WO2001090382A2 - Proteines de fusion agissant en tant que fas-ligand - Google Patents

Proteines de fusion agissant en tant que fas-ligand Download PDF

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WO2001090382A2
WO2001090382A2 PCT/JP2001/004456 JP0104456W WO0190382A2 WO 2001090382 A2 WO2001090382 A2 WO 2001090382A2 JP 0104456 W JP0104456 W JP 0104456W WO 0190382 A2 WO0190382 A2 WO 0190382A2
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Jyunko Touma
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Mochida Pharm Co Ltd
Toma Jyunko
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    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a fusion protein having a biological activity as a Fs ligand, a DNA encoding the same, an expression vector containing the DNA, and a cell transformed with the vector.
  • the present invention also provides a method for increasing the production amount of a recombinant protein which is useful for the production of the fusion protein, and which can be applied to all recombinant proteins. It provides a method for increasing biological activity.
  • Fas is a type I transmembrane protein with a molecular weight of about 45 kD that belongs to the TNF receptor Yuichi family and has anti-Fas antibody (Yone ha raeta 1., J. Ex P. Med. 169: 1747, 1989) ) And APO-1 antibody (Trautheta 1., Science 267: 1456, 1989) and are cell surface antigens that transmit apoptotic signals to cells.
  • Human Fas ligand is a type II transmembrane with a molecular weight of about 40 kD, belonging to the TNF family, which was first reported by Nagata et al. As a biological molecule that induces apoptosis in cells expressing Fas. Type protein (Tak ah ashieta 1., Inte rn ati ona l I mm uno 1 ogy 6: 1567, 1994) and, like TNF, are thought to form trimers in vivo (Tanakaeta 1., EMBO J. 14: 1129, 1995). In addition, rat Fas ligand (Sudaeta 1.
  • Fas intracellular signal transduction mechanism of apoptosis via Fas
  • Fas the intracellular region of Fas
  • a death domain a region called the death domain (Death doma in)
  • Caspases a series of cysteine proteases contribute to the signaling of apoptosis via Fas.
  • Fas-mediated apoptosis is associated with various diseases and physiological phenomena.
  • abnormalities of Fas-mediated apoptosis may be involved in liver cell death in viral fulminant hepatitis and certain autoimmune diseases.
  • the Fas-Fas ligand system may be responsible for functions other than apoptosis, such as the action on neutrophils and inflammatory activity (Karagaki et al. Immunity 28: 667, 1996).
  • expressing a biologically active recombinant protein having appropriate tertiary and quaternary structures using transformants is often an important issue.
  • transmembrane proteins as soluble proteins with biological activity. Soluble proteins are useful in applications to pharmaceuticals that require large amounts of highly purified proteins.
  • Soluble forms of the transmembrane protein have been prepared by removing the transmembrane and cytoplasmic domains and adding an appropriate signal peptide to allow secretion of the soluble form of the protein (Smithhet). 'a 1., Science 238: 1704, 1987; Treigereta 1., J. Immunol. 136: 4099, 1986).
  • Fas ligand a fusion protein of the CD8 signal sequence and its extracellular domain with a human Fas ligand extracellular domain has been disclosed (US Pat. No. 6,001,962).
  • Fas ligand has a lower biological activity than a full-length form of a Fas ligand, and has a high activity that can be used in the pharmaceutical field. No provision of a Fas ligand has been made so far. As with the Fas ligand, trimer formation is considered to be important for activity.
  • CD40 ligand a member of the TNF family, use a leucine zipper to prepare a trimeric CD40 ligand. A method has been disclosed (U.S. Pat. No. 5,716,805).
  • the fusion protein contains a peptide having an oligomer-forming ability such as leucine zipper, the yield of a soluble protein having a retained function may be significantly reduced, and it may be difficult to secure the production amount.
  • FLAG-like peptides do not alter the biological activity of the fusion protein and provide an epitope that is recognized by a specific monoclonal antibody, which allows for rapid detection and easy purification of the expressed fusion protein. Becomes possible.
  • FLAG-like peptides have been used only as tags for purification.
  • An object of the present invention is to provide a large amount of a Fs ligand fusion protein having high biological activity in a simple and convenient manner. Also provided are a method for simply increasing the amount of recombinant protein produced and a method for increasing the biological activity of a fusion protein of leucine zipper and transmembrane protein, which can be used for that purpose.
  • the convenient and large-scale supply of a Fs ligand fusion protein having high biological activity will lead to the development of a therapeutic drug for a disease involving Fap-mediated apoptosis. It is also essential for elucidation of intracellular signal transduction pathways triggered by binding of Fas—; Fas ligands, and searching for new factors that control the interaction of Fas—Fas ligands. Is expected in the field.
  • the present inventor has conducted intensive studies to obtain a high production amount of a Fs ligand having high biological activity. As a result, we succeeded in obtaining highly active and high-yield Fass ligands by using them as fusion proteins with leucine zippers and FLAG-like peptides.
  • a FLAG-like peptide has an effect of increasing the production amount of a recombinant protein and an effect of increasing the biological activity of a fusion protein of leucine zipper and a transmembrane protein.
  • the first aspect of the present invention comprises a peptide having at least a part of the amino acid sequence of a Fas ligand, a peptide capable of forming an oligomer, and a peptide capable of increasing the amount of recombinant protein produced, and binds to Fas. Is a fusion protein.
  • a second aspect of the present invention is a DNA having a nucleotide sequence encoding the fusion protein of the first aspect of the present invention.
  • a third aspect of the present invention is an expression vector comprising the DNA of the second aspect of the present invention.
  • a fourth aspect of the present invention is a transformant transformed with the expression vector of the third aspect of the present invention.
  • a fifth aspect of the present invention is a method for increasing the amount of recombinant protein produced, comprising producing a desired protein as a fusion protein with a FLAG-like peptide.
  • an expression vector containing a DNA fragment in which a nucleotide sequence encoding a desired protein and a nucleotide sequence encoding a FLAG-like peptide are ligated in reading frame to prepare a host and a host
  • the expression vector is introduced into appropriate cells or microorganisms, and the resulting transformant is cultured under conditions suitable for expression.
  • a method for producing a recombinant protein which comprises a step of recovering and purifying and increasing the production amount of the desired protein.
  • a seventh aspect of the present invention is a method for increasing the biological activity of a leucine zipper and a transmembrane protein by preparing a fusion protein of the fusion protein and further linking a FLAG-like peptide to the fusion protein. It is. BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES
  • FIG. 1 is a graph showing apoptosis-inducing activity of various Fs ligand fusion proteins on Jurkat cells.
  • FIG. 2 is a diagram schematically illustrating the primary structures of various human Fass ligand fusion proteins.
  • FIG. 3 is a diagram in which purified FLAG-I1eZip-shFasL was subjected to silver staining after electrophoresis.
  • a Fas ligand is a substance having an activity of binding to Fas at least as its biological activity. More preferably, it is a substance having an activity of inducing apoptosis in cells expressing Fas. That is, in the description herein, the biological activity relating to the Fas ligand refers to the activity of binding to Fas, and more preferably the activity of inducing apoptosis in cells expressing Fas. I do.
  • Fas or Fas ligand as used herein is derived from any animal species such as, for example, human, mouse, rat, guinea pig, chicken, porcupine, pig, sheep, wedge, porcupine, porcine, monkey, cat, dog, marmot However, it is preferably of human origin.
  • the (a) peptide having at least a part of the amino acid sequence of the Fas ligand according to the first embodiment of the present invention is preferably a peptide having the entire amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and A peptide having an arbitrary part of an amino acid sequence having an arbitrary length and having a biological activity as a Fas ligand.
  • the amino acid sequence is defined by adding one or more amino acids such as met to one or both of the N-terminus and the C-terminus or both. Peptide, or one or more amino acid mutations, additions, deletions, or substitutions at any position in the amino acid sequence as long as they have the biological activity of a Fas ligand.
  • the amino acid sequence of rat or mouse Fas ligand can be positioned as having multiple substitutions or deletions in the amino acid sequence of human Fas ligand. It is known to have active activity. Similarly, rhesus monkeys (Wangeta 1. Human Immunology 59: 599, 1998) and other animals such as guinea pigs, chickens, rabbits, pigs, hidges, horses, pests, monkeys, cats, dogs, marmots, etc. Even if the species-derived Fas ligand has a biological activity as a Fas ligand, the amino acid sequence of the Fas ligand of the first embodiment of the present invention may be reduced. Are included in peptides having a part.
  • a peptide having at least a portion of the amino acid sequence of a Fas ligand is the extracellular domain of a Fas ligand.
  • the extracellular domain of the Fas ligand corresponds to the 103-281 amino acid portion of the human Fas ligand described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Another preferred example is a 130 to 281 amino acid portion corresponding to a soluble human Fas ligand which is released from a membrane-type human Fas ligand in vivo by protease cleavage.
  • the fusion protein of the first embodiment of the present invention may or may not have an activity of inducing apoptosis as long as it has an activity of binding to Fas.
  • the fusion protein of the first aspect of the present invention preferably has an activity of inducing apoptosis. It is known that a human Fas ligand requires an amino acid portion of 145 to 281 amino acids from the N-terminus for apoptosis-inducing activity. Accordingly, the fusion protein of the first embodiment of the present invention preferably contains the amino acid sequence of the Fas ligand, which contains at least a part of the amino acid sequence of human Fas ligand, which is 145 to 281 amino acids. However, those having a stronger apoptosis-inducing activity are preferably those containing a sequence corresponding to the amino acid sequence of the 144th and subsequent amino acids of human Fas ligand.
  • a peptide capable of forming an oligomer is a peptide capable of self-associating into a dimer, a trimer, or a higher oligomer, and in many cases, an ⁇ -helix or / 3—Can have a secondary structure like a sheet. Roy; one is provided as a suitable example.
  • Leucine zipper is a term used to refer to a repetitive seven residue motif denoted as (ab cdefg) n (where n is 4 or 5) that exists as a conserved domain in many proteins.
  • a and d are generally hydrophobic residues such as leucine or isoleucine, which are aligned on the same side of the helix (McLa chal an et al., J. MoI. Biol. l. 98: 293, 1975).
  • the leucine residue at position d contributes to a large hydrophobic stabilizing energy and is important for dimer formation (Kry steketal., Int. J. Peptide Rep. s. 38: 229, 19,91).
  • amino acid substitutions corresponding to the above formula a and d residues of leucine zippers alter the oligomer-forming properties of leucine zippers (Harburyetal., Science 262: 1401, 1993.).
  • leucine zipper will still form a parallel dimer.
  • the leucine residues at position d replace isoloidin, the resulting peptide will spontaneously form a trimeric parallel helical coil in solution.
  • Substitution of all amino acids at position d with isoleucine and all amino acids at position a with leucine forms a tetramer.
  • peptides containing these substitutions are still referred to as leucine zippers.
  • a most preferred example of the leucine zipper has a sequence shown in SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto as long as it has an oligomer-forming ability.
  • peptides capable of forming oligomers include sequences involved in p53 tetramerization, platelet factor 4, and partial sequences of histone H3 and H4 proteins. (These are described in detail in Japanese Patent Publication No. 11-508126, which is incorporated herein by reference.)
  • mutations, additions, deletions, and substitutions of one or more amino acids at any position in the amino acid sequence are included in the leucine zipper as long as they have biological activity. It is.
  • Peptides that increase the amount of recombinant protein produced include, for example, the effect of increasing the amount of fusion protein that can be recovered from the culture supernatant when producing the fusion protein in mammalian cells, and the production of the fusion protein in E. coli. It means a peptide that has the effect of increasing the amount of fusion protein that can be recovered from the lysate of the bacterial cells during the culturing.
  • the present inventors have found FLAG-like peptides for the first time as a preferred example of a peptide that increases the production of a recombinant protein.
  • the FLAG-like peptide is preferably a FLAG peptide consisting of 8 amino acids of As-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys.
  • any amino acid sequence can be used as long as it has the effect of increasing the amount of recombinant protein produced, more preferably the effect of increasing the biological activity of the fusion protein of leucine zipper and the transmembrane protein.
  • Such a peptide is called a FLAG-like peptide.
  • a sp—L eu—Ty r One peptide having an amino acid sequence of Asp—Asp—Asp—Asp—Lys is also used as having the same function as the above-mentioned sequence consisting of 8 amino acids.
  • the amino acid sequence is Asp—B—Z—Asp—Asp—As ⁇ —Asp—Lys ( ⁇ , Tyr—Lys or Leu—Tyr).
  • A) can be represented as a peptide consisting of As another form, as described in JP-B-7-4255, the amino acid sequence is As ⁇ -Tyr-Lys- Xn -R (where R is Lys, Arg, Met or Asn, and Xi- n means any amino acid other than Lys, Arg, Met and Asn.
  • n is not particularly limited, but is preferably 3 to 5.
  • the fusion protein of the present invention is composed of a peptide having at least a part of the amino acid sequence of the Fas ligand, a peptide capable of forming an oligomer, and a peptide capable of increasing the production amount of the recombinant protein. As long as it retains the activity of inducing apoptosis in cells expressing Fas.
  • the three peptides can be linked in any order. It may contain any linker sequence or signal sequence.
  • Fas ligand In the case of Fas ligand, it is known that it interacts with Fas at the C-terminal side, so that peptides having oligomer-forming ability and peptides that increase the amount of recombinant protein produced must be at least the amino acid sequence of the Fas ligand. It is preferable to be linked to the N-terminal side of the peptide having a part. Linker sequences are well known in the art. Examples of signal sequences include mouse T lymphocyte antigen CD8 signal sequence, baculovirus gp67 protein signal sequence, and G—CSF signal. And a signal sequence that promotes secretion of a protein such as the human Fas signal sequence.
  • a preferred example of the fusion protein of the present invention is a fusion protein in which a FLAG-like peptide, a leucine zipper, and an extracellular domain of a human Fs ligand are linked in this order from the N-terminal side.
  • the most preferred example has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and is linked from the N-terminal side in the order of human Fas signal sequence, FLAG peptide, leucine zipper, extracellular domain of human Fas ligand The fused 'protein.
  • an amino acid sequence obtained by adding one or more amino acids such as Met to one or both of the N-terminus and the C-terminus, or both. Mutants, additions, deletions, or substitutions of one or more amino acids at any position in the defined peptide or amino acid sequence are included in the fusion protein of the present invention.
  • WST-1 Atsushi can be performed according to Takara Shuzo's Premix WST-1 Cell P roliferati on Assay System.
