WO2001091820A1 - Verfahren zur herstellung eines bioartifiziellen transplantates - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to a method for producing a bioartificial graft from a biological tissue intended for the transplantation and recipient-compatible cells applied thereon.
  • the invention relates to a method for the controlled cultivation of biological tissue.
  • transplant medicine there is a great need for suitable transplants that trigger the least possible adverse reactions of the transplant recipient. Only in certain cases is it possible to remove the transplant from the recipient's body and transplant it. From an immunological point of view, these transplants are the most harmless, but this possibility does not exist for certain vessels or organs or for larger areas of skin that can be replaced.
  • allogeneic transplants from other donors or - often in the orthopedic field - synthetic implants made of plastics, metals, ceramics etc. or various composites come into consideration.
  • allogeneic materials e.g. Donor organs need constant immunosuppression that is stressful for the recipient's organism. However, rejection reactions often occur as serious complications. Artificial materials can also lead to rejection reactions and inflammatory processes that destroy the result of the operation.
  • xenogenic material animal origin
  • the main advantage here is the better availability of this material compared to allogeneic (donor) materials.
  • Such a "biological material” is more flexible than an artificial material and in some places fits the recipient body better.
  • the xenogeneic transplant material is problematic because it is highly antigenic.
  • Chemically treated grafts of animal origin are used, for example, for heart valve replacement in humans.
  • the animal material is generally treated with glutaraldehyde in order to stabilize the structural proteins and to prevent an antigenic reaction.
  • glutaraldehyde is subject to constant hardening and progressive calcification after the transplant. These grafts must therefore be replaced every few years.
  • an exposed collagen matrix in the body is easily attacked by collagenases, so that damage can occur before re-colonization could take place in the body.
  • DE 19828726 A1 describes a method for producing a bioartificial graft, in which native cells on the interstitial connective tissue of the graft are first killed and then removed. The matrix is then repopulated with cells that are compatible with the recipient, preferably autologous, so that a recipient-specific biograft is obtained.
  • the invention is therefore based on the problem that a biological tissue selected for a transplant that is foreign to the transplant recipient, in particular an allogeneic or xenogeneic material, is to be transformed into a recipient-compatible, immunologically acceptable bioartificial transplant.
  • a method is to be created which produces mechanically more stable, more natural grafts.
  • the remodeling process is to be carried out with simultaneous stimulation and accelerate the natural reconstruction as controlled as possible.
  • the invention provides that in a method for producing a bioartificial graft from a biological tissue intended for the transplantation and recipient-compatible cells applied thereon,
  • a conditioning medium which comprise at least selected cells capable of remodeling the carrier structures
  • the treatment of the graft is continued until a substantial transformation of the original native tissue into a tissue essentially containing the recipient-specific cells has been achieved.
  • Cells capable of remodeling the support structures are understood to mean those which contribute to secreting new tissue matrix and preferably also clearing off dead cells. Depending on the type of tissue, this type includes different cells, e.g. Fibroblasts or connective tissue cells and their progenitor cells from preferably autologous stem cells.
  • the cells capable of remodeling include in the cardiovascular area e.g. the smooth muscle cells.
  • macrophages are also included, for example.
  • the cells mentioned promote and accelerate a tissue education; as a rule, they only enable the reshaping, since otherwise other processes (calcification, rejection) would "overtake” the tissue regeneration or tissue reshaping and would thus prevent it.
  • Tissue remodeling can also be stimulated by a targeted inflammatory stimulus that stimulates tissue healing processes.
  • the cells capable of remodeling can therefore also or partially be cells which can release inflammation mediators. Tissue healing then brings about an accelerated tissue remodeling.
  • the inflammation mediators can, however, also be added if other cells capable of remodeling are used. This then happens in particular for a limited time, so that a controllable inflammation process that stimulates healing is initiated.
  • the stem cells include: bone marrow cells, adipose-derived (mesenchymal) cells, tissue-specific stem cells, stem cells from peripheral blood, organ-specific stem cells and cells after autologous nuclear transfer, for example the body's own muscle cell nuclei in fibroblasts (with transdifferentiation).
  • the invention is based on the fundamentally new concept of controlled tissue regeneration in vitro.
  • the native cells of the tissue intended for transplantation are neither removed as usual, nor necessarily artificially killed. Rather, the tissue is subjected to an artificial "wound healing" in a suitable device, which can be a conventional colonization reactor; a stimulation stimulus is already exerted on newly growing cells primarily by tissue mediators.
  • a tissue in its native state is understood to mean a tissue as prepared, ie taken from the xenogeneic or allogeneic donor.
  • the cells present in the tissue which they find in a state of death after preparation or removal are not removed in separate process steps prior to further treatment.
  • the originally foreign graft is gradually transformed during the treatment phase into a bioartificial graft that is completely immune to the recipient.
  • the invention is based on the knowledge that the removal or even aggressive killing of the original native cells of a foreign allogeneic or xenogeneic tissue has made resettlement difficult, in particular also because an stimulus emanating from these cells is natural for every body ongoing cell renewal is lost. In particular, this removed important key factors for the matrix conversion that was ultimately required and for efficient matrix re-synthesis.
  • the recipient-compatible cells at least also include selected cells capable of remodeling the carrier structures, for example connective tissue cells or fibroblasts.
  • other recipient-compatible cells at least also include selected cells capable of remodeling the carrier structures, for example connective tissue cells or fibroblasts.
  • Cells are present. The person skilled in the art can select the cells to be used in accordance with the information and explanations given above to match the type of tissue to be transformed.
  • the rejection and calcification of the transplanted tissue or organ can be avoided by the method according to the invention, since remodeling in vitro is already carried out before the transplantation, in which the tissue intended for the transplantation is largely remodeled.
  • the recipient-specific cells used within the method also include cells capable of remodeling.
  • These include the fibroblasts, which can be caused by environmental stimuli to secrete new matrix and promote the removal of old cells.
  • Other cell types can also be used - mixed with the fibroblasts, in different layers or areas of the tissue.
  • the recipient-compatible cells are grown once at the beginning of the culture, i.e. treatment of the graft, multiple times at intervals or continuously within the medium.
  • the recipient-compatible cells can be dropped or spread onto the native tissue to be transformed, or can be supplied continuously or in batches with the conditioning medium.
  • the recipient-compatible or recipient-specific cells to be delivered to the graft to be transformed can be mixed with a biocompatible adhesive, which in particular may contain fibrin, collagen adhesive proteins from mussels or synthetic adhesive proteins, or in a culture medium suspension.
  • the treatment of the graft can be carried out with repeated exchange or with continuous passage of the medium, which can be a conventional culture medium.
  • the reshaping is preferably supported mechanically by moving the culture medium washing around the tissue and by a liquid flow for the transport of new recipient-compatible cells which flushes away / replaced cells during the reshaping.
  • the tissue can be rinsed in between - once or at intervals - which creates a mechanical stimulus that promotes the detachment of cells to be replaced.
  • the treatment of the transplant with the recipient-compatible cells in the conditioning medium is continued with repeated exchange or with continuous flow of the medium until extensive conversion of the original native tissue into such tissue has taken place essentially only has the recipient-specific cells used for colonization.
  • a conventional cell culture nutrient medium can be used as the conditioning medium, which can optionally be provided with various additives. Nutrient media suitable for this are known to the person skilled in the art. Receiver-specific cells are introduced into the conditioning medium, either continuously or in multiple batches.
  • Recipient-specific cells are understood to mean autologous or immunologically compatible or compatible cells for the recipient. Different types of cells can also be abandoned at different times of colonization or treatment, so that different cell layers of different types of cells can build up on the tissue. Mixtures of different cells can also be offered to the tissue. Furthermore, locally different cells can be applied, for example different cells on the top and bottom of a skin graft or different cells on the inside and the outside of a tubular vessel.
  • Body cells for example - depending on the underlying substrate - also the ones described below in question:
  • Connective tissue cells including fibroblasts, fibrocytes), muscle cells (myocytes), endothelial cells, skin cells (including keratinocytes), cells differentiated to organ cells (cardiac cells, kidney cells, etc.), preferably in structured organs with a collagen structure, generally all cells that are necessary for the conversion of a particular one , meaningful tissue for the implantation may be offered.
