはその部分ぺプチドと第
(1) 項記載のタンパク質、 もしくは第 (7) 項記載の部分ペプチドまたは その塩との結合量を測定し、 比較することを特徴とする第 （19) 項記載の スクリーニング方法、
(26) (i) レセプ夕一を含有する細胞またはその細胞膜画分に、 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩を 接触させた場合と、 （ii) レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分 に、 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドま たはその塩および試験化合物を接触させた場合において、 該レセプターを含 有する細胞またはその細胞膜画分と第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第
(7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩との結合量を測定し、 比較するこ とを特徴とする第 （19) 項記載のスクリーニング方法、
(27) (i) レセプターを含有する細胞に、 第 （1) 項記載のタンパク質 もしくは第 (7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩を接触させた場合と、 (ii) レセプ夕一を含有する細胞に、 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは 第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物を接触させた 場合において、 該レセプターを含有する細胞におけるレセプ夕一を介する細 胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2 +濃度の変動、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など）、 a+-Pi 輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 1 α -ヒドロキシラーゼ活性、 25-ヒド ロキシビタミン D 3-24-ヒドロキシラーゼ活性などの活性を測定して、比較す ることを特徴とする第 （19) 項記載のスクリーニング方法、
(28) 第 （19) 項および第 (25) 項〜第 （27) 項のいずれかに記載 のスクリーニング方法または第 （20) 項記載のスクリーニング用キットを 用いて得られるレセプ夕一ァゴニストを含有してなる医薬、 .
(29) 高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球 体腎炎、 糖尿病性腎症、 腎不全などの予防 ·治療剤である第 （28) 項記載 の医薬、 (30) 第 （19) 項および第 （25) 項〜第 （27) 項のいずれかに記載 のスクリーニング方法または第 （20) 項記載のスクリーニング用キットを 用いて得られるレセプターアン夕ゴニストを含有してなる医薬、
' (31) 腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン！) 抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン！)抵抗性く る病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線 維症、 嚢胞性線維性骨炎および腎不全などの予防'治療剤である第 （30) 項記載の医薬、
(32) ( i) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分 ペプチドまたはその塩を分解するプロティナーゼの存在下で第 （1) 項記載 のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩とレセプ ターを含有する細胞とを接触させた場合と、 （ii) 第 （1) 項記載のタンパ ク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩を分解するプロテ. イナーゼおよび試験化合物の存在下で第 （1) 項記載のタンパク質もしくは 第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩をレセプタ一を含有する細胞と を接触させた場合において、 該レせプターを含有する細胞におけるレセプ夕 一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノ シト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低 —下など） 、 Na+- 輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 ひ-ヒドロキシラ ーゼ活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-24-ヒドロキシラ一ゼ活性などの活性 を測定して、 比較することを特徴とする第 （22) 項記載のスクリーニング 方法、
(33) 第 （22) 項もしくは第 （32) 項記載のスクリーニング方法また は第 （23) 項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第 （1) 項 記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドを分解するプロテ イナーゼを阻害する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (34) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩を用いることを特徴とする第 （1) 項記載のタンパク質もし くは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩とレセプターとの結合後の 細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリー二 ング方法、
(35) (i) レセプターを含有する細胞に、 第 （1) 項記載のタンパク質 もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩を接触させた場合と、
(ii) レセプターを含有する細胞に、 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは 第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物を接触させた 場合において、 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分 ぺプチドまたはその塩とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を測定 し、 比較することを特徴とする第 （34) 項記載のスクリーニング方法、
(36) 第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 (7) 項記載の部分べプチ ドまたはその塩を含有する第 （1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項 記載の部分べプチドまたはその塩とレセプターとの結合後の細胞内シグナル 伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(37) 第 （34) 項〜第 （35) 項のいずれかに記載のスクリーニング方 法または第（36)項記載のスクリ一二ング用キットを用いて得られる第（ 1 ) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩と レセプ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物ま たはその塩、
(38) 第 （34) 項〜第 （35) 項のいずれかに記載のスクリーニング方 法または第（36)項記載のスクリーニング用キットを用いて得られる第（1) 項記載のタンパク質もしくは第 （7) 項記載の部分ペプチドまたはその塩と レセプ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物ま たはその塩を含有してなる医薬、 および
(39) 腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン]) 抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン D抵抗性く る病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機能宂進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線 維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎不全、 または高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症 候群、心不全、 脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、 腎不全などの予防 · 治療剤である第 （38) 項記載の医薬等を提供する。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で得られたプラスミド pCR— PHOSに含まれる本発明 のフォスファトニンタンパク質をコードする DNAの塩基配列、 およびそれ から推定される本発明のフォスファトニンタンパク質のアミノ酸配列を示す (図 2に続く） 。
図 2は、 実施例 1で得られたプラスミド： pCR— PHOSに含まれる本発明 のフォスファトニンタンパク質をコードする DNAの塩基配列、 およびそれ から推定される本発明のフォスファトニンタンパク質のアミノ酸配列を示す (図 1の続き、 図 3に続く） 。
図 3は、 実施例 1で得られたプラスミド pCR— PHOSに含まれる本発明 のフォスファトニンタンパク質をコードする DNAの塩基配列、 およびそれ 力、ら推定される本発明のフォスファトニンタンパク質のアミノ酸配列を示す (図 2の続き、 図 4に続く） 。
図 4は、 実施例 1で得られたプラスミド pCR— PHOSに含まれる本発明 のフォスファトニンタンパク質をコードする DN Aの塩基配列、 およびそれ から推定される本発明のフォスファトニンタンパク質のアミノ酸配列を示す (図 3の続き） 。
図 5は、 実施例 1で得られた本発明のフォスファトニンタンパク質のァミノ 酸配列から Ky t e Do o 1 i t t 1 e法により推定した該タンパク質の 親水性 ·疎水性度を示す。
図 6は、 実施例 2で得られたプラスミド pTCII-mPHOS- 2のプラスミド構築図 を示す。 一
図 7は、 実施例 3で得られた本発明のフォスファトニンタンパク質の SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。
図 8は、 実施例 3で得られた本発明のフォスファトニンタンパク質の H P L C分析結果を示す。
図 9は、 実施例 3で得られた本発明のフォスファトニンタンパク質の N末端 配列分析図を示す。
図 1 0は、実施例 3で得られたリン酸化 Phosphaioninの S D Sポリアクリル アミドゲル電気泳動図を示す。
図 1 1は、 Phosphatonin ELISAにおける検量線を示す。
図 1 2は、 ヒト血清中における本発明のフォスファトニンタンパク質の量を 示す。
図 1 3は、 実施例 6で得られたプラスミド pT- PH0SF- 1 1のプラスミド構築図 を示す。
図 1 4は、 実施例 7で得られた本発明のフォスファトニンタンパク質の S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動図を示す。
図 1 5は、 実施例 8記載のフォスファトニンタンパク質の活性測定の結果を 示す。 . 本発明のタンパク質は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一も しくは実質的に同一のァミノ酸配列を有するタンパク質、 さらに好ましくは 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有するタンパク質で ある。
本発明 タンパク質は、 例えば、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッジ、 ゥシ、 ゥマ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 滕臓 ]3細胞、 骨 髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルノヽンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内 皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロ ファージ、 Τ細胞、 Β細胞、 ナチュラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好 塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、.骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細 胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） 、 またはそれらの細胞が存在するあらゆ る組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底核、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 塍臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸、 十二指腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立 腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋などに由来するタンパク質 であってもよく、 また合成タンパク質であってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 例えば、 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミノ酸配列と約 4 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好 ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミ ノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1と実質的に同一のアミノ酸配列としては、例えば、配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 4 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、 より 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは 約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のタンパク質とし ては、 上記のとおり配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミノ酸配列 を含有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ま しい。
配列番号： 1と実質的に同一のアミノ酸配列を含有する本発明のタンパク 質としては、 上記のとおり配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含 有するタンパク質と実質的に同質の活性を有するタンパク質などが好ましい。 実質的に同質の活性としては、 例えば、 リン利尿活性、 低リン血症誘導活 性、 腎臓細胞における Na+- Pi輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 -ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25 -ヒドロキシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラ一 ゼ促進活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、. それらの活性が性質的に 同質であることを示す。 したがって、 リン利尿活性、 低リン血症誘導活性、 腎臓細胞における Na+- 輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 -ヒ ドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-24-ヒドロキシラーゼ 促進活性などが同等 （例、 約 0 . 5〜2倍程度） であることが好ましいが、 こ れらの活性の程度やタンパク質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ い。
また、 本発明のタンパク質には、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さ らに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1の 1 7番目から 5 2 5番目のアミノ酸配列に 1または 2個以 上 （例えば 1〜8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜9 個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付加したァ ミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜8 0個、 好ましく は 1〜2 0個程度、より好ましくは 1〜9個程度、さらに好ましくは数^ I ( 1 または 2個） ） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有 するタンパク質などのいわゆるムティンも含まれる。
また、 本発明のタンパク質には、 ①配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列中の 1ま,たは 2個以上 （例えば 1〜 8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） の アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列に 1または 2偭以上 （例えば 1〜 8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 よ り好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のァ ミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列 中の 1または 2個以上 （例えば 1〜 8 0個、 好ましくは 1〜 2 0個程度、 よ り好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のァ ミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列を含有するタンパク質など のいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が欠失または置換されている場合、 その欠失ま たは置換の位置としては、 特に限定されない。
本明細書におけるタンパク質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が N末 端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 (カルボキシル末端) である。 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質をはじめとする、 本発明 のタンパク質は、 C末端が力ルポキシル基 （一 C O O H) 、 カルポキシレー ト（― C O O— )、 アミド （― C O N H2) またはエステル （― C O O R) のい ずれであってもよい。
ここでエステル基の Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピルもしくは n—ブチルなどの ( ェ アルキル基、例えば、シクロべ ンチル、 シクロへキシルなどの C 3— 8シクロアルキル基、例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6— 1 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなど のフエ二ルー C卜2アルキル基もしくは α—ナフチルメチルなどの a一ナフ チルー Cェ _2アルキル基などの C 7_ェ 4ァラルキル基のほか、 経口用エステル として汎用されるピバロィルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のタンパク質が C末端以外に力ルポキシル基 （または力ルポキシレ —ト） を有している場合、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化され ているものも本発明のタンパク質に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 本発明のタンパク質には、 上記したタンパク質において、 N末端 のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基な どの ァシル基など）で保護されているもの、 N端側が生体内で切断され 生成したダル夕ミル基がヒ°口ダル夕ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の 側鎖上の置換基 （例えば、 —O H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 ィ ンド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァ セチル基などの ァシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が 結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質なども含まれる。 より具体的には、 本発明のタンパク質としては、 例えば、 配列番号： 1で 表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のアミノ酸配列を有する ヒト〇H O患者腫瘍由来のタンパク質、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列を有するヒト OHO患者腫瘍由来のタンパク質などが好適である。 なお、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目 のアミノ酸配列は、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列から分泌シグナ ル配列を除いた配列である。
本発明のタンパク質の部分ペプチドとしては、 前記した本発明のタンパク 質と同質の活性、 例えば、 リン利尿活性、 低リン血症誘導活性、 腎臓細胞に おける Na+- Pi輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 1 α-ヒドロキシラ ーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-24-ヒドロキシラーゼ促進活性な どを有するペプチドであれば何れのものであってもよい。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1 7番目〜 5 2 5番目のアミノ酸配列を有する部分ペプチド、 第 1 7番目〜 3 3 0番目のァ ミノ酸配列を有する部分ペプチド、 第 3 3 1番目〜 5 2 5番目のアミノ酸配 列を有する部分ペプチドなどが好ましく用いられる。 '
さらに、 本発明の部分ペプチドとしては、 配列番号： 1で表わされるアミ ノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列を含有するペプチドと実質的に同質の活性を有する部分べプチ ドが好ましい。
，実質的に同質の活性としては、 例えば、 リン利尿活性、 低リン血症誘導活 性、 腎臓細胞における Na+-Pi輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 a -ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D「24-ヒドロキシラー ゼ促進活性などが挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に 同質であることを示す。 したがって、 リン利尿活性、 低リン血症誘導活性、 腎臓細胞における Na+- Pi輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 1 α -ヒ ドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラーゼ 促進活性が同等 （例、 約 0 . 5〜2倍程度） であることが好ましいが、 これら の活性の程度や夕ンパク質の分子量などの量的要素は異なつていてもよい。 また、 これら本発明の部分ペプチドには、 本発明のタンパク質の （拮抗） 阻害型である、 すなわち、 本発明の夕ンパクの有する活性を阻害する活性を 有するものも含まれる。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸 配列と約 4 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有 するタンパク質の部分ペプチドが用いられ、 より具体的には、 配 番号： 1 で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 (例えば 1〜8 0個、 好ま しくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 配列番号： 1で表わされるァミノ 酸配列に 1または 2個以上（例えば 1〜 8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が付加し たアミノ酸配列、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （例えば 1〜8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜 9個程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換された アミノ酸配列を含有するタンパク質の部分ペプチドなども含まれる。
さらに、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1 7番目〜 5 2 5番 目のアミノ酸配列、 第 1 7番目〜 3 3 0番目のアミノ酸配列または第 3 3 1 番目〜 5 2 5番目のアミノ酸配列 （以下、 これらをアミノ酸配列 Aと略記す る） と約 4 0 %以上、 好ましくは 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有 する部分ペプチドが用いられ、 より具体的には、 アミノ酸配列 A中の 1また は 2個以上 （例えば 1〜8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましく は 1〜9偭程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配 列、 アミノ酸配列 Aに 1または 2偭以上 （例えば 1〜8 0個、 好ましくは 1 〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個） のァ ミノ酸が付加したアミノ酸配列、 アミノ酸配列 A中の 1または 2個以上 （例 えば 1〜8 0個、 好ましくは 1〜2 0個程度、 より好ましくは 1〜9個程度、 さらに好ましくは数個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配 列を含有する部分ペプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドの C末端は、 力ルポキシル基 （一 C O OH) 、 カルポキシレート（一C O O―)、 アミド （一 C O NH 2) またはエステル （一 C O O R) (Rは前記と同意義を示す） のいずれであってもよい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した部分ペプチドにおいて、 N 末端のメチォニン残基のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル 基などの ァシル基など）で保護されているもの、 N端側が生体内で切断 され生成したダルタミル基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ 酸の側鎖上の置換基 （例えば、 一〇H、 一 S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの C 6ァシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖 が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドの塩としては、 とりわけ生理 学的に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機 酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例 えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コ八ク酸、 酒石 酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンス ルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のタンパク質またはその塩は、 前述したヒトゃ温血動物の細胞、.組 織または血漿から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することも できるし、 後述するタンパク質をコードする D N Aを含有する形質転換体を 培養することによつても製造することができる。 また、 後述のタンパク質合 成法またはこれに準じて製造することもできる。
ヒトゃ温血動物の細胞、 組織または血漿から製造する場合、 ヒトゃ温血動 物の細胞または組織のホモジナイズ上清および血漿を硫安沈澱、 エタノ一ル 沈澱、 酸抽出、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、 逆相クロマトグラフィー、 レク チンカラムクロマ卜グラフィ一、 ゲル濾過クロマトグラフィーなどのクロマ トグラフィ一を組み合わせることにより精製単離することができる。
本発明のタンパク質、 その部分べプチドもしくはそれらの塩またはそれら のアミド体の合成には、 通常市販のタンパク質合成用樹脂を用いることがで きる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹旨、 ヒドロキシメ チル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一ベンジルォ キシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P A M樹脂、 4ーヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル榭脂、 ポ リアクリルアミド樹脂、 4 - (2'，4' -ジメトキシフエ二ルーヒドロキシメチ ル） フエノキシ樹脂、 4一 （2'，4' -ジメトキシフエ二ルー Fmocアミノエチル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 α—ァ ミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とするタンパク質の 配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の 最後に樹脂から夕ンパク質を切り出すと同時に各種保護基を除去し、 さらに 高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的のタンパク 質、 その部分ペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 タンパク質合成に使用できる各 種活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 力 ルポジイミド類としては、 D C C、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν-ェチル -N' -（3-ジメチルァミノプロリル）カルポジイミドなどが用いられ る。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H〇B t， H O O B t )とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、対称酸無水物 または H O B tエステルあるいは H〇O B tエステルとしてあらかじめ保護 アミノ酸の活性化を行なったのちに樹脂に添加することができる。 保護アミ ノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 タンパク質縮合反 応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、 N, N—ジメチルホルムアミド、 N—メチルピロリドン、 クロ口ホルム、 トリフ ルォロエタノール、 ジメチルスルホキシド、 D M F、 ジメチルスルホキシド、 ピリジン、 クロ口ホルム、 ジォキサン、 塩化メチレン、 テトラヒドロフラン、 ァセトニトリル、酢酸ェチル、 N-メチルピロリドンあるいはこれらの適宜の 混合物などが用いられる。 反応温度はタンパク質結合形成反応に使用され得 ることが知られている範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範 囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜4倍過剰 で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、 縮合が不十分な場 合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮 合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分な縮合が得られないとき には、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をァセ チル化することができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 夕一シャリーア ミルォキシ力ルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベン ジルォキシカルポニル、 C I— Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルボ二 ル、 トリフルォロアセチル、 フタリル、 ホルミル、 2—ニトロフエニルスル フエニル、 ジフエ二ルホスフイノチオイル、 Fm o cなどが用いられる。 力 ルポキシル基の保護基としては、 例えばアルキルエステル （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 ブチル、 ターシャリ一プチル、 シクロペンチル、 シクロ へキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチルなどのエス テル基） 、 ベンジルエステル、 4一二トロべンジルエステル、 4ーメトキシ ベンジルエステル、 4一クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル、 フエナシンエステル、 ベンジルォキシカルポニルヒドラジド、 夕一シャリ一 ブトキシカルポニルヒドラジド、 トリチルヒドラジドなどが用いられる。 セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはェ一テル化によって保護す ることができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基 などの低級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキ シカルポニル基、 エトキシカルポニル基などの炭素から誘導される基などが 用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C l 2 一 B z 1、 2—二トロベンジル、 B r— Z、 夕一シャリーブチルなどが用い られる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4 -メトキ シ- 2, 3, 6-トリメチルベンゼンスルホニル、 D N P、 ベンジルォキシメチル、 B u m, B o c、 T r t、 Fm o cなどが用いられる。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸 無水物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノ ール、 2, 4， 5 -トリクロ口フエノール、 2， 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチ ルアルコール、 パラニトロフエノール、 HON B、 N-ヒドロキシスクシミド、 N -ヒドロキシフタルイミド、 HO B t ) とのエステル〕 などが用いられる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミ ドが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 ？（1ー黒ぁるぃは？ ー炭 素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水 素、 メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸 あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体 アンモニア中ナトリゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱 離反応は、 一般に約一 2 0 ° (〜 4 0 °Cの温度で行われるが、 酸処理において は、 例えば、 ァニソ一ル、 フエノール、 チオアエソール、 メタクレゾール、 パラクレゾール、 ジメチルスルフィド、 1, 4-ブタンジチオール、 1 , 2-ェタン ジチオールのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジン のイミダゾ一ル保護基として用いられる 2, 4 -ジニトロフエニル基はチォフエ ノール処理により除去され、 トリブトファンのィンドール保護基として用い られるホルミル基は上記の 1, 2 -エタンジチオール、 1，4 -ブタンジチオールな どの存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アン モニァなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および保護基、 ならびにその 保護基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化などは公知の基あるいは公知 の手段から適宜選択しうる。 タンパク質のアミド体を得る別の方法としては、 まず、 カルポキシ末端ァ ミノ酸の a—力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺプ チド （タンパク質） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端 の a—アミノ基の保護基のみを除いたタンパク質と C末端の力ルポキシル基 の保護基のみを除去したタンパク質とを製造し、 この両タンパク質を上記し たような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様で ある。 縮合により得られた保護タンパク質を精製した後、 上記方法によりす ベての保護基を除去し、 所望の粗タンパク質を得ることができる。 この粗夕 ンパク質は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥する ことで所望のタンパク質のアミド体を得ることができる。