  • Fas-expressing cells it is preferable to use Jurkat cells, which are cell lines derived from human T cells.
  • an assay other than WST-1 assay for example, in order to examine the ability to bind to Fas, a method of performing immunoprecipitation between Fas and the fusion protein of the present invention, or a method of fluorescently labeling an antibody that recognizes the fusion protein, was used. Then, the fusion protein bound to the cells expressing Fas can be examined by flow cytometry. Also induces apoptosis The activity can be assayed by a method such as Rubies (J. Exp. Med. 177: 195, 1993).
  • the apoptosis-inducing activity of the fusion protein of the present invention is preferably such that the cell viability when adding 3 ng / mL of the fusion protein to WST-1 assay shown in the Examples is 50% or less. It can be evaluated that the lower the cell viability in the same assay, the higher the apoptosis-inducing activity of the fusion protein.
  • the fusion protein of the present invention which has a high apoptosis-inducing activity, is useful when applied to pharmaceuticals, because it can reduce the therapeutically effective dose, thereby reducing side effects and reducing production costs.
  • a more preferred example of the fusion protein of the present invention has an apoptosis-inducing activity in which the cell viability achieved when the fusion protein is added at 3 ng / mL is 20% or less in the same assay.
  • the fusion protein of the present invention is characterized in that by using both a FLAG-like peptide and a leucine zipper, the activity as a Fas ligand is increased and the amount of fusion protein produced is also increased. In the case of molecules such as Fas ligand that can form a multimeric structure in vivo, it was predictable that a fusion protein with leucine zipper would be able to obtain an active recombinant protein.
  • the fusion protein of the present invention has a production amount of at least 1.5 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, and more preferably, as compared with the case of using a fusion protein with leucine zipper alone.
  • the biological activity as a Fas ligand is 1.5 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, and further preferably 5 times or more.
  • especially preferred The feature is that it is 10 times or more.
  • the fusion protein of the first embodiment of the present invention is produced as a recombinant protein by genetic engineering.
  • Examples of producing the fusion protein by genetic engineering include transforming an appropriate host cell using the novel DNA of the second embodiment of the present invention described later or the expression vector of the third embodiment, The obtained transformant is cultured to recover a culture mixture, and the fusion protein is purified.
  • a method for synthesizing a cell-free system using the DNA or the recombinant DNA molecule (Sambrook eta. 1. Molecular Cloning 2 nded. Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989) is also one of the methods for production by genetic engineering.
  • a preferred method for producing a fusion protein by genetic engineering will be described in the sixth embodiment of the present invention.
  • the DNA has a nucleotide sequence encoding the fusion protein of the first aspect of the present invention. Since the fusion protein is composed of a peptide having at least a part of the amino acid sequence of Fas ligand, a peptide capable of forming an oligomer, and a peptide capable of increasing the amount of recombinant protein produced, the DNA It is a sequence obtained by linking nucleotide sequences encoding various kinds of peptides with their reading frames aligned.
  • the nucleotide sequences encoding the three peptides may be linked in any order, and may include an arbitrary linker sequence or a nucleotide sequence encoding a signal sequence.
  • Fas ligand it is known that it interacts with Fas on the C-terminal side.
  • the nucleotide sequence encoding a peptide capable of forming oligomers and a peptide capable of increasing the amount of recombinant protein produced is a nucleotide sequence encoding a peptide having at least a part of the amino acid sequence of the Fas ligand. It is preferably linked to the 5 'end of the amino acid.
  • DNAs for polypeptides having the same function are homologous to each other and often hybridize to each other even if the animal species or individual is different.
  • the diversity of amino acids also often occurs to the extent that the DNAs that encode them hybridize to each other.
  • DNA cloning by the hybridization method indicates that DNAs encoding different amino acid sequences hybridize to each other.
  • Polypeptides having amino acid sequences encoded by DNAs that hybridize to one another are considered to have substantially the same function.
  • the fusion protein of the present invention contains an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence that hybridizes to a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence, and has an activity of binding to Fas. Can also be characterized. '
  • the DNA fragment having a nucleotide sequence encoding each of the three peptides may be obtained by any method. That is, it may be chemically synthesized or cloned from an appropriate DNA library. Alternatively, it may be prepared by excision from another recombinant DNA having the sequence by treatment with a restriction enzyme, or another recombinant DNA may be used as a ⁇ type and subjected to a PCR method using an appropriate primer. It may be prepared by amplification. Those DNA fragments are public The fragments may be joined by the known ligation method, or the mixture of fragments may be converted into a continuous DNA fragment by the PCR method using an appropriate primer with a type III mixture.
  • the expression vector of the third aspect of the present invention contains the above-described DNA of the second aspect of the present invention.
  • This DNA fragment is operably linked to appropriate transcriptional and Z- or translation-regulating sequences, such as those obtained from mammalian, microbial, viral, or insect genes.
  • regulatory sequences include sequences having a regulatory role in gene expression (eg, transcription motors or enhancers), operator sequences to control transcription, sequences encoding mRNA ribosome binding sites, polyadenylation sites, Includes splice donor and acceptor sites, as well as appropriate sequences that control the initiation and termination of transcription and translation. The need for these nucleotide sequences is determined by the intended use of the expression vector.
  • the expression vector of the third aspect of the present invention can be obtained by introducing the DNA of the second aspect of the present invention into any vector. If necessary, the DNA may be introduced into an arbitrary vector together with another nucleotide sequence.
  • a method for introducing DNA into a vector is known (Sammbook eta l.Molecu lar Cloning 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1989). . That is, DNA and vector are each digested with an appropriate restriction enzyme, and each obtained fragment may be ligated using DNA ligase.
  • the vector may be any vector such as a plasmid vector, a phage vector, a virus vector, and the like.
  • the expression vector preferably has an E. coli replication origin, a marker gene, and a polyA additional sequence in addition to the DNA of the second embodiment of the present invention.
  • those having the promoter of SV40 and the promoter of SR, which function in animal cells, and the promoter of promoter of human celllongation factor 1 (EF1 ⁇ ) are also preferred examples of the expression vector.
  • the transformant according to the fourth aspect of the present invention is transformed with the expression vector according to the third aspect of the present invention. That is, the transformant of the fourth aspect of the present invention is transformed by directly introducing the expression vector of the third aspect of the present invention into an appropriate host cell or microorganism.
  • Methods for introducing the expression vector according to the third aspect of the present invention into host cells include electoporation method, protoplast method, alkali metal method, calcium phosphate precipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, and virus particles.
  • the transformant of the present invention can also be used for the purpose of producing the DN molecule of the second aspect of the present invention in large quantities.
  • the transformant produces the fusion protein of the first aspect of the present invention. Therefore, such a transformant is It can be used for the purpose of producing the fusion protein of the first aspect of the present invention and the like.
  • the transformant according to the fourth aspect of the present invention may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell.
  • prokaryotic cells is Escherichia coli Bacillus subtilis.
  • eukaryotic cells include mammalian cells such as CHO cells, HeLa cells, COS cells, and Namawa cells, as well as insect cells such as S ⁇ cells and yeast.
  • the transformant produces the fusion protein of the present invention, and more preferably, secretes the fusion protein of the present invention into the medium.
  • One of the most preferred examples is COS-1 cells.
  • a fifth embodiment of the present invention a method for increasing the amount of recombinant protein produced, which comprises producing a desired protein as a fusion protein with a FLAG-like peptide, will be described.
  • Increasing the amount of recombinant protein produced means, for example, increasing the amount of protein that can be recovered from the culture supernatant when producing the fusion protein in mammalian cells, or increasing the amount of bacterial cells when producing the fusion protein in E. coli. Means that the amount of protein that can be recovered from the lysate increases.
  • the FLAG-like peptide is used not only as a tag for purification as in the past but also as a sequence for increasing the amount of recombinant protein produced.
  • Conventionally known sequences that increase the amount of recombinant protein produced include secretory signal sequences. Secretory signal peptides facilitate secretion of proteins from cells.
  • the present inventors have newly found that the FLAG-like peptide is not a secretory signal sequence, but has an effect of increasing the amount of recombinant protein produced.
  • Example 2 when producing the extracellular domain of the Fas ligand in COS-1 cells, the N-terminal side of the extracellular domain of the Fas ligand Ligation of the FLAG peptide resulted in an approximately 3-fold increase in production.
  • leucine zipper was ligated to the N-terminal side of the extracellular domain of the Fas ligand to increase biological activity, the expression level was significantly reduced due to the presence of leucine zipper. Ligation increased the production by 20-35 times.
  • a problem may occur in that the production amount is significantly reduced.
  • the FLAG-like peptide can be further fused to increase the production amount.
  • a method for producing a desired protein as a fusion protein with a FLAG-like peptide will be described in the sixth embodiment of the present invention.
  • an expression vector containing a DNA fragment in which a nucleotide sequence encoding a desired protein and a nucleotide sequence encoding a FLAG-like peptide are ligated in reading frame and And introducing the expression vector into appropriate cells or microorganisms as hosts, culturing the resulting transformant under conditions suitable for expression, and recovering and purifying the recombinant protein from the culture mixture.
  • a method for producing a recombinant protein that increases the production of the desired protein is described.
  • the nucleotide sequence encoding the desired protein and the nucleotide sequence encoding the FLAG-like peptide may be ligated in any order as long as the effect of increasing the production amount by the FLAG-like peptide is recognized. And a base sequence encoding a signal sequence.
  • the expression vector is described in the third embodiment of the present invention.
  • the transformant is described in the fourth embodiment of the present invention.
  • the transformant can be cultured by a general method.
  • culturing transformants There are various books (“Microbial Experiment Method”, edited by The Biochemical Society of Japan, Tokyo Kagaku Dojin, 1992, etc.), which can be referred to.
  • the necessity of a method for gene amplification and expression induction depends on the type of host cell and the promoter used. For example, it can be induced with 3] 3-indoleacrylic acid when the promoter is the trp promoter, with dexamethasone when the MM TV promoter is used, and with methanol when the ⁇ 1 promoter is used.
  • DHFR farnesolate dehydrogenase
  • the culture mixture is a culture supernatant or cells. That is, when the transformant secretes the recombinant protein extracellularly, the protein is recovered and purified using the culture supernatant as a material.
  • the recombinant protein accumulates in the host cells, the cells are disrupted using lysozyme, detergent, freeze-thaw, pressurization, etc., and then centrifuged to collect the supernatant. Then, after removing unnecessary cell fragments and the like by filtration or the like, the recombinant protein is purified using the material as a material.
  • a method such as virus key (J. B acteriol. 127: 595, 19776) may be used. Can be used.
  • a method for purifying the recombinant protein from the culture mixture an appropriate method can be appropriately selected from methods usually used for protein purification. That is, various affinity chromatography such as salting-out method, P-Gori extrafiltration method, isoelectric point precipitation method, gel filtration method, electrophoresis method, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, antibody chromatography, etc.
  • a preferred example is the method described in Example 4.
  • Another suitable example includes affinity chromatography using specific antibodies to FLAG-like peptides, the method of which is disclosed in US Pat. No. 5,011,912.
  • the FLAG-like peptide containing the amino acid sequence Asp—Asp—Asp—Asp-Lys can be excised using enterokinase, and the recombinant protein is obtained by removing the FLAG-like peptide.
  • “increase in the amount of protein production” means that the amount of production is at least 1.5 times or more as compared with the case where the protein is not a fusion protein with a FLAG-like peptide. Means 2 times or more, more preferably 3 times or more, further preferably 20 times or more, particularly preferably 30 times or more.
  • an EIA system using an antibody specific to the target protein as shown in Example 2 can be used, or a general method available to those skilled in the art can be used.
  • a FLAG-like peptide is fused by further linking a FLAG-like peptide to the fusion protein.
  • Leucine zippers have been described in the first aspect of the present invention.
  • transmembrane proteins include the TNF family, to which TNF «, Fas ligand, TRAIL, CD40 ligand, etc. belong, and the TNFZNGF receptor, to which TNF receptor, Fas, DR4, etc. belong.
  • Transmembrane proteins generally have the function of transmitting signals into cells, but as long as they have the activity of binding both, they have the activity of transmitting signals into cells by binding both. It may or may not have one. When it binds but does not transmit a signal, it can be used to suppress changes in the phenotype of cells in response to the signal. However, it is preferable that they have an activity of transmitting an intracellular signal by binding of the two and inducing a change in the expression system of the cell in response to the signal.
  • the fusion protein produced by the method of the seventh aspect of the present invention is composed of a FLAG-like peptide, a mouth isin zipper, and a transmembrane protein, as long as the biological activity of the transmembrane protein is retained.
  • the three peptides may be linked in any order, and may include any linker sequence or signal sequence.
  • a transmembrane protein is a peptide having an entire amino acid sequence, a peptide having an arbitrary portion of any length of the amino acid sequence, or an amino acid sequence thereof, as long as its biological activity is maintained.
  • a mutation, addition, deletion, or substitution of one or more amino acids may occur at any position in the amino acid sequence.
  • a preferred example to which the method of the seventh embodiment of the present invention can be applied is a case where the extracellular domain of a Fas ligand is used as a transmembrane protein.
  • the fusion protein linked in the order of the FLAG peptide single-mouthed isinzipper and the human Fas ligand extracellular domain was fused to the non-FLAG peptide-linked leucine zipper-human Fas ligand extracellular domain. It had about 10-fold apoptosis-inducing activity as compared to the protein. That is, by linking the FLAG peptide, the biological activity of the fusion protein of leucine zipper and Fas ligand as a Fas ligand was successfully increased.
  • “increase in biological activity” means that at least one value of the activity or the like is at least large as compared with a case where the protein is not a fusion protein with a FLAG-like peptide. For example, it means 1.5 times or more, preferably 2 times or more, more preferably 3 times or more, further preferably 5 times or more, particularly preferably 10 times or more.
  • a general method is used for comparing the activity values and the like, the comparison can be made based on the activity amount per unit amount, that is, the specific activity.
  • the specific activity is determined by generally 50% inhibitory concentration (IC 5 Q) or 50% effective dose (ED 5.) And the like.
  • Plasmid pMl807 expressing a fusion protein of leucine zipper and human Fs ligand extracellular domain was prepared by the following method.
  • antisense primer 4 (AATAAGCTTGGTACCCT ATTAGAGCTTATATAA) were synthesized using a chemical synthesizer.
  • This sense primer 11 contains a sequence encoding the human Fas signal sequence.
