WO2001074337A1 - System für den transport von aktivstoffen in einem biologischen system - Google Patents

System für den transport von aktivstoffen in einem biologischen system Download PDF

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WO2001074337A1
WO2001074337A1 PCT/EP2001/003318 EP0103318W WO0174337A1 WO 2001074337 A1 WO2001074337 A1 WO 2001074337A1 EP 0103318 W EP0103318 W EP 0103318W WO 0174337 A1 WO0174337 A1 WO 0174337A1
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WO
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acid
water
particles
magnetic particles
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PCT/EP2001/003318
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Helmut Blum
Marcel Roth
Wolfgang Greb
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Eucro European Contract Research Gmbh & Co. Kg
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    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5094—Microcapsules containing magnetic carrier material, e.g. ferrite for drug targeting
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    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
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    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis

Definitions

  • the present invention relates to a system for the transport of active substances in a biological system, consisting of active substance and magnetic particle (s), a method for producing this system and the use of the system for the transport of active pharmaceutical substances and active substances.
  • Ferrofluids are understood to mean magnetic liquids in which a ferromagnetic or ferromagnetic substance, usually magnetite, is dispersed as a colloidally dispersed phase in a liquid dispersion medium, such as water, paraffin, toluene or any other liquid up to mercury. Often a surfactant or
  • wetting agents such as oleic acid are added to such a mixture in order to avoid agglomeration and thus the formation of larger aggregates. Due to the small size of the crystallites, the particles behave superparamagnetically, i.e. permanent magnetization is not possible.
  • ferrofluids Another area of application for ferrofluids is to remove unwanted cells, in particular 5 cancer cells, from cell suspensions. For example in the treatment of
  • Cancer can be avoided by removing cells from a variety of problems, such as the use of toxins, chemotherapeutic agents, etc., such methods being limited to physical treatment. Density gradient separation was used to remove lymphocytes from bone marrow cells, but without much efficiency.
  • Magnetic particles are also used in immunoassays, in drug targeting and for cell separation.
  • the most commonly used magnetic material is magnetite, which is incorporated into a variety of carrier systems or i5 microspheres or is directly bound to antibodies.
  • the magnetic particles are usually embedded in appropriate coating substances, such as polymers or silica gels. ⁇ r ⁇ ⁇ _ ⁇ _ " _ " _ "” ! '- 2 -
  • Magnetic colloidal liquids are known from European patent application EP 0 156 537, in which the magnetic phase is dispersed colloidally in a liquid dispersion medium.
  • the magnetic phase comprises fine magnetic particles coated with a cross-linked, biologically compatible polymer.
  • German patent application DE 43 07 262 describes a process for the preparation of magnetic polymeric silicon dioxide, in which magnetic materials, in particular Fe, ⁇ -Fe 2 0 3 , ⁇ -Fe 2 0 3) Fe 3 0 4 , are dispersed in alkali silicate solutions or as colloidal solution added and precipitated with mineral acids or carbon dioxide and
  • X-ray contrast agents can be applied to the surface of the particles obtained. They are used in imaging ultrasound and NMR diagnostic procedures as well as for the enrichment of radioactive isotopes. Another area of application is extracorporeal discharge or the binding of biological ingredients, toxic substances, bacteria or viruses
  • German patent application DE 43 25 386 discloses a magnetic liquid (ferrofluid) based on an aqueous carrier liquid, in which magnetic iron oxide particles, which consist largely of magnetite, by a first one
  • aqueous magnetic liquid can be used in medicine as a marker and / or for transport
  • One task of the particles described in the prior art is the targeted transport of substances, such as active pharmaceutical ingredients, in the body and their accumulation at desired locations.
  • This transport can essentially be achieved by means of two methods JO, namely on the one hand by means of enrichment by means of antibodies immobilized on the particle surface or by means of a permanent magnetic field.
  • the known magnetic particles used are generally polymer particles with sizes above 500 nm, which consist of inorganic or organic polymer and 55 embedded magnetic particles. Smaller particles are usually not used, since particles with a particle size below 100 nm, if stabilized, can hardly be concentrated using a magnetic field.
  • An important area of application of magnetic or superparamagnetic particles in the medical field is chemotherapy for cancer treatment or the protection of implants with antibiotics.
  • the active ingredients are bound by swelling
  • the magnetic particles can also be used in suspension in an aqueous medium, surface-active substances usually being attached to their surface, which hold the magnetic particles and any active ingredients adsorbed thereon in suspension.
  • the magnetic particles known from the prior art which are used for the enrichment or for the targeted transport of substances in biological systems, have a modified surface.
  • the modification of the surface serves to keep these substances in suspension and to bind the active substances.
  • the modification of the surfaces has the disadvantage that this modification represents an additional work step in the production. There is also a risk that the polymers used to modify the surfaces with the active substances and possibly also in the biological system, i.e. interactions that impair the effectiveness of the active substances and
  • EP 0 275 285 B1 describes a method for producing a stable superparamagnetic fluid in which the dispersion and stabilization is carried out using SO using ultrasound.
  • the disadvantage of ultrasound treatment is that this energy input destroys any thermally or mechanically unstable substances applied to the particles.
  • the present invention was based on the object of a system for the transport of
  • the present invention accordingly relates to a stabilizer-free system for the transport of active substances in a biological system composed of one or more active substance (s) and magnetic particles, which is characterized in that the particles are coated with active substance on at least part of their surface ( en) are provided.
  • stabilizer-free means that the magnetic particles have no
  • auxiliaries such as emulsifiers or surface coatings, as described in the prior art, are acted upon by active substances or are enveloped by them. Treatment of particles loaded with active substances is also not necessary and is preferably excluded.
  • the system according to the invention consists of magnetic particles and active substance.
  • the surface of the magnetic particles is provided with active substance (s).
  • active substance s
  • the active substance molecules are applied directly to the surface of the particles.
  • the particles can also be enveloped by the active substance, which is the case, for example, if the active substances have a structure or shape
  • An envelope is present, for example, when cells, cell cultures or cell components are used as active substances and the magnetic particles are present inside the cells, cell cultures or cell components, or when the active substances have the structure of a ball due to their molecular size, inside which there is the
  • the system according to the invention can be used for the targeted transport of active substances to a specific site of action in the body or biological system as well as for the “removal” of undesired components in / on the body or out of the body. It has the advantage that the active substances are applied directly to the particles, so that in the simplest case the system according to the invention consists of active substance (s) and magnetic particles.
  • Carrier function of the particles in the surrounding medium is achieved and on the other hand, by applying a magnetic field, a selective enrichment of the loaded particles
  • Biological system in the sense of the present invention means both the human or animal body itself and also an extracorporeal system, such as e.g. cells / cell cultures eluted from the body and / or devices located outside the body in which 0 body fluids are cleaned.
  • the particles according to the invention are usually absorbed by the organs, tissues and cells as well as implants.
  • superparamagnetic particles in particular metal oxides or metals, are used as magnetic particles.
  • Superparamagnetic particles have no 5 remanence, i.e. they can be reversibly moved and concentrated in a magnetic gradient field.
  • the advantage of the magnetic particles used is in particular that they are made entirely of inorganic material and can be sedimented well in the magnetic field! 0.
  • the particles for the transport of active substances in the biological system no further components for the modification of the particles themselves are necessary, such as coating with polymers, etc.
  • the system can be assembled or set as desired for the respective application.
  • suitable magnetic particles are ⁇ -Fe 2 0 3 , Fe 3 0 4 , MnFe 2 0 4 , NiFe 2 0 4 ,
  • Possible metals are Fe, Co, Ni and their alloy, if necessary also with other metals.
  • the magnetic particles used according to the invention preferably have one
  • Particle size from 1 to 300 nm, preferably up to 100 nm, here the individual discrete crystallites are meant. Agglomerates may also be present, the total particle size of which is above 100 nm, in particular above 300 nm.
  • volume-weighted average crystallite size can be determined using X-ray diffraction methods, in particular using a Scherrer analysis. The process is described, for example, in: CE Krill, R. Birringer: "Measuring average grain sizes in nanocrystalline materials ,,, Phil. Mag. A 77, p. 621. (1998). Accordingly, the volume-weighted average crystallite size D can be determined by the relationship
  • ⁇ is the wavelength of the X-rays used
  • ß is the full width at half the height of the reflection at the diffraction position 2 ⁇ .
  • K is a constant of the order of 1, the exact value of which depends on the crystal shape. This indefiniteness of K can be avoided by using the line broadening as an integral width
  • ⁇ is defined as the area under the X-ray diffraction reflex divided by its maximum intensity l 0 :
  • Sizes 20 and 2 ⁇ 2 are the minimum and maximum angular positions of the Bragg! 0 reflex on the 2 ⁇ axis.
  • I (2 ⁇ ) is the measured intensity of the reflection as a function of 2 ⁇ .
  • the active substance used can be adsorbed onto these particles, it having proven to be particularly advantageous if the active substance is already present during the formation of the magnetic particles, e.g. by size-controlled precipitation in an aqueous medium using alkaline substances or by reduction of metal cations.
  • Active substance molecule such as OH, SH, hydroxide, amino, carboxyl, ether, sulfo,
  • Phosphonic acid groups etc., take place. It is also possible to subsequently apply the active substance to the precipitated particles, e.g. by suspension of the uncoated (not
  • Liquid phase containing active substance mixture preferably water.
  • the active substances can also be bound to the magnetic particles via so-called spacer groups.
  • Spacers are short organic molecule chains that are used in the immobilization of molecules on supports, the spacer molecules not being a coating. Spacers can
  • the spacer molecules can improve the bond between magnetic particles and the active substances. They preferably have one or more polar groups. As examples, reference can be made to the groups already mentioned. Especially when cationic active ingredients are used, there have been
  • Spacers with two polar groups such as aminocarboxylic acids, diamines, betaines, dicarboxylic acids, aminophosphonates, etc. have been found to be suitable.
  • so-called agglomerates of magnetic particles consist of agglomerates of nanoparticles, i.e. of crystallites with one
  • agglomerates can consist of individual crystallites which either reversibly agglomerate at their contact surface or irreversibly through coalescence, i.e. through agglomeration across the grain boundaries.
  • An advantage of agglomerates is that they have both an outer and an inner surface, i.e. Have voids so that the active ingredients inside
  • Agglomerates can be obtained, for example, by precipitating the magnetic particles in the absence of an active ingredient, by drying or freeze-drying nanoparticles free of active ingredient or loaded with active ingredient with subsequent redispersion, agglomerate formation which can be controlled by the synthesis conditions, such as temperature increase, adjustment of the pH
  • Active substances in the sense of the present invention are both substances which are introduced into the body and substances which are to be removed from it, e.g. synthetic
  • active pharmaceutical ingredients such as living and dead cells, cell components and organelles, synthetic and natural DNA, genes, chromosomes, genetically modified autologous or heterologous Cells and xenobiotic units such as bacteria, 5 viruses, mycoplasma, fungi, and spores, thermally conductive substances such as metals, radiologically active substances such as ⁇ -emitters, particulate exogenous substances containing active substances Units such as liposomes, microcapsules and nanoparticles, as well as any mixtures of the above.