夕ンパク質のエステル体を得るには、 カルポキシ末端アミノ酸の a—カル ポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 タン パク質のアミド体と同様にして、 所望のタンパク質のエステル体を得ること ができる。
本発明のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩は、 自体公知のペプチド の合成法に従って、 あるいは本発明のタンパク質を適当なぺプチダーゼで切 断することによって製造することができる。 ペプチドの合成法としては、 例 えば固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の 夕ンパク質を構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合 させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺ プチドを製造することができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離としてはた とえば、 以下の①〜⑤に記載された方法が挙げられる。
① M. Bodanszkyおよび M. A. Ondei i i , ペプチド シンセシス （Pept i de Synthes i s) , Intersc i ence Publ i shers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、ザペプチド（The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明 および榊原俊平、生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 (1977年） ⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発第 14巻ペプチド合成広川書店 また、 反応後は通常の精製法、 たとえば、 溶媒抽出 '.蒸留 ·カラムクロマ トグラフィ一'液体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明 のタンパク質を精製単離することができる。 上記方法で得られるタンパク質 が遊離体である場合は、 公知の方法によって適当な塩に変換することができ るし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法によって遊離体に変換すること ができる。 本発明のタンパク質をコードする DNAとしては、 前述した本発明のタン パク質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであって もよい。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリー、 前記した細胞- 組織由来の cDNA、 前記した細胞'組織由来の c DNAライブラリー、 合 成 DNAのいずれでもよい。 ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリ オファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファ一ジミドなどいずれであってもよ い。 また、 前記した細胞 ·組織よ'り mRNA画分を調製したものを用いて直 接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT - PCR 法と略称する） によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有するタ ンパク質をコードする DNAとしては、 例えば、 ①配列番号： 2で表わされ る塩基配列を有する DNA、 ②配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAにハイブリダィズし、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を有す るタンパク質と同質の活性、 例えば、 リン利尿活性、 低リン血症誘導活性、 腎臓細胞における Na+- Pi輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 1 α -ヒ ドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラーゼ 促進活性などを有するタンパク質をコードする D Ν Αなどが用いられる。 配列番号： 2で表わされる塩基配列とハイブリダィズできる DN Aとして は、 例えば、 配列番号： 2で表わされる塩基配列と約 40%以上、 好ましく は約 60%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらに好ましくは約 90%以 上、 最も好ましくは約 95%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いられる。
ハイプリダイゼ一シヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、モレキュラー ·クローニング（Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って 行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使 用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイ ストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 1 9〜4
0 mM、 好ましくは約 1 9〜2 O mMで、 温度が約 5 0〜7 0 °C、 好ましく は約 6 0〜 6 5 °Cの条件を示す。 特に、 ナトリゥム濃度が約 1 9 mMで温度 が約 6 5 °Cの場合が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタン パク質をコードする D NA'としては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を 有する D NAなどが用いられる。 また、 本発明の配列番号： 1で表わされる アミノ酸配列を含有するタンパク質をコードする D NAを含有する D NAと しては、 例えば、 配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する D N Aなどが 用いられる。
本発明の部分べプチドをコ一ドする D N Aとしては、 前述した本発明の部 分ペプチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであ つてもよい。
具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1 7〜5 2 5番 目、 第 1 7〜3 3 0番目および第 3 3 1〜5 2 5番目のアミノ酸配列を有す る部分ペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2で表わ される塩基配列の第 4 9〜1 5.7 5番目、 第 4 9〜9 9 0番目および第 9 9 1〜1 5 7 5番目の塩基配列を有する D N Aなどが用いられる。
本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする D N Aのクロー エングの手段としては、 本発明のタンパク質をコードする D NAの部分塩基 配列を有する合成 D NAプライマーを用いて、 P C R法によって前記 D NA ライブラリ一等から目的とする D N Aを増幅するか、 または適当なベクター に組み込んだ DN Aを本発明のタンパク質の一部あるいは全領域を有する D N A断片もしくは合成 DN Aを用いて標識したものとのハイブリダィゼ一シ ヨンによって選別することができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例 えば、 モレキュラー ·クローニング（Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al.， Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って 行なうことができる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使 用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。
クローン化された本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードす る DNAは、 目的によりそのまま、 または所望により制限酵素で消化したり、 リンカ一を付加したりして使用することができる。該 DN Aはその 5'末端側 に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3'末端側には翻訳終止コドン としての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開 始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプタ一を用いて付加す ることもできる。
本発明のタンパク質またはその部分べプチドをコードする DNAの発現べ クタ一は、 例えば、 （ィ） 本発明のタンパク質をコードする DNAから目的 とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断片を適当な発現べクタ一中 のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
ベクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR 322， pBR 325, pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110, pTP 5, p C 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 p SH 19， D SH 15) 、 λファージなどのパクテリオファージ、 レトロウイルス， ヮ クシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなどの他、 pAl 一 11、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RS V, p cDNAI/Ne oなどが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に 対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物 細胞を宿主として用いる場合は、 SR プロモータ一、 SV40プロモータ ―、 LTRプロモ一ター、 CMVプロモータ一、 HS V- TKプロモ一夕一な どが挙げられる。
これらのうち、 CMVプロモーター、 SRひプロモーターなどを用いるの が好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t r pプロモータ一、 l a cプロモ一ター、 r e cAプロモーター、 λ PLプロモーター、 l pp プロモーターなどが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SPOlプロモー 夕一、 SP〇2プロモータ一、 p e nPプロモータ一など、 宿主が酵母であ る場合は、 PH05プロモー夕一、 PGKプロモータ一、 GAPプロモータ ―、 ADHプロモータ一などが好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合は、 ポ リヘドリンプロモーター、 P 10プロモーターなどが好ましい。
発現べクタ一には、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシン グシグナル、ポリ A付加シグナル、選択マーカ一、 SV40複製オリジン（以 下、 SV40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用い ることができる。選択マ一カーとしては、例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素（以 下、 dh ί rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピシリン耐性遺伝子 （以下、 Amp と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺伝子 （以下、 Ne oと略称する場合がある、 G418耐 性） 等が挙げられる。 特に、 CHO (dh f r ~) 細胞を用いて dh f r遺 伝子を選択マーカーとして使用する場合、 チミジンを含まない培地によって も選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 タンパク質の N端末 側に付加する。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 P h o A ·シグナル 配列、 OmpA ·シグナル配列などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 ひ一アミラーゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが、 宿主 が酵母である場合は、 MF a ·シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列など、 宿主が動物細胞である場合には、 例えばインシュリン ·シグナル配列、 0；— インターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ 利用できる。
このようにして構築された本発明のタンパク質をコードする D N Aを含有 するベクターを細胞に導入することによって形質転換体を製造することがで さる。
宿主としては、 例えばェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 ェシエリヒア 'コリ （Escherichia coli) Kl 2 · DH1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデ ミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60巻， 160 (1968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ' ァシッズ 'リサーチ， （Nucleic Acids Research)， 9巻， 309 (1981)〕： JA221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイォロジ一 （Journal of Molecular Biology) , 120巻， 517 ( 1978)〕 ， ΗΒ 101 〔ジャー ナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー， 41巻， 459 (1 69)〕 , C 600 〔ジェネティックス （Genetics) , 39卷， 440 (1954)〕 な どが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えばバチルス ·サチルス (Bacillus subtilis) MI 114 〔ジーン， 24卷， 255(1983)〕 ， 207— 21 〔ジャー ナル ·ォブ ·バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) , 95巻， 8 7 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えばサッカロマイセス セレピシェ （Saccharomyces cerevisiae)AH22, AH22R一， NA87 - 11 A, DKD - 5D, 2 0 B— 12、 シゾサッカロマイセス ポンべ (Sc izosaccharomyces pombe) NCYC 1913,NCYC 203.6、ピキア パス卜チス（Pichia pastoris) などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼 虫由来株化細胞 (Spodoptera frugiperdacell； S f細胞) 、 Tricfioplusia ni の中腸由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five TM細胞、 Maraestra brassicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞などが用 いられる。ウィルスが BmNP Vの場合は、蚕由来株化細胞（Bombyxmori N； BmN細胞） などが用いられる。 該 S ί細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.L.ら、 イン .ヴィト口 (in Vitro) , 13, 213-217, (1977)) などが項いられる。
昆虫としては、 例えばカイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ 一 (Nature) ， 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 1、 COS— 7、 Ve r o 細胞、 チャイニーズハムスター細胞 CH〇 （以下、 CHO細胞と略記） 、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムス夕一細胞 CHO (以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） 、 L細胞、 ミエローマ細胞、 ヒト FL細胞、 293細 胞、 C 127細胞、 BALB 3T3細胞、 S p- 2/0細胞などが用いられる c これらの中でも CHO細胞、 CH〇 （dh f r— ) 細胞、 293細胞などが 好ましい。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、例えば、プロシージングズ ·ォブ · ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69巻， 2110 (1972)ゃジ ーン （Gene) , 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って行なう ことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー ·アンド ·ジェ ネラル'ジェネティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 111 (1979)などに記載の方法に従って行なわれる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ'イン ·ェンザィモロジ一 (Methods in Enzymology) ， 194巻， 182— 187 (1991)に記載の 方法に従って行なわれる。
虫細胞や昆虫を形質転換するには、 例えばバイオ/テクノロジー
(Bio/Technology) ,6, 47 - 55 (1988)) などに記載の方法に従って行なうこと ができる。
動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新 細胞工学実 験プロ卜コール， 263— 267 (1995) (秀潤社発行） に記載の方法に 従って行なうことができる。
発現べクタ一の細胞への導入方法としては、 例えば、 リン酸カルシウム法 [Graham F. L. and van der Eb A. J.ヴイロロジー （Virology) 52, 456- 467 (1973)〕、 DEAE— d e x t r an法 [Sompayrac L.M. and Danna K. J. プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシ ィズ 'ォブ 'ザ ·ュ一エスエー （Pro atl. Acad. Sci. USA) 78, 7575-7578, 1981) 、 リポフエクシヨン法〔MaloneR.W. et al. プロシージングズ *ォブ- ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エス ェ一（Proc. Nail. Acad. Sci. USA) 86, 6077-6081, 1989〕、電気穿孔法！: Nuemann E. et al. ェンポ ·ジャーナル （EMBO J.) 1, 841-845 (1982) 〕 等が挙げ られる。
このようにして、 本発明のタンパク質をコードする DNAを含有する発現 ベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
なお、 動物細胞を用いて、 本発明のタンパク質を安定に発現させる方法と しては、 上記の動物細胞に導入された発現ベクターが染色体に組み込まれた 細胞をクローン選択によって選択する方法がある。 具体的には、 上記の選択 マ一カーを指標にして形質転換体を選択することができる。 さらに、 このよ うに選択マーカ一を用いて得られた動物細胞に対して、 繰り返しクローン選 択を行なうことにより本発明のタンパク質の高発現能を有する安定な動物細 胞株を得ることができる。
また、 dh f r遺伝子を選択マ一力一として用いた場合、 MTX濃度を徐々 に上げて培養し、 耐性株を選択することにより、 dh i r遺伝子とともに、 本発明のタンパク貧をコードする DNAを細胞内で増幅させて、 さらに高発 現の動物細胞株を得ることもできる。
上記の形質転換体を本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコード する DNAが発現可能な条件下で培養し、 本発明のタンパク質またはその部 分ペプチドを生成、 蓄積せしめることによって、 本発明のタンパク質、 その 部分べプチドまたはそ らの塩を製造することができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転 換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭 素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖な ど、 窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチ一 づ'リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液な どの無機または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン 酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどがそれぞれ用いられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培地の pH は約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 ダルコ一ス、 力 ザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Miller) , ジャーナル ·ォブ ·ェクスぺ リメンッ ·イン'モレキユラ ·ジェネティックス (Journal of Experiments inMolecular Genetics; , 431— 433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972] が好ましい。 ここに必要によりプロモーターを効率よく 働かせるために、 例えば 3；8—インドリル アクリル酸のような薬剤を加え ることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 °Cで約 3〜 24 峙間行い、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間 行ない、 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バー クホ一ルダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシージング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ · ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77巻， 4505 (19 80)〕 や 0.5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 プロ シージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ · ォブ 'ザ 'ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 81巻， 53 30 (1984) 〕 が挙げられる。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好 ましい。 培養は通常約 20°C〜35°Cで約 24〜72時間行ない、 必要に応 じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Grace's Insect Medium (Grace, T. C.，ネイチヤー (Nature) , 195, 788(1962)) に非 働化した 10%ゥシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。 培 地の pHは約 6. 2〜6. 4に調整するのが好ましい。 培養は通常約 27 °C で約 3〜5日間行い、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿生が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20 %の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 12 2巻， 501 (1952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジ一 （Virology) , 8 卷， 396 (1959)〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル'ォブ'ザ' アメリカン 'メディカル ·アソシエーション （The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシ 一ジング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディ スン (Proceeding of the Society for the Biological Medicine; , 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培 養は通常約 30°C〜40°Cで約 15〜72時間行ない、 必要に応じて通気や 撹拌を加える。
特に、 CHO (d h f r— ) 細胞および dh f r遺伝子を選択マーカーと · して用いる場合、 チミジンをほとんど含まない透析ゥシ胎児血清を含む DM EM培地を用いるのが好ましい。
上記培養物から本発明のタンパク質を分離精製するには、 例えば、 下記の 方法により行なうことができる。
本発明のタンパク質を培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培 養後、公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音波、 リゾチームおよび /"または凍結融解などによって菌体あるいは細胞 を破壊したのち、 遠心分離やろ過により本発明のタンパク質の粗抽出液を得 る方法などが適宜用い得る。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジンなどのたん ばく変性剤や、 トリトン X— 100 (登録商標。 以下、 TMと略称する場合 がある） などの界面活性剤が含まれていてもよい。
培養液中にタンパク質が分泌される場合には、 培養終了後、 それ自体公知 の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。 このようにし て得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれる本発明のタンパク質の精 製は、 自体公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これらの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利 用する方法、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法、 イオン 交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティ一ク 口マトグラフィ一などの特異的親和性を利用する方法、 疎水クロマトグラフ ィ一および逆相高速液体ク口マトグラフィ一などの疎水性の差を利用する方 法、 等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。 かくして得られる本発明のタンパク質が遊離体で得られた場合には、 自体 公知の方法あるいはそれに準じる方法に'よって塩に変換することができ、 逆 に塩で得られた場合には自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、 組換え体が産生する本発明のタンパク質を、 精製前または精製後に 適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリ ペプチドを部分的に除去することもできる。蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテイン キナーゼ、 グリコシダ一ゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のタンパク質の存在は、 特異抗体を用いたェンザ ィムィムノアッセィなどにより測定することができる。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩 （以下、 本発明の タンパク質と略記する場合がある） を認識し得る抗体であれば、 ポリクロー ナル抗体、 モノクローナル抗体の何れであつてもよい。
本発明のタンパク質に対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合が ある) は、 本発明のタンパク質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗 血清の製造法に従つて製造することができる。
〔モノク口一ナル抗体の作製〕
( a ) モノクロナール抗体産生細胞の作製
本発明のタンパク質は、 温血動物に対して投与により抗体産生が可能な部 位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体 産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジ ュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜10 回程度行なうことができる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙 げられるが、 マウスおよびラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原を免疫された温血動 物、 例えば、 マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5 日後に脾臓またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄 腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマを 調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化 タンパク質と抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測 定することにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケ
—ラーとミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 （Nature；)、 256、 495 (1975)] に 従い実施できる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（P EG) やセンダイウィルスなどが挙げられるが、 好ましくは PEGが用いら れる。
骨髄腫細胞としては、 例えば、 NS— 1、 P 3U1、 SP 2/0、 AP— 1などがあげられるが、 P 3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産 生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20 ： 1 程度であり、 PEG (好ましくは PEG 1000〜PEG6000) が 10 〜 80 %程度の濃度で添加され、 20〜 40 °C、 好ましくは 30〜 37 で 1〜 10分間ィンキュベ一トすることにより効率よく細胞融合を実施できる。 モノク口一ナル抗体産生ハイプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法 が使用できるが、 例えば、 タンパク質抗原を直接あるいは担体とともに吸着 させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用 いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス免疫グロプリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する 方法、 抗免疫グロプリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイブ リドーマ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を 加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが用いられる。 モノクローナル抗体の選別は、 自体公知あるいはそれに準じる方法に従つ て行なうことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チ ミジン） を添加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種 用培地としては、 ハイプリドーマが生育できるものならばどのような培地を 用いても良い。 例えば、 1〜20%、 好ましくは 10〜 20%の牛胎児血清 を含む RPMI 1640培地、 1〜10%の牛胎児血清を含む G I T培地 (和光純薬工業 （株） ) あるいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （SFM — 101、 日水製薬 （株） ） などを用いることができる。 培養温度は、 通常 20〜40°C、 好ましくは約 37°Cである。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5%炭酸ガス下で行なうこ とができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗体価は、 上記の抗血清中の抗体価 の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体公知の方法、 例えば、 免疫グロブ リンの分離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈澱法、 等電点沈澱法、 電気泳 動法、 イオン交換体 （例、 DEAE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過 法、 抗原結合固相あるいはプロテイン Aあるいはプロテイン Gなどの活性吸 着剤により抗体のみを採取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従つて行なうことができる。
〔ポリクロ一ナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法 にしたがって製造することができる。 例えば、 免疫抗原 （タンパク質抗原） とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造 法と同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のポリクローナ ル抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造すること ができる。 温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリア一蛋白質との複 合体に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリア一とハプテンとの混合 比は、 キャリアーに架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くで きれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ 血清アルブミンゃゥシサイログロプリン、 へモシァニン等を重量比で八プテ ン 1に対し、 約 0 . 1〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合で結合させる方法 が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いるこ とができるが、 グルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エス テル、 チオール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用い られる。
縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体ある いは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるた め、 完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与し てもよい。 投与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行な うことができる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水な ど、 好ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、 上記の血清中の抗体価の測定 と同様にして測定できる。 抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル抗体の 分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。 本発明のタンパク質または部分ペプチドをコードす D N Aまたは mR N Aに相補的な塩基配列を有するアンチセンス D NAとしては、 本発明のタン パク質または部分べプチドをコードする D N Aまたは m R N Aの塩基配列ま たはその一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有し、 該タンパク質または部 分べプチドの発現を抑制し得る作用を有するオリゴヌクレオチドまたはその 誘導体であれば、 いずれのアンチセンス D N Aであってもよい。
' 相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明のタンパク質または部分ペプチド をコードする D NAまたは mR NAの全塩基配列または部分塩基配列と約 4 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに 好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有する塩基配列などが挙げられる。特に、 本発明の D N Aまたは m R N Aの全塩基配列うち、 本発明のタンパク質の N 末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列 など） と約 4 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 % 以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有するアンチセンス D NA が好適である。 これらのアンチセンス D NAは、 公知の D NA合成装置など を用いて製造することができる。
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩は、 例えば、 リ ン利尿活性、 低リン血症誘導活性、 腎臓細胞における Na+- Pi輸送阻害活性、 25 -ヒドロキシビタミン D 3-1 -ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシ ビタミン D 3- 24 -ヒドロキシラーゼ促進活性などの作用を有している。したが つて、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩はさまざま な用途に用いることができる。 以下に、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩（以下、 本発明のタンパク質と略記する場合がある） 、 本発明のタンパク質をコード する D NA (以下、 本発明の D N Aと略記する場合がある） 、 本発明のタン パク質に対する抗体 （本発明の抗体と略記する場合がある） およびアンチセ ンス D N Aの用途を説明する。
( 1 ) 各種疾病の治療 ·予防剤などの医薬
本発明のタンパク質および本発明の D NAは、 例えば高リン血症、 動脈硬 化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 腎不 全などの予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
本発明のタンパク質または本発明の D NAを上記の医薬として使用する場 合は、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬 学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非 経口的に使用できる。 例えば、 本発明のタンパク質あるいは D NAを生理学 的に認められる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤 などとともに一般に認められた製剤実施に荽求される単位用量形態で混和す ることによつて製造することができる。 これら製剤における有効成分量は指 示された範囲の適当な用量が得られるようにするものである。 本発明の D N Aを用いる場合は、 該 D NAを単独あるいはレトロウイルスベクタ一、 アデ ノウィルスベクター、 アデノウイルスァソシェ一テツドウィルスベクターな どの適当なベクターに挿入した後、常套手段に従って投与することができる。 錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチン、 コ一ンス夕一チ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結 晶性セルロースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸な どのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳 糖またはサッカリンのような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェ リーのような香味剤などが用いられる。 調剤単位形態が力プセルである場合 には、 前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することがで きる。 注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるな どの通常の製剤実施に従つて処方することができる。 注射用の水性液として は、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いら れ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール など） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルべ一ト 8 0 TM、 H C O - 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆 油などが用いられ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコ一 ルなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナ トリウム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プ ロカインなど） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレンダリ コールなど） 、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調整された注射液は、 通常、 適当なアン プリレに充填される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒト または温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒ ッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することが できる。
該タンパク質または DNAの投与量は、 症状などにより差異はあるが、 経 口投与の場合、 一般的に通常成人の動脈硬化症患者 （60 kgとして） にお いては、 一日につき有効成分を約 0. lmg〜l 0 Omg、好ましくは約 1. 0〜50mg、 より好ましくは約 1. 0〜20mgである。 非経口的に投与 する場合は、 その 1回投与量は投与対象、 対象組織、 症状、 投与方法などに よっても異なるが、 例えば、 注射剤の形では通常成人の動脈硬化症患者 （体 重 6 O kgとして） においては、 一日につき有効成分を約 0. 01〜30m g程度、 好ましくは約 0. 1〜2 Omg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。
(2) 遺伝子診断剤
本発明の DN Aは、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは温血 哺乳動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） における本発明のタンパク質またはそ の部分ペプチドをコードする DNAの異常 （遺伝子異常） を検出することが できる。 したがって、 本発明の DN Aは、 本発明のタンパク質が関与する各 種疾病の遺伝子診断剤として有用である。
例えば、 本発明のタンパク質またはその部分ペプチドをコードする DNA または mRNAが損傷し、 欠損し、 あるいはタンパク質の発現が減少してい ることが検出された場合は、 例えば、 高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 腎不全などの疾病である 可能性ありと診断することができる。
一方、 本発明のタンパク質またはその部分べプチドをコードする D N Aま たは m R N Aが増加し、 あるいはタンパク質の発現が増加していることが検 出された場合は、 例えば、 腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン 血症性ビタミン D抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症 性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン D抵抗性くる病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性 副甲状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性ァ シドーシス、 嚢胞性線維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎不全などの疾患である可 能性ありと診断することができる。
本発明の D N Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 自体公知のノーザ ンハイブリダィゼーシヨンや P C R—S S C P法（ゲノミックス（Genomics) , 第 5巻， 8 7 4〜8 7 9頁 （1 9 8 9年） 、 プロシージングズ ·ォブ .ザ · ナショナル ·アカデミー 'ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ユーエスエー
(Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America) , 第 8 6巻， 2 7 6 6〜2 7 7 0頁 （1 9 8 9年） ） などによ り実施することができる。
( 3 ) 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の定量 本発明の抗体は、 本発明のタンパク質を特異的に認識することができるの で、 被検液中の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドイッチ免疫測定法に よる定量などに使用することができる。
すなわち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のタンパク質とを 競合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のタンパク質の割 合を測定することを特徴とする被検液中の本発明の夕ンパク質の定量法、 お よび （i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本 発明の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識 剤の活性を測定することを特徴とする被検液中の本発明のタンパク質の定量 法を提供する。
上記 （i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のタンパク質の N端 部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のタンパク質の C端部に反応する 抗 であることが望ましい。
また、 本発明のタンパク質に対するモノクローナル抗体 （以下、 モノクロ ーナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のタンパク質の定量を行な えるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2 、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のタンパク質の定量法は、 特に制限されるべ きものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 タンパク質量） に対応した 抗体、 抗原もしくは抗体—抗原複合体の量を化学的または物理的手段により 検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算 出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメ トリー、 競合法、 ィムノメトリック法およびサンドイッチ法が好適に用いら れるが、 感度、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好 ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同 位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素とし ては、 例えば、 〔1 2 5 I〕 、 〔1 3 1 I〕 、 〔3H〕 、 〔1 4 C〕 などが、 上記酵 素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクト シダーゼ、 ]3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダ —ゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが、 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレス カミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが、 発光物質としては、 例 えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニンなどがそ れぞれ用いられる。 さらに、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン —アビジン系を用いることもできる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通 常タンパク質あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合 を用いる方法でもよい。 担体としては、 例えば、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリ コン等の合成樹脂、 あるいはガラスなどが用いられる。
サンドイッチ法においては不溶化したモノクローナル抗体に被検液を反応 させ （1次反応） 、 さらに標識化したモノクローナル抗体を反応させ （2次 反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検液中 の本発明のタンパク質量等を定量することができる。 1次反応と 2次反応は 逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なつ てもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができ る。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは 標識用抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度 を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のタンパク質の測定法においては、 1次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明の タンパク質等の結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわ ち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用い られる抗体が、 本発明のタンパク質の C端部を認識する場合、 1次反応で用 いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用 いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例え ば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリ一などに用いること ができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合 的に反応させたのち、 未反応の標識抗原と（F) と抗体と結合した標識抗原 (B) とを分離し （BZF分離） 、 B， Fいずれかの標識量を測定し、 被検 液中の抗原量を定量する。' '
本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 BZF分離をポリエチレン グリコール、 前記抗体に対する第 2抗体などを用いる液相法、 および、 第 1 抗体として固相化抗体を用いる力 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用 い第 2抗体として固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識 化抗体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検 液中の抗原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反 応の標識ィヒ抗体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 い ずれかの相の標識量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリーでは、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果 生じた不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量僅かであり、 少量 の沈降物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザ一ネフ口 メトリ一などが好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常 の条件、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のタンパク質の 測定系を構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総 説、 成書などを参照することができる。
例えば、 入江 寛編「ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 4 9年発行） . 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ」 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川 栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら 編 「酵素免疫測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYJ Vol . 70 (Immunochemical Techniques (Part A))、 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 7 (Immunochemi cal Techniques (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part
D: Selec ted Immunoass ys)) > 同書 Vol . 92 (Immunochemical Techniques (Part E : Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I： Hybridoma Technology and
Monoclonal Ant ibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行）などを参照する ことができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のタンパ ク質等を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のタンパク質の濃度を定量するこ とによって、 本発明のタンパク質が関与する各種疾病の診断を行なうことが できる。
例えば、 本発明のタンパク質の濃度が減少している場合は、 例えば、 高リ ン血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿 病性腎症、 腎不全などの疾患である可能性ありと診断できる。
一方、 本発明のタンパク質の濃度が増加している場合は、 例えば、 腫瘍性 低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン D抵抗性くる病
(XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシゥ ム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン!)抵抗性くる病、 骨軟 化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機能亢進症、 パジエツ ト病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線維症、 嚢 胞性線維性骨炎、 腎不全などの疾患である可能性ありと診断できる。
また、 本発明の抗体のうち、 本発明のタンパク質の活性を中和することが できる抗体は、 例えば腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症' 性ビタミン D抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性く る病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビ夕 ミン D抵抗性くる病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性副甲 状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性ァシド 一シス、 嚢胞性線維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎不全などの疾患の予防 ·治療 剤などの医薬として使用することができる。
さらに、 本発明の抗体は、 体液や組織などの被検体中に存在する本発明の タンパク質等を検出するために使用することができる。 さらに、 本発明の夕 ンパク質等を精製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中 の本発明のタンパク質等を検出するために使用することができる。 ( 4 ) 医薬候補化合物のスクリーニング
(A) レセプタ一ァゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法 本発明のタンパク質は、 腎尿細管細胞上に存在するフォスファトニンレセ プター （以下、 レセプ夕一と略記する） に特異的に結合することができるの で、 本発明のタンパク質と該レセプターを用いたリガンド ·レセプ夕一結合 アツセィ系を構築することによって、 本発明のタンパク質と同様の作用を有 する医薬候補化合物のスクリーニングや、 本発明のタンパク質の作用を阻害 する医薬候補化合物のスクリーニングを行なうことができる。 すなわち、 本 発明は、 本発明のタンパク質を用いるレセプタ一ァゴニストまたはアン夕ゴ ニス卜のスクリーニング方法を提供する。
より具体的には、 本発明は、
(1) ( i) レセプターまたはその部分ペプチドに、 本発明のタンパク質を 接触させた場合と .（ii) レセプ夕一またはその部分ペプチドに、 本発明のタ ンパク質等および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴 とするレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニストのスクリーニング方法、 および
(2) ( i) レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、 本発明の タンパク質等を接触させた場合と （U) レセプターを含有する細胞またはそ の細胞膜画分に、 本発明のタンパク質および試験化合物を接触させた場合と の比較を行なうことを特徴とするレセプターァゴニストまたはアン夕ゴニス 卜のスクリーエング方法を提供する。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法においては、 （i) と （ii) の 場合における、 例えば、 レセプターまたはレセプターを含有する細胞等に対 する本発明のタンパク質の結合量、 該レセプ夕ーを含有する細胞におけるレ セプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチルコリ ン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生 成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） 、 Na+-Pi輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 -ヒド ロキシラーゼ活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3_24-ヒドロキシラーゼ活性な どを測定して、 比較することを特徴とするものである。
より具体的には、 本発明は、
(l a) (i) 標識した本発明のタンパク質を、 レセプ夕一またはその部分 ペプチドに接触させた場合と、 （ii) 標識した本発明のタンパク質および試 験化合物を、 レセプ夕一またはその部分べプチドに接触させた場合における、 標識した本発明のタンパク質の該レセプタ一またはその部分べプチドまたは それらの塩に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするレセプ夕一 ァゴニストまたはアン夕ゴニストのスクリーニング方法、
(2 a) ( i ) 標識した本発明のタンパク質を、 レセプ夕一を含有する細胞 またはその細胞膜画分に接触させた場合と、 （ii) 標識した本発明のタンパ ク質および試験化合物を、 レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分 に接触させた場合における、 標識した本発明のタンパク質の該細胞またはそ の細胞膜画分に対する結合量を測定し、 比較することを特徴とするレセプ夕 —ァゴ二ストまたはアン夕ゴニストのスクリーニング方法、 および
(2 b) U) 本発明のタンパク質を、 レセプタ一を含有する細胞に接触さ せた場合と、 （ii) 本発明のタンパク質および試験化合物を、 レセプターを 含有する細胞に接触させた場合における、 レセプターを介する細胞刺激活性 (例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変 動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） 、 Na+-Pi輸送 活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 ひ-ヒドロキシラ一ゼ活性、 25-ヒドロキ. シビタミン D 3_24-ヒドロキシラーゼ活性などを測定し、比較することを特徴 とするレセプターァゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニング方法を 提供する。
上記の （l a) または （2 a) のスクリーニング方法において、 レセプタ —に結合して、 本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害する化合物 がレセプターァゴニストまたはアン夕ゴニストとして選択できる。
上記 （2 b) のスクリーニング方法において、 レセプターに結合し、 該レ セプ夕一を含有する細胞におけるレセプ夕一を介する細胞刺激活性（例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） を促進する活性、 Na+-Pi 輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D3- 1 ひ-ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-24-ヒドロキシラーゼ促進活性などを有する化合 物をレセプ夕一ァゴニストとして選択することができ、 一方、 該細胞刺激活 性を抑制する活性、 Na+-Pi輸送促進活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 a- ヒドロキシラーゼ促進活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラー ゼ阻害活性などの作用を有する化合物をレセプターアン夕ゴニストとして選 択することができる。