  • Antiserum 1 contains the 3 'terminal region of the sequence encoding the human Fas signal sequence and the 5' terminal region of the sequence encoding the isoleucine zipper.
  • Sense Primer 2 contains an intermediate region of the leucine zipper coding sequence.
  • Antisense primer 2 contains the 3, terminal region of the leucine zipper coding sequence.
  • Sense primer 3 encodes human Fas signal sequence Contains the 5 'end region of the sequence and the EcoRI site (GAATTC).
  • Antisense primer 3 contains a nucleotide sequence coding for the 3 'terminal region of the leucine zipper coding sequence, the Pstl site (CTGCAG), and the N-terminal side of the extracellular domain of human Fas ligand.
  • Sense primer 14 contains the 3 ′ terminal region of the sequence encoding leucine zipper, the PstI site (CTGCAG), and the nucleotide sequence encoding the N-terminal side of the extracellular domain of human Fas ligand.
  • Antisense Primer 14 contains a sequence encoding the C-terminal side of the human Fas ligand, a TAA stop codon and a Kpn I site (GGTACC).
  • the resulting sense primer 1 and antisense primer 1 or sense primer 2 and antisense primer 2 were each replaced by 50 pmo1, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP by 10 nmo1, Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • Pfu DNA polymerase (Stratagene).
  • Using a DNA thermal cycler (PCR System 9600, PE Biosystems); 30 seconds at 94 ° C; 30 seconds at 55 ° C; 72.
  • CCR was performed 30 cycles of PCR with 1 minute as one cycle.
  • the resulting PCR products were 0.5 L each, the sense primer 3 and the antisense primer 3 each contained 50 pmo1, each containing 50? # 1
  • a reaction solution was prepared and subjected to PCR in the same manner as described above.
  • the resulting PCR product was double digested with EcoRI and KpnI.
  • the expression plasmid pMl070 International Publication No.WO95 / 13293
  • pMl807 which has a sequence encoding the human Fas ligand extracellular domain under the EF promoter and contains the DHFR gene
  • pMl807 was double-digested with EcoRI and KpnI.
  • a fragment of about 7 kbp was recovered and purified.
  • the fragment of the PCR product digested with EcoRI and KpnI described above was incorporated into this vector fragment, and the resulting plasmid was named pMl807.
  • Plasmid pMl809 expressing a fusion protein of FLAG peptide and human Fass ligand extracellular domain was prepared by the following method.
  • Antisense primer 5 (CTTGTCATCGTCATCCTTGTAG TCAGCAACAGACGTAAGAACC), Sense primer 5 (GAC
  • This antisense primer 5 contains 3, the terminal region of the sequence encoding the human Fas signal sequence and the sequence encoding the FLAG peptide.
  • Sense primer 5 contains a sequence encoding the FLAG peptide and a nucleotide sequence encoding the N-terminal side of the extracellular domain of human Fas ligand.
  • the obtained antisense primer 1 and the sense primer prepared in Example 1 (1) were used.
  • a 50-L PCR reaction solution containing 50 pmo1 of each of mer 3 and 0.05 pmo1 of sense primer 11 was prepared, and PCR was carried out in the same manner as in Example 1 (1).
  • the sense primer 5 and the antisense primer 14 prepared in Example 1 (1) were used at 50 pmo 1 each, and the ⁇ type was used in Example 1 (1).
  • a solution was prepared and subjected to PCR similarly. Fifty PCR reaction solutions containing 0.5 L of each of the obtained PCR products and 50 pmo1 of each of the sense primer 3 and the antisense primer 4 were prepared, and PCR was performed in the same manner.
  • the PCR product thus obtained was double-digested with EcoRI and KpnI, and incorporated into a vector fragment that was double-digested with EcoRI and KpnI of pMl070 as in Example 1 (1).
  • the resulting plasmid was named pMl809.
  • Plasmid pUC-I ZFL was prepared by the following method. pUCll8 (Takara Shuzo Co., Ltd.) is digested with PstI, the ends are blunted using DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.), and ligation is performed to crush the PstI site. PUC118 was obtained. This plasmid is double-digested with EcoRI and KpnI, and the PCR product containing the leucine zipper and human Fas ligand extracellular domain prepared in Example 1 (1) is double-digested with EcoRI and KpnI. The obtained plasmid was integrated, and the obtained plasmid was named pUC-I ZFL.
  • Plasmid pMl815, which expresses a fusion protein (SEQ ID NO: 4) of FLAG peptide, leucine zipper and human Fas ligand extracellular domain was prepared by the method shown below.
  • ATCCTTGTA and Sense Primer-6 (C GATGAC AAGAGAAT GAAAC AAATCGAAGAC) were synthesized using a chemical synthesizer.
  • This antisense primer 6 contains the sequence encoding the FLAG peptide and the 5 'end region of the sequence encoding the leucine zipper.
  • Sense primer 6 contains the 3 'terminal region of the sequence encoding the FLAG peptide and the 5 terminal region of the sequence encoding leucine zipper.
  • Example 1 (1) 5 O ⁇ L containing the obtained antisense primer 6 and the sense primer 13 prepared in Example 1 (1) at 50 pmo 1 respectively, and 1 ng of pM1809 prepared in Example 1 (2) as ⁇ Was prepared and PCR was performed in the same manner as in Example 1 (1).
  • a solution was prepared and subjected to PCR similarly. 0.5 L of each of the obtained PCR products and 50 L of a PCR reaction solution containing 50 pmo1 of each of sense primer 3 and antisense primer 3 were prepared, and PCR was performed in the same manner.
  • the PCR product thus obtained was double-digested with EcoRI and PstI.
  • the pUC-I ZFL prepared in Example 1 (3) was double-digested with EcoR I and Pst I, and subjected to agarose gel electrophoresis. Collected and refined. The fragment of the PCR product digested with the above EcoRI and PstI was incorporated into this vector side fragment to obtain a plasmid.
  • This plasmid was further double-digested with EcoR I and Kpn I, and the EcoR The resulting plasmid was incorporated into a vector-side fragment double-digested with I and Kpn I, and the resulting plasmid was named PM1815.
  • the present inventors deposited the plasmid pMl815 with the Patent Organism Depositary, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology at 1-1-1, Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan on May 12, 2000 (Accession number: FERM P-17853) and transferred from the original deposit to the international deposit on May 8, 2001 (Accession No. FERM BP-7575).
  • PMl 815, ⁇ 1809, pM1807, and pM1070 (International Publication Number W ⁇ 95 / 13293) prepared in Example 1 were introduced into COS-1 cells, and the protein was expressed and secreted in the supernatant. . That is, 1 plasmid was dissolved in 22 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 1 mM ethylenediaminetetraacetic acid solutions. To each of these, add 0.7 mL of D-MEM (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 0. SmgZmL DEAE-dextran and 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), and add the DNA-DEAE-dextran mixture. Produced.
  • D-MEM Dissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Fas ligand-specific antibody F 918-20-2 as a solid-phased antibody, F919-9-1-18 as a horseradish peroxidase-labeled antibody.
  • EIA Enzymei mmu no ass ay
  • WO 97Z02290 International Publication No. WO 97Z02290
  • the fusion protein FLAG-shF expressed by the plasmid pMl809 in which the FLAG peptide was fused to the human Fas ligand extracellular domain (shFasL) expressed by pM1070. as L had about three times the production.
  • the production amount of I 1 eZip-shFasL (pMl 807) fused with leucine zipper was remarkably reduced, while FLAG_IleZip-sFasL (FLAG peptide-fused) was further reduced.
  • M1815 had about 30 times the expression level.
  • Example 3 The apoptosis-inducing activity of various Fas ligand fusion proteins by adding the culture supernatant of cells was examined using WST-1 Atsushi shown below.
  • the COS-1 cell culture supernatant containing various Fas ligand fusion proteins obtained in Example 2 was diluted to a concentration to be assayed in a 1 ⁇ ?] ⁇ 11640 medium containing 10% to 83%.
  • 50 uLZwe 1 1 become so added previous cell Ueru the implanted 37 ° in C_ ⁇ 2 incubator C
  • apoptosis-inducing activity was measured.
  • 10 ⁇ l of WST-1 reagent Premix WST-1 Cell P roliferation Assay System, Takara Shuzo Co., Ltd.
  • FLAG—IleZips hFasL showed dose-dependently inhibitory activity on Jurkat cells.
  • FLAG-I 1 eZip-shFasL has about 10 times the apoptosis-inducing activity as compared to IleZipshFasL without the fusion of the FLAG peptide.
  • FLAG peptide had about 100-fold apoptosis-inducing activity as compared to shFasL to which no fusion was made.
  • F919-9-118 details are described in International Publication No. WO 097-0202290
  • Fas-F Fas-F It was shown that the activity was specific to the as ligand system.
  • an anti-Fas ligand antibody F919-9-18 (International publication) No. WO 097/02290) was purified by affinity chromatography using a Sepharose 4B carrier immobilized as follows. That is, 29,420 mL of COS-1 cell culture supernatant containing FLAG—IleZip—shFasL was passed through a 0.45 m filter (Millipack 60: Millipore), and the filtrate was collected. It was used as a purification starting material.
  • the purified starting material was flowed at a flow rate of 10 mL / min onto an F 919-9-9-18-Sepharose 4B FF column ( ⁇ 3.2 cm x 6.2 cm) previously equilibrated with phosphate-buffered saline (PBS-) in a cold place. Applied at. After applying the starting materials, the column was flushed with PBS at 15.3 mL / min (washing 1), and then the column was flushed with lmol / L NaCl / PBS- under the same conditions to perform a washing operation (washing 2).
  • Table 2 shows the quantitative results. Table 2 F 919-9-18 -Sepharose 4B Sample Volume (mL) FLAG-I Total FLAG—Recovery
  • FLAG-I1eZippsFaSL was found only in the eluted fraction.
  • Purified FLAG-IleZipsFaSL was obtained at a recovery rate of 84% by F919-9-118-Separose 4B FF column chromatography.
  • the purified product was electrophoresed by SDS-PAGE and subjected to silver staining (2D-silver staining reagent ⁇ II Daiichi: Daiichi Kagaku), which was detected as a single band (Fig. 3).
  • the cytotoxic activity of the purified product was confirmed by the method shown in Example 3. As a result, the purified product showed almost the same activity as the culture supernatant before purification.
  • a fusion protein having a biological activity as a Fs ligand is provided.
  • the Fas ligand fusion protein provided by the present invention has the effect of increasing the production of oligomer-forming peptides and recombinant proteins and increasing the biological activity of the fusion protein of leucine zipper and transmembrane protein. Since it is a fusion protein with its own peptide, high biological activity and high production are ensured.
  • the Fas ligand fusion protein can be developed as a therapeutic drug for a disease involving Fas-mediated apoptosis.
  • the present invention also provides a method for increasing the production amount of a recombinant protein which is useful for the production of the fusion protein, and which can be applied to all recombinant proteins. It provides a method for increasing biological activity.