  • the active substances are selected from water-soluble and / or lipid-soluble pharmaceutical active substances.
  • geminal bisphosphonic acids and / or their physiologically tolerable salts are used as active substances:
  • R a linear or branched alkyl radical having 1 to 10 carbon atoms, which may optionally be substituted by substituents such as amino groups, N-mono- or N-dialkylamino groups, the alkyl groups containing 1 to 5 carbon atoms and / or SH groups can, or a substituted or unsubstituted carbo- or heterocyclic aryl radical, optionally one or more heteroatoms and branched and unbranched alkyl radicals with 1 to 6 carbon atoms, free or mono- or. may have dialkylated amino groups with 1 to 6 carbon atoms or halogen atoms, and R 2 is OH, a halogen atom, preferably Cl, H or NH 2 .
  • Suitable salts of the compounds having the formula I are alkali metal salts, ammonium salts and ethanolamine salts.
  • Such compounds are particularly suitable for the treatment of osteoporotic diseases, the following compounds being particularly preferred: 3- (methylpentylamino) -1-hydroxypropane-1,1-diphosphonic acid (ibandronic acid), 1-hydroxyethane-1,1-diphosphonic acid ( Etidronic acid), dichloromethane diphosphonic acid (clodronic acid),
  • the system according to the invention in its simplest form consists of magnetic particle (s) and one or more active substance (s).
  • This system can be converted in a manner known per se into a pharmaceutical preparation for oral, parenteral, intravenous, inhalative and / or topical application and can be supplied to the biological system.
  • Suspensions, emulsions and liposomal systems can be mentioned as suitable forms of the pharmaceutical preparation.
  • the system according to the invention is in the form of a suspension.
  • Water or physiological NaCl solution is preferred as the suspension medium.
  • the magnetic particles are preferably only in the oil phase, which is the inner phase, i.e. which forms droplets.
  • magnetic particles can also be enriched in the water phase.
  • Oil ferrofluids Both macroemulsions and microemulsions can be used, i.e. thermodynamically stable emulsion systems with droplet sizes ⁇ 500 nm.
  • Oil ferrofluids can serve as carriers for lipid-soluble active substances, so that both the 50 magnetizable particles and the active substance or substances are present in the oil phase.
  • water-soluble active substances are used which are present in dissolved form in the aqueous phase and the magnetic particles are present in the oil phase.
  • Emulsifiers take place.
  • An example of a commercially available emulsifier is Solutol® (BASF AG). If the active substance and the magnetic particles are in the oil phase, the active substances can also be bound to the magnetic particles (adsorbed) here, but this is not absolutely necessary.
  • Oil ferrofluid emulsion can be dissolved or suspended.
  • the active substances are water-soluble polymers, such as cell components, proteins, etc.
  • suitable emulsifiers With the aid of suitable emulsifiers, a water phase containing such active substances can be converted into an emulsion containing magnetic oil.
  • the emulsion mixture can then be concentrated at the site of action using a permanent magnetic field.
  • the active substances and magnetic particles present independently of one another in the aqueous phase are discharged into the aqueous interior of
  • the non-entrapped fraction can be separated by centrifugation or gel chromatography, resulting in a purified magnetic liposome product.
  • the same process can be used to liposomally encapsulate magnetic particles described above with adsorbed active ingredients.
  • the active substances are adsorbed on the magnetic particles and at the same time are present in free form in the aqueous phase and / or in the oil phase.
  • the adsorption takes place either during the formation of the magnetic particles by precipitation or by suspending the magnetic particles
  • the loaded particles can each be formulated in the form of a suspension, microemulsion, oil-in-water emulsion, water-in-oil emulsion, water-in-oil-in-water emulsion, etc.
  • the loaded magnetic particles can be enriched in the aqueous phase or in the oil phase.
  • the system according to the invention for the transport of active substances in a biological system can be produced in various ways.
  • a water-soluble or water-suspendable active substance and a water-soluble precursor of the magnetic particles are dissolved in water and the magnetic particles are formed by precipitation, the magnetic particles precipitating as a solid loaded with the active substance.
  • the magnetic particles are placed in a solution or suspension of the active substance in water or another liquid. The magnetic particles are loaded with active substance by 5 adsorption on the surface of the magnetic particles.
  • oil-based ferrofluids can be obtained.
  • the magnetic particles are preferably first mixed with a solid or liquid oil or molten wax with stirring and, if appropriate, with heating.
  • the lipid-soluble particles obtained can then be emulsified in water in the presence of the active substance in a manner known per se.
  • oils or waxes which are suitable for the respective field of application and are liquid at processing temperature can be used as oils or waxes, provided that they are pharmaceutically harmless. If the oils or waxes are in solid form, they can be heated to produce an oil-based ferrofluid.
  • lipid-soluble active substances can be used in the system according to the invention.
  • lipid-soluble active substances can be used in the system according to the invention.
  • lipid-soluble active substances are first mixed with the lipid-soluble particles obtained and the mixture is then emulsified in water.
  • the lipid-soluble active substances can be added to the magnetic particles before or while they are mixed with the solid or liquid oil or wax.
  • these active substances are first mixed with the lipid-soluble particles obtained and the mixture is then emulsified in water.
  • Another object of the present invention relates to the use of the system described above for the transport of active substances in a biological system for the targeted transport of pharmaceutical active substances in the biological system and the use of the system for the enrichment of active substances in the biological system at predetermined locations ,
  • the ferrofluid drug product can be converted into suitable conventional drug forms or incorporated 55.
  • the pharmaceutical form of the soft gelatin capsule is suitable for the oral administration of an oil ferrofluid loaded with a drug.
  • the form of the liposomal encapsulation such as is particularly suitable for systemic injection or inhalation - '_ I " - ' - 12 _ described above.
  • Aqueous suspensions or oil-in-water emulsions are particularly suitable for insertion and positioning in body cavities such as the peritoneum, bladder space, urogenital and vaginal tract.
  • body cavities such as the peritoneum, bladder space, urogenital and vaginal tract.
  • a magnetic field can be applied externally to or in the vicinity of the “site” 5 to be treated, as a result of which the active substance can be locally concentrated at the desired location (drug targeting).
  • the active substances can develop their effect at the target organ or target location in accordance with their activity and, if appropriate, be released by the particles.
  • Active substances that are supposed to develop their effect directly through contact with the biological system to be treated are preferably released directly at the site of action.
  • An example of such active substances is the action of chemotherapeutic agents, cytostatics, active substances that support therapy, such as anti-inflammatory agents,
  • a ferrofluid composed of magnetic particles and bisphonate,! 5 can be transported to the tumor when treating bone tumors or metastases in the bone.
  • the bisphosphonate is bound to the bone apatite and inhibits bone remodeling.
  • the tumor cells are locally heated by the external magnetic field and thus destroyed.
  • active substances which have radiological properties> 0 such as ⁇ -emitters etc.
  • active substances which have radiological properties> 0 can be transported to their site of action according to the invention, where they can destroy the tissue to be treated, possibly with external heating, by local radiation.
  • the particles can be removed again using a magnetic field.
  • the use of the magnetic particles has the further advantage that the particles are promoted by the permanent magnetization to release the active substances.
  • the permanent magnetization can cause local overheating arise, which supports the release of active substances that are only loosely applied to the surface of the particles.
  • Another release mechanism that occurs in particular when there is no permanent magnetization is the slow dissociation of the active substance from the magnetic particle. This release can take place via chemical, in particular enzymatic, hydrolytic or thermal, or else purely physical.
  • the thermal cleavage of the active substances from the magnetic particles is preferably supported by an applied magnetic field.
  • Another advantage of the permanent magnetization of the magnetic particles located at the local site of action is the local overheating that occurs. This can be used to destroy diseased tissue or tumor tissue. Local overheating using a magnetic field is also known as local or cellular hyperthermia.
  • thermo-seeds usually consist of an alloy made of a magnetic metal, such as iron or
  • thermo-seeds which contains, for example, magnetic particles and a chemotherapeutic agent as an active ingredient, can be administered.
  • the system according to the invention accumulates in thermo seeds and thus forms a local cytostatic depot. Following the enrichment of the
  • thermo-seed treatment can be carried out by emitting an alternating magnetic field outside the body, which leads to heating of the thermo-seeds and the associated destruction of the tumor cells.
  • Metal with good thermal conductivity such as palladium or platinum.
  • the system of magnetic particles and metal according to the invention is transported to its place of action, followed by heating to the Curie point by external application of an alternating magnetic field. The occurring limited
  • This embodiment can be applied to any tumor.
  • the system according to the invention can be injected or inhaled in a suitable pharmaceutical preparation as described above become.
  • inhalation of this system is suitable for the treatment of lung tumors.
  • HEDP Hydroxyethane diphosphonic acid
  • the oil ferrofluid obtained was mixed with isotonic saline in a volume ratio of 1: 9.
  • the emulsifier Solutol ® HS 15 polyethylene glycol 660-12- hydroxystearate, manufactured by BASF AG having a weight proportion of 15 g per liter and ansch manendem stirring using a magnetic stirrer, a ferrofluid-in-water emulsion obtained with droplet sizes in the range 10-100 microns.
  • the oil-soluble active substance (nabumetone) was loaded before the emulsification by dissolving 2 ml of active substance in 8 ml of oil-based ferrofluid.
  • Example 3 Preparation of a ferrofluid in which the active substance corresponds to the oil phase
  • the oil ferrofluid was mixed with isotonic saline in a volume ratio of 1: 9.
  • a ferrofluid-in-water emulsion with droplet sizes in the range of 5-100 micrometers was obtained by adding the emulsifier Solutol HS 15 (polyethylene glycol 660-12-hydroxystearate, manufacturer: BASF AG) with a weight fraction of 15 g per liter and then stirring with a magnetic stirrer , To dose the active substance, the oil phase was diluted accordingly with isotonic saline.
  • phospholipon 5 g are dissolved in a round bottom flask in chloroform and the organic phase is removed in vacuo on a rotary evaporator until a thin one has formed a solvent-free lipid film.
  • 100 ml of the water-dispersed ferrofluid product from Example 1 is added to the lipid film with gentle heating and agitated for one hour on a mechanical shaker until the lipid film has completely detached from the wall and liposomes have formed.
  • the preparation is treated with ultrasound for 1-2 minutes in order to achieve a size distribution of the liposomes in the nanometer range.
  • the preparation is then separated from the non-encapsulated fraction on a Sephadex-G75 column.
  • the ferrofluid liposome dispersion can be adjusted to the desired concentration with isotonic saline.
  • Example 5 Aqueous solutions of natural or synthetic proteins
  • the ferrofluid is injected and specifically transports the magnetically assisted urodilatin to the kidney. This is followed by desorption and separation of the unloaded particles from the blood via external blood washing, i.e. Ferroparticles are captured and disposed of by magnetic blood adsorbers.
  • Example 7 Magnetic transport of cells and cell components in a water-in-oil-in-water emulsion YY " YY YY - - 18 -
  • 1 ml of an isotonic salt solution of genetically modified epithelial cells was emulsified in 9 ml of ferrofluids obtained in Example 2 by adding 1 g of Solutol® HS 15 and stirring with a magnetic stirrer at room temperature.
  • a water which was not stable over a long period of time was obtained in ferrofluid emulsion, which was emulsified in 30 ml of a 1% strength aqueous solutol solution 5 by means of magnetic stirring.
  • a cell-containing water-in-ferrofluid-in-water emulsion with droplet sizes in the micrometer range was formed.
  • the cell-containing ferrofluid emulsion obtained is suitable, for example, for targeted transport and for placing the cells at a specific site of action, such as. B. for attaching 0 cells to certain vessel wall sites (e.g. in coronary arteries according to PTCA).
  • a specific site of action such as. B. for attaching 0 cells to certain vessel wall sites (e.g. in coronary arteries according to PTCA).