また、 上記の （l a) または （2 a) のスクリーニング方法において、 本 発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻害する活性が認められた試験化 合物の中で、 リン利尿活性、 低リン血症誘導活性、 該レセプターを含有する 細胞におけるレセプターを介する細胞刺激活性（例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞 内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 pHの低下など） 、 腎臓細胞における Na+- Pi輸送阻害活性、 25 - ヒドロキシビタミン D 3-1 α-ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビ タミン D 3-24-ヒドロキシラ一ゼ促進活性などの活性を有する化合物をレセ プタ一ァゴニストとして選択することができ、 これらの活性を有しない化合 物をレセプ夕一アンタゴニストとして選択することができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプターとしてはヒトあるい は温血動物の腎近位尿細管細胞に発現しているフォスファトニンレセプター などが用いられる。
これらのレセプ夕一および本発明のタンパク質に対するレセプタ一は、 自 体公知のタンパク質の精製方法に従って入手することができ、 また、 自体公 知の遺伝子工学的手法に従って該レセプターをコードする DNAをクロー二 ングした後、 前記した本発明のタンパク質の発現方法に従って目的とするレ セプターを入手することもできる。
該レセプ夕一の部分ペプチドとしては、 全長レセプターを適当に切断して 得られる部分ペプチドを用いることができる。
標識した本発明のタンパク質としては、 例えば、 〔3Η〕 、 〔1251〕 、 4C〕 、 〔35S〕 などで標識した本発明のタンパク質などを用いることができ る。 本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプ夕一を含有する細胞 としては、 前記した本発明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞 として列記したものと同様のものを用いることができるが、 なかでも、 C H O細胞などが好ましい。 レセプターを含有する細胞は、 レセプターをコード する D N Aを用いて、 自体公知の方法、 例えば、 前記した本発明のタンパク 質の発現方法などに従って製造することができる。 また、 上記レセプターを 含有する細胞として、 C L 8細胞株 （ポーン （BONE) ， 18, 159-169, 1996) 、 O K細胞株（アメリカン'ジャ一ナル 'ォブ 'フィジオロジー（AMER I CAN J OURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227, 1987) などの株化細胞を用いることもでき る。
本発明のスクリーニング方法において、 レセプターを含有する細胞を用い る場合、 該細胞をグルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化することが できる。 固定化方法は、 それ自体公知の方法に従って行うことができる。 上記レセプターを含有する細胞の細胞膜画分としては、細胞を破砕した後、 それ自体公知の方法で得られる細胞膜が多く含まれる画分のことをいう。 細 胞の破碎方法とじては、 P 011 e r— E 1 veh j em型ホモジナイザーで細胞を押し潰 す方法、 ワーリングブレンダ一やポリトロン （Kinemat ica社製） のよる破砕、 超音波による破碎、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルか ら噴出させることによる破砕などが挙げられる。 細胞膜の分画には、 分画遠 心分離法や密度勾配遠心分離法などの遠心力による分画法が主として用いら れる。 例えば、 細胞破砕液を低速 （5 0 0 r p m〜3 0 0 0 r p m) で短時 間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 （1 5 0 0 0 r p m
〜3 0 0 0 0 r' p m) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる沈澱を膜画分 とする。 該膜画分中には、 発現したレセプ夕一または本発明のタンパク質と、 細胞由来のリン脂質や膜蛋白質などの膜成分が多く含まれる。
該レセプターを含有する細胞やその細胞膜画分中のレセプ夕一の量は、 1 細胞当たり 1 0 3〜1 0 8分子であるのが好ましく、 1 0 5〜1 0 7分子である のが好適である。 なお、 発現量が多いほど膜画分当たりのリガンド結合活性 (比活性） が高くなり、 高感度なスクリーニング系の構築が可能になるばか りでなく、 同一ロットで大量の試料を測定できるようになる。
試験化合物としては、 例えばタンパク質、 タンパク、 非タンパク質性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液な どが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合 物であってもよい。 ，
本発明のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質とレセプ夕一 との反応は、 通常約 37 °Cで数時間行なうことができる。
具体的には、 上記の （l a) または （2 a) のスクリーニング方法を実施 するには、 まず、 本発明のレセプ夕一を含有する細胞またはその細胞膜画分、 あるいはレセプタ一またはその部分ペプチドを、 スクリーニングに適したバ ッファーに懸濁することによりレセプ夕一標品を調製する。バッファーには、 pH約4〜10 (望ましくは、 pH約 6〜8) のリン酸バッファ一、 トリス -塩酸バッファ一などの、 本発明のタンパク質とレセプ夕一との結合を阻害 しないバッファーであればいずれでもよい。 また、 非特異的結合を低減させ る目的で、 CHAPS、 Twe e n - 80™ (花王—アトラス社） 、 ジギト ニン、 デォキシコレ一卜などの界面活性剤をバッファーに加えることもでき る。 さらに、 プロテア一ゼによるレセプターやリガンドの分解を抑える目的 で、 PMSF、 ロイぺプチン、 バシトラシン、 ァプロチニン、 E— 64 (夕 ンパク質研究所製） 、 ぺプスタチンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添加するこ ともできる。 一方、 細胞が固定化細胞の場合、 培養器に固定化させたまま、 つまり細胞を生育させた状態で、 あるいはダルタルアルデヒドゃパラホルム アルデヒドで固定した細胞を用いて、 本発明のタンパク質等とレセプターを 結合させることができる。
この場合、 該緩衝液は培地やハンクス液などが用いられる。 そして、 0.0 1 m 1〜 10 m 1の該レセプター溶液に、 一定量 （例えば、 2000 C i / mmo 1の場合、 約 10000 c ρπ！〜 1000000 c pm) の標識した 本発明のタンパク質等 （例えば、 〔1251〕 で標識した本発明のタンパク質） を添加し、 同時に 10_4M〜10— 1DMの試験化合物を共存させる。 非特異 的結合量 （NSB) を知るために大過剰の未標識の本発明のタンパク質を加 えた反応チューブも用意する。 反応は 0°Cから 50° (：、 望ましくは 4°Cから 37°Cで 20分から 24時間、 望ましくは 30分から 3時間行なう。反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファーで洗浄した後、 ガラス繊維 濾紙に残存する放射活性（例えば、 〔1251〕 の量） を液体シンチレ一シヨン カウンターまたはァーカウンタ一で測定する。 濾過には、 マ二ホールドゃセ ル八一べス夕一を用いることができるが、 セルノ、一ベスターを用いることが 効率を上げるために望ましい。 拮抗する物質がない場合のカウント（B。） か ら非特異的結合量（NSB) を引いたカウント （B。一 NSB) を 100%と した時、 特異的結合量 （B— NSB) が、 例えばカウント （B。― NSB) の 50 %以下になる試験化合物をァゴニストまたはアンタゴニスト候補化合物 として選択することができる。
また、 上記 （2 b) のスクリーニング方法を実施するためには、 レセプ夕 —を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノ シトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 PHの低 下など） 、 Na+-Pi輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 ひ-ヒドロキシラ —ゼ活性、 25-ヒドロキシビ夕ミン D 3- 24-ヒドロキシラーゼ活性などの活性 を公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って測定することができる。 具体的には、 まず、 レセプターを含有する細胞をマルチウエルプレート等 に培養する。 スクリーニングを行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある いは細胞に毒性を示さない適当なバッファ一に交換し、 試験化合物などを添 加して一定時間インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収し て、 生成した産物をそれぞれの方法に従って定量する。 細胞刺激活性の指標 とする物質 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン 酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） の生 成が、 細胞が含有する分解酵素によって検定困難な場合は、 該分解酵素に対 する阻害剤を添加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制 などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の基礎的産生量を増大さ せておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
a+- Ρί輸送活性の測定は、，例えばコール J. A. (Cole J. A.) 等の方法に準 じて行うことができる （アメリカン 'ジャーナル *ォブ'フィジオロジー (AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227, 1987) 。
25-ヒドロキシビタミン D3-l α-ヒドロキシラ一ゼ活性および 25 -ヒドロキ シビタミン D 3-24-ヒドロキシラーゼ活性の測定は、 例えばミャゥチ
A. (Miyauchi Α.)等の方法に準じて行なうことができる （ジャ一ナル ·ォブ- クリニカル'エンドクリノロジー 'アンド ·メタポリズム（JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM) 67, 46-53, 1988) 。
これらの測定に用いる細胞としては例えば先述の CL 8細胞株および〇K 細胞株などの株化細胞が挙げられる。
上記 （2 b) のスクリーニング方法において、 試験化合物を添加した際に' レセプ夕一を含有する細胞が、 該レセプターを介する細胞刺激活性（例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位 変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 PHの低下など） 上昇、 Na+-Pi輸送活性低 下、 25-ヒドロキシビタミン03-1 α -ヒドロキシラーゼ活性低下、 25-ヒドロ キシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラーゼ活性上昇などを示した場合、該試験化 合物をレセプターァゴニスト候補ィヒ合物として選択することができる。一方、 試験ィ匕合物を添カ卩した際にレセプターを含有する細胞が、 該レセプターを介 する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞 内 C a2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシト —ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下な ど） 低下、 Na+- Pi輸送活性上昇、 25-ヒドロキシビタミン D 3_l α-ヒドロキ シラーゼ活性上昇、 25-ヒドロキシビ夕ミン D 3-24-ヒドロキシラーゼ.活性低 下などを示した場合、 該試験化合物をレセプターアンタゴニスト候補化合物 として選択することができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質、 好ましくはさ らに、 レセプターを含有する細胞もしくはその細胞膜画分等を含有するもの である。
本発明のスクリ一二ング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清 アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0.45 mのフィル夕一で濾 過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。
②レセプター標品
本発明の夕ンパク質に対するレセプターなどを含有する CHO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 105個/穴で継代し、 37 ：、 5%C〇2、 95%a i rで 2日間培養したもの。
③標識した本発明の夕ンパク質標品
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を 〔3H〕 、 C1 5 IK 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識したもの。
④本発明のタンパク質標準液
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩を 0.1%ゥシ血 清アルブミン（シグマ社製） を含む PBSで 0. ImMとなるように溶解し、 - 20 で保存したもの。
〔測定法〕
① 12穴組織培養用プレートにて培養した組換え型レセプ夕一を含有する C
HO細胞を、 測定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩 衝液を各穴に加える。
② 10一3〜 10— 10Mの試験化合物溶液を 5；½ 1加えた後、 5ηΜの標識し た本発明のタンパク質を 5 ^ 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 非特異的 結合量を知るためには試験化合物のかわりに 10— 4Μの本発明のタンパク質 を 5 1加えておく。
③反応液を除去し、 1 m 1の洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した 標識した本発明のタンパク質を 0. 5mlの 0.2 N NaOH- 1%SDS で溶解し、 ，4mlの液体シンチレ一夕一 A (和光純薬製） と混合する。 ④液体シンチレーシヨンカウンター （ベックマン社製） を用いて放射活性を 測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。 な お、 〔125 I〕 で標識されている場合は、 液体シンチレ一夕一と混合すること なしに直接ガンマーカゥン夕一で測定できる。
[数 1]
PMB= 100 X (B-NSB) / (B。一 NSB)
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の結合量
NS B： Non-specific Binding (非特異的結合量)
B。 ：最大結合量 以上のとおり、 本発明のタンパク質はレセプターァゴニストまたはアン夕 ゴニストをスクリーニングするための試薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質とレセプターとの結合を阻 害する化合物であり、 具体的には、 該レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞 膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） 、 Na+- Pi輸送阻害 活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 α -ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25-ヒド ロキシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラーゼ促進活性などの作'用を有する化合 物またはその塩 （いわゆる、 レセプ夕一ァゴニスト） 、 あるいは該レセプ夕 —を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノ シトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 PHの低 下など） 、 Na+- Pi輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D3-l α -ヒドロキ シラ一ゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-24-ヒドロキシラ一ゼ促進活 性などの作用を有しない化合物またはその塩 （いわゆる、 レセプ夕一アン夕 ゴニスト） である。 レセプ夕一ァゴニストは、 本発明のタンパク質が有する生理活性の全部ま たは一部を有しているので、 該生理活性に応じて安全で低毒性な医薬として 有用である。 例えば、 高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒 中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 腎不全などの疾病の予防 ·治療剤など の医薬として有用である。
一方、 レセプ夕一アン夕ゴニストは、 本発明のタンパク質が有する生理活 性の全部または一部を抑制することができるので、 該生理活性を抑制する安 全で低毒性な医薬として有用である。 例えば、 腫瘍性低リン血性骨軟化症 (0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン D抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優 性遺伝を示す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン 血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン D抵抗性くる病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎 性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機能宂進症、 パジェット病、 腎ファンコー 二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎 不全などの疾患の予防 ·治療剤などの医薬として有用である。
( B ) 本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼ阻害剤のスクリーニン グ方法およびスクリーニング用キット
本発明のタンパク質またはその塩は生体内に存在するプロティナーゼによ つて切断され、 失活すると考えられる。 したがって、 本発明のタンパク質お よび本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼを用いることによって、 本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼを阻害する活性を有する化合 物を選択することができる。
該プロティナーゼを阻害する活性を有する化合物は、 生体内における本発 明のタンパク質の失活を防ぐことにより、 細胞間接触に依存しない発明の夕 ンパク質の活性を促進することが きるので、 例えば、 高リン血症、 動脈硬 化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 腎不 全などの疾患の予防 ·治療剤などの医薬として期待できる。
すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発 明のタンパク質を分解するプロティナーゼを阻害する活性を有する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法を提供する。 より具体的には、 本発明は、
( 1 ) ( i ) 本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼと本発明のタン パク質とをィンキュベ一卜した後、 レセプ夕一を含有する細胞に接触させた 場合と、
(ii) 本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼおよび試験化合物と本 発明の夕ンパク質とをィンキュベートした後、 レセプターを含有する細胞に 接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のタンパク質を分 解するプロティナーゼを阻害する活性を有する化合物またはその塩のスクリ 一二ング方法を提供する。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法においては、 （i) と （Π) の 場合における、 例えば、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキ ドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 CAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） 、 Na+- Pi輸送活性、 25-ヒドロキ シビタミン D3-l ひ-ヒドロキシラーゼ活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-24 - ヒドロキシラ一ゼ活性などの活性を測定して、 比較することを特徴とするも のである。
より具体的には、 本発明は、
(l a) ( i) 本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼと本発明の夕 ンパク質とをインキュベートした後、 レセプ夕一を含有する細胞に接触させ た場合と、 f
(ii) 本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼおよび試験化合物と本 発明のタンパク質とをインキュベートした後、 レセプターを含有する細胞に 接触させた場合における、 レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 cA MP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） 、 Na+- Pi輸送活性、 25-ヒドロキ シビタミン D 3-1 ひ-ヒドロキシラーゼ活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 24- ヒドロキシラーゼ活性などの活性を測定し、 比較することを特徴とする本発 明のタンパク質を分解するプロティナーゼを阻害する活性を有する化合物ま たはその塩のスクリーニング方法を提供する。
上記のスクリーニング方法において、 該レセプターを介する細胞刺激活性
(例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変 動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 Na+-P i輸送 阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 α -ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25- ヒドロキシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラーゼ促進活性などの活性を促進す る試験化合物を本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼを阻害する活 性を有する化合物またはその塩として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプ夕一としては、 ヒトある いは温血動物の腎近位尿細管細胞に発現しているフォスファトニンレセプ夕 一が用いられる。
本発明のタンパク質に対するレセプターは、 自体公知のタンパク質の精製 方法に従って入手することができ、 また、 自体公知の遺伝子工学的手法に従 つて該レセプ夕ーをコードする D N Aをクローニングした後、 前記した本発 明のタンパク質の発現方法に従って目的とするレセプターを入手することも できる。
本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼとしては、 例えば、 亜鉛メ 夕口べプチダ一ゼや Ρ Η Ε X遺伝子産物などが用いられる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプ夕一を含有する細胞 としては、 前記した本発明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞 として列記したものと同様のものを用いることができるが、 なかでも、 C H 〇細胞などが好ましい。 レセプ夕一を含有する細胞は、 レセプ夕一をコード する D NAを用いて、 自体公知の方法、 例えば、 前記した本発明のタンパク 質の発現方法などに従って製造することができる。 また、 上記レセプ夕一を 含有する細胞として、 C L 8細胞株 （ボーン （BONE) , 18, 159-169, 1996) 、 〇 K細胞株（ァメリカン'ジャーナル'ォブ 'フィジオロジー（A ERI CAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227, 1987) などの株化細胞を用いることもでき る。
本発明のスクリーニング方法において、 レセプ夕一を含有する細胞を用い る場合、 該細胞をグルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化することが できる。 固定化方法は、 それ自体公知の方法に従って行うことができる。 上記レセプ夕一を含有する細胞の細胞膜画分としては、 前記したものと同 様のものを用いることができる。
試験化合物としては、 例えばタンパク質、 タンパク、 非タンパク質性化合 物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液な どが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合 物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 プロティナ一ゼと本発明のタンパ ク質とのインキュベートは、 通常数時間、 約 3 7 °Cで行なうことができる。 また、 この反応混合物とレセプターを含有する細胞との反応は、通常数時間、 約 3 7 °Cで行なうことができる。
レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチル コリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸 化、 p Hの低下など） 、 Na+- P i輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 a - ヒドロキシラーゼ活性、 25 -ヒドロキシビタミン D 3-24-ヒドロキシラーゼ活 性などの測定は前記と同様にして行なうことができる。
本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質および本発明の タンパク質を分解するプロティナーゼを、—好ましくはさらに、 レセプターを 含有する細胞を含有するものである。 '
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Bal anced Sal t Solut i on (ギブコ社製） に、 0 . 0 5 %のゥシ血清 アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0 . 4 5 mのフィルタ一で濾 過滅菌し、 4 °Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。 ②レセプター標品
本発明のタンパク質に対するレセプターなどを含有する C HO細胞を、 1 2穴プレートに 5 X 1 0 5個 Z穴で継代し、 3 7 °C、 5 % C 02、 9 5 % a i rで 2日間培養したもの。
③本発明のタンパク質標品
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩
④本発明の夕ンパク質を分解するプロティナ一ゼ標品
本発明のタンパク質を分解するプロテナーゼ
〔測定法〕
①本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼと本発明のタンパク質とを 約 3 7 °Cで数時間ィンキュベ一トする。
②本発明のタンパク質を分解するプロティナ一ゼおよび試験化合物と本発明 のタンパク質とを約 3 7 °Cで数時間ィンキュベー卜する。
③上記①ぉよび②で得られる反応混合物を、 それぞれ本発明のタンパク質に 対するレセプ夕一を含有する細胞と約 3 7 °Cで数時間培養する。
④次いで、 該レセプタ一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、 細胞内 c AM P生成、 細胞 内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質 のリン酸化、 P Hの低下など） 、 Na+HPi輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 1 α-ヒドロキシラ一ゼ活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3_24-ヒドロキシラ ーゼ活性などを前記の方法に従つて測定する。
以上のとおり、 本発明のタンパク質は本発明の夕ンパク質を分解するプロ ティナーゼを阻害する活性を有する化合物またはその塩をスクリーニングす るための試薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質を分解するプロティナーゼ を阻害し、 該プロティナーゼによる本発明のタンパク質の失活を抑制する化 合物である。 したがって、 該化合物は、 細胞間接触に依存しない本発明の夕 ンパク質による該レセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸 遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2 +濃度の変動、細胞内 c AM P生成、 細胞内 c GM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋 白質のリン酸化、 p Hの低下など） 、 Na+-I>i輸送阻害活性、 25-ヒドロキシビ 夕ミン D 3-l ひ-ヒドロキシラ一ゼ阻害活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 24 - ヒドロキシラ一ゼ促進活性などの活性を促進することができ、 例えば高リン 血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病 性腎症、 腎不全などの安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 前記したレセプ夕一 ァゴニスト Zアン夕ゴニストと同様にして実施することができる。
(C) 本発明のタンパク質とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を 促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法
本発明のタンパク質は、 ヒトあるいは温血動物の腎近位尿細管細胞に発現 しているフォスファトニンレセプター （以下、 レセプターと略記する） に特 異的に結合することができるので、 本発明のタンパク質と該レセプターを用 いたリガンド ·レセプ夕一結合アツセィ系を構築することによって、 本発明 のタンパク質が該レセプターに結合した後の細胞内シグナル伝達を促進また は阻害する化合物またはその塩のスクリーニングを行なうことができる。 すなわち、 本発明は、 本発明のタンパク質を用いることを特徴とする本発 明のタンパク質とレセプ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または 阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニング方法を提供する。
より具体的には、 本発明は、
( 1 ) ( i ) レセプターを含有する細胞に、 本発明のタンパク質を接触させ た場合と （i i) レセプ夕一を含有する細胞に、 本発明のタンパク質および試 験化合物を接触させた場合との比較を行なうことを特徴とする本発明のタン パク質とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する 化合物またはその塩のクリーニング方法を提供する。
具体的には、 本発明のスクリーニング方法においては、 （i ) と （i i) の 場合における、 例えば本発明のタンパク質とレセプタ一が結合した後の細胞 内シグナル伝達などを測定して、 比較することを特徵とするものである。 より具体的には、 本発明は、
(l a) (i) 本発明のタンパク質を、 レセプ夕一を含有する細胞に接触さ せた場合と、 （ii) 本発明のタンパク質および試験化合物を、 レセプ夕一を 含有する細胞に接触させた場合における、 レセプターを介する細胞刺激活性
(例えば、.ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変 動、 細胞内 CAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） を測定し、 比 較することを特徴とする本発明のタンパク質とレセプターとの結合後の細胞 内シグナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング 方法を提供する。
上記 （l a) のスクリ一ニング方法において、 本発明のタンパク質とレセ プ夕一との結合を阻害せず、 本発明のタンパク質による該レセプターを介す る細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 cAM P生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一 ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） を促進する化合物を、 本発明のタンパク質とレセプターとの結合後の細胞内 シグナル伝達を促進する化合物またはその塩として選択することができる。 一方、 本発明のタンパク箅とレセプターとの結合を阻害せず、 本発明のタン パク質による該レセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊 離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋 白質のリン酸化、 pHの低下など） を阻害する作用を有する化合物を、 本発 明のタンパク質とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を阻害する化 合物またはその塩として選択することができる。
すなわち、 本スクリーニング方法は、 本発明のタンパク質とレセプ夕一と の結合に影響を与えず、 レセプター結合後の細胞内シグナル伝達を調節 （促 進または抑制） する化合物を選択する方法であるので、 本スクリーニング方 法に用いる試験化合物としては、 前記したレセプタ一ァゴニス 二ストのスクリーニング方法において、 レセプ夕一ァゴニストまたはアン夕 ゴニス卜として選択されなかった化合物を用いるのが望ましい。
本発明のスクリーニング方法に用いられるレセプ夕一としては、 ヒトある いは温血動物の腎近位尿細管細胞に発現しているフォスファトニンレセプ夕 一などが用いられる。
本発明のタンパク質に対するレセプ夕一は、 自体公知のタンパク質の精製 方法に従って入手することができ、 また、 自体公知の遺伝子工学的手法に従 つて該レセプターをコ一ドする D NAをクロ一ニングした後、 前記した本発 明のタンパク質の発現方法に従って目的とするレセプターを入手することも できる。 .