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Description

明
F a sリガンド融合蛋癜質 技術分野
本発明は、 F a sリガンドずしおの生物孊的掻性を有する融合蛋癜質、 それを コヌドする DNA、 該 DNAを含む発珟ベクタヌ、 該ベクタヌにより圢質転換さ, 现
れた圢質転換䜓を提䟛する。 本発明は、 たた、 該融合蛋癜質の産生に有甚で あり、 か぀、 組換え蛋癜質党般に応甚可胜な組換え蛋癜質の産生量増加方法およ びロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質ずの融合蛋癜質の生物孊的掻性を䞊昇させ る方法を提䟛する。 背景技術
F a sは、 TNFレセプ倕䞀ファミリヌに属する分子量玄 45 kDの I型膜貫 通型蛋癜質であり、 抗 Fa s抗䜓 Yone ha r a e t a 1. , J . Ex P. Me d. 169 : 1747, 1989) や APO— 1抗䜓 T r a u t h e t a 1. , S c i enc e 267 : 1456, 1989) によっお認識さ れ、 アポトヌシスのシグナルを现胞に䌝達する现胞衚面抗原である。
ヒト F a sリガンドは、 F a sを発珟する现胞に察しおアポトヌシスを誘 導する生䜓内分子ずしお、 長田等のグルヌプにより最初に報告された TNF ファミリ䞀に属する分子量玄 40 kDの II型の膜貫通型蛋癜質で Tak ah a s h i e t a 1. , I n t e rn a t i ona l I mm u n o 1 o g y 6 : 1567, 1994) 、 TNFず同様、 生䜓内で 3量䜓を圢成するず考えら れおいる T a n a k a e t a 1.  EMBO J . 14 : 1129、 1 995) 。 たた、 ラット F a sリガンド S u d a e t a 1. C e 1 1 7 5 : 1 169, 1 993) やマりス F a sリガンド T a k a h a s h i e t a 1. , Ce l l 76 : 969, 1994) ず现胞倖領域においお高 ぃホモロゞ䞀を有しおおり、 ヒト F a sのみでなくマりス F a sをも認識 し、 アポトヌシスを誘導するこずができる。 同様にラット F a sリガンドおよび マりス F a sリガンドも、 ヒト F a sを認識しおアポト䞀'シスを誘導するこずが できる。
䞀方、 F a sを介するアポト䞀シスの现胞内シグナル䌝達機序に関しおも研究 が進んでおり、 F a sの现胞内領域、 特にデスドメむン De a t h doma i n) ず呌ばれる領域ず盞互䜜甚しおシグナルを䌝達たたは抑制する因子の同定 およびクロヌニングが報告されおいる他、 C a s p a s eず呌ばれる䞀連の システィンプロテア䞀れが F a sを介するアポト䞀シスのシグナル䌝達に寄䞎し おいるこずが報告されおいる。
近幎、 アポト䞀シス、 特に F a sを介するアポト䞀シスず皮々の疟患および生 理珟象ずの関連が瀺唆されおいる。 たずえば、 りィルス性劇症肝炎における肝现 胞死およびある皮の自己免疫疟患等においお、 Fa sを介するアポト䞀シスの異 垞が関䞎する可胜性が瀺唆されおいる。 たた、 F a s— F a sリガンド系は アポト䞀シス以倖の機胜、 たずえば、 奜䞭球に䜜甚しお起炎性に働く䜜甚等 も担っおいる可胜性が瀺唆されおいる 抧垣等、 臚床免疫 28 : 667, 1996) 。 組換え蛋癜質技術においお、 圢質転換䜓を甚いお適切な䞉次および四次構造を 有する生物孊的に掻性な組換え蛋癜質を発珟させるこずはしばしば重芁な課題ず なっおいる。 特に興味の察象ずなっおいるのは、 膜貫通型蛋癜質を生物孊的掻性 を有する可溶性蛋癜質ずしお発珟させるこずである。 可溶性蛋癜質は、 高床に粟 補された蛋癜質を倧量に必芁ずする医薬品ぞの適甚においお有甚である。
膜貫通型蛋癜質の可溶性圢態は、 膜貫通ドメむンおよび现胞質内ドメむンを削 陀し、 そしお適切なシグナルペプチドを添加しおその蛋癜質の可溶性圢態の分泌 を可胜にさせるこずにより調補されおいる Sm i t h e t ' a 1. , S c i e n c e 238 : 1704, 1987 ; Tr e i ge r e t a 1. , J . Immuno l. 136 : 4099, 1986 ) 。 F a sリガンドの堎合では、 CD8シグナル配列およびその现胞倖ドメむンずヒト F a sリガンド现胞倖ドメ むンの融合蛋癜質が開瀺されおいる 米囜特蚱第 6, 001 962号 。 しか し䞀般的に、 可溶型の F a sリガンドは党長型の F a sリガンドに比しお生物孊 的掻性が䜎いこずが知られおおり、 医薬の分野で利甚できる皋床の高い掻性を有 する F a sリガンドの提䟛はこれたでなされおいない。 F a sリガンドず同様、 䞉量䜓を圢成するこずが掻性に重芁であるず考えられおいる TNFファミリヌの 䞀員である CD 40リガンドにおいおは、 ロむシンゞッパヌを甚いお䞉量䜓 CD 40リガンドを調補する方法が開瀺されおいる 米囜特蚱第 5 716, 805 号 。 しかしながら、 融合蛋癜質がロむシンゞッパヌのようなオリゎマヌ圢成胜 を有するペプチドを含む堎合は、 機胜が保持された可溶性蛋癜質の収量が著しく 䜎䞋する堎合があり、 産生量を確保するのに困難が生じるこずがある P ac k e t a 1. J. Mo 1. B i o l. 246 : 28, 1995) 。 FLAG様ペプチドは、 融合蛋癜質の生物孊的掻性を倉化させず、 特異的モノ クロヌナル抗䜓により認識されるェピトヌプを提䟛するが、 このこずにより、 発 珟される融合蛋癜質の迅速な怜出および容易な粟補が可胜になる。 埓来、 FLAG様ペプチドは粟補甚のタグずしおのみ甚いられおきた。 近幎、 FLAG ペプチドを膜結合型蛋癜質の膜結合ドメむンに融合するこずにより融合蛋癜質を 可溶性圢態ずしお調補したのち、 FLAGペプチドをェンテロキナ䞀れを甚いお 陀去するず膜結合掻性が回埩するこずが瀺された Che n e t a 1. , B i o c h em i s t r y 37 : 13643, 1998) 。 しかし、 FLAG様 ペプチドが組換え蛋癜質の産生量を増加させる効果およびロむシンゞッパヌず膜 貫通型蛋癜質ずの融合蛋癜質の生物孊的掻性を䞊昇させる効果を有するこずは、 これたで知られおいなかった。
本発明の目的は、 高い生物孊的掻性を有する F a sリガンド融合蛋癜質を簡䟿 が぀倧量に䟛絊するこずにある。 たた、 そのために甚いるこずのできる、 組換え 蛋癜質の産生量を簡䟿に増加させる方法およびロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜 質ずの融合蛋癜質の生物孊的掻性を䞊昇させる方法もあわせお提䟛される。 高い 生物孊的掻性を有する F a sリガンド融合蛋癜質を簡䟿か぀倧量に䟛絊する こずは、 F a sを介したアポト䞀シスが関䞎する疟患の治療薬の開発に぀な がる。 たた、 F a s—; F a sリガンド結合により惹起される现胞内情報䌝達経路 の解明や、 F a s— F a sリガンド盞互䜜甚を制埡する新芏因子の採玢においお も必須であり、 医療をはじめ、 倚くの分野で枎望されおいる。
医薬の分野においお有甚な F a sリガンドを提䟛するためには、 高い生物孊的 掻性を保蚌するこずおよび高い産生量を確保するこずが重芁であるず考えられる が、 本発明以前にそのような提案はなされおいない。 発明の開瀺
本発明者は、 高い生物孊的掻性を有する F a sリガンドを高産生量で取埗する ベく鋭意研究を重ねおきた。 その結果、 F a sリガンドをロむシンゞッパヌおよ び F L A G様べプチドずの融合蛋癜質ずするこずにより、 高掻性か぀高産生量で 取埗するこずに成功した。 本発明においお、 F L A G様ペプチドが組換え蛋癜質 の産生量を増加させる効果およびロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質ずの融合蛋 癜質の生物孊的掻性を䞊昇させる効果を有するこずが開瀺される。
本発明第 1の態様は、 F a sリガンドのアミノ酞配列の少なくずも䞀郚を有す るペプチドず、 オリゎマヌ圢成胜を有するペプチド、 および組換え蛋癜質の産生 量を増加させるペプチドからなり、 F a sに結合する融合蛋癜質である。 本発明 第 2の態様は、 本発明第 1の態様の融合蛋癜質をコヌドする塩基配列を有 する D NAである。 本発明第 3の態様は、 本発明第 2の態様の D N Aを含む発珟 ベクタヌである。 本発明第 4の態様は、 本発明第 3の態様の発珟ベクタヌで圢質 転換された圢質転換䜓である。
本発明第 5の態様は、 所望の蛋癜質を F L A G様べプチドずの融合蛋癜質ずし お産生させるこずを特城ずする組換え蛋癜質の産生量増加方法である。 本発明第 6の態様は、 所望の蛋癜質をコヌドする塩基配列ず F L A G様ペプチドをコヌド する塩基配列を読み枠を合わせた状態で連結した D NA断片を含む発珟べクタ䞀 を䜜補し、 宿䞻ずなる適切な现胞や埮生物にその発珟べクタ䞀を導入し、 埗られ た圢質転換䜓を発珟に適切な条件で培逊し、 その培逊混合物から組換え蛋癜質を 回収、 粟補する工皋を含み、 該所望の蛋癜質の産生量を増加させる組換え蛋癜質 補造方法である。 本発明第 7の態様は、 ロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質の融 合蛋癜質を䜜補する際に、 該融合蛋癜質にさらに FLAG様ペプチドを連結する こずにより該融合蛋癜質の生物孊的掻性を䞊昇させる方法である。 図面の簡単な説明
図 1は、 J u r k a t现胞に察する各皮 F a s リガンド融合蛋癜質の アポト䞀シス誘導掻性を瀺す図である。
図 2は、 各皮ヒト F a sリガンド融合蛋癜質の䞀次構造を暡匏化した図 である。
図 3は、 粟補 FLAG— I 1 e Z i p - s h F a s Lを電気泳動埌、 銀染色を 行った図である。 発明を実斜するための最良の圢態
以䞋に詳现に本発明を説明する。
たず、 本発明第 1の態様の融合蛋癜質に぀いお説明する。 本明现曞䞭の説明に おいお、 Fa sリガンドずは、 少なくずもその生物孊的掻性ずしお、 Fa sに結 合する掻性を有する物質のこずである。 より奜たしくは、 Fa sを発珟する现胞 にアポト䞀シスを誘導する掻性を有する物質である。 すなわち、 本明现曞䞭の説 明においお F a sリガンドに関する生物孊的掻性ずは、 Fa sに結合する掻性の こずであり、 より奜たしくは F a sを発珟する现胞にアポトヌシスを誘導する掻 性を意味する。 F a sリガンドによるアポトヌシスの誘導は、 Fa sリガンドが 现胞衚面の F a sに結合し、 Fa sを介しお、 アポ 1 ^䞀シスのシグナルが现胞に 䌝達されるためず考えられおいる。 ここでいう F a sあるいは Fa sリガンドは 䟋えば、 ヒト、 マりス、 ラット、 モルモット、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブタ、 ヒッゞ、 ゥシ、 ゥマ、 サル、 ネコ、 ィヌ、 マヌモット等のいかなる動物皮由来の ものであっおもよいが、 奜たしくはヒト由来のものである。
本発明第 1の態様の a) F a sリガンドのアミノ酞配列の少なくずも䞀郚を 有するぺプチドずは、 奜たしくは配列衚の配列番号 1に蚘茉のアミノ酞配列の党 䜓を有するペプチド、 および、 そのアミノ酞配列の任意の長さからなる任意の䞀 郚分を有するペプチドであり、 F a sリガンドずしおの生物孊的掻性を有するも のを意味する。 もちろん、 そのアミノ酞配列の任意の䞀郚に加え、 その N末端、 C末端のいずれか䞀方、 もしくはその䞡方に、 䟋えば Me t等の任意の 1぀以䞊 のアミノ酞が付加しおなるアミノ酞配列で芏定されるペプチド、 あるいはァミノ 酞配列䞭の任意の䜍眮に 1぀以䞊のアミノ酞の倉異、 付加、 欠倱、 眮換が生じた ものであっおも F a sリガンドずしおの生物孊的掻性を有する限りにおいおは、 これに含たれる。 䟋えばラットやマりスの F a sリガンドのアミノ酞配列はヒト の Fa sリガンドのアミノ酞配列に耇数の眮換、 欠倱が生じおいるものず䜍眮づ けるこずができるが、 いずれも F a sリガンドずしおの生物孊的掻性を有するこ ずが知られおいる。 同様に、 ァカゲザル Wang e t a 1. Human Immuno l ogy 59 : 599, 1998 ) やモルモット、 ニヮトリ、 ゥ サギ、 ブタ、 ヒッゞ、 ゥシ、 ゥマ、 サル、 ネコ、 ィヌ、 マヌモット等の他の動物 皮由来の F a sリガンドであっおも、 Fa sリガンドずしおの生物孊的掻性を有 する限りにおいおは本発明第 1の態様の F a sリガンドのアミノ酞配列の少なく ずも䞀郚を有するペプチドに含たれる。 F a sリガンドのアミノ酞配列の少なく ずも䞀郚を有するペプチドの最も奜適な䞀䟋は、 F a sリガンドの现胞倖ドメむ ンである。 F a sリガンドの现胞倖ドメむンは、 配列衚の配列番号 1に蚘茉のヒ トの F a sリガンドでは 1 0 3〜2 8 1アミノ酞郚分に盞圓する。 たた他の奜適 な䟋ずしおは、 生䜓内で膜型ヒト F a sリガンドからプロテアヌれ切断によっお 遊離される可溶型ヒト F a sリガンドに盞圓する 1 3 0〜2 8 1アミノ酞郚分が 挙げられる。 本発明第䞀の態様の融合蛋癜質は、 F a sに結合する掻性を有する 限りにおいおはアポトヌシスを誘導する掻性のあるものであっおもないもの であっおもよい。 F a sに結合し、 か぀アポトヌシスを誘導しない堎合には、 生 䜓内の F a sリガンドに拮抗する物質ずしお、 アポトヌシスを人為的に抑制する ために䜿甚するこずができる。 しかしながら、 本発明第䞀の態様の融合蛋癜質は アポト䞀シスを誘導する掻性を有するものであるこずが奜たしい。 ヒトの F a s リガンドにおいおは N末端から 1 4 5〜2 8 1アミノ酞郚分がアポトヌシス誘導 掻性に必芁であるこずが知られおいる。 した力぀お、 本発明第䞀の態様の融合蛋 癜質は F a s リガンドのアミノ酞配列の少なくずも䞀郚ずしお、 ヒトの F a sリガンドの 1 4 5〜2 8 1アミノ酞郚分を含有するものが奜たしい。 しか しアポトヌシス誘導掻性がより匷いものずしおは、 ヒトの F a sリガンドの 1 4 4番目以降のアミノ酞配列に察応する配列を含有するものが奜たしい。