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Abstract

Es wird ein stabilisator-freies System für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen System aus einem oder mehreren Aktivstoff(en) sowie magnetischen Partikeln, beansprucht, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Partikel auf zumindest einem Teil ihrer Oberfläche mit Aktivstoff(en) versehen sind. In diesem System ist eine Modifizierung der magnetischen Partikel nicht unabdingbar erforderlich. Es kann sowohl in wässerige und ölige Suspensionen als auch in Mikroemulsionen, Öl-in-Wasser-Emulsionen, Wasser-in-Öl-Emulsionen und auch Wasser-in-Öl-in-Wasser-Emulsionen eingearbeitet werden.

Description

System für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen System
5
Die vorliegende Erfindung betrifft ein System für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen System, bestehend aus Aktivstoff sowie magnetische(n) Partikel(n), ein Verfahren zur Herstellung dieses Systems sowie die Verwendung des Systems zum Transport für pharmazeutische Wirk- und Aktivstoffe.
0
Unter Ferrofluiden versteht man magnetische Flüssigkeiten, in denen eine ferri- oder ferromagnetische Substanz, in der Regel Magnetit, als eine kolloidal dispergierte Phase in einem flüssigen Dispersionsmedium, wie Wasser, Paraffin, Toluol oder einer beliebigen anderen Flüssigkeit bis hin zu Quecksilber, dispergiert ist. Häufig wird ein Tensid oder
5 Benetzungsmittel, wie Oleinsäure, einem solchen Gemisch zugefügt, um die Agglomerierung und somit die Bildung größerer Aggregate zu vermeiden. Aufgrund der geringen Größe der Kristallite verhalten sich die Teilchen superparamagnetisch, d.h. es ist keine Permanentmagnetisierung möglich.
!0 Die Ferrofluide und auch andere metallische Kolloide sind seit vielen Jahren Gegenstand intensiver Forschung, da sie dazu in der Lage sind, Makromoleküle, insbesondere Proteine, zu binden.
Ein weiteres Einsatzgebiet der Ferrofluide ist, unerwünschte Zellen, insbesondere !5 Krebszellen, aus Zellsuspensionen, zu entfernen. Beispielsweise bei der Behandlung von
Krebs kann durch die Entfernung von Zellen eine Vielzahl von Problemen umgangen werden, wie der Einsatz von Toxinen, chemotherapeutischen Mitteln usw., wobei derartige Verfahren auf die physikalische Behandlung beschränkt sind. Die Dichte-Gradienten-Separation wurde zur Entfernung von Lymphocyten aus Knochenmarkzellen verwendet, jedoch ohne große 10 Effizienz.
Eingesetzt werden unterschiedliche Arten von magnetischen Teilchen auch in Immunoassays, im Drug-Targeting und für Zellabtrennungen. Das am häufigsten verwendete magnetische Material ist Magnetit, das in eine Vielzahl von Trägersystemen oder i5 Mikrosphären eingearbeitet wird oder direkt an Antikörper gebunden wird. Üblicherweise sind die magnetischen Partikel in entsprechende Hüllsubstanzen eingebettet, wie Polymere oder Kieselgele. ~r~ ~ _Γ_ "_"_" "! ' - 2 -
Aus der europäischen Patentanmeldung EP 0 156 537 sind magnetische kolloidale Flüssigkeiten bekannt, worin die magnetische Phase kolloidal in einem flüssigen Dispersionsmedium dispergiert ist. Die magnetische Phase umfasst feine magnetische Teilchen, die mit einem vernetzten, biologisch kompatiblem Polymer beschichtet sind.
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In der deutschen Patentanmeldung DE 43 07 262 wird ein Verfahren zur Herstellung von magnetischem polymeren Siliciumdioxid beschrieben, worin magnetische Materialien, insbesondere Fe, ß-Fe203, γ-Fe203) Fe304, in Alkalisilikatlösungen dispergiert oder als kolloidale Lösung zugegeben und mit Mineralsäuren oder Kohlendioxid gefällt und
10 kondensiert werden. Auf die Oberfläche der erhaltenen Teilchen können Röntgenkontrastmittel aufgebracht werden. Sie werden bei bildgebenden Ultraschall- und NMR-Diagnostikverfahren eingesetzt sowie auch zur Anreicherung von radioaktiven Isotopen. Ein weiteres Einsatzgebiet ist der extra- oder intrakorporale Austrag oder die Bindung von biologischen Inhaltsstoffen, toxischen Substanzen, Bakterien oder Viren aus
15 dem Organismus mit Hilfe von Magnetfeldern.
In der deutschen Patentanmeldung DE 43 25 386 wird eine magnetische Flüssigkeit (Ferrofluid) auf der Basis einer wässerigen Trägerflüssigkeit offenbart, worin magnetische Eisenoxidteilchen, die zum größten Teil aus Magnetit bestehen, durch eine erste
!0 monomolekulare Adsorptionsschicht aus gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren und eine zweite Adsorptionsschicht aus oberflächenaktiven Substanzen stabilisiert sind. Sowohl die erste als auch die zweite Adsorptionsschicht bestehen aus Tensiden, die vollständig aus natürlich nachwachsenden Rohstoffen hergestellt sind. Die beschriebene wässerige magnetische Flüssigkeit kann in der Medizin als Markierungsstoff und/oder zum Transport
!5 von Wirkstoffen eingesetzt werden.
Eine Aufgabe der im Stand der Technik beschriebenen Partikel ist der zielgerichtete Transport von Stoffen, wie pharmazeutischen Wirkstoffen, im Körper und deren Anreicherung an gewünschten Stellen. Dieser Transport kann im wesentlichen mittels zweier Methoden JO erreicht werden, nämlich zum einen über die Anreicherung mittels an der Partikeloberfläche immobilisierter Antikörper oder mittels Permanentmagnetfeld.
Die bekannten eingesetzten magnetischen Partikel sind in der Regel Polymerpartikel mit Größen oberhalb 500 nm, die aus anorganischem oder organischem Polymer und 55 eingelagerten magnetischen Teilchen bestehen. Kleinere Partikel werden üblicherweise nicht eingesetzt, da sich Partikel mit einer Teilchengröße unter 100 nm, sofern stabilisiert, kaum mittels eines Magnetfelds aufkonzentrieren lassen. Ein wichtiges Einsatzgebiet der magnetischen bzw. superparamagnetischen Partikel im medizinischen Bereich ist die Chemotherapie zur Krebsbehandlung oder der Schutz von Implantaten mittels Antibiotika. Die Anbindung der Wirkstoffe erfolgt durch Quellung der
5 Polymerpartikel oder durch Adsorption an die polymeren Oberflächen. Die magnetischen Teilchen können auch in wässerigem Medium suspendiert eingesetzt werden, wobei an deren Oberfläche üblicherweise oberflächenaktive Substanzen angelagert sind, welche die magnetischen Teilchen sowie gegebenenfalls daran adsorbierte Wirkstoffe in Suspension halten.
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Wie bereits beschrieben, weisen die aus dem Stand der Technik bekannten magnetischen Partikel, die zur Anreicherung oder zum zielgerichteten Transport von Stoffen in biologischen Systemen eingesetzt werden, eine modifizierte Oberfläche auf. Die Modifikation der Oberfläche dient dazu, diese Stoffe in Suspension zu halten und die Aktivstoffe zu binden.
5 Die Modifizierung der Oberflächen hat den Nachteil, dass diese Modifizierung ein zusätzlicher Arbeitsschritt bei der Herstellung darstellt. Ferner besteht die Gefahr, dass die zur Modifikation der Oberflächen eingesetzten Polymere mit den Aktivstoffen und gegebenenfalls auch mit im biologischen System, d.h. im Körper, befindlichen Proteinen etc. Wechselwirkungen eingehen können, die die Wirksamkeit der Aktivstoffe beeinträchtigt und
!0 in manchen Fällen sogar zu unerwünschten, ggf. toxischen Nebenreaktionen und Wirkungen dieser Mittel führen kann.
Ein weiterer Nachteil ist, dass das nachträgliche Aufbringen einer Beschichtung auf bereits oberflächenmodifizierte Partikel aufwendig und daher zeitintensiv ist. Schließlich weisen die !5 beschichteten Partikel eine relativ geringe Adsorptionskapazität für pharmazeutische Wirkstoffe auf.
In der EP 0 275 285 B1 wird ein Verfahren zur Herstellung eines stabilen superparamagnetischen Fluids beschrieben, in dem das Dispergieren und Stabilisieren durch SO Einsatz von Ultraschall erfolgt. Die Ultraschallbehandlung hat den Nachteil, dass durch diesen Energieeintrag ggf. auf den Partikeln aufgebrachte, thermisch oder mechanisch instabile Substanzen zerstört werden.
Der vorliegenden Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein System für den Transport von
!5 Aktivstoffen in einem biologischen System zur Verfügung zu stellen, worin eine Modifizierung der magnetischen Partikel nicht unabdingbar erforderlich ist und das eine Einarbeitung dieser
Partikel sowohl in wässerige und ölige Suspensionen als auch in Mikroemulsionen, Öl-in- Wasser-Emulsionen, Wasser-in-ÖI-Emulsionen und auch Wasser-in-ÖI-in-Wasser- Emulsionen ermöglicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Stabilisator-freies System für den 5 Transport von Aktivstoffen in einem biologischen System aus einem oder mehreren Aktivstoff(en) sowie magnetischen Partikeln, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Partikel auf zumindest einem Teil ihrer Oberfläche mit Aktivstoff(en) versehen sind.
Stabilisator-frei bedeutet in der vorliegenden Erfindung, dass die magnetischen Partikel ohne
0 Zusatz von Hilfsmitteln, wie Emulgatoren oder Oberflächenbeschichtungen, wie sie im Stand der Technik beschrieben werden, mit Aktivstoffen beaufschlagt sind bzw. von diesen umhüllt sind. Auch ist eine Behandlung von mit Aktivstoffen beladenen Partikeln nicht erforderlich und vorzugsweise ausgeschlossen. In der einfachsten Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung besteht das erfindungsgemäße System aus magnetischem Partikel und Aktivstoff.
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Erfindungsgemäß ist zumindest ein Teil der Oberfläche der magnetischen Partikel mit Aktivstoff(en) versehen. Das bedeutet, dass die Aktivstoffmoleküle unmittelbar auf der Oberfläche der Partikel aufgebracht sind. Die Partikel können auch vom Aktivstoff umhüllt sein, was zum Beispiel dann der Fall ist, wenn die Aktivstoffe aufgrund ihrer Struktur, Form
!0 oder Größe die magnetischen Partikel umgeben aber nicht auf der Oberfläche direkt aufgebracht sind. Eine Umhüllung liegt beispielsweise dann vor, wenn als Aktivstoffe Zellen, Zellkulturen bzw. Zellbestandteile verwendet werden und die magnetische Partikel im inneren der Zellen, Zellkulturen bzw. Zellbestandteile vorliegen, oder wenn die Aktivstoffe aufgrund ihrer Molekülgröße die Struktur eines Knäuels aufweisen, in dessen Inneren sich die
!5 magnetischen Partikel befinden.
