WO2001098341A1 - Nouveau polypeptide et son adn - Google Patents

Nouveau polypeptide et son adn Download PDF

Info

Publication number
WO2001098341A1
WO2001098341A1 PCT/JP2001/005258 JP0105258W WO0198341A1 WO 2001098341 A1 WO2001098341 A1 WO 2001098341A1 JP 0105258 W JP0105258 W JP 0105258W WO 0198341 A1 WO0198341 A1 WO 0198341A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polypeptide
salt
ester
amide
present
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/005258
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shunbun Kita
Yoshio Taniyama
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Takeda Chemical Industries, Ltd. filed Critical Takeda Chemical Industries, Ltd.
Priority to AU2001274563A priority Critical patent/AU2001274563A1/en
Priority to EP01941118A priority patent/EP1293510A4/en
Priority to US10/297,895 priority patent/US6992171B2/en
Publication of WO2001098341A1 publication Critical patent/WO2001098341A1/ja
Priority to US11/189,301 priority patent/US20050261192A1/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
    • C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a partial peptide of cupirin and its function.
  • HD L-cholesterol cholesterol contained in HD L (high-density lipoprotein), hereafter sometimes abbreviated as HD L-C
  • HD L-C high-density lipoprotein
  • apolipoprotein A- which is the main extractor, is used. It is clear from recent studies on transgenic mice and others that increasing the I (apo A-I (hereinafter sometimes referred to as apo A-1)) is a necessary technology. Is coming.
  • apo A-1 is present in plasma as a complex with HDL as phospholipids, cholesterol, cholesterol esters, etc., and these are mainly catabolized and metabolized in the liver, but in hypertriglyceridemia, triglyceride, etc. (Hereinafter sometimes referred to as TG)
  • TG hypertriglyceridemia, triglyceride, etc.
  • the increased content of HDL is converted to smaller, ap0A-1 particles by the action of various ipases, which are mainly catabolized by the kidney It is known.
  • Catabolic metabolism in the kidney is established by small particles apo A-1 that have passed through tubular filtration undergo reabsorption and subsequent degradation in the proximal tubule.
  • LRP LDL receptor-related protein
  • the binding of apo A-1 and cupirin may be important findings for the development of therapeutics for hypo-HD Lemia, which is a problem in hyperTG, etc., and for the development of fundamental therapies for arteriosclerosis. Limiting the apoA-1 binding domain in the cubin molecule for drug development of the above is extremely useful, for example, in the development of an anti-cupilin apo AI binding site antibody and in the search for low molecular weight compounds.
  • the finding that the apo A-I binding site is localized within the cubin molecule is extremely important in considering clinical applications, and its identification has been awaited.
  • the administration of a substance that inhibits the binding of apo AI to the partial fragment of cupirin increases the concentration of apo A-1 in the blood, raises the concentration of HDL, and increases the efficacy of drugs for treating atherosclerosis. It has been awaited for the treatment of TGemia, hypercholesterolemia and atherosclerotic disease. Disclosure of the invention
  • a medicine comprising a compound obtained by a screening method.
  • Restricting the apo A-1 binding site in the cupillin molecule is characterized by inhibiting the binding of the apo A-1 binding fragment of cupirin itself, the antibody thereto, or also the apo A-I It leads to clinical application of low molecular compounds.
  • the present inventors have found apoA-1 binding activity in the cubulin CUB7-CUB14 fragment peptide (Blood 91, 3593-3600 (1998)) and the CUB9-CUB14 fragment peptide. Was.
  • the present invention (1) a polypeptide which is a partial fragment of cupillin, which has the ability to bind to apolipoprotein A-I, an amide thereof, or an ester thereof, or a salt thereof;
  • polypeptide according to the above (1) wherein the polypeptide has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, and the amide thereof. , Or its ester or its salt
  • polypeptide according to (1) above wherein the polypeptide has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, an amide thereof, or an ester thereof or a salt thereof; (4) the polypeptide is represented by SEQ ID NO: 19
  • polypeptide according to the above (1) wherein the polypeptide has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19, an amide thereof, or an ester thereof, or a salt thereof.
  • a medicament comprising the polypeptide according to (1), an amide thereof, or an ester thereof, or a salt thereof,
  • hypoapolipoprotein A—Iemia or neuropathy comprising the polypeptide according to (1), its amide, or its ester or its salt
  • polypeptide according to (1), its amide, or its ester, or its ester obtained by using the screening method according to (13) or the screening kit according to (14) above for a mammal.
  • a compound that promotes the activity of a salt or a method of preventing or treating renal disorder, nephritis, nephropathy, urinary protein disease, neuropathy or vitamin B12 deficiency comprising a compound or a salt thereof;
  • Diabetes obesity, arteriosclerosis, high fat, which comprises administering to a mammal an effective amount of the polypeptide according to (1), an amide thereof, or an ester or a salt thereof.
  • SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19 An amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19 is represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19, respectively.
  • About 50% or more preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • An amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19 is represented by 1 or 2 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19, respectively.
  • the present invention provides the polypeptide according to the above (2) or (4), which is an amino acid sequence substituted with another amino acid, or an amino acid sequence obtained by combining them, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof. .
  • DNA and polypeptide of the present invention can be used for basic research such as molecular weight markers, tissue markers, chromosome mapping, identification of genetic diseases, design of primers and probes, etc.
  • Figure 1 shows the amino acid sequence of the mature human cubilin protein (continued from Figure 2)
  • Figure 2 shows the amino acid sequence of the mature human cupilin protein (continued from Figure 1).
  • FIG. 3 shows the results of Western plotting performed in Example 2.
  • lane C shows COS 7 cells transfected with pSecTag2
  • lanes I and II show cDNAs encoding human cubin fragment I and II, respectively, in pSecTag2.
  • Expression vector Lane III shows the culture supernatant of COS 7 cells transfected with pTB2116
  • Lanes IV and V show the cDNAs encoding partial fragments IV and V of human cubilin, respectively.
  • 1 shows COS 7 cells transfected with an expression vector integrated into COS7.
  • intracellular indicates a crushed product of each cell
  • culture supernatant indicates a PVDF membrane blotted from a gel obtained by electrophoresing the culture supernatant of each cell.
  • FIG. 4 shows the results of Western plotting performed in Example 3.
  • lanes I to V show the culture supernatant containing partial fragments I to V
  • lane M shows the molecular weight marker.
  • Elution indicates the EDTA selective elution fraction
  • Pass indicates the PVDF membrane plotted from the gel obtained by electrophoresing the unbound fraction.
  • FIG. 5 shows the results of Western plotting performed in Examples 4 and 5.
  • the left end of each blot shows the migration of the molecular weight marker.
  • Mock, Cub7-12, Cub9-14, Cub7-14, and Cubl3-20 indicate vectors transfected into COS7 cells, respectively, Mock encodes only the vector, and Cub7-12 encodes the CUB7-CUB12 fragment peptide.
  • a vector expressing cDNA, Cub9-14 encodes a fragment peptide of CUB9-CUB14.
  • a vector expressing cDNA, and Cub7-14 corresponds to fragment III of Example 3.
  • Cubl3-20 correspond to fragment IV in Example 3.
  • FIG. 7 shows the binding curve of the biotinylated human polyprotein A-I performed in Example 7.
  • FIU indicates a measured value quantified by a fluorescence measuring device.
  • polypeptide of the present invention which is a partial fragment of kubilin (hereinafter, may be referred to as the polypeptide of the present invention) having the ability to bind to the apolipoprotein (protein) A-I, is a human warm blood.
  • Animal eg, guinea pig, rat, mouse, chick, egret, bush, higgin, horse, monkey, etc.
  • cells eg, liver cells, spleen cells, nerve cells, glial cells, knee iS cells, bone marrow
  • Cells mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, epithelial cells, endothelial cells, fibroblasts, fiber cells, muscle cells, adipocytes, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells , Neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovial cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, mammary cells, Or stromal cells, or precursors of these cells, stem cells or cancer cells, etc.) or any tissue in which these cells are present, such as the brain, various parts of the brain (eg, olfactory
  • polypeptide of the present invention when the polypeptide of the present invention has a signal peptide, the polypeptide can be efficiently secreted extracellularly.
  • the partial fragment of cubin having the ability to bind to apolipoprotein A-I is a partial peptide of cupilin, and may be any partial peptide as long as it has the ability to bind to apolipoprotein A-I.
  • a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 Is preferred.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 is about 50% or more, preferably about 60%, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10. % Or more, more preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • the amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 includes about 50% or more, preferably about 60% or more, of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19,
  • the amino acid sequence preferably has about 70% or more, more preferably about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more homology.
  • polypeptide having an amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 of the present invention include, for example, substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 described above. And a polypeptide having substantially the same properties as a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • polypeptide of the present invention having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 include, for example, substantially the same amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 described above. And a polypeptide having substantially the same properties as the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19.
  • Substantially the same properties include, for example, binding to apolipoprotein AI. Substantially the same means that those properties are qualitatively the same. Therefore, the properties such as binding ability to apolipoprotein A-I are the same (eg, about 0.1 to 100 times, preferably about 0.5 to 10 times, more preferably 0.5 to 2 times). Although it is preferable, the degree of this property and the quantitative factors such as the molecular weight of the polypeptide may be different.
  • amino acid sequence having amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or 1 or more (preferably about 1 to 30 amino acids, preferably An amino acid sequence into which about 1 to 10 amino acids have been inserted, more preferably about 1 to 5 amino acids, and 1 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19 Or amino in which two or more (preferably about 1 to 30, preferably about 1 to 10, and more preferably about 1 to 5) amino acids are substituted with another amino acid So-called peptides such as polypeptides containing an amino acid sequence or a combination thereof Emissions are also included.
  • amino acid sequence has been inserted, deleted or substituted as described above,
  • the position of the deletion or substitution is not particularly limited, and examples include positions not essential for apoA-I binding in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 19.
  • polypeptide has a N-terminus at the left end (amino terminus) and a C-terminus at the right end (capillary terminus) according to the convention of peptide notation.
  • Polypeptides of the present invention including polypeptides containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, have a C-terminus with a normal lipoxyl group (1-CO OH) or a carboxylate (—COO—)
  • the C-terminal may be an amide (—CONH 2 ) or an ester (one COOR).
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl or n _ heptyl, for example, Shikuropen chill, C 3 of cyclohexyl etc. cyclohexane - 8 cycloalkyl group, for example, phenyl, ⁇ - naphthyl C 2 Ariru groups such, for example, benzyl, phenyl, such as phenethyl - C i _ 2 alkyl or a- naphthylmethyl, etc. ⁇ - Nafuchiru C ⁇ 2 C 7 _ 1 4 Ararukiru group such as an alkyl group In addition, a pivaloyloxymethyl group commonly used as an oral ester is used.
  • the lipoxyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester and the like are used.
  • polypeptides of the present invention amino acid residues (e.g., Mechionin residues) of N-terminal Amino group protecting groups (e.g., formyl group, such as Asechiru groups such as ( ⁇ _ 6 Al force Noiru C 6 Protected by N-terminal glutamine), N-terminal glutamine residue generated by cleavage in vivo, oxidized with glutamate, substituent on the side chain of amino acid in the molecule (eg, - those protected by 6 Ashiru group) - SH, amino group, imidazole group, India Lumpur group, Guanijino group) appropriate protecting groups (e.g., formyl group, such as Arukanoiru groups such Asechiru group ⁇ Or a complex polypeptide such as a so-called sugar polypeptide to which a sugar chain is bound, etc.
  • Amino group protecting groups e.g., formyl group, such as Asechiru groups such as ( ⁇ _ 6 Al force Noiru C
  • Examples of the salt of the polypeptide of the present invention include physiologically acceptable acids (eg, inorganic acids and organic acids) and bases ( An example For example, a physiologically acceptable acid addition salt is preferable.
  • a physiologically acceptable acid addition salt is preferable.
  • examples of such a salt include inorganic acids (for example, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, and the like).
  • Sulfuric acid or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, tartaric acid, citric acid, malic acid, oxalic acid, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) And the like are used.
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced from the above-mentioned method for purifying a polypeptide (protein) from cells or tissues of a human warm-blooded animal, or a DNA encoding the polypeptide described below can be produced. It can also be produced by culturing a transformant containing the transformant. It can also be produced according to the peptide synthesis method described below.
  • human or mammalian tissues or cells When producing from human or mammalian tissues or cells, human or mammalian tissues or cells are homogenized and then extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, etc. Purification and isolation can be performed by combining the above chromatography.
  • a commercially available resin for polypeptide (protein) synthesis can be used.
  • resins include, for example, chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, Lylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, (2 ', 4'-dimethoxyphenyl monohydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl Fmoc aminoethyl) phenoxy resin, and the like.
  • an amino acid having a suitably protected amino group and side chain functional group is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target polypeptide according to various known condensation methods.
  • the polypeptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed.
  • an intramolecular disulfide bond formation reaction is carried out in a highly diluted solution to obtain a target polypeptide or an amide thereof.
  • the protected amino acids described above various activating reagents that can be used for polypeptide synthesis can be used, and carbodiimides are particularly preferable.
  • carbopimides DCC, N, N'-diisopropyl carbopimide, N-ethyl-N '-(3-dimethylaminoprolyl) carbopimide, and the like are used.
  • the protected amino acid may be added directly to the resin along with a racemization inhibitor additive (eg, HOBt, HOOBt) or may be pre-protected as a symmetric anhydride or HOBT or HOOBt ester.
  • the amino acid can be added to the resin after activation.
  • the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the polypeptide (protein) condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols such as dimethyl sulfoxide, ethers such as pyridine, dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, or an appropriate mixture thereof are used.
  • the reaction temperature is appropriately selected from the range known to be usable for the polypeptide (protein) bond formation reaction, and is usually selected from the range of about 120 to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in a 1.5 to 4-fold excess. Ninhydrin
  • Ninhydrin As a result of the test using the reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be performed by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, acetylation of unreacted amino acid with acetic anhydride or acetylimidazole so that subsequent reactions are not affected. be able to.
  • Examples of the protecting group for the amino group of the starting material include Z, Boc, t-pentyloxy carbonyl, isopolnyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CI-Z, Br_Z, adamantyl Xycarbonyl, trifluoroacetic acid, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group may be, for example, a linear, branched or cyclic alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.) Alkyl esterification), aralkyl esterification (eg, benzyl ester, 412 trobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxy carbonyl It can be protected by hydrazide, t-butoxycarbonyl hydrazide, trityl hydrazide and the like.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propyl, butyl, t-butyl,
  • the hydroxyl group of serine can be protected, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, lower groups such as acetyl groups.
  • Groups derived from carbonic acid, such as an aroyl group such as an alkanoyl group and a benzoyl group, a benzyloxycarbonyl group, and an ethoxycarbonyl group are used.
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydrovinyl group, a t-butyl group, and the like.
  • the protecting group of the phenolic hydroxyl group of tyrosine for example, Bz 1, C l 2 - Bz l, 2- nitrobenzyl, B r- Z, t one-butyl or the like is used.
  • activated raw oxypoxyl groups include, for example, corresponding acid anhydrides, azides, and activated esters [alcohols (eg, phenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2,4 —Dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HON B, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphenylimide, HO B t) and the like).
  • activated amino group of the raw material for example, a corresponding phosphoric amide is used.
  • a cation scavenger such as amide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol and the like.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is removed by thiophenol treatment
  • the formyl group used as an indole protecting group of tryptophan is 1,2-ethanedithiol, 1,
  • it is also removed by alkali treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the raw material, the protection group, the elimination of the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be appropriately selected from known groups or known means.
  • an amide form of the polypeptide for example, first, after protecting a carboxy terminal amino acid with a single amino acid, a peptide (polypeptide) chain having a desired chain length is added to the amino group side. And then remove the N-terminal amino-protecting group only from the polypeptide and remove the C-terminal hydroxyl group. A polypeptide with only the protecting group removed is produced, and both polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected polypeptide obtained by the condensation, all the protecting groups are removed by the above-mentioned method, and a desired crude polypeptide can be obtained. The crude polypeptide is purified by various known purification means, and the main fraction is freeze-dried to obtain an amide of the desired polypeptide.
  • an ester of the polypeptide for example, after condensing a single amino group of a carboxy-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, the same as the amide of the polypeptide, An ester form can be obtained.
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known peptide synthesis method.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, the target peptide can be produced by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting the partial peptide of the present invention with the remaining portion, and if the product has a protective group, removing the protective group to produce the desired peptide. it can.
  • Known condensation methods and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following 1 to 5.
  • the polypeptide of the present invention can be purified and isolated by a combination of ordinary purification methods such as solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, and recrystallization.
  • an appropriate salt may be prepared by a known method or a method analogous thereto. Can be converted to a free form or, if obtained in the form of a salt, a free form or another salt by a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention. Either cDNA or synthetic DNA derived from cells or tissues may be used.
  • the vector used for the library 1 may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Alternatively, it can be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a preparation of the entire RNA or mRNA fraction from the above-mentioned cell'tissue.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide of the present invention include a DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 22, or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 22.
  • Any DNA can be used as long as it has a DNA or the like that encodes and encodes a polypeptide having substantially the same properties as the polypeptide of the present invention.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 under eight stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 7%, of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9
  • a DNA or the like containing a nucleotide sequence having a homology of 0% or more, more preferably about 80% or more is used.
  • Examples of the DNA that can hybridize with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22 under high stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 60% or more of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 22.
  • Hybridization is performed according to a known method or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). With Wear.
  • the procedure can be performed according to the method described in the attached instruction manual. More preferably, it can be performed under high stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a condition in which the sodium concentration is about 19 to 4 OmM, preferably about 19 to 20 mM, and the temperature is about 50 to 70 ° (:, preferably, about 60 to 65 ° C). Show.
  • Examples of the DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 include a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 9, and the like, represented by SEQ ID NO: 19
  • a DNA encoding the polypeptide of the present invention having an amino acid sequence a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 22 and the like are used.
  • the DNA was amplified by the PCR method using a synthetic DNA primer having a partial nucleotide sequence of the polypeptide of the present invention, or incorporated into an appropriate vector.
  • the DNA can be selected by hybridization with a DNA fragment encoding a part or the entire region of the polypeptide of the present invention or labeled with a synthetic DNA. Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning nd et. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). When a commercially available library is used, it can be performed according to the method described in the attached instruction manual.
  • the DNA base sequence can be replaced by ODA-LA PCR using PCR or a known kit, for example, Mutan TM -supper Ex-ress Km (Takara Shuzo), Mutan TM -K (Takara Shuzo), or the like.
  • the method can be performed according to a known method such as the Gapped duplex method, the Kunke method, or the like, or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the cloned polypeptide can be used as it is, or it can be used after digesting with a restriction enzyme or adding a linker, if desired.
  • the DNA has an ATG as a translation initiation codon at its 5 'end and a TAA, TGA or TAG as a translation termination codon at the 3' end. ⁇
  • the expression vector for the polypeptide of the present invention may be prepared, for example, by (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (mouth) placing the DNA fragment in an appropriate expression vector. It can be produced by ligating downstream of the promoter.
  • vectors include Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), yeast-derived plasmids (eg, pSHl9, pSHl 5), pacteriophages such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, baculovirus, etc., pAl-11, XT1, Rc / CMV, pRc / RSV, pcDNA I ZNeo, etc. Used.
  • Escherichia coli-derived plasmids eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13
  • Bacillus subtilis-derived plasmids eg, pUB110, pTP5, pC194
  • yeast-derived plasmids
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SRa promoter when an animal cell is used as a host, SRa promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, HSV-TK promoter, jS-actin and the like can be mentioned.
  • CMV cytomegalovirus
  • SRa promoter cytomegalovirus promoter
  • the host is a genus Escherichia, a trp promoter, a lac promoter, a recA promoter, a PL promoter, a lpp promoter, a T7 promoter, etc., and when the host is a bacillus, a SP01 promoter
  • yeast such as SP02 promoter, penP promoter, etc., PH05 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • a polyhedrin promoter, a P10 promoter and the like are preferable.
  • Selection techniques include, for example, dihydrofolate reductase (hereinafter dh fr Genes [methotrexate (MTX) resistance], Ampicillin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated to Amp), Neomycin resistance gene (may be abbreviated as Neor, Geneticin resistance) ) And the like.
  • dh fr gene is used as a selection marker by using dh fr gene-deficient Chinese 8-muscle cells
  • the recombinant cells can be selected using a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is added to the N-terminal side of the polypeptide of the present invention.
  • the host is a genus Escherichia, the ⁇ ⁇ ⁇ signal sequence, OmpA ⁇ signal sequence, etc., and when the host is a bacillus, the ⁇ -amylase ⁇ signal sequence, subtilisin ⁇ signal sequence, etc.
  • the host is Signal sequence, SUC2, signal sequence, etc. for yeast, Insulin signal sequence, hyinterferon signal sequence, antibody molecule, signal sequence, etc. for host animal cells Available for each.
  • the polypeptide of the present invention When the polypeptide of the present invention has the above-mentioned signal sequence, the polypeptide of the present invention is efficiently secreted out of the cell.
  • a transformant can be produced.
  • Escherichia bacteria for example, Escherichia bacteria, Bacillus bacteria, yeast, insect cells, insects, animal cells and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli K12 ⁇ DH1 Natl. Acad. Sci. USA, 60, 160 (1968)], JMl 03 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Research), 9, 309 (1981) ], JA 221 [Journal of Molecular Biology], 120, 517 (1978)], HB 101 [Journal of Molecular Biology, 41, 459 (Journal of Molecular Biology)] 1969)] and C600 [Genetics, 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria include, for example, Bacillus subtilis ) MI 114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1 984)] and the like are used.
  • yeast examples include, for example, Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A, DKD- 5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC 1 913, NCYC 2036, Pichia pastoris (KM71) or the like is used.
  • insect cells for example, when the virus is Ac NPV, the cell line derived from the larva of night moth (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), MG1 cell derived from the midgut of Trictioplusia ni, and egg derived from Trichoplusia ni egg High Five TM cells, cells derived from Mamestra bras sicae or cells derived from Estigmena acrea are used.