該レセプターの部分ペプチドとしては、 全長レセプ夕一を適当に切断して 得られる部分ペプチドを用いることができる。
本発明のスクリーニング方法に用いられる上記レセプ夕一を含有する細胞 としては、 前記した本発明のタンパク質を発現させるために用いる宿主細胞 として列記したものと同様のものを用いることができるが、 なかでも、 C H 0細胞などが好ましい。 レセプ夕一を含有する細胞は、 レセプターをコ一ド する D NAを用いて、 自体公知の方法、 例えば、 前記した本発明のタンパク 質の発現方法などに従って製造することができる。 また、 上記レセプタ一を 含有する細胞として、 C L 8細胞株 （ボーン （BONE) , 18, 159-169, 1996) 、 O K細胞株（アメリカン'ジャーナル'ォブ 'フィジオロジー（AMERI CAN J OURNAL OF PHYSIOLOGY) 253, E221-E227, 1987) などの株化細胞を用いることもでき る。 '
本発明のスクリーニング方法において、 レセプ夕一を含有する細胞を用い る場合、 該細胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定ィ匕することが できる。 固定化方法は、 それ自体公知の方法に従って行うことができる。 上記レセプ夕一を含有する細胞の細胞膜画分としては、 前記と同様のもの が用いられる。
試験化合物としては、 例えば、 タンパク質、 タンパク、 非タンパク質性化 合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液 などが挙げられ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化 合物であってもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質とレセプター を含有する細胞との反応は、 通常約 37 で数時間行なうことができる。 上記 （l a) のスクリーニング方法において、 本発明のタンパク質による 該レセプ夕ーを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチル コリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸 ィ匕、 pHの低下など） の測定は前記と同様にして行なうことができる。
上記 （1 a) のスクリーニング方法において、 試験化合物を添加した際に、 本発明のタンパク質によるレセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラ キドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 cA MP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） が促進された場合、 該試験化合 物をレセプ夕一結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物またはその塩 として選択することができる。 一方、 試験化合物を添加した際に、 本発明の タンパク質によるレセプターを介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸 遊離、 アセチルコリン遊離、細胞内 C a 2+濃度の変動、細胞内 cAMP生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋 白質のリン酸化、 pHの低下など） が阻害された場合、 該試験化合物をレセ プター結合後の細胞内シグナル伝達を促進する化合物またはその塩化合物と して選択することができる。 ， 本発明のスクリーニング用キットは、 本発明のタンパク質を、 好ましくは さらに、 レセプターを含有する細胞を含有するものである。
本発明のスクリーニング用キットの例としては、 次のものが挙げられる。 〔スクリーニング用試薬〕
①測定用緩衝液および洗浄用緩衝液
Hanks' Balanced Salt Solution (ギブコ社製） に、 0.05%のゥシ血清 アルブミン （シグマ社製） を加えたもの。 孔径 0.45 /zmのフィルターで濾 過滅菌し、 4°Cで保存するか、 あるいは用時調製しても良い。
②レセプター標品
本発明のタンパク質に対するレセプ夕一を含有する CHO細胞を、 12穴 プレートに 5X 105個 穴で継代し、 37°C、 5%C02、 95%a i rで 2日間培養したもの。
③本発明のタンパク質標品
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩
〔測定法〕
細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトー ルリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 pHの低下など） を前記の方法に従って測定する。
以上のとおり、 本発明のタンパク質はレセプター結合後の細胞内シグナル 伝達を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリーニングするための 試薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物またはその塩は、 本発明のタンパク質とレセプ夕一が結合した後 のレセプ夕一を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸遊離、 ァセチル コリン遊離、 細胞内 C a 2+濃度の変動、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGM P生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸 ィ匕、 pHの低下など） を促進する化合物またはその塩、 あるいは該細胞刺激 活性を阻害する化合物またはその塩である。
本発明のタンパク質とレセプターが結合した後の細胞内シグナル伝達を促 進する化合物またはその塩は、 例えば、 高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症候 群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 腎不全などの疾病の 予防 ·治療剤などの安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のタンパク質とレセプ夕一が結合した後の細胞内シグナル伝達を阻 害する化合物またはその塩は、 例えば、 腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン D抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示 す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる 病 （HHRH) 、 ビタミン D抵抗性くる病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異 常症、 二次性副甲状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎不全などの 疾患の予防 ·治療剤などの安全で低毒性な医薬として有用である。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得ら れる化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 前記したレセプ夕一 ァゴニスト Zアン夕ゴニストと同様にして実施することができる。 ( 4 ) アンチセンス D NA
本発明のタンパク質をコードする D N Aまたは mR N Aに相補的に結合し、 該 D N Aもしくは mR N Aや本発明のタンパク質の発現を抑制することがで きるアンチセンス D N Aは、 生体内において上記の作用を発揮する本発明の タンパク質またはそれをコードする D N Aの機能を抑制することができる。 したがって、 該アンチセンス D NAは、 例えば、 腫瘍性低リン血性骨軟ィ匕症 (0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン！)抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優 性遺伝を示す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン 血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン D抵抗性くる病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎 性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一 二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎 不全などの疾患の予防 ·治療剤として使用することができる。
該アンチセンス D NAを上記の治療 ·予防剤として使用する楊合、 前記し た本発明のタンパク質または D NAを含有する各種疾病の治療 ·予防剤と同 様にして実施することができる。
さらに、 該アンチセンス D NAは、 組織や細胞における本発明の D NAの 存在やその発現状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプロ一ブとし て使用することもできる。
( 5 ) D N A転移動物の作製 さらに本発明は、 リン利尿活性および Zまたは低リン血症誘導活性を有す る新規なタンパク質 「フォスファトニン （phosphatonin) 」 をコードする D NA (以下、 本発明の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DNA (本 発明の外来性変異 DNAと略記する場合がある） を有する非ヒト哺乳動物を 提供する。
すなわち、 本発明は、
(1)本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1)記載の動物、
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および (4) 本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを含有し、 哺乳動物にお いて発現しうる組換えベクター、 および
(5) 第 （4) 記載の組換えべクタ一を含有してなる遺伝子治療用医薬など を提供するものである。
本発明の外来性 DNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺乳動物 （以 下、 本発明の DNA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 受精卵、 精子およ びその始原細胞を含む胚芽細胞などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺乳動物 の発生における胚発生の段階 （さらに好ましくは、 単細胞または受精卵細胞 の段階でかつ一般に 8細胞期以前） に、 リン酸カルシウム法、 電気パルス法、 リポフエクシヨン法、 凝集法、 マイクロインジェクション法、 パーティクル ガン法、 DEAE—デキストラン法などにより目的とする本発明の外来性 D N Aを転移することによって作出することができる。 また、 該 DNA転移方 法により、 体細胞、 生体の臓器、 組織細胞などに目的'とする本発明の外来性 DNAを転移し、 細胞培養、 組織培養などに利用することもでき、 さらに、 これら細胞を上述の胚芽細胞と自体公知の細胞融合法により融合させること により本発明の DNA転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺乳動物としては、 例えば、 ゥシ、 ブタ、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の作成の面から個体発生および生物サイクルが 比較的短く、 また、 繁殖が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純 系として、 C57BLZ6.系統， DBA2系統など、 交雑系として、 B 6C 3F 1系統， BDF 1系統， B6D2F 1系統， BALB/c系統， I CR 系統など） またはラット （例えば、 Wi s t a r, SDなど） などが好まし い。
哺乳動物において発現しうる組換えベクターにおける 「哺乳動物」 として は、 上記の非ヒト哺乳動物の他にヒトなどが挙げられる。
本発明の外来性 DNAとは、 非ヒト哺乳動物が本来有している本発明の D NAではなく、 いったん哺乳動物から単離 ·抽出された本発明の DNAをい ろ。
本発明の変異 DN Aとしては、 元の本発明の DN Aの塩基配列に変異 （例 えば、 突然変異など） が生じたもの、 具体的には、'塩基の付加、 欠損、 他の 塩基への置換などが生じた DNAなどが用いられ、 また、 異常 DNAも含ま れる。
該異常 D N Aとしては、 異常な本発明のタンパグ質を発現させる D N Aを 意味し、 例えば、 正常な本発明のタンパク質の機能を抑制するタンパク質を 発現させる DNAなどが用いられる。
本発明の外来性 DNAは、 対象とする動物と同種あるいは異種のどちらの 哺乳動物由来のものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させ るにあたっては、 該 D N Aを動物細胞で発現させうるプロモ一夕一の下流に 結合した DNAコンストラクトとして用いるのが一般に有利である。例えば、 本発明のヒト DNAを転移させる場合、 これと相同性が高い本発明の DNA を有する各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス ター、 ラット、 マウスなど） 由来の DNAを発現させうる各種プロモータ一 の下流に、 本発明のヒト DNAを結合した DNAコンストラクト （例、 べク ターなど） を対象哺乳動物の受精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロイン ジェクシヨンすることによつて本発明の D N Aを高発現する D N A転移哺乳 動物を作出することができる。
本発明のタンパク質の発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファージなどのバクテ リオファージ、 モロニ一白血病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニア ゥィルスまたはバキュロウィルスなどの動物ウィルスなどが用いられる。 な かでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミドまたは酵母由来 のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ウィルス (例、 シミアンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィルス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプ 口モーター、 各種哺乳動物 （ヒト、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハム ス夕一、 ラット、 マウスなど） および鳥類 （ニヮトリなど） 由来のものとし ては、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロブラキン I I、 エラス夕一ゼ、 ェ リスロポェチン、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性 タンパク質、 ダルタチオン S—トランスフェラーゼ、 血小板由来成長因子 、 ケラチン K1, 1 0ぉょび 14、 コラ一ゲン I型および I I型、 サイク リック AMP依存タンパク質キ^ "一ゼ β Iサブユニット、 ジストロフィン、 酒石酸抵抗性アルカリフォスファタ一ゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮 レセプ夕一チロシンキナ一ゼ （一般に T i e 2と略される） 、 ナトリウム力 リウムアデノシン 3リン酸化酵素 （N a， K-ATP a s e) 、 ニューロフ イラメント軽鎖、 メタ口チォネイン Iおよび I I A、 メタ口プロティナーゼ 1組織インヒビ夕一、 MHCクラス I抗原 （H— 2L) 、 H— r a s、 レニ ン、 ドーパミン /3—水酸化酵素、 甲状腺ペルォキシダ一ゼ （TPO) 、 ポリ ペプチド鎖延長因子 1 （EF— 1 ひ） 、 βァクチン、 αおよび /3ミオシン 重鎖、 ミオシン軽鎖 1および 2、 ミエリン基礎タンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免疫グロブリン、 H鎖可変部 （VNP) 、 血清アミロイド Pコ ンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン ( 、 平滑筋 ァクチン、 プレブ口 エンケフアリン A、 パソプレシンなどのプロモーターなどが用いられるが、 好ましくは全身で高発現することが可能なサイトメガロウィルスプロモータ 一、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 ) のプロモーター、 ヒト およびニヮトリ )3ァクチンプロモーターなどを用いることができる。
上記ベクターは、 DN A転移哺乳動物において目的とするメッセンジャー R NAの転写を終結する配列 （一般に夕一ミネ夕一と呼ばれる） を有してい ることが好ましく、 例えば、 ウィルス由来、 各種哺乳動物および鳥類由来の 各 D NAの配列を用いることができ、 好ましくは、 シミアンウィルスの S V 4 0夕一ミネタ一などが用いられる。
その他、 目的 D NAをさらに高発現させる目的で各 D NAのスプライシン グシグナル、 ェンハンサ一領域、 真核 D NAのイントロンの一部などをプロ モ一夕一領域の 5 '上流、 プロモーター領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域 の 3 '下流 に連結することも目的により可能である。
正常な本発明のタンパク箅の翻訳領域は、 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウス、 ヒトなど） 由来の 肝臓， 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 D N Aおよび市販の各種ゲノム D N Aライブラリ一よりゲノム D N Aの全てあるいは一部として、または肝臓、 腎臓、 甲状腺細胞、 線維芽細胞由来 R N Aより公知の方法により調製された 相補 D N Aを原料として取得することが出来る。 また、 外来性の異常 D N A は、 上記の細胞または組織より得られた正常なタンパク質の翻訳領域を点突 然変異誘発法により変異した翻訳領域を作製することができる。
該翻訳領域は転移動物において発現しうる D NAコンストラクトとして、 前記のプロモ一ターの下流および所望により転写終結部位の上流に連結させ る通常の D N A工学的手法により作製することができる。
受精卵細胞段階における本発明の D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細 胞および体細胞のすべてに存在するように確保される。 D NA転移後の作出 動物の胚芽細胞において、 本発明の D NAが存在することは、 作出動物の後 代がすべて、 その胚芽細胞および体細胞のすべてに本発明の D N Aを保持す ることを意味する。
D NAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞のす ベてに本発明の D N Aを有する。
本発明の外来性正常 D NAを転移させた非ヒト哺乳動物は、 交配により D N Aを安定に保持することを確認して、 該 D NA保有動物として通常の飼育 環境で継代飼育することが出来る。 受精卵細胞段階における本発明の D N A の転移は、 対象哺乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに過剰に存在するよ うに確保される。 D NA転移後の作出動物の胚芽細胞において本発明の D N Aが過剰に存在することは、 作出動物の子孫が全てその胚芽細胞および体細 胞の全てに本発明の D NAを過剰に有することを意味する。 D NAを受け継 いだこの種の動物の子孫はその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の D N Aを過剰に有する。 導入 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動 物を取得し、 この雌雄の動物を交配することによりすべての子孫が該 D N A を過剰に有するように繁殖継代することができる。
本発明の正常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の正常 D NAが高 発現させられており、 内在性の正常 D NAの機能を促進することにより最終 的に本発明の夕ンパク質の機能亢進症を発症することがあり、 その病態モデ ル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の正常 D NA転移動物 を用いて、 本発明のタンパク質の機能亢進症や、 本発明のタンパク質が関連 する疾患の病態機序の解明およびこれらの疾患の治療方法の検討を行なうこ とが可能である。
また、 本発明の外来性正常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発 明のタンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質に関連す る疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利用可能である。
一方、 本発明の外来性異常 D N Aを有する非ヒト哺乳動物は、 交配により D NAを安定に保持することを確認して該 D N A保有動物として通常の飼育 環境で継代飼育することが出来る。 さらに、 目的 D NAを前述のプラスミド に組み込んで原科として用いることができる。 プロモーターとの D N Aコン ストラク卜は、 通常の D NA工学的手法によって作製することができる。 受 精卵細胞段階における本発明の異常 D N Aの転移は、 対象哺乳動物の胚芽細 胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動 物の胚芽細胞において本発明の異常 D N Aが存在することは、 作出動物の子 孫が全てその胚芽細胞および体細胞の全てに本発明の異常 D NAを有するこ とを意味する。 D NAを受け継いだこの種の動物の子孫は、 その胚芽細胞お よび体細胞の全てに本発明の異常 D N Aを有する。 導入 D N Aを相同染色体 の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 この雌雄の動物を交配すること によりすベての子孫が該 D NAを有するように繁殖継代することができる。 本発明の異常 D NAを有する非ヒト哺乳動物は、 本発明の異常 D NAが高 発現させられており、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより最終 的に本発明のタンパク質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態 モデル動物として利用することができる。 例えば、 本発明の異常 D N A転移 動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症の病態機序の解明 およびこの疾患を治療方法の検討を行なうことが可能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 D N A高発現動物は、 本発明のタンパク質の機能不活性型不応症における本発明の異常タンパク質 による正常タンパク質の機能阻害（dominant negat ive作用） を解明するモデ ルとなる。
また、 本発明の外来異常 D NAを転移させた哺乳動物は、 遊離した本発明の タンパク質の増加症状を有することから、 本発明のタンパク質の機能不活性 型不応症に対する治療薬スクリーニング試験にも利用可能である。
また、上記 2種類の本発明の D N A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
①組織培養のための細胞源としての使用、
②本発明の D N A転移哺乳動物の組織中の D NAもしくは R NAを直接分析 するか、 または D NAにより発現されたタンパク質組織を分析することによ る、 本発明のタンパク質により特異的に発現あるいは活性化するタンパク質 との関連性についての解析、
③ D NAを有する組織の細胞を標準組織培養技術により培養し、 これらを使 用して、 一般に培養困難な組織からの細胞の機能の研究、
④上記③記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のス クリーニング、 および
⑤本発明の変異タンパク質を単離精製およびその抗体作製などが考えられる。 さらに、 本発明の D NA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不 活性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の臨床症状を調べ ることができ、 また、 本発明のタンパク質に関連する疾患モデルの各臓器に おけるより詳細な病理学的所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による二次的疾患の研究および治療に貢献することができる。
