EP1339396A2 - Magnetische partikel zur zielgerichteten regionalen therapie - Google Patents
Magnetische partikel zur zielgerichteten regionalen therapieInfo
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- EP1339396A2 EP1339396A2 EP01998333A EP01998333A EP1339396A2 EP 1339396 A2 EP1339396 A2 EP 1339396A2 EP 01998333 A EP01998333 A EP 01998333A EP 01998333 A EP01998333 A EP 01998333A EP 1339396 A2 EP1339396 A2 EP 1339396A2
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- A61P35/00—Antineoplastic agents
Definitions
- the present invention relates to magnetic particles for targeted regional therapy of diseases, in particular for treatment in humans.
- the invention is particularly suitable for regional treatment against Tu ore, local infections and local inflammation and similar local disease states.
- Magnetic Drug Targeting is based on binding therapeutically active substances to magnetic particles as a carrier system in order to enrich the therapeutic substance regionally or locally with magnetic field support and thus a higher effectiveness at the desired therapy location with a simultaneous reduction of systemically related side effects to achieve.
- DE-A-19 624 426 describes magnetic particles which comprise a core with nanocrystalline magnetic particles and a shell made of polymers with such reactive groups which are capable of covalent bonding or of ion exchange. It is proposed to use therapeutic agents such as e.g. to bind the cytostatics doxorubicin or mitoxantrone, for example via ion exchange reactions, to the magnetic particles and then to apply them intravenously in the form of a dispersion. With reference to other prior art documents, DE-A-19 624 426 initially mentions that - due to the structure and structure of those magnetic particles - e.g. is to be injected intra-arterially, but this should lead to considerable problems in clinical practice. The actual teaching of DE-A-19 624 426 therefore distances itself from such an application route and, according to the task, only considers intravenous application.
- A.S. Luebbe et al. in Cancer Res., Vol. 56, pp. 4694-4701 (1996) preclinical experiments on animals using magnetic field-assisted drug targeting when administered intravenously. Furthermore, A.S. Luebbe et al. in Cancer Res., Vol. 56, pp. 4686-4693 (1996) describes studies on the biocompatibility of magnetic particles loaded with 4'-epidoxorubicin.
- the object is achieved in that magnetic particles, which comprise a magnetic substance in combination with a therapeutic substance, are used for regional therapy of illnesses supported by magnetic fields by means of intra-arterial application.
- FIG. 1 shows the magnetic resonance image representation of tumors (VX-2 carcinoma) of rabbits after intraarterial (FIG. 1A) or intravenous (FIG. IB) application of magnetic particles and after 60 minutes of application of an external magnetic field (magnetic resonance 6 hours afterwards).
- FIG. 2 shows a histological section through the VX-2 door immediately after the magnetic field-assisted regional therapy according to the present invention.
- FIGS. 3A, 3B and 3C show enlarged areas of the sections shown as fields A, B and C in FIG. 2.
- FIGS. 5A to 5G illustrate the effect of the regional therapy according to the invention, which is supported by a magnetic field using magnetic particles compared to various control groups and comparative samples.
- FIG. 6 shows an example of a side effect (leukocyte values) in connection with the inventive, field-assisted, regional therapy using magnetic particles in comparison with control groups and comparative samples.
- FIG. 7A shows the absence of further side effects in the system according to the invention, in contrast to the occurrence of side effects in a control group that can be seen in FIG. 7B.
- Fig. 8 shows schematically the quantitative enrichment of 59 Fe with and without magnetic support. (Magnetic Targeting) in different tissues and organs.
- 9A shows the quantitative determination of the distribution of the active ingredient mitoxantrone by means of HPLC analysis with regard to the released active ingredient after intraarterial application of the active ingredient without exposure to magnetic fields in different tissues and organs.
- 9B shows the quantitative determination of the distribution of the active ingredient mitoxantrone by means of HPLC analysis with regard to the released active ingredient after intraarterial application according to the invention. of the active ingredient with magnetic field effects in different tissues and organs.
- 10A shows the distribution of the active ingredient mitoxantrone in percentages after intra-arterial application of the active ingredient without exposure to a magnetic field, based on the amount of mitoxantrone applied in different tissues and organs.
- FIG. 10B shows the distribution of the drug mitoxantrone in percentages by fiction, j jeffleßer intraarterial Application of the active ingredient with magnetic field action based on the amount of mitoxantrone applied in different tissues and organs.
- 11 shows the quantitative determination of the distribution of the active ingredient mitoxantrone by means of HPLC analysis with regard to the released active ingredient after intravenous administration of the active ingredient in different tissues and organs.
- An essential criterion of the concept according to the invention is that the magnetic particles, which comprise the magnetic substance and the therapeutic substance combined, are present in an embodiment for intra-arterial application. It has surprisingly been found that the local enrichment at the desired destination and the regional effectiveness of the therapeutic substance are significantly improved and, at the same time, harmful side effects are minimized if intra-arterial administration is provided and not intravenously as in the prior art described at the beginning ,
- FIG. IB Result of an intravenous application (FIG. IB) in the form of magnetic resonance image representations using the example of a tumor in the rear limbs (VX-2 carcinoma) of rabbits shown.
- the magnetic resonance image was recorded 6 hours after magnetic particles, which were loaded with a cytostatic, were applied either intra-arterially or intravenously in suitable liquids and then an inhomogeneous magnetic field, the pole of which was aimed at the tumor site, was applied for 60 minutes.
- the tumor in the medial thigh area of the rear limbs is indicated by a dotted, oval line, the area marked with an "f" indicating the head of the thigh bone (femur).
- the defined extinction signals of the magnetic resonance imaging which are visible in FIG. 1A and are restricted to the tumor area, confirms the high concentration of the magnetic particles loaded with the therapeutic substance in a stable state even 6 hours after application and targeted enrichment by means of magnetic force, during the comparison with the intravenous application shows almost no signal extinction in FIG.
- the magnetic particles for regional therapy of diseases can be administered via intra-arterial application
- the magnetic particles are usually in a form suitable for intra-arterial application, suitably in a liquid known to the person skilled in the art and designed for infusion or perfusion.
- the liquid should be biocompatible and not immunogenic, especially sterile and pyrogen-free.
- the magnetic particles can be used in view of the combination between the magnetic substance and the therapeutic see substance according to the invention basically in the form of two alternative configurations.
- the therapeutic substance is reversibly bound to the surface of the magnetic particles with a magnetic core substance
- the therapeutic substance is firmly connected to the magnetic substance.
- the first-mentioned embodiment is intended for molecular substances that develop their therapeutic effect after the reversible binding has been separated
- the second, alternative embodiment was primarily designed for radiation therapy, in which it is not the direct action of a dissociated molecular substance, but rather the emission a biologically effective radiation arrives.
- suitable polymers include: starch, starch esters or ether derivatives, their degradation products such as dextrins, furthermore dextrans, other polysaccharides, pectins, proteins such as albumin, casein, collagen, gelatin and their derivatives and Degradation products, as well as synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylic acids or the like.
- starch, starch degradation products and derivatives, dextrans, dextrins, serum albumin and polyvinyl alcohol can be mentioned as particularly suitable polymers for the construction of the casing for the above-mentioned purpose.
- the particle size of the magnetic particles which can be determined by means of dynamic light scattering, is set within the scope of the invention with regard to the desired target location. It has been found that an excellent compromise can be achieved between the avoidance of a tendency to embolism, good mobility through the vascular system in connection with excellent enrichment and distribution at the desired target location with sufficient orientation and maneuverability by the magnetic field to be applied after intra-arterial application if the particle size is in the range from 20 nm to 500 nm and in particular in the range from 50 nm to 200 nm.
- the particle size is set in a manner known per se (see above sources), primarily by setting suitable manufacturing conditions for the magnetic particles (nanoparticles).
- the procedure according to the invention made it possible to achieve complete remission of the tumor after the short duration of a single treatment. It turned out to be particularly advantageous that only a minor part, usually already at 10-50% of the conventionally systemically applied dose of the therapeutic substance used in each case, was able to achieve complete remission of the tumor without the occurrence of side effects.
- a 50% reduction in tumor volume resulted after 4 to 6 days (at a dose that corresponds to 20% of the conventionally systemically applied dose, there was a 50% reduction after 3 - 12 days (on average 6 days); in the case of a dose of 50% of the conventional systemically applied dose, there was a 50% reduction after 3 - 6 days (mean: 4.2 days).
- the side effects associated with systemic therapy are minimized or completely suppressed. None of the treated individuals developed side effects such as hair loss (alopecia), ulcers (ulcers) or muscle atrophy, and the general condition (weight, food intake, feces and urine output, activity) remained throughout the 3-month observation period compared to the physiological conditions of healthy individuals - viduen normal. No significant changes in serum iron levels or leukocyte levels were found. In contrast, the values and results in comparison and control groups were significantly worse.
- the comparison conditions were identical in each case (ie identical magnetic substance (starch-coated iron oxide particles; particle diameter 100 nm); application of an inhomogeneous magnetic field with a maximum magnetic flux density of, for example, 1.7 Tesla and a corresponding magnetic field gradient).
- the therapeutic substance is reversibly bound to the polymer shell described above via ionic interaction, in which case the polymer applied to the magnetic core particles bears ionically charged groups.