  • Sf cells include Sf9 cells (ATCC CRL1711) and Sf21 cells (Vaughn, J. et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) Are used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7 (COS 7), Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dh fr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter, CHO (dhfr-)) Cells, mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • To transform animal cells for example, Cell Engineering Separate Volume 8 New Cell Engineering Experiment Protocol. 263—267 (1995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 456 (1973) Can be performed according to the method described in (1).
  • a transformant transformed with the expression vector containing the polynucleotide encoding the polypeptide can be obtained.
  • a liquid medium is suitable as the medium used for the culturing, and a carbon source necessary for the growth of the transformant is contained therein.
  • the carbon source include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose.
  • the nitrogen source include ammonium salts, nitrates, corn chip liquor, peptone, casein, yeast extract, meat extract, soybean meal, potato
  • inorganic or organic substances and inorganic substances such as an extract include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
  • the pH of the medium is preferably about 5-8.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, M9 medium containing glucose and casamino acids (Miller, Journal of Ops Experimen in, Molecular of Genetics). 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • a drug such as 3j3-indolylacrylic acid can be added to make the promotion work efficiently.
  • cultivation is usually at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours. This can be done and, if necessary, aeration or agitation can be added.
  • cultivation is usually performed at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours.
  • Burkholder's minimal medium (Bostian, KL et al., Processings of the National Academy of Cultures) may be used. Sciences of Ob The Us
  • the pH of the medium is adjusted to about 5-8.
  • Culture is usually performed at about 20-35 ° C for about 24-72 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • the culture medium When culturing an insect cell or a transformant whose host is an insect, the culture medium was 10% immobilized in Grace's Insect Medium (Grace, TCC, Nature, 195, 788 (1962)). A solution to which additives such as sera are appropriately added is used.
  • the ⁇ ⁇ of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4. Culture is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and aeration and agitation are added as necessary.
  • a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association] 199, 519 ( 1967)], and 199 medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine], 73, 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8.
  • Cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C for about 15 to 60 hours, and aeration and agitation are added as necessary.
  • polypeptide of the present invention can be produced in the cells of the transformant, in the cell membrane, or outside the cells.
  • the polypeptide of the present invention can be separated and purified from the culture by, for example, the following method.
  • the cells or cells are collected by a known method after culture, suspended in an appropriate buffer, and then subjected to ultrasound, lysozyme and / or freezing. After the cells or cells have been destroyed by thawing or the like, a method of obtaining a crude extract of the polypeptide by centrifugation or filtration is used as appropriate.
  • the buffer may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • Purification of the polypeptide contained in the culture supernatant or extract obtained in this manner can be performed by appropriately combining known separation and purification methods.
  • known separation and purification methods include methods using solubility such as salting out and solvent precipitation.
  • the polypeptide produced by the recombinant may be arbitrarily modified or partially removed by the action of a suitable protein-modifying enzyme or protease before or after purification. It can.
  • a suitable protein-modifying enzyme or protease for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence of the thus produced polypeptide of the present invention or a salt thereof can be measured by, for example, enzymimnoassay western blot analysis using a specific antibody. Can be.
  • the antibody against the polypeptide of the present invention or a salt thereof may be any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody as long as it can recognize the polypeptide of the present invention or a salt thereof.
  • An antibody against the polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a known antibody or antiserum production method using the polypeptide of the present invention as an antigen.
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof is administered to a warm-blooded animal at a site capable of producing an antibody by administration, itself or together with a carrier or a diluent.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually performed once every 2 to 6 weeks, for a total of 2 to 10 times.
  • warm-blooded animals to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • a warm-blooded animal immunized with an antigen for example, an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in them.
  • an individual with an antibody titer is selected from a mouse, and the spleen or lymph node is collected 2 to 5 days after the final immunization and contained in them.
  • monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared.
  • the antibody titer in the antiserum can be measured, for example, by reacting a labeled polypeptide described below with the antiserum, and then measuring the activity of the labeling agent bound to the antibody.
  • the fusion operation can be performed according to a known method, for example, the method of Koehler and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)].
  • the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, but PEG is preferably used.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include myeloma cells of warm-blooded animals such as NS-1, P3U1, SP2Z0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells (spleen cells) and the number of myeloma cells used is 1: 1 to 20: 1, PEG (preferably PEG100-PEG600) is added at a concentration of about 10-80%, and about 20-40 ° (: preferably, Approximately 30 to 37. Incubation with (: for approximately 1 to 10 minutes enables efficient cell fusion.
  • a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, a microplate) on which a polypeptide antigen is adsorbed directly or together with a carrier.
  • a solid phase eg, a microplate
  • Anti-immunoglobulin antibody anti-mouse immunoglobulin antibody is used if the cell used for cell fusion is mouse
  • protein A protein A
  • a monoclonal antibody bound to a solid phase by adding a hybridoma culture supernatant to a solid phase to which an anti-immunoglobulin antibody or protein A is adsorbed, adding a polypeptide labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like And a method for detecting antibody.
  • the selection of the monoclonal antibody can be performed according to a known method or a method analogous thereto. Usually, it can be performed in an animal cell culture medium supplemented with HAT (hypoxanthine, aminopterin, thymidine).
  • HAT hyperxanthine, aminopterin, thymidine
  • any medium can be used as long as it can grow hybridomas.
  • an RPMI 1640 medium containing about 1 to 20%, preferably about 10 to 20% fetal bovine serum, a GIT medium containing about 1 to 10% fetal bovine serum (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a serum-free medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • the culturing temperature is usually about 20 to 40 ° C, preferably about 37 ° C.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% CO2.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by known methods, for example, immunoglobulin separation and purification [eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE) Absorption / desorption method by ultrafiltration, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or only antibody is collected using active adsorbent such as protein A or protein G.
  • immunoglobulin separation and purification eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchangers (eg, DEAE)
  • Absorption / desorption method by ultrafiltration, ultracentrifugation method, gel filtration method, antigen-bound solid phase or only antibody is collected using active adsorbent such as protein A or protein G.
  • Specific purification method for obtaining antibodies by dissociating and binding) [Preparation of polyclonal antibody]
  • the polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a known method or a method analogous thereto.
  • a immunizing antigen polypeptide antigen itself or a complex thereof with a carrier protein is formed and immunized against a warm-blooded animal in the same manner as in the above-described method for producing a monoclonal antibody.
  • the antibody can be produced by collecting an antibody-containing substance corresponding to the salt thereof and separating and purifying the antibody.
  • the type of carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the hapten are determined by the antibody against the hapten immunized by cross-linking the carrier. Any material may be cross-linked at any ratio as long as it can be efficiently used.For example, serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc., in a weight ratio of about 0.1 to 2 per hapten per hapten. A method of coupling at a rate of 0, preferably about 1 to 5 is used.
  • various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier.
  • an active ester reagent containing a daltaraldehyde, a carbodiimide, a maleimide active ester, a thiol group or a dithioviridyl group is used.
  • the condensation product is administered to a warm-blooded animal itself or together with a carrier or diluent at a site where antibody production is possible.
  • Complete Freund's adjuvant / incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration. The administration is usually made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected from blood, ascites, etc., preferably from blood of a warm-blooded animal immunized by the above method.
  • the polyclonal antibody titer in the antiserum can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the antiserum described above.
  • the separation and purification of the polyclonal antibody can be performed according to the same method for separation and purification of immunoglobulin as in the above-described separation and purification of the monoclonal antibody.
  • DNA of the present invention DNA encoding the polypeptide of the present invention
  • the antisense DNA having a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention has a nucleotide sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention. Any antisense DNA may be used as long as it has an effect of suppressing the expression of NA.
  • the nucleotide sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, the entire nucleotide sequence or a partial nucleotide sequence of the nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complementary strand of the DNA of the present invention). And about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more. In particular, about 70% of the total nucleotide sequence of the complementary strand of the DNA of the present invention is complementary to the complementary sequence of the nucleotide sequence of the portion encoding the N-terminal portion of the polypeptide of the present invention (for example, the nucleotide sequence near the start codon).
  • antisense DNA having homology of preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more is suitable. These antisense DNAs can be produced using a known DNA synthesizer or the like.
  • the polypeptide of the present invention may be abbreviated as the polypeptide of the present invention
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention hereinafter, referred to as The DNA of the present invention may be abbreviated
  • an antibody against the polypeptide of the present invention, its amide, or its ester or its salt hereinafter sometimes abbreviated as the antibody of the present invention
  • antisense explain the use of DNA.
  • Cubilin exists as a membrane protein in vivo and binds to apolipoprotein A-I.
  • the polypeptide of the present invention which is a partial fragment having apolipoprotein A-I binding ability of cubulin, is apolipoprotein in blood. Apolipoprotein A-I catabolism can be suppressed by binding to protein A-I. Therefore, the polypeptide of the present invention and the DNA of the present invention may be used for diabetes, obesity, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, low HDL blood, low apolipoprotein A-I It can be used as a medicine for the treatment and prevention of disorders.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, the DNA is used alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, or the like. Later, they can be administered to humans or warm-blooded animals according to conventional means.
  • the DNA of the present invention or the vector into which the DNA of the present invention has been introduced are formulated as they are or together with a physiologically acceptable carrier such as an auxiliary for promoting uptake, and are usually referred to parenterally.
  • the polypeptide of the present invention which can be administered by a catheter such as a gene gun or a hydrogel catheter, is used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, at least 90%, preferably 95% or more, more preferably It is preferable to use those purified to 98% or more, more preferably 99% or more.
  • the polypeptide of the present invention can be used, for example, in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., which are sugar-coated as required, orally, or aseptically with water or other pharmaceutically acceptable liquids. It can be used parenterally in the form of injections such as aqueous solutions or suspensions.
  • the polypeptide of the present invention may be combined with a physiologically acceptable carrier, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative, stabilizer, binder, etc., in a unit dosage form generally required for the practice of a pharmaceutical preparation. It can be manufactured by mixing with. The amount of the active ingredient in these preparations is such that a suitable dosage in the specified range can be obtained.
  • additives that can be incorporated into tablets, capsules, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin,
  • a swelling agent such as alginic acid, a lubricant such as magnesium stearate, a sweetening agent such as sucrose, lactose or saccharin, a flavoring agent such as peppermint, cocoa oil or cellulose are used.
  • Liquid carriers such as oils and fats can be included.
  • a sterile composition for injection can be formulated according to a conventional pharmaceutical preparation such as dissolving or suspending an active substance in a vehicle such as water for injection, or a naturally occurring vegetable oil such as sesame oil or coconut oil.
  • aqueous liquids for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.), and suitable solubilizing agents.
  • glucose and other adjuvants eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.
  • suitable solubilizing agents eg, an alcohol (eg, ethanol, etc.), a polyalcohol (eg, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.), a nonionic surfactant (eg, polysorbate 80 TM, HCO-50, etc.) are used in combination.
  • the oily liquid examples include sesame oil and soybean oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a solubilizer.
  • a buffer eg, phosphate buffer, acetate acetate
  • soothing agents eg, benzalkonidum chloride, proforce hydrochloride, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared injection solution is usually filled in an appropriate ampoule.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic and can be used, for example, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, birds, higgies, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, etc.).
  • warm-blooded animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, birds, higgies, bushes, dogs, dogs, Cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the polypeptide of the present invention varies depending on the target disease, the administration subject, the administration route, and the like. Examples thereof include diabetes, obesity, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, and hypotriglyceridemia. Oral administration of the polypeptide of the present invention for the treatment of HD L blood disease, hypoapolipoprotein A-I blood disease, neuropathy, etc., generally requires one day for an adult (as 6 Ok). Of the polypeptide of the invention is administered in an amount of about lmg to 100 mg, preferably about 10 to 500 mg, more preferably about 10 to 20 mg.
  • the single dose of the polypeptide of the present invention varies depending on the administration subject, target disease, etc., and includes, for example, diabetes, obesity, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia.
  • the polypeptide of the present invention is administered to an adult (with a body weight of 60 kg) in the form of an injection for the purpose of treating hypo HD L bloodemia, hypoapolipoprotein A-I blood disease or neuropathy, etc.
  • cubilin When the expression level of cubilin is abnormally verbose, for example, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, low HD L blood, low apolipoprotein A-I blood, post-meal hyperlipidemia Various diseases such as diabetes, diabetes, obesity, arteriosclerosis, myocardial infarction, and angina occur.
  • compounds or salts thereof that inhibit the apolipoprotein A-I binding of cubulin include, for example, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hypo-HD Lemia, hypoapolipoprotein A_I, post-meal hyperlipidemia. It can be used as a medicament for the treatment and prevention of blood, diabetes, obesity, arteriosclerosis, myocardial infarction, angina, etc.
  • cubilin exists as a membrane protein in the living body and binds to apolipoprotein A-I, so that cubilin or its DNA is abnormal, defective, or abnormally expressed.
  • various diseases such as nephropathy, nephritis, nephropathy, urinary protein disease, neuropathy, vitamin B12 deficiency and the like develop.
  • a compound or a salt thereof that promotes apolipoprotein A-I binding of cubilin is used as a therapeutic or prophylactic agent for, for example, nephropathy, nephritis, nephropathy, urinary proteinosis, neuropathy, bimin B12 deficiency, etc. And so on.
  • cubulin for screening a compound or a salt thereof that inhibits or promotes the function of cubulin.
  • cubulin is a large protein consisting of more than 3,500 amino acids, and is not suitable for screening compounds or salts thereof that promote or inhibit the binding to apo A-1. It has disadvantages such as specific adsorption and binding and decomposition of the cubin molecule itself, and it is difficult to implement a highly sensitive and efficient screening method.
  • the screening method using the polypeptide of the present invention does not have such a disadvantage, and by using the screening method, the polypeptide of the present invention and Compounds or salts thereof that inhibit or promote the binding to A-1 can be screened with high sensitivity and high efficiency.
  • Such a compound or a salt thereof can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing the above-mentioned diseases, because it inhibits or promotes the binding of cupulin to apOA-1.
  • a compound or a salt thereof that inhibits the binding between cubulin and apo AI, characterized by using the polypeptide of the present invention (abbreviated as “inhibitor in“ (2) Screening of drug candidate compound for disease ”) Or a compound that promotes the binding of cubilin to apo A-1 or a salt thereof (may be abbreviated as a promoter in “(2) Screening of drug candidate compounds for disease”).
  • (2) a kit for screening for an inhibitor or an accelerator characterized by containing the polypeptide of the present invention referred to as “the screening kit of the present invention in“ (2) Screening of drug candidate compounds for diseases ”);
  • the screening kit of the present invention in“ (2) Screening of drug candidate compounds for diseases a kit for screening for an inhibitor or an accelerator characterized by containing the polypeptide of the present invention
  • the amount of apoA-1 bound to the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention relative to apoA-1 is characterized by measuring the amount of binding and the like for comparison.
  • binding amounts can be measured according to a known method or a method analogous thereto.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts, etc., and these compounds are novel compounds. Or a known compound.
  • peptide a partial peptide of apo A-1 is preferable.
  • the binding amount in the case of the above (ii) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably as compared with the case of the above (i).
  • the compound or a salt thereof obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is a test compound described above, for example, a peptide, a protein, a non-peptidic compound, a synthetic compound, a fermentation product, a cell extract, and a plant extract.
  • salt of the compound those similar to the salts of the polypeptide of the present invention described above are used.
  • the screening was performed by the SPA method (Scintillation Proximity Assay, Anal Biochem. 1987 Mar; 161 (2): 494-500), a method using a fluorescent binding assay, a surface plasmon sensor, or a method analogous thereto. It can be carried out.
  • the SPA method can be specifically performed as follows.
  • the polypeptide of the present invention is directly or indirectly bound to SPA beads, and (i) apo A-1 labeled with a radioisotope, or (ii) apo AI and a test compound labeled with a radioisotope Mix.
  • the method is characterized in that the fluorescence intensities in the cases (i) and (ii) are measured and compared.
  • the polypeptide of the present invention is bound to SP A beads.
  • the polypeptide of the present invention may be directly bound to the beads, or may be bound indirectly. Direct binding can be performed by the method described in the instruction manual attached to the SPA beads. Also, as a method of indirect connection,
  • polypeptide of the present invention has a sugar chain
  • Such coated SPA peas may be prepared by a known method or a method analogous thereto, but is conveniently obtained from Amersham Pharmacia Biotech.
  • -A tag consisting of several amino acids, such as Gin-Glu-Asp-Leu), a histidine tag and the like.
  • the fusion inserts the DNA encoding the polypeptide of the present invention into a vector such as pFLAG "CMV-1, SecTag or pcDNA3.1 / His, and is inserted into a suitable host cell such as E. coli, COS7 or CHO.
  • the tag may be added at any site of the polypeptide of the present invention, but may be bound to ap0A-1.
  • the polypeptide of the present invention to which a tag is added is hereinafter referred to as Tag-CUBIII.
  • the fusion protein of GST and the polypeptide of the present invention can be prepared by a known method or a method analogous thereto.
  • the fusion site may be any site of the polypeptide of the present invention, but is preferably a site that does not affect the binding to apo A-I.
  • apo A-1 When labeling apo A-1 with a radioisotope (eg, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C], [ 35 S], [ 33 P], etc.) Labeling can be performed by a known method or a method analogous thereto. Specifically, apo A-1 was dissolved at a concentration of 50 xg / m1 in 40 ml of 0.4 M lycine-NaH buffer pH 8.5, and 125 I was added to lmCi. Allow the labeling reaction to proceed. Add 50 1 chloramine T solution (4 mg / m 1), keep at room temperature for 15 minutes, then add 100 1 of 16 mg / m 1 metabisuliite and stir for 10 minutes.
  • a radioisotope eg, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C], [ 35 S], [ 33 P], etc.
  • reaction solution was extracted with 40 ml of acetone getyl ether (3: 1, v / v), and the obtained precipitate was dried, dissolved in phosphate buffer, and dialyzed against the same buffer to give 125 I-labeled apo. You can get AI.
  • the anti-tag antibody can be prepared by a known method or a method analogous thereto using an antigen such as FLAG or myc as an antigen.
  • the antibody may be a monoclonal individual or a polyclonal antibody.
  • a commercially available anti- evening antibody may be used.
  • For the anti-myc antibody, clone 9E10 (Sigma) and the like, and for the anti-FLAG antibody, clone Ml (Sigma) and the like can be used.
  • the biotin modification of the anti-antibody or the polypeptide of the present invention can be performed by a known method or a method analogous thereto.
  • the anti-tag antibody or the polypeptide of the present invention is added at a concentration of 1 mg / ml.
  • Concentration of carbonate buffer 0.1 M sodium bicarbonate, 0.1 M salt Sodium chloride, pH 8.3 solution, add 50/1 of an aqueous solution of Sulfo-NHS-Biotin (Pierce) 1 mg / m1 and mix the reaction solution gently at 4 ° C overnight. Thereafter, the reaction solution can be dialyzed against 20 mM Tris-HCl buffer pH 7.4 containing 150 mM sodium chloride to modify the biotin.
  • binding reaction buffer streptavidin Yttrium silicate Type S PA beads lmg, Pyotin-modified anti-myc monoclonal antibody (9E10, Sigma) 0.51, Purified polypeptide of the present invention (CUBIII-myc-His fragment) 10-200ng, Mix 250,000 cpm of radioactively labeled apo A-1 and 10 pmo 1 to 100 pmo 1 of unlabeled apo AI to make 200 l.
  • the test sample is dissolved in the above-mentioned binding buffer and included in the reaction solution 2001. Assume that the scintillation count when no sample is contained is 100%, and evaluate substances that change the scintillation count.
  • the screening kit of the present invention contains labeled apoA-1, various types of coated SPA beads, the polypeptide of the present invention, and the like.
  • this is performed as follows. After immobilizing the polypeptide of the present invention, the labeled apo AI and the test compound are mixed, incubated, washed, and the amount of the bound labeled apo A-1 is quantified by an appropriate method. Specifically, a concentration of the polypeptide of the present invention suitable for a high binding capacity microphone plate for fluorescence measurement, for example, Black Clini plate enhanced binding (Labsysterns), for example, a concentration of 0.1-1 OigZml Immobilize by diluting in buffer and incubating. As the buffer solution, for example, 2 OmM Tr is- HC 1 ( pH7. 4), can be used a buffer solution containing 50 OmM Na C 1, 2mM C a C 1 2 and 0.1% azide Natoriumu.
  • a suitable blocking reagent For example, SuperBlock TBS (Pierce) can be used.
  • the plate is washed with the buffer used for the binding reaction, and the mixture of the labeled apo A-1 and the test compound is incubated on a microplate well to perform a competitive binding reaction.
  • the buffer used include 2 OmM Tris-HC 1 (pH 7.4), 15 OmM NaC 1, 1 mM CaC 12 , 0.1% sodium azide and 5% Brock-Ac A buffer solution containing e (Dainippon Pharmaceutical) is used.
  • Sulio_NHS-LC-LC-Biotin is used for labeling apo A-1 molecule.
  • apo A-1 was prepared at a concentration of 1 mg / m1 in 5 OmM sodium bicarbonate pH 8.5, and 1 mg / ml of Sulio-NHS-LC-LC-Biotin dissolved in pure water at a concentration of 1 mgZm1. Mix / 10 volumes and incubate at-4 ° C to produce biotin-labeled apo A-1.
  • concentration of the biotin-labeled apo A-1 in the competitive binding reaction solution for example, a concentration of about 0.1 gZml can be used.
  • the amount of the bound biotin-labeled apo A-I after washing for example, a / 3-galactosidae-labeled Streptavidin or the like is used.
  • 4-Methylumberif e11i1-j3-D-galactopyranoside is used for the activity measurement.
  • the amount of the labeled apoA-1 specifically bound to the polypeptide of the present invention can be quantitatively calculated by measuring the excitation light around 365 nm and the fluorescence emission around 46 Onm. .
  • the method using a surface plasmon sensor can be performed using BI ACORE TM 3000 (Biacore) or the like, according to the method described in the attached instruction manual or a method similar thereto. Can be performed as follows. Binding the polypeptide of the present invention directly or indirectly to a sensor chip; (i) a Apply the po A-1 solution to the sensor chip, or (ii) apply the apo A-1 solution containing the test compound to the sensor chip, and measure the surface plasmon in (i) and (ii). And comparing them.
  • the compound When the fluorescence intensity decreases due to the addition of the test compound, the compound can be selected as an inhibitor. When the fluorescence intensity increases, the compound can be selected as an accelerator.
  • the polypeptide of the present invention is immobilized on a sensor chip.