Das erfindungsgemäße System kann zum zielgerichteten Transport von Aktivstoffen an einen speziellen Wirkort im Körper bzw. biologischen System als auch zum „Abtransport,, von unerwünschten Komponenten im/am Körper oder aus dem Körper eingesetzt werden. Es hat 10 den Vorteil, dass die Aktivstoffe unmittelbar auf den Partikeln aufgebracht sind, das erfindungsgemäße System im einfachsten Fall also aus Aktivstoff(en) und magnetischen Partikeln besteht.
Es wurde festgestellt, dass durch die gezielte Beladung mit Aktivstoff zum einen eine Art
15 Carrierfunktion der Partikel im umgebenden Medium erzielt wird und zum anderen kann durch Anlegen eines Magnetfelds eine selektive Anreicherung der beladenen Partikel
(Sedimentation) und Anreicherung der Partikel erreicht werden. Eine im Vergleich zu größeren Partikeln relativ große Partikeloberfläche ermöglicht eine höhere Beladung der Oberfläche mit Aktivstoffen, d.h. das erfindungsgemäße System kann im Vergleich zum Stand der Technik eine deutlich höhere Konzentration an Aktivstoffen aufnehmen. Insgesamt können mit weniger magnetischem Material gleiche Aktivstoffgehalte in das biologische 5 System eingebracht werden.
Biologisches System in Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet sowohl der menschliche oder tierische Körper selbst aber auch ein extrakorporales System, wie z.B. aus dem Körper eluierte Zellen/Zellkulturen und/oder außerhalb des Körpers befindliche Geräte, in denen 0 Körperflüssigkeiten gereinigt, werden. Die erfindungsgemäßen Partikel werden üblicherweise von den Organen, Geweben und Zellen sowie Implantaten aufgenommen.
Als magnetische Partikel werden insbesondere superparamagnetische Partikel eingesetzt, insbesondere Metalloxide oder Metalle. Superparamagnetische Teilchen besitzen keine 5 Remanenz, d.h. sie lassen sich in einem magnetischen Gradientenfeld reversibel bewegen und konzentrieren.
Der Vorteil der eingesetzten magnetischen Partikel besteht insbesondere darin, dass sie vollständig aus anorganischem Material aufgebaut sind und sich gut im Magnetfeld !0 sedimentieren lassen. Für den Einsatz der Partikel zum Transport von Aktivstoffen im biologischen System sind keine weiteren Komponenten für die Modifikation der Partikel selbst erforderlich, wie Beschichtung mit Polymeren etc. Das System kann für den jeweiligen Anwendungszweck beliebig konfektioniert bzw. eingestellt werden.
!5 Beispiele für geeignete magnetische Partikel sind γ-Fe203, Fe304, MnFe204, NiFe204,
CoFe204 und deren beliebigen Gemische, wobei Fe304 (Magnetit) besonders bevorzugt eingesetzt wird. Als mögliche Metalle sind Fe, Co, Ni sowie deren Legierung ggf. auch mit anderen Metallen zu nennen.
10 Die erfindungsgemäß eingesetzten magnetischen Partikel weisen vorzugsweise eine
Teilchengröße von 1 bis 300 nm, vorzugsweise bis 100 nm auf, wobei hier die einzelnen diskreten Kristallite gemeint sind. Es können auch Agglomerate vorliegen, deren Gesamtteilchengröße oberhalb von 100 nm, insbesondere oberhalb von 300 nm liegt.
;5 Die volumengewichtete mittlere Kristallitgröße ist mit Röntgenbeugungsverfahren, insbesondere über eine Scherrer-Analyse, bestimmbar. Das Verfahren ist beispielsweise beschrieben in: C. E. Krill, R. Birringer: „Measuring average grain sizes in nanocrystalline materials,,, Phil. Mag. A 77, S. 621. (1998). Demnach kann die volumengewichtete mittlere Kristallitgröße D bestimmt werden durch den Zusammenhang
D = Kλ/ßcosθ.
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Dabei ist λ die Wellenlänge der verwendeten Röntgenstrahlung, ß ist die volle Breite auf halber Höhe des Reflexes an der Beugungsposition 2Θ. K ist eine Konstante der Größenordnung 1 , deren genauer Wert von der Kristallform abhängt. Man kann diese Unbestimmtheit von K vermeiden, indem man die Linienverbreiterung als integrale Weite ft
0 bestimmt, wobei ß, definiert ist als die Fläche unter dem Röntgenbeugungsreflex geteilt durch dessen maximaler Intensität l0:
2Θ2
5 ß, = 1/l0 I l(2θ)d(2θ)
J
Dabei sind die Größen 20., und 2Θ2 die minimale und maximale Winkelposition des Bragg- !0 Reflexes auf der 2Θ-Achse. I(2Θ) ist die gemessene Intensität des Reflexes als Funktion von 2 θ. Unter Verwendung von diesem Zusammenhang ergibt sich als Gleichung zur Bestimmung der volumengewichteten mittleren Kristallitgröße D: D = λ/ßjCosθ.
In einer möglichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die magnetischen
!5 Partikel als Nanopartikel mit einer Teilchengröße von vorzugsweise unter 100 nm eingesetzt.
Auf diese Teilchen kann der eingesetzte Aktivstoff adsorbiert werden, wobei es sich als besonders vorteilhaft erwiesen hat, wenn der Aktivstoff bereits bei der Bildung der magnetischen Partikel, z.B. durch größenkontrollierte Fällung im wässerigen Medium mittels alkalischer Substanzen oder durch Reduktion von Metallkationen vorliegt. Durch die in situ
»0 erzeugte große Partikeloberfläche kann eine optimale Adsorption des Aktivstoffes an die
Oberfläche mittels funktioneller, vorzugsweise ionischer oder polarer Gruppen im
Aktivstoffmolekül, wie OH-, SH-, Hydroxid-, Amino-, Carboxyl-, Ether-, Sulfo-,
Phosphonsäuregruppen usw., erfolgen. Es ist auch möglich, den Aktivstoff nachträglich auf die gefällten Partikel aufzubringen, z.B. durch Suspension der ungecoateten (nicht
\5 modifizierten) magnetischen Partikel in einer den Aktivstoff beziehungsweise das
Aktivstoffgemisch enthaltenden flüssigen Phase, vorzugsweise Wasser. In einer weiteren möglich Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Aktivstoffe auch über sog. Spacer-Gruppen an die magnetischen Partikel gebunden werden. Spacer sind kurze organische Molekül-Ketten, die bei der Immobilisierung von Molekülen auf Trägern genutzt werden, wobei die Spacer-Moleküle keine Beschichtung darstellen. Spacer können
5 beispielsweise eingesetzt werden, wenn die Aktivstoffe keine polaren Gruppen oder ionischen Gruppen aufweisen. Die Spacer-Moleküle können die Bindung zwischen magnetischen Partikeln und den Aktivstoffen verbessern. Sie weisen vorzugsweise eine oder mehrere polare Gruppe(n) auf. Als Beispiele kann auf die bereits genannten Gruppen verwiesen werden. Insbesondere wenn kationische Aktivstoffe verwendet werden, haben sich
0 Spacer mit zwei polaren Gruppen, wie Aminocarbonsäuren, Diamine, Betaine, Dicarbonsäuren, Aminophosphonate, etc. als geeignet erwiesen.
In einer weiteren Ausführungsform werden sogenannte Agglomerate von magnetischen Partikeln eingesetzt, die aus Agglomeraten von Nanopartikeln, d.h. von Kristalliten mit einer
15 Teilchengröße unter 100 nm, bestehen. Diese Agglomerate können aus einzelnen Kristalliten bestehen, welche an ihrer Kontaktfläche entweder reversibel agglomeriert oder irreversibel durch Koaleszens, d.h. durch Zusammenwachsen über die Korngrenzen hinweg, agglomeriert sind. Ein Vorteil von Agglomeraten besteht darin, dass sie sowohl eine äußere als auch eine innere Oberfläche, d.h. Hohlräume aufweisen, so dass die Aktivstoffe innen
_0 und außen gebunden werden können. Agglomerate können beispielsweise erhalten werden, indem die magnetischen Partikel in Abwesenheit eines Wirkstoffs gefällt werden, durch Trocknung oder Gefriertrocknung wirkstofffreier oder mit Wirkstoff beladenen Nanopartikel mit anschließender Redispergierung, Agglomeratbildung, welche durch die Synthesebedingungen gesteuert werden kann, wie Temperaturerhöhung, Einstellung des pH-
>5 Wertes, hoher Elektrolytgehalt oder durch eine geeignete Nachbehandlung der gefällten Partikel bei Temperaturen von über 100°C.
Aktivstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind sowohl Stoffe, die in den Körper eingebracht werden, als auch Stoffe, die aus ihm entfernt werden sollen, z.B. synthetische
30 pharmazeutische Wirkstoffe, natürliche pharmazeutische Wirkstoffe und Extrakte, natürliche und rekombinante Peptide, Proteine, Enzyme, Antikörper und Antikörperfragmente, endogene biologische Einheiten wie lebende und abgestorbene Zellen, Zellbestandteile und Organellen, synthetische und natürliche DNA, Gene, Chromosomen, gentechnisch veränderte autologe oder heterologe Zellen, und xenobiotische Einheiten wie Bakterien, 5 Viren, Mycoplasma, Pilze, und Sporen, wärmeleitfähige Substanzen, wie Metalle, radiologisch wirksame Stoffe, wie γ-Strahler, Aktivstoffe enthaltende partikuläre exogene Einheiten wie Liposomen, Mikrokapseln und Nanopartikel, sowie beliebige Gemische der voranstehenden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Ausgestaltung sind die Aktivstoffe ausgewählt aus wasserlöslichen und/oder lipidlöslichen pharmazeutischen Wirkstoffen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden als Aktivstoffe geminale Bisphosphonsäuren und/oder deren physiologisch verträglichen Salze, vorzugsweise solche mit der allgemeinen Formel I eingesetzt:
P03H2 RrC-R2 Formel I
P03H2
in der ist
R-, ein linearer oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls substituiert sein kann durch Substituenten wie Aminogruppen, N-Mono- bzw. N- Dialkylaminogruppen, wobei die Alkylgruppen 1 bis 5 C-Atome und/oder SH-Gruppen enthalten können, oder ein substituierter oder unsubstituierter carbo- oder heterocyclischer Arylrest, der ggf. ein oder mehrere Heteroatome und als Substituenten verzweigte und unverzweigte Alkylreste mit 1 bis 6 C-Atomen, freie oder mono- resp. dialkylierte Aminogruppen mit 1 bis 6 C-Atomen oder Halogenatome aufweisen kann, und R2 gleich OH, ein Halogenatom, vorzugsweise Cl, H oder NH2.
Als Beispiele für geeignete Salze der Verbindungen mit der Formel I können Alkalimetallsalze, Ammoniumsalze und Ethanolamminsalze genannt werden.
Derartige Verbindungen eignen sich insbesondere für die Behandlung von osteoporotischen Erkrankungen, wobei folgende Verbindungen besonders bevorzugt sind: 3-(Methyl-pentylamino)-1-hydroxypropan-1 ,1-diphosphonsäure (Ibandronsäure), 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonsäure (Etidronsäure), Dichlormethandiphosphonsäure (Clodronsäure),
3-Amino-1-hydroxypropan-1 ,1-diphosphonsäure (Pamidronsäure), 4-Amino-1-hydroxybutan-1,1-diphosphonsäure (Alendronsäure), 2-(3-Pyridin)-1-hydroxyethan-1 ,1-diphosphonsäure (Risedronsäure), 4-Chlorphenylthiomethan-1 ,1-di-phosphonsäure (Tiludronsäure), Pyrimidinyl-1 -hydroxyethan-1 , 1 -diphosphonsäure (Zoledronsäure), CycloheptyIaminomethan-1,1-diphosphonsäure (Cimadronsäure), 6-Amino-1-hydroxyhexan-1 ,1 -diphosphonsäure (Neridronsäure), 3-(N,N-Dimethylamino)-1-hydroxypropan-1 ,1-diphosphonsäure (Olpadronsäure), 5 3-Pyrrol-1 -hydroxypropan-1 , 1 -diphosphonsäure und/oder