また、 本発明の DNA転移動物から各臓器を取り出し、 細切後、 トリプシ ンなどのタンパク質分解酵素により、 遊離した DN A転移細胞の取得、 その 培養またはその培養細胞の系統化を行なうことが可能である。 さらに、 本発 明のタンパク質産生細胞の特定化、 低リン血症との関連性、 またはそれらに おけるシグナル伝達機構を調べ、 それらの異常を調べることなどができ、 本 発明のタンパク質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。
さらに、 本発明の DNA転移動物を用いて、 本発明のタンパク質の機能不 活性型不応症を含む、 本発明のタンパク質に関連する疾患の治療薬の開発を 行なうために、 上述の検査法および定量法などを用いて、 有効で迅速な該疾 患治療薬のスクリーニング法を提供することが可能となる。 また、 本発明の
DN A転移動物または本発明の外来性 DN A発現ベクターを用いて、 本発明 のタンパク質が関連する疾患の DN A治療法を検討、 開発することが可能で ある。
(6) ノックアウト動物の作製
さらに、'本発明は、 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹 細胞および本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物を提供する。
すなわち、 本発明は、
(1) 本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞、
(2) 大腸菌由来の ]3—ガラクトシダーゼ遺伝子を有する細胞である第（1) 項記載の胚幹細胞、
(3) ネオマイシン耐性である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （1) 項記載の胚幹細胞、
(5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DN A発現不全非ヒト哺乳動物、
( 7 ) レポ一夕一遺伝子が本発明のタンパク質のプロモーターの制御下で発 現しうる第 （6) 項記載の動物、
(8) レポーター遺伝子が大腸菌由来 iS—ガラクトシダーゼ遺伝子である第 (7) 項記載の動物、
(9) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の動物、
(10) ゲッ歯動物がマウスである第 （9) 項記載の動物、 および
(11) 第 （7) 項記載の動物に、 試験化合物を投与し、 レポ一ター遺伝子 の発現を検出することを特徴とする本発明のタンパク質のプロモーター活性 を促進する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供する。
本発明の DN Aが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞とは、 該非ヒト 哺乳動物が有する本発明の DNAに人為的に変異を加えることにより、 DN Aの発現能を抑制するか、 もしくは該 D N Aがコ一ドしている本発明のタン パク質の活性を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明の タンパク質の発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと称す ることがある） 非ヒト哺乳動物の胚幹細胞 （以下、 ES細胞と略記する） を いう。
非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の DNAに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子ェ 学的手法により該 DN A配列の一部又は全部の削除、 他 DN Aを挿入または 置換させることによって行なうことができる。 これらの変異により、例えば、 コドンの読み取り枠をずらしたり、 プロモーターあるいはェキソンの機能を 破壌することにより本発明のノックアウト DNAを作製すればよい。
本発明の DNAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞 （以下、 本発明 の DN A不活性化 E S細胞または本発明のノックアウト E S細胞と略記す る） の具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒト哺乳動物が有する本発明 の DNAを単離し、 そのェキソン部分にネオマイシン耐性遺伝子、 ハイグロ マイシン耐性遺伝子を代表とする薬剤耐性遺伝子、 あるいは l a c Z (β— ガラクトシダ一ゼ遺伝子） 、 c a t (クロラムフエニコールァセチルトラン スフエラ一ゼ遺伝子） を代表とするレポーター遺伝子等を挿入することによ りェキソンの機能を破壌するか、 あるいはェキソン間のィントロン部分に遺 伝子の転写を終結させる DNA配列 （例えば、 poly A付加シグナルなど） を 挿入し、 完全なメッセンジャー RNAを合成できなくすることによって、 結 果的に遺伝子を破壊するように構築した DNA配列を有する DNA鎖（以下、 ターゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同組換え法により該動 物の染色体に導入し、 得られた ES細胞について本発明の DNA上あるいは その近傍の DNA配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼーション解析 あるいはターゲッティングベクター上の DNA配列とターゲッティングべク 夕一作製に使用した本発明の DNA以外の近傍領域の DN A配列をプライマ —とした PCR法により解析し、'本発明のノックアウト ES細胞を選別する ことにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞 としては、 例えば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また 公知 E V an sと Kau f m aの方法に準じて新しく樹立したものでもよ レ^ 例えば、 マウスの ES細胞の場合、 現在、 一般的には 129系の ES細 胞が使用されているが、 免疫学的背景がはっきりしていないので、 これに代 わる純系で免疫学的に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的 で例えば、 C 57 BLZ6マウスや C 57 B LZ 6の採卵数の少なさを D B AZ2との交雑により改善した BDF 1マウス （C 57 BLZ6と DBAZ 2との F 1) を用いて樹立したものなども良好に用いうる。 BDF 1マウス は、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという利点に加えて、 C 57BL / 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた ES細胞は病態モデル マウスを作出したとき、 C 57 BL/6マウスとバッククロスすることでそ の遺伝的背景を C 57BL/6マウスに代えることが可能である点で有利に 用い得る。
また、 E S細胞を樹立する場合、 一般には受精後 3.5日目の胚盤胞を使用 するが、 これ以外に 8細胞期胚を採卵し胚盤胞まで培養して用いることによ り効率よく多数の初期胚を取得することができる。
また、 雌雄いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通常雄の ES細胞の方が 生殖系列キメラを作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を削減 するためにもできるだけ早く雌雄の判別を行なうことが望ましい。
ES細胞の雌雄の判定方法としては、 例えば、 PCR法により Y染色体上 の性決定領域の遺伝子を増幅、 検出する方法が、 その 1例として挙げること ができる。
この方法を使用すれば、従来、核型分析をするのに約 106個の細胞数を要 していたのに対して、 1コロニー程度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初期における E S細胞の第一次セレクションを雌雄の判別で行なうこと が可能であり、 早期に雄細胞の選定を可能にしたことにより培養初期の手間 は大幅に削減できる。
また、 第二次セレクションとしては、 例えば、 G—バンデ ング法による 染色体数の確認等により行うことができる。 得られる E S細胞の染色体数は 正常数の 100%が望ましいが、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な場 合は、 ES細胞の遺伝于をノックアウトした後、 正常細胞 （例えば、 マウス では染色体数が 2 n = 40である細胞） に再びクローニングすることが望ま しい。
このようにして得られた胚幹細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個 体発生できる能力を失いやすいので、 注意深く継代培養することが必要であ る。例えば、 S TO繊維芽細胞のような適当なフィーダ一細胞上で L I F (1 - 10000 U/inl) 存在下に炭酸ガス培養器内 （好ましくは、 5 %炭酸ガス、 95 %空気または 5%酸素、 5%炭酸ガス、 90%空気） で約 37 °Cで培養 するなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶液 (通常 0.001-0.5%トリプシン/ 0.1 - 5mM EDTA, 好ましく は約 0.1 %トリプシン/ ImM EDTA) 処理により単細胞化し、 新たに 用意したフィーダ一細胞上に播種する方法などがとられる。 このような継代 は、 通常 1一 3日毎に行なうが、 この際に細胞の観察を行い、 形態的に異常 な細胞が見受けられた場合はその培養細胞は放棄することが望まれる。 -
ES細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 また は細胞集塊を形成するまで浮遊培養することにより、 頭頂筋、 内臓筋、 心筋 などの種々のタイプの細胞に分化させることが可能であり 〔M. J. Evans及び M. H. Kaufman, ネィチヤ一（Nature)第 292巻、 154頁、 1981年； G. R. Mart in プロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイエンス · ュ一エスエー （Pro at l. Acad. Sci . ϋ. S. Α· ) 第 78巻、 7634頁、 1981年； T. C. Doetschman ら、 ジャーナル'ォブ'ェンブリオロジ一 ·アンド ·ェク スペリメンタル ·モルフォロジ一、 第 87卷、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて得られる本発明の D N A発現不全細胞は、 インビトロに おける本発明のタンパク質の細胞生物学的検討において有用である。
本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物は、 該動物の mR NA量を公知方 法を用いて測定して間接的にその発現量を比較することにより、 正常動物と 区別することが可能である。
該非ヒト哺乳動物としては、 前記と同様のものが用いられる。
本発明の D NA発現不全非ヒ卜哺乳動物は、 例えば、 前述のようにして作 製した夕一ゲッティングベクターをマウス胚幹細胞またはマウス卵細胞に導 入し、 導入によりターゲッティングベクタ一の本発明の D N Aが不活性化さ れた D N A配列が遺伝子相同組換えにより、 マウス胚幹細胞またはマウス卵 細胞の染色体上の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさせることによ り、 本発明の D NAをノックアウトさせることができる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはそ の近傍の D NA配列をプローブとしたサザンハイプリダイゼーション解析ま たは夕ーゲッティングベクター上の D NA配列と、 ターゲッティングベクタ —に使用したマウス由来の本発明の D N A以外の近傍領域の D N A配列とを プライマ一とした P C R法による解析で判定することができる。 非ヒト哺乳 動物胚幹細胞を用いた場合は、 遺伝子相同組換えにより、 本発明の D N Aが 不活性化された細胞株をクローニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細胞期の非ヒト哺乳動物胚または胚盤胞に注入し、 作製したキメラ胚を偽 妊娠させた該非ヒト哺乳動物の子宮に移植する。 作出された動物は正常な本 発明の D N A座をもつ細胞と人為的に変異した本発明の D N A座をもつ細胞 との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が変異した本発明の D NA座をもつ場合、 このようなキメラ個体と正常個体を交配することにより得られた個体群より、 全ての組織が人為的に変異を加えた本発明の D N A座をもつ細胞で構成され た個体を、 例えば、 コートカラーの判定等により選別することにより得られ る。 このようにして得られた個体は、 通常、 本発明のタンパク質のヘテロ発 現不全個体であり、本発明のタンパク質のヘテロ発現不全個体同志を交配し、 それらの産仔から本発明の夕ンパク質のホモ発現不全個体を得ることができ る。
卵細胞を使用する場合は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクショ ン法で D N A溶液を注入することにより夕一ゲッティングベクターを染色体 内に導入したトランスジエニック非ヒト哺乳動物を得ることができ、 これら のトランスジエニック非ヒト哺乳動物に比べて、 遺伝子相同組換えにより本 発明の D N A座に変異のあるものを選択することにより得られる。
このようにして本発明の D NAがノックアウトされている個体は、 交配に より得られた動物個体も該 D N Aがノックアウトされていることを確認して 通常の飼育環境で飼育継代を行なうことができる。
さらに、 生殖系列の取得および保持についても常法に従えばよい。 すなわ ち、 ¾不活化 D NAの保有する雌雄の動物を交配することにより、 該不活化 D N Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得しうる。 得られ たホモザィゴート動物は、 母親動物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート 複数になるような状態で飼育することにより効率的に得ることができる。 へ テロザィゴー卜動物の雌雄を交配することにより、 該不活化 P N Aを有する ホモザィゴートおよびへテロザィゴート動物を繁殖継代する。
本発明の D NAが不活性化された非ヒト哺乳動物胚幹細胞は、 本発明の D NA発現不全非ヒト哺乳動物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 本 発明のタンパク質発現不全マウスは、 本発明のタンパク質により誘導され得 る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のタンパク質の生物活性の不活性 化を原因とする疾病のモデルとなり得るので、 これらの疾病の原因究明及ぴ 治療法の検討に有用である。
また、 本発明のタンパク質の構造遺伝子をレポーター遺伝子で置換された 本発明のタンパク質発現動物では、 レポ一夕一遺伝子が本発明のタンパク質 のプロモーターの支配下に存在するので、 レポーター遺伝子がコードする物 質の発現をトレ一スすることにより、 本発明のタンパク質のプロモ一ターの 活性を検出することができる。 例えば、 本発明のタンパク質をコ一ドする D N A領域の一部を大腸菌由来の 一ガラクトシダーゼ遺伝子 ( 1 a c Z) で 置換している場合、 本来、 本発明のタンパク質の発現する組織で、 本発明の タンパク質の代わりに —ガラクトシダ一ゼが発現する。 従って、 例えば、 5—ブロモ一4一クロ口一 3—インドリル一 3—ガラクトピラノシド （X— g a l) のような /3—ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色する ことにより、 簡便に本発明のタンパク質の動物生体内における発現状態を観 察することができる。 具体的には、 本発明のタンパク質欠損マウスまたはそ の組織切片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 ダルベッコリン酸緩衝生理 食塩液 (PBS) で洗浄後、 X— ga 1を含む染色液で、 室温または 7°C付 近で、 約 30分ないし 1時間反応させた後、 組織標本を ImM EDTA/P BS溶液で洗浄することによって、 iS—ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を観察すればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRNA を検出してもよい。
このような本発明のタンパク質発現不全動物は、 本発明のタンパク質のプ 口モーターを活性化または不活化する物質をスクリーニングする上で極めて 有用であり、 本発明のタンパク質発現不全に起因する各種疾患の原因究明ま たは治療薬の開発に大きく貢献することができる。 本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略号 あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体 を示すものとする。
DNA ：デォキシリポ核酸
cDNA ：相補的デォキシリポ核酸 A 'アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA リポ核酸 dATP ：リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 dCTP デォキシシチジン三リン酸 ATP 三リン酸'
EDTA '四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A l a ' ァラニン
Va 1 バリン
Le u
I 1 e イソロイシン
S e r セリン
Th r スレオニン
Cy s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン
H i s ヒスチジン
Ph e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン T r p
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
Me メチル基
E t ェチル基
B u ブチル基
Ph フエニル基
TC チアゾリジン一 4 (R) 一力ルポキサミド基 また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で 表記する。
To s ： P-トルエンスルフォニル
CHO ：ホルミル ·
B z 1
CI 2Bzl ： 2, 6 - Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルボニル
C 1 -Z 2一クロ口べンジルォキシカルポニル
B r -Z 2—ブロモベンジルォキシカルポニル
B o c t一ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエノ一ル
T r t トリチル
B um t—ブトキシメチル
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t
HOOB t 3， 4—ジヒドロ一 3—ヒドロキシ一 4—ォキソ一
1, 2, 3一べンゾ卜リアジン HONB ：卜ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2， 3-ジカルポキシイミ ド、
本明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
本発明のヒ卜由来タンパク質のアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 2〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする D N Aの塩基配列を示す。 〔配列番号： 3〕
プラスミド pCR— PHOSに挿入されている、 本発明のヒト由来タンパ ク質をコードする DN Aを含有する DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする DN Aをクローニングするため に使用したプライマ一の塩基配列を示す。
.〔配列番号： 5〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする DNAをクローニングするため に使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 6〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする DNAをクローニングするため に使用したプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1で用いられた Xh o Iサイトを含む O 1 i g o (dT) 18リンカ —プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする DNAをクロ一ニングするため に使用したプライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする DN Aをクロ一ニングするため に使用したプライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 10〕
本発明のヒト由来タンパク質をコードする DNAをクローニングするため · に使用したプライマーの塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシエリヒア コリ （Escherichia coli)TOP 10/pCR— PHOSは、平成 12年 5月 29日から通商産業 省工業技術院生命工学工業技街研究所 （N I BH) に寄託番号 FERM B P— 7172として、 また平成 12年 5月 11日から財団法人 ·発酵研究所
(I FO) に寄託番号 I FO 16431として寄託されている。
後述の実施例 2で得られた形質転換ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) MM294 (DE 3)/pTC II— mPHOS— 2は、 2001年 6月 7 曰から日本国茨城県つくば市東 1一 1一 1 中央第 6、 独立行政法人産業技 術総合研究所 特許生物寄託センタ一に寄託番号 FERM BP— 7625 として、 また受託番号 I FO 16646として 2001年 5月 31日付で 日本国大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17— 85、財団法人発酵研究所（ I FO) に寄託されている。
後述の実施例 6で得られた形質転換ェシエリヒア コリ （Escherichia coli) JM109/pT-PH0SF-llは、 2001年 6月 7日から日本国茨城県つくば市 東 1— 1一 1 中央第 6、 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託 センタ一に寄託番号 FERM BP—7626として、 また受託番号 I FO 1664'7として 2001年 5月 31日付で日本国大阪府大阪市淀川区十三 本町 2— 17— 85、 財団法人発酵研究所 （I FO) に寄託されている。 実施例
以下に、 実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明はそ れに限定されるものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モ レキユラ一'クロ一ニング （Molecular cloning) に記載されている方法に従 つた。 [実施例 1 ] リン利尿活性および Zまたは低リン血症誘導活性を有する新規 なタンパク質、 フォスファトニン （phosphatonin) 」 をコードする cDNA のクロ一ニング
OHO患者腫瘍由来の cDN Aライブラリ一は以下のようにして調製した。 すなわち、 OHO患者の副鼻腔腫癟組織より、 フエノール-クロ口ホルム-ィ ソァミルアルコ一ル、 L i C 1沈澱法（プラント ·セル'フィジオロジー（PLANT CELL PHYSIOLOGY) 36, 85-93, 1995) に準じ t o t a 1 RNAを取得した。 抽出した t o t a l RNA約 480〃 g力、ら、 O 1 i g o t e x (dT) 3。 一 Sup e r (宝酒造 （株） ） を用いて p o 1 y (A) + RNA約 6 /xgを 取得した。
c DN Aライブラリ一はグブラーとホフマン （Gubler and Hoffman) の方法 に従って作製した。 po l y (A) + RNA (2. 5 g) 、 Xh o Iサイ トを含む O l i go (dT) 18—リンカ一プライマー