( b ) オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドずは、 二量䜓、 䞉量䜓、 或いはそれ より高床のオリゎマヌぞず自己䌚合する胜力があるペプチドのこずであり、 倚く の堎合、 α—ぞリックスや /3—シヌトのような 2次構造をずりうる。 ロむ 䞀が奜適な 1䟋ずしお提䟛される。 ロむシンゞッパヌは、 数々の蛋癜質における保存ドメむンずしお存圚する、  ab c d e f g) n (nは 4あるいは 5) ず衚瀺される反埩性 7残基モチヌフを 意味するのに甚いられる甚語である。 匏䞭、 aおよび dは䞀般的にロむシンある いはむ゜ロむシンのような疎氎性残基であり、 これらはぞリックスの同䞀面に䞊 んでいる McLa c h l an e t a l . , J. Mo l. B i o l. 98 : 293 1975) 。 䜍眮 dに存圚するロむシン残基は倧きな疎氎性安定化゚ネ ルギ䞀の䞀因ずなっおおり、 そしおこれは二量䜓圢成にずっお重芁である (Kry s t e k e t a l . , I n t. J. Pe p t i d e Re s. 38 : 229 19,91) 。 たた、 ロむシンゞッパヌの䞊蚘匏 aおよび d残基に察応 するアミノ酞眮換がロむシンゞッパヌのオリゎマヌ圢成特性を倉化させるこずが 芋いだされた Ha r bu r y e t a l . , S c i e n c e 262 : 1401 1993.) 。 䜍眮 aの党おの残基がむ゜ロむシンに代わる堎合には、 ロむシンゞッパヌは䟝然ずしお平行二量䜓を圢成する。 この倉化に加え、 䜍眮 d のロむシン残基が党おィ゜ロむゞンに代わる堎合には、 埗られるぺプチドは溶液 䞭においお自発的に䞉量䜓平行らせん状コむルを圢成する。 䜍眮 dの党おのアミ ノ酞をむ゜ロむシンで、 そしお䜍眮 aの党おのアミノ酞をロむシンで眮換するず 四量䜓を圢成する。 オリゎマヌ圢成のメカニズムが同䞀であるかぎり、 これらの 眮換を含むペプチドは䟝然ずしおロむシンゞッパヌずしお匕甚される。 ロむシン ゞッパヌのもっずも奜適な 1䟋は、 配列番号 2に蚘茉される配列を有するもので あるがオリゎマヌ圢成胜を有するかぎりにおいおはこれに限定されるものではな い。 オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドの他の䟋ずしおは、 p 53の四量䜓化に 関䞎する配列、 血小板因子 4、 ヒストン H3および H4蛋癜質の䞀郚の配列など が知られおいる これらは、 特衚平 1 1侀 508 126号公報に詳现に蚘茉 され、 本明现曞はこれを匕甚ずしお明现曞の内容ずする。  。 ここで、 アミノ酞 配列䞭の任意の䜍眮に 1぀以䞊のアミノ酞の倉異、 付加、 欠倱、 眮換が生じたも のであっおもロむシンゞッパヌずしおの生物孊的掻性を有する限りにおいおは、 これに含たれる。
(c) 組換え蛋癜質の産生量を増加させるペプチドずは、 䟋えば哺乳動物现胞 に融合蛋癜質を産生させる際に培逊䞊枅から回収できる融合蛋癜質量を増加させ る効果や、 倧腞菌に融合蛋癜質を産生させる際に菌䜓のラむセヌトから回収でき る融合蛋癜質量を増加させる効果を有するぺプチドを意味する。 組換え蛋癜質の 産生量を増加させるペプチドの奜適な 1䟋ずしお本発明者は初めお FLAG様べ プチドを芋出した。 本明现曞䞭の説明においお FLAG様ペプチドずは、 奜たし くは A s — Ty r— Ly s—A s p— As p— As p— As p— Ly sずいう 8アミノ酞からなる FLAGペプチドのこずである Ho p p e r e t a l.  B i o/Te c hno l ogy 6 : 1204, 1988 ;米囜登録商 暙登録番号第 1557485号 。 しかし、 組換え蛋癜質の産生量を増加させる 効果を有し、 より奜たしくはロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質ずの融合蛋癜質 の生物孊的掻性を䞊昇させる効果を有する限りにおいおは、 そのアミノ酞配列の 任意の䞀郚に加え、 その N末端、 C末端のいずれか䞀方、 もしくはその䞡方に、 䟋えば Me t等の任意の 1぀以䞊のアミノ酞が付加しおなるアミノ酞配列で芏定 されるペプチド、 あるいはアミノ酞配列䞭の任意の䜍眮に 1぀以䞊のアミノ酞の 倉異、 付加、 欠倱、 眮換が生じたものであっおも、 これに含たれる。 このような ペプチドを FLAG様ペプチドず呌ぶ。 䟋えば、 A s p— L e u— Ty r 侀 As p—As p— As p—As p— Ly sずいうアミノ酞配列からなるぺプチ ドも、 前述の 8アミノ酞からなる配列ず同等の機胜を有するものずしお䜿甚され おいる。 すなわち、 FALG様ペプチドの奜たしい䞀圢態は、 アミノ酞配列 が As p— B— Z—As p— As p— As ρ—As p— Ly s (䌹し、 Ty r— Ly sたたは L e u— Tyr である からなるペプチドず衚すこずが出来る。 たた 別の䞀圢態ずしおは、 特公平 7— 4255に蚘茉されおいるように、 アミノ酞配 列が As ρ-Ty r -Ly s—Xい n — R (䜆し、 Rは Ly s、 Ar g、 Me t たたは As nであっお、 Xi-n は Ly s、 Ar g、 Me tおよび As n以倖のい ずれかのアミノ酞を意味する。  からなるペプチドず衚すこずが出来る。 ここで、 nは特に限定されないが奜たしくは 3〜 5である。
本発明の融合蛋癜質は F a sリガンドのアミノ酞配列の少なくずも䞀郚を有す るペプチド、 オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドおよび組換え蛋癜質の産生量を 増加させるペプチドから構成されるが、 少なくずも F a sず結合するずいう性質 を保持しおおり、 より奜たしくは F a sを発珟しおいる现胞にアポトヌシスを誘 導する掻性を保持しおいる限りにおいおは、. 3皮のペプチドはいかなる順序で連 結されおもよいし、 任意のリンカ䞀配列やシグナル配列を含むこずもできる。 F a sリガンドの堎合、 C末端偎においお F a sず盞互䜜甚するこずが知られおい るので、 オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドおよび組換え蛋癜質の産生量を増加 させるペプチドは F a sリガンドのアミノ酞配列の少なくずも䞀郚を有する ペプチドの N末端偎に連結されるこずが奜たしい。 リンカ䞀配列は、 圓技術分野 においお呚知である。 シグナル配列の䟋ずしおは、 マりス Tリンパ球抗原 CD 8 シグナル配列、 バキュロりィルス gp 67蛋癜シグナル配列、 G— CSFシグナ ル配列、 ヒト F a sシグナル配列のような蛋癜質の分泌を促すシグナル配列が挙 げられる。
本発明の融合蛋癜質の奜適な 1䟋は、 N末端偎から F L AG様べプチド、 ロむシンゞッパヌ、 ヒト F a sリガンドの现胞倖ドメむンの順に連結された融合 蛋癜質である。 最も奜適な 1䟋は配列衚の配列番号 4に瀺されるアミノ酞配列を 有するものであり、 N末端偎からヒト F a sシグナル配列、 FLAGペプチド、 ロむシンゞッパヌ、 ヒト F a sリガンドの现胞倖ドメむンの順に連結された融合 ' 蛋癜質である。 配列番号 4のアミノ酞配列の任意の䞀郚に加え、 その N末端、 C 末端のいずれか䞀方、 もしくはその䞡方に、 䟋えば Me t等の任意の 1぀以䞊の アミノ酞が付加しおなるアミノ酞配列で芏定されるペプチド、 あるいはアミノ酞 配列䞭の任意の䜍眮に 1぀以䞊のアミノ酞の倉異、 付加、 欠倱、 眮換が生じたも のであっおも、 本発明の融合蛋癜質に含たれる。
本発明の融合蛋癜質の生物孊的掻性、 すなわち F a sずの結合胜あるいはアポ ト䞀シス誘導掻性の怜定には実斜䟋に瀺されおいる WST— 1アツセィのほかに 通垞甚いられるアツセィを甚いるこずができる。 WST— 1アツセィは宝酒造株 匏䌚瀟の P r emi x WST- 1 Ce l l P r o l i f e r a t i on As s ay Sy s t e mに埓っお行うこずが出来る。 Fas 発珟现胞ずしおは、 ヒト T现胞由来株化培逊现胞である J u r k a t现胞を甚いるこずが奜たしい。 WST— 1アツセィ以倖のアツセィずしおは、 䟋えば F a sずの結合胜を調べる には、 Fa sず本発明の融合蛋癜質ずで免疫沈降を行う方法や、 該融合蛋癜質を 認識する抗䜓を蛍光暙識したうえで、 F a sを発珟しおいる现胞に結合した該融 合蛋癜質をフロヌサむトメトリヌで調べるこずができる。 たたアポトヌシス誘導 掻性の怜定にはル䞀ビ゚等の方法を甚いるこずができる J. Exp. Me d. 177 : 195, 1993) 。 本発明の融合蛋癜質のアポトヌシス誘導掻性は、 実斜䟋に瀺されおいる WS T— 1アツセィにおいお該融合蛋癜質を 3 n g/mL 添加したずきの现胞生存率が 50%以䞋であるこずが奜たしい。 同アツセィにお いお现胞生存率が䜎いほど、 該融合蛋癜質のアポトヌシス誘導掻性は高いず評䟡 できる。 高いアポトヌシス誘導掻性を有する本発明の融合蛋癜質は、 医薬品に適 甚する際に、 治療に有効な投䞎量を䜎く抌さえるこずができるため副䜜甚の軜枛 や補造コストの䜎䟡栌化に぀ながり有甚である。 本発明の融合蛋癜質のより奜た しい䟋は、 同アツセィにおいお該融合蛋癜質を 3 ng/mL添加したずきに達す る现胞生存率が 20%以䞋であるアポト䞀シス誘導掻性を有するものである。 本発明の融合蛋癜質は、 FLAG様ペプチドずロむシンゞッパヌの䞡方を甚い るこずにより、 F a sリガンドずしおの掻性を増倧させ、 か぀融合蛋癜質の産生 量も増倧させた点に特城がある。 生䜓内で倚量䜓構造をずりうる F a sリガンド のような分子の堎合、 ロむシンゞッパヌずの融合蛋癜質ずすれば組換え蛋癜質で 掻性を有するものが取埗できるであろうこずは予枬可胜であ぀たが、 驚くべきこ ずにロむシンゞッパヌに F L A Gぺプチドを組み合わせるこずによっお、 口むシ ンゞッパヌのみを䜿甚した堎合に比べお掻性が䞊昇し、 たた産生量も増倧した。 すなわち、 本発明の融合蛋癜質は、 ロむシンゞッパヌのみずの融合蛋癜質ずした 堎合に比べお、 産生量が少なくずも 1. 5倍以䞊、 奜たしくは 2倍以䞊、 より奜 たしくは 3倍以䞊、 曎に奜たしくは 20倍以䞊、 特に奜たしくは 30倍以䞊であ り、 か぀ Fa sリガンドずしおの生物孊的掻性が 1. 5倍以䞊、 奜たしくは 2倍 以䞊、 より奜たしくは 3倍以䞊、 曎に奜たしくは 5倍以䞊、 特に奜たしくは 10倍以䞊であるこずを特埵ずするものである。
本発明第 1の態様の融合蛋癜質は、 組換え型蛋癜質ずしお遺䌝子工孊的に生産 される。 該融合蛋癜質を遺䌝子工孊的に生産する䟋には、 埌述する本発明第 2の 態様の新芏 DNA、. もしくは第 3の態様の発珟ベクタヌを甚いお、 適圓な宿䞻现 胞を圢質転換し、 埗られた圢質転換䜓を培逊しお培逊混合物を回収し、 該融合蛋 癜質を粟補する。 たた、 該 DN Aや組換え DN A分子を利甚しお無现胞系の合成 方法 (S amb r ook e t a 1. Mo l e c u l a r C l on i ng 2 n d e d . Co l d S p r i n g Ha r b o r L ab o r a t o r y, New Yo r k. 1989) で埗る方法も、 遺䌝子工孊的に生産する方 法の 1぀である。 遺䌝子工孊的に融合蛋癜質を補造する奜たしい方法に぀いおは 本発明第 6の態様で説明する。
次に本発明の第 2の態様の DN Aに぀いお説明する。 該 DN Aは本発明第 1の 態様の融合蛋癜質をコヌドする塩基配列を有する。 該融合蛋癜質は F a sリガン ドのアミノ酞配列の少なくずも䞀郚を有するペプチド、 オリゎマヌ圢成胜を有す るペプチドおよび組換え蛋癜質の産生量を増加させるペプチドから構成されるの で、 該 DNAはそれら 3皮のペプチドをコヌドする塩基配列を読み枠を合わせた 状態で連結したものである。 該 D N Aがコヌドする融合蛋癜質が少なくずも Fa sず結合するずいう性質を保持しおおり、 より奜たしくは Fa sを発珟しお いる现胞にアポト䞀シスを誘導する掻性を保持しおいる限りにおいおは、 3皮の ぺプチドをコヌドする塩基配列はいかなる順序で連結されおもよいし、 任意のリンカ䞀配列やシグナル配列をコヌドする塩基配列を含むこずもできる。 F a sリガンドの堎合、 C末端偎においお F a sず盞互䜜甚するこずが知られお いるので、 オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドおよび組換え蛋癜質の産生量を増 加させるペプチドをコヌドする塩基配列は F a sリガンドのアミノ酞配列の少な くずも䞀郚を有するぺプチドをコ䞀ドする塩基配列の 5'末端偎に連結されるこず が奜たしい。