  • the polypeptide of the present invention may be directly immobilized on a sensor chip or may be indirectly immobilized.
  • any method may be used, but a method of covalent bonding as an NHS-ester is preferable.
  • a method for indirect immobilization a method according to the above method can be used.
  • apo A-1 may be immobilized on a sensor chip, and a solution of the polypeptide of the present invention may be applied to the sensor chip.
  • the sensor chip CM5 was used in a one-to-one solution of 0.2 M N-ethyl N '-(3-dimethyl 1 amino P-yl) -carbodiimide and 0.05 M N-hyd dish ysucciniimide.
  • a polypeptide of the present invention (CUBIII-myc-His fragment) at a concentration of 40 g / ml dissolved in 10 mM sodium acetate pH 4.0
  • the polypeptide of the present invention (CU BIII-my c-His fragment) is immobilized.
  • For blocking apply 1 M ethanolamine PH8.5.
  • a buffer for the binding measurement As a buffer for the binding measurement, a buffer pH 7.4 containing 10 mM sodium dihydrogen phosphate, 150 mM sodium chloride, 1.0 mM sodium chloride, 0.1% sodium azide is used. After equilibration with this buffer and stabilization of the plasmon change, apply apo AI diluted with this buffer to 50-500 nM, and measure the change of surface plasmon. For the purpose of evaluating binding inhibition or binding promoting substances, dissolve the test sample in the above buffer and use the apoAI solution. Include in. The substance that inhibits or promotes binding is evaluated by comparing the change in surface plasmon when the specimen is not contained with the change in surface plasmon when the specimen is mixed.
  • the screening kit of the present invention includes a sensor chip on which a polypeptide or apo A-1 is immobilized, apo A-I or a polypeptide, and the like.
  • Compounds or salts thereof obtained using the screening method or screening kit of the present invention include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, plant extracts, animal tissue extracts It is a compound selected from liquids, plasma, and the like, and is a compound that promotes or inhibits the function of the polypeptide of the present invention.
  • salt of the compound those similar to the aforementioned salts of the polypeptide of the present invention can be used.
  • a compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, it can be carried out according to conventional means.
  • tablets, capsules, elixirs, microcapsules, sterile solutions, suspensions, and the like can be prepared in the same manner as in the above-mentioned medicine containing the polypeptide of the present invention.
  • the preparations obtained in this way are safe and low toxic, such as, for example, human or warm-blooded animals (eg, mice, rats, puppies, sheep, bushy, pussi, puma, birds, cats, dogs, Monkeys).
  • human or warm-blooded animals eg, mice, rats, puppies, sheep, bushy, pussi, puma, birds, cats, dogs, Monkeys.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, target disease, subject to be administered, route of administration, and the like.
  • examples include nephritis, nephropathy, hyper-HD L blood disease, and hyperpolyp-tin A_I blood disease.
  • a compound that promotes the binding of the polypeptide of the present invention to apo AI for the purpose of treating proteinuria generally, in an adult (with a body weight of 60 kg), the compound is administered daily. Is administered in an amount of about 0.1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 5 Omg, more preferably about 1.0 to 2 Omg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, the target disease, and the like.
  • the compound examples include nephritis, nephropathy, hyper-HD Lemia, hyperapolipoprotein AIemia, A compound that promotes the binding of the polypeptide of the present invention to apo A-1 for the treatment of proteinuria.
  • an adult usually in the form of an injection
  • the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 20 mg. It is convenient to administer about 0.1 to 1 Omg by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 60 kg.
  • a compound that inhibits the binding of the polypeptide of the present invention to apoA-1 is orally administered for the purpose, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), the amount of the compound is about 0. 1-10 mg, preferably about 1.0-5 mg, more preferably about 1.0-20 mg.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration subject, target disease, etc., and includes, for example, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hypoHDLemia, hypoapolipoprotein A.
  • the compound when administered to an adult (as 60 kg), the compound is used in an amount of about 0.01 to 3 Omg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 1 Omg per day. Is conveniently administered by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 Okg.
  • Antibodies against the polypeptide of the present invention include the polypeptide of the present invention and cubin (hereinafter referred to as “(4) of the polypeptide of the present invention or a salt thereof). (Sometimes referred to as the polypeptide of the present invention in the section “Quantitation”), so that the polypeptide of the present invention in the test solution can be quantified, particularly by a sandwich immunoassay. That is, the present invention can be used for quantification and the like.
  • the antibody of the present invention is allowed to competitively react with the test solution and the labeled polypeptide of the present invention, and the ratio of the labeled polypeptide of the present invention bound to the antibody is measured.
  • a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution characterized by comprising: (ii) After reacting the test solution with the antibody of the present invention insolubilized on the carrier and another labeled antibody of the present invention simultaneously or continuously, the activity of the labeling agent on the insolubilized carrier is measured.
  • a method for quantifying the polypeptide of the present invention in a test solution is provided.
  • the polypeptide of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention (hereinafter sometimes referred to as the monoclonal antibody of the present invention), and can also be detected by tissue staining or the like.
  • the antibody molecule itself may be used, or the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the method for quantifying the polypeptide of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the antibody, the antigen or the antibody corresponding to the amount of the antigen in the test solution (eg, the amount of the polypeptide of the present invention) is used. Any method that detects the amount of one antigen complex by chemical or physical means and calculates this from a standard curve prepared using a standard solution containing a known amount of antigen can be used. You may. For example, nephrometry, a competitive method, an immunometric method and a sandwich method are preferably used, but it is particularly preferable to use a sandwich method described later in terms of sensitivity and specificity.
  • a labeling agent used in a measurement method using a labeling substance for example, a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance and the like are used.
  • the radioisotope for example, [ 125 I], [ 131 I], [ 3 H], [ 14 C] and the like are used.
  • the enzyme a stable enzyme having a large specific activity is preferable.
  • / 3-galactosidase, ⁇ -darcosidase, alkaline phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • the fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiosinate and the like are used.
  • luminescent substance for example, luminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used. Furthermore, it is also possible to use a biotin-avidin system for binding the antibody or antigen to the labeling agent.
  • Carriers such as agarose, dextran, and cellulose Examples include insoluble polysaccharides, polystyrene, polyacrylamide, synthetic resins such as silicon, and glass.
  • a test solution is reacted with the insolubilized monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • the amount of the polypeptide of the present invention in the test solution can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in the reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the labeling agent and the method of insolubilization can be in accordance with those described above.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the antibody used for labeling is not necessarily one kind, and a mixture of two or more kinds of antibodies is used for the purpose of improving measurement sensitivity and the like. May be used.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary reaction and the secondary reaction is preferably an antibody having a different site to which the polypeptide of the present invention binds.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, when the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention, the antibody used in the primary reaction is Preferably, an antibody that recognizes other than the C-terminal, for example, the N-terminal, is used.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a measurement system other than the sandwich method, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephelometry.
  • a competition method the antigen in the test solution and the labeled antigen are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted labeled antigen (F) and the labeled antigen (B) bound to the antibody are separated. (B / F separation)
  • the labeling amount of either B or F is measured, and the amount of antigen in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • B / F separation is performed using a polyethylene glycol
  • a liquid phase method using a second antibody against the antibody or a solid phase antibody is used as the first antibody.
  • a solid-phase method using a soluble first antibody and a solid-phased antibody as the second antibody is used.
  • the antigen in the test solution and the immobilized antigen are subjected to a competitive reaction with a certain amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Reaction with an excess amount of the labeled antibody, and then adding immobilized antigen to the unreacted labeled antibody. After binding the body to the solid phase, the solid and liquid phases are separated. Next, the amount of label in either phase is measured to determine the amount of antigen in the test solution.
  • nephrometry the amount of insoluble sediment resulting from an antigen-antibody reaction in a gel or in a solution is measured. Even when the amount of antigen in the test solution is small and only a small amount of sediment is obtained, laser nephrometry utilizing laser scattering is preferably used.
  • the polypeptide of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • an increase or decrease in the concentration of the polypeptide of the present invention is detected by quantifying the concentration of the polypeptide of the present invention using the antibody of the present invention, for example, hyperlipidemia, Diseases such as hypertriglyceridemia, hypo HD L blood disease, hypoapolipoprotein A-I blood disease, postprandial hyperlipidemia, arteriosclerosis, myocardial infarction, and angina pectoris.
  • hyperlipidemia Diseases such as hypertriglyceridemia, hypo HD L blood disease, hypoapolipoprotein A-I blood disease, postprandial hyperlipidemia, arteriosclerosis, myocardial infarction, and angina pectoris.
  • the antibody of the present invention can be used for detecting the polypeptide of the present invention present in a subject such as a body fluid or a tissue.
  • preparation of an antibody column used for purifying the polypeptide of the present invention, detection of the polypeptide of the present invention in each fraction during purification, and behavior of the polypeptide of the present invention in test cells It can be used for analysis, etc.
  • the DNA of the present invention can be used, for example, as a probe to produce human or warm-blooded animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, birds, higgies, bushes, horses, cats, cats, dogs). , Monkeys, etc.), it is possible to detect abnormalities (genetic abnormalities) in the DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention in, for example, damage, mutation or reduced expression of the DNA or mRNA, Or, it is useful as a gene diagnostic agent for increasing or overexpressing mRNA.
  • the above-described genetic diagnosis using the DNA of the present invention includes, for example, the well-known Northern hybridization and PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-879 (1989)), The National Academy of Sciences of the USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA), Vol. 86, pp. 2766-2770 (1989)) can do.
  • RNA mutation when expression reduction is detected by Northern hybridization or when DNA mutation is detected by PCR-SSCP method, for example, renal damage, nephritis, nephropathy, urinary protein disease, neuropathy, etc. It can be diagnosed that there is a high possibility that the disease is a disorder or a disease such as vitamin B12 deficiency.
  • the antibody of the present invention having an activity of neutralizing the activity of the polypeptide of the present invention is, for example, It can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing a disease caused by excessive expression of the polypeptide of the present invention.
  • the neutralizing antibody of the present invention specifically recognizes the binding site of cuprin to apo A-1 or its vicinity, it can be used in the same manner as an inhibitor, such as hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, and low HD L blood. It can be used as a medicament for the treatment and prevention of hypertension, post-prandial hyperlipidemia, arteriosclerosis, myocardial infarction, angina, etc.
  • the antibody molecule itself may be used, or F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody molecule may be used.
  • the therapeutic or prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as a liquid preparation or as a pharmaceutical composition in an appropriate dosage form, in humans or warm-blooded animals (eg, rats, porcupines, sheep, bush, Oral or parenteral administration to mice, cats, dogs, monkeys, etc.).
  • warm-blooded animals eg, rats, porcupines, sheep, bush, Oral or parenteral administration to mice, cats, dogs, monkeys, etc.
  • the dosage varies depending on the administration target, target disease, symptoms, administration route, etc., for example, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hypo-HD Lemia, hypoapolipoprotein A-I, postprandial
  • the antibody of the present invention is usually used in a single dose of about 0.01 to 20 mg Z kg, preferably about 0.1 kg. It is preferable to administer about 1 to 1 O mgZkg body weight, more preferably about 0.1 to 5 mgZkg body weight by intravenous injection about 1 to 5 times a day, preferably about 1 to 3 times a day. It is convenient. In the case of other parenteral administration and oral administration, an equivalent dose can be administered. If the symptoms are particularly severe, the dose may be increased depending on the symptoms.
  • the antibodies of the present invention can be administered by themselves or as a suitable pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for the above administration contains the above or a salt thereof and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including sugar-coated tablets and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (soft capsules and the like). ), Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and contains a carrier, diluent or excipient commonly used in the pharmaceutical field.
  • a carrier for example, tablets Lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients.
  • compositions for parenteral administration include injections, suppositories, etc.
  • injections include intravenous, subcutaneous, intradermal, intramuscular, and intravenous injections.
  • Shape Such injections are prepared according to known methods, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous solution for injection for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other adjuvants and the like are used, and a suitable solubilizing agent, for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyetiiylene (50 mol) adduct of ydrogenated castor oi 1)] and the like.
  • a suitable solubilizing agent for example, alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants [eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyetiiylene (50 mol) adduct of ydrogenated castor oi 1)] and the like.
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil, and the like are used, and
  • the above-mentioned oral or parenteral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a unit dosage form adapted to the dose of the active ingredient.
  • dosage unit dosage forms include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), suppositories, etc., and usually about 5 to 50 mg per dosage unit dosage form. It is preferable that about 5 to 10 Omg of the above antibody is contained in an injection, and about 10 to 25 Omg of the above antibody is contained in other dosage forms.
  • compositions may contain another active ingredient as long as the composition does not cause an undesirable interaction with the above-mentioned antibody.
  • bases, amino acids, and the like are indicated by abbreviations based on the abbreviations by IUPAC-I UB Coalition on Biochemical Nomenclature or commonly used abbreviations in the art, and examples thereof are described below.
  • amino acids can have optical isomers, L-forms are indicated unless otherwise specified. You.
  • RNA Messenger liponucleic acid dATP Deoxyadenosine triphosphate dTTP Deoxythymidine triphosphate dGTP Deoxyguanosine triphosphate d CTP Deoxycytidine triphosphate ATP Adenosine triphosphate
  • a rg arginine H is histidine
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of one of the sense strand primers used in Example 1.
  • Example 2 shows the base sequence of the antisense strand primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a sense strand primer used in Example 1.
  • Example 2 shows the base sequence of the antisense strand primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of cDNA which encodes the cupilin partial peptide obtained in Example 1.
  • Example 1 shows the base sequence of cDNA which encodes the cubin partial peptide obtained in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of one of the sense strand primers used in Example 1.
  • Example 2 shows the base sequence of the antisense strand primer used in Example 1.
  • the nucleotide sequence of the cDNA encoding the partial fragment IHI of human cupulin is shown.
  • [SEQ ID NO: 10] 3 shows the amino acid sequence of partial fragment III of human cubulin.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a sense strand primer used in Example 1.
  • Example 2 shows the base sequence of the antisense strand primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a sense strand primer used in Example 1.
  • Example 2 shows the base sequence of the antisense strand primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a sense strand primer used in Example 1.
  • Example 2 shows the base sequence of the antisense strand primer used in Example 1.
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of a sense strand primer used in Example 1.
  • Example 2 shows the base sequence of the antisense strand primer used in Example 1.
  • FIG. 2 shows the amino acid sequence of a fragment peptide of CUB 9—CUB 14, which is a partial fragment of human cuvirin.
  • FIG. 1 shows the nucleotide sequence of cDNA encoding a fragment peptide of CUB7-CUB12, which is a partial fragment of human cubilin.
  • Example 6 shows the amino acid sequence of the polypeptide used in Example 5.
  • Example 4 The transformant Escherichia coli DH5 ⁇ / ⁇ 2231 obtained in Example 4 described below has been used since May 24, 2001.
  • IFO Institution for Fermentation
  • Cloning of cDNA encoding the partial fragment of human cupillin is performed by PCR using the cDNA library derived from human small intestine as follows. I got it.
  • PCR was performed using oligo DNA represented by SEQ ID NO: 1 as the sense strand primer and oligo DNA represented by SEQ ID NO: 2 as the antisense strand primer.
  • SEQ ID NO: 5 oligo DNA represented by SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 3 oligo DNAs represented by SEQ ID NO: 3
  • SEQ ID NO: 4 oligo DNAs represented by SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as the sense strand and the antisense strand primer to obtain cDNA (SEQ ID NO: 6) encoding the human cubin partial peptide.
  • the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 7 is used as a sense strand primer, and the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 8 PCR with BamHI and NotI, followed by integration into a vector pSecTag2 (Invitrogen) treated with the same restriction enzymes.
  • the eukaryotic expression vector with an IgK signal sequence added upstream and a Myc and His tag added downstream has a partial fragment of human cubulin III (SEQ ID NO: 10, amino acid sequence of mature human cuprin protein).
  • oligo-DNA represented by SEQ ID NO: 11 as a sense strand
  • PCR was performed using oligo DNA represented by SEQ ID NO: 12 as an antisense strand primer, and fragmentation I (25-816 in the amino acid sequence of the mature human cubilin protein ( Figures 1-2) ( Figures 1-2)
  • the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 13 is used as the sense strand primer
  • the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 14 is used as the antisense strand primer.
  • PCR is performed to have an amino acid sequence consisting of amino acids 474 to 1390 in the partial fragment II (amino acid sequence of mature human cubulin protein (FIGS. 1-2)). cDNA encoding each were cloned into the expression base Kuta scratch.
  • the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 15 was used as the sense strand primer, and the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 16 was used as the antisense strand.
  • PCR was performed as a primer, and cDNA encoding partial fragment IV (having the amino acid sequence consisting of amino acids 1852 to 2804 in the amino acid sequence of the mature human cubilin protein (FIGS. 1-2)) was sequenced.
  • Oligo DNA represented by 17 PCR was performed using the oligo DNA represented by SEQ ID NO: 18 as the antisense strand primer as a primer for the sense strand, and the amino acid sequence of the partial fragment V (adult human cubilin protein) ( Figures 1-269)
  • the cDNAs encoding the above amino acids were cloned into the above expression vectors.
  • the plasmid pTB2116 obtained by incorporating the cDNA (SEQ ID NO: 9) encoding the partial fragment III of human cubilin into the pSecTag2 vector was used to obtain Escherichia coli DH5o according to a known method.
  • Escherichia coli DH5a / pTB2116 was used to obtain a transformant: Escherichia coli DH5a / pTB2116.
  • An expression vector pTB2116 containing the cDNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9 obtained in Example 1 was transferred to COS 7 cells using TransFast (Promega), a transfection reagent. Transiently transfected. Thereafter, a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (partial fragment II) was produced in the serum-free supernatant by replacing the medium with a serum-free medium. Similarly, for the partial fragments I, II, IV and V, the expression vectors were transfected into COS 7 cells, and those partial fragments were produced in the serum-free supernatant.
  • the amino acid sequence corresponding to the fragment peptide of CUB9-CUB14 represented by SEQ ID NO: 19 (the amino acid sequence of mature human cupulin protein (Fig. 1 2) has an amino acid sequence consisting of the amino acid at position 1391-12091 in the above.) And encodes an amino acid sequence corresponding to the fragment peptide of CUB7-CUB12 represented by SEQ ID NO: 20
  • the cDNA was subcloned into the expression vector used in Example 1.
  • the cDNA encoding the above human CUB9-CUB14 fragment peptide (SEQ ID NO: 22) was incorporated into the pSecTag2 vector, and the resulting plasmid pTB2231 was transformed into Escherichia coli DH5 according to a known method.
  • the transformant was introduced into ⁇ to obtain a transformant: Escliericliia coli DH5 ⁇ / ⁇ 2231.
  • These cubulin partial fragments were expressed in the COS 7 cell supernatant in the same manner as in Example 2, and the interaction with human polyprotein A-I binding resin was examined in the same manner as in Example 3.
  • CDNA (SEQ ID NO: 22) encoding a fragment peptide of CUB9-CUB14 was incorporated into a baculovirus for insect cell expression.
  • the cDNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 (( ⁇ 89- (Myc tag and His tag added to the C-terminus of the fragment peptide of ⁇ 814) was inserted into the pFastBac vector Using this, a baculovirus was constructed in accordance with a standard method, and a culture supernatant expression system in insect cell HiFive cells was prepared A portion having a CUB9-CUB14 fragment peptide expressed in the culture supernatant The protein was found to bind to the human polyprotein A-I binding resin in the same manner as in Example 4. (Fig. 5) From this, the fragment peptide of CUB9-CUB14 expressed in insect cells was also found to bind to human polyprotein A-I.
  • the insect cell-expressed CUB9-CUB14 fragment peptide obtained in Example 5 was Purification was performed using a His tag attached to the end.
  • the culture supernatant was precipitated under 50% saturated ammonium sulfate conditions, and the precipitate was collected by centrifugation (12000 g, 30 minutes).
  • the resulting precipitate was dissolved in a buffer containing 20 mM Tris-HCl (H 7.4), 500 mM NaCl, 10 mM Imidazole, and 0.1% sodium azide.
  • the resulting solution was loaded 0.1M NiS0 4 and was applied to the equilibrated HiTrap Chelating column (Amersham Pharmacia) with the same buffer, washed with the same buffer, 200 mM from the same buffer at 10 mM Imidazole A linear gradient up to Imidazole was formed, and the CUB9-CUB14 fragment peptide was eluted.
  • the eluted fraction obtained was subjected to SDS-PAGE (12.5% gel), CBB-stained, and transferred to a PVDF membrane in a semi-dry manner as shown in Fig. 6A.
  • the anti-Myc monoclonal antibody 9E10 (Si gma) are shown in Fig. 6B.
  • the fragment peptide of the insect cell-expressed CUB9-CUB14 obtained in Example 5 was added to a buffer containing 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2 mM CaCl 2 and 0.1% sodium azide at a final concentration of ⁇ g / The mixture was dissolved in 100 ml / well, incubated at 100 l / well on a plate for fluorescent immunoassay (Clini plate Black enhanced binding, Flow lab.) and immobilized. After blocking non-specific binding sites with 200 l / well SuperBlockTBS (Pierce), incubate with biotinylated human polyprotein A-I, wash, react with streptavidin / 3 galactosidase, and wash.
  • fluorescent immunoassay Clini plate Black enhanced binding, Flow lab.
  • the fragment peptide of the insect cell-expressed CUB9-CUB14 obtained in Example 5 was used at a concentration of 3 g / ml and 100 ⁇ l / well at a fluorescence immunoassay plate (Cl ini plate Black enhanced binding, Flow lab). ), Immobilize, block non-specific binding sites with 200 l / well SuperBlock TBS (Pierce), and add biotin-added human polyprotein AI (final concentration 0.1 xg / ml).
  • the polypeptide of the present invention (an amide thereof or an ester thereof or a salt thereof) and the DNA of the present invention may be used for diabetes, obesity, arteriosclerosis, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, hypo-HD Lemia, Treatment of hypoapolipoprotein A-I blood or neuropathy • Can be used as a medicament such as a prophylactic agent.
  • a compound or a salt thereof that inhibits apolipoprotein A-I binding of cu "villin obtained by the screening method or kit using the polypeptide of the present invention includes, for example, hyperlipidemia, hypertriglyceridemia, Low HD L blood, low apo Lipoprotein A—I as a medicament for the treatment and prevention of hyperlipidemia, postprandial hyperlipidemia, diabetes, obesity, arteriosclerosis, myocardial infarction, angina pectoris, and apolipoprotein A—I binding of cubin
  • a salt thereof can be used, for example, as a medicament such as a therapeutic or preventive agent for nephropathy, nephritis, nephropathy, urinary proteinosis, neuropathy, vitamin B12 deficiency and the like.
  • the antibody of the present invention can specifically recognize the polypeptide of the present invention and cubin, it can be used for quantification of the polypeptide of the present invention in a test solution, and the like. It can be used as a medicament such as an agent for treating or preventing a disease caused by excessive expression of the polypeptide of the present invention.
  • the DNA of the present invention is also useful as a gene diagnostic agent, for example, by using it as a probe.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Description