( (GA) 10ACGCGTCGACTCGAGCGGCCGCGGA CCG (T) 18) (配列番号： 7 ) 、 5 - me t hy l dCTP、 dATP、 dGTP、 dTTP、 RAV— 2リバ一スト ランスクリプタ一ゼおよび Sup e r s c r i p t I Iリバ一ストランスク リプ夕ーゼを用いて f i r s t s t r and DN Aを合成した。 これに R Na s eH、 DNAポリメラ一ゼ Iおよび d NT P mixtureを反応させ、 s e c ond s t r and DNAを合成した。 S e c ond s t r an d DNA の末端を平滑化した後、 T4 DNAリガ一ゼを用いて E c o R I— No t I— BamHIアダプタ一 （宝酒造 （株） ） をライゲーシヨン した。 これを制限酵素 Xho Iで切断後スピンカラムを用いて低分子量 DN Aを除去し、 T4 DNAリガーゼを用いて λ Z AP I I (EcoRI- Xhol切断） (STRATAGENE社） とベクターライゲーシヨンした。 こうして得られた λファ ージベクターをインビトロパッケージングキット （STRATAGENE社） を用いて λファージ前駆体夕ンパク質に組み込み、 λファージライブラリーを作製し た。 ライブラリーのタイ夕一は宿主として大腸菌 XL1 Blue MRFを用いて測定 した。 プライマリー λファージライブラリーのタイ夕一は 1. 0x 106 ρ f u/m 1であった。
宿主として大腸菌 XL1 Blue MRF'を用いてプライマリ一 λファージライブラ リーを 4° (：、 終夜増幅した。 シャーレ （直径 150画） 1枚あたり約 5x 10 4個のプラークを形成させ、 これに SMバッファ一 10mlを重層した。 回収 した S Mバッファーにジメチルスルホキシドを終濃度 7%となるよう加え、 一 80°Cで保存した。 増幅した λファ一ジライブラリーのタイ夕一は 1. 0 X 10 p f uZm 1以上であった。
フォスファトニン c DNAのクローニングは、 PCR法によって行なった。 上記で作製した O H O患者腫瘍由来の λファージライブラリ一を錶型とし、 プライマ一として、 c DNAライブラリ一に用いたホス卜ベクター、 pB l u e s c r i p t SK (+/-) のマルチクローニングサイトの 5'側にあ る配列番号 ·· 4の合成オリゴ DNAをフォワードプライマー、 Rowe P. S. N. の国際特許出願 国際公開公報 （W〇 99Z60017号） に記載 のフォスファトニン遺伝子配列の粹止コドンの 3'側にある配列番号： 5の合 成ォリゴ D N Aをリバースプライマ一として用いた。
5' -GGAAACAGCTATGACCATG- 3'
(配列番号： 4) 一 3'
(配列番号： 5)
PCR反応は、 TaKaRa Ex Taq (宝酒造 （株） ） を含む系で、 サ一マルサイクラ一 （GeneAmp PCR System, PEアプライドパイォシステムズ 社） を用いて 95°C， 3分を 1サイクル、 95°C, 45秒、 58°C， 45秒、 72°C, 3分を 30サイクル、 72°C， 5分を 1サイクル、 4°C放置の条件 で行なった。
得られた増幅断片を 1 %ァガロースゲル電気泳動に供しメインバンドを抽 出精製した後、 TOPO TA クロ一ニングキット （インビトロジェン社） を用いて pCR I I— TOPOベクター （インビトロジェン社） に揷入し、 大腸菌 TOP 10株に導入した。 ' 得られた形質転換菌からプラスミド DNAを抽出し、 ビッグダイ夕一ミネ —夕一サイクルシークェンスレディリアクションキット （PEアプライドバ ィォシステムズ社） を用いて PCR反応を行ない、 AB I PR I SM™ 377 DNAシーケンサ一 （PEアプライドバイオシステムズ社） により c DNA断片の塩基配列を決定した。
取得したクロ一ン # 1の保持するプラスミド DNAは、 R owe P. S. N. の国際特許出願国際公開公報 （W〇 99/60017号） に記載のフ ォスファトニンの Va l (1番目） から As p (430番目） をコードする 1290個の塩基配列と本質的に同一の塩基配列を含む 1713個の塩基配 列を有しており、 525個のアミノ酸からなるフォスファトニンタンパク質 をコードしていた。
クローン # 1の保持するプラスミド DN Aのインサート配列は R owe P. S. N. の国際特許出願 国際公開公報 C O 99/60017号） に 記載のフォスファト二ン遺伝子配列および同時に得られた他のクローンの保 持するプラスミド DNAのインサ一卜配列と数塩基異なっていた。 そこで真 のフォスファトニン遺伝子配列を確定するため、 増幅精度 i d e 1 i t y) のより高い P y r obe s t DNA p o 1 yme r a s eを用いて P CRを行った。 上記で作製した OHO患者腫瘍由来の λファージライブラリ ーを鐃型とし、 プライマ一として、 先のクローン Αにおける開始コドン AT Gの 5'側から始まる配列番号： 6の合成オリゴ DNAをフォワードプライマ 一、 配列番号： 5の合成オリゴ DNAをリバ一スプライマーとして用いた。
(配列番号： 6)
PCR反応はサ一マルサイクラ一 （GeneAmp PCR System, PEアプライドバ ィォシステムズ社） を用いて 98 ， 10秒、 56°C， 45秒、 72°C， 3 分を 30サイクル、 4 °C放置の条件で行なった。
得られた増幅断片を 1 %ァガロースゲル電気泳動に供しメインバンドを抽 出精製した後、 Ze r o B l un t PCRクローニングキット （インビ トロジェン社） を用いて pCR— B 1 un tベクタ一 （インビトロジェン社） に挿入し、 大腸菌 TOP 10株に導入した。
得られた形質転換菌からプラスミド DNAを抽出し、 ビッグダイタ一ミネ —夕一サイクルシークェンスレディリアクションキット （PEアプライドバ ィォシステムズ社） を用いて PCR反応を行ない、 AB I PR I SM™ 377 DNAシーケンサ一 （PEアプライドバイオシステムズ社） により c DN A断片の塩基配列を決定した。 こうして本発明のフォスファトニンタン パク質をコ一ドする D N Aを保持するプラスミド pCR— PHOSを含有す る形質転換体：ェシエリヒア コリ （Escherichiacoli)TOP 1 OZpCR -PHOS (クローン #9) を得た。
取得した TOP 1 OZp CR— PHOS (クロ一ン # 9 ) が保持するプラ. スミド DNAは配列番号： 2で表される 1575個の塩基配列を含む配列番 号： 3で表される 1662個の塩基配列を有しでおり、 配列番号： 1で表さ れる 525個のアミノ酸からなるフォスファトニンタンパク質をコードして いた （図 1〜4) 。 アミノ酸配列から推定される本発明のタンパク質のタン パク質部分 （シグナルペプチドを含む） の分子量は 58. 4 kD aであった。 配列番号： 3で表される塩基配列は R owe P. S. N. の国際特許出願 国際公開公報 （WO 99ノ 60017号） に記載のフォスファトニンの V a 1 (1番目） から As p (430番目） をコードする 1290個の塩基配 列と本質的に同一の塩基配列を含有し、 さらにその 5'領域に開始の Me tか ら成る 95個のアミノ酸配列をコードする新規の 285個の塩基配列を含有 していた。 配列番号： 3で表される塩基配列と R owe P. S. N. の国際 特許出願 国際公開公報（WO 99Z60017号） に記載のフォスファト ニンの塩基配列との共通配列の中で、 唯一 293番目の塩基が異なっており (Rowe P. S.N.公開公報： G1—配列番号： 3 ： C 293) 、 それに伴い配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列も 1残基異なっていた（Rowe P.S.N.公開公報： V a 1 配列番号： 1 ： L e u 96) 。
配列番号：' 1で表されるアミノ酸配列の疎水性度を K i t e Do o 1 i t t 1 e法により推定したところ、 Me tで始まる N末端領域は局所的に疎 水性が高いことが明らかとなり、 シグナル配列の存在が示唆された （図 5) 。 分泌タンパク質であるインタ一ロイキン- 2の N末端配列（A 1 a— P r o— Th r-) と同一の配列 （A l a17-Th r 19) が配列番号： 1にも存在す ることから、. Me t X-A 1 a 16がシグナル配列であると予想された。配列番 号： 1で表されるアミノ酸配列の Me t 1— A 1 a 16を除く領域は親水性が非 常に高く、 また膜貫通領域を含まないことから、 本発明のタンパク質が細胞 外に分泌されるタンパク質であることが予想された。 これはフォスファト二 ンが液性因子であることと合致する。
配列番号： 1で表されるアミノ酸配列のモチーフ解析を高速ホモロジー検 索ッ一ル 「Gapp e d BLAST」 を用いて行って見出されたモチーフ を表 1に示す。
[表 1]
Figure imgf000086_0001
配列番号： 1で表される本発明のタンパク質は As n 477— Th r 48Q、 A s n 478— Ar g481に糖鎖結合部位を、 S e r 256 -G 1 y 259にグリコサ ミノダリカン結合部位をそれぞれ有していた。 配列番号： 1で表される本発 明のタンパク質は細胞接着に関わる RGD配列 （Ar g 247— As p 249) を 有していた。 RGD配列はコラーゲン、 ビトロネクチン、 フイブリノ一ゲン、 フォンヴィルブランドファクターなどにもその存在が知られており、 本発明 のタンパク質においてもこの部位が細胞との相互作用に寄与していることが 予想された。
配列番号： 1で表される本発明のタンパク質はプロテインキナーゼ(3、 力 ゼインキナーゼ I I、 c AMP依存性プロテインキナ一ゼ、 チロシンキナー ゼによる数多くのリン酸化部位を有しており （表 1) 、 これらが本発明のタ ンパク質およびその部分ペプチドの生物活性においてなんらかの役割を果た していると考えられた。 また配列番号： 1で表される本発明のタンパク質は コラーゲン、 ビトロネクチン、 フィブロネクチン、 ォステオボンチン、 デン ティン-シァロフォスフォプロテイン （DSSP) などのリン酸化糖タンパク 質に特徴的なミリストイル化部位を数多く有していた （表 1) 。 本発明の夕 ンパク質の C末端領域にはァスパラギン酸およびセリンに富んだ配列 （A s p50 -S e r522 ; DSSESSDSGSSSES) が存在し、 DSSPに 繰り返し見られる配列、 例えば As p 686 -S e r 699； DS SDS SDS S SS SDSと 79%と高いホモロジ一を示した。 同様の配列がォステオボン チンにも存在しており （As p 101— As p 116； DDSHQSDESHHH SDESD) 、 これらのことから本発明のタンパク質と骨形成との関連が示 唆された。
フォスファトニンは PHEX遺伝子産物により切断されると考えられてい るが、 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列は亜鉛メタ口エンドべプチダー ゼの基質特異性に合致するアミノ酸配列 （A 1 a 327— S e r 333； ADAV DVS) を有していることから、 この部位 （Va 1330— As p331) が PH EX遺伝子産物により切断されることが予想された。 [実施例 2 ] 大腸菌での組換え型 Phosphatoninの発現
シグナル配列 (Met1- Ala16)を除いた成熟型 phosphatonin発現用プラスミド を構築し大腸菌発現を試みた。
まず成熟型 phosphatoninの 5，末端領域配列に Nde Iサイトと開始コドン ATG を付加したオリゴ DNAをフォワードプライマー （5' -
CATATGGCACCAACATTTCAACCACAGA-3'配列番号： 8) 、 終止コドンの 3，側の DNA 配列を有するオリゴ DNAをリバ一スプライマ一 （5'-
CTCTCGTCGACATCAACTCACA-3'配列番号： 9) として、動物細胞発現用プラスミ ド pCR— PHOS-9 (実施例 1) を铸型として pyrobest DM polymerase (宝酒造 （株） ） による PCR (98°CX45秒、 56°CX45秒、 72°CX3分、 30サ ィクル） を行った。 得られた PCR産物を 1%ァガロースゲル電気泳動で精製し、 pCR Blant vector (Invitrogen)とライゲーシヨン後 TOP10コンビテントセル に形質転換した。 コロニー PCRによって得られた陽性株 12株からプラスミド DNA(pCR-mPHOS)を調製し、 Sac I消化により逆方向にインサートの入った 3 株を選んだ。 これらはいずれも正しい DNA配列を有していた。 インサートの 5'側にあるホストベクターの Bam HIサイトを利用し、 これら 3種のプラスミ ド DNAを Nde I/BamHI消化し、 1%ァガロースゲル電気泳動に供してインサー トを精製した。 同様にして調製した pTCII (Nde I/BamHI)アームとこれらのィ ンサ一トとをライゲーションし、 IM109コンビテントセルに形質転換した。得 られた形質転換体（JM109/pTCII-mPHOS - 2)からプラスミド DMを調製し、 Nde I/BamHI消化によりインサートの存在を確認した。 pTCII- mPHOS- 2 (図 6) は 正しい成熟型 phosphatoninをコードする DNA配列を有していた。
次に、 pTCII- mPHOS- 2を T 7 RNAポリメラーゼ遺伝子（lacプロモ一ター 制御下）を有する発現用大腸菌株 (ΜΜ294ΦΕ3))コンピテントセルにトランス フエクトし、 大腸菌 MM294 (DE 3)/pTC II— mPHOS— 2を得た。 この形質転換株を、 1 O iigZmlのテトラサイクリンを含む LB培地 (1%ペプトン、 0. 5%酵母エキス、 0. 5%塩化ナトリウム） 1リット ルを仕込んだ 2リットル容フラスコ中で 37°C、 8時間振とう培養した。 得 られた培養液を 5 g Zm 1のテトラサイクリンを含む主発酵培地 （ 1. 6 8%リン酸一水素ナトリウム、 0. 3%リン酸二水素カリウム、 0. 1%塩 化アンモニゥム、 0. 05%塩化ナトリウム、 0. 05%硫酸マグネシウム、 0. 02 %消泡剤、 0. 00025 %硫酸第一鉄、 0. 0005 %塩酸チア ミン、 1. 5%ブドウ糖、 1. 5%カザミノ酸） 19リットルを仕込んだ 5 0リットル容発酵槽へ移植して、 37 で通気撹拌培養を開始した。 培養液 の濁度が約 500クレツト単位になつた時点で、 75 // M分のィソプロピル —]3— D—チォガラクトビラノシド （I PTG) を添加し、 さらに 3. 5時 間培養を続けた（1 530クレツト）。 最終的にこの培養液の遠心分離を行う ことにより、 約 300 gの湿菌体が得られ、 一 80°Cに凍結保存された。 なお本菌体における Phosphatoninの発現量は、 菌体抽出液を SDS-PAGEに 供し、 Phosphatoninが示す 60 Kdのバンドの染色度から、 約 15mg/g湿 菌体（300mg/L)と推測された。 また、 これらの菌体を 20 mM EDTA(pH6) および 20 raM Tris- HC1/8M Urea (pH8)中で順次超音波処理し成熟型
phosphatoninの発現形態を調べると、 全てが可溶性画分に存在していた。
[実施例 3] 組換え型 Phosphatoninの精製 '
実施例 2で得られた菌体 50 gに、 50mM 2 - (N—モルホリノ） エタ ンスルホン酸 （MES)/NaOH、 ImM p—アミジノフエニルメタンス ホニルライド塩酸塩 （APMSF塩酸塩） （pH6. 0) 2Lを加えて超音 波破砕機 （ソニファー 450) (ブランソン （株） ）を用いて 4°C、 10分間 の菌体破砕を 3回繰り返した後、 遠心分離 （8000 r pm、 30分間） を 行い、 上澄液を得た。 この上澄液を限外濾過膜（再生セルロース膜分画分子 量 1 OK (k dalton) 、 膜面積 0. lm2 X 2枚） （ザリトリウス （株） ） で濃縮、 5 OmM MESZNaOHに置換し、 遠心分離 （6000 r pm、 20分間） を行ない上澄液 1 00 OmLを得た。 本上澄液 50 OmLを 50 mM MES/NaOH (pH6. 0) で平衡化した S P—トヨパール 55 0 C (5 cm I D X 20 cmL、 40 OmL) (東ソ一 （株） ） に吸着さ せた後、 20mLZ分の流速で 0. 5M NaC l 5 OmM MES/Na OH (pH6. 0) で洗浄し、 0. 8M NaC l 5 OmM MES/Na OH (pH6. 0) で Phosphatoninを溶出させ.た。 本操作を上澄液半量ずつ 2回に分けて行った。溶出液を前述の限外濾過膜で濃縮し 5 OmM MESZ NaOH (pH6. 0)置換した後、続いて、 5 OmM MES/NaOH (p H6. 0) で平衡化した CM— 5 PW (21. 5 mm ID X 150mmL、 13 ^m) (東ソ一 （株） ） に吸着させた後、 0〜50%B (B=5 OmM MES/N OH (pH6. 0) 、 1. 5 M N a C 1 ) の段階勾配で 40分 間、 5m 1 /分の流速で溶出し、 Phosphatoninのフラクションをプールした。 本溶出液を限外濾過膜 （ビバスピン 20 分画分子量 1 OK (k dalton) ) (ザリトリウス （株)） で濃縮した。最後に PBSで平衡ィ匕した Sup e r d e x 200 (10mm I D X 30mmL、 10 m) (アマシャム ファ ルマシア（株））にアプライし、 0. 5mL/分の流速で溶出した。 Phosphatonin 溶出画分をプ一ルし標品約 3 Omgを得た。
このようにして得られた Phosphatonin標品の純度を測定する目的で、 S D Sポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。 本標品を 10 OmM DTT を添加した S am 1 e bu f f e r [Laemmli, Nature, 227, 680 (1979)] に懸濁し、 95 °Cで 1分間加熱した後、 マルチゲル 10/ 20 (第一化学薬 品） で電気泳動を行った。 泳動後のゲルをク一マシー ·プリリアント ·ブル ― (Coomassie brilliant blue) で染色した結果、 約 60Kdに単一バンド の蛋白が認められた。 このことから Phosphatoninの本標品は単一であり、 き わめて高純度の標品であることが分かった （図 7) 。
Phosphatoninの純度を測定する目的でギルソン H P L Cシステム （ギルソ ン （株） ） を用いイオン交換、 逆相 HPLCにより分析を行った。 イオン交 換 HP LCにおいては 5 OmM MES/NaOH (pH6. 0) で平衡化し た CM— 5 PW (7. 5mm ID X 75mmL、 10 urn) (東ソ一（株）） に Phosphatonin 30 gを注入し、 20〜70%B (B=5 OmM MES /NaOH (pH5. 8) 、 1. 5M NaC l) の段階勾配で 30分間、 0. 8m 1 /分の流速で溶出した。 逆相 HPLCにおいては 30%B (A=0. 1%トリフルォロ酢酸 （TFA) 、 B=80% ァセトニトリル Z0. 1 % TFA) で平衡化した C 4 P— 50 (4. 6mm ID X 250mmL、 5 im) (昭和電工（株） ） に Phosphatonin 15 gを注入し 10〜 50 % B の段階勾配で 40分間、 0. 5ml Z分の流速で溶出した。 検出は 280ナ ノメートルの波長で行い、 得られたデータはクロマトコーダ一 21 (システ ム インスツルメンッ （株） ） で波形処理を行い純度を計算した。 その結果、 P osph ioninは単一ピークを示し、このことから Phosphatoninの本標品は単 一であり、 きわめて高純度の標品であることが分かった （図 8) 。
得られた； Phosphatoninについて、 そのアミノ酸組成値をアミノ酸分析計
(日立 L一 850 OA) を用いて決定した。 結果を [表 2] に示す。
本標品の測定値は、 N末端に Me tが付加された Phosphatoninのアミノ酸 組成の理論値と一致した。
[表 2] アミノ酸 Phosphatoninの塩基配列 1モルあたりの残基数
より予想される値 '
A S X 74 70 4
Th r l 23 21 9
S e r x) 56 39 9
G 1 70 71 7
P r o 28 29 2
G 1 y 46 45 0
A 1 a 22 21 5
Cy s 2) N. D
Va 1 13 13. 2
Me t 7 7 4
I 1 e 25 23
Leu 21 21
Ty r 12 12 0
P h e 13 12 1
L y s 50 48. 1 H i s 18 17 8
T r p 1 0. 6
A r g 29 25. 5 酸加水分解 （6 N HC 1— 4%チォグリコール酸、 1 10°C、 24及び 4 8時間加水分解の平均値）
1) 0時間に外挿した値
2) 未検出
約 10 gを用いて分析を行つた。
N末端アミノ酸配列を気相プロテインシーケンサ一 （アプライドバイオシ ステムモデル 492) を用いて決定した。 その結果、 得られた Phosphatonin の N末端には Me t付加体と付加していないものの混合物である他は塩基配 列から推定された Phosphatoninの N末端アミノ酸配列と一致した（図 9)。 実施例 1に示されるように Phosphatoninはリン酸化修飾を受けやすいモ チーフを有しているので、カゼイン キナ一ゼ IIによるリン酸化を行った。 前述の精製 Phosphatonin 7. 5mgを 20mM N— 2—ヒドロキシェチル ピぺラジン一 N '一 2—エタンスルホン酸 (HEPES) XNaOH 1 5m M NaC l 1 5mM MgC 12 0. 3mM ATP pH7. 5で希釈した 後、 37 °Cの恒温水槽で 5分間予備加温した後カゼイン キナーゼ II (CAL B I OCHEM (株） ） を 47mU添加し、 37°Cで 60分間皮応させた。 反応終了後氷冷し、 限外濾過膜 （ビバスピン 20 分画分子量 1 OK (k dalton) ) (ザリトリウス （株)） で濃縮した。 濃縮液を P B 3で平衡化した S u p e r d e X 200 ( 10 mm I D X 30mmL、 13 m) (アマ シャム フアルマシア (株) ) にアプライし、 0. 5 mL/分の流速で溶出し、 Phosphatonin溶出画分をプールした。
リン酸化 Phosphatoninを確認する目的で、前述の S D Sポリアクリルアミ ドゲリレ電気泳動を行った （マルチゲル 12. 5 (第一化学薬品） ） 泳動後の ゲルをクーマシー ·ブリリアント ·ブルー （Coomassie brilliant blue) で 染色した結果、 反応の前後で分子量の変化が認められ、 このことから Phosphatoninはリン酸化されていることが明らかになった (図 10) 。 [実施例 4 ] ポリクローナル抗体の作製
実施例 3で得られた Phosphatoninをフロイント完全アジュバントもしく は不完全アジュバントを用いェマルジヨン化し Kb 1 ： JW系の兎に 2週間 毎に lmgずつ皮下注射により免疫し 10週間飼育した。 10週目に頸動脈 より全血液を回収し、遠心分離により抗血清約 70 mLを得たのち防腐剤（ 0. 05%アジ化ナトリウム） を添加し 4 °Cに保存した。
抗血清から抗体を精製するに先立ち NHS— H i t r a (ImL 10 ) (アマシャム フアルマシア（株））に実施例 3で精製した Phosphatonin 3 mgをカップリングし Phosphatonin NHS Hi trap抗原カラムを作成した。 カップリング収率は 95%であった。
前述の抗血清 6mLを MAP S I I パインデイング バッファ一 （日本 バイオラッド （株） ） で 2倍に希釈し、 あらかじめ同バッファ一で平衡化し たプロテイン A S e p a r o s e FF (16 mm I D X 5 OmmL, 50 zm 1 OmL) (アマシャム フアルマシア （株） ） に吸着させ、 プ 口ティン A MAP S I Iバインディング バッファ一で洗浄した後にプロ ティン A MAPS I I エリュ一シヨン バッファー （日本バイオラッド (株） ） にて I gG画分を溶出した。 得られた画分は 1M Tr i s/HC 1 (pH8. 0) を用いて中和した後、 PBSで 4°C一夜透析した。 透析液 を 0. 1M Tr i sZHC l (ρΗ8. 0 )で平衡化した Phosphatonin NHS Hitrap抗原カラム （ImL) に吸着させた後同バッファ一で洗浄しのち、 0. 5M Na C 1 0. lM Tr i s/HC l (pH8. 0) で非吸着画分を、 0. 5M NaC 1 0. 1M酢酸緩衝液 （pH4. 5) で低力価の抗体を除 去した後 0. 5 M NaC 1 0. 1M G l yc i ne/HC l (pH2. 7) で高力価の抗体を溶出し、溶出画分はすぐに 1M Tr i s/HC 1で中和し た。溶出画分を集め PB Sで透析して抗 Phosphatonin抗体 16mgを精製し た。 [実施例 5] EL I S A系の設定
実施例 4で得られた抗体を用いて EL I S A系の設定を行った。 本 EL I S A系はサンドイツチ法で行なつた。 .系の設定に先立ち実施例 4で得られた 抗体 3mgを用いピオチン化抗体を EZ— L i nk S u 1 f o— NHS— LC ピオチレ一シヨンキット （ピアス （株） ） .を用いて調製した。 2. 7 m gのピオチン化抗体が得られビォチン付加量は抗体 1分子についてビォチ ン 7. 5個であった。