- the degree of association in the reversible bond between the therapeutic substance and the ionically charged groups of the polymer shell is set by suitable ambient conditions. These suitable conditions include, in each case individually or in combination, the temperature, the pH and in particular the osmolality.
- Active ingredient concentration leads. For example, after the intra-arterial application and the subsequent localization and enrichment using the magnetic field concentrated at the target site at a point in time at which the magnetic particles at the target site are sufficiently accumulated (approximately after 30 minutes to a few hours) the physiological ambient conditions are changed, that a dissociation of the ionic bond of the therapeutic substance is favored by the magnetic carrier. For example, depending on the type of ionic interaction, the desired dissociation can be promoted by a local temperature device or by the supply of physiologically tolerable infusion solutions, which are adjusted according to the respective factors such as pH and / or osmolality, preferably on the same intra-arterial solution Application point are fed.
- the polymer of the shell can be designed or modified with ionically charged groups or ionizable groups in such a way that the ionic interaction can take place in a reversible manner.
- the therapeutic substance has, for example, anionic groups, such as, for example, carboxylate, sulfate, sulfonate, phosphate or similar groups
- the shell polymer should carry correspondingly positively charged or ionizable groups, for example due to the presence or incorporation of primary, secondary or tertiary groups Amino groups or quarterly ammonium groups or by imino groups can be realized.
- a particularly favorable combination is achieved when the polymer shell carries negatively charged phosphate groups and the therapeutic substance is reversibly bound to the phosphate groups via one or more amino or ammonium groups, because on the one hand, a stable association between the substance combination initially exists when the loaded magnetic particles are provided, but on the other hand enables rapid dissociation under physiological environmental conditions and at the same time very good tolerability and compliance with natural systems is realized.
- Starch polymers esterified with phosphate groups have proven to be very suitable polymer substances for coating magnetic cores.
- therapeutic substance is to have a regional or local effect.
- therapeutic substances include: low molecular weight, synthetic or natural or semi-synthetic drugs, antibodies, in particular monoclonal antibodies and genetically engineered, preferably human or partly human antibodies, furthermore peptides, angiogenesis factors, hormones, lymphokines and cytokines, lectins and oligonucleotides and DNAs such as Antisense oligonucleotides or DNA therapeutically used DNA substances, each as isolated DNA, in the form of
- Plasmids or vectors or forms enclosed in suitable carrier systems can be present.
- a particularly useful area of application of the present invention is regional therapy against tumors, but also the treatment of local inflammation, local arteriosclerosis, local
- cytostatic for example, to call mitoxantrone, which can be bonded to magnetic particles in a stable but inexpensively reversibly dissociable manner.
- the structure of such a magnetic particle is shown in FIG. 4 by way of example in the case of magnetic nanoparticles modified with phosphate groups.
- the therapeutic substance used as an emitter of high-energy radiation can generally be a biologically active radiator and is preferably an ⁇ and / or a ⁇ radiator or such a substance which, by activation, for example by a neutron source, is converted into an ⁇ and / or ⁇ -emitter can be converted or transferred.
- boron or boron compounds can be mentioned as very promising therapeutic substances, which can be converted into an ⁇ -emitter by means of neutron activation.
- the use of boron or boron compounds can be an excellent way to realize with the inventive magnetic "carrier system, is described in detail below, and which thereby enabled Strahlenthera- pie is both very targeted as a local therapy feasible, and therefore offers itself as side effects of therapy.
- the therapeutic substance need not be reversibly associated on the surface of the magnetic particles, as was described above in the context of the first embodiment of the magnetic particles for the invention.
- the substance is integrated directly into the magnetic core of the particles or that the magnetic core is coated with the therapeutic substance.
- the term "substance” including the element capable or activatable for emission of high-energy radiation, for example magnetic iron-boron alloys, iron borides, iron borates or magnetic, mixed oxides or mixed oxides such as boron ferrites, boron magnetites, or by coating magnetic particles of, for example, ferrites, magnetites or similar double oxides with the metal, the metal oxide or another compound of the
- Element that is capable of or can be activated to emit intense radiation, e.g. with boron oxide, boric acid, borate ions or boric acid ester.
- intense radiation e.g. with boron oxide, boric acid, borate ions or boric acid ester.
- alternatively or further elements which may have a favorable influence on the magnetization, the material properties or the production, can be present in chemical compound, e.g. Nickel, cobalt, rare earth elements, silicon and / or carbon.
- the above general descriptions for the first embodiment of the magnetic particles apply accordingly, in particular with regard to the optionally provided coating with suitable polymers, the preferably set particle size of the magnetic particles and the use of a preferred dose, which is reduced compared to the conventionally used radiation dose, the over the targeted regional therapy according to the invention can be implemented.
- the magnetic field device that can be used for therapy support should generate an inhomogeneous magnetic field.
- inhomogeneous magnetic fields generating electromagnets with a pole maximum of up to 2.5 Tesla, preferably up to 2.0 Tesla, in particular in the range from over 1.0 Tesla to 1.8 Tesla, are suitable, starting from from the specified pole maximum sets a correspondingly strong magnetic flux gradient.
- Such strong magnetic fields are very efficient in combination with the magnetic particles described above.
- the pole maximum mentioned above should preferably occur at a distance of up to 20 mm, more preferably up to 15 mm, from the pole piece of the electromagnet.
- the magnetic particles used in the examples and comparative examples were produced in accordance with DE-A-19 624 426 (available from chemicell, Berlin, Germany). They consist of a colloidal dispersion of magnetic particles, which can be obtained by wet chemical processes from iron oxides and hydroxides to produce special multi-domain particles. The particles were encased in starch polymers modified with phosphate groups in order to stabilize them under various physiological conditions and to enable ionic binding to the therapeutic substance.
- the cytostatic agent mitoxantrone which is cationic or positively ionizable, was used as a therapeutic substance Carries groups and is capable of reversibly binding to the starch polymers of the coating of the magnetite particles modified with esterified phosphate groups, with the formation of reversible ionic interactions.
- Table 1 shows the characteristics of the exemplary ferrofluids used.
- the combination used as a representative example between mitoxantrone and magnetic particles carrying phosphate groups is shown schematically in FIG. 1, the relevant chemical structures of the therapeutic substance and of the phosphate groups being shown in the figure broken down and enlarged.
- the positively charged NH + groups of the hydrochloride forms of mitoxantrone (MTX-HCl) are associated with the phosphate groups of the starch derivative at a pH of 7.4.
- the loaded ferrofluids contained 6.5 mg mitoxantrone per 10 ml of the liquid Composition.
- the dissociation could be adjusted by means of suitable factors of the physiological environmental conditions such as pH, osmolality and temperature by changing the blood electrolyte concentration according to the specific requirements and the desired dissociation.
- the therapeutic substance almost completely dissociated after 60 minutes.
- VX-2 squamous cell carcinoma established in rabbits (A. Hough et al., Am. J. Pathol., 87, p. 537 (1977); CS Galasko and DS Muckle, Br. J. Cancer, 29, p. 59 (1974)).
- the tumor grows rapidly with increasing vascularity in the area.
- the animals soon develop (within 2 - 3 weeks) central tumor necrosis, locoregional lymph node metastases and hematogenous metastases in the lungs. Fragments of vital VX-2 were used to transmit the tumor.
- Chemotherapy was started when the tumors reached a volume of approximately 3500 mm 3 .
- FF-MTX Mitoxantrone-bound ferrofluids
- n denotes the number of tumor-bearing animals examined in each group.
- Dose indicates the proportion of therapeutic substance compared to the normal systemic mitoxantrone dose (10 mg / m 2 ) that was administered by a single application.
- the intra-arterial application was via the femoral artery, the intravenous application via the ear vein.
- the external magnetic field was concentrated over the tumor.
- the magnetic flux density was focused on the tumor region with a specially adapted pole shoe, which was brought into contact with the surface of the tumor.
- the magnetic flux density in the area of the tumor surface was about 1.7 Tesla and about 10 mm below the tip of the pole piece about 1.0 Tesla.
- the magnetic field was concentrated over the tumor during the application of the infusion solution described above and applied for a total of 60 min.
- blood samples were taken once a week by venipuncture and centrifuged at 2000 x g for two hours. Immediately after taking the blood, measurements of various parameters in clinical chemistry (iron, alanine aminotransferase, aspartate ainotransferase, ⁇ -glutamyl transferase, alkaline phosphatase and lactate dehydrogenase) and blood count parameters (cell values of whole blood and differential blood) were carried out.
- iron iron, alanine aminotransferase, aspartate ainotransferase, ⁇ -glutamyl transferase, alkaline phosphatase and lactate dehydrogenase
- blood count parameters cell values of whole blood and differential blood
- SPSS "Statistical Package for Social Sciences
- FIG. 5C shows a progressive increase in the tumor volume with palpable, enlarged lymph nodes in the groin area (metastases). Furthermore, the comparison with the intravenous application (groups 4a and 4b, FIGS. 5E and 5F) showed no statistically significant tumor remissions in comparison to the intraarterial application according to the invention.