䞀般に、 同䞀の機胜を有するポリペプチドに察する D NAは、 動物皮や個䜓が 異なっおいおも互いに盞同性があり、 互いにハむブリダィズするこずが倚い。 ァ ミノ酞の倚様性も、 それらをコヌドする D N Aが互いにハむブリダィズする範囲 で生じるこずが倚い。 䟋えばハむブリダィれ䞀シペン法による D N Aの クロヌニングは、 異なるアミノ酞配列をコヌドする D N Aが互いにハむブリダむ ズするこずを瀺しおいる。 互いにハむブリダィズする D NAによっおコヌドされ るアミノ酞配列を有するポリペプチドは、 実質的に同䞀の機胜を有するず考えら れる。
埓っお、 本発明の融合蛋癜質は、 そのアミノ酞配列をコヌドする塩基配列に盞補 的な塩基配列にハむプリダむズする塩基配列によっおコ䞀ドされるアミノ酞配列 を含有するもので F a sに結合する掻性を有するものずしおも特城づけるこずが できる。 '
3皮のぺプチドそれぞれをコ䞀ドする塩基配列を有する D NA断片は、 いかな る方法で埗られたものでもよい。 すなわち、 化孊合成されたものであっおも よく、 適圓な D NAラむブラリ䞀からクロヌニングされたものであっおもよい。 たた、 該配列を有する別の組換え D NAから制限酵玠凊理により切り出し調補し たものであっおもよいし、 別の組換え D NAを铞型にしお適圓なプラむマヌをも ちいお P C R法により増幅しお調補したものでもよい。 それらの D NA断片は公 知のラむゲ䞀シペン方法により぀なぎあわせるか、 断片の混合物を錡型ずし お適圓なプラむマヌを甚いお PC R法により連続した DNA断片ずするこずがで さる。
次に、 本発明第 3の態様の発珟ベクタヌに぀いお説明する。 本発明第 3の態様 の発珟ベクタヌは、 䞊述した本発明第 2の態様の DN Aを含む。 この DNA断片 を、 哺乳類、 埮生物、 りィルス、 もしくは昆虫遺䌝子から埗られるもののような 適切な転写および Zたたは翻蚳調節塩基配列に機胜可胜なように連結させる。 調 節配列の䟋には、 遺䌝子発珟における調節的圹割を有する配列 䟋えば、 転写プ 口モヌタヌもしくはェンハンサヌ 、 転写を制埡するためのオペレヌタヌ配列、 mRNAリボ゜ヌム結合郚䜍をコヌドする配列、 ポリアデニル化郚䜍、 スプラむ スドナヌおよびァクセプタ䞀郚䜍、 ならびに転写および翻蚳の開始および停止を 制埡する適切な配列が含たれる。 これらの塩基配列の必芁性は、 発珟べクタ䞀の 䜿甚目的によっお決定される。
本発明の第 3の態様の発珟べクタ䞀は、 本発明の第 2の態様の DNAを任意の ベクタ䞀に導入しお埗るこずができる。 必芁であれば、 該 DN Aを他の塩基配列 ずずもに任意のベクタヌに導入しおもよい。 DNAをベクタヌに導入する方法は 公知である (S amb r ook e t a l. Mo l e cu l a r C l on i n g 2nd e d. Co l d S p r i ng Ha r bo r L a b o r a t o r y, New Yo r k. 1989) 。 すなわち、 DNAずべクタ䞀をそれぞ れ適圓な制限酵玠で消化し、 埗られたそれぞれの断片を DNAリガヌれを甚いお ラむゲ䞀シペンさせればよい。 ベクタ䞀は、 プラスミドベクタヌ、 ファヌゞべク 倕䞀、 ã‚Šã‚£^スベクタヌ等いかなるものでもよい。 たずえば、 pSV2— dh f , r、 pB l ue s c r i p t l l, p P I C 9 K, A Z ap I I、 λ g t 11 , p E F— B〇 S等から適宜遞択しお䜿甚するこずができる。 該発珟べクタ䞀は、 本発明第 2の態様の DN Aに加えお倧腞菌耇補開始点、 マヌカ䞀遺䌝子、 ポリ A 付加配列を有しおいるこずが奜たしい。 これらに加えお、 倧腞菌で機胜する t r pプロモヌ倕䞀、 1 a cプロモヌ倕䞀、 もしくは酵母で機胜するアルコヌルォキ シダヌれ A〇X) 1のプロモヌタヌ、 もしくは昆虫现胞で機胜するポリべドリ ンプロモヌタ䞀、 もしくは動物现胞で機胜する SV40のプロモヌ倕䞀や SR のプロモヌタ䞀、 ヒトェロンゲヌシペンファクタヌ 1ひ (EF 1 α) のプロモ䞀 倕䞀を有するものも該発珟べクタ䞀の奜適な䟋ずしお挙げられる。
次に、 本発明の第 4の態様の圢質転換䜓に぀いお説明する。 本発明の第 4の態 様の圢質転換䜓は、 本発明の第 3の態様の発珟ベクタヌで圢質転換される。 すな わち、 本発明第 4の態様の圢質転換䜓は、 宿䞻ずなる適圓な现胞や埮生物に、 本 発明第 3の態様の発珟ベクタヌを盎接導入する事によっお圢質転換される。 本発 明の第 3の態様の発珟べクタ䞀を宿䞻现胞に導入する方法ずしおは、 ゚レクト口 ポレヌシペン法、 プロトプラスト法、 アルカリ金属法、 リン酞カルシりム沈 柱法、 DEAEデキストラン法、 マむクロむンゞェクション法、 りィルス粒子を 甚いる方法等の公知方法 実隓医孊臚時増刊、 遺䌝子工孊ハンドブック 1991 幎 3月 20日発行、 矊土瀟、 参照 があるがいずれの方法を甚いおも構わない。 本発明の圢質転換䜓は、 本発明の第 2の態様の DN Α分子を倧量に補造する目的 でも䜿甚するこずができる。 たた、 本発明の第 2の態様の DNAが、 宿䞻现胞の 適圓なプロモヌタヌの䞋流に組み蟌たれた堎合には、 該圢質転換䜓は、 本発 明第 1の態様の融合蛋癜質を生産する。 埓っお、 このような圢質転換䜓は、 本発 明の第 1の態様の融合蛋癜質を補造する目的等に䜿甚できる。 本発明第 4の態様 の圢質転換䜓は、 原栞现胞、 真栞现胞のいずれであっおもよい。 原栞现胞の代衚 的な䟋ずしおは、 倧腞菌 枯草菌があげられる。 真栞现胞の代衚的な䟋ずしおは CHO现胞、 HeLa现胞、 COS现胞、 N am a 1 w a现胞等の哺乳動物现胞 の他、 S ί现胞等の昆虫现胞や酵母等があげられる。 奜たしくは、 該圢質転換䜓 は、 本発明の融合蛋癜質を産生するものがよく、 より奜たしくは、 本発明の融合 蛋癜質を培地䞭に分泌するものがよい。 もっずも奜適な䟋の 1぀ずしおは COS— 1现胞が挙げられる。
次に、 本発明の第 5の態様である、 所望の蛋癜質を FLAG様ペプチドずの融 合蛋癜質ずしお産生させるこずを特城ずする組換え蛋癜質の産生量増加方法に぀ いお説明する。 組換え蛋癜質の産生量を増加させるずは、 䟋えば哺乳動物现胞に 融合蛋癜質を産生させる際に培逊䞊枅から回収できる蛋癜質量が増加するこ ずや、 倧腞菌に融合蛋癜質を産生させる際に菌䜓のラむセヌトから回収できる蛋 癜質量が増加するこずを意味する。
本方法の特城は、 FLAG様ペプチドを埓来のように粟補甚のタグずしおのみ 甚いおるのではなく、 組換え蛋癜質の産生量を増加させる配列ずしお䜿甚しおい るずころにある。 埓来知られおいる組換え蛋癜質の産生量を増加させるような配 列ずしおは、 分泌シグナル配列が挙げられる。 分泌シグナルペプチドは现胞から の蛋癜質の分泌を容易にする。 F LAG様べプチドは分泌シグナル配列ではない が、 組換え蛋癜質の産生量を増加させる効果を有するこずを本発明者は新たに芋 出した。 実斜䟋 2に瀺されるように、 COS— 1现胞にお F a sリガンドの现胞 倖ドメむンを産生する際に、 F a sリガンドの现胞倖ドメむンの N末端偎に F L A Gペプチドを連結するず産生量が玄 3倍に増加した。 䞀方、 生物孊的掻性 を䞊昇させるために F a sリガンドの现胞倖ドメむンの N末端偎にロむシンゞッ パヌを連結した堎合では、 ロむシンゞッパヌの存圚により発珟量が著しく枛少し たが、 F L A Gぺプチドをさらに連結するず産生量が 2 0〜 3 5倍䞊昇した。 サ むト力むンのようなオリゎマヌの圢成が掻性に重芁な蛋癜質を、 オリゎマヌ圢成 胜を有するぺプチドずの融合蛋癜質ずしお産生させるず産生量が著しく䜎䞋する ずいう問題が生じるこずがある。 このような堎合に F L A G様べプチドをさらに 融合し産生量を増倧させるこずができる。 所望の蛋癜質を F L A G様べプチドず の融合蛋癜質ずしお産生させる方法に぀いおは本発明第 6の態様で説明する。 次に、 本発明第 6の態様である、 所望の蛋癜質をコヌドする塩基配列ず F L A G様ペプチドをコヌドする塩基配列を読み枠を合わせた状態で連結した D N A断 片を含む発珟ベクタヌを䜜補し、宿䞻ずなる適切な现胞や埮生物にその発珟べク タヌを導入し、 埗られた圢質転換䜓を発珟に適切な条件で培逊し、 その培逊混合 物から組換え蛋癜質を回収、 粟補する工皋を含み、 該所望の蛋癜質の産生量を増 加させる組換え蛋癜質補造方法に぀いお説明する。
該 D N A断片は、 F L A G様べプチドによる産生量増倧効果が認められる限り においおは、 所望の蛋癜質をコヌドする塩基配列ず F L A G様ペプチドをコヌド する塩基配列がいかなる順序で連結されおもよいし、 任意のリンカヌ配列や シグナル配列をコヌドする塩基配列を含むこずもできる。 発珟べクタ䞀に぀いお は本発明第 3の態様に説明されおいる。 圢質転換䜓に぀いおは本発明第 4の態様 に説明されおいる。
圢質転換䜓の培逊は、 䞀般的な方法で行うこずができる。 圢質転換䜓の培逊に ぀いおは各皮の成曞  「埮生物実隓法」 瀟団法人日本生化孊䌚線、 株匏䌚瀟東京 化孊同人、 1 9 9 2幎、 等 があるので、 それらを参考にしお行うこずがで きる。 たた、 遺䌝子の増幅や発珟誘導の方法おょぎ必芁性は、 宿䞻ずなる现胞の 皮類や、 䜿甚するプロモ䞀タヌによっお異なる。 䟋えは、 プロモヌタヌが t r p プロモヌタ䞀である時には 3 ]3—むンドヌルアクリル酞で、 MM T Vプロ モヌタヌである堎合にはデキサメサゟンで、 Α〇χ 1プロモヌタヌであればメタ ノヌルで誘導するこずが可胜である。 DHFR (葉酞脱氎玠酵玠 遺䌝子を含む発珟 ベクタ を甚いた時にはメトトレキセヌトで遺䌝子の増幅を行うこずが可胜であ る。
本発明第 6の態様においお、 培逊混合物ずは、 培逊䞊枅もしくは现胞のこずで ある。 すなわち、 圢質転換䜓が、 該組換え蛋癜質を现胞倖に分泌する堎合にはそ の培逊䞊枅を材料ずしお該蛋癜質を回収、 粟補する。 䞀方、 該組換え蛋癜質が宿 䞻现胞内に蓄積される堎合には、 リゟチヌム、 界面掻性剀、 凍結融解、 加圧等の 手段を甚いお现胞を砎碎した埌、 遠心分離しお䞊枅を回収し、 濟過等により䞍芁 な现胞断片等を取り陀いた埌に、 それを材料ずしお該組換え蛋癜質を粟補する。 䜿甚する圢質転換䜓が倧腞菌であり、 産生された該蛋癜質がペリブラズムに蓄積 される堎合は、 りィルスキヌ等の方法 J . B a c t e r i o l . 1 2 7 : 5 9 5 , 1 9 7 6 ) 等が䜿甚できる。 培逊混合物から該組換え蛋癜質を粟補する 方法ずしおは、 蛋癜質の粟補に通垞䜿甚されおいる方法の䞭から適切な方法を適 宜遞択しお行うこずができる。 すなわち、 塩析法、 P艮倖濟過法、 等電点沈柱法、 ゲル濟過法、 電気泳動法、 むオン亀換クロマトグラフィヌ、 疎氎性クロマトダラ フィ䞀、 抗䜓クロマトグラフィヌ等の各皮ァフィ二ティヌクロマトグラフィヌ、 クロマトフォヌカシング法、 吞着クロマトグラフィヌおよび逆盞クロマトグ ラフィ䞀等、 通垞䜿甚され埗る方法の䞭から適切な方法を適宜遞択し、 必芁によ り HPLCシステム等を䜿甚しお適圓な順序で粟補を行えば良い。 奜適な䞀䟋ずしお は実斜䟋 4に瀺す方法が挙げられる。 他の奜適な䞀䟋ずしおは、 F L A G様ぺプ チドに察する特異抗䜓を甚いたァフィ二ティヌクロマトグラフィヌが挙げられ、 その方法は米囜特蚱第 5, 011 912号においお開瀺されおいる。 As p— As p— As p— As p-Ly sずいうアミノ酞配列を含む F LAG様ペプチド はェンテロキナヌれを甚いお切陀するこずが可胜であり、 該組換え蛋癜質を F L AG様べプチドを陀去したかたちで取埗するこずもできる。 本発明の第 5お よび第 6の態様においお、 「蛋癜質の産生量の増加」 ずは、 FLAG様ペプチド ずの融合蛋癜質ずしない堎合に比べお、 産生量が少なくずも 1. 5倍以䞊、 奜た しくは 2倍以䞊、 より奜たしくは 3倍以䞊、 曎に奜たしくは 20倍以䞊、 特に奜 たしくは 30倍以䞊であるこずを意味する。 蛋癜質の産生量の枬定は、 実斜䟋 2 に瀺すような目的の蛋癜質に特異的な抗䜓を甚いた E I A系を䜿甚できるほか、 圓業者が甚い埗る䞀般的な方法を甚い埗る。
次に、 本発明第 7の態様である、 ロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質の融合蛋 癜質を䜜補する際に、 該融合蛋癜質にさらに F L A G様べプチドを連結するこず により F L A G様ペプチドが融合されおいる該融合蛋癜質の膜貫通型蛋癜質ずし おの生物孊的掻性を䞊昇させる方法に぀いお説明する。 ロむシンゞッパヌに぀い おは、 本発明第 1の態様で説明されおいる。 膜貫通型蛋癜質の䟋ずしおは、 TNF«、 Fa sリガンド、 TRAI L、 CD 40リガンドなどが属する TNF ファミリヌや TNFレセプタヌ、 Fa s、 DR4などが属する TNFZNGFレ セプ倕䞀ファミリ䞀が挙げられ、 他にぞモポむ゚チンレセプ倕䞀ファミリヌ、 ィ ンタヌフェロンレセプ倕䞀フアミリヌ等のサむトカむンレセプ倕䞀も挙げら れる。 これら膜貫通型蛋癜質の生物孊的掻性ずは、 少なくずも、 レセプタヌの堎 合は察応するリガンドに、 リガンドの堎合は察応するレセプタヌに結合する掻性 を意味する。 膜貫通型蛋癜質は䞀般的に现胞内ぞシグナルを䌝達する機胜を有す るが、 䞡者が結合する掻性を有しおいる限りにおいおは、 䞡者の結合により现胞 内ぞシグナルを䌝達する掻性を有するものでも有しないものであっおもよい。 結 合するがシグナルを䌝達しない堎合には、 シグナルに応じた现胞の衚珟系の倉化 を抑制するために䜿甚するこずができる。 しかし、 䞡者の結合により现胞内ヘシ グナルが䌝達され、 シグナルに応じた现胞の衚珟系の倉化を惹起する掻性を有す るこずが奜たしい。