明細書 新規ポリペプチドおよびその D N A 技術分野
本発明は、 キューピリンの部分べプチドおよびその機能に関する。 背景技術
HD L—コレステロール （HD L (高密度リポタンパク） に含まれるコレステ ロール、 以下、 HD L— Cと略称することがある） 値は冠動脈疾患において負の 危険因子として知られ、 その上昇を目的とした薬剤開発は以前から試みられてき たが、 フイブラート系薬剤をはじめとするこの様な試みは HD L—Cを有意な差 を持って上昇させるが、 十分ではない。 また、 この様な HD L— Cの上昇は、 結 果的要素を表現するものであり、 動脈硬化病巣からのコレステロールの引き抜き が真の目的である限り、 その引き抜きの主体となるアポリポタンパク A— I (ァ ポ A— I (以下、 apo A- 1と記載することがある） ) の上昇こそが必要とされる技 術であることが、 近年のトランスジエニックマウスなどの研究から明らかとなつ てきている。
apo A- 1は血漿中でその殆どが HD Lとしてリン脂質、コレステロール、コレス テロールエステルなどと複合体として存在し、 これらは主に肝で異化代謝される が、 高トリグリセリド血症などでは、 トリグリセリド （以下、 T Gと記載するこ とがある） 含量の増加した HD Lは各種の l ipaseの働きによってより小さな、 ap 0 A - 1粒子へと変換され、 これらは主に腎で異化代謝されることが知られている。 腎での異化代謝は、尿細管濾過を通過した小粒子 apo A- 1が近位尿細管内で再吸収 とそれに続く分解を受けることによつて成立する。 Kozyrakiらは尿細管上皮に発 現し、 ビタミン B 1 2—内因子複合体や L D L受容体関連タンパク （L R P) 結 合タンパク （以下、 RA Pと記載することがある） を結合することが知られるキ ユービリン分子 （GenBank登録番号 AF034611) が apo A-Iとも結合することを報告 している (Nature Medicine Vol. 5, No. 6， 656-661 (1999)； Pro Nat l. Ac a d. Sc i. USA, Vol. 96, 10158-10163 (1999)等） 。 しかし、 キュービリンと apo A - 1の結合の血清 apo A_I濃度や HD L濃度、 あるいは動脈硬化症との関連につい ては明らかにされていない。
apo A- 1とキューピリンの結合は、高 T G血症などで問題となる低 HD L血症の 治療薬開発や動脈硬化の根本的治療薬開発に重要な知見となる可能性があるが、 これらの薬剤開発のため、キュービリン分子内の apo A- 1結合ドメインを限定して いくことは、例えば抗キューピリン apo A-I結合サイト抗体の開発や、低分子化合 物の探索などに極めて有用である。
このように、キュービリン分子内に apo A-I結合サイ卜が限局して存在するとい う知見は、 臨床応用を考える上で極めて重要であり、 その同定は待ち望まれてい た。また、 apo A-Iとキューピリン部分フラグメントとの結合を阻害する物質を投 与することによる、血中 apo A- 1濃度の上昇、 HD L濃度の上昇、 さらには動脈硬 化症の治療薬は、 高 T G血症や高コレステロール血症、 動脈硬化性疾患の治療の ために待ち望まれていた。 発明の開示
キュービリン上の apo A- 1結合サイトを同定し、同定した結合サイトを含むキュ 一ビリンのフラグメントと apo A- 1の結合を阻害する化合物を探索するためのス クリーニング方法の構築、 および構築したスクリ一ニング方法により得られる化 合物を含有してなる医薬を提供する。
キューピリン分子内の apo A- 1結合サイトを限局することは、 キューピリンの a po A- 1結合フラグメントそのものや、 これに対する抗体や、 あるいはまた apo A - Iとの結合を阻害することを特徴とする低分子化合物の臨床応用につながる。 本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 キュービリンの CUB7- CUB14のフラグメ ントペプチド （Blood 91, 3593-3600 (1998) ) および CUB9-CUB14のフラグメント ペプチドに apo A- 1結合活性を見いだした。 また本フラグメントを用いた apo A-I 結合測定実験系を開発した。 これらの知見に基づいて、 さらに検討を重ねた結果 、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は、 (1) ァポリポタンパク A— Iに結合する能力を有する、 キューピリンの部分 フラグメントであるポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはそ の塩、
(2) ポリペプチドが配列番号： 10で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチドである、 前 記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩
(3) ポリペプチドが配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有する、 前記 (1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩、 (4) ポリペプチドが配列番号： 19で表されるアミノ酸配列と同一もしくは 実質的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチドである、 前 記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩
(5) ポリペプチドが配列番号： 19で表されるアミノ酸配列を有する、 前記 (1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩、
(6) 前記 （1) 記載のポリペプチドをコードする DNAを含有する DNA、
(7) 配列番号： 9で表される塩基配列を含有する前記 （6) 記載の DNA、
(8) 配列番号： 22で表される塩基配列を含有する前記 （6) 記載の DNA (9) 前記 （6) 記載の DNAを含有する組換えべクタ一、
(10) 前記 （9) 記載の組換えベクターで形質転換された形質転換体、
(11) 前記 （10) 記載の形質転換体を培養し、 該ポリペプチドを生成せし めることを特徴とする前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそ のエステルまたはその塩の製造法、
(12) 前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステル またはその塩に対する抗体、
(13) 前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステル またはその塩を用いることを特徴とする前記 （1) 記載のポリペプチドまたはそ の塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法、 (14) 前記 （1) 記載のポリペプチドまたはその塩を含有してなる前記 （1 ) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性 を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット、
(15) 前記 （13) 記載のスクリーニング方法または前記 （14) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる、 前記 （1) 記載のポリペプチド、 その アミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物 またはその塩、
(16) 前記 （13) 記載のスクリーニング方法または前記 （14) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのァ ミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物ま たはその塩を含有してなる医薬、
(17) 前記 （13) 記載のスクリーニング方法または前記 （14) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのァ ミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩 を含有してなる腎障害、 腎炎、 腎症、 尿タンパク症、 神経障害またはビタミン B 12欠乏症の予防 ·治療剤、
(18) 前記 （13) 記載のスクリーニング方法または前記 （14) 記載のス クリーニング用キットを用いて得られる前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのァ ミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩 を含有してなる高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HDL血症、 低ァポリポプ 口ティン A— I血症、 食事後高脂血症、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞ま たは狭心症の予防 ·治療剤、
(19) 前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステル またはその塩を含有してなる医薬、
(20) 前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステル またはその塩を含有してなる糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症、 高トリダリ セリド血症、 低 HDL血症、 低アポリポプロテイン A— I血症または神経障害の 予防 ·治療剤、
(21) 請求項 6記載の DNAを用いることを特徴とする診断剤。 (22) 前記 （12) 記載の抗体を含有してなる診断剤、
(23) 哺乳動物に対して、 前記 （13) 記載のスクリーニング方法または前 記 （14) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる前記 （1) 記載のポ リペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する 化合物またはその塩を含有してなる腎障害、 腎炎、 腎症、 尿タンパク症、 神経障 害またはビタミン B 12欠乏症の予防 ·治療方法、
(24) 哺乳動物に対して、 前記 （13) 記載のスクリーニング方法または前 記 （14) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる前記 （1) 記載のポ リペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する 化合物またはその塩の有効量を投与することを特徴とする高脂血症、 高トリダリ セリド血症、 低 HDL血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症 、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞または狭心症の予防 ·治療方法、
(25) 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HDL血症、 低ァポリポプロテ イン A— I血症、 食事後高脂血症、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞または 狭心症の予防 ·治療剤の製造のための、 前記 （13) 記載のスクリーニング方法 または前記 （14) 記載のスクリーニング用キットを用いて得られる前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を 阻害する化合物またはその塩の使用、
(26) 哺乳動物に対して、 前記 （1) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 も しくはそのエステルまたはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HDL血症、 低ァポリ ポプロティン A— I血症または神経障害の予防 ·治療方法、
(27) 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 H DL血症、 低アポリポプロテイン A— I血症または神経障害の予防 ·治療剤の製 造のための、 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステル またはその塩の使用等に関する。
さらには、 本発明は、
(28) 配列番号： 10または配列番号： 19で表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列が、 それぞれ配列番号： 10または配列番号： 19で表 されるアミノ酸配列と約 50%以上 （好ましくは約 60%以上、 さらに好ましく は約 70%以上、 より好ましくは約 80%以上、 特に好ましくは約 90%以上、 最も好ましくは約 95%以上） の相同性を有するアミノ酸配列である上記 （2) または （4) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはそ の塩、
(29) 配列番号： 10でまたは配列番号： 19表されるアミノ酸配列と実質 的に同一のアミノ酸配列が、 それぞれ①配列番号： 10または配列番号： 19で 表されるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度） の アミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番号： 10または配列番号： 19で表 されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度） のアミ ノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 10または配列番号： 19で表され るアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜30個程度） のァミノ 酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または④それらを組み合わせたァ ミノ酸配列である上記 （2) または （4) 記載のポリペプチド、 そのアミド、 も しくはそのエステルまたはその塩等を提供する。
さらに本発明の DNA、 およびポリペプチド、 そのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩等は、 分子量マーカー、 組織マーカ一、 染色体マッピング、 遺伝 病の同定、 プライマー、 プローブの設計等の基礎研究に利用できる可能性がある
図面の簡単な説明
図 1はヒトキユービリン成熟体タンパクのアミノ酸配列を示す （図 2につづく
) o
図 2はヒトキユーピリン成熟体夕ンパクのァミノ酸配列を示す （図 1よりつづ <) 。
図 3は実施例 2で行われたウエスタンプロッティングの結果を示す。
図中、 レーン Cは、 p S e c Ta g 2をトランスフエクトした COS 7細胞を、 レーン Iおよび I Iは、 それぞれヒトキュービリン部分フラグメント Iおよび I Iをコードする cDNAを p S e c T a g 2に組み込んだ発現ベクターをトラン スフェク卜した COS 7細胞を、 レーン I I Iは pTB 2116をトランスフエ クトした COS 7細胞の培養上清を、 レーン IVおよび Vは、 それぞれヒトキュ 一ビリン部分フラグメント I Vおよび Vをコードする cDNAを pSe cTag 2に組み込んだ発現ベクターをトランスフエクトした COS 7細胞を示す。 また 、 「細胞内」 はそれぞれの細胞の破砕物を、 「培養上清」 はそれぞれの細胞の培 養上清を電気泳動したゲルからブロットした P VD F膜を示す。
図 4は実施例 3で行われたウエスタンプロッティングの結果を示す。
図中、 レーン I〜Vは部分フラグメント I〜Vを含有する培養上清を、 レーン M は分子量マーカ一をそれぞれ示す。 また、 「Elution」は ED T A選択的溶出画分 を、 「Pass」 は非結合画分をそれぞれ電気泳動したゲルからプロットした PVD F膜を示す。
図 5は実施例 4及び 5で行われたウエスタンプロッティングの結果を示す。 各ブロッティングの左端は分子量マーカーの泳動を示す。
Mock, Cub7- 12、 Cub9- 14、 Cub7- 14、 Cubl3- 20はそれぞれ CO S 7細胞にトラン スフエクシヨンしたベクターを示し、 Mockはベクターのみ、 Cub7-12は CUB7- CUB1 2のフラグメントペプチドをコードする cDNAを発現するべクタ一、 Cub9-14は C UB9- CUB 14のフラグメントぺプチドをコ一ドする c DN Aを発現するべクタ一、 C ub7- 14は実施例 3のフラグメント I I Iに相当し、 Cubl3- 20は実施例 3のフラグ メント I Vに相当する。
図中、 Sa即 leはヒトァポリポタンパク A— I結合樹脂にアプライしたサンプル 溶液を、 Passはカラム通過フラクションを、 Washは洗浄時溶出フラクションを E1 utionは EDTAによる溶出フラクションを示す。 Passの図中、約 70 kD aに認、 められるバンドは高濃度のアルブミンによる非特異的な認識バンドと考えられる 図 6は実施例 6で行われたウエスタンブロッテイング （A) 及び CBBスティ ン （B)の結果を示す。 各レーンの No. は実施例 6中、 10 から 200崖までの Imidazoleグラジェントによる溶出フラクションの No. を示す。
図 7は実施例 7で行われたピオチン付加ヒトァポリポタンパク A— I結合曲線 を示す。 図中、 F I Uは蛍光測定装置で定量した測定値を示す。 発明を実施するための形態
本発明のァポリポタンパク （プロテイン） A— Iに結合する能力を有する、 キ ュ一ビリンの部分フラグメントであるポリペプチド （以下、 本発明のポリべプチ ドと称することがある） は、 ヒトゃ温血動物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マ ウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サル等） の細胞 （例えば、 肝細 胞、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 iS細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞 、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 繊維芽細胞、 繊維細胞 、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュ ラルキラ一細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜 細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞等） もしくはそれらの細 胞が存在するあらゆる組織、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳 基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消 化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 唾液腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 軟骨、 関節、 骨格筋等に由来するポリペプチドで あってもよく、 組換えポリペプチドであってもよく、 合成ポリペプチドであって もよい。
また、 本発明のポリペプチドがシグナルペプチドを有している場合は、 ポリべ プチドを効率よく細胞外に分泌させることができる。
ァポリポタンパク A— Iに結合する能力を有する、 キュービリンの部分フラグ メントはキューピリンの部分ペプチドであって、 ァポリポタンパク A— Iに結合 する能力を有するものであればいかなる部分ペプチドでもよいが、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する ポリペプチド、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のァミノ酸配列を有するポリべプチドが好ましい。
配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好 ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列等が挙げられる。
配列番号'： 1 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列として は、 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と約 5 0 %以上、 好ましくは約 6 0 %以上、 さらに好ましくは約 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 特に好 ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアミノ酸 配列等が挙げられる。
本発明の配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を有するポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 1 0で表されるァ ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1 0で表されるァ ミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチド等 が好ましい。
本発明の配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配 列を有するポリペプチドとしては、 例えば、 前記の配列番号： 1 9で表されるァ ミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有し、 配列番号： 1 9で表されるァ ミノ酸配列を有するポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチド等 が好ましい。
実質的に同質の性質としては、 例えば、 ァポリポタンパク A— Iと結合するこ と等が挙げられる。 実質的に同質とは、 それらの性質が定性的に同質であること を示す。 したがって、 ァポリポタンパク A— Iとの結合能等の性質が同等 （例、 約 0 . 1〜1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 5〜1 0倍、 より好ましくは 0. 5〜2 倍） であることが好ましいが、 この性質の程度、 ポリペプチドの分子量等の量的 要素は異なっていてもよい。
また、 配列番号： 1 0または配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と実質的 に同一のアミノ酸配列を含有するポリぺプチドとしてより具体的には、 例えば、 それぞれ①配列番号： 1 0または配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列中の 1 または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さ らに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ②配列番 号： 1 0または配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好 ましくは、 1〜3 0個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （ 1〜5 ) 個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 ③配列番号： 1 0または配列 番号： 1 9で表されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0 個程度、 好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミ ノ酸が挿入されたアミノ酸配列、 ④配列番号： 1 0または配列番号： 1 9で表さ れるアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜3 0個程度、 好まし くは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは数 （1〜5 ) 個） のアミノ酸が他のアミ ノ酸で置換されたァミノ酸配列、 または⑤それらを組み合わせたァミノ酸配列を 含有するポリペプチド等のいわゆるムティンも含まれる。
上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている塲合、 その挿入
、 欠失または置換の位置としては、 特に限定されないが、 配列番号： 1 0または 配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列中の a p o A- I結合に必須でない位置 等が挙げられる。
本明細書におけるポリべプチドは、 ぺプチド標記の慣例に従つて左端が N末端 (ァミノ末端) 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 配列番号： 1 0で 表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドをはじめとする、 本発明のポリべ プチドは、 C末端が通常力ルポキシル基（一 C O OH) またはカルポキシレート（ — C O O— ) であるが、 C末端がアミド （― C ONH2) またはエステル （一 C O O R) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル 、 イソプロピルもしくは n _プチル等の アルキル基、 例えば、 シクロペン チル、 シクロへキシル等の C 3— 8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナ フチル等の C 2ァリール基、 例えば、 ベンジル、 フエネチル等のフエニル— C i _ 2アルキル基もしくは a—ナフチルメチル等の α—ナフチルー C ^ 2アルキル 基等の C 7_ 1 4ァラルキル基のほか、経口用エステルとして汎用されるピバロィル ォキシメチル基等が用いられる。
本発明のポリペプチドが C末端以外に力ルポキシル基 （またはカルボキシレー 卜） を有している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されている ものも本発明のポリペプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば 上記した C末端のエステル等が用いられる。
さらに、 本発明のポリペプチドには、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン 残基） のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等の (^_6アル力 ノィル等の C 6ァシル基等） で保護されているもの、 生体内で切断されて生成 する N末端のグルタミン残基がピ口グル夕ミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸 の側鎖上の置換基 （例えば一 OH — S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 インド ール基、 グァニジノ基等） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基等 の アルカノィル基等の ^— 6ァシル基等）で保護されているもの、あるいは 糖鎖が結合したいわゆる糖ポリペプチド等の複合ポリペプチド等も含まれる。 本発明のポリペプチドの塩としては、 生理学的に許容される酸 （例、 無機酸、 有機酸） や塩基 （例、 アルカリ金属塩） 等との塩が用いられ、 とりわけ生理学的 に許容される酸付加塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例え ば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸 、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩等 が用いられる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、 前述したヒトゃ温血動物の細胞または 組織から公知のポリペプチド （タンパク質） の精製方法によって製造することも できるし、 後述するポリペプチドをコードする D NAを含有する形質転換体を培 養することによつても製造することができる。 また、 後述のペプチド合成法に準 じて製造することもできる。
ヒ卜や哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺乳動物の組織ま たは細胞をホモジナイズした後、 酸等で抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマト グラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーを組み合わ せることにより精製単離することができる。
本発明のポリペプチドまたはその塩、 またはそのアミド体の合成には、 通常市 販のポリペプチド （タンパク質） 合成用樹脂を用いることができる。 そのような 樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 リルアミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4一べンジルォキシベンジルアルコール樹 脂、 4一メチルベンズヒドリルァミン樹脂、 P AM樹脂、 4ーヒドロキシメチル メチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 (2' , 4 ' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキシ樹脂、 4— (2'，4' -ジメ トキシフエ二ルー Fm o cアミノエチル） フエノキシ樹脂等を挙げることができ る。 このような樹脂を用い、 ひーァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したァミノ 酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 公知の各種縮合方法に従い、 樹脂 上で縮合させる。 反応の最後に樹脂からポリぺプチドを切り出すと同時に各種保 護基を除去し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し 、 目的のポリペプチドまたはそれらのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリペプチド合成に使用できる各種 活性化試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジ イミド類としては、 D C C、 N, N '—ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェ チル— N '— （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミド等が用いられる。 これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 HO O B t ) とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するかまたは、 対称酸無水物または HO B tエステルあるいは HO O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性 化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ポリべプチ ド （タンパク質） 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択さ れうる。 例えば、 N， N—ジメチルホルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミ ド， N—メチルピロリドン等の酸アミド類、 塩化メチレン， クロ口ホルム等のハ ロゲン化炭化水素類、 トリフルォロエタノール等のアルコール類、 ジメチルスル ホキシド等のスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラヒドロフラン等の エーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリル等の二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチル等のエステル類あるいはこれらの適宜の混合物等が用いられる。 反応 温度はポリペプチド （タンパク質） 結合形成反応に使用され得ることが知られて いる範囲から適宜選択され、 通常約一 2 0〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。ニンヒドリン 反応を用いたテス卜の結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行なうこと なく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰 り返しても十分な縮合が得られないときには、. 無水酢酸またはァセチルイミダゾ 一ルを用いて未反応ァミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影響を 与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 Bo c、 t一ペンチルォキシ 力ルポニル、 イソポルニルォキシカルポニル、 4—メトキシベンジルォキシカル ポニル、 C I— Z、 B r_Z、 ァダマンチルォキシカルボニル、 トリフルォロア セチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—二トロフエニルスルフエニル、 ジフエ二ル ホスフイノチオイル、 Fmo c等が用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピル、 プチル、 t -ブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロヘプ チル、 シクロォクチル、 2—ァダマンチル等の直鎖状、 分枝状もしくは環状アル キルエステル化） 、 ァラルキルエステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4一二 トロべンジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4—クロ口ベンジルェ ステル、 ベンズヒドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベンジルォキシ カルポニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド化、 トリチルヒド ラジド化等によって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって保護するこ とができる。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基等の低級
Figure imgf000014_0001
アルカノィル基、 ベンゾィル基等のァロイル基、 ベンジルォキシカル ポニル基、 エトキシカルポニル基等の炭酸から誘導される基等が用いられる。 ま た、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラ二 ル基、 t-ブチル基等である。
チロシンのフエノール性水酸基の保護基としては、 例えば、 Bz 1、 C l 2— Bz l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 t一ブチル等が用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、 例えば、 To s、 4—メトキシ -2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル 、 Bum, Bo c、 Tr t、 Fmo c等が用いられる。 原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペン夕クロ口フエノール、 2 ， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2， 4—ジニトロフエノール、 シァノメチル アルコール、 パラニトロフエノール、 HON B、 N—ヒドロキシスクシミド、 N —ヒドロキシフ夕ルイミド、 HO B t ) とのエステル〕 等が用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 ？ 一黒ぁるぃは？ —炭素等 の触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、.無水フッ化水素、 メタン スルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれら の混合液等による酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジン等による塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリウムに よる還元等も用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約 _ 2 0〜4 0 °Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノール 、 チオアニソール、 メタクレゾ一ル、 パラクレゾール、 ジメチルスルフイド、 1 , 4一ブタンジチオール、 1 , 2—エタンジチオール等のようなカチオン捕捉剤 の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2 , 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリプトフ アンのインド一ル保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2—エタンジ チオール、 1 , 4—ブタンジチオール等の存在下の酸処理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニア等によるアルカリ処理によっても除去さ れる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護 基の脱離、 反応に関与する官能基の活性化等は公知の基または公知の手段から適 宜選択しうる。
ポリペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 カルポキシ 末端アミノ酸のひ一力ルポキシル基をアミド化して保護した後、 アミノ基側にぺ プチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の N末端 のひ一アミノ基の保護基のみを除いたポリぺプチドと C末端の力ルポキシル基の 保護基のみを除去したポリぺプチドとを製造し、 この両ポリぺプチドを上記した ような混合溶媒中で縮合させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護ポリぺプチドを精製した後、 上記方法によりすべての保 護基を除去し、 所望の粗ポリペプチドを得ることができる。 この粗ポリペプチド は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥することで所望の ポリペプチドのアミド体を得ることができる。
ポリペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルポキシ末端アミノ酸の a 一力ルポキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとした後、 ポ リペプチドのアミド体と同様にして、 所望のポリペプチドのエステル体を得るこ とができる。
本発明のポリぺプチドまたはその塩は、 公知のぺプチドの合成法に従って製造 することができる。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成 法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分ペプチドを構成し得る部分 ぺプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が保護基を有する場 合は保護基を脱離することにより目的のペプチドを製造することができる。 公知 の縮合方法や保護基の脱離としては、 例えば、 以下の①〜⑤に記載された方法が 挙げられる。
®M. Bodanszkyおよび M. A. Ondet t i, ペプチド ·シンセシス (Pept ide Syn the s is) , Intersc ience Publ ishers, New York (1966年)
② Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド (The Pept ide) , Academic Press, New York (1965年）
③泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
④矢島治明および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 ( 1977年）
⑤矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
また、 反応後は通常の精製法、 例えば、 溶媒抽出 ·蒸留 ·カラムクロマトダラ フィ一 ·液体クロマトグラフィー ·再結晶等を組み合わせて本発明のポリべプチ ドポリぺプチドを精製単離することができる。 上記方法で得られるポリぺプチド が遊離体である場合は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩 に変換することができるし、 逆に塩で得られた場合は、 公知の方法あるいはそれ に準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
本発明のポリペプチドをコードする D NAとしては、 前述した本発明のポリべ プチドをコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよ レ^ また、 ゲノム D NA、 前記した細胞'組織由来の c D NA、 合成 D NAのい ずれでもよい。
ライブラリ一に使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コス ミド、 ファージミド等いずれであってもよい。 また、 前記した細胞 '組織より全 R N Aまたは mR N A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 R T— P C R法と略称する） によって増幅す ることもできる。
本発明のポリペプチドをコードする D NAとしては、 例えば、 配列番号： 9ま たは配列番号： 2 2で表される塩基配列を含有する D NA、 または配列番号： 9 または配列番号： 2 2で表される塩基配列とハイストリンジェン卜な条件下でハ ィプリダイズする塩基配列を有し、 本発明のポリぺプチドと実質的に同質の性質 (例、 免疫原性等） を有するポリペプチドをコードする D NA等を有し、 本発明 のポリペプチドと実質的に同質の性質を有するポリペプチドをコードする D NA であれば何れのものでもよい。
配列番号： 9で表される塩基配列と八イストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 9で表される塩基配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上の相同性を 有する塩基配列を含有する D NA等が用いられる。
配列番号： 2 2で表される塩基配列とハイストリンジェントな条件下でハイブ リダィズできる D NAとしては、 例えば、 配列番号： 2 2で表される塩基配列と 約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましくは約 8 0 %以上の相同 性を有する塩基配列を含有する D N A等が用いられる。
ハイブリダィゼーシヨンは、 公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキュラー ·クローニング (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989)に記載の方法等に従って行なうことがで きる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方 法に従って行なうことができる。 より好ましくは、 ハイストリンジェン卜な条件 に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリウム濃度が約 19〜4 Om M、 好ましくは約 19〜 20 mMで、 温度が約 50〜 70 ° (：、 好ましくは約 60 〜65°Cの条件を示す。
配列番号： 10で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコ一 ドする DNAとしては、 配列番号： 9で表される塩基配列を有する DNA等が、 配列番号： 19で表されるアミノ酸配列を有する本発明のポリペプチドをコード する DNAとしては、 配列番号： 22で表される塩基配列を有する DNA等用い られる。
本発明のポリペプチドを完全にコードする DNAのクローニングの手段として は、 本発明のポリペプチドの部分塩基配列を有する合成 DNAプライマーを用い て PC R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DNAを本 発明のポリペプチドの一部あるいは全領域をコードする DNA断片もしくは合成 D N Aを用いて標識したものとのハイブリダイゼーシヨンによつて選別すること ができる。 ハイブリダィゼ一シヨンの方法は、 例えば、 モレキュラー ·クロー二 ング (Molecular Cloning) nd ひ. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor La b. Press, 1989) に記載の方法等に従って行なうことができる。 また、 市販のラ イブラリーを使用する場合、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうこと ができる。
DNAの塩基配列の置換は、 PCRや公知のキット、 例えば、 Mu t an™- s up e r Ex re s s Km (宝酒造） 、 Mu t a nTM— K (宝酒造） など を用いて、 ODA—LA P CR法、 Gapped dup l ex法、 Kunke 1法等の公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って行なうことができる。 クローン化されたポリべプチドをコ一ドする DNAは目的によりそのまま、 ま たは所望により制限酵素で消化したり、 リンカーを付加したりして使用すること ができる。 該 DNAはその 5， 末端 ίに翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' 末端側には翻訳終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有し ^
ていてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNA アダプタ—を用いて付加することもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のポリべプチ ドをコードする DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DNA断 片を適当な発現べクタ一中のプロモーターの下流に連結することにより製造する ことができる。
ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミド （例、 pBR322， pBR32 5， pUC 12, pUC 13) 、 枯草菌由来のプラスミド （例、 pUB 110， pTP 5, pC 194) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9， pSHl 5) 、 λファージ等のパクテリオファージ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルス等の動物ウィルス等の他、 pAl— 11、 XT 1, Rc/ CMV、 pRc/RSV, p c DNA I ZNe o等が用いられる。
本発明で用いられるプロモータ一としては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応 して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿 主として用いる場合は、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 LTRプ 口モーター、 CMVプロモー夕一、 HS V- TKプロモータ一、 jS-ァクチン等が 挙げられる。
これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモー夕一、 SRaプロモ —ター等を用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 t rp プロモーター、 l acプロモーター、 r e cAプロモーター、 PLプロモータ 一、 l ppプロモーター、 T 7プロモーター等が、 宿主がバチルス属菌である場 合は、 SP01プロモーター、 SP02プロモータ一、 penPプロモー夕一等 、 宿主が酵母である場合は、 PH05プロモータ一、 PGKプロモーター、 GA Pプロモータ一、 ADHプロモーター等が好ましい。 宿主が昆虫細胞である場合 は、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモータ一等が好ましい。
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサ一、 スプライシングシ ダナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 S V40 o r iと略称する場合がある） 等を含有しているものを用いることができ る。 選択マ一力一としては、 例えば、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （以下、 dh f rと 略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセー卜 （MTX) 耐性〕 、 アンピシリ ン耐性遺伝子 （以下、 Amp と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性遺伝 子（以下、 Ne o rと略称する場合がある、 Geneticin耐性）等が挙げられる。 特 に、 dh f r遺伝子欠損チャイニーズ八ムス夕一細胞を用いて dh f r遺伝子を 選択マーカーとして使用する場合、 組換え体細胞をチミジンを含まない培地によ つても選択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のポリペプチドの N端末側に付加する。宿主がェシエリヒア属菌である場合は、 ΡΙιοΑ·シグナル配 列、 OmpA ·シグナル配列等が、 宿主がバチルス属菌である場合は、 α—アミラー ゼ ·シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列等が、 宿主が酵母である場合は 、 MFo! ·シグナル配列、 SUC2 ·シグナル配列等、 宿主が動物細胞である場 合には、 ィンシュリン ·シグナル配列、 ひーィンターフェロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列等がそれぞれ利用できる。
本発明のポリペプチドが上記のようなシグナル配列を有する場合、 本発明のポ リベプチドは細胞外へ効率よく分泌される。
このようにして構築された本発明のポリペプチドをコードする DNAを含有す るベクターを用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞等が用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア 'コリ （Escheric hia coli) K 12 · DH1 〔プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·ァカデ ミ一 ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ュ一エスエー （Proc. Natl. Acad. Sc i. USA) , 60巻， 160 (1968)〕 ， J Ml 03 〔ヌクイレック 'ァシッ ズ.リサ—チ， （Nucleic Acids Research) ， 9巻， 309 (1981)〕 ， J A 221 〔ジャーナル ·ォブ ·モレキュラー ·バイオロジー （Journal of Molecul ar Biology) 〕 ， 120巻， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル ·ォ ブ 'モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459 (1969)〕 ， C600 〔ジ エネティックス （Genetics) , 39巻， 440 (1954)〕 等が用いられる。 バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス ·サブチルス (Bacillus subtilis ) M I 114 〔ジーン， 24巻, 255 (1983)] , 207-21 〔ジャーナ ル ·ォブ ·バイオケミストリ一 （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87 (1 984)〕 等が用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス ·セレビシェ （Saccharomyces cere visiae) AH22, AH22R―， NA87 - 11 A, DKD— 5D， 20 B- 12、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ（Schizosaccharomyces pombe) NCYC 1 913, NCYC 2036, ピキア ·パストリス （Pictiia pastoris) KM71等 が用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合は、 夜盗蛾の幼虫由 来株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f細胞） 、 Trictioplusia niの中腸 由来の MG1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High Five™細胞、 Mamestra bras sicae由来の細胞または Estigmena acrea由来の細胞等が用いられる。 ウィルスが BmNPVの場合は、 蚕由来株化細胞 （Bonibyxmori N細胞； BmN細胞） 等が 用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 （ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J丄ら、 イン 'ヴイボ (In Vivo) ， 13, 213-217, (197 7)) 等が用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫等が用いられる 〔前田ら、 ネィチヤ一 （N ature) , 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7 (COS 7) , Vero, チヤィ ニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） 、 dh f r遺伝子欠損 チャイニーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (dhf r— ) 細胞と略記） 、 マウス L細胞、 マウス At T— 20、 マウスミエローマ細胞、 ラット GH3、 ヒト FL細胞等が用いられる。
ェシエリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシ一ジングズ ·ォブ-ザ 'ナショナル 'アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ ·ザ'ユーエスエー （P roc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 69卷， 2110 (1972)やジーン （Gene) , 17巻， 107 (1982)等に記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質転換するには、 例えば、 モレキュラー 'アンド ·ジエネラ ル ·ジエネティックス （Molecular & General Genetics) ， 168巻， 111 ( 1979)等に記載の方法に従って行なうことができる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ'イン 'ェンザィモロジ一 （Meth ods in Enzymology) , 194卷， 182— 187 (1991) 、 プロシ一ジング ズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォプ ·ザ ·ュ —エスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA)， 75巻， 1929 (1978)等に 記載の方法に従って行なうことができる。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ/テクノロジー （Bi o/Tec nology)，6， 47-55(1988)) 等に記載の方法に従って行なうことができる。 動物細胞を形質転換するには、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロ トコ一ル. 263— 267 (1995) (秀潤社発行） 、 ヴィロロジー （Virolo gy) , 52巻， 456 (1973)に記載の方法に従って行なうことができる。 このようにして、 ポリぺプチドをコ一ドする DN Αを含有する発現べクタ一で 形質転換された形質転換体を得ることができる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養 に使用される培地としては液体培地が適当であり、 その中には該形質転換体の生 育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては 、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖等、 窒素源としては 、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーンスチープ ·リカー、 ペプトン、 カゼイン、 酵母エキス、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液等の無機または有 機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウム等が挙げられる。 また、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因 子等を添加してもよい。 培地の p Hは約 5〜 8が望ましい。
ェシエリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミ ノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナル ·ォプ ·ェクスペリメンッ ·イン ·モレキュラー ·ジエネティックス (Journal of Experiments inMolecu lar Genetics) ， 431 -433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 ここに必要によりプロモー夕一を効率よく働かせるため に、 例えば、 3 j3—インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることができる。 宿主がェシェリヒア属菌の場合、 培養は通常約 15〜 43 °Cで約 3〜 24時間 行ない、 必要により、 通気や撹拌を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養は通常約 30〜 40 °Cで約 6〜 24時間行な レ 必要により通気や撹拌を加えることもできる。
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホ —ルダ一 （Burkholder) 最小培地 〔Bostian, K. L. ら、 プロシ一ジングズ ·ォブ •ザ ·ナショナル.アカデミー .ォブ.サイェンシィズ.ォブ.ザ.ユーエスェ
― (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 77巻， 4505 (1980)〕 や 0. 5%力 ザミノ酸を含有する SD培地 〔BiUer, G. A. ら、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ •ナショナル 'アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ ·ザ ·ユーエスェ一 （P roc. Natl. Acad. Sci. USA) , 81巻， 5330 (1984) 〕 が挙げられ る。 培地の p Hは約 5〜 8に調整するのが好ましい。 培養は通常約 20〜 35 °C で約 24〜72時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する際、 培地としては、 Gr ace' s Insect Medium (Grace, T. C. C.，ネイチヤー (Nature) , 195, 788 (1962) ) に 非動化した 10 %ゥシ血清等の添加物を適宜加えたもの等が用いられる。 培地の ρΗは約 6. 2〜6. 4に調整するの力好ましい。 培養は通常約 27 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5 〜20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) ， 122巻， 5 01 (1952)] , DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8巻， 396 ( 1959)〕 ， RPMI 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ ·ザ ·アメリカン .メ ディカリレ ·ァソシエーション (The Jounal of the American Medical Associati on) 199巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング ·ォブ ·ザ · ソサイエティ 'フォー ·ザ ·バイオロジカル 'メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73巻， 1 (1950)〕等が用いられ る。 pHは約 6〜8であるのが好ましい。 培養は通常約 30〜40°Cで約 15〜 60時間行ない、 必要に応じて通気や撹拌を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内、 細胞膜または細胞外に本発明のポリ ぺプチドを生成せしめることができる。 上記培養物から本発明のポリペプチドを分離精製するには、 例えば、 下記の方 法により行なうことができる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、 培養 後、 公知の方法で菌体あるいは細胞を集め、 これを適当な緩衝液に懸濁し、 超音 波、 リゾチームおよび/または凍結融解等によって菌体あるいは細胞を破壊した の ¾、 遠心分離やろ過によりポリぺプチドの粗抽出液を得る方法等が適宜用いら れる。 緩衝液の中に尿素や塩酸グァニジン等の蛋白質変性剤や、 トリトン X— 1 0 0 TM等の界面活性剤が含まれていてもよい。培養液中にポリペプチドが分泌さ れる場合には、 培養終了後、 公知の方法で菌体あるいは細胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるポリべプチド の精製は、 公知の分離 ·精製法を適切に組み合わせて行なうことができる。 これ らの公知の分離、 精製法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法
、 透析法、 限外ろ過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電 気泳動法等の主として分子量の差を利用する方法、 イオン交換クロマトグラフィ —等の荷電の差を利用する方法、 ァフィ二ティークロマトグラフィー等の特異的 親和性を利用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィー等の疎水性の差を利用 する方法、 等電点電気泳動法等の等電点の差を利用する方法等が用いられる。 かくして得られるポリペプチドが遊離体で得られた場合には、 公知の方法ある いはそれに準じる方法によつて塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合 には公知の方法あるいはそれに準じる方法により、 遊離体または他の塩に変換す ることができる。
なお、 組換え体が産生するポリペプチドを、 精製前または精製後に適当な蛋白 修飾酵素または蛋白分解酵素等を作用させることにより、 任意に修飾を加えたり 、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 これらの酵素としては、 例え ば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべプチダーゼ、 プロテイン キナーゼ、 グリコシダーゼ等が用いられる。
かくして生成する本発明のポリペプチドまたはその塩の存在は、 特異抗体を用 いたェンザィムィムノアツセィゃウェスタンプロット解析等により測定すること ができる。
本発明のポリぺプチドまたはその塩に対する抗体は、 本発明のポリぺプチドま たはその塩を認識し得る抗体であれば、 ポリクロ一ナル抗体、 モノクローナル抗 体の何れであってもよい。
本発明のポリペプチドまたはその塩に対する抗体は、 本発明のポリペプチドを 抗原として用い、 公知の抗体または抗血清の製造法に従って製造することができ る。
〔モノクローナル抗体の作製〕
( a ) モノクローナル抗体産生細胞の作製
本発明のポリペプチドまたはその塩は、 温血動物に対して投与により抗体産生 が可能な部位にそれ自体あるいは担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際し て抗体産生能を高めるため、 完全フロイン卜アジュバン卜や不完全フロイントァ ジュバントを投与してもよい。 投与は通常 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計 2〜1 0回 程度行われる。 用いられる温血動物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モ ルモット、 マウス、 ラット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリが挙げられるが、 マウスお よびラッ卜が好ましく用いられる。
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、 抗原で免疫された温血動物、 例えばマウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の 2〜 5日後に脾臓 またはリンパ節を採取し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異種動物 の骨髄腫細胞と融合させることにより、 モノクローナル抗体産生ハイプリドーマ を調製することができる。 抗血清中の抗体価の測定は、 例えば、 後記の標識化ポ リペプチドと抗血清とを反応させたのち、 抗体に結合した標識剤の活性を測定す ることにより行なうことができる。 融合操作は既知の方法、 例えば、 ケーラーと ミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 （Nature) , 256、 495 (1975) ] に従い実施する ことができる。 融合促進剤としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （P E G ) やセンダイウィルス等が挙げられるが、 好ましくは P E Gが用いられる。 骨髄腫細胞としては、 例えば、 N S— 1、 P 3 U 1、 S P 2 Z 0、 A P—l等 の温血動物の骨髄腫細胞が挙げられるが、 P 3 U 1が好ましく用いられる。 用い られる抗体産生細胞 （脾臓細胞） 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜 2 0 ： 1程度であり、 P E G (好ましくは P E G 1 0 0 0〜P E G 6 0 0 0 ) が 1 0〜 8 0 %程度の濃度で添加され、 約 2 0〜 4 0 ° (：、 好ましくは約 3 0〜 3 7 。(：で約 1〜 1 0分間ィンキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施でき る。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングには種々の方法が使 用できるが、 例えば、 ポリペプチド抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた 固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性 物質や酵素等で標識した抗免疫グロプリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマ ウスの場合、 抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる） またはプロテイン Aを 加え、 固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、 抗免疫グロブリン抗 体またはプロテイン Aを吸着させた固相にハイプリドーマ培養上清を添加し、 放 射性物質や酵素等で標識したポリぺプチドを加え、 固相に結合したモノクローナ ル抗体を検出する方法等が挙げられる。
モノクローナル抗体の選別は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って行なう ことができる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添 加した動物細胞用培地で行なうことができる。 選別および育種用培地としては、 ハイプリド一マが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。 例えば 、約 1〜2 0 %、好ましくは約 1 0〜2 0 %の牛胎児血清を含む R P M I 1 6 4 0培地、 約 1〜1 0 %の牛胎児血清を含む G I T培地 （和光純薬工業 （株） ) あ るいはハイプリドーマ培養用無血清培地 （S FM— 1 0 1、 日水製薬 （株） ) 等 を用いることができる。 培養温度は、 通常約 2 0〜4 0 °C、 好ましくは約 3 7 °C である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培 養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことができる。 ハイプリドーマ培養上清の抗 体価は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
( b ) モノクローナル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 公知の方法、 例えば、 免疫グロブリンの分 離精製法 〔例、 塩析法、 アルコール沈殿法、 等電点沈殿法、 電気泳動法、 イオン 交換体 （例、 D E AE) による吸脱着法、 超遠心法、 ゲルろ過法、 抗原結合固相 あるいはプロテイン Aあるいはプロティン G等の活性吸着剤により抗体のみを採 取し、 結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕 に従って行なうことができる 〔ポリクローナル抗体の作製〕
本発明のポリクローナル抗体は、 公知あるいはそれに準じる方法に従って製造 することができる。 例えば、 免疫抗原 （ポリペプチド抗原） 自体、 あるいはそれ とキャリアー蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の製造法と 同様に温血動物に免疫を行ない、 該免疫動物から本発明のポリペプチドまたはそ の塩に対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離精製を行なうことにより製造す ることができる。
温血動物を免疫するために用いられる免疫抗原とキャリアー蛋白質との複合体 に関し、 キャリアー蛋白質の種類およびキャリアーとハプテンとの混合比は、 キ ャリア一に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、 どの 様なものをどの様な比率で架橋させてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンや ゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重量比でハプテン 1に対し、 約 0 . 1 〜2 0、 好ましくは約 1〜5の割合でカプルさせる方法が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることが できるが、 ダルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チ オール基、 ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。 縮合生成物は、 温血動物に対して、 抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは 担体、 希釈剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全 フロイントアジュバントゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投 与は、 通常約 2〜 6週毎に 1回ずつ、 計約 3〜1 0回程度行なわれる。
ポリクローナル抗体は、 上記の方法で免疫された温血動物の血液、 腹水等、 好 ましくは血液から採取することができる。
抗血清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の抗血清中の抗体価の測定と 同様にして測定できる。 ポリクローナル抗体の分離精製は、 上記のモノクロ一ナ ル抗体の分離精製と同様の免疫グロプリンの分離精製法に従って行うことができ る。