  • the precursor cells are also suitable, preferably from autologous stem cells of the recipient.
  • the stem cells include those already mentioned above.
  • the tissue to be reshaped or the graft which is initially in its native state, as removed, and then reshaped in the course of the method, can in principle be any transplantable tissue.
  • these include: general vessels, aortas, veins, aortic valves, heart valves, organ parts and whole organs, skin pieces, tendons, cornea, cartilage, bones, larynx, heart, trachea, nerves, miniscus, intervertebral disk, ureters, urethra, bladder , Inner ear bones, ear and nasal cartilage, articular cartilage, connective tissue, fatty tissue, glandular tissue, nerves, muscles, etc.
  • the recipient-compatible, preferably autologous or genetically modified, and thereby recipient-specific made allogeneic or xenogeneic cells include cells that are suitable for the construction of the desired tissue, and optionally also those that stimulate tissue reorganization and / or can control, such as cells producing cellular factors and / or chemotactically influencing cells, especially cells from the leukocyte family (lymphocytes, thrombocytes, macrophages, mast cells, granulocytes, such as all forms of white blood cells), Granulocytes, lymphocytes, macrophages, monocytes, bone marrow cells, spleen cells, memory cells, thymus cells and peripheral or central stem cells (from blood and bone marrow) or stem cells from adipose tissue, preferably pluripotent stem cells.
  • leukocyte family lymphocytes, thrombocytes, macrophages, mast cells, granulocytes, such as all forms of white blood cells
  • Fibroblasts or myofibroblasts, muscle cells and / or endothelial cells are preferably used for heart valves, keratinocytes, cells of mesodermal origin (mesodermal cells) and, if necessary, skin appendages for skin grafts.
  • an important aspect of the invention is that the ideally autologous fibroblasts can mutate from a dormant to an activated phenotype due to the signaling effect of the donor cells that initially remain but die in vitro.
  • This has considerable consequences for the gene expression of the recipient-specific or compatible cells, which are also obtained from healthy tissue in a dormant phenotype.
  • a “disease state” and thus subsequently a “healing state” is then induced in vitro.
  • Cooperation with ideally recipient-specific or recipient-specific helper cells can have a reinforcing and permissive effect.
  • the recipient-compatible cells that are used for tissue remodeling therefore preferably also include macrophages, but also blood platelets and immune-competent cells such as lymphocytes.
  • a major advantage of the invention results from the fact that implantations can take place more quickly.
  • the foreign cells were first removed.
  • the matrix was weakened considerably mechanically. It was then repopulated, which took at least 24 to 96 hours.
  • the stability of the matrix gradually decreased during the resettlement, but finally only up to approx. 70 - 80% of the initial value (e.g. measured by tensile load).
  • the method according to the invention enables tissue remodeling within approximately 4 days (3 to 6 days), the mechanical stability remaining approximately unchanged over the entire period. Since the tissue already corresponds to a physiological stability and resilience initially, the risk of Ruptures significantly in the first time after implantation.
  • the remodeling is continued in vivo in the body (after the implantation).
  • the autologous, allogeneic or xenogeneic tissue intended for transplantation which is in native form, should be sterilized. This has to be done especially with xenogenic tissues, since it should definitely be ruled out that foreign viruses and bacteria are also included in the freshly produced bioartificial graft. Disease transmission should also be excluded with allogeneic starting tissues. Only in exceptional cases should it be possible to reshape autologous tissue for other purposes. Sterilization also makes sense here, but it should be less expensive.
  • a tissue in native form is understood to mean a tissue which has been left essentially as it was removed.
  • native means natural, unchanged, undenatured.
  • the tissue When entering the treatment phase with the recipient-compatible cells, the tissue should still carry its native cells so that the endogenous stimulus can be used for the remodeling of the tissue.
  • these cells are generally already in the state of the onset of death due to the time elapsed for preparation and, if appropriate, transport. Sterilization should be carried out as gently as possible.
  • it can be rinsed with a sterilizing solution, for example, or it can be sterilized with a gas (fumigation).
  • the success of the sterilization can be specifically checked by, for example, after the sterilization for the presence of certain viruses or bacteria which are to be strictly prevented.
  • the tissue intended for the transplant can be subjected to additional non-denaturing process steps, for example rinsing, before any sterilization that may be required.
  • additional non-denaturing process steps for example rinsing, before any sterilization that may be required.
  • a gentle freezing of the native graft tissue is also possible, as far as more profound tissue changes are avoided.
  • additional cellular mediators and / or factors or chemical mediators are added to the conditioning medium during the treatment with recipient-compatible cells or afterwards.
  • the effect of certain factors has already been investigated, so that the person skilled in the art can specifically select and use line growth factors, cell-differentiating factors, chemotactic factors and others.
  • Neuropeptides These can have the ability to activate mesenchymal cells.
  • Suitable neuropeptides include: Neurokinin (Neurokinin A (NKA)), substance P (SP), vasoactive intestinal peptide (VIP), calcitonin-gene-related peptide (CGRP) );
  • fibronectin (Fn) cytokines, such as interleukin-1-beta (IL-1 beta), interleukin 6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8), interferons such as interferon-gamma (IFN-gamma), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (granulocyte-macrophage colony stimulation factor (GM-CSF)), transformation Growth factor beta 1 (transforming growth factor - beta 1 (TGF-beta 1)), osteogenic protein-1 (osteogenic protein-1 (OP-1)), recombinant
  • fibroblast growth factor fibroblast growth factor
  • ECGF endothelial cell growth factor
  • glycoproteins such as alpha-2-macroglobulin (alpha-2M), clara cell protein (CC-16), platelet factor 4, beta-tlromboglobulin, neutrophil-activating paptid-1 , further also synthetic mediators, such as mannose-6-phosphate, adaptile and others.
  • the method is carried out in such a way that immune-competent cells, in particular macrophages, which release cellular mediators and / or factors to the conditioning medium are fed to the conditioning medium and / or tissue.
  • the conditioning medium can be autologous, i.e. recipient's own blood, temporarily enriched with it or temporarily replaced by blood. This allows macrophages from the blood to selectively adhere to the tissue.
  • the macrophages receive immunostimulatory stimuli from the tissue that has not yet or only incompletely transformed, thereby releasing cell-type-specific mediators that accelerate the remodeling. Platelets, for example, lyse and release growth factors.
  • the tissue remodeling is stimulated, controlled and accelerated.
  • the method is to be carried out in such a way that cellular mediators and / or factors are released or transferred to the conditioning medium from a culture of immunocompetent cells, in particular a macrophage culture.
  • This culture can also contain lymphocytes or platelets.
  • Stem cells can also be added here.
  • Macrophage culture can take place in a bioreactor which is connected in a suitable manner to the reactor in which the bioartificial graft is prepared and treated. Factors removed from the bioreactor can be added to the circulating or batchwise conditioning culture medium in a suitable amount.
  • pressure- and load-dependent remodeling e.g. through pulsatile perfusion operation, for example in vessels and heart valves, which has a very positive effect on the resemblance to nature of the remodeled tissue. It improves the expression of the bioartificial tissue in vitro in accordance with normal physiology.
  • the macrophage culture, or the culture of other immune-competent cells can be kept separate from the conditioning medium during the steps of treatment with recipient-compatible cells by means of a film, membrane or partition wall which is permeable to the cellular mediators and / or factors, and the Mediators and / or factors formed can be continuously released into the conditioning medium.
  • the tissue intended for transplantation will generally be treated in a bioreactor in which the culture medium is kept within a certain space and, if necessary, circulated. Within this space, a culture space for the culture of the immunocompetent cells or macrophages can be formed with a permeable partition, so that the cellular mediators and / or factors formed can constantly migrate into the conditioning medium. AI Alternatively, the immunocompetent cells can also be cultured separately and the cell culture products can be fed to the bioreactor that is used for tissue culture.