EL I S Aは 96穴マイクロウェルプレート (マキシソープ'ヌンク (株) ) を用いて行った。初めに実施例 4で得られた抗 Phosphatonin抗体を 5 OmM 炭酸ナトリウム緩衝液 （pH 9. 6) に 5 gZmLの濃度になるように希 釈し各ゥエルに 100 添加し 4°Cで一夜放置し吸着させた。 次に 10m M リン酸緩衝液 ImM EDTA 0. 05% (V/V) の Twe e n 20 (pH7. 4)の洗浄液で 200 ゥエルで 4回洗浄し、 プロック液 （2
5%プロックエース (大日本製薬） を PBSで希釈) 100 ^LZゥエルを 加え室温 2時間放置した。 次に前述の洗浄操作を行い、 10%ブロックエー ス— PBS 0. 1 % (V/V) Twe en 20で希釈した組換え型
Phosphatonin CHO細胞培養上清 （実施例 7に記載） ゃヒト血清などの試料 液や実施例 2で示した大腸菌調製 Phosphatoninを 0. 25〜2ng/mLの 濃度に希釈した標準液を 100 LZゥエル添加した後室温で 2時間プレー ト上の抗体に結合させた。 前述の洗浄操作の後 10%ブロックエース一 PB S O. 1 % (V/V) Twe en 20で 3 gZmLの濃度に希釈したビ ォチン化抗 Phosphatonin抗体を 100 L/ゥエル添加した後室温で 1時 間結合させた。 前述の洗浄操作の後 PBS 0. 1 % (VZV) Twe en 20で0. 5〃gZmLの濃度に希釈したホースラデイシュ ペルォキシダ —ゼ標識ストレプトアビジン （ピアス （株） ） を 100 Lノウエル添加し 室温で 30分間放置した。 前述の洗浄操作の後 TMB (日本バイオラッド (株） ) を添加し十分な発色が得られるまで放置し、 100 ゥェルの 1N硫酸を添加し反応を停止した後 450 nmの吸光度を測定した。 検出限 界は 0. I ngZmL、測定範囲は 0. 1〜 3 n g/mLであった'（図 11 )。 特に高濃度の C H O細胞発現細胞細胞上清測定時は検出範囲の広い系が必要 であり、 上記記載の実施例の酵素として 2 gZmLのアルカリホスファタ ーゼー標識ストレレブトアビジン （ピアス （株） ） を用い、 基質を B l u e Pho s (KPL (株） ） を用いた。 この時検出限界は 0. 5 n gZmL、 測定範囲は 0. 5〜30 n gZmLの範囲であった。
本測定系を用いてヒト血清中の定量を行った。 各血清を前述の 10 %ブロ ックエース一 PBS 0. 1 % (V/V) Twe e n 20で 20倍に希釈し た後、 EL I SA系に供した。 OHO患者と健康な成人との比較を行ったが、 OHO患者では健康な成人より高値を示し、 腫瘍を切除すると約 2割程数値 が減少していた （図 12) 。 これより Phosphatonin測定 EL I S A系は腫瘍 性低リン酸血症の診断薬として非常に有用であることが示された。
\
[実施例 6 ] CHO細胞株での組換え型 Phosphatoninの分泌発現 phosphatonin全長 cDNAを含有するプラスミド (pCR-PHOS-9) を铸型に、 開 始コドンを含むフォワードプライマー （5' -
CTCAAAGATGCGAGTTTTCTGTGTGGGA-3 ' 配列番号： 6) と終止コドンの前に FLAG 配列をコードする遺伝子を揷入したリバースプライマ一 （ 5' - CTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGTCACCATCGCTCTCACTTGA-3' 配列番号： 10) 'とを用いて Pyrobest DNA polymerase (宝酒造）による PCR反応 (98°CX45秒、 56°CX45秒、 72°CX3分、 30サイクル） を行った。 PCR産物を 1%ァガロース ゲル電気泳動に供し、 目的サイズのバンドをゲルから抽出、 精製した。 この PCR産物に 3' 末端にアデニンを付加した後、 pTARGET™ Vector (Promega社） とライゲ一ションし、 これを JM 109コンビテントセルに形質転換した。 コロ ニー PCRにより得られた陽性株 2株からプラスミド DNAを取得し、 Sac I (宝 酒造） 消化によるインサートチェックおよび DNA配列分析を行って、 順方向 に正しいインサートの入ったプラスミド（pT- PH0SF- 11)を得た （図 13) 。 phohsphatonin- FLAG発現プラスミド （pT- PH0SF- 11) を制限酵素 Ahdl (Biolabs社） で 1個所切断後、 エレクト口ポレーシヨン法を用いて CH0-K1 細胞に導入した (lxl07Cells、 Plasmid 10ug/800ul PBS, 0, 4cmCuvet te、 960uF-0.25kV(BIO-RAD ¾；)) 。 10 mLのハム F12- 10%FCS培地（Gibco BRL社) でー晚培養した後、 ジエネティシン（Gibco BRL¾) 550ug/mlを含むハム F12 - 10%FCS培地で限外希釈によるクロ一ニングを行った。 各クローンの培養上清 を実施例 5に示した ELISA系を用いて選択することにより高安定発現株 (CHO- PH0SF- 11- 34- 24)を取得した。
[実施例 7] CHO組換え型 Hiosphat0ninの精製
CH0細胞組換え型 Phosphatoninの精製は抗 Phosphatonin抗体カラムを用い て行つた。抗 Phosphatonin抗体（実施例 4 ) 50 mg を HiTrap-NHSカラム（5 mL, Amars am Pharmasia社）に力ップリングすることにより抗 Phosphatonin抗体 カラムを作製した。 高安定発現株 (CH0- PH0SF-11-34-24)培養上清 3 Lを 50 mM Tris-HCl ( H 8.0) で平衡化した抗 Phosphatonin抗体カラムに吸着さ せた後、 4mLZ分の流速で 0.5 M NaCl, Tris-HCl (pH 8) で洗浄し、 0.5 M NaCl, 0.1 M glycin (pH 3.0) で Phosphatoninを溶出させ、 1M Tris-HCl
(pH 8.0) で中和した。 溶出液を限外濾過膜 （ビバスピン 20 分画分子量 1 OK (kdalton) ) (ザリトリウス （株)） で濃縮後、 PBSにバッファ一 置換し、 標品とした （2.2 mg) 。 実施例 3と同様に SDSポリアクリルアミ ドゲル電気泳動を行った結果、 約 6 OKdおよび糖鎖付加体と考えられる高 分子量の位置にバンドが認められた （図 14) 。
[実施例 8 ] 組換え型 Phosphatoninの活性測定
CH0細胞組換え型 Phosphatoninの腎におけるリン再吸収阻害活性は正常ヒ ト近位尿細管上皮細胞 （RPTEC，
Figure imgf000096_0001
を用いて行った。 RPTECを 24穴プレート (2xl04/well) で REGM (BioWhi Uaker社）を用いて 37°C、 5¾ C02 で 3日間培養した後、 培地を 0.1% BSA を含む RBGM (BioWhit taker社）に置換 し、 37°C、 5% C02でー晚培養した。 0.1% BSA を含む RBGMで希釈した C H〇 組換え型 Phosphatonin (最終濃度 1 g /mL) をゥエルに添加し、 37°C, 5¾ C02 で 2時間反応させた後、 培地を除去し洗浄バッファ一 （10mM Tris - HEPES(pH7.4), 137 mM NaCl, 2.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2， 5.4 mM KC1) 1 mL で洗浄した。取り込みバッファー (10mMTris-HEPES(pH7.4)', 137mMNaCI, 0.1 mM KH2 32P04(0.5mCi/raL), 2.8 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, 5.4mM Cl) を 0.25mL 添加し 37°C， 5分間インキュベートした後、取り込みバッファーを除去し、氷 冷した停止バッファー (14mM Tris-HEPES(pH7.4), 137 mM NaCl) l mLで 3 回洗浄した。 0.5 NNaOH 0.5 inLで細胞を可溶化し （タンパク濃度測定用とし て 10 mL を保存） 、 液体シンチレ一シヨン A液 3虬と混合後、 液体シンチ レ一シヨンカウンタ一により放射活性を測定した。 タンパク濃度は BCA Protein Assay Reagent (PIERCE社）を用いた。 図 15に示すように CHO細 胞組換え型 Pfiosphatoninは RPTECにおけるリン酸の細胞内取り込みを阻害し た。 '' 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩は、 リン利尿活 性、 低リン血症誘導活性、 腎臓細胞における Na+- 輸送阻害活性、 25-ヒド ロ^シビタミン D 3-l α-ヒドロキシラーゼ阻害活性、 25 -ヒドロキシビタミ ン D 3- 2'4-ヒドロキシラ一ゼ促進活性などの作用を有している。したがって、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩、 および本発明の DNAは、 例えば、 高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性腎症、 腎不全などの疾病の予防 ·治療剤などとし て有用である。
また、 .本発明の DNAは、 例えば腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0Η0) 、 家族 性低リン血症性ビタミン D抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低 リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病
(HHRH) 、 ビタミン D抵抗性くる病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常 症、 二次性副甲状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎 尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎不全高リン血 症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性 腎症、 腎不全などの疾患の遺伝子診断剤として有用である。
本発明のタンパク質、その部分ペプチドまたはそれらの塩に対する抗体は、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩を特異的に認識す ることができるので、 被検液中の本発明のタンパク質の定量、 特にサンドィ ツチ免疫測定法による定量などに使用することができる。 また、 本発明の夕 ンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩の活性を中和することができ る抗体は、 例えば腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症性ビ 夕ミン D抵抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性くる病 (ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン D 抵抗性くる病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機 能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎不全高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症 候群、心不全、脳卒中、慢性糸球体腎炎、糖尿病性腎症、 腎不全などの予防 · 治療剤などとして使用することができる。
さらに、 本発明のタンパク質、 その部分ペプチドまたはそれらの塩は、 レ セプターァゴニスト Zアンタゴニスト， プロティナ一ゼ阻害作用を有する化 合物またはレセプター結合後の細胞内シグナル伝達を促進もしくは阻害する 化合物をスクリーニングするための試薬として有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のァ ミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する夕ンパク 質またはその塩。
2 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の 1 7番目から 5 2 5番目のァ ミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩。
3 . 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を含有するタンパク質またはその塩である請求項 1記載のタン パク質またはその塩。
4. 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を含有するタンパク質またはそ の塩である請求項 3記載のタンパク質またはその塩。
5 . リン利尿活性およびノまたは低リン血症誘導活性を有するタンパク質で ある請求項 1〜4記載のタンパク質またはその塩。
6 . ①腎におけるナトリゥム依存性リン (Na+-P i)輸送活性を抑制する活性、
②腎における 25-ヒドロキシビタミン D3- 1 ひ-ヒドロキシラーゼ活性を抑制す る活性および③腎における 25-ヒドロキシビタミン D3- 24-ヒドロキシラ一ゼ 活性を促進する活性から選ばれる少なくとも一つの活性を有するタンパク質 である請求項 1〜 4記載のタンパク質。
7 . 請求項 1記載のタンパク質の部分ペプチドまたはその塩。
8 . ,請求項 1記載のタンパク質または請求項 7記載の部分べプチドをコ一ド する塩基配列を有する D NAを含有する D NA。
9 . 配列番号： 2または配列番号： 3で表わされる塩基配列を有する請求項 8記載の D NA。
1 0 . 請求項 8記載の D NAを含有する組換えべクタ一。
1 1 . 請求項 1 0記載の組換えべクタ一を保持する形質転換体。
1 2 . 請求項 1 1記載の形質転換体を培養し、 請求項 1記載のタンパク質ま たは請求項 7記載の部分ペプチドを生成、 蓄積せしめ、 これを採取すること を特徴とする請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分べプチ ドまたはその塩の製造方法。
1 3 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまた はその塩を含有してなる医薬。
1 4. 請求項 8記載の D NAを含有してなる医薬。
1 5 . 血中リン濃度の異常を調節、 改善し得る請求項 1 3または 1 4記載の
1 6 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまた はその塩に対する抗体。
1 7 . 請求項.1 6記載の抗体を用いることを特徴とする請求項 1記載のタン パク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩の定量方法。
1 8 . 請求項 1 7記載の定量方法を用いることを特徴とする請求項 1記載の タンパク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩が関与する疾 患の診断方法。
1 9 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とするレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニ ストのスクリーニシグ方法。
2 0 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまた はその塩を含有するレセプタ一ァゴニストまたはアンタゴニストのスクリー ニング用キット。
2 1 . 請求項 1 9記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリ —ニング用キットを用いて得られるレセプ夕一ァゴニストまたはアン夕ゴニ ス卜。
2 2 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまた はその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質または請求項 7記載の部分べプチドを分解するプロティナ一ゼを阻害する作用を有する化 合物またはその塩のスクリ一ニング方法。
2 3 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまた はその塩を含有する請求項 1記載の夕ンパク質または請求項 7記載の部分べ プチドを分解するプロティナーゼを阻害する作用を有する化合物またはその 塩のスクリーニング用キット。
2 4. 請求項 2 2記載のスクリーニング方法または請求項 2 3記載のスクリ 一二ング用キッ卜を用いて得られる請求項 1記載のタンパク質または請求項 7記載の部分べプチドを分解するプロティナーゼを阻害する作用を有する化 合物またはその塩。
2 5 . ( i ) レセプ夕一またはその部分ペプチドに、 請求項 1記載のタンパ ク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩を接触させた場合と、 (i i) レセプタ一またはその部分ペプチドに、 請求項 1記載のタンパク質も しくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩および試験ィヒ合物を接蝕さ せた場合において、 該レセプ夕一またはその部分ペプチド 請求項 1記載の 夕ンパク質、 もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩との結合量 を測定し、比較することを特徴とする請求項 1 9記載のスクリーニング方法。
2 6 . ( i ) レセプタ一を含有する細胞またはその細胞膜画分に、 請求項 1 記載の夕ンパク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩を接触 させた場合と、 （i i) レセプターを含有する細胞またはその細胞膜画分に、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその 塩および試験化合物を接触させた場合において、 該レセプ夕一を含有する細 胞またはその細胞膜画分と請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載 の部分べプチドまたはその塩との結合量を測定し、 比較することを特徴とす る請求項 1 9記載のスクリーニング方法。
2 7 . ( i ) レセプ夕一を含有する細胞に、 請求項 1記載のタンパク質もし くは請求項 7記載の部分ペプチドまたはその塩を接触させた場合と、 （i i) レセプ夕一を含有する細胞に、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7 記載の部分ペプチドまたはその塩および試験ィヒ合物を接触させた場合におい て、該レセプタ一を含有する細胞におけるレセプターを介する細胞刺激活性、 Na+-Pi輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3-1 α-ヒドロキシラーゼ活性ま たは 25-ヒドロキシビタミン D 3- 24-ヒドロキシラーゼ活性を測定して、 比較 することを特徴とする請求項 1 9記載のスクリーニング方法。
2 8 . 請求項 1 9、 Μ求項 2 5、 請求項 2 6または請求項 2 7のいずれかに 記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリーニング用キット を用いて得られるレセプターァゴニストを含有してなる医薬。
2 9 . 高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体 腎炎、 糖尿病性腎症または腎不全の予防 ·治療剤である請求項 2 8記載の医
3 0 . 請求項 1 9、 請求項 2 5、 請求項 2 6または請求項 2 7のいずれかに 記載のスクリーニング方法または請求項 2 0記載のスクリーニング用キット を用いて得られるレセプタ一アン夕ゴニストを含有してなる医薬。
3 1 . 腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン！)抵 抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン D抵抗性く る病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線 維症、 嚢胞性線維性骨炎または腎不全の予防 ·治療剤である請求項 3 0記載 の医薬。
3 2 . ( i ) 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分べプチ ドまたはその塩を分解するプロティナーゼの存在下で請求項 1記載の夕ンパ ク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩とレセプターを含有 する細胞とを接触させた場合と、 （i i) 請求項 1記載のタンパク質もしくは 請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩を分解するプロティナーゼおよび 試験化合物の存在下で請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部 分ペプチドまたはその塩をレセプ夕一を含有する細胞とを接触させた場合に おいて、 該レセプタ一を含有する細胞におけるレセプターを介する細胞刺激 活性、 Na+-Pi輸送活性、 25-ヒドロキシビタミン D 3- 1 ひ-ヒドロキシラ一ゼ 活性または 25-ヒドロキシビタミン D 3- 24 -ヒドロキシラ一ゼ活性を測定して、 比較することを特徴とする請求項 2 2記載のスクリ一二ング方法。
3 3 . 請求項 2 2もしくは請求項 3 2記載のスクリーニング方法または請求 項 2 3記載のスクリーニング用キットを用いて得られる請求項 1記載のタン パク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドを分解するプロティナ一ゼを阻 害する作用を有する化合物またはその塩を含有してなる医薬。
3 4. 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7項記載の部分ペプチドま たはその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載のタンパク質もしくは請 求項 7記載の部分べプチドまたはその塩とレセプ夕一との結合後の細胞内シ グナル伝達を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
3 5 . ( i ) レセプ夕一を含有する細胞に、 請求項 1記載のタンパク質もし くは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩を接触させた場合と、 （ i i ) レセプターを含有する細胞に、 請求項 1記載の夕ンパク質もしくは請求項 7 記載の部分ペプチドまたはその塩および試験化合物を接触させた場合におい て、 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまたは その塩とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を測定し、 比較するこ とを特徴とする請求項 3 4記載のスクリ一二ング方法。
3 6 . 請求項 1記載のタンパク質もしくは請求項 7記載の部分ペプチドまた はその塩を含有する請求項 1記載の夕ンパク質もしくは請求項 7記載の部分 ペプチドまたはその塩とレセプターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
3 7 . 請求項 3 4または請求項 3 5のいずれかに記載のスクリーニング方法 または請求項 3 6記載のスクリーニング用キットを用いて得られる請求項 1 記載の夕ンパク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩とレセ プターとの結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物または その塩。
3 8 . 請求項 3 または請求項 3 5のいずれかに記載のスクリ一エング方法 または請求項 3 6記載のスクリーニング用キットを用いて得られる請求項 1 記載の夕ンパク質もしくは請求項 7記載の部分べプチドまたはその塩とレセ プ夕一との結合後の細胞内シグナル伝達を促進または阻害する化合物または その塩を含有してなる医薬。 '
3 9 . 腫瘍性低リン血性骨軟化症 （0H0) 、 家族性低リン血症性ビタミン D抵 抗性くる病 （XLH) 、 常染色体優性遺伝を示す低リン血症性くる病 （ADHR) 、 高カルシウム尿症を伴う低リン血症性くる病 （HHRH) 、 ビタミン D抵抗性く る病、 骨軟化症、 骨粗鬆症、 腎性骨形成異常症、 二次性副甲状腺機能亢進症、 パジェット病、 腎ファンコ一二症候群、 腎尿細管性アシドーシス、 嚢胞性線 維症、 嚢胞性線維性骨炎、 腎不全、 高リン血症、 動脈硬化、 急性冠症候群、 心不全、 脳卒中、 慢性糸球体腎炎、 糖尿病性腎症または腎不全の予防 ·治療 剤である請求項 3 8記載の医薬。
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