本発明第 7の態様の方法で䜜補される融合蛋癜質は、 F L A G様ペプチド、 口 むシンゞッパヌ、 膜貫通型蛋癜質から構成されるが、 該膜貫通型蛋癜質の生物孊 的掻性が保持されおいる限りにおいおは 3皮のぺプチドはいかなる順序で連結さ れおもよいし、 任意のリンカ䞀配列やシグナル配列を含むこずもできる。 たた膜 貫通型蛋癜質は、 その生物孊的掻性が保持されおいる限りにおいおはそのアミノ 酞配列党䜓を有するペプチド、 そのアミノ酞配列の任意の長さからなる任意の䞀 郚分を有するペプチド、 そのアミノ酞配列の任意の䞀郚に加え、 その N末端、 C 末端のいずれか䞀方、 もしくはその䞡方に、 䟋えば M e t等の任意の 1぀以䞊の アミノ酞が付加しおなるアミノ酞配列で芏定されるペプチド、 あるいはアミノ酞 配列䞭の任意の䜍眮に 1぀以䞊のアミノ酞の倉異、 付加、 欠倱、 眮換が生じたも のであっおもよい。 もちろん、 膜貫通型蛋癜質の现胞倖ドメむンもこれに 含たれる。
本発明第 7の態様の方法が適甚できる奜適な 1䟋ずしお、 膜貫通型蛋癜質ずし お Fa sリガンドの现胞倖ドメむンを甚いた堎合が挙げられる。 実斜䟋 3に瀺す ように、 FLAGペプチド䞀口むシンゞッパ䞀䞀ヒト F a sリガンド现胞倖 ドメむンの順で連結された融合蛋癜質は、 FLAGペプチドが連結されおいない ロむシンゞッパ䞀䞀ヒト F a sリガンド现胞倖ドメむン融合蛋癜質に比しお 箄 1 0倍のアポト䞀シス誘導掻性を有しおいた。 すなわち、 FLAGペプチドを 連結するこずによりロむシンゞッパヌず F a sリガンドずの融合蛋癜質の F a s リガンドずしおの生物孊的掻性を䞊昇させるこずに成功した。 本発明の第 7の態 様においお、 「 生物孊的掻性の䞊昇」 ずは、 FLAG様ペプチドずの融合蛋癜質 ずしない堎合に比べお、 少なくずも 1぀の掻性等の倀が、 少なくずも倧であるこ ず、 䟋えば 1. 5倍以䞊、 奜たしくは 2倍以䞊、 より奜たしくは 3倍以䞊、 曎に 奜たしくは 5倍以䞊、 特に奜たしくは 1 0倍以䞊であるこずを意味する。 掻性倀 等の比范は䞀般的な方法が甚いられるが、 単䜍量あたりの掻性量、 即ち比掻性で 比范するこずが出来る。 比掻性は、 通垞 50 %阻害濃床 I C5Q) たたは 5 0 % 有効甚量 ED5。 等によっお求められる。
[実斜䟋]
以䞋に、 実斜䟋をもっお本発明を䞀局具䜓的に説明するが、 これらは䞀䟋ずし お瀺すものであり、 本発明はこれらにより䜕等限定されるものではない。 たた、 以䞋の蚘茉においお甚いる略号は、 該分野における慣甚略号に基づくもので ある。 (実斜䟋 1) ヒト F a sリガンド融合蛋癜質発珟ベクタヌの䜜補
(1) ロむシンゞッパヌずヒト F a sリガンド现胞倖ドメむンの融合蛋癜質を 発珟するプラスミド pMl 807を以䞋に瀺す方法で䜜補した。
むマ䞀
、 センスプラむマヌ 2
TCACATCGAAAATGAG) 、 アンチセンスプラむマ䞀 2 (GCGTT
CGATGTGATAGA) 、 センスプラむマ䞀 3 (T G C G AATT C AC C ATGCTGGGCATCTGG) 、 アンチセンスプラむマ䞀 3 (GGAAGA
、 センスブラ むマ䞀 4
AG) およびアンチセンスプラむマヌ 4 (AATAAGCTTGGTACCCT ATTAGAGCTTATATAA) を化孊合成機にお合成した。 このセンスプ ラむマ䞀 1はヒト Fa sシグナル配列をコ䞀ドする配列を含んでいる。 アンチセ 侀 1はヒト F a sシグナル配列をコヌドする配列の 3' 末端領域ず む゜ロむシンゞッパヌをコヌドする配列の 5' 末端領域を含んでいる。 センスプ ラむマヌ 2はロむシンゞッパヌをコヌドする配列の䞭間領域を含んでいる。 アンチセンスプラむマヌ 2はロむシンゞッパヌをコヌドする配列の 3 末端領域 を含んでいる。 センスプラむマヌ 3はヒト F a sシグナル配列をコヌドする 配列の 5' 末端領域ず E c oR Iサむト GAATTC) を含んでいる。 アンチ センスプラむマヌ 3はロむシンゞッパヌをコヌドする配列の 3' 末端領域、 P s t lサむト CTGCAG) およびヒト F a sリガンド现胞倖ドメむンの N末端 偎をコ䞀ドする塩基配列を含んでいる。 センスプラむマ䞀 4はロむシンゞッパ䞀 をコヌドする配列の 3' 末端領域、 P s t Iサむト CTGCAG) およびヒト F a sリガンド现胞倖ドメむンの N末端偎をコヌドする塩基配列を含んでいる。 ンチセンスプラむマ䞀 4はヒト Fa sリガンドの C末端偎をコヌドする配列、 TAA終止コドンおよび Kpn Iサむト GGTACC) を含んでいる。
埗られたセンスプラむマヌ 1およびアンチセンスプラむマ䞀 1たたは センスプラむマヌ 2およびアンチセンスプラむマヌ 2をそれぞれ 50 pmo 1、 dATP、 dCTP、 dGTP、 d TT Pをそれぞれ 10 nmo 1、 P f u D NAポリメラヌれ ストラタゞヌン瀟 を 1. 25ナニットおよび添付の 10 X P f tlバッファヌ 5 Lを含む 50 Lの溶液を調補した。 DNAサヌマルサむ クラ䞀 PCRシステム 9600、 PEバむオシステムズ瀟 を䜿甚レお 94°Cで 30秒 55°Cで 30秒 72。Cで 1分を 1サむクルずする P C R を 30サむクル行った。 埗られた PC R産物をそれぞれ 0. 5 L、 センスブラ むマ䞀 3およびアンチセンスプラむマヌ 3をそれぞれ 5 0 pmo 1を含む 50 の〇1反応液を調補し、 䞊蚘ず同様に PC Rを行った。
䞀方、 センスプラむマ䞀 4およびアンチセンスプラむマヌ 4をそれぞれ 50 p mo l、 铞型ずしおヒト F a sリガンドをコヌドする配列を含むプラスミド ρ B X-hFL 1 (囜際公開番号 W〇 95/13293) を 1 n g含む 50 Lの P CR反応液を調補し、 同様に PCRを行った。 さらに、 センスプラむマ䞀 3およ びアンチセンスプラむマヌ 3を甚いお埗られた PC R産物ずセンスプラむマヌ 4 およびアンチセンスプラむマヌ 4を甚いお埗られた P CR産物をそれぞれ 0. 5 11 センスプラむマ䞀 3およびアンチセンスプラむマヌ 4をそれぞれ 50 pmo 1を含む 50 Lの PCR反応液を調補し、 同様に PC Rを行った。 埗られた PCR産物を E c oR Iおよび Kpn Iで二重消化した。 䞀方、 EF プロモヌタヌ䞋にヒト F a sリガンド现胞倖ドメむンをコヌドする配列を持 ち DHFR遺䌝子を含む発珟プラスミド pMl 070 (囜際公開番号 WO 95ノ 13293) を Ec oR Iおよび Kp n Iで二重消化し、 ァガロヌス電気泳動に 䟛した埌、 箄 7 k b pの断片を回収し粟補した。 このベクタヌ偎断片に䞊述 の Ec oR Iおよび Kpn Iで消化した PCR産物の断片を組み蟌み、 埗られた プラスミドを pMl 807ず呜名した。
(2) F L AGぺプチドずヒト F a sリガンド现胞倖ドメむンの融合蛋癜質を 発珟するプラスミド pMl 809を以䞋に瀺す方法で䜜補した。
アンチセンスプラむマヌ 5 (CTTGTCATCGTCATCCTTGTAG TCAGCAACAGACGTAAGAACC) 、 センスプラむマヌ 5 (GAC
CAG) を化孊合成機にお合成した。 このアンチセンスプラむマヌ 5はヒト Fa sシグナル配列をコヌドする配列の 3 末端領域ず FLAGペプチドをコヌ ドする配列を含んでいる。 センスプラむマヌ 5は FLAGペプチドをコヌドする 配列ずヒト Fa sリガンド现胞倖ドメむンの N末端偎をコヌドする塩基配列を含 んでいる。
埗られたアンチセンスプラむマ䞀 5ず実斜䟋 1 (1) で䜜補したセンスプラむ マヌ 3をそれぞれ 50 pmo 1、 铞型ずしおセンスプラむマ䞀 1を 0. 05 pmo 1含む 50 Lの PCR反応液を調補し、 実斜䟋 1 (1) ず同様に PCR を行った。 䞀方、 センスプラむマヌ 5および実斜䟋 1 (1) で䜜補したアンチセ ンスプラむマ䞀 4をそれぞれ 50 pmo 1、 铞型ずしお実斜䟋 1 (1) で䜿甚し た pBX— hFL 1を lng含む 50 Lの PCR反応液を調補し、 同様に PC Rを行った。 埗られた PCR産物をそれぞれ 0. 5 L、 センスプラむマヌ 3お よびアンチセンスプラむマヌ 4をそれぞれ 50 pmo 1を含む 50 の PCR 反応液を調補し、 同様に PC Rを行った。
こうしお埗られた PCR産物を Ec oR Iおよび Kpn Iで二重消化し、 実斜 䟋 1 (1) ず同様に pMl 070の Ec oR Iおよび Kpn Iで二重消化したベ クタ䞀偎断片に組み蟌み、 埗られたプラスミドを pMl 809ず呜名した。
(3) プラスミド pUC— I ZFLを以䞋に瀺す方法で䜜補した。 pUC l l 8 (宝酒造株匏䌚瀟 を P s t Iで消化し、 DNA B l un t i ng K i t (宝酒造株匏䌚瀟 を甚いお末端を平滑化した埌ラむゲヌションを行うこずで、 P s t Iサむトを぀ぶした pUC 118を埗た。 このプラスミドを Ec oR Iお よび Kpn Iで二重消化し、 実斜䟋 1 (1) で䜜補したロむシンゞッパヌおよび ヒト F a sリガンド现胞倖ドメむンを含む PCR産物を Ec oR Iおよび Kpn Iで二重消化した断片を組み蟌み、 埗られたプラスミドを pUC—I ZFLず呜 名した。
(4) FLAGペプチドずロむシンゞッパヌずヒト Fa sリガンド现胞倖ドメ むンの融合蛋癜質 配列番号 4) を発珟するプラスミド pMl 815を以䞋に瀺 す方法で䜜補した。 ATCCTTGTA) 、 センスプラむマ䞀 6 (C GATGAC AAGAGAAT GAAAC AAATCGAAGAC) を化孊合成機にお合成した。 このアン チセンスプラむマヌ 6は F L A Gぺプチドをコ䞀ドする配列ずロむシンゞッパヌ をコヌドする配列の 5' 末端領域を含んでいる。 センスプラむマヌ 6は FLAG ぺプチドをコ䞀ドする配列の 3' 末端領域ずロむシンゞッパヌをコヌドする配列 の 5 末端領域を含んでいる。
埗られたアンチセンスプラむマヌ 6ず実斜䟋 1 (1) で䜜補したセンスプラむ マ䞀 3をそれぞれ 50 pmo 1、 铞型ずしお実斜䟋 1 (2) で䜜補した pM18 09を 1 ng含む 5 O^ Lの PCR反応液を調補し、 実斜䟋 1 (1) ず同様に P CRを行った。 䞀方、 センスプラむマヌ 6および実斜䟋 1 (1) で䜜補したアン チセンスプラむマヌ 3をそれぞれ 50 pmo 1、 铞型ずしお実斜䟋 1 (1) で䜜 補した pMl 807を 1 ng含む 50 Lの P C R反応液を調補し、 同様に PC Rを行った。 埗られた PCR産物をそれぞれ 0. 5 L、 センスプラむマヌ 3お よびアンチセンスプラむマヌ 3をそれぞれ 50 pmo 1を含む 50 Lの PCR 反応液を調補し、 同様に PC Rを行った。
こうしお埗られた PCR産物を E c oR Iおよび P s t Iで二重消化した。 侀 方、 実斜䟋 1 (3) で䜜補した pUC— I ZFLを Ec oR Iおよび P s t Iで 二重消化し、 ァガ口䞀ス電気泳動に䟛した埌、 箄 3. 7 kbpの断片を回収し粟 補した。 このベクタヌ偎断片に䞊述の Ec oR Iおよび P s t Iで消化した PC R産物の断片を組み蟌み、 プラスミドを埗た。 このプラスミドを曎に Ec oR I および Kp n Iで二重消化し、 実斜䟋 1 (1) ず同様に pMl 807の E c oR Iおよび Kp n Iで二重消化したベクタヌ偎断片に組み蟌み、 埗られたプラスミ ドを PM1815ず呜名した。 本発明者はプラスミド pMl 815を、 平成 12 幎 5月 12日付で日本囜茚城県぀くば垂東 1䞁目 1番地 1の独立行政法人産業技 術総合研究所、 特蚱生物寄蚗センタヌに寄蚗し 受蚗番号 FERM P— 17853) 、 さらに平成 13幎 5月 8日付で原寄蚗から囜際寄蚗に移管した  受蚗番号 FERM BP— 7575) 。
(実斜䟋 2) ヒト F a sリガンド融合蛋癜質の発珟
( 1 ) COS-1现胞を甚いたヒト F a sリガンド融合蛋癜質の発珟を以䞋に 瀺す方法で行った。