  • the product ie the organ or the tissue in general
  • the product can be perfused or co-incubated for conditioning purposes with or with the addition of recipient-specific whole blood or individual blood components (proteins, fibronectin, thrombin, fibrinogen, plasma, serum, cellular components).
  • recipient-specific whole blood or individual blood components proteins, fibronectin, thrombin, fibrinogen, plasma, serum, cellular components.
  • the following can be used as immune-competent cells:
  • the co-culture of immunocompetent cells which produce mediators, factors, co-factors and release them to the conditioning medium, is particularly advantageous, since mediators / factors that are particularly suitable for the respective purpose can also be produced during a culture step that is required anyway, so that the Use of additional expensive and less specific factors can be dispensed with.
  • Cryopreserved allogeneic veins are sterile placed in a bioreactor without further treatment and perfused with ideally serum-free or autologous serum / plasma enriched medium.
  • Pre-expanded autologous arterial fibroblasts and smooth muscle cells are attached to the outside of the previously cryopreserved vein. This is done here by applying in an (autologous) fibrin gel, collagen gel, in synthetic glue proteins from mussels by dropping or spreading on the cells mixed with the glue before cultivation or by dropping or spreading on a cell suspension in medium.
  • Endothelial cells (optional after a pre-colonization with myofibroblasts) are applied within the vascular lumen.
  • a bioreactor being any suitable device.
  • the fibroblasts are stimulated by the cell detritus of the dead cells to synthesize new matrix, to build up new tissue structures and to integrate more intensely into the tissue / matrix.
  • a multi-layer muscle cell coat develops within a few days.
  • the arterialized (remodeled) vessel is therefore very quickly ready for transplantation without loss of stability (as is usually the case after the cellularization up to ⁇ 20% initial strength).
  • Xenogenic arteries are colonized without any cellularization with autologous arterial vascular cells in analogy to the first example, but still without endothelial cells.
  • the chimeric construct (transformed tissue) is flushed with autologous blood.
  • macrophages selectively adhere to the exposed matrix.
  • Lymphocytes receive immunostimulatory stimuli through the xenogeneic matrix. Platelets lyse and release growth factors such as PDGF.
  • the autologous blood is replaced with plasma-enriched culture medium and re-cultivated for several days (approx. 3-10).
  • platelet preparations obtained at approx. 3000 g and white blood cells (1800 g) can be co-cultivated separately in different areas of the bioreactor or synchronously in a separate apparatus. In the latter case, the culture products obtained in this way become the tissue culture in the actual tissue bioreactor fed.

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Abstract

Bei dem Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplantates aus einem für die Transplantation vorgesehenen biologischen Gewebe und darauf aufgebrachten empfängerverträglichen Zellen wird eine kontrollierte Geweberegeneration in vitro durchgeführt, indem ausgewählte zu einem Remodelling der Trägerstrukturen befähigte Zellen einem nativen in Kultur befindlichen Gewebe zugeführt werden und die Kultur fortgeführt wird bis ein im wesentlichen umgebildetes, die zugeführten empfängerverträglichen Zellen aufweisendes, neues Gewebe entstanden ist.

Description

Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplantates
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplantates aus einem für die Transplantation vorgesehenen biologischen Gewebe und darauf aufgebrachten empfängervertäglichen Zellen.
Allgemein betrifft die Erfindung ein Verfahren zur kontrollierten Züchtung von biologischem Gewebe.
In der Transplantationsmedizin besteht ein großes Bedürfnis nach geeigneten, in möglichst geringem Maße adverse Reaktionen des Transplantat-Empfängers auslösenden Transplantaten. Nur in bestimmten Fällen ist es möglich, das Transplantat aus dem Körper des Empfängers selbst zu entnehmen und zu verpflanzen. Aus immunologischer Sicht sind diese Transplantationen am un- bedenklichsten, bei bestimmten Gefäßen oder Organen sowie bei größeren zu ersetzenden Hautbereichen besteht diese Möglichkeit jedoch nicht. Für bestimmte Organe kommen heute praktisch nur allogene Transplantate fremder Spender oder - vielfach im orthopädischen Bereich - synthetische Implantate aus Kunst- Stoffen, Metallen, Keramik usw. bzw. verschiedenen Verbundstoffen in Betracht. Bei der Verwendung allogener Materialien, wie z.B. Spenderorganen ist eine ständige für den Organismus des Empfängers belastende Immunsuppression nötig. Dennoch kommt es häufig zu Abstoßungsreaktionen als ernsten Komplika- tionen. Auch künstliche Materialien können zu Abstoßungsreaktionen und entzündlichen Prozessen führen, die das Operationsergebnis zunichte machen.
Aus verschiedenen Gründen wird heute oft versucht, xenogenes Material (tierischen Urprungs) zu verwenden. Vorteilhaft ist hierbei vor allem die bessere Verfügbarkeit dieses Materials gegenüber allogenen (Spender-) Materialien. Auch ist ein solches "biologisches Material" flexibler als ein künstliches Ma terial und paßt sich an manchen Stellen dem Empfängerkörper besser an. Das xenogene Transplantationsmaterial ist jedoch deshalb problematisch, da es stark antigen ist.
Es wird daher seit längerer Zeit versucht, xenogene Transplan- tationsmaterialien - speziell verschiedene für eine Transplantation vorgesehene Gewebe - empfängerverträglich zu machen. Hierzu wird in der Regel versucht, innerhalb oder auf der strukurgebenden Bindegewebsmatrix des xenogenen Transplantats eingebettete native Zellen abzutöten oder zu entfernen sowie Fremdproteine und andere Fremdsubstanzen auszuspülen. Die strukturgebende Matrix aus interstitiellem Bindegewebe kann als eine immunologisch weitgehend neutrale Matrix angesehen werden.
Chemisch behandelte Transplantate tierischer Herkunft werden beispielsweise für den Herzklappenersatz bei Menschen verwendet. Das tierische Material wird dabei im allgemeinen mit Glutaraldehyd behandelt, um die Strukturproteine zu stabilisieren und eine antigene Reaktion zu verhindern. Das mit Glut- araldehyd behandelte Gewebe unterliegt jedoch einer stetigen Verhärtung und fortschreitenden Calzifizierung nach der Transplantation. Diese Transplantate müssen daher alle paar Jahre ersetzt werden.
Ersatzweise wurde auch bereits versucht, eine azellularisierte und hierdurch "neutralisierte" freiliegende Collagenmatrix zu transplantieren, was jedoch, wie sich zeigte, ebenfalls Probleme mit sich bringt. Die azellularisierte Collagenmatrix ist durch den Azellularisierungsvorgang stark aufgelockert und me- chanisch instabil. Ein schwerwiegender Nachteil der Destabili- sierung ist die Gefahr von Initialversagen nach Implantation
im Körper durch Ruptur. Dies trat bei Tiermodellen in 20 % der Fälle auf (azellularisierte Schweineherzklappen, rebesiedelt mit autologen Zellen im Niederdruckkreislauf, Pulmonalpositi- on) .
Zusätzlich wird eine freiliegende Collagenmatrix im Körper durch Collagenasen leicht angegriffen, so dass es zu Schädigungen kommen kann, bevor eine Re-Besiedlung im Körper stattfinden könnte.
Es ist daher ebenfalls versucht worden für eine Transplantati- on vorgesehene azellularisierte biologische Gewebe vor der Transplantation bereits mit autologen oder allogenen Zellen wiederzubesiedeln. In der DE 19828726 AI wird beispielsweise ein Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplantats beschrieben, bei dem zunächst native Zellen auf dem interstitiellen Bindegewebe des Transplantats abgetötet und dann entfernt werden. Die Matrix wird danach mit für den Empfänger verträglichen, vorzugsweise autologen Zellen neu besiedelt, so daß ein empfängerspezifisches Biotransplantat erhalten wird.