- 5G shows in relation to comparison group 5 the importance of the support by a magnetic field, in which the procedure was as in groups la and lb according to the invention, but without applying the external magnetic field. Further tumor growth and metastasis formation could be prevented, however no remission of the tumor was observed. At the time of treatment, less than 5% of the animals showed a low necrotic fraction in the area of the tumor.
- FIGS. 6A and 6B The results on the local and systemic side effects are summarized in FIGS. 6A and 6B.
- control group 6 the general condition deteriorated during the observation period.
- the tumor-infected animals developed pneumonia, which explains the increase in the number of leukocytes observed in FIGS. 6A and 6B with respect to the control group.
- there were no significant changes in the leukocyte values in groups la and lb according to the invention see FIGS. 6A and 6B.
- the other parameters examined also remained normal in the observation period of three months.
- 7A clearly shows the normal appearance of the hind legs, which is also visible from the outside, after the tumor treatment of the group according to the invention.
- FIGS. 3 and 1 For histological assessment and for magnetic resonance imaging (see FIGS. 3 and 1), the tumor was removed for 60 min immediately after the single application of 50% FF-MTX in the femoral artery and the application of the magnetic field, and in 3, 7% formalin fixed. 5 ⁇ m thick paraffin sections of the tumor were cut and stained with hematoxylin and eosin. The histological staining led to the histological findings shown in FIGS. 2 and 3A to 3C.
- magnetic resonance image analysis was carried out on four tumor-bearing animals after a corresponding application and 6 hours after application of the external magnetic field. The images were carried out at 1.5 Tesla using a clinical magnetic resonance scanner (ACS-NT; Philips). A fat suppressing Tl-weighted turbospin echo sequence was used for the image display (TR 535, TE 20, echo train sounds 5). This led to the magnetic resonance image depictions shown in FIGS. 1A and IB.
- FIG. 8 shows the quantitative enrichment of 59 Fe with and without magnetic field support (magnetic drug targeting).
- 5 times could be accumulated in the tumor 34 times more, and even more than 236 times more peritumally. This is very important especially for the sano situation (ie the tumor has been completely recorded, including the tumor extensions). There is also a much lower accumulation in the liver, spleen and bone marrow.
- the data in FIG. 8 always relate to activity (Bq) / gram of tissue.
- FIGS. 9A and 9B show the HPLC analyzes with regard to the released active substance mitoxantrone after intraarterial application without exposure to a magnetic field (FIG. 9A) and with
- FIGS. 11 and 12 show that the intravenous administration of the active ingredient mitoxantrone results in almost no accumulation in the corresponding muscle area. On the other hand, there is a strong concentration in the liver, kidney and spleen.
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Abstract
Die Erfindung beschreibt magnetische Partikel, die eine magnetische Substanz in Kombination mit einer therapeutischen Substanz umfassen, zur Magnetfeld-unterstützten, regionalen Therapie von Krankheiten mittels intraarterieller Applikation.
Description
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft magnetische Partikel zur zielgerichteten regionalen Therapie von Krankheiten, insbe- sondere zur Behandlung beim Menschen. Die Erfindung eignet sich besonders gut zur regionalen Behandlung gegen Tu ore, lokale Infektionen und lokale Entzündungen und ähnliche lokale Krankheitszustände.
Die Therapie von Krankheiten ist in der Regel eine Balanceakt zwischen der Wirksamkeit und der Toxizität des eingesetzten Wirkstoffs. Dies gilt insbesondere für die Chemotherapie mit den in der Regel toxischen Cytostatika. Eine Reihe von Strategien wurden deshalb entwickelt, um diesem Dilemma zu begegnen.
Eine Strategie mit der Bezeichnung "Magnetic Drug Targeting" beruht darauf, therapeutisch wirksame Substanzen an magnetische Partikel als Trägersystem zu binden, um Magnetfeld- unterstützt die therapeutische Substanz regional bzw. lokal anzureichern und somit eine höhere Wirksamkeit am gewünschten Therapieort bei gleichzeitiger Reduzierung systemisch bedingter Nebenwirkungen zu erzielen. Dabei handelt es sich um spezielle Anwendungen der für breite technische Bereiche entwickelten magnetischen Flüssigkeiten, den so genannten Ferrofluiden.
Versuche, eine gezielte Chemotherapie mit magnetischen, Arzneimittel-beladenen Albumin-Mikropartikeln unter Zuhilfe- nähme von Magnetfeldern durchzuführen, werden von K.J. Widder et al. in Eur. J. Cancer Clin. Onkol., Vol. 19, S. 135-139 (1983) und P.K. Gupta und CT. Hung in N. Willmot und J. Daly (Hrg.), "Microspheres and Regional Cancer Therapy" , S. 71-116, CRC Press, Boca Rayton (FL) (1991), beschrieben. Dabei liegt der Wirkstoff im von Albumin beschichteten Kern
vor, was jedoch eine Phagozytose notwendig macht, um den Wirkstoff frei zu setzen.
Die DE-A-19 624 426 beschreibt magnetische Partikel, die einen Kern mit nanokristallinen magnetischen Teilchen und eine Hülle aus Polymeren mit solchen reaktiven Gruppen umfassen, die zur kovalenten Bindung oder zum Ionenaustausch befähigt sind. Es wird vorgeschlagen, therapeutische Wirkstoffe, wie z.B. die Cytostatika Doxorubicin oder Mitoxantron, beispielsweise über lonentauscherreaktionen an die magnetischen Teilchen zu binden und anschließend in Form einer Dispersion intravenös zu applizieren. Unter Bezugnahme auf andere Dokumente des Stands der Technik wird in der DE-A- 19 624 426 einleitend erwähnt, dass dort - bedingt durch die Struktur und den Aufbau jener magnetischen Partikel - z.B. intraarteriell zu injizieren ist, was aber in der klinischen Praxis zu erheblichen Problemen führen soll. Die eigentliche Lehre der DE-A-19 624 426 nimmt daher von einem solchen Applikationsweg Abstand und zieht aufgabengemäß nur eine intravenöse Applikation in Betracht.
Ferner beschreiben A.S. Lübbe et al. in Cancer Res., Vol. 56, S. 4694-4701 (1996) präklinische Experimente an Tieren mittels Magnetfeld-unterstutzten Wirkstoff-Targetings bei intravenöser Applikation. Ferner wurden durch A.S. Lübbe et al. in Cancer Res., Vol. 56, S. 4686-4693 (1996) Studien zur Bioverträglichkeit von mit 4' -Epidoxorubicin beladenen magnetischen Partikeln beschrieben.
Die tatsächliche therapeutische Wirksamkeit von mit therapeutischen Substanzen beladenen magnetischen Teilchen ist jedoch bisher noch nicht beschrieben worden. Insbesondere gibt der oben genannte Stand der Technik nicht die Bedingungen wieder, welche für eine effiziente und wirksame regionale bzw. lokale Therapie von Krankheiten bei gleichzeitiger Minimierung systemisch bedingter Nebenwirkungen erforderlich sind.
Es war daher Aufgabe vorliegender Erfindung, technischen Mittel und Wege zur Verfügung zu stellen, um die regionale bzw. lokale Therapie von Krankheiten zu verbessern.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass magnetische Partikel, die eine magnetische Substanz in Kombination mit einer therapeutischen Substanz umfassen, zur Magnetfeld-unterstutzten, regionalen Therapie von Krankheiten mittels intraarterieller Applikation eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung und die bevorzugten Ausführungsformen werden nachfolgend unter Bezugnahme auf die beigefügten Figuren näher erläutert.
Fig. 1 zeigt die Magnetresonanz-Bilddarstellung von Tumoren (VX-2-Karzinom) von Kaninchen nach intraarterieller (Fig. 1A) bzw. intravenöser (Fig. IB) Applikation magnetischer Partikel und nach 60-minütiger Anwendung eines externen magnetischen Feldes (Magnetresonanz-Bildaufnahmen 6 h danach) .
Fig. 2 zeigt einen histologischen Schnitt durch den VX-2- Tu or unmittelbar nach der Magnetfeld-unterstutzten, regionalen Therapie gemäß der vorliegenden Erfindung.
Die Figuren 3A, 3B und 3C zeigen vergrößert unterschiedliche Bereiche der jeweils in Fig. 2 als Felder A, B und C dargestellten Sektionen.
Fig. 4 zeigt die reversible Bindung einer therapeutischen Substanz über ionische Wechselwirkung an ionisch geladene Gruppen der Polymerhülle der magnetischen Partikel gemäß einer Ausführungsform vorliegender Erfindung.
Die Figuren 5A bis 5G veranschaulichen die Wirkung der erfindungsgemäßen, Magnetfeld-unterstutzten, regionalen Therapie
mittels magnetischer Partikel im Vergleich zu verschiedenen Kontrollgruppen und Vergleichsproben.
Fig. 6 zeigt ein Beispiel einer Nebenwirkung (Leukozyten- werte) im Zusammenhang mit der erfindungsgemäßen, Magnetfeldunterstützten, regionalen Therapie mittels magnetischer Partikel im Vergleich zu Kontrollgruppen und Vergleichsproben .
Fig. 7A zeigt die Abwesenheit weiterer Nebenwirkungen im erfindungsgemäßen System im Gegensatz zum in Fig. 7B ersichtlichen Auftreten von Nebenwirkungen bei einer Kontrollgruppe .