本発明のポリペプチドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと称するこ ともある） に相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列を有するアンチセンス D NAとしては、 本発明の D N Aに相補的な、 または実質的に相補的な塩基配列 を有し、 該 D NAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば、 いずれのアン チセンス D N Aであってもよい。
本発明の D NAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の D NAに 相補的な塩基配列 （すなわち、 本発明の D NAの相補鎖） の全塩基配列あるいは 部分塩基配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列等が挙げられる 。 特に、 本発明の D N Aの相補鎖の全塩基配列うち、 本発明のポリペプチドの N 末端部位をコードする部分の塩基配列 （例えば、 開始コドン付近の塩基配列等） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましくは約 9 0 %以 上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有するアンチセンス D NAが好適で ある。 これらのアンチセンス D NAは、 公知の D N A合成装置等を用いて製造す ることができる。
以下に、 本発明のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはそ の塩 （以下、 本発明のポリペプチドと略記する場合がある） 、 本発明のポリぺプ チドをコードする D NA (以下、 本発明の D NAと略記する場合がある） 、 本発 明のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩に対する抗 体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合がある） 、 およびアンチセンス D NAの 用途を説明する。
( 1 ) キュービリンが関与する各種疾病の治療 ·予防剤
キュービリンは生体内で膜タンパクとして存在し、 アポリポプロテイン A— I と結合するが、 キュービリンのアポリポプロテイン A— I結合能を有する部分フ ラグメントである本発明のポリペプチドは、 血液中のアポリポプロテイン A— I と結合することで、 アポリポプロテイン A— Iの異化を抑えることができる。 従 つて、 本発明のポリペプチドおよび本発明の D NAは、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化 症、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A - I血症または神経障害の治療 ·予防剤等の医薬として使用することができる。 例えば、 （ィ） 本発明の D NAを該患者に投与し、 生体内で本発明のポリべプチ ドを発現させることによって、 （口） 細胞に本発明の D NAを挿入し、 本発明の ポリペプチドを発現させた後に、 該細胞を患者に移植することによって、 または (八） 本発明のポリペプチドを該患者に投与すること等によって、 該患者におけ る本発明のポリペプチドの役割を十分に発揮させることができる。
本発明の D NAを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 該 D NAを単独 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァ ソシエーテツドウィルスベクター等の適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に 従って、 ヒトまたは温血動物に投与することができる。 本発明の D NAまたは本 発明の D NAが揷入されたベクターは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための 補助剤等の生理学的に認められる担体とともに製剤化され、通常,非経口的に例え ば、 遺伝子銃やハイドロゲルカテーテルのようなカテーテルによって投与できる 本発明のポリペプチドを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 少なくと も 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さらに好ましく は 9 9 %以上に精製されたものを使用するのが好ましい。
本発明のポリペプチドは、 例えば、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル 剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤等として経口的に、 あるいは水もしくは それ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤等の注射剤の 形で非経口的に使用できる。 例えば、 本発明のポリペプチドを生理学的に認めら れる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤等とともに一般 に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造す ることができる。 これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な用量 が得られるようにするものである。
錠剤、 カプセル剤等に混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル口 ースのような賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸等のような膨化剤 、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンの ような甘味剤、 ペパーミント、 ァカモノ油またはチェリ一のような香味剤等が用 いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 前記タイプの材料にさらに 油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物は注射 用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油等のような天然産出植物油 等を溶解または懸濁させる等の通常の製剤実施に従って処方することができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を 含む等張液 （例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウム等 ) 等が挙げられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノール 等） 、 ポリアルコール （例えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコー ル等） 、 非イオン性界面活性剤 （例えば、 ポリソルベー卜 8 0™、 H C O - 5 0 等） 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が挙げら れ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等と併用してもよ レ^ また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナトリウム緩衝液等） 、 無痛 化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力イン等） 、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコ一ル等） 、 保存剤 （例えば、 ベンジル アルコール、 フエノール等） 、 酸化防止剤等と配合してもよい。 調製された注射 液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は、 安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまた は温血動物 （例えば、 ラッ卜、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ 夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドの投与量は、 対象疾患、 投与対象、 投与ル一卜等により 差異はあるが、 例えば、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症、 高卜リグリセリ ド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症または神経障害等の治 療目的で本発明のポリペプチドを経口投与する場合、 一般的に成人 （6 O k と して） においては、 一日につき本発明のポリペプチドを約 l m g〜l 0 0 O m g 、 好ましくは約 1 0〜5 0 0 m g、 より好ましくは約 1 0〜2 0 O m g投与する 。 非経口的に投与する場合は、 本発明のポリペプチドの 1回投与量は投与対象、 対象疾患等によっても異なるが、 例えば、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症 、 高トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症また は神経障害等の治療目的で本発明のポリペプチドを注射剤の形で成人 （体重 6 0 k gとして） に投与する場合、 一日につき該ポリペプチドを約 1〜1 0 0 O m g 程度、 好ましくは約 1〜2 0 O m g程度、 より好ましくは約 1 0〜1 0 O mg程 度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与することができる。
( 2 ) 疾病に対する医薬候補化合物のスクリーニング
( i ) キュービリンの発現量が異常に冗進している場合、 例えば、 高脂血症、 高 トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後 高脂血症、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞、 狭心症等の種々の疾病が発症 する。
したがって、 キュービリンのアポリポプロテイン A— I結合を阻害する化合物 またはその塩は、 例えば、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低 アポリポプロテイン A_ I血症、 食事後高脂血症、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞、 狭心症等の治療 ·予防剤等の医薬として使用できる。
(ii) 一方、 キュービリンは生体内で膜タンパクとして存在し、 アポリポプロテ イン A— Iと結合するため、 キュービリンまたはその DNA等に異常があったり 、 欠損している場合あるいは発現量が異常に減少している場合、 例えば、 腎障害 、 腎炎、 腎症、 尿タンパク症、 神経障害、 ビタミン B 1 2欠乏症等の種々の疾病 が発症する。
したがって、 キュービリンのアポリポプロテイン A— I結合を促進する化合物 またはその塩は、 例えば、 腎障害、 腎炎、 腎症、 尿タンパク症、 神経障害、 ビ夕 ミン B 1 2欠乏症等の治療 ·予防剤等の医薬として使用できる。
したがって、 キュービリンの機能を阻害または促進する化合物またはその塩の スクリーニングを行うためにキュービリンを用いることを考えることができる。 しかし、 キュービリンは 3 , 5 0 0個以上のアミノ酸からなる巨大なタンパク であり、 apo A- 1との結合を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一二 ング方法を実施する際、 非特異的な吸着や結合、 キュービリン分子自体の分解、 といった欠点があり、 高感度で効率のよいスクリーニング方法を実施することは 困難である。
—方、 本発明のポリぺプチドを用いたスクリ一二ング方法にはそのような欠点 はなく、 該スクリーニング方法を用いることにより本発明のポリペプチドと apo A - 1との結合を阻害または促進する化合物またはその塩を高感度かつ効率良くス クリーニングすることができる。 かかる化合物またはその塩はキュ一ビリンと ap 0 A- 1の結合を阻害または促進するため、上記各種疾患の治療'予防剤等の医薬と して用いることができる。
すなわち、 本発明は、
1 ) ①本発明のポリペプチドを用いることを特徴とするキュービリンと apo A-I との結合を阻害する化合物もしくはその塩 （ 「 （2 ) 疾病に対する医薬候補化合 物のスクリーニング」 において阻害剤と略記する場合がある） 、 またはキュービ リンと apo A- 1との結合を促進する化合物もしくはその塩（「（2 ) 疾病に対する 医薬候補化合物のスクリーニング」 において促進剤と略記する場合がある） のス クリーニング方法、 ②本発明のポリペプチドを含有することを特徴とする、 阻害 剤または促進剤のスクリーニング用キット （ 「 （2 ) 疾病に対する医薬候補化合 物のスクリーニング」 において本発明のスクリーニング用キッ卜と称することも ある） を提供し、 より具体的には、 例えば、
2 )①（i ) 本発明のポリペプチドに apo A-Iを接触させた場合と （i i)本発明の ポリペプチドに apo A- 1および試験化合物を接触させた場合との比較を行なうこ とを特徴とする促進剤または阻害剤のスクリーニング方法、 ②本発明のポリぺプ チドおよび apo A- 1を含有することを特徴とする、促進剤または阻害剤のスクリ一 ニング用キッ卜を提供する。
具体的には、 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 （i ) と （ii) の 場合における、 本発明のポリペプチドに対する apo A- 1の結合量または apo A- 1に 対する本発明のポリぺプチドの結合量などを測定して、 比較することを特徴とす るものである。
これらの結合量は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法などに従って測定す ることができる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液などがあげら れ、 これら化合物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよ い。 ペプチドとしては、 apo A- 1の部分ペプチドが好ましい。
例えば、 上記 （i i) の場合における結合量が上記 （i ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましくは 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上阻害する試験化 合物をキュービリンと apo A-Iの結合を阻害する化合物として、 一方、 上記 （i i ) の場合における結合量が上記 （i ) の場合に比べて、 約 2 0 %以上、 好ましく は 3 0 %以上、 より好ましくは約 5 0 %以上上昇させる試験化合物をキューピリ ンと apo A- 1の結合を促進する化合物として選択することができる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 上記した試験化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非 ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組 織抽出液、 血漿などから選ばれた化合物であり、 キュ一ビリンの機能 （例、 アポ リポプロテイン A— I結合など） を促進または阻害する化合物である。
該化合物の塩としては、 上記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用 いられる。
以下に、 該スクリーニング方法について具体的に記載する。
該スクリーニングは S P A法（シンチレ一シヨンプロキシミティーアツセィ、 A nal Biochem. 1987 Mar; 161 (2)： 494-500) 、 蛍光結合アツセィ、 表面ブラズモ ンセンサ一を用いた方法またはそれらに準じた方法により行うことができる。 〔I〕 S P A法は具体的には以下のようにして行うことができる。
S P Aビーズに本発明のポリペプチドを直接または間接的に結合させ、 （i)放 射性同位元素で標識した apo A- 1と、 または（i i)放射性同位元素で標識した apo A-Iおよび試験化合物と混合する。 次に、 （i ) と （i i) の場合における、 蛍光強 度を測定して、 比較することを特徴とするものである。
より具体的には、
① S P Aビーズに本発明のポリペプチドを結合させる。 結合様式としては、 ビー ズに本発明のポリペプチドを直接結合してもよいし、 間接的に結合してもよい。 直接結合する方法としては、 S P Aビーズに添付の取扱説明書に記載の方法に より行うことができる。 また、 間接的に結合する方法としては、
(i)銅で表面がコートされた S P Aビーズを用い、ヒスチジンタグの付加された 本発明のポリぺプチドと S P Aビーズを結合させる方法、
(ii) ダル夕チオンで表面がコートされた SPAビーズを用い、 GSTと本発明 のポリぺプチドの融合夕ンパクと S P Aビーズを結合させる方法、
(iii)二次抗体で表面がコートされた SPAビ一ズを用い、本発明のポリべプチ ドに対する抗体をリンカ一として用いて、 本発明のポリペプチドと SPAビーズ を結合させる方法、
(iv) 二次抗体で表面がコートされた SPAビーズを用い、 F LAGや my cな どのタグに対する抗体をリンカ一として用いて、 本発明のポリペプチドにかかる タグを付加したポリペプチドと S P Aビーズを結合させる方法、
(V)ストレプトアビジンで表面がコートされた SPAビーズを用い、 ピオチンで 標識された本発明のポリペプチドと S P Aビーズを結合させる方法、
(vi) ストレプ卜アビジンで表面がコートされた S PAビーズを用い、 FLAG や m y cなどの夕グに対する抗体をビォチン標識したものをリンカ一として用い て、 本発明のポリぺプチドにかかる夕グを付加したポリぺプチドと S P Aビーズ を結合させる方法などが挙げられる。
本発明のポリペプチドが糖鎖を有している場合は、
(vii) WGA (wheat germ agglutinin) で表面がコートされた S PAビーズを 用い、 本発明のポリぺプチドと S P Aビーズを結合させる方法も用いることがで きる。 .
このようなコーティングした S P Aピーズは公知の方法またはそれに準じた方 法により作製してもよいが、 アマシャムフアルマシアバイオテックから入手する ことが簡便である。
②（i)本発明のポリペプチドにタグを付加する場合、 タグとしては、 この分野で 通常使用される、 特異的に検出できるあればいかなるものでも用いることができ る。
本発明のポリペプチドと apoA-Iとの結合に影響を与えない、 FLAG (Asp- T yr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys) や my c (Glu- Gin- Lys_Leu- lie- Ser- Gin- Glu- As p-Leu) のような数個のアミノ酸からなるタグ、 ヒスチジンタグなどが好ましい。 かかるタグと本発明のポリぺプチドとの融合体を発現させることにより、 タグ の付加した本発明のポリペプチドを得ることができる。 融合体は pFLAG"CMV- 1、 SecTagまたは pcDNA3.1/Hi sのようなべクタ一に本発明のポリペプチドをコードす る DNAを挿入し、 大腸菌、 COS 7や CHOなどの適当な宿主細胞に導入し、 該細胞の細胞内、 細胞膜または細胞外から生成することにより得ることができる 。 タグが付加される位置は本発明のポリペプチドのいかなる部位でもよいが、 ap 0 A- 1との結合に影響を与えない部位が好ましい。以下、タグの付加された本発明 のポリぺプチドを Tag- CUBIIIと称することがある。
(ii) GSTと本発明のポリペプチドとの融合タンパクは公知の方法またはそれ に準じた方法により作製することができる。 融合部位は本発明のポリべプチドの いかなる部位でもよいが、 apo A-Iとの結合に影響を与えない部位が好ましい。
(iii) apo A- 1を放射性同位元素 （例、 〔125I〕 、 〔131I〕 、 〔3H〕 、 〔14 C] 、 〔35S〕 、 〔33P〕 等） で標識する場合、 標識は公知の方法またはそれに 準じた方法により行うことができる。具体的には apo A- 1を 40mlの 0. 4Mの l yc ine— N a〇H緩衝液 p H 8. 5に 50 x g/m 1の濃度に溶解し、 125 Iを lmC i添加してラベリング反応を進行させる。 50 1のクロラミン T溶液 (4mg/m 1 ) を加え、 15分間室温に保持し、 その後 16 mg/m 1の metabisuliiteを 100 1添加し、 10分撹拌する。反応液を 40mlのァ セトン ジェチルエーテル （3 : 1， v/v) で抽出し、 得られた沈殿を乾燥し 、 リン酸緩衝液に溶解、 同緩衝液に透析することで125 I標識 apo A-Iを得ること ができる。
(iv) 抗タグ抗体をピオチンで修飾する場合、 抗タグ抗体は FLAGまたは my cのような夕グを抗原として用いて公知の方法またはそれに準じた方法により作 製することができる。 該抗体はモノクローナル個体であってもポリクローナル抗 体であってもよい。 抗夕グ抗体は市販のものを用いてもよく、 抗 my c抗体はク ローン 9E 10 (シグマ社） などを、 抗 FLAG抗体はクローン Ml (シグマ社 ) などを用いることができる。
抗夕グ抗体や本発明のポリべプチドのピオチン修飾は公知の方法またはそれに 準じた方法により行うことができるが、 具体的には抗タグ抗体や本発明のポリべ プチドを 1 mg/mlの濃度の炭酸緩衝液（0. 1M炭酸水素ナトリウム、 0. 1M塩 化ナトリウム、 pH8. 3) 溶液に調製し、 Sulfo-NHS-Biotin (Pierce社） 1 m g/m 1の水溶液を 50 / 1添加し、 反応液を 4°Cで一晩緩やかに混合する。 そ の後反応液を 150 mM塩化ナトリゥムを含む 20 mMトリス塩酸緩衝液 p H 7 . 4に透析することでピオチン修飾することができる。
(V) 上記 （i) 〜 （iv) の処理を行い、 シンチレ一夕一により蛍光強度を測定す る。 試験化合物を加えたことにより蛍光強度が下がった場合、 該化合物は阻害剤 として選択することができ、 蛍光強度が上がった場合、 該化合物は促進剤として 選択することができる。
さらに具体的な操作手順を以下に示す。 すなわち、 150mM塩化ナトリウム 、 1. OmM塩化カルシウム、 0. 1 %アジ化ナトリウムを含む 2 OmM卜リス 塩酸緩衝液 PH7. 4 (以下結合反応緩衝液と省略する） 中に、 ストレブ卜アビ ジン Yttrium silicateタイプ S PAビーズ lmg、 ピオチン修飾抗 my cモノク ローナル抗体 （9E10、 シグマ社製） 0. 5 1、 精製した本発明のポリぺプ チド （CUBIII— my c—H i sフラグメント） 10— 200n g、放射性ョー ドラベルした apo A- 1を 250， 000 c pm、非標識 apo AIを 10 pmo 1から 100 pmo 1を混合し、 液量 200 1にする。
本反応液を 25 °Cで 1時間緩やかに混合した後に、 卓上遠心機にて 1, 000 rpm、 2分遠心し、 SPAビーズを沈殿し、 シンチレ一シヨンカウンタにて S P Aビーズから発する蛍光を測定する。 結合阻害あるいは結合促進物質の評価の 目的には、 被検体を上記の結合緩衝液に溶解し、 反応液 200 1に含める。 被 検体を含まない場合のシンチレーシヨンカウントを 100 %とし、 シンチレ一シ ヨンカウントを変化させる物質を評価する。
本発明のスクリーニング用キッ卜は、標識 apo A- 1、各種コーティングを施した SPAビーズおよび本発明のポリぺプチドなどを含有するものである。
〔II〕 本発明のフラグメントペプチドをコートしたプレートを用いて蛍光 apoA - 1 結合アツセィを行う。
具体的には以下のようにして行う。 本発明のポリペプチドを固相化した後に、 標識 apo A-Iと試験化合物とを混合し、インキュベート後、洗浄し、結合した標識 apo A- 1の量を適当な方法で定量する。 具体的には、 本発明のポリぺプチドを蛍光測定用高結合能型マイク口プレー卜 、例えば Black Clini plate enhanced binding (Labsys terns) に適当な濃度、例 えば 0. 1— 1 O igZmlの濃度に緩衝液に希釈して、 インキュベートするこ とによって固相化する。緩衝液としては、 例えば、 2 OmM Tr i s— HC 1 ( pH7. 4) ， 50 OmM Na C 1 , 2mM C a C 12および 0. 1%アジ化 ナトリゥムを含む緩衝液を用いることができる。
一晩以上のインキュベーションによって固相化した後に、 適当なブロッキング 試薬によって非特異結合を抑えるが、これには例えば SuperBlock TBS (Pierce社） などを用いることができる。
プロッキング後に結合反応に用いる緩衝液で洗浄し、標識 apo A- 1および試験化 合物の混合液をマイクロプレ一卜のゥエル上でィンキュベ一トすることにり競合 結合反応を行う。 用いる緩衝液としては、例えば、 2 OmM Tr i s -HC 1 ( pH7. 4) ， 1 5 OmM Na C 1 , 1 mM C aC 12, 0. 1 %アジ化ナト リウムおよび 5% B l o c k一 Ac e (大日本製薬）を含む緩衝液などが用いら れる。 また、 apo A- 1分子の標識には、例えば、 Sulio_NHS- LC- LC- Biotinなどが用 いられる。 具体的には、 apo A- 1を、 5 OmM sodium bicarbonate pH 8.5 に 1 mg/m 1の濃度に調製し、 lmgZm 1の濃度に純水に溶解した Sulio- NHS - LC - LC-Biotinを 1/10容混合し、 ー晚 4°Cでインキュベートすることによってビ ォチン標識 apo A- 1を作成する。 競合結合反応液中のピオチン標識 apo A- 1の濃度 としては、 例えば 0. 1 gZml程度の濃度を用いることができる。
洗浄後の結合したピオチン標識 apo A-I量の定量には、 例えば /3- Galactosidas e標識 Streptavidinなどが用いられる。 また、 その活性測定には 4- Methylumberif e 11 i 1- j3 -D-gal ac t opyranos ide などが用いられる。この場合、 365 nm付近の 励起光、 および 46 Onm付近の蛍光発光を測定することで、 本発明のポリぺプ チドに特異的に結合した標識 apo A- 1の量を定量算出することができる。
〔III〕 表面プラズモンセンサ一を用いた方法は B I ACORE™ 3000 ( ビアコア） 等を使用して、 添付の使用説明書に記載の方法またはそれに準じた方 法により行うことができるが、 具体的には以下のようにして行うことができる。 本発明のポリペプチドをセンサーチップに直接または間接に結合させ、 （i) a po A- 1溶液をセンサーチップにアプライするか、 または （ii) 試験化合物を含ん だ apo A- 1溶液をセンサーチップにアプライし、 （i) と （ii) の場合における、 表面プラズモンを測定して、 比較することを特徴とするものである。
試験化合物を加えたことにより蛍光強度が下がつた場合、 該化合物は阻害剤と して選択することができ、 蛍光強度が上がった場合、 該化合物は促進剤として選 択することができる。
より具体的には、
①本発明のポリペプチドをセンサーチップに固定させる。 固定化様式としては、 センサ一チップに本発明のポリペプチドを直接固定ィヒさせてもよいし、 間接的に 固定化してもよい。
直接固定化させる場合、 いかなる方法によって結合させてもよいが、 NHS— エステルとして共有結合させる方法が好ましい。 間接的に固定化させる方法とし ては、 上記の方法に準じた方法を用いることができる。
また、 apo A- 1をセンサ一チップに固定し、本発明のポリペプチドの溶液をセン サーチップにアプライしてもよい。
②次に、 apo A- 1溶液をセンサーチップにアプライする。
③表面プラズモンを測定する。
具体的には、 センサチップ CM 5を 0. 2Mの N- ethy卜 N' - (3-d ime thy 1 amino P卿 yl) -carbodiimideと 0.05Mの N - hyd皿 ysucciniimideの水溶液を一対一で 混合した溶液で処理し、 10 mMの酢酸ナトリウム pH4. 0に溶解した 40 g/mlの濃度の本発明のポリペプチド（CUBIII— my c— H i sフラグメン 卜） をアプライすることで、 センサチップ CM5に本発明のポリペプチド （CU BIII-my c -H i sフラグメント） を固定する。 ブロッキングには、 1 Mのェ 夕ノールァミン PH8. 5をアプライする。 結合測定の緩衝液としては、 10m Mリン酸 2水素ナトリウム、 15 OmM塩化ナトリウム、 1. OmM塩ィ匕カルシ ゥム、 0. 1 %アジ化ナトリウムを含む緩衝液 pH 7. 4を用いる。 本緩衝液で 平衡化し、 プラズモン変化が安定化した後に、 本緩衝液で 50— 500 nMに希 釈した apo AIをアプライし、 表面プラズモンの変化を測定する。 結合阻害あるい は結合促進物質の評価の目的には、 被検体を上記の緩衝液に溶解し、 apoAI溶液 に含める。 被検体を含まない場合の表面プラズモン変化と被検体を混合した場合 の表面プラズモン変化を比較することにより、 結合阻害あるいは結合促進物質を 評価する。
本発明のスクリーニング用キットは、ポリペプチドまたは apo A- 1の固定化され たセンサーチップおよび、 apo A-Iまたはポリペプチド等を含むものである。 本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物またはその塩は、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵生産物、 細胞抽出液、 植物抽出液、 動物組織抽出液、 血漿等から 選ばれた化合物であり、 本発明のポリぺプチドの機能を促進または阻害する化合 物である。
該化合物の塩としては、 前記した本発明のポリペプチドの塩と同様のものが用 いられる。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる 化合物を上述の治療 ·予防剤として使用する場合、 常套手段に従って実施するこ とができる。 例えば、 前記した本発明のポリペプチドを含有する医薬と同様にし て、 錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤、 無菌性溶液、 懸濁 液剤等とすることができる。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ 、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 対象疾患、 投与対象、 投与ルー 卜等により差異はあるが、 例えば、 腎炎、 腎症、 高 HD L血症、 高ァポリポプ口 ティン A_ I血症、 タンパク尿の治療の目的で本発明のポリペプチドと apo A-I との結合を促進する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 （体重 6 0 k gと して） においては、 一日につき該化合物を約 0. 1〜1 0 0 m g、好ましくは約 1 . 0〜5 O m g、 より好ましくは約 1 . 0〜2 O m g投与する。 非経口的に投与 する場合は、 該化合物の 1回投与量は投与対象、 対象疾患等によっても異なるが 、 例えば、 腎炎、 腎症、 高 HD L血症、 高アポリポプロテイン A— I血症、 タン パク尿の治療の目的で本発明のポリペプチドと apo A- 1との結合を促進する化合 物を注射剤の形で通常成人 （60kgとして） に投与する場合、 一日につき該化 合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. l〜20mg程度、 より好 ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができる。 一方、 例えば、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HDL血症、 低アポリポ プロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 動脈硬化症、 心筋梗塞、 狭心症等の治 療の目的で本発明のポリペプチドと apo A- 1との結合を阻害する化合物を経口投 与する場合、 一般的に成人 （体重 60 kgとして） においては、 一日につき該化 合物を約 0. 1〜10 Omg、好ましくは約 1. 0〜5 Omg, より好ましくは約 1. 0〜20mg投与する。 非経口的に投与する場合は、 該化合物の 1回投与量 は投与対象、 対象疾患等によっても異なるが、 例えば、 高脂血症、 高トリグリセ リド血症、 低 HDL血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 動脈硬化症、 心筋梗塞、 狭心症等の治療の目的で本発明のポリペプチドと apo A- Iとの結合を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人（60 k gとして）に投与す る場合、 一日につき該化合物を約 0. 01〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1 〜20mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg程度を静脈注射により投与 するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 Okg当たりに換算した量を投与 することができる。
(3) 本発明のポリペプチドまたはその塩の定量
本発明のポリペプチドに対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する場合があ る） は、 本発明のポリペプチドおよびキュービリン （以下、 「 （4) 本発明のポ リぺプチドまたはその塩の定量」 項において本発明のポリぺプチドと記載するこ とがある） を特異的に認識することができるので、 被検液中の本発明のポリぺプ チドの定量、 特にサンドィツチ免疫測定法による定量等に使用することができる すなわち、 本発明は、
(i) 本発明の抗体と、 被検液および標識化された本発明のポリペプチドとを競 合的に反応させ、 該抗体に結合した標識化された本発明のポリペプチドの割合を 測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリぺプチドの定量法、 および ( i i) 被検液と担体上に不溶化した本発明の抗体および標識化された本発明の別 の抗体とを同時あるいは連続的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性 を測定することを特徴とする被検液中の本発明のポリぺプチドの定量法を提供す る。
また、 本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体 （以下、 本発明のモ ノクローナル抗体と称する場合がある） を用いて本発明のポリペプチドの定量を 行なえるほか、 組織染色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には 、 抗体分子そのものを用いてもよく、 また、 抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 あ るいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリペプチドの定量法は、 特に制限されるべき ものではなく、 被測定液中の抗原量 （例えば、 本発明のポリペプチド量） に対応 した抗体、 抗原もしくは抗体一抗原複合体の量を化学的または物理的手段により 検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて作製した標準曲線より算出す る測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノメ卜リック法およびサンドィツチ法が好適に用いられるが、 感度 、 特異性の点で、 後述するサンドイッチ法を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる標識剤としては、 例えば、 放射性同位元 素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質等が用いられる。 放射性同位元素としては、 例え ば、 〔125 I〕 、 〔131 I〕 、 〔3H〕 、 〔14C〕 等が用いられる。 上記酵素としては 、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 /3—ガラクトシダーゼ、 β— ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ一ゼ、 パ一ォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水 素酵素等が用いられる。 蛍光物質としては、 例えば、 フルォレスカミン、 フルォ レツセンイソチオシァネート等が用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ルミ ノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ルシゲニン等が用いられる。 さらに 、 抗体あるいは抗原と標識剤との結合にピオチン一アビジン系を用いることもで さる。