Hierbei ist bereits sehr vorteilhaft, dass antigene Komponenten weitgehend entfernt oder abgeschirmt sind. Das auf diese Weise erhaltene bioartifizielle Transplantat besitzt jedoch noch nicht die geforderten "natürlichen" Eigenschaften. Das Anwachsen der Zellen auf der azellularisierten aufgelockerten Matrix ist erschwert. Durch eine selbst geringe, Veränderung der Matrixstruktur wird auch kein vollkommen natürlicher Wiederaufbau der Zellen erhalten. Es bestehen auch noch erhebliche Probleme, das erforderliche Anwachsen verschieden diffe- renzierter Zellen an den jeweils erforderlichen Orten zu steuern. Aus der US PS 5192312 (Orton) ist bereits ein Besiedlungsverfahren bekannt, bei welchem eine implantierbare menschliche Herzklappe mit Fibroblasten-Wachstumsfaktor behandelt und danach mit einer solchen Menge Fibroblasten besiedelt wird, von der vermutet wird, das Implantat nicht-immunogen zu machen. Die Vorbereitung mit Wachstumsf ktoren behindert dieses Ziel, da eine primäre Maskierung mit exogenem Wachstumsfaktor zu funktioneilen Veränderungen der aufzubringenden Zellen und einer exogen induzierten Verschiebung in einen proliferatori- sehen Phänotypus führen kann. Die exogene Zugabe von Wachstumsfaktoren führt zu internen Konkurrenzmechanismen in der Signalkommunkation, die letztendlich dazu führen, dass zwar viele Zellen entstehen, diese jedoch durch den Wachstumsfaktor nicht in der Lage sind, notwendige Remodellingprozesse einzu- leiten. Die rasche Fertigstellung eines autologisierten Implantats hinsichtlich der Stützstrukturen wird hierdurch bereits in vitro verhindert. Eine Nachwirkung in vivo ist wahrscheinlich, da transformierte Zellen entstehen können. Dies hat weitere erhebliche Konsequenzen nach der Implantation in vivo, da allogene und xenogene Matrices immunogene Restwirkungen haben, die zu inflammatorisehen Reaktionen und der Ausbildung von Verkalkungsfoci und damit zu langfristigen Transplantatversagen führen.
Der Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, dass ein für eine Transplantation ausgewähltes für den Transplantations- Empfänger fremdes biologisches Gewebe, insbesondere ein allo- genes oder xenogenes Material, zu einem empfängervertäglichen immunologisch aktzeptablen bioartifiziellen Transplantat umge- formt werden soll.
Weiterhin soll ein Verfahren geschaffen werden, das mechanisch stabilere, naturähnlichere Transplantate erzeugt. Der Umbil- dungsprozess soll bei gleichzeitiger Stimulierung und Be- schleunigung des natürlichen Umbaus möglichst kontrolliert ablaufen.
Zur Lösung dieses Problems ist erfindungsgemäß vorgesehen, dass bei einem Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplantates aus einem für die Transplantation vorgesehenen biologischen Gewebe und darauf aufgebrachten empfänger- verträglichen Zellen,
einem für die Transplantation vorgesehenen autologen, alloge nen oder xenogenen, in nativer Form vorliegenden und nicht mit exogenen Wachstumsfaktoren vorbehandelten Gewebe in einem konditionierenden Medium empfängerverträgliche Zellen zugeführt werden, die wenigstens ausgewählte zu einem Remo- delling der Trägerstrukturen befähigte Zellen umfassen,
die Behandlung des Transplantats fortgesetzt wird bis eine weitgehende Umbildung des ursprünglichen nativen Gewebes in ein im wesentlichen die zugeführten empfängerspezifischen Zellen aufweisendes Gewebe erzielt worden ist.
Unter "zu einem Remodelling der Trägerstrukturen befähigten Zellen" werden solche verstanden, die dazu beitragen, neue Gewebematrix zu sezernieren und vorzugsweise auch abgestorbene Zellen abzuräumen. Zu diesem Typus gehören je nach Gewebeart verschiedene Zellen, z.B. Fibroblasten bzw. Bindegewebszellen sowie deren Vorlauferzellen aus bevorzugt autologen Stammzellen.
Zu den zum Remodelling befähigten Zellen gehören im cardiovas- kulären Bereich z.B. die glatten Muskelzellen. Allgemein zählen beispielsweise auch Makrophagen hinzu.
Die genannten Zellen fördern und Beschleunigen eine Gewebeum- bildung; in der Regel ermöglichen sie die Umbildung dadurch erst, da anderenfalls andere Prozesse (Calzifizierung, Abstoßung) die Geweberegeneration oder Gewebeumbildung zeitlich "überholen" und auf diese Weise verhindern würden.
Die Anregung zur Gewebeumbildung kann auch durch einen gezielten Entzündungsreiz erfolgen, der Vorgänge zur Gewebeheilung stimuliert. Bei den zum Remodelling befähigten Zellen kann es sich daher auch oder teilweise um Zellen handeln, die Entzün- dungsmediatoren freisetzen können. Die Gewebeheilung bringt dann eine beschleunigte Gewebeumbildung mit sich. Die Entzündungsmediatoren können jedoch auch bei Verwendung anderer zum Remodelling befähigter Zellen zusätzlich zugeführt werden. Dies geschieht dann insbesondere zeitlich begrenzt, so dass ein kontrollierbarer heilungsstimulierender Entzundungsprozess eingeleitet wird.
Zu den Stammzellen werden gerechnet: Knochenmarkszellen, aus Fettgewebe stammende (mesenchymale) Zellen, gewebespezifische Stammzellen, Stammzellen aus peripherem Blut, organspezifische Stammzellen sowie Zellen nach autologem Kerntransfer, beispielsweise körpereigene Muskelzellkerne in Fibroblasten (mit erfolgender Transdifferenzierung) .
Der Erfindung liegt das grundlegend neue Konzept einer kontrollierten Geweberegeneration in vitro zugrunde. Anders als bei den bisher angewendeten Verfahren werden die nativen Zellen des zur Transplantation vorgesehenen Gewebes weder wie bisher üblich entfernt noch notwendigerweise künstlich abgetö- tet. Das Gewebe wird vielmehr in einer geeigneten Vorrichtung, die ein üblicher Besiedlungsreaktor sein kann, einer künstlichen "Wundheilung" unterzogen; dabei wird bereits primär durch gewebeeigene Mediatoren, ein Stimulationsreiz auf neu anwachsenden Zellen ausgeübt. Unter einem Gewebe in nativem Zustand wird ein Gewebe wie präpariert, d.h. dem xenogenen oder allogenen Spender entnommen, verstanden. Die in dem Gewebe vorhandenen Zellen, die sie ab Präparation oder Entnahme in einem Zustand des Absterbens be- finden, werden entsprechend den Prinzipien dieser Erfindung nicht vor der Weiterbehandlung in gesonderten Verfahrens- schritten entfernt.
Durch die Zuführung von für den Empfänger verträglichen und zu der Gewebeart passenden Zellen wird das ursprünglich fremde Transplantat während der Behandlungsphase allmählich zu einem für den Empfänger völlig immunverträglichen bioartifiziellen Transplantat umgebildet.
Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass das Entfernen oder auch aggressive Abtöten der ursprünglichen nativen Zellen eines fremden allogenen oder xenogenen Gewebes die Wiederbesiedlung erschwert hat, und zwar insbesondere auch deshalb, weil ein von diesen Zellen ausgehender Reiz für die na- türliche in jedem Körper vor sich gehende ständige Zellerneuerung verloren geht. Insbesondere wurden dadurch wichtige Schüsselfaktoren für den letztendlich erforderlichen Matrixumbau sowie für eine effiziente Matrixneusynthese entfernt.
Zusätzlich bewirkte die Azellularisierung eine erhebliche
DeStabilisierung, die hinsichtlich einer klinisch erforderlichen guten Initialstabilität für Implantationszwecke jedoch dringend erforderlich ist. Die Erfindung löst diese Probleme.