Fig. 8 zeigt schematisch die quantitative Anreicherung von 59Fe mit und ohne Magnet eldunterstützung. (Magnetic Targeting) in unterschiedlichen Geweben und Organen.
Fig. 9A zeigt die quantitative Bestimmung der Verteilung des Wirkstoffs Mitoxantron mittels HPLC-Analyse bezüglich des freigesetzten Wirkstoffs nach intraarterieller Applikation des Wirkstoffs ohne Magnetfeldeinwirkung in unterschiedlichen Geweben und Organen.
Fig. 9B zeigt die quantitative Bestimmung der Verteilung des Wirkstoffs Mitoxantron mittels HPLC-Analyse bezüglich des freigesetzten Wirkstoffs nach erfindungsgemäßer intraarterieller Applikation. des Wirkstoffs mit Magnetfeldeinwirkung in unterschiedlichen Geweben und Organen.
Fig. 10A zeigt die Verteilung des Wirkstoffs Mitoxantron in Prozentangaben nach intraarterieller Applikation des Wirkstoffs ohne Magnetfeldeinwirkung bezogen auf die applizierte Menge an Mitoxantron in unterschiedlichen Geweben und Organen.
Fig. 10B zeigt die Verteilung des Wirkstoffs Mitoxantron in Prozentangaben nach erfindungsjjemäßer intraarterieller
Applikation des Wirkstoffs mit Magnetfeldeinwirkung bezogen auf die applizierte Menge an Mitoxantron in unterschiedlichen Geweben und Organen.
Fig. 11 zeigt die quantitative Bestimmung der Verteilung des Wirkstoffs Mitoxantron mittels HPLC-Analyse bezüglich des freigesetzten Wirkstoffs nach intravenöser Applikation des Wirkstoffs in unterschiedlichen Geweben und Organen.
Fig. 12 zeigt die Verteilung des Wirkstoffs Mitoxantron in Prozentangaben nach intravenöser Applikation des Wirkstoffs bezogen auf die applizierte Menge an Mitoxantron in unterschiedlichen Geweben und Organen.
Ein wesentliches Kriterium der erfindungsgemäßen Konzeptes besteht darin, dass die magnetischen Partikel, .die die magnetische Substanz und die therapeutische Substanz kombiniert umfassen, in einer Ausgestaltung zur intraarteriellen Applikation vorliegen. Es hat sich überraschend herausge- stellt, dass die lokale Anreicherung am gewünschten Zielort sowie die regionale Wirksamkeit der therapeutischen Substanz signifikant verbessert werden und gleichzeitig schädliche Nebenwirkungen minimiert werden, wenn eine intraarterielle Applikation vorgesehen ist und nicht wie im eingangs be- schriebenen Stand der Technik intravenös.
Die wesentlich bessere regionale Anreicherung von mit einer therapeutischen Substanz beladenen magnetischen Partikeln für die zielgerichtete, regionale Therapie im Falle einer intra- arteriellen Applikation ist in Fig. 1A im Vergleich zu dem
Ergebnis einer intravenösen Applikation (Fig. IB) in Form von Magnetresonanzbild-Darstellungen am Beispiel eines Tumors in den hinteren Gliedmaßen (VX-2-Karzinom) von Kaninchen gezeigt. Die Magnetresonanz-Darstellung wurde aufgenommen 6 Stunden, nachdem magnetische Partikel, die mit einem Cyto- statikum beladen waren, entweder intraarteriell oder intravenös in dafür jeweils geeigneten Flüssigkeiten appliziert
wurden und anschließend 60 Minuten ein inhomogenes Magnetfeld, dessen Pol auf die Tumorstelle gerichtet war, angelegt wurde. Der Tumor im medialen Oberschenkelbereich der hinteren Gliedmaßen wird durch eine gepunktete, ovale Linie angezeigt, wobei die mit einem " f" markierte Fläche den Kopf des Oberschenkelknochens (Femur) anzeigt. Die in Fig. 1A ersichtlichen, auf den Tumorbereich beschränkten definierten Extinktionssignale der Magnetresonanz-Darstellung belegt die hohe Anreicherung der mit der therapeutischen Substanz beladenen magnetischen Partikel in stabilem Zustand auch 6 Stunden nach Applikation und zielgerichteter Anreicherung mittels Magnetkraft, während der Vergleich mit der intravenösen Applikation in Fig. IB nahezu keine Signalextinktion zeigt.
Im Rahmen experimenteller Untersuchungen mit magnetischen
Partikeln, die zum quantitativen Nachweis radioaktiv markiert waren, wurde nachgewiesen, dass sogar 80% bis 90% der erfindungsgemäß eingesetzten magnetischen Partikel bei intraarterieller Applikation im Tumor oder im peritumoralen Gebiet konzentriert werden konnten. Dies belegt den signifikanten Vorteil der vorliegenden Erfindung, wonach für eine gleiche Wirksamkeit der herkömmlich applizierten therapeutischen Substanz eine verringerte Dosis, vorzugsweise eine wesentlich verringerte Dosis der entsprechenden therapeutischen Substanz erforderlich ist, was zu erheblich weniger Nebenwirkungen führt. Aufgrund dieser ausgezeichneten Anreicherung im Zielgebiet konnte erfindungsgemäß am Beispiel eines Tumors bereits bei einmaliger Applikation eine vollständige Remission des Tumors erreicht werden. Eine Embolisation aufgrund der eingesetzten magnetischen Partikel wurde nicht beobachtet.
Ferner wurde gefunden, dass mit der erfindungsgemäßen Ausgestaltung zur intraarteriellen Applikation der mit der thera- peutischen Substanz beladenen magnetischen Partikel eine ausgezeichnete Verteilung der magnetischen Partikel durch den
gesamten Tumor erreicht wird. Dies wird anhand der in den Figuren 2 und den damit zusammenhängenden Figuren 3A, 3B und 3C dargestellten histologischen Befunde gezeigt. Bei der erfindungsgemäßen Vorgehensweise werden die hohen Mengen an magnetischen Partikeln über den gesamten Tumorbereich hinweg erzielt, wie an den Gesamtschnitten des Tumors in Fig. 2 anhand der Ansammlungen der braun-schwarz sichtbaren magnetischen Partikel deutlich wird. Es gibt eng lokalisierte Bereiche mit Ansammlungen magnetischer Partikel besonders hoher Dichte, aber auch über den gesamten Tumor zerstreute und verteilte magnetische Partikel in geringerer Dichte. Eine genauere Untersuchung des in Fig. 2 als Feld A gekennzeichneten Bereiches zeigt ferner (s. Fig. 3A) , dass das Blutgefäß, welches den Tumor versorgt, eine hohe intramurale Konzentration der zum Magnetfeld orientierten magnetischen
Partikel aufweist. Im interstitialen Bereich des Tumorgewebes (s. Feld B, das in Fig. 3B vergrößert dargestellt ist) liegen ebenfalls zahlreiche, hochkonzentrierte Anreicherungen von magnetischen Partikeln vor (in Fig. 3B durch Pfeile darge- stellt) . Schließlich zeigt auch der in Fig. 3C dargestellte Übergangsbereich zwischen Muskulatur und Tumorgewebe eine Vielzahl von hochkonzentrierten Ansammlungen magnetischer Partikel, die als schwarze Kondensationen innerhalb und außerhalb des Tumors ersichtlich sind.
Damit die magnetischen Partikel zur regionalen Therapie von Krankheiten über intraarterielle Applikation verabreicht werden können, liegen die magnetischen Partikel üblicherweise in einer zur intraarteriellen Applikation geeigneten Form vor, geeigneter Weise in einer dem Fachmann geläufigen, zur Infusion oder Perfusion ausgestalteten Flüssigkeit. Die Flüssigkeit sollte biokompatibel und nicht immunogen sein, insbesondere steril und pyrogenfrei.
Die magnetischen Partikel können im Hinblick auf die Kombination zwischen der magnetischen Substanz und der therapeuti-
sehen Substanz erfindungsgemäß grundsätzlich in Form von zwei alternativen Ausgestaltungen vorliegen. Im ersten Fall liegt die therapeutische Substanz reversibel gebunden an der Oberfläche der magnetischen Partikel mit einer magnetischen Kernsubstanz vor, wohingegen bei der zweiten Alternative die therapeutische Substanz fest mit der magnetischen Substanz verbunden ist. Während die erstgenannte Ausgestaltung für molekulare Substanzen vorgesehen ist, die nach Trennung der reversiblen Bindung ihre therapeutische Wirkung entfalten, wurde die zweite, alternative Ausgestaltung vornehmlich für die Strahlentherapie konzipiert, bei der es nicht auf eine direkte Einwirkung einer dissoziierten molekularen Substanz, sondern auf das Aussenden einer biologisch wirksamen Strahlung ankommt.