抗原あるいは抗体の不溶化にあたっては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常 ポリぺプチドあるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用 いる方法でもよい。 担体としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロース等の 不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポリアクリルアミド、 シリコン等の合成樹脂、 あ るいはガラス等が挙げられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノクローナル抗体に被検液を 反応させ （1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反 応させ （2次反応） たのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより 被検液中の本発明のポリぺプチド量を定量することができる。 1次反応と 2次反 応は逆の順序に行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なつ てもよい。 標識化剤および不溶化の方法は前記のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免疫測定法において、 固相用抗体あるいは標識用抗 体に用いられる抗体は必ずしも 1種類である必要はなく、 測定感度を向上させる 等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい。
本発明のサンドイッチ法による本発明のポリペプチドの測定法においては、 1 次反応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発明のポリぺ プチドの結合する部位が相異なる抗体が好ましく用いられる。 すなわち、 1次反 応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2次反応で用いられる抗体が、 本発明のポリぺプチドの C端部を認識する場合、 1次反応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部以外、 例えば N端部を認識する抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドィツチ法以外の測定システム、 例えば、 競合法、 ィムノメトリック法あるいはネフロメトリー等に用いることができる。 競合法では、 被検液中の抗原と標識抗原とを抗体に対して競合的に反応させた のち、 未反応の標識抗原（F) と、 抗体と結合した標識抗原（B) とを分離し （B /F分離） 、 B , Fいずれかの標識量を測定し、 被検液中の抗原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性抗体を用い、 B/F分離をポリエチレングリコ ール、 前記抗体に対する第 2抗体等を用いる液相法、 および、 第 1抗体として固 相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性のものを用い第 2抗体として 固相化抗体を用いる固相化法とが用いられる。
ィムノメトリック法では、 被検液中の抗原と固相化抗原とを一定量の標識化抗 体に対して競合反応させた後固相と液相を分離するか、 あるいは、 被検液中の抗 原と過剰量の標識化抗体とを反応させ、 次に固相化抗原を加え未反応の標識化抗 体を固相に結合させたのち、 固相と液相を分離する。 次に、 いずれかの相の標識 量を測定し被検液中の抗原量を定量する。
また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは溶液中で抗原抗体反応の結果生じ た不溶性の沈降物の量を測定する。 被検液中の抗原量が僅かであり、 少量の沈降 物しか得られない場合にもレーザーの散乱を利用するレーザーネフロメトリー等 が好適に用いられる。
これら個々の免疫学的測定法を本発明の定量方法に適用するにあたっては、 特 別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件 、 操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えて本発明のポリペプチドの測定系を 構築すればよい。 これらの一般的な技術手段の詳細については、 総説、 成書等を 参照することができる。
例えば、 入江 寛編 「ラジオィムノアツセィ〕 (講談社、 昭和 4 9年発行） 、 入江 寛編 「続ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治 ら編 「酵素免疫測定法」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免 疫測定法」 （第 2版） （医学書院、 昭和 5 7年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫 測定法」 （第 3版） （医学書院、 昭和 6 2年発行） 、 「Methods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (I腿 imochemical Teclm ues (Part A) )、 同書 Vol. 73 (I腿 unochemical Tec niQues (Part B) ) , 同書 Vol. 74 (I匪翻 chemical Teclmidues (Part C) )、 同書 Vol. 84 (Inununochemical Techniques (Part D: Selected Immunoassays) ) , 同書 Vol. 92 (Immunochemical TechniQues (Part E: Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods) ) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques ( Part I： Hybridoma Technology and Monoclonal Ant ibodies) ) (以上、 ァカデミツ クプレス社発行)等を参照することができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のポリべプチ ドを感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のポリぺプチドの濃度を定量すること によって、 本発明のポリペプチドの濃度の増多または減少が検出された場合、 例 えば、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 動脈硬化症、 心筋梗塞、 狭心症等の疾病である、 または将来罹患する可能性が高いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 体液や組織等の被検体中に存在する本発明のポリぺプ チドを検出するために使用することができる。 また、 本発明のポリペプチドを精 製するために使用する抗体カラムの作製、 精製時の各分画中の本発明のポリぺプ チドの検出、 被検細胞内における本発明のポリペプチドの挙動の分析等のために 使用することができる。
(4) 遺伝子診断剤
本発明の DNAは、 例えば、 プロ一ブとして使用することにより、 ヒトまたは 温血動物 （例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕 、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） における本発明のポリペプチドをコードす る DNAまたは mRNAの異常 （遺伝子異常） を検出することができるので、 例 えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNA または m R N Aの増加あるいは発現過多等の遺伝子診断剤として有用である。 本発明の DN Aを用いる上記の遺伝子診断は、 例えば、 公知のノーザンハイブ リダィゼーシヨンや PC R— S S CP法 （ゲノミックス （Genomics) ， 第 5巻， 874〜879頁 （1989年） 、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ .ナショナル · アカデミー'ォブ 'サイェンシィズ 'ォブ 'ュ一エスェ一 （Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA)， 第 86巻， 2766〜 2770頁 (1989年） ) 等により実施することができる。
例えば、 ノーザンハイプリダイゼ一ションにより発現低下が検出された場合や PCR— S SCP法により DNAの突然変異が検出された場合などは、 例えば、 腎障害、 腎炎、 腎症、 尿タンパク症、 神経障害、 ビタミン B 12欠乏症等の疾病 である可能性が高いと診断することができる。
一方、 ノーザンハイプリダイゼーションにより発現過多が検出された場合など は、 例えば、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HDL血症、 低ァポリポプ口 ティン A— I血症、 食事後高脂血症、 動脈硬化症、 心筋梗塞、 狭心症等の疾病で ある可能性が高いと診断することができる。
(5) 本発明の抗体を含有する医薬
本発明のポリぺプチドの活性を中和する作用を有する本発明の抗体は、 例えば 、 本発明のポリペプチドの発現過多に起因する疾患の治療 ·予防剤等の医薬とし て使用することができる。
本発明の中和抗体はキューピリンの apo A- 1に対する結合部位またはその近傍 を特異的に認識するため、 阻害剤と同様に、 例えば、 高脂血症、 高トリグリセリ ド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 動 脈硬化症、 心筋梗塞、 狭心症等の治療 ·予防剤等の医薬として使用できる。 このような目的には、抗体分子そのものを用いてもよく、 また、抗体分子の F ( a b ' ) 2、 F a b '、 あるいは F a b画分を用いてもよい。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療 ·予防剤は、 そのまま液剤として、 ま たは適当な剤型の医薬組成物として、 ヒトまたは温血動物 （例、 ラット、 ゥサギ 、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サル等） に対して経口的または非経口的に 投与することができる。 投与量は、 投与対象、 対象疾患、 症状、 投与ルート等に よっても異なるが、 例えば、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 動脈硬化症、 心筋梗塞、 狭 心症等の治療の目的で、本発明の抗体を 1回量として、通常 0. 0 1〜2 0 mg Z k g体重程度、好ましくは 0. 1〜1 O m gZk g体重程度、さらに好ましくは 0 . l〜5 m gZ k g体重程度を、 1日 1〜5回程度、好ましくは 1日 1〜 3回程度 、 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の 場合もこれに準ずる量を投与することができる。 症状が特に重い場合には、 その 症状に応じて増量してもよい。
本発明の抗体は、 それ自体または適当な医薬組成物として投与することができ る。 上記投与に用いられる医薬組成物は、 上記またはその塩と薬理学的に許容さ れ得る担体、 希釈剤もしくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口 または非経口投与に適する剤形として提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための組成物としては、 固体または液体の剤形 、 具体的には錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 丸剤、 顆粒剤、 散剤、 カプセル剤 （ソフトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸濁剤等が あげられる。 かかる組成物は公知の方法によって製造され、 製剤分野において通 常用いられる担体、 希釈剤もしくは賦形剤を含有するものである。 例えば、 錠剤 用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗糖、 ステアリン酸マグネシウム 等が用いられる。
非経口投与のための組成物としては、 例えば、 注射剤、 坐剤等が用いられ、 注 射剤は静脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤等の剤形 を包含する。 かかる注射剤は、 公知の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはそ の塩を通常注射剤に用いられる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸濁または乳 化することによって調製する。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、 適当な溶解補助剤、 例え ば、 アルコール (例、 エタノール) 、 ポリアルコール (例、 プロピレングリコー ル、 ポリエチレングリコール) 、 非イオン界面活性剤 〔例、 ポリソルべ一ト 8 0 、 H C O - 5 0 (polyoxyetiiylene (50mol) adduct of ydrogenated castor oi 1) 〕 等と併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 大豆油等が用いら れ、 溶解補助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジルアルコール等を併用してもよ い。 調製された注射液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用い られる坐剤は、 上記抗体またはその塩を通常の坐薬用基剤に混合することによつ て調製される。
上記の経口用または非経口用医薬組成物は、 活性成分の投与量に適合するよう な投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形とし ては、 錠剤、 丸剤、 カプセル剤、 注射剤 （アンプル） 、 坐剤等が例示され、 それ ぞれの投薬単位剤形当たり通常 5〜 5 0 O m g程度、 とりわけ注射剤では 5〜1 0 O m g程度、 その他の剤形では 1 0〜2 5 O m g程度の上記抗体が含有されて いることが好ましい。
なお前記した各組成物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生 じない限り他の活性成分を含有してもよい。 本明細書および図面において、 塩基やアミノ酸等を略号で表示する場合、 I U P A C - I UB Co匪 ision on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは 当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ 酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すものとす る。
DNA デォキシリポ核酸
c DNA 相補的デォキシリポ核酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C
RNA リポ核酸
mRNA メッセンジャーリポ核酸 dATP デォキシアデノシン三リン酸 dTTP デォキシチミジン三リン酸 dGTP デォキシグアノシン三リン酸 d CTP デォキシシチジン三リン酸 ATP アデノシン三リン酸
EDTA エチレンジァミン四酢酸 SDS ドデシル硫酸ナトリウム G 1 y グリシン
A 1 a ァラニン
V a 1 バリン
L eu
I 1 e
S e r セリン
Th r スレオニン
C y s
Me t メチォニン
G 1 u グルタミン酸
As p ァスパラギン酸
L y s リジン
A r g アルギニン H i s ヒスチジン
P h e フエ二ルァラニン
Ty r チロシン
T r p トリブトファン
P r o プロリン
A s n ァスパラギン
G 1 n グルタミン
p G 1 u ピログルタミン酸
また、 本明細 i :中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
Me メチル基
E t ェチル基
Bu ブチル基
P h フエニル基
TC チアゾリジン— 4 (R) 一力ルポキサミド基
T o s P -トルエンスルフォニル
CHO ホルミル
B z 1
C 12-Bzl 2 , 6—ジクロロべンジル
Bom ベンジルォキシメチル
Z ベンジルォキシカルポニル
C 1一 Z 2—クロ口べンジルォキシカルボニル
B r -Z 2一プロモベンジルォキシカルポニル
B o c t—ブトキシカルポニル
DNP ジニトロフエニル
T r t 卜リチル
B um t一ブトキシメチル
Fmo c N— 9—フルォレニルメトキシカルポニル
HOB t HO O B t ： 3， 4ージヒドロー 3—ヒドロキシー 4ーォキソ一
1， 2 , 3—べンゾ卜リアジン
HO N B ： 1ーヒドロキシー 5 _ノルポルネンー 2， 3—ジカル ポキシイミド
D C C 本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
実施例 1で用いられたセンス鎖プライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2〕
実施例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3〕
実施例 1で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
実施例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
実施例 1で得られたキューピリン部分ペプチドをコ一ドする c D NAの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 6〕
実施例 1で得られたキュービリン部分べプチドをコードする c D N Aの塩基配 列を示す。
〔配列番号： 7〕
実施例 1で用いられたセンス鎖プライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 8〕
実施例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 9〕
ヒトキュ一ビリンの部分フラグメント I I Iをコードする c D NAの塩基配列 を示す。
〔配列番号： 1 0〕 ヒトキュービリンの部分フラグメント I I Iのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 11〕
実施例 1で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 12〕
実施例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 13〕
実施例 1で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 14〕
実施例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマ一の塩基配列を示す。
〔配列番号： 15〕
実施例 1で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 16〕
実施例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 17〕
実施例 1で用いられたセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 18〕
実施例 1で用いられたアンチセンス鎖プライマーの塩基配列を示す。
〔配列番号： 19〕
ヒトキユービリンの部分フラグメントである CUB 9— CUB 14のフラグメ ントペプチドのアミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 20〕
ヒトキユービリンの部分フラグメントである CUB 7 -CUB 12のフラグメ ントペプチドをコードする c DN Aの塩基配列を示す。
〔配列番号： 21〕
実施例 5で用いられたポリペプチドのァミノ酸配列を示す。
〔配列番号： 22〕
ヒトキユーピリンの部分フラグメントである CUB 9 -CUB 14のフラグメ
:をコードする cDNAの塩基配列を示す。 後述の実施例 1で得られた形質転換体ェシェリヒア ·コリ （Escherichia coli ) DH5 α/ρΤΒ 2116は、 平成 12 (2000) 年 6月 19日から茨城県 つくば市東 1— 1一 1 中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物 寄託セン夕一に寄託番号 FERM BP— 7190として、 平成 12 (2000 ) 年 6月 1日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17— 85の財団法人 ·発酵 研究所 （I FO) に寄託番号 I FO 16438として寄託されている。
後述の実施例 4で得られた形質転換体ェシエリヒア ·コリ （Escherichia coli ) DH5 α/ρΤΒ 2231は、 平成 13 (2001) 年 5月 24日から茨城県 つくば巿東 1一 1一 1 中央第 6の独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物 寄託センタ一に寄託番号 FERM BP— 7607として、 平成 13 (2001 ) 年 5月 17日から大阪府大阪市淀川区十三本町 2— 17-85の財団法人 ·発 酵研究所 （I FO) に寄託番号 I FO 16626として寄託されている。 実施例
以下に実施例を示して、 本発明をより詳細に説明するが、 これらは本発明の範 囲を限定するものではない。 実施例 1
ヒトキュ一ビリンの部分フラグメントをコードする cDNAのクロ一ニング ヒト小腸由来 cDNA Libraryを用いて以下の要領で P CRを行うことによりヒト キュ一ピリンの部分フラグメントをコードする c DNAのクロ一ニングを行つ た。
ヒト小腸由来 Marathon Ready cDNA (Clontech社） を用いて、配列番号: 1で表 されるオリゴ DNAをセンス鎖プライマ一として、 配列番号： 2で表されるオリ ゴ DNAをアンチセンス鎖プライマ一として PCRを行い、 ヒトキュービリン部 分ペプチドをコードする cDNA (配列番号： 5) を得た。 同じく配列番号： 3 及び配列番号： 4で表されるオリゴ DNAをセンス鎖及びアンチセンス鎖プライ マ一として P C Rを行い、 ヒトキユービリン部分べプチドをコ一ドする c D N A (配列番号： 6) を得た。 配列番号： 5で表わされる塩基配列を有する cDNA および配列番号： 6で表わされる塩基配列を有する c DNAを混合し、 これらを 鍀型として、 配列番号： 7で表されるオリゴ DNAをセンス鎖プライマーとして 、 配列番号： 8で表されるオリゴ DNAをアンチセンス鎖プライマ一として PC Rを行い、 B amH I及び No t Iによって制限酵素処理を施し、 同様な制限酵 素処理を施したベクター pS e c Ta g 2 (Invitrogen) に組み込むことによつ て、 IgKシグナル配列を上流に、 また My cおよび H i sタグを下流に付加した 真核細胞発現ベクターに、 ヒトキュービリンの部分フラグメント I I I (配列番 号： 10、 ヒトキューピリン成熟体タンパクのアミノ酸配列 （図 1〜2) 中、 1 165〜2091番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。 CUB7- CUB14の フラグメントペプチドに相当する。 ） をコードする、 配列番号： 9で表される全 長 2781 b pからなる c DNAをクロ一ニングした。
また、 同様にして、 Cac o— 2細胞から精製した mRNAからランダムブラ イマ一を用いて RT— PCRを行って取得した cDNAを用いて、 配列番号： 1 1で表されるオリゴ DNAをセンス鎖プライマーとして、 配列番号： 12で表さ れるオリゴ DN Aをアンチセンス鎖プライマ一として PC Rを行い、 部分フラグ メント I (ヒトキユービリン成熟体タンパクのアミノ酸配列 （図 1〜2) 中、 2 5〜816番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。 ） をコードする cD NAを、 配列番号： 13で表されるオリゴ DNAをセンス鎖プライマ一として、 配列番号： 14で表されるオリゴ DNAをアンチセンス鎖プライマ一として PC Rを行い、 部分フラグメント I I (ヒ卜キュービリン成熟体タンパクのアミノ酸 配列 （図 1〜2) 中、 474〜1390番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を 有する。 ） をコードする cDNAをそれぞれ上記発現べクタ一にクローニングし た。
さらに、 同様にして、 ヒト小腸由来 Marathon Ready cDNA (Clontech社) を用い て、 配列番号： 15で表されるオリゴ DNAをセンス鎖プライマーとして、 配列 番号： 16で表されるオリゴ DNAをアンチセンス鎖プライマ一として PCRを 行い、 部分フラグメント IV (ヒトキュ一ビリン成熟体タンパクのアミノ酸配列 (図 1〜2) 中、 1852〜2804番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有 する。 ） をコードする cDNAを、 配列番号： 17で表されるオリゴ DNAをセ ンス鎖プライマーとして、 配列番号： 18で表されるオリゴ DNAをアンチセン ス鎖プライマーとして PC Rを行い、 部分フラグメント V (ヒトキユービリン成 熟体タンパクのアミノ酸配列 （図 1〜2) 中、 2569〜3623番目のァミノ 酸からなるアミノ酸配列を有する。 ） をコードする cDNAをそれぞれ上記発現 ベクターにクローニングした。
また、 前述のごとく、 ヒトキユービリンの部分フラグメント I I Iをコードす る cDNA (配列番号： 9) を pSe cTag2ベクターに組み込むことによつ て得られたプラスミド pTB 2116を公知の方法に従い大腸菌 （Escherichia coli) DH5o!に導入して、 形質転換体：大腸菌 （Escherichia coli) DH5a /pTB 2116を得た。 実施例 2
ヒ卜キュービリンの部分フラグメントの COS 7細胞での発現
COS 7細胞に、 実施例 1で得られた配列番号： 9で表わされる塩基配列を有 する cDNAを含有する発現べクタ一 pTB 2116を、 トランスフエクシヨン 試薬である TransFast (Promega) を用いて一過性にトランスフエクトした。 その 後、 無血清培地に置換することで配列番号： 10で表わされるアミノ酸配列を有 するポリペプチド （部分フラグメント I I I) を無血清上清中に産生させた。 同 様に、 部分フラグメント I、 I I、 I Vおよび Vについても発現べクタ一を CO S 7細胞に卜ランスフエクトし、 それらの部分フラグメントを無血清上清中に産 生させた。 発現の確認のため、 得られたそれぞれの培養上清の一部について非還 元条件下に SDS— PAGE (12. 5 %ゲル） を行い、 セミドライ方式で PV DF膜に転写した後、 抗 My cモノクローナル抗体 9E10 (S i gma) を用 いたウエスタンブロッテイングによって検出した。 図 3に示すように、 オーバ一 ラップするヒトキュ一ビリン部分フラグメント I〜Vが COS 7細胞で発現し、 培養上清へ分泌していることが確認された。 実施例 3
ヒトァポリポタンパク A— I結合樹脂と、 ヒトキュービリン部分フラグメント との相互作用
ヒトァポリポタンパク A— I (S i gma) 2 mgと膨潤した CNBr- activated s epharose (Amersham Pharmacia) 1mlとの割合で、 0.5M NaCl, 0.1M NaHC03を含む PH8.3の結合用緩衝液中で 4 下、一晩混合することによってヒトアポリポタンパ ク A— Iを架橋結合した seplmrose樹脂を作製した。作製したヒトアポリポタンパ ク A— I結合樹脂 50 ^1と実施例 2で得た部分フラグメント I〜Vを含有する 培養上清それぞれ 200 ilを 4で下に一晩混合し、遠心分離により、非結合画分 を除いた後に、 0.2%のゥシアルブミンを含む D— MEM培地 （Gibco) 400 1で 4回洗浄し、さらに D— MEM培地で 1回洗浄し、続いて 20 EDTAを含む D— M EM培地に混合し、 5分間インキュベートした後に、 遠心分離によって EDT A 選択的溶出画分を得た。 非結合画分及び EDT A選択的溶出画分についてそれぞ れ SDS— PAGE (12. 5 %ゲル） を行い、 セミドライ方式で P VD F膜に 転写した後、抗 Mycモノクロ一ナル抗体 9E10 (S i gma)を用いて検出した 。 図 4に示すように、 部分フラグメント I I Iのみがヒトァポリポタンパク A— I結合樹脂と結合し、 EDTAによって選択的に溶出されることが明らかとなつ た。
このことから、 ヒトキュ一ピリンのヒトァポリポタンパク A— Iとの結合部位 は部分フラグメント I I I (CUB7-CUB14のフラグメントペプチドに相当する） で あることが明らかとなった。 実施例 4
CUB9-CUB14フラグメントペプチドの apo A-I結合作用
さらにヒトァポリポタンパク A— I結合部位を絞り込むことを目的として、 配 列番号： 19で表される CUB9- CUB14のフラグメントペプチドに相当するアミノ酸 配列 （ヒトキュ一ビリン成熟体タンパクのアミノ酸配列 （図 1〜2) 中、 139 1一 2091番目のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。 ） をコードする c DNAおよび配列番号： 20で表される CUB7- CUB12のフラグメントペプチドに相 当するァミノ酸配列をコードする cDNAを、 実施例 1で用いた発現べクタ一に サブクローニングした。 上記ヒト CUB9- CUB 14のフラグメントペプチドをコードする cDNA (配列番号 : 22) を、 p S e c T a g 2ベクタ一に組み込み、 得られたプラスミド pTB 2231を、 公知の方法に従い大腸菌 （Escherichia coli) DH5 αに導入して 、 形質転換体：大腸菌 （Escliericliia coli) DH5 α/ρΤΒ 2231を得た。 これらのキュービリン部分フラグメントを、 実施例 2と同様の方法で COS 7 細胞上清に発現せしめ、 実施例 3と同様にヒトァポリポタンパク A— I結合樹脂 との相互作用を調べた。
CUB9-CUB14のフラグメントぺプチドを含有する部分夕ンパクは、 ヒトアポリポ タンパク A— I結合樹脂と結合した （図 5) 。 これより、 ヒトキュービリンのヒ トァポリポタンパク A— Iとの結合部位は、 CUB9- CUB 14のフラグメントペプチド であることが明らかとなった。 実施例 5
CUB9- CUB14フラグメントぺプチドの apo A- 1結合作用
CUB9- CUB14のフラグメントペプチドをコードする cDNA (配列番号： 22) を昆虫細胞発現用バキュロウィルスに組み込んだ。
具体的には、 配列番号： 21で表されるアミノ酸配列 （(^89-(^814のフラグメ ントペプチドの C末端に My cタグ及び H i sタグを付加） をコードする cDN Aを、 pFastBacベクタ一にサブクローニングした。 これを用いて定法に従いバキ ュロウィルスを構築し、 昆虫細胞 HiFive cellでの培養上清発現系を作製した。 培養上清中に発現された CUB9- CUB 14のフラグメントペプチドを有する部分タン パクは、 実施例 4と同様の方法によりヒトァポリポタンパク A— I結合樹脂と結 合することが判明した （図 5) 。 これより、 昆虫細胞に発現した CUB9- CUB14のフ ラグメン卜ペプチドも、 ヒ卜ァポリポタンパク A— Iと結合することが明らかと なった。 実施例 6
CUB9- CUB 14のフラグメントペプチドの精製
実施例 5で得られた昆虫細胞発現 CUB9- CUB14のフラグメントぺプチドを、 C末 端に付加した H i sタグを利用して精製した。
具体的には、 培養上清を 50%飽和硫酸アンモニゥム条件下で沈殿生成し、 沈殿 を遠心 （12000 g， 30分） により収集した。 得られた沈殿を 20 mM Tris- HC1 ( H 7.4), 500 mM NaCl, 10 mM Imidazole, 0.1%アジ化ナトリウムを含む緩衝液に 溶解した。得られた溶解液を 0.1M NiS04を負荷し、 同緩衝液で平衡化した HiTrap Chelating column (Amersham Pharmacia) にアプライし、 同緩衝液で洗浄した後 、 同緩衝液で 10 mM Imidazoleから 200 mM Imidazoleまでの直線グラジェントを 形成せしめ、 CUB9- CUB14のフラグメントペプチドを溶出した。
得られた溶出画分を SDS— PAGE (12. 5 %ゲル） にかけ、 CBB染色 したものを図 6 Aに、 セミドライ方式で PVDF膜に転写した後、 抗 My cモノ クローナル抗体 9E 10 (S i gma) を用いて検出したものを図 6 Bにそれぞ れ示す。
これらの結果から、 溶出画分には CUB9-CUB 14のフラグメントペプチドが主成分 として含まれていることが判明した。 実施例 7
CUB9-CTB14のフラグメントペプチドと apo A-Iとの結合の定量
実施例 5で得られた昆虫細胞発現型 CUB9- CUB14のフラグメントペプチドを、 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0.1%アジ化ナトリウムを含む緩衝液 に終濃度ト^ g/mlとなるように溶解し、 100 l/wellにて蛍光ィムノアツセィ用 プレート (Clini plate Black enhanced binding, Flow lab. )上でインキュべ一 トし、 固相化した。 200 l/wellの SuperBlockTBS (Pierce) で非特異結合部位 をブロックした後に、 ピオチン付加ヒトァポリポタンパク A— Iとインキュべ一 トし、 洗浄後ストレプトアビジン /3ガラクトシダーゼと反応せしめ、 洗浄後に定 法により i3—ガラクトシダーゼ活性を測定することにより、 固相化した CUB9-CUB 結合反応および洗浄には 20 mM Tris- HC1 (pH7.4) , 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0 .1%アジ化ナトリウム， 5 % (v/v) Block-Ace (大日本製薬）を含む緩衝液を用い た。 図 7に示すように、 CUB9- CUB14のフラグメントペプチドの固相化量依存的、 ビ ォチン付加ヒ卜ァポリポタンパク A— Iの用量依存的な結合反応が認められた。 また、 結合は強固であり結合反応後の長時間 （2〜3時間） の洗浄でも結合量に 変化は認められず、 結合曲線からアポリボタンパク A— Iのおよその親和性 （Kd ) は、 20-100 nMレベルと判断できる。 実施例 8
スクリーニング 法
実施例 5で得られた昆虫細胞発現型 CUB9- CUB 14のフラグメントぺプチドを、 3 g/mlの濃度で 100 ^ l/wel lにて蛍光ィムノアツセィ用プレート （Cl ini plate Black enhanced binding, Flow lab. ) 上でインキュベートし、 固相化し、 200 l/wel lの SuperBlock TBS (Pierce) で非特異結合部位をブロックした後に、 ビ ォチン付加ヒトァポリポタンパク A-I (終濃度 0. 1 x g/ml)と試験化合物とを一夜 インキュベートし、 洗浄後、 100 M l/wel lでストレプトアビジン ガラクトシダ —ゼ 0. 05 U/mlと 1時間反応せしめ、 洗浄後、 0. 5 mM 4-Methylumbel l iferil j3 - D_galact(3pyranos ideを、 10 mM K2HP04, 150 mM NaCl 2 mM MgCl2, 0. 1%アジ化ナ トリゥム， 0. 2% BSAを含む pH 7. 0に調製した緩衝液に溶解した反応液を加えて インキュベートし、 励起光 365皿、 吸光 460 nmにて測定した。 また、 結合反応およ び洗浄には 20 mM Tris-HCl (pH7. 4) , 150 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 0. 1 %アジ化ナ トリウム， 5 % (v/v) Block-Ace (大日本製薬）を含む緩衝液を用いた。 産業上の利用可能性
本発明のポリペプチド （そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩） お よび本発明の D NAは、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症、 高トリグリセリ ド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症または神経障害の治療 •予防剤等の医薬として使用することができる。
また、 本発明のポリペプチドを用いるスクリーニング方法またはキットにより 得られる、 キュ"ビリンのアポリポプロテイン A— I結合を阻害する化合物また はその塩は、 例えば、 高脂血症、 高卜リグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポ リポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋 梗塞、 狭心症等の治療 ·予防剤等の医薬として、 およびキュービリンのアポリポ プロテイン A— I結合を促進する化合物またはその塩は、 例えば、 腎障害、 腎炎 、 腎症、 尿タンパク症、 神経障害、 ビタミン B 1 2欠乏症等の治療 ·予防剤等の 医薬として使用できる。
さらに、 本発明の抗体は、 本発明のポリペプチドおよびキュービリンを特異的 に認識することができるので、 被検液中の本発明のポリぺプチドの定量等に使用 することができ、 つ、 本発明のポリペプチドの発現過多に起因する疾患の治療 •予防剤等の医薬として使用できる。
本発明の D NAは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 遺伝子診断 剤としても有用である。