Solange das fremde, noch mit nativen Zellen besiedelte xenogene oder allogene für die Transplantation vorgesehene Gewebe in seinem nativen Zustand belassen wird, werden bei Kultur bzw. Inkubation des Gewebes in einer beispielsweise aus Nährmedium bestehenden konditionierenden Umgebung durch Zellen des umzu- bildenden Gewebes zelluläre Mediatoren freigesetzt, die einen natürlichen Umbau begünstigen (endogener Stimulus) . Die Mediatoren verteilen sich auf bestimmten Wegen innerhalb des Gewebes und wandern zum geringen Teil in das konditionierende Me- dium aus . Werden nun während der Kultur des für die Transplantation vorgesehen Gewebes, das noch mit seinen nativen Zellen ausgestattet ist, in dem konditionierenden Medium schubweise oder laufend neue empfängerverträgliche Zellen zugeführt, werden diese in den Umbildungsprozeß miteinbezogen und ersetzen mit der Zeit die nativen Zellen, die bei Austausch des konditionierenden Mediums allmählich mit abgeführt werden. Dabei ist es wesentlich, dass die empfängerverträglichen Zellen ausgewählte zu einem Remodelling der Trägerstrukturen befähigte Zellen, z.B. Bindegewebszellen oder Fibroblasten, zumindest mit umfassen. Daneben können weitere empfängerverträgliche
Zellen vorhanden sein. Die jeweils zu verwendenen Zellen kann der Fachmann entsprechend den oben gemachten Angaben und Erläuterungen passend zu dem umzubildenden Gewebetyp auswählen.
Grundsätzlich ist es nämlich bekannt, dass natürliche - auch nicht-azellularisierte, beispielsweise nicht-denaturierte allogene Transplantate an ihrer Oberfläche mit Endothelzellen besiedelt werden können. Dies geschieht auch nach der Transplantation spontan in vivo, wenn sich im Körper Endothelzellen auf ein allogenes oder xenogenes Transplantat aufsiedeln. Eine solche Endothelialisierung führt jedoch nicht zu einer wirklichen Umbildung bzw. einem "Remodelling" des Transplantatgewebes. Durch immunologische Prozesse setzen recht bald an dem fremden (und fremd bleibenden) Gewebe von einzelnen Focuspunk- ten (Verkalkungsfoci) ausgehende Verkalkungsprozesse ein. Das transplantierte Gewebe oder Organ wird dabei im Laufe der Zeit immer stärker geschädigt und schließlich funktionsuntüchtig.
Tierversuche zeigen, dass beispielsweise Herzklappen bereits innerhalb von 24 bis 48 Stunden spontan endothelialisieren.
Dabei wird jedoch das Gewebe nicht umgebaut sondern verdichtet. Die Endothelzellen verbleiben physiologischerweise an der Oberfläche. Wie L. Maxwell, J.B. Gavin, B.G. Barratt-Boyes, in "Differences between heart valve allografts and xenografts in the incidence and Initiation of dystrophic calcification" , Pa- thology (1989, 21, 5-10) untersucht haben, führt die Anwesenheit restlicher Spenderzellen zu Kalzifizierungsnestern, die letztendlich ein Klappenversagen bewirken.
Die Abstoßung und Verkalkung des transplantierten Gewebes bzw. Organs kann durch das erfindungsgemäße Verfahren vermieden werden, da bereits vor der Transplantation ein Remodelling in vitro durchgeführt wird, bei dem das für die Transplantation vorgesehene Gewebe weitgehend umgebaut wird.
Hierfür ist es notwendig, dass die innerhalb des Verfahrens verwendeten empfängerspezifischen Zellen zu einem Remodelling befähigte Zellen mit umfassen. Zu diesen gehören u.a. die Fi- broblasten, die durch Umgebungsreize dazu veranlasst werden können, neue Matrix zu sezernieren und die Entfernung alter Zellen zu fördern. Andere Zelltypen können zusätzlich - gemischt mit den Fibroblasten, in verschiedenen Schichten oder Bereichen des Gewebes - verwendet werden.
Vorzugsweise werden die empfängerverträglichen Zellen einmalig zu Beginn der Kultur, d.h. der Behandlung des Transplantats, mehrfach in Intervallen oder kontinuierlich innerhalb des Mediums zugeführt .
Dabei können die empfängerverträglichen Zellen auf das umzubildende native Gewebe aufgetropft oder aufgestrichen, oder kontinuierlich oder schubweise mit dem konditionierenden Medium zugeführt werden. Die dem umzubildenden Transplantat zuzuführenden empfängerver- sträglichen bzw. empfängerspezifischen Zellen können in bestimmten Ausführungsformen vermischt mit einem biologisch verträglichen Kleber, der insbesondere Fibrin, Kollagen Kleber- proteine aus Muscheln oder synthetische Kleberproteine enthalten kann, oder in einer Kulturmedium-Suspension aufgegeben werde .
Die Behandlung des Transplantats kann unter mehrmaligem Aus- tausch oder bei kontinuierlichem Durchlauf des Mediums, das ein übliches Kulturmedium sein kann, durchgeführt werden.
Die Umbildung wird vorzugsweise mechanisch dadurch unterstützt, dass das das Gewebe umspülende Kulturmedium bewegt wird und ein Flüssigkeitsstrom für das Antransportieren neuer empfängerverträglicher Zellen vorhanden ist, der bei der Umbildung abgestoßene/ersetzte Zellen mit fortspült. Das Gewebe kann zwischendurch - einmalig oder in Intervallen - gespült werden, wodurch ein mechanischer Reiz ausgeübt wird, der die Ablösung zu ersetzender Zellen begünstigt.
Wesentlich für die Erfindung ist daher, dass die Behandlung des Transplantates mit den empfängerverträglichen Zellen in dem konditionierenden Medium unter mehrmaligem Austausch oder bei kontinuierlichem Durchfluß des Mediums so lange fortgesetzt wird, bis ein weitgehender Umbau des ursprünglichen nativen Gewebes in ein solches Gewebe erfolgt ist, das im wesentlichen nur die zur Besiedlung verwendeten empfängerspezifischen Zellen aufweist.
Die Behandlung des nativen Gewebes in dem konditionierenden Medium mit empfängerverträglichen Zellen, wobei das konditio- nierende Medium entweder kontinuierlich umgewälzt oder mehrmals ausgetauscht wird, entspricht einer an sich bekannten Be- Siedlung einer unterliegenden Matrix mit Zellen, wie sie im
Stande der Technik bekannt ist und in verschiedenen Varianten durchgeführt werden kann.
Als konditionierendes Medium kann ein übliches Zellkultur- Nährmedium verwendet werden, das ggf. mit verschiedenen Zusätzen versehen sein kann. Hierfür geeignete Nährmedien sind dem Fachmann bekannt. In das konditionierende Medium werden empfängerspezifische Zellen eingebracht, entweder kontinuierlich oder in mehreren Schüben.
Unter empfängerspezifischen Zellen werden für den Empfänger autologe oder immunologisch kompatible bzw. verträgliche Zellen verstanden. Es können auch zu unterschiedlichen Besied- lungs- bzw. Behandlungszeitpunkten verschiedene Arten von Zellen aufgegeben werden, so dass sich auf dem Gewebe unterschiedliche Zellschichten aus verschiedenartigen Zellen aufbauen können. Ferner können dem Gewebe Mischungen unterschiedlicher Zellen angeboten werden. Weiterhin können örtlich ver- schiedene Zellen aufgebracht werden, beispielsweise auf der Oberseite und der Unterseite eines Hauttransplantats unterschiedliche Zellen oder auf der Innenseite und der Außenseite eines röhrenförmigen Gefäßes unterschiedliche Zellen.
Als empfängerverträgliche Zellen kommen grundsätzlich alle
Körperzellen, beispielsweise - je nach dem unterliegenden Substrat - auch die nachfolgend beschriebenen in Frage :
Bindegewebszellen (u.a.Fibroblasten, Fibrozyten) , Muskelzellen (Myozyten) , Endothelzellen, Hautzellen (u.a. Keratinozyten) , zu Organzellen differenzierte Zellen (Herzzellen, Nierenzellen, usw.), vorzugsweise bei strukturierten Organen mit Kollagengerüst, allgemein alle Zellen, die für den Umbau eines bestimmten, für die Implantation vorgesehenen Gewebes sinnvol- lerweise angeboten werden können. Geeignet sind auch die Vorläuferzellen, bevorzugt aus autologen Stammzellen des Empfängers. Zu den Stammzellen gehören die oben bereits genannten.