Bei beiden Ausgestaltungen der magnetischen Partikel ist es vorteilhaft, einen Kern, in dem die magnetische Substanz vorliegt, mit einem Polymeren zu umhüllen. Ein solcher Grundaufbau sowie Modifikationsmöglichkeiten magnetischer Partikel ist an sich bekannt, und in so weit kann auf bekannte Literatur und Offenbarungsquellen verwiesen werden, die sich auf den Aufbau und die Herstellung entsprechender magnetischer Partikel bzw. magnetischer Flüssigkeiten (Ferrofluide) beziehen, insbesondere die in die vorliegende Offenbarung mit einzubeziehenden Veröffentlichungen in "Encyclopedia of Physical Science and Technology", Vol. 9, S. 321 ff., Academic Press, New York (1992) sowie die eingangs erwähnte DE-A-19 624 426. Erfindungsgemäß ist es dabei bevorzugt, ein Polymer als Hüllmaterial einzusetzen, welches in wässrigen Medien, insbesondere im physiologischen Milieu, kompatibel ist und zur Stabilisierung im wässrigen Medium sowie bei der Anwendung dient.
Beispiele geeigneter Polymer schließen ein: Stärke, Stärkeester oder -etherderivate, deren Abbauprodukte wie Dextrine, ferner Dextrane, andere Polysaccharide, Pektine, Proteine wie Albumin, Casein, Kollagen, Gelatine und deren Derivate und
Abbauprodukte, sowie synthetische Polymere wie Polyvinyl- alkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyacrylsäuren oder dergleichen. Als zum Aufbau der Hülle zum vorstehend genannten Zweck besonders geeignete Polymere sind insbesondere Stärke, Stärkeabbauprodukte und -derivate, Dextrane, Dextrine, Serumalbumin und Polyvinylalkohol zu nennen.
Die Teilchengröße der magnetischen Partikel, die mittels dynamischer Lichtstreuung ermittelt werden kann, wird im Rahmen der Erfindung im Hinblick auf den gewünschten Zielort eingestellt. Es hat sich herausgestellt, dass ein ausgezeichneter Ko promiss erzielt werden kann zwischen der Vermeidung einer Tendenz zur Embolie, einer guten Gängigkeit durch das vaskuläre System in Verbindung mit einer ausgezeichneten Anreicherung und Verteilung am gewünschten Zielort unter gleichzeitiger ausreichender Orientierungs- und Manövrierfähigkeit durch das anzulegende Magnetfeld nach intraarterieller Applikation, wenn die Teilchengröße im Bereich von 20 nm bis 500 nm und insbesondere im Bereich von 50 nm bis 200 nm liegt. Die Einstellung der Teilchengröße erfolgt auf an sich bekannte Weise (siehe oben genannte Quellen) , vornehmlich durch Einstellung geeigneter Herstellungsbedingungen der magnetischen Teilchen (Nanopartikel) .
Es wurde nachgewiesen, dass durch die erfindungsgemäße Vorgehensweise eine vollständige Remission des Tumors bereits nach der kurzen Dauer einer einmaligen Behandlung erzielt werden konnte. Als besonders vorteilhaft erwies es sich, dass lediglich ein untergeordneter Anteil, gewöhnlich bereits bei 10 - 50% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis der jeweils eingesetzten therapeutischen Substanz, die vollständige Remission des Tumors ohne das Auftreten von Nebenwirkungen erreicht werden konnte. Eine 50%ige Reduktion des Tumorvolumens ergab sich im Mittel je nach Dosis nach 4 bis 6 Tagen (bei einer Dosis, die 20% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis entspricht, ergab sich eine 50%-Reduktion
nach 3 - 12 Tagen (im Mittel 6 Tage) ; im Fall einer Dosis von 50% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis ergab sich eine 50%-Reduktion nach 3 - 6 Tagen (Mittel: 4,2 Tage). Insbesondere aufgrund der Möglichkeit, mit dem erfindungsge- mäßen Konzept die Dosis der therapeutischen Substanz deutlich zu verringern und ggf. lediglich eine einmalige Applikation anzuwenden, werden die üblicher Weise mit der systemischen Therapie einhergehenden Nebenwirkungen minimiert bzw. völlig unterdrückt. Keines der behandelten Individuen entwickelte Nebeneffekte, wie Haarschwund (Alopecia) , Geschwüre (Ulcus) oder Muskelatrophie, und der Allgemeinzustand (Gewicht, Nahrungsaufnahme, Kot und Urinausscheidungen, Aktivität) blieb während der gesamten 3-monatigen Beobachtungszeit im Vergleich zu den physiologischen Zuständen gesunder Indi- viduen normal. Es wurden keine signifikanten Änderungen im Serumeisengehalt oder bei den Leukozyten-Werten gefunden. Demgegenüber waren die Werte und Ergebnisse in Vergleichsund Kontrollgruppen wesentlich schlechter. Im Falle der Applikation der therapeutischen Substanz ohne magnetische Substanz konnte zwar eine Remission bei hohen Dosen (bei 100% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis nach 33 Tagen und bei 75% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis nach 36 Tagen) erreicht werden, jedoch entwickelte sich Haarschwund (Alopecia) nach 33 Tagen. Ferner zeigte sich eine blaugrüne Urin-Färbung, die Muskulatur wurde atrophisch, und der haarlose Bereich entwickelte Hautentzündung und Geschwürbildung. Eine Reduzierung der allein angewandten therapeutischen Substanz auf 20 bzw. 50% der herkömmlich systemisch angewandten Dosis konnte keine Remission des Tumors herbei- führen, und Metastasen entwickelten sich im Mittel nach 48
Tagen. Die Nebenwirkungen waren in diesem Fall zwar geringer, jedoch ging die Behandlung mit Gewichtsverlust und einer Leukozytopenie einher. Die andere Vergleichsgruppe mit der magnetischen Substanz alleine (Ferrofluide) zeigte einen äußerst schlechten Krankheitsverlauf, bei dem das Tumorvolumen sich progressiv erhöhte, mit tastbaren, vergrößerten
Lymphknoten (Metastasen) nach 45 Tagen. Der Vergleich mit einer intravenösen Applikation (20 bzw. 50% Dosis der therapeutischen Substanz) zeigte lediglich eine sehr geringe Tumorremission, wobei die Volumenreduktion des Tumors nicht statistisch signifikant im Vergleich zur Kontrollgruppe war. Bei diesen Untersuchungen waren die Vergleichsbedingungen jeweils identisch (d.h. identische magnetische Substanz (Stärke-umhüllte Eisenoxidteilchen; Teilchendurchmesser 100 nm) ; Anlegen eines inhomogenen Magnetfelds mit maximaler magnetischer Flussdichte von z.B. 1,7 Tesla und einem entsprechenden Magnetfeldgradienten) .
Nachfolgend wird die vorstehend genannte, erste Ausgestal- tungsform der erfindungsgemäß eingesetzten magnetischen Partikel näher beschrieben.
Bei dieser Ausgestaltung ergeben sich deutliche Vorteile, wenn die therapeutische Substanz über ionische Wechselwirkung an die oben beschriebene Polymerhülle reversibel gebunden ist, wobei in diesem .Fall das auf den magnetischen Kernpartikeln aufgebrachte Polymer ionisch geladenen Gruppen trägt. Weil die therapeutischen Effekte besonders günstig beein- flusst werden können, ist es erfindungsgemäß bevorzugt, dass der Assoziationsgrad bei der reversiblen Bindung zwischen der therapeutischen Substanz und den ionisch geladenen Gruppen der Polymerhülle durch geeignete Umgebungsbedingungen eingestellt ist. Zu diesen geeigneten Bedingungen gehören insbesondere, jeweils einzeln oder kombiniert, die Temperatur, der pH-Wert und insbesondere die Osmolalität. Durch diese Fak- toren kann in günstiger Weise eine sehr rasche Dissoziation der therapeutischen Substanz von den magnetischen Trägerpartikeln erreicht werden mit der Folge, dass die therapeutische Substanz nach der Lokalisierung im Zielort, z.B. einem Tumor, sehr rasch frei agieren kann und zu einem therapeu- tisch sehr effizienten, sprunghaften Anstieg der aktiven
Wirkstoffkonzentration führt. So kann beispielsweise nach der
intraarteriellen Applikation und der direkt anschließenden Lokalisierung und Anreicherung mithilfe des am Zielort konzentrierten Magnetfelds zu einem Zeitpunkt, an dem die magnetischen Partikel am Zielort in ausreichendem Maße ange- reichert sind (etwa nach 30 Minuten bis zu wenigen Stunden) die physiologischen Umgebungsbedingungen so geändert werden, dass eine Dissoziation der ionischen Bindung der therapeutischen Substanz vom magnetischen Träger begünstigt wird. So kann z.B., je nach Art der ionischen Wechselwirkung, die gewünschte Dissoziation gefördert werden durch eine lokale Temperatur-Einrichtung oder durch die Zufuhr von physiologisch verträglichen, jedoch hinsichtlich der jeweiligen Faktoren wie pH und/oder Osmolalität entsprechend eingestellten Infusionslösungen, die vorzugsweise an derselben intraarteriellen Applikationsstelle zugeführt werden.