Claims

請求の範囲
1 . ァポリポタンパク A— Iに結合する能力を有する、 キュービリンの部分フ ラグメントであるポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその 塩。
2 . ポリペプチドが配列番号： 1 0で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチドである、 請求 項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩。
3 . ポリべプチドが配列番号： 1 0で表されるァミノ酸配列を有する、 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩。
4. ポリペプチドが配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有することを特徴とするポリペプチドである、 請求 項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩。
5 . ポリペプチドが配列番号： 1 9で表されるアミノ酸配列を有する、 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩。
6 . 請求項 1記載のポリペプチドをコードする D NAを含有する D NA。
7 . 配列番号： 9で表される塩基配列を含有する請求項 6記載の D NA。
8 . 配列番号： 2 2で表される塩基配列を含有する請求項 6記載の D NA。
9 . 請求項 6記載の D NAを含有する組換えベクター。
1 0 . 請求項 9記載の組換えべクタ一で形質転換された形質転換体。
1 1 . 請求項 1 0記載の形質転換体を培養し、 該ポリペプチドを生成せしめる ことを特徴とする請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエス テルまたはその塩の製造法。
1 2 . 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまた はその塩に対する抗体。
1 3 . 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまた はその塩を用いることを特徴とする請求項 1記載のポリぺプチドまたはその塩の 活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング方法。
1 4. 請求項 1記載のポリペプチドまたはその塩を含有してなる請求項 1記載 のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進 または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット。
1 5 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 4記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られる、 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはそ の塩。
1 6 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 4記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られる請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 も しくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその 塩を含有してなる医薬。
1 7 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 4記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られる請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 も しくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物またはその塩を含有し てなる腎障害、 腎炎、 腎症、 尿タンパク症、 神経障害またはビタミン B 1 2欠乏 症の予防 ·治療剤。
1 8 . 請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 4記載のスクリ一 ニング用キットを用いて得られる請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 も しくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物またはその塩を含有し てなる高脂血症、 高卜リグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞または狭心 症の予防 ·治療剤。
1 9 . 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまた はその塩を含有してなる医薬。
2 0 . 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまた はその塩を含有してなる糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症、 高トリグリセリ ド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症または神経障害の予防 •治療剤。
2 1 . 請求項 6記載の D NAを用いることを特徴とする診断剤。
2 2 . 請求項 1 2記載の抗体を含有してなる診断剤。
2 3 . 哺乳動物に対して、 請求項 1 3記載のスクリ一ニング方法または請求項 1 4記載のスクリーニング用キットを用いて得られる請求項 1記載のポリべプチ ド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進する化合物ま たはその塩を含有してなる腎障害、 腎炎、 腎症、 尿タンパク症、 神経障害または ビタミン B 1 2欠乏症の予防 ·治療方法。
2 4. 哺乳動物に対して、 請求項 1 3記載のスクリーニング方法または請求項 1 4記載のスクリーニング用キッ卜を用いて得られる請求項 1記載のポリべプチ ド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する化合物ま たはその塩の有効量を投与することを特徴とする高脂血症、 高トリグリセリド血 症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症、 食事後高脂血症、 糖尿病
、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞または狭心症の予防 ·治療方法。
2 5 . 高脂血症、 高卜リグリセリド血症、 低 HD L血症、 低ァポリポプロティ ン A— I血症、 食事後高脂血症、 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 心筋梗塞または狭 心症の予防 ·治療剤の製造のための、 請求項 1 3記載のスクリーニング方法また は請求項 1 4記載のスクリーニング用キットを用いて得られる請求項 1記載のポ リペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルまたはその塩の活性を阻害する 化合物またはその塩の使用。
2 6 . 哺乳動物に対して、 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしく はそのエステルまたはその塩の有効量を投与することを特徴とする糖尿病、 肥満 、 動脈硬化症、 高脂血症、 髙トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低ァポリポプ ロティン A— I血症または神経障害の予防 ·治療方法。
2 7 . 糖尿病、 肥満、 動脈硬化症、 高脂血症、 高トリグリセリド血症、 低 HD L血症、 低アポリポプロテイン A— I血症または神経障害の予防 ·治療剤の製造 のための、 請求項 1記載のポリペプチド、 そのアミド、 もしくはそのエステルま たはその塩の使用。
PCT/JP2001/005258 2000-06-22 2001-06-20 Nouveau polypeptide et son adn WO2001098341A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2001274563A AU2001274563A1 (en) 2000-06-22 2001-06-20 Novel polypeptide and its dna
EP01941118A EP1293510A4 (en) 2000-06-22 2001-06-20 POLYPEPTIDE AND ITS DNA
US10/297,895 US6992171B2 (en) 2000-06-22 2001-06-20 Polypeptide and its DNA
US11/189,301 US20050261192A1 (en) 2000-06-22 2005-07-26 Novel polypeptide and its DNA

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000188306 2000-06-22
JP2000-188306 2000-06-22
JP2001122125 2001-04-20
JP2001-122125 2001-04-20

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US11/189,301 Division US20050261192A1 (en) 2000-06-22 2005-07-26 Novel polypeptide and its DNA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2001098341A1 true WO2001098341A1 (fr) 2001-12-27

Family

ID=26594490

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/005258 WO2001098341A1 (fr) 2000-06-22 2001-06-20 Nouveau polypeptide et son adn

Country Status (4)

Country Link
US (2) US6992171B2 (ja)
EP (1) EP1293510A4 (ja)
AU (1) AU2001274563A1 (ja)
WO (1) WO2001098341A1 (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2150627B1 (en) 2007-05-09 2013-09-11 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Polymorphism in the apo (a) gene predict responsiveness to acetylsalicylic acid treatment
WO2011161017A1 (en) * 2010-06-22 2011-12-29 Jjk Medical Ltd. New medium, devices and methods
CN108866019A (zh) * 2018-07-18 2018-11-23 青岛农业大学 一种重组肺炎链球菌二氢叶酸还原酶的制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999037757A1 (en) * 1998-01-22 1999-07-29 Administrators Of The Tulane Educational Fund Cubilin protein, dna sequences encoding cubilin and uses thereof

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6806254B2 (en) * 2000-02-03 2004-10-19 Nuvelo, Inc. Methods and materials relating to alpha-2-macroglobulin-like polypeptides and polynucleotides
US6436703B1 (en) * 2000-03-31 2002-08-20 Hyseq, Inc. Nucleic acids and polypeptides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999037757A1 (en) * 1998-01-22 1999-07-29 Administrators Of The Tulane Educational Fund Cubilin protein, dna sequences encoding cubilin and uses thereof

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAMMAD S.M. ET AL.: "Cubulin, the endocytic receptor for intrinsic factor-vitamin B12 complex, mediates high-densitiy lipoprotein holoparticle endocytosis", PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 96, August 1999 (1999-08-01), pages 10158 - 10163, XP002946934 *
KOZYRAKI R. ET AL.: "The human intrinsic factor-vitamin B12 receptor, cubilin: molecular characterization and chromosomal mapping of the gene to 10p within the autosomal recessive megaloblastic menia(MGA1)region", BLOOD, vol. 91, no. 10, May 1998 (1998-05-01), pages 3593 - 3600, XP002946932 *
KRISTIANSEN M. ET AL.: "Molecular dissection of the intrinsic factor-vitamin B12 receptor, cubulin, discloses resions important for membrane association and ligand binding", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 29, July 1999 (1999-07-01), pages 20540 - 20544, XP002946935 *
MOESTRUP S. ET AL.: "The intrinsic factor-vitamin B12 receptor and target of teratogenic antibodies is a megalin-binding peripheral membrane protein with homology to deveropmental proteins", J. BIOL. CHEM., vol. 273, no. 9, February 1998 (1998-02-01), pages 5235 - 5242, XP002946933 *
See also references of EP1293510A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP1293510A4 (en) 2005-02-09
EP1293510A1 (en) 2003-03-19
US20050261192A1 (en) 2005-11-24
US20030176339A1 (en) 2003-09-18
US6992171B2 (en) 2006-01-31
AU2001274563A1 (en) 2002-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2347294A1 (en) Novel g protein coupled receptor protein, dna and its ligand
WO2001016309A1 (fr) Proteine recepteur couplee a une proteine g et adn correspondant
EP1234878A1 (en) Use of disease-associated gene
US20050261192A1 (en) Novel polypeptide and its DNA
JP2000050875A (ja) 新規ｇ蛋白質共役型レセプター蛋白質およびそのｄｎａ
WO2001059106A1 (fr) Nouvelles proteines receptrices couplees a des proteines g et adn associes
WO2002057441A1 (fr) Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g et adn de cette proteine
JP2003000261A (ja) 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
US20040101956A1 (en) Novel g protein-coupled receptor protein
JPH10324698A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2002233369A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2002223762A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2002233372A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JPH111497A (ja) 新規膜タンパク質およびそのｄｎａ
JP2003227822A (ja) 慢性閉塞性肺疾患の診断薬
EP1101821A1 (en) Novel protein and its dna
JP2003000266A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2002233371A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2002233376A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2003116584A (ja) 癌の予防・治療剤および診断剤
JP2002218981A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2002233375A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2002218984A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ
JP2003125788A (ja) 疾患関連遺伝子の用途
JP2002233377A (ja) 新規タンパク質およびそのｄｎａ

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ PL PT RO RU SD SE SG SI SK SL TJ TM TR TT TZ UA UG US UZ VN YU ZA ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001941118

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10297895

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001941118

Country of ref document: EP

REG Reference to national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: 8642

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: JP