Bei dem umzubildenden Gewebe bzw. dem Transplantat, das zunächst in nativem Zustand, wie entnommen, vorliegt und dann im Laufe des Verfahrens umgebildet wird, kann es sich grundsätzlich um jedes transplantierbare Gewebe handeln. Insbesondere zählen hierzu: allgemein Gefäße, Aorten, Venen, Aortenklappen, Herzklappen, Organteile und ganze Organe, Hautstücke, Sehnen, Cornea, Knorpel, Knochen, Larynx, Herz, Trachea, Nerven, Mi- niskus, Diskus intervertebralis, Ureteren, Urethra, Blase, Innenohrknöchelchen, Ohr- und Nasenknorpel, Gelenkknorpel, Bindegewebe, Fettgewebe, Drüsengewebe, Nerven, Muskeln u.a.m.
Für den Umbau des Gewebes mit Hilfe von empfängerverträglichen Zellen werden jeweils Zellen oder Gemische von Zellen ausgewählt, die zu dem jeweiligen Gewebetyp passen. Die empfängerverträglichen, vorzugsweise autologen oder genetisch modifi- zierten und hierdurch empfängerspezifisch gemachten allogenen oder xenogenen Zellen umfassen neben den erfindungswesentlichen Fibroblasten oder Bindegewebszellen solche Zellen, die für den Aufbau des gewünschten Gewebes geeignet sind, und wahlweise zusätzlich solche, die die Gewebeumbildung mit sti- mulieren und/oder kontrolieren können, wie z.B. zelluläre Faktoren produzierende Zellen und/oder chemotaktisch beeinflussende Zellen, hierunter vor allem Zellen aus der Familie der Leukozyten (Lymphozyten, Thrombozyten, Makrophagen, Mastzellen, Granulozyten, , so z.B. alle Formen der weißen Blutkör- perchen, Granulozyten, Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten, Knochenmarkszellen, Milzzellen, Memory-Zellen, Thymuszellen sowie periphere oder zentrale Stammzellen (aus Blut und Knochenmark) oder Stammzellen aus Fettgewebe, vorzugsweise pluri- potente Stammzellen. Bei Herzklappen werden bevorzugt Fibroblasten oder Myofibro- blasten, Muskelzellen und/oder Endothelzellen eingesetzt, bei Hauttransplantaten Keratinozyten, Zellen mesodermalen Ursprungs (Mesodermalzellen) und ggf. Hautanhangsgebilde.
Ein wichtiger Aspekt der Erfindung besteht darin, dass die idealerweise autologen Fibroblasten durch die Signalwirkung der initial verbliebenen aber in vitro absterbenden Donor- Zellen von einem ruhenden in einen aktivierten Phänotypus mu- tieren können. Dies hat erhebliche Konsequenzen für die Genexpression der empfängerspezifischen bzw. -verträglichen Zellen, die ja auch in einem ruhenden Phänotypus aus gesundem Gewebe gewonnen werden. In vitro wird dann ein "Krankheitszustand" und damit nachfolgend ein "Heilungszustand" induziert. Hierbei kann die Kooperation mit idealerweise empfängereigenen oder empfängerspezifischen Helferzellen verstärkend und permissiv wirken. Die empfängerverträglichen Zellen, die für den Gewebeumbau eingesetzt werden, umfassen daher vorzugsweise auch Makrophagen, aber auch Blutplättchen sowie immunkompetente Zellen wie Lymphozyten.
Zentral für die Erfindung ist, dass die Behandlung fortgesetzt wird bis ein weitgehender, wenn nicht praktisch vollständiger Umbau erreicht oder soweit initiiert wurde, damit eine Weiter- führung des ständigen Umbaus in vivo angebahnt ist.
Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung ergibt sich daraus, dass Implantationen rascher erfolgen können. Bei der herkömmlichen Methode wurden die Fremdzellen zunächst abgeführt . Da- bei wurde die Matrix mechanisch erheblich geschwächt. Anschließend wurde wiederbesiedelt, was einen Zeitraum von wenigstens 24 bis 96 Stunden in Anspruch nahm. Die Stabilität der Matrix nahm während der Wiederbesiedlung allmählich, jedoch abschließend nur bis auf ca. 70 - 80 % des Ausgangswertes (z.B. gemessen an Zugbelastung) zu. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht einen Gewebeumbau binnen ca. 4 Tagen (3 bis 6 Tagen) , wobei die mechanische Stabilität über den gesamten Zeitraum etwa unverändert bleibt.. Da das Gewebe bereits in- itial einer physiologischen Stabilität und Belastbarkeit entspricht, verringert sich die Gefahr von Rupturen in der ersten Zeit nach Implantation erheblich. Der Umbau wird im Körper in vivo (nach dem Implantation) fortgesetzt.
Vor der Behandlung mit den empfängerverträglichen Zellen sollte das für die Transplantation vorgesehene autologe, allogene oder xenoge, in nativer Form vorliegende Gewebe sterilisiert werden. Dies hat insbesondere bei xenogenen Geweben zu geschehen, da sicher ausgeschlossen werden sollte, dass artfremde Viren und Bakterien in das frisch erzeugte bioartifizielle Transplantat mit eingetragen werden. Auch bei allogenen Ausgangsgeweben sollte eine Krankheitsübertragung sicher ausgeschlossen werden. Nur ausnahmsweise dürfte es möglich sein, autologe Gewebe für andere Einsatzzwecke umzubilden. Auch hier ist eine Sterilisation sinnvoll, die jedoch weniger aufwendig sein müßte .
Unter einem Gewebe in nativer Form wird ein solches Gewebe verstanden, das im wesentlichen so belassen wurde, wie es ent- nommen worden ist. Nativ bedeutet in diesem Zusammenhang natürlich, unverändert, nicht-denaturiert . Das Gewebe soll bei Eintritt in die Behandlungsphase mit den empfängervertäglichen Zellen, noch seine nativen Zellen tragen, damit der endogene Stimulus für den Umbau des Gewebes genutzt werden kann. Diese Zellen befinden sich jedoch, wie oben bereits erwähnt, wegen des für Präparation und ggf. Transport verstrichenen Zeitraums im allgemeinen bereits im Zustand des beginnenden Absterbens. Die Sterilisierung soll möglichst schonend erfolgen. Zum Zwek- ke der Sterilisierung kann beispielsweise mit einer sterilisierenden Lösung gespült werden oder es kann mit einem Gas sterilisiert werden (Begasung) .
Als besonders geeignet wird derzeit eine Sterilisation durch Plasmaionisation angesehen, bei der eine Gasentladung in Anwesenheit von H202 erfolgt. Hierzu wird eine wässrige Lösung von Wasserstoffperoxid in eine Sterilisationskammer injiziert und vaporisiert. Unter reduziertem Umgebungsdruck wird mit Hilfe einer Radiofrequenzenergie ein niedrig-Temperatur-Plasma appliziert. Hierdurch wird ein elektrisches Feld generiert, welches ein Plasma erzeugt. In dem Plasma-Zustand wird das Wasserstoffperoxid unter Radikalbildung gespalten. Die Radika- le stellen die aktive Spezies für die Sterilisation dar. Dieses Verfahren hiterlässt keine toxischen Rückstände, da nach Abschluss der Reaktion die Radikale zu Wasser, Sauerstoff und anderen nicht toxischen Produkten abreagieren. Die Verwendung von Peroxiden entspricht auch einem in vielen Zellen vorkom- menden natürlichen Prozess (z.B. in Makrophagen).
Gegebenenfalls kann der Erfolg der Sterilisierung spezifisch geprüft werden, in dem beispielsweise nach der Sterilisierung auf Anwesenheit bestimmter Viren oder Bakterien, die strikt unterbunden werden sollen, getestet wird.