Je nach Art der einzusetzenden therapeutischen Substanz kann das Polymer der Hülle so mit ionisch geladenen Gruppen oder ionisierbaren Gruppen ausgestaltet oder modifiziert sein, dass die ionische Wechselwirkung in reversibler Weise stattfinden kann. Weist die therapeutische Substanz z.B. anionische Gruppen, wie z.B. Carboxylat-, Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat- oder ähnliche Gruppen auf, sollte das Hüllpolymer entsprechend positiv geladene oder ionisierbare Gruppen tragen, was z.B. durch das Vorliegen oder Einbauen von primären, sekundären oder tertiären Aminogruppen oder quarter- nären Ammoniumgruppen oder durch Iminogruppen realisierbar ist. Andererseits besteht die Möglichkeit, bei therapeutischen Substanzen, die positiv geladenen oder ionisierbaren Gruppen wie primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppen oder quarternäre Ammoniumgruppen besitzen, die entsprechend umgekehrt geladenen oder ionisierbaren Gruppen wie Carboxylat-, Sulfat-, Sulfonat-, Phosphat- oder ähnliche Gruppen im Hüllpolymer vorzusehen oder einzubauen. Eine besonders günstige Kombination wird dann erreicht, wenn die Polymerhülle negativ geladene Phosphatgruppen trägt und die
therapeutische Substanz über eine oder mehrere Amino- oder Ammoniumgruppen an die Phosphatgruppen reversibel gebunden sind, weil dann einerseits anfänglich bei der Bereitstellung der beladenen magnetischen Partikel eine stabile Assoziation zwischen der Substanzkombination, andererseits aber eine rasche Dissoziation unter physiologischen Umgebungsbedingungen ermöglicht und gleichzeitig eine sehr gute Verträglichkeit und Übereinstimmung mit natürlichen Systemen realisiert wird. Als sehr geeignete Polymersubstanzen zur Beschichtung magnetischer Kerne haben sich mit Phosphatgruppen veresterte Stärkepolymere erwiesen.
Obgleich die Wahl der therapeutischen Substanz grundsätzlich keiner Einschränkung unterliegt, kommt das erfindungsgemäße Konzept am besten zum Tragen, wenn die therapeutische Substanz eine regionale bzw. lokale Wirkung entfalten soll. Besonders geeignete therapeutische Substanzen schließen ein: niedermolekulare, synthetische oder natürliche bzw. semisynthetische Arzneimittel, Antikörper, insbesondere mono- klonale Antikörper und gentechnologisch erzeugte, vorzugsweise humane oder teils humane Antikörper, ferner Peptide, Angiogenesefaktoren, Hormone, Lymphokine und Cytokine, Lektine sowie Oligonukleotide und DNAs wie z.B. Antisense- Oligonukleotide oder gentherapeutisch einzusetzende DNA- Substanzen, die jeweils als isolierte DNA, in Form von
Plasmiden oder Vektoren oder in geeigneten Carrier-Systemen eingeschlossenen Formen vorliegen können. Ein besonders nützliches Einsatzgebiet der vorliegenden Erfindung ist die regionale Therapie gegen Tumoren, aber auch die Behandlung lokaler Entzündungen, lokaler Arteriosklerose, lokaler
Infektionen, insbesondere Pilzinfektionen, und dergleichen. Neben einem gentherapeutischen Ansatz kommen hier als therapeutische Substanzen insbesondere Antitumoragentien, vor allem Cytostatika sowie solche Substanzen in Betracht, die energiereiche Strahlung aussenden oder durch Aktivierung aussenden können. Als sehr gut geeignetes Cytostatikum ist
z.B. Mitoxantron zu nennen, welches stabil, jedoch günstig reversibel dissoziierbar an magnetische Teilchen gebunden werden kann. Der Aufbau eines solchen magnetischen Partikels ist in Fig. 4 beispielhaft bei mit Phosphatgruppen odifi- zierten, magnetischen Nanopartikeln gezeigt.
Die als Emittent energiereicher Strahlung zum Einsatz kommende therapeutische Substanz kann generell ein biologisch wirksamer Strahler sein und ist vorzugsweise ein α- und/oder ein γ-Strahler oder eine solche Substanz, die durch Aktivierung, z.B. durch eine Neutronenquelle, in einen α- und/oder γ-Strahler umgewandelt bzw. überführt werden kann. Als sehr Erfolg versprechende therapeutische Substanzen sind in diesem Zusammenhang Bor oder Borverbindungen zu nennen, die mittels Neutronenaktivierung in einen α-Strahler verwandelt werden können. Der Einsatz von Bor oder Borverbindungen lässt sich auf hervorragende Weise mit dem erfindungsgemäßen magnetischen "Trägersystem verwirklichen, wie nachfolgend näher beschrieben wird, und die dadurch ermöglichte Strahlenthera- pie ist einerseits sehr zielgerichtet als lokale Therapie realisierbar und bietet sich daher als nebenwirkungsarme Therapieform an.
Bei dieser Ausführungsform braucht die therapeutische Sub- stanz nicht an der Oberfläche der magnetischen Teilchen reversibel assoziiert sein, wie dies oben im Rahmen der ersten Ausgestaltung der magnetischen Partikel für die Erfindung beschrieben wurde. Beim Einsatz einer eine energiereiche Strahlung emittierenden oder einer hierzu aktivierbaren therapeutischen Substanz ist es bevorzugt, dass die Substanz direkt im magnetischen Kern der Partikel integriert ist, oder dass der magnetische Kern mit der therapeutischen Substanz beschichtet ist. Dies kann ohne weiteres zum Beispiel realisiert werden, indem im ersten Fall geeignete, magnetische Eisen-Substanz-Legierungen oder -Verbindungen unter Bildung
einer festen chemischen Verbindung zwischen der magnetischen Substanz und der therapeutischen Substanz bereitgestellt werden, wobei die Bezeichnung „Substanz" das zur Emission energiereicher Strahlung befähigte oder aktivierbare Element einschließt, z.B. magnetische Eisen-Bor-Legierungen, Eisenboride, Eisenborate oder magnetische, gemischte Oxide oder Mischoxide wie Borferrite, Bormagnetite, oder indem im zweiten Fall magnetische Teilchen aus z.B. Ferriten, Magne- titen oder ähnlichen Doppeloxiden beschichtet werden mit dem Metall, dem Metalloxid oder einer anderen Verbindung des
Elementes, welches zur Emission intensiver Strahlung befähigt ist oder aktiviert werden kann, z.B. mit Boroxid, Borsäure, Borationen oder Borsäureester. In den vorstehend genannten Legierungs- und Verbindungsbeispielen können wahlweise alter- native oder weitere, ggf. die Magnetisierung, die Materialbeschaffenheit oder die Herstellung günstig beeinflussende Elemente in chemischer Verbindung vorliegen, z.B. Nickel, Kobalt, Seltenerdelemente, Silizium und/oder Kohlenstoff.
Ansonsten gelten die obigen allgemeinen Beschreibungen zur ersten Ausführungsform der magnetischen Teilchen hier entsprechend, insbesondere in Bezug auf die wahlweise vorgesehene Umhüllung mit geeigneten Polymeren, die bevorzugt eingestellte Teilchengröße der magnetischen Partikel sowie dem Einsatz einer bevorzugten, gegenüber der herkömmlich angewandten Strahlendosis verminderten Dosis, die über die erfindungsgemäße, gezielt regionale Therapie realisierbar ist.
Die zur Therapieunterstützung einsetzbare Magnetfeldeinrichtung sollte ein inhomogenes Magnetfeld erzeugen. Zur günstigen Zielorientierung der magnetischen Partikel sind insbesondere stark inhomogene Magnetfelder erzeugende Elektro- magnete mit einem Polmaximum bis 2,5 Tesla, vorzugsweise bis 2,0 Tesla, insbesondere im Bereich von über 1,0 Tesla bis 1,8 Tesla geeignet, wobei sich ausgehend vom festgelegten Pol-
maximum ein entsprechend starker Magnetflussgradient einstellt. Solche starken Magnetfelder sind in Kombination mit den oben beschriebenen magnetischen Partikeln sehr effizient. Dabei sollte sich das zuvor genannte Polmaximum vorzugsweise in einer Entfernung bis 20 mm, weiter bevorzugt bis 15 mm vom Polschuh des Elektromagneten einstellen. Bei einer solchen Ausgestaltung ergeben sich besonders günstige Magnetfluss- und Orientierungsbedingungen und insbesondere entsprechend günstige Gradienten, die die Anreicherung der magnetischen Partikel im gewünschten Zielorgan oder -gewebe unterstützen. Um die magnetischen Partikel effizienter in tieferen Körperbereichen, z.B. beim Pankreas-Karzinom, zu fokussieren, können auch rotierende Magnetfelder in vorteilhafter Weise zum Einsatz kommen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen, die jedoch nicht einschränkend aufzufassen sind, näher erläutert.
Beispiele und Vergleichsbeispiele
Die im Rahmen der Beispiele und Vergleichsbeispiele zum Einsatz kommenden magnetischen Partikel (magnetische Nanoparti- kel für flüssige Zusammensetzungen/ Ferrofluide [FF]) wurden gemäß DE-A-19 624 426 hergestellt (erhältlich von chemicell, Berlin, Deutschland) . Sie bestehen aus einer kolloidalen Dispersion von magnetischen Partikeln, die durch nasschemische Verfahren aus Eisenoxiden und -hydroxiden unter Erzeugung von speziellen Multidomänen-Teilchen erhältlich sind. Die Teilchen waren von mit Phosphatgruppen modifizierten Stärkepolymeren umhüllt, um diese unter verschiedenen physiologischen Bedingungen zu stabilisieren und eine ionischen Beindung an die therapeutische Substanz zu ermöglichen. Als therapeutische Substanz kam das Cytostatikum Mitoxantron zum Einsatz, welches kationische bzw. positiv ionisierbare
Gruppen trägt und in der Lage ist, an die mit veresterten Phosphatgruppen modifizierten Stärkepolymere der Umhüllung der Magnetitpartikel unter Ausbildung reversibler ionischer Wechselwirkungen reversibel zu binden.
Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt die Charakteristiken der verwendeten, beispielhaften Ferrofluide.
Tabelle 1
Die als repräsentatives Beispiel zum Einsatz kommende Kombination zwischen Mitoxantron und Phosphatgruppentragenden magnetischen Teilchen ist in Fig. 1 schematisch dargestellt, wobei die relevanten chemischen Strukturen der therapeutischen Substanz sowie der Phosphatgruppen in der Abbildung in Einzelteile aufgelöst und vergrößert dargestellt sind. Die positiv geladenen NH+-Gruppen der Hydrochlorid- formen des Mitoxantrons (MTX-HCl) sind bei einem in der Zusammensetzung eingestellten pH von 7,4 mit den Phosphatgruppen des Stärkederivats assoziiert. Die beladenen Ferro- fluide enthielten 6,5 mg Mitoxantron pro 10 ml der flüssigen
Zusammensetzung. Da die Bindung der therapeutischen Substanz über die ionische Wechselwirkung reversibel war, konnte die Dissoziation mittels geeigneter Faktoren der physiologischen Umgebungsbedingungen wie pH, Osmolalität und Temperatur über die Veränderung der Blutelektrolyt-Konzentration gemäß den spezifischen Erfordernissen und der gewünschten Dissoziation eingestellt werden. In den nachfolgend beschriebenen Versuchen dissoziierte die therapeutische Substanz nahezu vollständig nach 60 Minuten.
Die Wirksamkeitstests wurden an einem aussagekräftigen Tiermodell durchgeführt, und zwar beim in Kaninchen etablierten VX-2-Schuppenzellkarzinom (A. Hough et al., Am. J. Pathol., 87, S. 537 (1977); C.S. Galasko und D. S. Muckle, Br. J. Cancer, 29, S. 59 (1974)). Nach Implantation in Weichgewebe vergrößert sich der Tumor rasch mit zunehmender Vaskularität in dessen Umgebung. Die Tiere entwickeln bald (innerhalb 2 - 3 Wochen) eine zentrale Tumornekrose, lokoregionale Lymphknotenmetastasen und hämatogene Metastasen in den Lungen. Zur Übertragung des Tumors wurden Fragmente von vitalem VX-2-
Gewebe mit 1 mm Größe aus der Tumorperipherie von Donortieren entnommen, in ein spezielles Medium (RPMI 1640, 2,0 g/1 NaHC03, L-Glutamin) überführt und unmittelbar unter sterilen Bedingungen in den hinteren Gliedmaßen von anästhesierten Empfängerkaninchen (Gesamtanzahl n = 26) im Zufuhrbereich der femoralen Arterie implantiert. Die Chemotherapie wurde begonnen, wenn die Tumoren ein Volumen von etwa 3500 mm3 erreichten. Zur Chemotherapie wurden die Tiere mit einer intramuskulären Injektion von 35 mg/kg Körpergewicht Ketamin und 5 mg/kg Körpergewicht Xylazin anästhesiert, dann wurde die Oberschenkel-bezügliche Arterie kanülisiert, und ein Verweilkatheter (0,8 mm Durchmesser) wurde nach Abtrennung der Oberschenkel-bezüglichen Vene vom saphenischen Nerv etwa 2 cm distal von der Leisten-bezüglichen Furche eingebracht. Die Mitoxantron-gebundenen Ferrofluide (FF-MTX) in unterschiedlicher Dosis, Mitoxantron allein (MTX) oder Ferrofluide
allein (FF) wurden mittels Perfusion über einen Zeitraum von 10 min verabreicht. Ferner wurden zum Vergleich Mitoxantron- gebundene Ferrofluide in verschiedenen Dosen intravenös verabreicht. In einer Kontrollgruppe wurde keine therapeu- tische Substanz angewandt.
Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt einen Überblick über das experimentelle Protokoll, "n" bezeichnet die Anzahl der jeweils pro Gruppe untersuchten Tumor-tragenden Tiere. Die Spalte "Dosis" gibt an, welcher Anteil an therapeutischer Substanz gegenüber der normalen systemischen Mitoxantron- Dosis (10 mg/m2) durch einmalige Applikation verabreicht wurde. Die intraarterielle Applikation erfolgte über die femorale Arterie, die intravenöse Applikation erfolgte über die Ohrvene. Das externe magnetische Feld wurde über dem Tumor konzentriert.
Tabelle 2
Zur Erzeugung eines inhomogenen, externen Magnetfelds wurde ein Elektromagnet mit einer magnetischen Flussdichte im
Maximum von 1,7 Tesla eingesetzt. Die magnetische Flussdichte wurde auf die Tumorregion fokussiert mit einem speziell adaptierten Polschuh, welcher in Kontakt mit der Oberfläche des Tumors gebracht wurde. Dabei betrug die magnetische Flussdichte im Bereich der Tumoroberfläche etwa 1,7 Tesla und
etwa 10 mm unterhalb der Spitze des Polschuhs ungefähr 1,0 Tesla. Das Magnetfeld wurde über dem Tumor während der oben beschriebenen Applikation der Infusionslösung konzentriert und für insgesamt 60 min angelegt.
Zur Blutuntersuchung wurden Blutproben mittels Venenpunktur einmal wöchentlich entnommen und bei 2000 x g innerhalb von zwei Stunden zentrifugiert . Unmittelbar nach der Blutentnahme wurden Messungen verschiedener Parameter der Klinischen Chemie (Eisen, Alanin-Aminotransferase, Aspartat-Ainotrans- ferase, γ-Glutamyltransferase, Alkalische Phosphatase und Laktatdehydrogenase) sowie von Blutzahl-Parametern (Zellwerte von Gesamtblut und differentiellem Blut) durchgeführt.
Die statistische Auswertung verlief folgendermaßen:
Das Tumorvolumen wurde unter Verwendung der Formel für elliptische Massen (1/6 πa2b, a = Weite der Horizontalachse, b = Länge der Vertikalachse) berechnet. Volumenänderungen wurden als Prozentwerte in Bezug auf 100% Tumorvolumen zu Beginn der Behandlung ausgedrückt. Statistische Analysen der relativen Tumorvolumina wurden unter Verwendung des Einmal- proben-t-Tests (mit einem konservativen, festen Wert von 100% für die Kontrollgruppe) sowie einem t-Test für zwei unabhängige Proben (Welch-Test) durchgeführt. Für Blutparameter (Absolutwerte) wurden der t-Test für zwei unabhängige Proben angewandt. Die resultierenden, zweiseitigen p-Werte wurden als signifikant angesehen bei einem Wert von 0,05 oder darunter. Das Ergebnis war signifikant bei Werten von 0,01 bis 0,05 und hochsignifikant bei Werten unter 0,01. Die p- Werte wurden unter Verwendung der "Statistical Package for Social Sciences" (SPSS), Version 9,0, auf einer Microsoft- Excel-Version 97 berechnet.
Die Ergebnisse für die in der obigen Tabelle 2 dargestellten Gruppen sind in den jeweiligen Figuren 5A bis 5G grafisch dargestellt, wobei die Entwicklung des mittleren Tumor-
volumens (mit den jeweils als Balken dargestellten maximalen und minimalen Werten) gegen dem zeitlichen Verlauf aufgetragen ist. Die Bezeichnung "Metastasen" bedeutet den Beginn der Metastasenbildung. Entsprechend bedeutet "Alopezie" den Beginn des festgestellten Haarschwunds. "Behandlung" zeigt die anfängliche, einmalige Behandlung an.
Die Ergebnisse der erfindungsgemäßen Gruppen la und 1b mit der intraarteriellen Applikation einer im Vergleich zur her- kömmlich systemisch angewandten Dosis lediglich 20%-igen bzw. 50%-igen Dosis an Cytostatikum (Mitoxantron) , die auf magnetischen Teilchenträgern mittels ionischer Wechselwirkung reversibel gebunden waren, zeigen eine hoch signifikante Reduktion des Tumorvolumens bereits nach wenigen Tagen (vgl. Fig. 5A und 5B) . Es wurden weder Metastasenbildungen noch Alopezie-Erscheinungen beobachtet. Demgegenüber war eine intraarterielle Gabe von Mitoxantron alleine mit schlechten Resultaten verbunden, da eine gegenüber systemischen Dosen verminderte Dosis (20 bzw. 50%) zu keiner Tumor-Remission, aber zur Metastasenbildung führte, während höhere Dosen (75 bzw. 100%) zwar eine Reduzierung des Tumorvolumens herbeiführte, jedoch im zeitlichen Verlauf wesentlich später einsetzte und zur Alopezie führte. (s. FIG. 5C) Ferrofluide alleine zeigten praktisch keine therapeutischen Wirkungen. Die entsprechende Figur 5D zeigt eine progressive Vergrößerung des Tumorvolumens mit tastbaren, vergrößerten Lymphknoten in der Leistengegend (Metastasen) . Ferner zeigte der Vergleich mit der intravenösen Applikation (Gruppen 4a und 4b, Figuren 5E und 5F) keine statistisch signifikanten Tumor- Remissionen im Vergleich zur erfindungsgemäßen intraarteriellen Applikation. Fig. 5G zeigt in Bezug auf die Vergleichsgruppe 5 die Bedeutung der Unterstützung durch ein magnetisches Feld, in dem wie in den erfindungsgemäßen Gruppen la und lb, jedoch ohne Anlegen des externen Magnet- feldes verfahren wurde. Zwar konnte ein weiteres Tumorwachstum und die Metastasenbildung verhindert werden, jedoch wurde
keine Remission des Tumors beobachtet. Zum Zeitpunkt der Behandlung zeigten weniger als 5% der Tiere eine geringe nekrotische Fraktion im Bereich des Tumors.