2-Pyrimidazol-1-hydroxyethan-1 ,1 -diphosphonsäure (Minodronsäure) sowie deren physiologisch verträglichen Salzen.
Wie bereits voranstehend ausgeführt besteht das erfindungsgemäße System in seiner 10 einfachsten Form aus magnetischem Partikel(n) und einem oder mehreren Aktivstoff(en). Dieses System kann in an sich bekannter Weise in eine pharmazeutische Zubereitung für die orale, parenterale, intravenöse, inhalative und/oder topische Applikation überführt werden und dem biologischen System zuführt werden. Als geeignete Formen der pharmazeutischen Zubereitung sind Suspensionen, Emulsionen und liposomale Systeme zu nennen. 15
In einer möglichen Ausführungsform liegt das erfindungsgemäße System in Form einer Suspension vor. Als Suspensionsmedium ist Wasser oder physiologische NaCI-Lösung bevorzugt.
_0 In einer weiteren Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung liegt das erfindungsgemäße
System für den Transport von Aktivstoffen als Emulsion vor, wobei sowohl Wasser-in-ÖI- als auch ÖI-in-Wasser-Emulsionen möglich sind. Die magnetischen Partikel liegen vorzugsweise ausschließlich in der Öl-Phase vor, welche die innere Phase, d.h. die Tröpfchen bildet. Zusätzlich können auch magnetische Partikel in der Wasser-Phase angereichert sein. In
!5 Fällen, in denen die magnetischen Partikel in der Öl-Phase vorliegen, spricht man auch von
Ölferrofluiden. Es können sowohl Makroemulsionen als auch Mikroemulsionen eingesetzt werden, d.h. thermodynamisch stabile Emulsionssysteme mit Tröpfchengrößen < 500 nm.
Ölferrofluide können als Träger für lipidlösliche Aktivstoffe dienen, so dass sowohl die 50 magnetisierbaren Partikel als auch der bzw. die Aktivstoffe in der Öl-Phase vorliegen. In einer weiteren Ausgestaltung werden wasserlösliche Aktivstoffe eingesetzt, die in gelöster Form in der wässerigen Phase vorliegen, und die magnetischen Partikel in der Öl-Phase vorliegen.
Um eine Erhöhung der physiologischen Verträglichkeit und eine schnelle Verteilung der
55 Aktivstoffe im Blutstrom zu bewirken, kann eine Emulgierung der beladenen Partikel in
Wasser gegebenenfalls auch unter Verwendung geeigneter physiologisch verträglicher
Emulgatoren erfolgen. Ein Beispiel für einen handelsüblichen Emulgator ist Solutol® (BASF AG). Liegen der Aktivstoff und die magnetischen Partikel in der Öl-Phase vor, so können auch hier die Wirkstoffe an die magnetischen Partikel gebunden sein (adsorbiert sein), was jedoch nicht unbedingt erforderlich ist.
5 In einer weiteren Ausgestaltung können wasserlösliche Wirkstoffe in der Wasser-Phase einer
Ölferrofluid-Emulsion gelöst oder suspendiert werden. Diese Ausführungsform ist besonders geeignet, wenn die Aktivstoffe wasserlösliche Polymere, wie Zellbestandteile, Proteine etc. sind. Unter Zuhilfenahme geeigneter Emulgatoren kann eine derartige Aktivstoffe enthaltende Wasserphase in eine magnetisches Öl enthaltende Emulsion überführt werden. Das
0 Emulsionsgemisch kann anschließend mittels Permanentmagnetfeld am Wirkort auf konzentriert werden.
In einer bevorzugten Ausführung werden die unabhängig voneinander in der wässerigen Phase vorliegenden Aktivstoffe und magnetischen Partikel in den wässerigen Innenraum von
5 Liposomen eingeschlossen. Falls erwünscht kann die nicht-eingeschlossene Fraktion durch Zentrifugation oder Gelchromatographie abgetrennt werden, woraus ein gereinigtes magnetisches Liposomenprodukt resultiert. Derselbe Prozess kann angewandt werden, um oben beschriebene magnetischen Partikel mit adsorbierten Aktivstoffen liposomal zu verkapseln.
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In einer möglichen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Aktivstoffe auf den magnetischen Partikeln adsorbiert und liegen gleichzeitig in freier Form in der wässerigen Phase und/oder in der Öl-Phase vor. Die Adsorption erfolgt entweder während der Bildung der magnetischen Partikel durch Fällung oder durch Suspendieren der magnetischen Partikel
!5 in einer Lösung, einer Suspension bzw. einer Dispersion der Aktivstoffe. Die beladenen Partikel können jeweils in Form einer Suspension, Mikroemulsion, ÖI-in-Wasser-Emulsion, Wasser-in-ÖI-Emulsion, Wasser-in-ÖI-in-Wasser-Emulsion etc. formuliert werden. Die beladenen magnetischen Partikel können in der wässerigen Phase oder in der Öl-Phase angereichert sein.
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Die Herstellung des erfindungsgemäßen Systems für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen System kann auf verschiedene Arten erfolgen.
In einer ersten Ausführungsform werden ein wasserlöslicher oder in Wasser suspendierbarer !5 Aktivstoff und eine in Wasser lösliche Vorstufe der magnetischen Partikel in Wasser gelöst und die magnetischen Partikel durch Ausfällung gebildet, wobei die magnetischen Partikel beladen mit dem Aktivstoff als Feststoff ausfallen. In einer weiteren Ausgestaltung dieses Herstellungsverfahrens werden die magnetischen Partikel in eine Lösung oder Suspension des Aktivstoffs in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit gegeben. Das Beladen der magnetischen Partikel mit Aktivstoff erfolgt durch 5 Adsorption auf der Oberfläche der magnetischen Partikel.
In einer weiteren Ausgestaltung können ölbasierte Ferrofluide erhalten werden. Vorzugsweise werden die magnetischen Partikel zunächst mit einem festen oder flüssigen Öl oder geschmolzenem Wachs unter Rühren und ggf. unter Erwärmen vermischt. Anschließend 10 können die erhaltenen lipidlöslichen Partikel in Gegenwart des Aktivstoffes in an sich bekannter Weise in Wasser emulgiert werden.
Als Öle oder Wachse können alle auf dem jeweiligen Einsatzgebiet geeigneten und bei Verarbeitungstemperatur flüssigen natürlichen oder sythetischen Öl oder Wachse eingesetzt 15 werden, sofern sie pharmazeutisch unbedenklich sind. Sofern die Öle oder Wachse in fester Form vorliegen, können sie zur Herstellung eines ölbasierten Ferrofluids erwärmt werden.
In einer weiteren Ausgestaltung des Herstellungsverfahrens können lipidlösliche Aktivstoffe in dem erfindungsgemäßen System eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung
_0 werden diese Aktivstoffe zunächst mit den erhaltenen lipidlöslichen Partikeln vermischt und das Gemisch wird anschließen in Wasser emulgiert. In einer weiteren möglichen Ausgestaltung können die lipidlöslichen Aktivstoffe zu den magnetischen Partikeln zugesetzt werden bevor oder während diese mit dem festen oder flüssigen Öl oder Wachs vermischt werden.
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In einer bevorzugten Ausgestaltung werden diese Aktivstoffe zunächst mit den erhaltenen lipidlöslichen Partikeln vermischt und das Gemisch wird anschließen in Wasser emulgiert.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des oben 50 beschriebenen Systems für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen System für den zielgerichtete Transport pharmazeutischen Wirkstoffen in dem biologischen System sowie die Verwendung des Systems für die Anreicherung von Aktivstoffen in dem biologischen System an vorgegebenen Orten. Zu diesem Zweck kann das Ferrofluid- Arzneistoffprodukt in geeignete konventionelle Arzneiformen überführt oder eingearbeitet 55 werden. Z.B. eignet sich für die orale Verabreichung eines mit Arzneistoff beladenen Ölferrofluids die Arzneiform der Soft-Gelatine Kapsel. Für die systemische Injektion oder die inhalative Anwendung eignet sich besonders die Form der liposomalen Verkapslung wie - '_ I " -' -12 _ oben beschrieben. Zur Einbringung und Positionierung in Körperhöhlen wie Peritoneum, Blasenraum, Urogenital- und Vaginaltrakt sind wässerige Suspensionen oder Öl-in-Wasser- Emulsionen besonders geeignet. Für den gezielten Transport der verwendeten Aktivstoffe kann beispielsweise extern ein Magnetfeld an oder in der Nähe des zu behandelnden „Ortes,, 5 angelegt werden, wodurch der Aktivstoff an der gewünschten Stelle lokal konzentriert werden kann (Drug-targeting).
Die Aktivstoffe können am Zielorgan bzw. Zielort ihre Wirkung entsprechend ihrer Aktivität entfalten und ggf. von den Partikel freigesetzt werden.
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Aktivstoffe, die ihre Wirkung unmittelbar durch Kontakt mit dem zu behandelnden biologischen System entfalten sollen, werden vorzugsweise unmittelbar am Wirkort freigesetzt. Ein Beispiel für derartige Aktivstoffe ist die Wirkung von Chemotherapeutika, Cytostatika, die Therapie unterstützenden Wirkstoffen, wie entzündungshemmenden Mitteln,
5 Schmerzmittel, etc., die mittels angelegtem Magnetfeld durch Transport über die magnetischen Partikel zu ihrem Wirkort transportiert werden, dort aufgrund ihrer Affinität zum behandelnden Gewebe, Tumor o. ä. freigesetzt werden und ihre Wirkung entfalten. Nach Beendigung der Freisetzung können die magnetischen Partikel wieder über das angelegte Magnetfeld, das bedeutet nach Verändern der Position des Magnetfelds, aus dem Körper
!0 entfernt werden.
Werden beispielsweise die voranstehend beschriebenen Bisphosphonate als Aktivstoffe verwendet, so kann bei der Behandlung von Knochentumoren bzw. Metastasen im Knochen, das erfindungsgemäße System, ein Ferrofluid aus magnetischem Partikeln und Bisphonat, !5 zum Tumor transportiert werden. Das Bisphosphonat wird an das Knochenapatit gebunden und inhibiert den Knochenumbau. Durch das externe Magnetfeld werden die Tumorzellen lokal erhitzt und so zerstört.
In einer weiteren Ausführungsform können Aktivstoffe, die radiologische Eigenschaften >0 zeigen, wie γ-Strahler etc., erfindungsgemäß zu ihrem Wirkort transportiert werden, dort das zu behandelnde Gewebe, gegebenenfalls mit externer Erwärmung, durch lokale Bestrahlung zerstören. Zum Abschluss der Bestrahlung können die Partikel mittels eines Magnetfelds wieder entfernt werden.
55 Neben dem Targeting-Effekt hat der Einsatz der magnetischen Partikel hat den weiteren Vorteil, daß die Partikel durch die andauernde Magnetisierung die Freisetzung der Aktivstoffe gefördert wird. Durch die andauernde Magnetisierung kann eine lokale Überwärmung entstehen, wodurch die Freisetzung von Aktivstoffen, die nur lose auf der Oberfläche der Partikel aufgebracht sind, unterstützt wird. Ein weiterer Freisetzungsmechanismus, der insbesondere dann auftritt, wenn keine Dauermagnetisierung vorliegt, ist die langsame Dissoziation des Aktivstoffes vom magnetischen Partikel. Diese Freisetzung kann über eine 5 chemische, insbesondere enzymatische, hydrolytische oder thermische Abspaltung oder auch über eine rein physikalische Abspaltung erfolgen. Die thermische Abspaltung der Aktivstoffe von den magnetischen Partikeln wird vorzugsweise durch ein angelegtes Magnetfeld unterstüzt.