実斜䟋 1で䜜成した pMl 815、 ρΜ1809、 pM1807、 ぉょびpM 1070 (囜際公開番号 W〇 95/13293) を CO S— 1现胞ぞ導入しその 䞊枅䞭に該蛋癜質を発珟、 分泌させた。 すなわち、 1 のプラスミドを2 2 の 10mM Tr i s—HC l (pH7. 4) ノ 1 mM゚チレンゞァミン四酢酞 溶液に溶解した。 これらに、 それぞれ 0. SmgZmL DEAE—デキストラ ンおよび 50mM Tr i s—HC l (pH7. 4) を含有する D— MEM (日 氎補薬株匏䌚瀟 0. 7mLを添加し、 DNA— DEAEデキストラン混合液を 䜜補した。 6ゥ゚ルプレヌト内でセミコンフルェントたで単局培逊した C O S - 1现胞に DNA— DEAEデキストラン混合液を滎䞋し、 C〇2 むンキュベヌタ 䞭で、 37°Cにお培逊した。 4時間埌、 DNA— DEAEデキストラン混合液を 陀去し、 10%FBS (ギブコ瀟 を含有する D— MEMに亀換し、 さらに 96 時間培逊した。 プラスミドを導入した COS— 1现胞の培逊䞊枅を回収し、 以䞋 の 2) および実斜䟋 3に䜿甚した。 (2) COS— 1现胞培逊䞊枅䞭のヒト Fa sリガンド融合蛋癜質の定量を以 䞋に瀺す方法で行った。 培逊䞊枅䞭のヒト F a sリガンド融合蛋癜質の定量は、 F a sリガンド特異的な抗䜓 固盞化抗䜓ずしお F 918— 20— 2、 西掋ヮサ ビペルォキシダヌれ暙識抗䜓ずしお F919— 9侀 18、 各抗䜓の詳现は囜際公 開番号 W〇 97Z02290に蚘茉されおいる を甚いた E I A (E n z y m e i mmu no a s s ay) にお実 Ÿした (Bone Ma r r ow T r a n s p l an t a t i on 22 : 751, 1998) 。 è¡š 1に瀺すように p M 1070により発珟されるヒト F a sリガンド现胞倖ドメむン s hF a s L) に比べお、 それに FLAGペプチドを融合したプラスミド pMl 809により発 珟される融合蛋癜質 FLAG— s hF a s Lは玄 3倍の産生量を有しおいた。 た た、 ロむシンゞッパヌを融合した I 1 e Z i p— s hF a s L (pMl 807) は産生量が著しく枛少したが、 さらに F L A Gペプチドを融合させた F L A G _ I l e Z i p— s F a s L ( M 1 8 1 5) は玄 30倍の発珟量を有し おいた。
F a sリガンド融合蛋癜質産生量における FLAGペプチドの効果
Figure imgf000032_0001
(実斜䟋 3) 现胞の培逊䞊枅添加による各皮 F a s リガンド融合蛋癜質の アポト䞀シス誘導掻性の怜蚎を以䞋に瀺す WS T— 1アツセィで行った。 ヒト T 现胞由来株化培逊现胞である J u r k a t现胞を 4 x 105 c e l l s ZmLず なるように 10%FBSを含む RPMI 1640培地 日氎補薬株匏䌚瀟 に懞 濁し、 それを 96ゥ゚ルプレヌトに 50 uL/we 1 1 (2 x 104 e e l I s Zwe 1 1) ず぀怍え蟌んだ。 次に実斜䟋 2で埗られた各皮 Fasリガンド融合 蛋癜質を含む COS— 1现胞培逊䞊枅を 10%?83を含む1^?]^11640培 地にお怜定する濃床に垌釈した。 この溶液を 50 uLZwe 1 1ずなるように先 の现胞を怍え蟌んだゥ゚ルに添加し 37°Cの C〇2 むンキュベヌタ䞭で玄 20時 間培逊埌、 アポトヌシス誘導掻性を枬定した。 枬定にはミトコンドリアの酵玠掻 性を指暙に生存现胞数を怜定する WST— 1è©Šè–¬ P r emi x WST-1 Ce l l P r o l i f e r a t i on As s ay Sys t em, 宝酒造株 匏䌚瀟 を 1 0 u LZwe 1 1添加し 3 7°Cの C02 ィンキュベヌタ䞭で 0. 5^2時間培逊埌、 吞光床 450 nm— 620 nm) を枬定するこずで実 斜した。 アポトヌシス誘導掻性の刀定はバックダランドずしお现胞を怍え蟌んで いないゥ゚ルの倀を差し匕いた埌、 F a sリガンド融合蛋癜質を党く含たない培 地で同様に枬定したゥ゚ルの倀を 100%ずしお算出し結果を図 1に瀺した。 现胞生存率 ) =
怜定するゥ゚ルの吞光床䞀现胞非添加ゥ゚ルの吞光床
X 100
Fas リガンド融合蛋癜質
非添加ゥ゚ルの吞光床 䞀现胞非添加ゥ゚ルの吞光床
図 1に瀺すように、 FLAG— I l e Z i p-s hFa s Lは甚量䟝存的に J u r k a t现胞に察しお障害掻性を瀺した。 しかも、 FLAG— I 1 e Z i p- s hF a s Lは FLAGペプチドの融合されおいない I l e Z i p-s hF a s Lに比しお玄 10倍のアポトヌシス誘導掻性を有しおおり、 ロむシンゞッパ䞀や F LAGぺプチドも融合されおいない s h F a s Lに比しお玄 1 00倍の アポト䞀シス誘導掻性を有しおいた。 たた、 これらのアポトヌシス誘導掻性は抗 ヒト F a sリガンド䞭和抗䜓である F919— 9侀 18 (詳现は、 囜際公開番号 WO 097ノ 02290に蚘茉されおいる によっお完党に抑制され、 Fa s— F a sリガンド系特異的な掻性であるこずが瀺された。 (実斜䟋 4) ヒト Fa sリガンド融合蛋癜質の粟補
実斜䟋 2 (1) の手法で調補した FLAG— I l e Z i p— s hFa s Lを含 む COS— 1现胞培逊䞊枅を甚いお、 抗 Fa sリガンド抗䜓 F919-9- 18 (囜際公 開番号 WO 097/02290号公報に蚘茉 を固盞化したセファロヌス 4B担 䜓を甚いたァフィ二ティクロマトグラフィヌにより以䞋の通り粟補した。 すなわ ち、 FLAG— I l e Z i p— s hF a s Lを含む COS— 1现胞培逊䞊枅 29, 420 mLを 0.45 m孔埄のフィルタヌ ミリパック 60  ミリポア瀟 に 通し、 ろ過液を回収し、 粟補出発材料ずした。 冷所にお予め phosphate- buffered saline(PBS-) で平衡化された F 919— 9—18-Sepharose 4B FFカラム Ί 3. 2 cmx 6. 2 c m) に粟補出発材料を流速 10 mL/minにおアプラむ した。 出発材料をアプラむした埌、 カラムに PBS を 15.3mL/min にお流し 掗浄 1) 、 次いでカラムに lmol/L NaCl/PBS-を同条件䞋に流し掗浄操䜜 掗浄 2 ) ずした。 匕き続いおカラムに 5 Ommol/L— glycine — NaOH(pHll)を 1 OmL/min にお流し、 溶離操䜜をおこなった。 各溶離画分 40mL あたり 10mL の lmol/ LTris-HCl (pH8) を速やかに加え、 冷所に保存した。 各画分の FLAG— I 1 e Z i P- s hF a s Lの量を実斜䟋 2に蚘茉の方法により枬定し、 FLAG - I l e Z i p-s hFa s Lが含たれる画分を回収した。
è¡š 2に定量結果を瀺す。 è¡š 2 F 919-9-18 -Sepharose 4B サンプル 液量 (mL) FLAG- I 総 FLAG— 回収率
1 e Z i p— I 1 e Z i p s h F a s L — s F a s
(ng/mL) L (mg) ( ) 培逊䞊枅 29,420 1,390 40.8 100 出発物質 30,210 1,260 38.2 93.6 非吞着 +掗浄 1 33, 000 1.58 0.05 0.1 掗浄 2 290 0.00 0.00 0.0
Fr. 1 47.9 0.00 0.00 0.0
Fr. 2 138.6 247, 000 34.2 83.8
Fr. 3 243.6 645 0.16 0.4 è¡š 2に瀺すように、 FLAG— I 1 e Z i p-s hFa s Lは溶離画分にのみ 認められた。 F 919— 9侀 18 - Sep arose 4B FF カラムクロマトグラフィ䞀 により 84%の回収率で粟補 FLAG— I l e Z i p-s hFa s Lを埗るこず が出来た。 粟補品を SDS- PAGEで泳動し、 銀染色 2D-銀染色詊薬 · II第䞀第䞀 化孊薬品 を行ったずころ、 単䞀バンドずしお怜出された 図 3) 。 粟補品の现 胞障害掻性を実斜䟋 3に瀺す方法で確認した。 その結果、 粟補品は粟補前の培逊 䞊枅ずほが同等の掻性を瀺した。 産業䞊の利甚の可胜性
本発明により、 F a sリガンドずしおの生物孊的掻性を有する融合蛋癜質が提 䟛される。 本発明が提䟛する Fa sリガンド融合蛋癜質は、 オリゎマヌ圢成胜を 有するペプチドおよび組換え蛋癜質の産生量を増加させ、 か぀ロむシンゞッパヌ ず膜貫通型蛋癜質の融合蛋癜質の生物孊的掻性を䞊昇させる効果を有するぺプチ ドずの融合蛋癜質であるため、 高い生物孊的掻性ず高い産生量が確保される。 該 Fa sリガンド融合蛋癜質は、 F a sを介したアポトヌシスが関䞎する疟患の治 療薬ずしお開発する事ができる。 本発明は、 たた、 該融合蛋癜質の産生に有甚で あり、 か぀、 組換え蛋癜質党般に応甚可胜な組換え蛋癜質の産生量増加方法およ びロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質ずの融合蛋癜質の生物孊的掻性を䞊昇させ る方法を提䟛する。

Claims

請 求 の 範 囲 .
1. (a) F a s リガンドのアミノ酞配列の少なくずも䞀郚を有する ペプチド、 (b) オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドおよび c) 組換え蛋癜質 の産生量を増加させるペプチドを含み、 Fa sに結合するこずを特城ずする融合
2. 前蚘 a) F a sリガンドのアミノ酞配列の少なくずも 1 郚を有す るペプチドが、 a— 1) 配列番号 1に蚘茉のアミノ酞配列からなるペプチド、 ~ (a— 2) 配列番号 1 に蚘茉のアミノ酞配列の 103〜281番目のアミノ酞配0 列からなるペプチド、 a— 3) 配列番号 1に蚘茉のアミノ酞配列の 130 〜281番目のアミノ酞配列からなるペプチド、 a— 4) 配列番号 1に蚘茉の アミノ酞配列の 145〜281番目のアミノ酞配列を少なくずも含むペプチド、 および a— 5) (a— l) 〜 a— 4) のいずれかに蚘茉のペプチドにおいお 1たたは数個以䞋のアミノ酞が欠倱、 眮換もしくは付 されたアミノ酞配列から5 なり、 F a sに結合する掻性を有するペプチド、 からなる矀より遞択され 前蚘 b) オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドが、 b— 1) ロむシン ゞッパヌ、 b— 2) 配列番号 2に蚘茉のアミノ酞配列からなるペプチド、 およ び b— 3) 配列番号 2のアミノ酞配列においお 1たたは数個以䞋のアミノ酞が 欠倱、 眮換もしくは付加されたアミノ酞配列からなり、 オリゎマヌ圢成胜を有す るペプチド、 からなる矀より遞択され
前蚘 c) 組換え蛋癜質の産生量を増加させるペプチドが、 c侀 1) F L A G様ぺプチド、  c侀 2 ) ァミノ酞配列が A s p-B-Z-A s P- As p— As p— As p— Ly s (䜆し、 B— Zは Ty r— Ly sたたは L e u -Tyr である からなるペプチド、 および c侀 3) アミノ酞配列が As p -Ty r -Ly s— Xい n — R (䜆し、 Rは Ly s、 A r g、 Me tたたは As nであっお、 Xi— n は Ly s、 Ar g、 M e tおよび A s n以倖のいずれかのァ ミノ酞を意味する からなるペプチド、 からなる矀より遞択される
請求項 1に蚘茉の融合蛋癜質。
3. Fa sを発珟しおいる现胞にアポトヌシスを誘導する掻性を有するこずを 特城ずする請求項 2に蚘茉の融合蛋癜質。
4. 前蚘 F a sを発珟しおいる现胞にアポトヌシスを誘導する掻性が、 WST— 1アツセィにおいお該融合蛋癜質を 3 ng/mL添加したずきの现胞生 存率が 50 %以䞋であるこずを特城ずする請求項 3に蚘茉の融合蛋癜質。
5. N末端偎より前蚘 c) のペプチド、 前蚘 b) のペプチド、 および前蚘 (a) のペプチド、 の順に連結された請求項 2ないし 4のいずれかに蚘茉の融合
6. 曎にシグナル配列を含んでなる請求項 2ないし 5のいずれかに蚘茉の融合 蛋癜質。
7. 以䞋の d) たたは e) の蛋癜質
(d) 配列番号 4に蚘茉のアミノ酞配列からなる蛋癜質
(e) 配列番号 4のアミノ酞配列においお、 1 たたは数個以䞋のアミノ酞が 欠倱、 眮換もしくは付加されたアミノ酞配列からなり、 F a sに結合する掻性を 有する蛋癜質。
8. 請求項 1ないし 7のいずれかに蚘茉の融合蛋癜質をコヌドする DNA。
9. 請求項 8に蚘茉の DN Aを含む発珟べクタ䞀。
10. 請求項 9に蚘茉の発珟ベクタヌにより圢質転換された圢質転換䜓。
11. 所望の蛋癜質を FLAG様ペプチドずの融合蛋癜質ずしお産生させ、 該 蛋癜質の産生量を増加させるこずを特城ずする組換え蛋癜質を産生する方法。 5
12. 前蚘所望の蛋癜質が膜貫通型蛋癜質である請求項 11に蚘茉の方法。
13. 前蚘所望の蛋癜質が膜貫通型蛋癜質の现胞倖ドメむンである請求項 11 に蚘茉の方法。
14. 前蚘所望の蛋癜質がオリゎ y—圢成胜を有するぺプチドず膜貫通型蛋癜 質の融合蛋癜質である請求項 11に蚘茉の方法。
10 15. 前蚘所望の蛋癜質がオリゎマヌ圢成胜を有するペプチドず、 膜貫通型蛋 , 癜質の现胞倖ドメむンの融合蛋癜質である請求項 11に蚘茉の方法。
16. オリゎマヌ圢成胜を有するペプチドがロむシンゞッパヌであり、 膜貫通 型蛋癜質が Fa sリガンドである請求項 14たたは 15に蚘茉の方法。
17. 所望の蛋癜質をコヌドする塩基配列ず FLAG様ペプチドをコヌドする 15 塩基配列を読み枠を合わせた状態で連結した DN A断片を含む発珟ベクタヌを䜜 補し、 宿䞻にその発珟ベクタヌを導入し、 埗られた圢質転換䜓を発珟に適切な条 , 件で培逊し、 その培逊混合物から組換え蛋癜質を回収、 粟補する工皋を含み、 該 所望の蛋癜質の産生量を増加させるこずを特城ずする組換え蛋癜質の補造 方法。
20 18. ロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質の融合蛋癜質を䜜補する際に、 該融 合蛋癜質にさらに F L A G様べプチドを連結するこずにより該融合蛋癜質の生物 孊的掻性を䞊昇させる方法。
19. ロむシンゞッパヌず膜貫通型蛋癜質の现胞倖ドメむンの融合蛋癜質を䜜 補する際に、 該融合蛋癜質にさらに FLAG様ペプチドを連結するこずにより該 融合蛋癜質の生物孊的掻性を䞊昇させる方法。
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