Die Resultate zu den lokalen und systemischen Nebeneffekten sind in den Figuren 6A und 6B zusammengefasst . Bei der Kontrollgruppe 6 verschlechterte sich im Beobachtungszeitraum der allgemeine Zustand. Die tumorerkrankten Tiere entwickelten Pneumonien, was die in den Figuren 6A und 6B bzgl. der Kontrollgruppe zu beobachtende Erhöhung der Leukozytenzahl erklärt. Demgegenüber zeigten sich keine signifikanten Änderungen bei den Leukozyten-Werten in den erfindungsgemäßen Gruppen la und lb (s. Figuren 6A und 6B) . Auch die übrigen untersuchten Parameter blieben im BeobachtungsZeitraum von drei Monaten normal. Die Fig. 7A zeigt anschaulich die auch nach außen sichtbare, normale Erscheinung der Hinterläufe nach der Tumorbehandlung der erfindungsgemäßen Gruppe. Bei den Vergleichsgruppen wurden teils starke Nebenwirkungen beobachtet, etwa den oben bereits erwähnten Alopezie- Erscheinungen, Entfärbung des Urins, Entzündungserscheinungen, Geschwürbildung und Gewichtsverlust. Im Gegensatz zur äußerlich normalen Erscheinung in der erfindungsgemäßen Gruppe (vgl. Fig. 7A) sind die starken Nebenwirkungen einer intraarteriellen Applikation mit dem Cytostatikum alleine (Vergleichsgruppe 2) deutlich in Fig. 7B zu sehen.
Zur histologischen Beurteilung und zur Magnetresonanz- Darstellung (vgl. die jeweiligen Figuren 3 und 1) wurden unmittelbar nach der einmaligen Applikation von 50% FF-MTX in die femorale Arterie und dem Anlegen des magnetischen Felds für 60 min der Tumor entfernt und in 3,7%-igem Formalin fixiert. 5 μm dicke Paraffin-Schnitte des Tumors wurden geschnitten und mit Hämatoxilin und Eosin angefärbt. Die histologische Anfärbung führte zu den in den Figuren 2 und 3A bis 3C dargestellten histologischen Befunden.
Daneben wurden nach einer entsprechenden Applikation und 6 h nach Anlegen des externen magnetischen Feldes eine Magnetresonanz-Bildanalyse an vier Tumor-tragenden Tieren durchgeführt. Die Bilddarstellungen wurden bei 1,5 Tesla mittels eines klinischen Magnetresonanz-Scanners (ACS-NT; Philips) ausgeführt. Eine Fett unterdrückende Tl-gewichtete Turbospin- Echosequenz wurde zur Bilddarstellung (TR 535, TE 20, Echozugklänge 5) verwendet. Dies führte zu den in Figuren 1A und IB gezeigten Magnetresonanz-Bilddarstellungen.
Weiterhin wurden Versuche zur Quantifizierung der magnetischen Partikel beziehungsweise freigesetzten Wirkstoffe in verschiedenen Geweben und Organen durchgeführt. Die Ergebnisse sollen nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren 8 bis 12 verdeutlicht werden.
In Figur 8 ist die quantitative Anreicherung von 59Fe mit und ohne Magnetfeldunterstützung (Magnetic Drug Targeting) gezeigt. Mit Magnetfeldeinwirkung konnte im Tumor 34 mal mehr 5Fe (entspricht magnetischen Partikel) angereichert werden, peritumoral sogar mehr als 236 mal mehr. Dies ist gerade für die sano-Situation (d.h., der Tumor ist vollständig erfasst, inklusive der Tumorausläufer) sehr wichtig. Ferner sieht man eine wesentlich geringere Anreicherung in Leber, Milz und Knochenmark. Die Angaben in Fig. 8 beziehen sich immer auf Aktivität (Bq) /Gramm Gewebe.
In den Figuren 9A und 9B sind die HPLC-Analysen bezüglich des freigesetzten Wirkstoffs Mitoxantron nach intraarterieller Applikation ohne Magnetfeldeinwirkung (Fig. 9A) und mit
Magnetfeldeinwirkung (Fig. 9B) angegeben. Aus der relativen Angabe Mitoxantron (μg) /Gramm Gewebe ergibt sich im Tumor eine 6-fach größere Anreicherung, peritumoral eine 9-fach stärkere und im gleichseitig befallenen Lymphknoten eine 5- fach stärkere Anreicherung bei der erfindungsgemäßen
Applikation (Fig. 9B) gegenüber den Vergleichswerten ohne Magnetfeldeinwirkung (Fig. 9A) .
Bei dem in den Figuren 10A und 10B gezeigten Vergleich ergibt sich bezogen auf die applizierte Menge an Mitoxantron
(5 mg/m2 Körperoberfläche) im Tumor eine 120-fach stärkere Anreicherung bei intraarterieller Applikation mit Magnetfeldeinwirkung gegenüber der intraarteriellen Applikation ohne Magnetfeldeinwirkung. Peritumoral ergibt sich eine 30-fach stärkere Wirkstoffanreicherung.
Die in den Figuren 11 und 12 gezeigten Vergleichsversuche zeigen, dass die alleinige intravenöse Gabe des Wirkstoffs Mitoxantron nahezu keine Anreicherung im entsprechenden Muskelarreal ergibt. Hingegen kommt es zu einer starken Konzentriereung in Leber, Niere und Milz.
Claims
1. Magnetische Partikel, die eine magnetische Substanz in Kombination mit einer therapeutischen Substanz umfassen, zur Magnetfeld-unterstutzten, regionalen Therapie von Krankheiten mittels intraarterieller Applikation.
2. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Kern, in dem die magnetische Substanz vorliegt, sowie eine Hülle aus einem Polymer umfasst .
3. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilchengröße der magnetischen Partikel größer als 50 nm und kleiner als 200 nm beträgt.
4. Magnetische Partikel gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz in einer Dosis vorliegt, berechnet auf Basis der partikelgebundenen Menge, die 10 bis 50 % der herkömmlich systemisch angewandten Dosis entspricht.
5. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz über ionische Wechselwirkung an die Polymerhülle reversibel gebunden ist, die ionisch geladene Gruppen trägt.
6. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerhülle negativ geladene Phosphatgruppen trägt und dass die therapeutische Substanz über eine oder mehrere Amino- oder Ammoniumgruppen an die Phosphatgruppen reversibel gebunden ist.
7. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Polymerhülle aus mit Phosphatgruppen veresterten Stärkepolymeren gebildet ist.
8. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Assoziationsgrad der reversiblen Bindung zwischen der therapeutische Substanz und den ionisch geladenen Gruppen der Polymerhülle durch Bedingungen der Temperatur, des pH-Werts und/oder der Osmolalität eingestellt ist.
9. Magnetische Partikel gemäß einem der vorangehenden Ansprüche mit einem Cytostatikum als therapeutischer Substanz.
10. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Cytostatikum Mitoxantron ist.
11. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 mit einer DNA-Substanz als therapeutischer Substanz.
12. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz ein biologisch wirksamer Strahler ist oder durch Aktivierung in einen biologisch wirksamen Strahler umgewandelt werden kann.
13. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz ein α- und/oder ein γ-Strahler ist oder durch Aktivierung in einen α- und/oder ein γ-Strahler umgewandelt werden kann.
14. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz Bor oder eine Borverbindung ist, die mittels Neutronenaktivierung in einen α-Strahler umgewandelt werden kann.
15. Magnetische Partikel gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutische Substanz im magnetischen Kern der Partikel integriert ist, oder dass" der magnetische Kern mit der therapeutischen Substanz beschichtet ist.
16. Magnetische Partikel gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Therapie unterstützt wird von einem inhomogenen Magnetfeld mit einem Polmaximum von über 1,0 Tesla bis 2,0 Tesla.
17. Magnetische Partikel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die magnetischen Partikel in einer zur Infusion oder Perfusion ausgestalteten Flüssigkeit vorliegen.
18. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur regionalen Therapie gegen Tumoren.
19. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur regionalen Therapie gegen lokale Infektionen.
20. Verwendung von magnetischen Partikeln gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 zur regionalen Therapie gegen lokale Entzündungen.
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