0 Ein weiterer Vorteil der bei der andauernden Magnetisierung der am lokalen Wirkort befindlichen magnetischen Partikel ist die auftretende lokale Überwärmung. Diese kann genutzt werden, um erkrankte Gewebe beziehungsweise Tumorgewebe zu zerstören. Die lokale Überwärmung mittels Einsatz von magnetischem Feld wird auch als lokale oder zelluläre Hyperthermie bezeichnet.
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Die Kombination aus dem erfindungsgemäßen System und der Hyperthermie läßt sich beispielsweise auch bei der Behandlung von Tumoren, die unter Verwendung von sogenannten Thermo-seeds behandelt werden können, einsetzen. Die Thermo-seeds bestehen in der Regel aus einer Legierung aus einem magnetischem Metall, wie Eisen oder
!0 Kobalt, und einem nichtmagnetischen Material, wie den Edelmetallen Gold, Silber, Palladium oder Platin. Nach Implantation der Thermo-seeds in den Tumor kann das erfindungsgemäße System, das beispielsweise magnetische Partikel und ein Chemotherapeutikum als Aktivstoff enthalten, verabreichen. Das erfindungsgemäße System reichert sich in Thermo-seeds an und bildet so ein lokales Cytostatikumdepot. Im Anschluss an die Anreicherung des
!5 erfindungsgemäßen Systems am Tumor kann die übliche Thermo-seed-Behandlung erfolgen, indem außerhalb des Körpers ein magnetisches Wechselfeld abgestrahlt wird, welches zu einer Erhitzung der Thermo-seeds und die damit verbundene Zerstörung der Tumorzellen führt.
50 Eine ähnliche tumorbehandelnde Wirkung kann erreicht werden, wenn als Aktivstoff ein
Metall mit einer guten Wärmeleitfähigkeit, wie Palladium oder Platin verwendet wird. In dieser Ausführungsform wird das erfindungsgemäße System aus magnetischen Partikel und Metall an ihren Wirkort transportiert, anschließend erfolgt eine Erwärmung auf den Curie-Punkt durch externes Anlegen eines magnetischen Wechselfeldes. Die auftretende limitierte
55 Überwärmung führt zur Zerstörung der Tumorzellen. Diese Ausführungsform kann auf jeden beliebigen Tumor angewendet werden. Das erfindungsgemäße System kann in einer geeigneten pharmazeutischen Zubereitung wie oben beschrieben injiziert oder auch inhaliert werden. Beispielsweise ist die Inhalation dieses Systems zur Behandlung von Lungentumoren geeignet.
Beispiele
Beispiel 1 : Herstellung eines wasserdispergierten Ferrofluids
5 6.48g FeCI3 wurden in 40 g entionisiertem Wasser gelöst. Außerdem wurden 3,97 g FeCI2*4H20 in einer Mischung aus 8 ml entionisiertem Wasser und 2 ml 37%iger Salzsäure gelöst. Kurz vor Einsatz der Lösungen im Fällungsprozess wurden die beiden Mischungen vereinigt.
10 In einem Becherglas wurden 400 ml entionisiertes Wasser mit 10 g NaOH und 0,2 g
Hydroxyethandiphosphonsäure (HEDP) verrührt. Nach Abkühlen wurden hierzu unter starkem Rühren die salzsaure Eisensalzlösung gegossen. Mittels Magnetfeld wurde der gebildete schwarze Niederschlag sedimentiert und die überstehende Lösung abdekantiert. Anschließend wurde das gefällte Material mehrmals in Wasser aufgenommen und dekantiert,
15 um Fremdionen zu entfernen. Anschließend wurden 0,5 g HEDP und 100 ml Wasser zugegeben. Nach 1 stündigem Rühren bei 40 °C wurde 12 h lang bei RT nachgerührt. Nicht suspendierte Anteile wurden durch Zentrifugieren (5000-11000 Umdrehungen/Minute) abgetrennt. Auf diese Weise wurde eine magnetische Flüssigkeit erhalten, die im Rotationsverdampfer bis zum Erhalt des gewünschten Feststoffgehalts eingeengt wurde.
.0
Beispiel 2: Herstellung einer Ölferrofluid-in-Wasser-Emulsion
a. Herstellung des Ölferrofluids
7.8 g wasserfreies Eisen(lll)-chlorid wurden in 50g C02-freiem Wasser gelöst. Gleichzeitig
_5 wurden in einem zweiten Gefäß 4.8g FeCI2 *4H20 in 10g Wasser gelöst und mit Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert. Beide Lösungen wurden dann vereinigt und zu einer kräftig gerührten Vorlage, bestehend aus 100 ml 25%iger Ammoniaklösung und 300 ml entionisiertem Wasser unter Ausfällung eines schwarzen Niederschlags gegeben. Nach mehrmaligem Waschen mit Wasser und jeweiligem Abzentrifugieren und Abdekantieren
50 überstehender wässeriger Phase wurde der Niederschlag mit 100g Wasser und 2.0g
Laurinsäure versetzt. Unter Rühren wurde auf 85 °C erwärmt, bis der Niederschlag unter Flockenbildung sedimentierte. Anschließend wurde zu der noch 85°C heißen Mischung 10g Sonnenblumenöl gegeben und eine Stunde gerührt. Hierbei ging der Niederschlag dispersionsstabil in die Ölphase über, welche abgetrennt und mehrmals mit Wasser
.5 ausgeschüttelt wurde. Es wurde ein ölbasiertes Ferrofluid erhalten. b. Transport eines Aktivstoffs zu einem befallenen Gelenk
(Aktivstoff: Antirheumatikum Nabumeton) Das erhaltene Ölferrofluid wurde mit isotonischer Salzlösung im Volumenverhältnis 1 : 9 vermischt. Durch Zugabe des Emulgators Solutol® HS 15 (Polyethylenglykol 660-12- Hydroxystearat, Hersteller: BASF AG) mit einem Gewichtsanteil von 15g pro Liter und anschießendem Rühren mittels Magnetrührer wurde eine Ferrofluid-in-Wasser-Emulsion erhalten mit Tröpfchengrößen im Bereich 10 - 100 μm. Die Beladung mit dem öllöslichen Wirkstoff (Nabumeton) erfolgte vor der Emulgierung durch Lösen von 2 ml Wirkstoff in 8 ml ölbasiertem Ferrofluid.
Beispiel 3: Herstellung eines Ferrofluids, worin der Aktivstoff der Ölphase entspricht
7.8 g wasserfreies Eisen(lll)-chlorid wurden in 50 g C02-freiem Wasser gelöst. In einem zweiten Gefäß wurden 4.8 g FeCI2*4H20 in 10 g Wasser gelöst, die erhaltene Lösung wurde mit Salzsäure bis zu einem pH-Wert von 2 angesäuert. Beide Lösungen wurden zu einer Mischung vereinigt und zu einer stark gerührten Vorlage, bestehend aus 100 ml 25% Ammoniaklösung und 300 ml entionisiertem Wasser unter Ausfällung eines schwarzen Niederschlags gegeben. Nach mehrmaligem Waschen mit Wasser und jeweiliger Abzentrifugation und Abdekantieren überstehender wässeriger Phase wurde der Niederschlag mit 100 g Wasser und 2.0 g Laurinsäure versetzt. Unter Rühren erwärmte man auf 85 °C, bis der Niederschlag unter Flockenbildung sedimentierte. Anschließend wurden zu der noch 85°C heißen Mischung 10 g des öllöslichen Wirkstoffes Nabumeton gegeben und eine Stunde gerührt. Hierbei ging der Niederschlag dispersionsstabil in die Ölphase über, welche abgetrennt und mehrmals mit Wasser ausgeschüttelt wurde. Man erhielt ein ölbasiertes Ferrofluid.
Das Ölferrofluid wurde mit isotonischer Salzlösung im Volumenverhältnis 1 : 9 vermischt. Durch Zugabe des Emulgators Solutol HS 15 (Polyethylenglykol 660-12-Hydroxystearat, Hersteller: BASF AG) mit einem Gewichtsanteil von 15g pro Liter und anschießendes Rühren mittels Magnetrührer wurde eine Ferrofluid-in-Wasser-Emulsion erhalten mit Tröpfchengrößen im Bereich 5-100 Mikrometer. Zur Wirkstoffdosierung wurde die Ölphase entsprechend mit isotonischer Salzlösung verdünnt.
Beispiel 4: Liposomal verkapseltes wasserdispergiert.es Ferrofluid
5 g Phospholipon werden in einem Rundkolben in Chloroform gelöst und die organische Phase unter Vakuum am Rotationsverdampfter abgezogen, bis sich ein dünner lösungsmittelfreier Lipidfilm gebildet hat. 100 ml des wasserdispergierten Ferrofluidprodukts von Beispiel 1 wird unter leichtem Erwärmen zu dem Lipidfilm gegeben und für eine Stunde an einem mechanischen Schüttler bewegt, bis sich der Lipidfilm komplett von der Wand abgelöst hat und sich Liposomen gebildet haben. Das Präparat wird für 1-2 Minuten mit Ultraschall behandelt, um eine Grössenverteilung der Liposomen im Nanometerbereich zu erreichen. Das Präparat wird dann über eine Sephadex-G75 Säule von der nichtverkapselten Fraktion getrennt. Die Ferrofluid-Liposomendispersion kann mit isotonischer Kochsalzlösung auf die gewünschtge Konzentration eingestellt werden.
10
Beispiel 5: Wässerige Lösungen natürlicher oder synthetischer Proteine
1 ml einer wässerigen Lösung von Urodilatin (nephroprotektives Protein) wurde in 9 ml des ölbasierten Ferrofluids aus Beispiel 2 durch Zusatz von 1g Solutol® HS 15 und Rühren mittels 15 Magnetrührer bei Raumtemperatur emulgiert. Man erhielt eine Wasser-in-Ferrofluid- Emulsion, welche in 30 ml einer 1%igen wässerigen Solutollösung mittels Magnetrührung emulgiert wurde. Es bildete sich eine proteinhaltige Wasser-in- Ferrofluid-in-Wasser- Emulsion mit Tröpfchengrößen im Bereich zwischen 3-50 Mikrometer.
_0 Das Ferrofluid wird injiziert und transportiert das magnetunterstützte Urodilatin gezielt zum Wirkort Niere. Danach erfolgt Desorption und Separation der unbeladenen Partikel aus dem Blut über externe Blutwäsche, d.h. Ferropartikel werden durch magnetische Blutadsorber eingefangen und entsorgt.
_5 Beispiel 6: Magnetischer Transport von DNA in einer Wasser-in-ÖI-in-Wasser-Emulsion
1 ml einer isotonischen Salzlösung des Oligonucleotids Single Strand 24mer phosphorothioat (synthetisches DNA-Derivat) wurde in 9 ml des ölbasierten Ferrofluids aus Beispiel 2 durch Zusatz von 1g Solutol® HS 15 und starkes Rühren mittels Magnetrührer bei Raumtemperatur 50 emulgiert. Man erhielt eine nicht langzeitstabile Wasser in Ferrofluid-Emulsion, welche in 30 ml einer 1 %igen wässerigen Solutollösung mittels Magnetrührung emulgiert wurde. Es bildete sich eine oligonucleotidhaltige Wasser in Ferrofluid-in-Wasser-Emulsion mit Tröpfchengrößen im Mikrometerbereich.
55 Beispiel 7: Magnetischer Transport von Zellen und Zellbestandteilen in einer Wasser-in-ÖI- in-Wasser-Emulsion YY" YY YY - - 18 -
1 ml einer isotonischen Salzlösung von gentechnisch veränderten Epithelzellen wurden in 9 ml in Beispiel 2 erhaltenen Ferrofluids durch Zusatz von 1g Solutol® HS 15 und Rühren mittels Magnetrührer bei Raumtemperatur emulgiert. Man erhielt eine nicht lang-zeitstabile Wasser in Ferrofluid-Emulsion, welche in 30 ml einer 1%igen wässerigen Solutollösung 5 mittels Magnetrührung emulgiert wurde. Es bildete sich eine zellhaltige Wasser-in-Ferrofluid- in-Wasser-Emulsion mit Tröpfchengrößen im Mikrometerbereich.
Die erhaltene zellhaltige Ferrofluid-Emulsion ist beispielsweise zum zielgerichteten Transport und zur Plazierung der Zellen an einem speziellen Wirkort geeignet, wie z. B. zur Anheftung 0 der Zellen an bestimmte Gefäßwandstellen (z. B. in Coronararterien nach PTCA).