Das für die Transplantation vorgesehene Gewebe kann nach seiner Präparation vor einer möglicherweise erforderlichen Sterilisierung zusätzlichen nicht-denaturierenden Verfahrensschrit- ten, z.B. einem Spülen ausgesetzt werden. Auch ein schonendes Einfrieren des nativen Transplantat-Gewebes ist möglich, sofern hierbei tiefgreifendere Gewebeänderungen vermieden werden. In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass dem konditionierenden Medium, während der Behandlung mit empfängerverträglichen Zellen oder danach, zusätzlich zelluläre Mediatoren und/oder Faktoren oder chemische Mediatoren zugesetzt werden. Die Wirkung bestimmter Faktoren wurde bereits untersucht, so dass der Fachmann gezielt Zeilwachstumsfaktoren, zelldifferen- zierende Faktoren, chemotaktische Faktoren und andere auswählen und einsetzen kann. Insbesondere können verwendet werden: Neuropeptide : Diese können die Fähigkeit besitzen, mesenchyma- le Zellen zu aktivieren. Bei Fibroblasten kann die Proliferation und Chemotaxis beeinflusst werden. Unter den geeigneten Neuropeptiden sind insbesondere zu nennen: Neurokinin (Neuro- kinin A (NKA) ) , Substanz P (SP) , vasoactives Intestinal-Peptid (VIP) , Calcitonin-Gen-bezogenes Peptid (calcitonin-gene- related peptide (CGRP) ) ; als weitere vorwiegend chemotaktisch und/oder proliferations- steuernd wirkende Mediatoren/Faktoren können - je nach Zell- und Gewebetypus - verwendet werden: Fibronectin (Fn) , Cytokine, wie Interleukin-1-beta (IL-1 be- ta) , Interleukin-6 (IL-6) , Interleukin-8 (IL-8) , Interferone, wie Interferon-gamma (IFN-gamma) , Granulozyten- Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (granulocyte- macrophage colony Stimulation factor (GM-CSF) ) , Transformations-Wachstumsfaktor beta 1 (transforming growth factor - be- ta 1 (TGF-beta 1) ) , osteogenes Protein-1 (osteogenic protein-1 (OP-1) ) , recombinantes humanes osteogenes Protein-1 (rhOP-1) , Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (urokinase-type plasmi- nogen activator (u-PA) ) , PDGF (platelet-derived growth factor) , Insbesondere PDGF AA, PDGF AB, PDGF BB, HGF (hepatocyte growth factor) , VEGF (vascular endothelial growth factor) , FGF
(fibroblast growth factor) , ECGF (endothelial cell growth factor) , Glycoproteine, wie alpha-2-Macroglobulin (alpha-2M) , Clara Zellprotein (CC-16) , Platelet factor 4, beta- Tlromboglobulin, Neutrophile-aktivierendes Paptid-1, ferner auch synthetische Mediatoren, wie z.B. Mannose-6-phosphat, Ad- aptil und andere.
Die konkrete Funktion der einzelnen Mediatoren, Faktoren, Co- Faktoren ist dem Fachmann auf dem Gebiet für isolierte Zellen bekannt, so dass er im Rahmen der hier beschriebenen Erfindung für den jeweiligen Zweck geeignete Mediatoren/Faktoren auswählen kann.
In Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, daß das Verfahren so geführt wird, daß dem konditionierenden Medium und/oder Gewebe immunkompetente Zellen, insbesondere Makrophagen, die zelluläre Mediatoren und/oder Faktoren an das konditionierende Medium abgeben, zugeführt werden. Insbesondere kann das kondi- tionierende Medium hierfür aus autologen, d.h. empfängereigenem Blut bestehen, hiermit zeitweise angereichert oder durch Blut zeitweise ersetzt werden. Hierdurch können Makrophagen aus dem Blut selektiv an dem Gewebe adhärieren. Die Makrophagen erhalten immunstimulatorische Reize aus dem noch nicht oder unvollständig umgebildeten Gewebe und setzen hierdurch zelltypspezifische Mediatoren frei, die den Umbau beschleunigen. Blutplättchen lysieren und setzen beispielsweise Wachstumsfaktoren frei. Der Gewebeumbau wird angeregt, gesteuert und beschleunigt .
In weiterer Fortbildung der Erfindung ist vorgesehen, das Verfahren so zu führen, dass aus einer Kultur immunkompetenter Zellen, inssbesondere einer Makrophagen-Kultur, zelluläre Mediatoren und/oder Faktoren an das konditionierende Medium ab- gegeben oder in dieses überführt werden. Diese Kultur kann auch Lymphozyten oder Blutplättchen enthalten. Weiterhin können hier auch Stammzellen zugesetzt sein. Die Kultur zur verstärkten Abgabe von Faktoren oder Mediatoren geeigneter, beispielsweise immunkompetenter Zellen oder die
Makrophagen-Kultur kann in einem Bioreaktor erfolgen, der mit dem Reaktor, in dem das bioartifzielle Transplantat vorberei- tet und behandelt wird, in geeigneter Weise verbunden ist. Aus dem Bioreaktor abgenommene Faktoren können dem umlaufenden oder schubweise zugeführten konditionierenden Kulturmedium in geeigneter Menge zugeführt werden.
Durch einen geeigneten Bioreaktor kann hier ein druck- und belastungsabhängiges Remodelling, z.B. durch pulsatilen Perfusionsbetrieb, beispielsweise bei Gefäßen und Herzklappen, durchgeführt werden, das sich sehr positiv auf die Naturähnlichkeit des umgebildeten Gewebes auswirkt. Es verbessert die der nor- malen Physiologie entsprechende Ausprägung des bioartifiziellen Gewebes in vitro.
Alternativ kann die Makrophagen-Kultur, bzw. die Kultur sonstiger immunkompetenter Zellen, während der Schritte der Be- handlung mit empfängerverträglichen Zellen durch ein für die zellulären Mediatoren und/oder Faktoren durchlässige Folie, Membran oder Trennwand von dem konditionierenden Medium getrennt gehalten werden und die gebildeten Mediatoren und/oder Faktoren können kontinuierlich in das konditionierende Medium abgegeben werden.
Die Behandlung des für die Transplantation vorgesehenen Gewebes wird im allgemeinen in einem Bioreaktor erfolgen, in dem das Kulturmedium innerhalb eines bestimmten Raumes vorgehalten und ggf. umgewälzt wird. Innerhalb dieses Raumes kann mit einer permeablen Trennwand ein Kulturraum für die Kultur der immunkompetenten Zellen oder Makrophagen ausgebildet werden, so dass die gebildeten zellulären Mediatoren und/oder Faktoren ständig in das konditionierende Medium auswandern können. AI- ternativ können die immunkompetenten Zellen auch gesondert kultiviert und die Zellkulturprodukte können dem Bioreaktor, der zur Gewebekultur verwendet wird, zugeführt werden. Zusätzlich kann das Produkt (d.h., das Organ oder allgemein das Ge- webe) zu Konditionierungszwecken mit oder unter Zusatz von empfängerspezifischem Vollblut oder einzelner Blutkomponenten (Proteine, Fibronektin, Thrombin, Fibrinogen, Plasma, Serum, zelluläre Bestandteile) perfundiert bzw. koinkubiert werden. Als immunkompetente Zellen können insbesondere verwendet wer- den:
Alle Formen der weißen Blutkörperchen, Granulozyten, Lymphozyten, Makrophagen, Monozyten, Knochenmarkszellen, Milzzellen, Memory-Zellen, Thymuszellen Beide vorgenannten Alternativen können auch kombiniert werden, indem sowohl immunkompetente, bzw. immunmodulatorische Zellen innerhalb oder außerhalb des Gewebe-Bioreaktors cokultiviert werden, um bestimmte Mediatoren/Faktoren zu erzeugen, und gleichzeitig auch noch natürlich gewonnene oder synthetische Mediatoren/Faktoren dem Gewebekulturmedium zugesetzt werden.
Die Co-Kultur immunkompetenter Zellen, die Mediatoren, Faktoren, Co-Faktoren produzieren und an das konditionierende Medium abgeben, ist besonders vorteilhaft, da für den jeweiligen Zweck besonders geeignete Mediatoren/Faktoren während eines ohnehin erforderlichen Kulturschritts mitproduziert werden können, so dass auf die Verwendung zusätzlicher teurer und weniger spezifischer Faktoren verzichtet werden kann.
Im folgenden wird die Erfindung anhand einiger Beispiele be- schrieben:
Beispiel 1 Transdifferenzierung einer allogenen kryokonservierten Vene in eine autologe Arterie:
Kryokonservierte allogene Venen werden ohne weitere Behandlung steril in einen Bioreaktor eingebracht und mit idealerweise serumfreien oder autologem Serum / Plasma angreichertem Medium perfundiert . Vorexpandierte autologe aus einer Arterie stammende Fibroblasten und glatte Muskelzellen werden an der Außenseite der vormals kryokonservierten Vene angebracht . Dies geschieht hier durch Aufbringen in einem (autologen) Fibringel, Kollagengel, in synthetischen Kleberproteinen aus Muscheln durch Auftropfen oder Aufstreichen der mit dem Klebervermischten Zellen vor der Kultivierung oder durch Auftropfen oder Aufstreichen einer Zellsuspension in Medium. Innerhalb des Gefäßlumens werden Endothelzellen (fakultativ nach einer Vorbesiedlung mit Myofibroblasten) aufgebracht. Dies geschieht unter langsamen Rotieren des Gefäßes innerhalb eines Bioreaktors, wobei ein Bioreaktor jede hierfür geeignete Vorrichtung sein kann. Die Fibroblasten werden durch den Zelldetritus der abgestorbenen Zellen angeregt neue Matrix zu synthetisieren, neue Gewebestrukturen aufzubauen und sich verstärkt in das Gewebe/die Matrix zu integrieren. Ein mehrlagiger Muskelzellmantel bildet sich innerhalb weniger Tage aus.
Das arterialisierte (umgebildete) Gefäß ist somit ohne Stabilitätsverlust (wie überlicherweise nach der Azellularisierung bis zu < 20 % initiale Stärke) , sehr rasch transplantationsbereit .
Beispiel 2
Transdifferenzierung einer xenogenen kryokonservierten Arterie in eine autologe humane Arterie: Xenogene Arterien werden ohne jegliche Azellularisierung mit autologen arteriellen Gefäßzellen in Analogie zu dem ersten Beispiel, jedoch noch ohne Endothelzellen besiedelt. Das Chimäre Konstrukt (umgebildetes Gewebe) wird mit autologem Blut durchspült . In dieser Phase adharieren Makrophagen selektiv an der exponierten Matrix. Lymphozyten erhalten immunstimulatori- sche Reize durch die xenogene Matrix. Bluttplättchen lysieren und setzen Wachstumsfaktoren wie PDGF frei. Nach einer Einwirkzeit von ca. 4 Std. (ausreichend für die Makrophagenadhä- sion) wird das autologe Blut wieder mit plasmaangereichertem Kulturmedium ersetzt und für mehrere Tage (ca. 3-10) nachkultiviert . In dieser Phase kommt es zu einem akzelerierten Ma- trixturnover durch die für die Besiedlung zugeführten (autologen) Myofibroblasten. Durch pulsatile Belastungen erfolgt eine gerichtete druckgesteuerte Deposition neuer Matrixmolekule und Fasern. Ebenso wird die orientierte Integration der neuformierten Zellverbände ermöglicht.
Alternativ können Präparationen von Blutplättchen (Gewinnung bei ca. 3000 g und weiße Blutkörperchen (1800 g) separat in unterschiedlichen Bereichen des Bioreaktors oder synchron in einer gesonderten Apparatur kokultiviert werden. In letzterem Falle werden die so erhaltenen Kulturprodukte der Gewebekultur in dem eigentlichen Gewebe-Bioreaktor zugeführt.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung eines bioartifiziellen Transplantates aus einem für die Transplantation vorgesehenen biologi- sehen Gewebe und darauf aufgebrachten empfängerverträglichen Zellen, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t,
- dass dem für die Transplantation vorgesehenen autologen, allogenen oder xenogenen, in nativer Form vorliegenden und nicht mit exogenen Wachstumsfaktoren vorbehandelten
Gewebe in einem konditionierenden Medium empfängerverträgliche Zellen zugeführt werden, die wenigstens ausgewählte zu einem Remodelling der Trägerstrukturen befähigte Zellen umfassen,
- dass die Behandlung des Transplantates fortgesetzt wird bis eine weitgehende Umbildung des usprünglichen nativen Gewebes in ein im wesentlichen die zugeführten empfänger verträglichen Zellen aufweisendes Gewebe erzielt worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Remodelling der Trägerstrukturen befähigten Zellen Bindegewebszellen oder deren Vorläufer sind, insbesondere Fibrobla- sten oder Bindegewebs-Vorlauferzellen, vorzugsweise aus autologen Stammzellen.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das umzubildende Gewebe ein Herzgewebe ist und die zum Remodelling befähigten Zellen glatte Muskelzellen sind.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Remodelling befähigten Zellen Makrophagen sind.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die empfängerverträglichen Zellen einmalig zu Beginn der Kultur, mehrfach in Intervallen oder kontinuierlich innerhalb des Mediums zugeführt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die empfängerverträglichen Zellen auf das umzubildende native Gewebe aufgetropft oder aufgestrichen, oder kontinuierlich oder schubweise mit dem konditionierenden Medi- um zugeführt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die zuzuführenden empfängerverträglichen Zellen vermischt mit einem biologisch verträglichen Kleber, der ins- besondere Fibrin, Kollagen oder Kleberproteinen enthalten kann, oder in einer Kulturmedium-Suspension aufgegeben werden.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung des Transplantats in der Kultur unter mehrmaligem Austausch oder bei kontinuierlichem Durchlauf des Mediums durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass dem konditionierenden Medium während der Be- handlung mit empfängerverträglichen Zellen zelluläre Mediatoren und/oder Faktoren oder chemische Mediatoren zugesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge- kennzeichnet, dass das Verfahren so geführt wird, dass dem konditionierenden Medium und/oder dem Gewebe zur Abgabe zellulärer Mediatoren und/oder Faktoren besonders befähigte und aktivierbare Zellen, insbesondere Makrophagen, zusätzlich zugeführt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Abgabe zellulärer Mediatoren und/oder Faktoren besonders befähigten und aktivierbaren Zellen, insbesondere die Makrophagen, in einer Kultur vorgehalten werden, vorzugsweise in einem Bioreaktor, weiter vorzugsweise in demselben Bioreaktor, in dem auch das Transplantat behandelt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Makrophagen- oder entsprechende Zellkultur während der Be- Siedlung oder Behandlung mit empfängerverträglichen Zellen durch eine für die zellulären Mediatoren und/oder Faktoren durchlässige Folie, Membran oder Trennwand von dem konditionierenden Medium getrennt gehalten wird und die gebildeten Mediatoren und/oder Faktoren kontinuierlich in das konditionie- rende Medium abgegeben werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das für die Transplantation vorgesehene autologe, allogene oder xenogene, in nativer Form vorliegende Gewebe zunächst sterilisiert wird, vorzugsweise durch Spülen mit einer sterilen Lösung oder durch Begasen.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Sterilisation durch eine Plasmaionisation mit H202 erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das für die Transplantation vorgesehene Gewebe nach seiner Präparation, vorzugsweise vor oder nach der Sterilisierung, zusätzlichen nicht-denaturierenden Verfahrens- schritten ausgesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das für die Transplantation vorgesehene Gewebe nach seiner Präparation, vorzugsweise vor oder nach der Sterilisierung, zusätzlich ein- oder mehrmals gespült wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die empfängerverträglichen Zellen autologe Zellen des Transplantat-Empfängers sind.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die empfängerverträglichen Zellen für den Empfänger als verträglich ausgewählte allogene oder genetisch veränderte allogene Zellen sind.
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