Claims

Patentansprüche
1. Stabilisator-freies System für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen 5 System aus einem oder mehreren Aktivstoff(en) sowie magnetischen Partikeln, das dadurch gekennzeichnet ist, dass die Partikel auf zumindest einem Teil ihrer Oberfläche mit Aktivstoff(en) versehen sind.
2. System nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das biologische System der menschliche oder tierische Körper, ein extrakorporales System, wie aus dem Körper
0 eluierte Zellen/Zellkulturen und/oder außerhalb des Körpers befindliche Geräte, in denen
Körperflüssigkeiten gereinigt, werden, ist.
3. System nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel ausgewählt sind aus superparamagnetischen Metalloxiden und/oder Metallen.
4. System nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Oxide 5 ausgewählt sind aus γ-Fe203, Fe304, MnFe204, NiFe204, CoFe204 und beliebigen
Gemischen daraus.
5. System nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass magnetischen Partikel eine Teilchengröße von 1 bis 300 nm, vorzugsweise bis 100 nm, aufweisen.
!0 6. System nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivstoffe ausgewählt sind aus Stoffen, die in den Körper eingebracht werden, als auch aus Stoffen, die aus ihm entfernt werden sollen.
7. System nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivstoffe ausgewählt sind aus synthetischen pharmazeutischen Wirkstoffen,
!5 natürlichen pharmazeutischen Wirkstoffen und Extrakten, natürlichen und rekombinanten
Peptiden, Proteinen, Enzymen, Antikörpern und Antikörperfragmenten, endogenen biologischen Einheiten, wie lebenden und abgestorbene Zellen, Zellbestandteilen und Organellen, synthetischer und natürlicher DNA, Genen, Chromosomen, gentechnisch veränderten autologen oder heterologen Zellen, und xenobiotischen Einheiten, wie
(0 Bakterien, Viren, Mycoplasma, Pilze, und Sporen, wärmeleitfähigen Substanzen, wie
Metalle, radiologisch wirksamen Stoffen, wie γ-Strahler, Aktivstoffe enthaltenden partikulären exogenen Einheiten, wie Liposomen, Mikrokapseln und Nanopartikeln, sowie beliebige Gemische der voranstehenden.
8. System nach einem der Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aktivstoffe ausgewählt sind aus wasserlöslichen und/oder lipidlöslichen pharmazeutischen Wirkstoffen.
9. System nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die wasserlöslichen 5 Aktivstoffe ausgewählt sind aus geminalen Bisphosphonsäuren und/oder deren physiologisch verträglichen Salzen der allgemeinen Formel I
P03H2 RrC-R2 Formel I o I
P03H2
in der ist
5 R1 ein linearer oder verzweigter Alkylrest mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, der gegebenenfalls substituiert sein kann durch Substituenten wie Aminogruppen, N-Mono- bzw. N-Dialkylaminogruppen, wobei die Alkylgruppen 1 bis 5 C-Atome und/oder SH- Gruppen enthalten können, oder ein substituierter oder unsubstituierter carbo- oder heterocyclischer Arylrest, der ggf. ein oder mehrere Heteroatome und als Substituenten
!0 verzweigte und unverzweigte Alkylreste mit 1 bis 6 C-Atomen, freie oder mono- resp. dialkylierte Aminogruppen mit 1 bis 6 C-Atomen oder Halogenatome aufweisen kann, ist und R2 gleich OH, ein Halogenatom, vorzugsweise Cl, H oder NH2.
10. System nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Bisphosponat !5 ausgewählt ist aus 3-(Methyl-pentylamino)-1-hydroxypropan-1 ,1 -diphosphonsäure (Iban- dronsäure), 1-Hydroxyethan-1 ,1 -diphosphonsäure (Etidronsäure), Dichlormethandiphos- phonsäure (Clodronsäure), 3-Amino-1-hydroxypropan-1,1 -diphosphonsäure (Pamidron- säure), 4-Amino-1-hydroxybutan-1 ,1 -diphosphonsäure (Alendronsäure), 2-(3-Pyridin)-1- hydroxyethan-1 , 1 -diphosphonsäure (Risedronsäure), 4-Chlorphenylthiomethan-1 , 1 -di- i0 phosphonsäure (Tiludronsäure), Pyrimidinyl-1-hydroxyethan-1,1 -diphosphonsäure
(Zoledronsäure), Cycloheptyiaminomethan-1,1 -diphosphonsäure (Cimadronsäure), 6- Amino-1-hydroxyhexan-1,1 -diphosphonsäure (Neridronsäure), 3-(N,N-Dimethylamino)-1- hydroxypropan-1 ,1 -diphosphonsäure (Olpadronsäure), 3-Pyrrol-1-hydroxypropan-1 ,1- diphosphonsäure und/oder 2-Pyrimidazol-1-hydroxyethan-1 ,1-diphosphonsäure
15 (Minodronsäure) sowie deren physiologisch verträglichen Salzen.
. "x YY .Y~<: - 21 -
11. System nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass es in eine pharmazeutische Zubereitung für die orale, parenterale, intravenöse, inhalative und/oder topische Applikation überführt wird.
12. System nach einem der Ansprüche 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es als 5 Suspension, Emulsion oder liposomales System vorliegt.
13. Verfahren zur Herstellung eines Systems für den Transport von Aktivstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass ein wasserlöslicher oder in
. Wasser suspendierbarer Aktivstoff und eine in Wasser lösliche Vorstufe der magnetischen Partikel in Wasser gelöst und die magnetischen Partikel durch Ausfällung 10 gebildet, wobei die magnetischen Partikel beladen mit dem Aktivstoff als Feststoff ausfallen.
14. Verfahren zur Herstellung eines Systems für den Transport von Aktivstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel in eine Lösung oder Suspension des Aktivstoffs in Wasser oder einer anderen Flüssigkeit
5 gegeben werden.
15. Verfahren zur Herstellung eines Systems für den Transport von Aktivstoffen nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel mit einem festen oder flüssigen Lipid unter Rühren vermischt und die erhaltenen lipidlöslichen Partikel in Gegenwart des Aktivstoffes in Wasser emulgiert werden.
!0 16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein lipidlöslicher Aktivstoff mit den erhaltenen lipidlöslichen Partikeln vermischt und das Gemisch in Wasser emulgiert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel und das feste oder flüssige Lipid in Gegenwart eines lipidlöslichen Aktivstoffs
!5 vermischt werden.
18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen lipidlöslichen Partikel emulgiert werden und die erhaltenen Emulsion anschließend mit einer wässerigen Lösung des Aktivstoffs vermischt wird.
19. Verwendung des Systems für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen 50 System nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für den zielgerichtete Transport pharmazeutischen Wirkstoffen in dem biologischen System.
0. Verwendung des Systems für den Transport von Aktivstoffen in einem biologischen System nach einem der Ansprüche 1 bis 12 für die Anreicherung von Aktivstoffen in dem biologischen System an vorgegebenen Orten.
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004071386A2 (en) * 2003-02-13 2004-08-26 Colorobbia Italia S.P.A. Compositions comprising microcapsules containing magnetic nanoparticles and biologically active molecules, their preparation and use
WO2008049537A1 (de) * 2006-10-23 2008-05-02 Apg Medical Ltd. Verwendung von magnetischen cs -kapseln und/oder mikrokapseln für die behandlung von aneurysmen
EP2209420A1 (de) * 2007-10-09 2010-07-28 Washington University in St. Louis Partikel für bildgebung
US7780953B2 (en) * 2002-12-20 2010-08-24 Guerbet Compositions magnetic particles covered with gem-bisphosphonate derivatives
ITFI20100206A1 (it) * 2010-10-01 2012-04-02 Abbruzzese Saccardi Alberto 10 Nanoparticelle autoassemblanti per il rilascio di bifosfonati nel trattamento di tumori.
EP3028721A1 (de) 2014-12-05 2016-06-08 Exchange Imaging Technologies GmbH Nanopartikel-Formulierung mit umgekehrter thermischer Gelierung zur Injektion
US9468607B2 (en) 2007-10-09 2016-10-18 Washington University Ligand directed toroidal nanoparticles for therapy and diagnostic imaging
US9498488B2 (en) 2003-06-27 2016-11-22 Biorest Ltd. Method of treating acute coronary syndromes
US9498439B2 (en) 2010-04-15 2016-11-22 Washington University Prodrug compositions, prodrug nanoparticles, and methods of use thereof
US9764043B2 (en) 2009-12-17 2017-09-19 Washington University Antithrombotic nanoparticle
US9808500B2 (en) 2009-12-17 2017-11-07 Washington University Antithrombotic nanoparticle
US9993427B2 (en) 2013-03-14 2018-06-12 Biorest Ltd. Liposome formulation and manufacture
CN109453120A (zh) * 2018-11-23 2019-03-12 中山大学肿瘤防治中心 磁性纳米药物载体及其应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2003226668A1 (en) * 2002-03-20 2003-09-29 President And Fellows Of Harvard College Vesicles comprising an amphiphilic di-block copolymer and a hydrophobic compound.
DE10222481A1 (de) * 2002-05-22 2003-12-04 Eucro Europe Contract Res Gmbh Kontrastmittel für die Verwendung in bildgebenden Verfahren
CA2597699C (en) * 2005-02-17 2012-07-31 Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. Bisphosphonates for treating endometriosis
KR100746312B1 (ko) * 2005-03-14 2007-08-03 한국화학연구원 수용성 산화철 나노 입자 및 이의 제조방법
US20100151253A1 (en) * 2005-07-08 2010-06-17 Henkel Kgaa Primer Compositions for Adhesive Bonding Systems
US20100178250A1 (en) * 2006-08-25 2010-07-15 Philadelphia Health & Education Corporation Method of Local Delivery of Bioactive and Diagnostic Agents Using Magnetizable Bone Cement
US8501159B2 (en) * 2006-12-18 2013-08-06 Colorobbia Italia S.P.A. Magnetic nanoparticles for the application in hyperthermia, preparation thereof and use in constructs having a pharmacological application
US20100041034A1 (en) * 2008-04-14 2010-02-18 Murante Richard S Method for manipulating samples with magnetic nucleation nanoparticles
US9205155B2 (en) 2009-10-30 2015-12-08 General Electric Company Treating water insoluble nanoparticles with hydrophilic alpha-hydroxyphosphonic acid conjugates, the so modified nanoparticles and their use as contrast agents
PT2886126T (pt) 2013-12-23 2017-09-13 Exchange Imaging Tech Gmbh Nanopartícula conjugada a péptidos de ligação a cd44

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4427821A1 (de) * 1993-03-17 1996-02-01 Silica Gel Gmbh Superparamagnetische Teilchen und deren Verwendung
DE19612001A1 (de) * 1996-03-18 1997-09-25 Silica Gel Gmbh Adsorptions Te Superparamagnetische Teilchen mit vergrößerter R¶1¶-Relaxivität, Verfahren zur Herstellung und deren Verwendung

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0156537A3 (de) * 1984-03-02 1987-05-13 Board Of Regents University Of Texas System Biologische magnetische Flüssigkeiten
US4827945A (en) * 1986-07-03 1989-05-09 Advanced Magnetics, Incorporated Biologically degradable superparamagnetic materials for use in clinical applications
US5219556A (en) * 1990-07-09 1993-06-15 Mallinckrodt Medical, Inc. Stabilized therapeutic radiopharmaceutical complexes
US5948384A (en) * 1990-09-14 1999-09-07 Syngenix Limited Particulate agents
WO1994021240A2 (de) * 1993-03-17 1994-09-29 Silica Gel Ges.M.B.H Superparamagnetische teilchen, verfahren zu ihrer herstellung und verwendung derselben
GB9710049D0 (en) * 1997-05-19 1997-07-09 Nycomed Imaging As Method

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE4427821A1 (de) * 1993-03-17 1996-02-01 Silica Gel Gmbh Superparamagnetische Teilchen und deren Verwendung
DE19612001A1 (de) * 1996-03-18 1997-09-25 Silica Gel Gmbh Adsorptions Te Superparamagnetische Teilchen mit vergrößerter R¶1¶-Relaxivität, Verfahren zur Herstellung und deren Verwendung

Cited By (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7780953B2 (en) * 2002-12-20 2010-08-24 Guerbet Compositions magnetic particles covered with gem-bisphosphonate derivatives
WO2004071386A3 (en) * 2003-02-13 2005-04-21 Colorobbia Italiana Spa Compositions comprising microcapsules containing magnetic nanoparticles and biologically active molecules, their preparation and use
WO2004071386A2 (en) * 2003-02-13 2004-08-26 Colorobbia Italia S.P.A. Compositions comprising microcapsules containing magnetic nanoparticles and biologically active molecules, their preparation and use
US9827254B2 (en) 2003-06-27 2017-11-28 Biorest Ltd. Method of treating acute coronary syndromes
US10517883B2 (en) 2003-06-27 2019-12-31 Zuli Holdings Ltd. Method of treating acute myocardial infarction
US10213446B2 (en) 2003-06-27 2019-02-26 Biorest Ltd. Method of treating acute coronary syndromes
US9498488B2 (en) 2003-06-27 2016-11-22 Biorest Ltd. Method of treating acute coronary syndromes
WO2008049537A1 (de) * 2006-10-23 2008-05-02 Apg Medical Ltd. Verwendung von magnetischen cs -kapseln und/oder mikrokapseln für die behandlung von aneurysmen
EP2209420A1 (de) * 2007-10-09 2010-07-28 Washington University in St. Louis Partikel für bildgebung
EP2209420A4 (de) * 2007-10-09 2014-01-22 Univ St Louis Partikel für bildgebung
US9446150B2 (en) 2007-10-09 2016-09-20 Washington University Particles for imaging
US9468607B2 (en) 2007-10-09 2016-10-18 Washington University Ligand directed toroidal nanoparticles for therapy and diagnostic imaging
US9764043B2 (en) 2009-12-17 2017-09-19 Washington University Antithrombotic nanoparticle
US9808500B2 (en) 2009-12-17 2017-11-07 Washington University Antithrombotic nanoparticle
US10201500B2 (en) 2010-04-15 2019-02-12 Washington University Prodrug compositions, prodrug nanoparticles, and methods of use thereof
US9498439B2 (en) 2010-04-15 2016-11-22 Washington University Prodrug compositions, prodrug nanoparticles, and methods of use thereof
US11141379B2 (en) 2010-04-15 2021-10-12 Washington University Prodrug compositions, prodrug nanoparticles, and methods of use thereof
US11872313B2 (en) 2010-04-15 2024-01-16 Washington University Prodrug compositions, prodrug nanoparticles, and methods of use thereof
US9226897B2 (en) 2010-10-01 2016-01-05 Istituti Fisioterapici Ospitalieri Self-assembling nanoparticles for the release of bisphosphonates in the treatment of human cancers
WO2012042024A1 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Istituti Fisioterapici Ospitalieri Self-assembling nanoparticles for the release of bisphosphonates in the treatment of human cancers
ITFI20100206A1 (it) * 2010-10-01 2012-04-02 Abbruzzese Saccardi Alberto 10 Nanoparticelle autoassemblanti per il rilascio di bifosfonati nel trattamento di tumori.
US9993427B2 (en) 2013-03-14 2018-06-12 Biorest Ltd. Liposome formulation and manufacture
US10265269B2 (en) 2013-03-14 2019-04-23 Biorest Ltd. Liposome formulation and manufacture
US11633357B2 (en) 2013-03-14 2023-04-25 Zuli Holdings, Ltd. Liposome formulation and manufacture
EP3028721A1 (de) 2014-12-05 2016-06-08 Exchange Imaging Technologies GmbH Nanopartikel-Formulierung mit umgekehrter thermischer Gelierung zur Injektion
CN109453120A (zh) * 2018-11-23 2019-03-12 中山大学肿瘤防治中心 磁性纳米药物载体及其应用

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EA005571B1 (ru) 2005-04-28
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JP2003528911A (ja) 2003-09-30
DE50111006D1 (de) 2006-10-26

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